CN104884615B - 具有蛋白酶活性的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些蛋白酶的分离的核酸序列。本发明还涉及包括这些核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞(包括植物和动物细胞)，以及生产和使用这些蛋白酶(特别是在动物饲料中使用这些蛋白酶)的方法。

Description

具有蛋白酶活性的多肽
对序列表的引用
本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些蛋白酶的分离的核酸序列。本发明还涉及包括这些核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞(包括植物和动物细胞)，以及生产和使用这些蛋白酶(特别是在动物饲料中使用这些蛋白酶)的方法。
发明背景
在动物饲料中使用蛋白酶(体内)，和/或这类的蛋白酶用于处理植物性蛋白(体外)的用途中，注意的是蛋白对于动物和人类是必需营养因子。人类和牲畜通常从植物性蛋白来源获得必需蛋白质。重要的植物性蛋白来源是例如油籽作物、豆类和谷类。
当例如大豆粉包含在单胃动物如猪和家禽的饲料中时，相当比例的大豆粉未被有效地消化(在小猪、生长猪和家禽如肉仔鸡、蛋鸡和公鸡中的表观回肠蛋白消化率仅是80％左右)。
动物的胃肠道是由一系列各自呈现不同pH环境的段组成。在单胃动物如猪和家禽以及许多类型的鱼中，胃是具有潜在地低至1-2的pH的强酸性的，而肠具有一个6-7.5左右的更中性的pH。除胃和肠之外，家禽在胃之前还具有一个嗉囊。嗉囊中的pH主要由消化的饲料决定并且因此典型地位于pH 4-6的范围内。通过一种蛋白酶消化蛋白可发生在整个消化道中，其条件是该蛋白酶是有活性的并存活于该消化道的条件下。因此，以下这样的蛋白酶是特别令人希望的：它们是高度地酸稳定的并且所以可以在胃环境中存活，并且同时在靶动物的消化道的宽范围的生理pH下是有效地有活性的。本发明的新颖的S53蛋白酶对于这些目的是有用的。
由于动物饲料通常以丸状形式配制，其中在造丸过程中应用蒸汽，因此在暴露于所述蒸汽处理之后用于动物饲料中的蛋白酶仍能够保持是有活性的也是令人希望的。
为了生产用于工业使用的蛋白酶，重要的是生产高产量的蛋白酶，使得可获得足够量的该产品以能够以有利的价格提供该蛋白酶。
相关技术说明
S53蛋白酶在本领域是已知的。来自多叶奇果菌(Grifola frondosa)、具有登录号MER078639的S53肽(SEQ ID NO:9)与SEQ ID NO:5具有83.6％序列一致性。由马丁内斯(Martinez)等人在“木材腐朽真菌鲑色波斯特孔菌的基因组、转录组和分泌组分析支持木质纤维素转化的独特机制(Genome,transcriptome,and secretome analysis of wooddecay fungus Postia placenta supports unique mechanisms of lignocelluloseconversion)”，2009，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)106:1954-1959中分离了一种来自鲑色波斯特孔菌(Postia placenta)的S53蛋白酶(Uniprot：B8PMI5，SEQ IDNO:10)，该S53蛋白酶与SEQ ID NO:5具有74.5％序列一致性。
范登威梅伦伯格(Vanden Wymelenberg)等人已经在“黄孢原毛平革菌V2.0基因组数据库的计算分析与木质素分解培养物中的肽的质谱鉴定揭示了分泌的蛋白的复杂混合物(Computational analysis of the Phanerochaete chrysosporium v2.0genomedatabase and mass spectrometry identification of peptides in ligninolyticcultures reveal complex mixtures of secreted proteins)”，2006，真菌遗传学与生物学(Fungal Genet.Biol.)43:343-356中分离了一种S53蛋白酶(Uniprot：Q281W2，SEQ IDNO:11)，该S53蛋白酶与SEQ ID NO:5具有74.1％序列一致性。已经由马丁内斯(Martinez)等人在“木材腐朽真菌鲑色波斯特孔菌的基因组、转录组和分泌组分析支持木质纤维素转化的独特机制(Genome,transcriptome,and secretome analysis of wood decay fungusPostia placenta supports unique mechanisms of lignocellulose conversion)”，2009，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)106:1954-1959中鉴定了另一种来自鲑色波斯特孔菌的S53多肽(Uniprot:B8P431，SEQ ID NO:12)，该S53多肽与SEQ IDNO:5具有68.2％序列一致性。其他肽(包括S53蛋白酶)与SEQ ID NO:5具有少于70％序列一致性。
弗洛达斯(Floudas)等人已经在“重建自31个真菌基因组的酶解木质素分解的古生代来源(The Paleozoic origin of enzymatic lignin decomposition reconstructedfrom 31fungal genomes)”，2012，科学(Science)，336:1715-1719中公开了一种S53蛋白酶的序列，该序列与SEQ ID NO:5具有80.6％一致性。费尔南德斯-弗艾友(Fernandez-Fueyo)等人已经在“虫拟蜡菌和黄孢原毛平革菌的比较基因组学提供了对选择性木质素分解的深入理解(Comparative genomics of Ceriporiopsis subvermispora and Phanerochaetechrysosporium provide insight into selective ligninolysis)”，2012，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.)109:5458-5463中公开了三种丝氨酸蛋白酶的序列(Uniprot：M2QQ01，SEQ ID NO:26，Uniprot：M2QWH2，SEQ ID NO:27，Uniprot：M2RD67，SEQID NO:28)，这三个序列与SEQ ID NO:5分别具有80.8％、79.1％和78.6％一致性。
WO 02/068623描述了一种用于在饲料和食品应用中使用的来自黑曲霉、与SEQ IDNO:5具有49.2％序列一致性的蛋白酶。WO 12/048334描述了作为饲料添加剂或用于饲料的来自嗜热毁丝霉、与SEQ ID NO:5具有47.9％序列一致性的丝氨酸类型的内肽酶。
WO 95/28850披露了一种植酸酶与一种或多种微生物蛋白水解酶组合以改善植物性蛋白的溶解度。WO 01/58275披露了枯草杆菌蛋白酶家族的酸稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 01/58276披露了来源于拟诺卡氏菌属NRRL 18262的酸稳定性蛋白酶(10R蛋白酶)连同一种来源于白拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alba)DSM 14010的蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 04/072221、WO 04/111220、WO 04/111223、WO 05/035747以及WO 05/123911披露了与10R蛋白酶相关的蛋白酶及其在动物饲料中的用途。WO 04/072279披露了其他蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 04/034776披露了一种枯草杆菌蛋白酶/角蛋白酶，来自地衣芽孢杆菌的PWD-1，在家禽饲料中的用途。WO 04/077960披露了一种通过采用一种细菌或真菌蛋白酶来增加草料或谷物在反刍动物中的消化率的方法。
包括一种蛋白酶并且销售以用于在动物饲料中使用的商业产品包括ProAct(DSM NP/诺维信公司(Novozymes))、(丹尼斯克公司(Danisco))、(丹尼斯克公司)、(丹尼斯克公司)、AllzymeTM(奥特奇公司(Alltech))、(生物资源有限公司(BioResources,Int.)、PoultrygrowTM(杰夫公司(Jefo))和(诺伟思公司(Novus))。
发明概述
本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽具有至少84％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少83％序列一致性；
(c)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少85％序列一致性；
(d)一种多肽，该多肽由在高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列，
(iv)SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列，
(v)SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列，
(vi)SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列，
(vii)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的全长互补链；
(e)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少84％序列一致性的多核苷酸编码；
(f)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少83％序列一致性的多核苷酸编码；
(g)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列具有至少85％序列一致性的多核苷酸编码；
(h)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
本发明还涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽具有至少60％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少60％序列一致性；
(c)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少60％序列一致性；
(d)一种多肽，该多肽由在高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列，
(iv)SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列，
(v)SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列，
(vi)SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列，
(vii)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的全长互补链；
(e)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码；
(f)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码；
(g)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码；
(h)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
本发明涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，包括这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体以及重组宿主细胞，并且涉及产生这些多肽的方法。
本发明还涉及包括本发明的多肽的组合物，优选动物饲料组合物；本发明的多肽在动物饲料中或作为动物饲料添加剂的用途；用于制备用于在动物饲料中使用的组合物的方法，用于改善动物饲料的营养价值的方法以及处理有待在动物饲料组合物中使用的蛋白的方法。
序列表综述
SEQ ID NO:1是如分离自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3的cDNA序列。
SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是来自SEQ ID NO:1的具有HQ标记的重组表达DNA序列的DNA序列。
SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是来自大型亚灰树花菌的成熟S53蛋白酶3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是从SEQ ID NO.3获得的成熟S53蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是10R蛋白酶(WO 05/035747，SEQ ID NO:1)的DNA序列。
SEQ ID NO:8是10R蛋白酶(WO 05/035747，SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是来自多叶奇果菌(MER078639)的S53肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是来自鲑色波斯特孔菌的S53肽(Uniprot：B8PMI5)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是来自黄孢原毛平革菌的S53肽(Uniprot：Q281W2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是来自鲑色波斯特孔菌的S53肽(Uniprot：B8P431)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是引物597。
SEQ ID NO:14是引物598。
SEQ ID NO:15是分离自变色栓菌对比种(Trametes cf.versicolor)的S53蛋白酶1的cDNA序列。
SEQ ID NO:16是如从SEQ ID NO:15推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是来自SEQ ID NO:15的重组表达DNA序列的DNA序列。
SEQ ID NO:18是如从SEQ ID NO:17推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是从SEQ ID NO.15和SEQ ID NO:17获得的成熟S53蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是分离自变色栓菌(Trametes versicolor)的S53蛋白酶2的cDNA序列。
SEQ ID NO:21是如从SEQ ID NO:20推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是来自SEQ ID NO:20的重组表达DNA序列的DNA序列。
SEQ ID NO:23是如从SEQ ID NO:22推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是从SEQ ID NO.20和SEQ ID NO:22获得的成熟S53蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是来自污叉丝孔菌的S53肽(Uniprot：R7SPH9)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26是来自虫拟蜡菌的S53肽(Uniprot：M2QQ01)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是来自虫拟蜡菌的S53肽(Uniprot：M2QWH2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是来自虫拟蜡菌的S53肽(Uniprot：M2RD67)的氨基酸序列。
序列的一致性矩阵：
附图简要说明
图1示出了来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)与蛋白酶10R相比在25℃下、对Suc-AAPF-pNA底物的pH-活性曲线。
图2示出了来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)与蛋白酶10R相比的pH-稳定性曲线(在37℃下2小时后的残余活性)。
图3示出了来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)在pH 4.0下与蛋白酶10R相比在pH 6.5下、对Protazyme AK的温度活性曲线。
图4示出了来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)在pH 4下与蛋白酶10R在pH 9.0下相比，对10种Suc-AAPX-pNA底物的P1-特异性(25℃)。
图5示出了来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)与蛋白酶10R相比，对大豆-玉米粉的活性(OD340x稀释因子)。
图6示出了空白T0样品、空白样品和用来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)或蛋白酶10R孵育的样品中的游离胺的水平(OD340x稀释因子)。
图7示出了分离自变色栓菌对比种的S53蛋白酶1与来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)相比，在25℃下，对Suc-AAPF-pNA底物的pH-活性曲线。
图8示出了分离自变色栓菌对比种的S53蛋白酶1与来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)相比的pH-稳定性曲线(在37℃下2小时后的残余活性)。
图9示出了分离自变色栓菌对比种的S53蛋白酶1与来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)相比，在pH 4下，对Protazyme AK的温度活性曲线。
图10示出了分离自变色栓菌对比种的S53蛋白酶1与来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)相比，在pH 4下，对10种Suc-AAPX-pNA底物的P1-特异性(25℃)。
定义
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞中获得。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。
控制序列：术语“控制序列”是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括在多肽的产生中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与提供了其表达的额外的核苷酸相连接的线性或环状DNA分子。
片段：术语“片段”意指使一个或多个(例如，若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。在一个方面中，一个片段包含至少330个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的氨基酸20至349)；在另一个方面中，一个片段包含至少345个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的氨基酸10至354)；在一个另外的方面中，一个片段包含至少355个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2或SEQID NO:5的氨基酸5至359)。在一个方面中，一个片段包含至少330个氨基酸残基(例如，SEQID NO:16或SEQ ID NO:20的氨基酸20至349)；在另一个方面中，一个片段包含至少345个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20的氨基酸10至354)；在一个另外的方面中，一个片段包含至少355个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20的氨基酸5至359)。在一个方面中，一个片段包含至少330个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:24的氨基酸20至349)；在另一个方面中，一个片段包含至少345个氨基酸残基(例如，SEQID NO:21或SEQ ID NO:24的氨基酸10至354)；在一个另外的方面中，一个片段包含至少355个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24的氨基酸5至359)。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指一种处于自然界中不存在的形式或环境中的多核苷酸，例如(1)任何非天然存在的多核苷酸，(2)至少部分地从与其天然相关联的天然存在的组分中的一个或多个或全部中去除的任何多核苷酸；(3)通过相对于如在自然界中发现的那一多核苷酸进行人工修饰的任何多核苷酸或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分而增加多核苷酸的量来修饰的任何多核苷酸(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多重拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)。在一个方面中，该分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如至少5％纯的，更多至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，至少90％纯的，以及至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所确定的。该多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或其任意组合。
分离的多肽：术语“分离的多肽”意指一种处于自然界中不存在的形式或环境中的多肽，例如(1)任何非天然存在的多肽，(2)至少部分地从与其天然相关联的天然存在的组分中的一个或多个或全部中去除的任何多肽；(3)通过相对于如在自然界中发现的那一多肽(在与其他组分例如其他多肽、次级代谢产物、盐等的掺合物中)进行人工修饰的任何多肽或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分而增加多肽的量来修饰的任何多肽。在一个方面中，该多肽是至少1％纯的，例如至少5％纯的，至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，以及至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所确定的。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指呈现其在翻译以及任何翻译后修饰之后的最终形式的多肽，所述修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面中，基于使用埃德曼(Edman)降解和整体分子量分析对具有C-末端HQ标记的成熟多肽的测序，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的编号中的氨基酸1至366。使用预测程序SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程学(Protein Engineering)10:1-6)，将SEQ ID NO:2的编号中的氨基酸-198至-182预测为信号肽。
在另一个方面中，基于使用埃德曼降解和整体分子量分析对成熟多肽的测序，该成熟多肽是SEQ ID NO:17的编号中的氨基酸1至366。使用预测程序SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程学(Protein Engineering)10:1-6)，将SEQ ID NO:17的编号中的氨基酸-199至-183预测为信号肽。
在一个另外的方面中，基于预测程序SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程学(Protein Engineering)10:1-6)，将该成熟多肽预测为SEQ ID NO:23的编号中的氨基酸1至366并且将该信号肽预测为氨基酸-199至-183。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面中，基于通过埃德曼降解确定的成熟多肽和具有C-末端HQ标记的成熟多肽的整体分子量分析，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的编号中的核苷酸605至1702。此外，基于预测程序SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程学(ProteinEngineering)10:1-6)，SEQ ID NO:1的编号中的核苷酸11至61被预测为编码信号肽。
在另一个方面中，基于通过埃德曼降解确定的成熟多肽和该成熟多肽的整体分子量分析，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:15的核苷酸707至853、核苷酸912至1022、核苷酸1077至1276、核苷酸1332至1469、核苷酸1531至1978以及核苷酸2031至2084的结合序列或其cDNA序列。基于预测程序SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程学(Protein Engineering)10:1-6)，SEQ ID NO:15的编号中的核苷酸1至51被预测为编码信号肽。在一个另外的方面中，基于通过埃德曼降解确定的成熟多肽和该成熟多肽的整体分子量分析，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:17的核苷酸598至1695或其cDNA序列。基于预测程序SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程学(Protein Engineering)10:1-6)，SEQ ID NO:22的编号中的核苷酸1至51被预测为编码信号肽。
在另一个方面中，基于预测SEQ ID NO:20的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序(尼尔森(Nielsen)等人，1997，见上文)，将该成熟多肽编码序列预测为SEQ ID NO:20的核苷酸706至852、核苷酸914至1024、核苷酸1080至1279、核苷酸1333至1470、核苷酸1532至1979以及核苷酸2032至2085的结合序列或其cDNA序列。在另一个方面中，基于预测SEQ IDNO:22的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序(尼尔森(Nielsen)等人，1997，见上文)，将该成熟多肽编码序列预测为SEQ ID NO:22的核苷酸598至1695或其cDNA序列。
核酸构建体：术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或合成的单链或双链的核酸分子。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。存在若干种蛋白酶活性类型，例如在Arg和Lys残基的羧基末端侧切割的胰蛋白酶样蛋白酶和在疏水性氨基酸残基的羧基末端侧切割的糜蛋白酶样蛋白酶。本发明的蛋白酶是具有酸性pH最佳值(pH最佳值<pH 7)的丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)。
可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。pH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。pH值测定的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。温度测定的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。普通蛋白酶底物的实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的安森(Anson)和米尔斯基(Mirsky)方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶孵育测定后，确定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量用作蛋白酶活性的量度(安森(Anson)，M.L.和米尔斯基(Mirsky)，A.E.，1932，普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)16:59以及安森(Anson)，M.L.，1938，普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)22:79)。
用于本发明的目的，使用描述于“材料与方法”中的测定确定蛋白酶活性，如动力学Suc-AAPF-pNA测定、Protazyme AK测定、动力学Suc-AAPX-pNA测定以及邻苯二甲醛(OPA)。对于Protazyme AK测定，当用该蛋白酶孵育时，不可溶Protazyme AK(天青精-交联的酪蛋白)底物释放蓝色并且确定该颜色作为蛋白酶活性的量度。对于Suc-AAPF-pNA测定，当用该蛋白酶孵育时，无色的Suc-AAPF-pNA底物释放黄色的对硝基苯胺并且确定该黄色作为蛋白酶活性的量度。
本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19和/或SEQ D NO:24的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性程度，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。使用版本6.1.0。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度，该算法如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。使用版本6.1.0。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严谨度条件：不同的严谨度条件定义如下。
术语“非常低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸，其中该子序列编码具有蛋白酶活性的一个片段。在一个方面中，一个子序列包含至少990个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸662至1651)，例如，以及至少1035个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸632至1666)；例如，以及至少1065个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸617至1681)。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因工程化多肽生产系统内部的形式的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组结合的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的或100％纯的。本发明的多核苷酸优选以一种基本上纯的形式存在。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指按重量计包含最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多肽天然或重组结合的其他多肽材料的制剂。优选地，按在该制剂中存在的总多肽物质的重量计，该多肽是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％、至少99.5％纯的、和100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(若干个)氨基酸残基取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指将占据某个位置的氨基酸替换为不同的氨基酸；缺失意指去除占据某个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据某个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6的多肽或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。
发明详细说明
具有蛋白酶活性的多肽
具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。
术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括属于EC 3.4酶组(包括其十八个亚类中的每一个)的任何酶。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(San Diego)的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于1994，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)223:1-5；1995，欧洲生物化学杂志232:1-6；1996，欧洲生物化学杂志237:1-5；1997，欧洲生物化学杂志250:1-6；以及1999，欧洲生物化学杂志264:610-650的增刊1-5。命名定期得以增补和更新；参见例如万维网(WWW)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
本发明和根据本发明使用的蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：
(a)属于EC 3.4.21酶组的蛋白酶；和/或
(b)属于EC 3.4.14酶组的蛋白酶；和/或
(c)肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶，该肽酶家族包括两种不同类型的肽酶：三肽氨肽酶(外切型)和内切肽酶；如在1993，生物化学杂志(Biochem.J.)290:205-218和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.4(2011年1月31日)(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.，巴雷特(Barrett)，A.J.和贝特曼(Bateman)，A.，2010，“MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the peptidase database)”，核酸研究(Nucl.Acids Res.)38:D227-D233中。
为了确定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S53家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可对所有蛋白酶类型进行确定，而不论其是天然或野生型蛋白酶，还是经基因工程改造或合成的蛋白酶。
S53肽酶家族包含酸起作用的内肽酶和三肽-肽酶。催化三联体的残基是Glu、Asp、Ser，并且在氧阴离子穴中存在一个另外的酸性残基Asp。这些残基的顺序是Glu、Asp、Asp、Ser。该Ser残基在枯草杆菌蛋白酶的Asp、His、Ser三联体中是等价于Ser的亲核体，并且该三联体的Glu是枯草杆菌蛋白酶中的广义碱基His的一个代替物。
该催化三联体或氧阴离子穴的任意氨基酸的突变将导致酶活性的变化和损失。来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(SEQ ID NO:5)的催化三联体和氧阴离子穴的氨基酸可能是位置Glu-85、Asp-89、Asp-175以及Ser-283。来自变色栓菌的S53蛋白酶1(SEQ ID NO:19)的催化三联体和氧阴离子穴的氨基酸可能是位置Glu-85、Asp-89、Asp-175以及Ser-283。来自变色栓菌的S53蛋白酶2(SEQ ID NO:24)的催化三联体和氧阴离子穴的氨基酸可能是位置Glu-85、Asp-89、Asp-175以及Ser-283。
该S53家族的肽酶倾向于在酸性pH下最有活性(不像同源的枯草杆菌蛋白酶)，并且这可归因于羧基残基(尤其Asp)在该氧阴离子穴中的功能的重要性。这些氨基酸序列不与家族S8中的那些(即，丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶和同系物)密切相似，并且这一点与完全不同的活性部位残基以及关于最大活性的所得的较低的pH一起，为该家族提供了实质性的差异。这个家族的成员的肽酶单元的蛋白质折叠与具有亲族类型SB的枯草杆菌蛋白酶的类似。
关于本发明，鉴定并克隆了在低pH(3-4)下对大豆-玉米粉具有高活性的来自大型亚灰树花菌的一种新S53蛋白酶。为了确定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S53家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可对所有蛋白酶类型进行确定，而不论其是天然发生或野生型蛋白酶，还是经基因工程改造或合成的蛋白酶。
本发明提供了具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明的蛋白酶是S53肽酶家族的丝氨酸蛋白酶。本发明的蛋白酶展现了pH特性，尤其是pH稳定性特性，这使它们作为用于在动物饲料中使用和其他应用的候选物具有实质性利益。
本发明的蛋白酶是对P1位置中的疏水性氨基酸残基(例如Leu、Tyr、Phe及Met)具有偏好的酸性蛋白酶。这些蛋白酶在从2-5的宽pH范围下对Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA和Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA具有活性，并在经受低至3的pH 2小时之后保持了多于95％的活性。
本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽具有至少84％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少83％序列一致性；
(c)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少85％序列一致性；
(d)一种多肽，该多肽由在高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列，
(iv)SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列，
(v)SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列，
(vi)SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列，
(vii)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的全长互补链；
(e)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少84％序列一致性的多核苷酸编码；
(f)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少83％序列一致性的多核苷酸编码；
(g)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列具有至少85％序列一致性的多核苷酸编码；
(h)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少86％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少88％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少89％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有100％序列一致性。
本发明涉及以下分离的多肽，这些分离的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少84％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不多于三十个氨基酸，例如相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十二个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少84％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少86％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少88％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少89％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有100％序列一致性。
本发明涉及以下分离的多肽，这些分离的多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少83％，例如至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽相差不多于三十个氨基酸，例如相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十二个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少86％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少88％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少89％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ IDNO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有100％序列一致性。
本发明涉及以下分离的多肽，这些分离的多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ IDNO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽相差不多于三十个氨基酸，例如相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十二个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
本发明还涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽具有至少60％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少60％序列一致性；
(c)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少60％序列一致性；
(d)一种多肽，该多肽由在中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列，
(iv)SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列，
(v)SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列，
(vi)SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列，
(vii)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的全长互补链；
(e)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码；
(f)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码；
(g)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码；
(h)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少75％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有100％序列一致性。
本发明涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不多于二十个氨基酸，例如相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少70％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少75％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少80％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的成熟多肽具有100％序列一致性。
本发明涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽相差不多于二十个氨基酸，例如相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少70％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少75％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少80％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种用于在动物饲料中使用的多肽或一种由多核苷酸编码的用于在动物饲料中使用的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽具有100％序列一致性。
本发明涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽相差不多于二十个氨基酸，例如相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
在一个具体实施例中，本发明还涉及一种用于制备动物饲料或饲料添加剂的方法，该方法包括制备一种动物饲料或饲料添加剂组合物，该组合物包括一种动物饲料和一种选自下组的蛋白酶，该组由以下各项组成：
(a)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽；
(b)SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽；
(c)SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽；
(d)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(e)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；以及
(f)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。
本发明还涉及一种动物饲料或饲料添加剂组合物，该组合物包含一种动物饲料和一种选自下组的蛋白酶，该组由以下各项组成：
(a)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽；
(b)SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽；
(c)SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽；
(d)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(e)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；以及
(f)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。
在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不多于二十个氨基酸，例如相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
在具体实施例中，这些动物饲料组合物可以处于丸状、糊状(mash)或液体组合物的形式，如在此进一步描述的。
本发明的多肽优选包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是从N-末端和/或C-末端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:5的多肽或由其组成。在另一个优选的方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至366或由其组成。
本发明的多肽优选包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:18的成熟多肽或其等位基因变体或由其组成；或是从N-末端和/或C-末端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面中，该多肽包括SEQID NO:19的多肽或由其组成。在另一个优选的方面中，该多肽包括SEQ ID NO:16的氨基酸1至366或由其组成。
本发明的多肽优选包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:23的成熟多肽或其等位基因变体或由其组成；或是从N-末端和/或C-末端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面中，该多肽包括SEQID NO:24的多肽或由其组成。在另一个优选的方面中，该多肽包括SEQ ID NO:21的氨基酸1至366或由其组成。
本发明还涉及具有蛋白酶活性的由以下多核苷酸编码的分离的多肽，这些多核苷酸在低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补链杂交(J.萨姆布鲁克(Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)和T.马尼亚蒂斯(Maniatis)，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
可以使用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24的氨基酸序列或SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽或其片段来设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆对来自不同属或种的菌株的具有蛋白酶活性的多肽进行编码的DNA。具体地说，这类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少14，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以筛选从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20或其子序列同源的克隆或DNA，优选将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交指示多核苷酸在非常低到非常高严谨度条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列、其全长互补链或其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针杂交的分子。
在一个方面中，该核酸探针是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列。在另一个方面中，该核酸探针是其片段。在另一个方面中，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个优选的方面中，该核酸探针是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，高至非常高严谨度条件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严谨度在25％甲酰胺中，对于中和中-高严谨度在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严谨度在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在65℃(高严谨度)和在70℃(非常高严谨度)使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针而言，严谨度条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390)的计算法所计算的Tm之下大约5℃至大约10℃，在每毫升0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特(Denhardt)溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后，将载体材料在所计算的Tm之下5℃至10℃，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤1次(持续15分钟)并且使用6X SSC洗涤2次(每次15分钟)。
本发明还涉及具有蛋白酶活性的由以下多核苷酸编码的分离的多肽，这些多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少84％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
本发明还涉及具有蛋白酶活性的由以下多核苷酸编码的分离的多肽，这些多核苷酸与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列具有至少83％，例如至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
本发明还涉及具有蛋白酶活性的由以下多核苷酸编码的分离的多肽，这些多核苷酸与SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及以下变体，这些变体在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或多个(或若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入，或其同源序列。氨基酸变化可以是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代、插入或缺失；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基；具有多达约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸标记或HQ标记、一种抗原表位或一种结合域。
在另一个实施例中，本发明涉及以下变体，这些变体在SEQ ID NO:19，或SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽的一个或多个(或若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入，或其同源序列。氨基酸变化可以是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代、插入或缺失；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基；具有多达约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸标记或HQ标记、一种抗原表位或一种结合域。
在另一个实施例中，本发明涉及以下变体，这些变体在SEQ ID NO:24，或SEQ IDNO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽的一个或多个(或若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入，或其同源序列。氨基酸变化可以是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代、插入或缺失；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基；具有多达约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸标记或HQ标记、一种抗原表位或一种结合域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。预期不会实质上改变特异性活性的最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
一种亲本多肽中的必需氨基酸可以根据本领域中已知的程序来鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，FEBS快报309:59-64。还可以从与亲本多肽相关的多肽的一致性分析推断必需氨基酸的一致性。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
本发明还涉及具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少84％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的变体多肽，这些变体多肽包括SEQ ID NO:5、SEQID NO:6，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或其同源序列的至少一个或多个(若干个)氨基酸的至少一个取代、缺失和/或插入。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少85％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少86％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少87％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少88％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少89％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少90％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少91％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少92％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少93％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少94％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少95％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少96％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少97％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少98％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少99％序列一致性。
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的成熟多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是不多于20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。
本发明还涉及具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:19，或SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:18的成熟多肽具有至少83％，例如至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的变体多肽，这些变体多肽包括SEQ ID NO:19，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽或其同源序列的至少一个或多个(若干个)氨基酸的至少一个取代、缺失和/或插入。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少84％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少85％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少86％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少87％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少88％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少89％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少90％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少91％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少92％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少93％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少94％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少95％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少96％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少97％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少98％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:19具有至少99％序列一致性。
SEQ ID NO:19的成熟多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是不多于20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。
本发明还涉及具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:24，或SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:23的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的变体多肽，这些变体多肽包括SEQ ID NO:24，或SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的成熟多肽或其同源序列的至少一个或多个(若干个)氨基酸的至少一个取代、缺失和/或插入。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少86％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少87％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少88％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少89％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少90％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少91％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少92％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少93％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少94％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少95％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少96％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少97％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少98％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:24具有至少99％序列一致性。
SEQ ID NO:24的成熟多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是不多于20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合蛋白还可以使用内含肽技术构建，其中融合在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug Discovery World)4:35-48。
该多肽可以由包含对于His标记或HQ标记进行编码的重组DNA序列来表达，以在任意翻译后修饰之后给出包含该His标记或HQ标记的全部或部分的成熟多肽。该HQ标记(具有序列–RHQHQHQ)可以在该翻译后修饰过程中完全或部分切割掉，得到例如另外的氨基酸-附接至该成熟多肽的C-末端的RHQHQ。
在翻译后修饰过程中，碳水化合物分子通常附接至来自真菌来源的多肽上。为了协助质谱分析，可以将该多肽与内切糖苷酶一起孵育，以将每个N-连接的位置去糖基化。对于每个去糖基化的N-连接位点，在蛋白质骨架上剩余一个N-乙酰己糖胺。
实施例
在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了有益的热特性如热稳定性、蒸汽稳定性等，和/或pH特性如酸稳定性、pH最佳值等。
本发明的一个实施例是与蛋白酶10R相比，在25℃下，在pH 2与5之间，例如在pH 2与4之间，优选在pH 3与5之间，或更优选在pH 3与4之间具有改进的蛋白酶活性的分离的多肽。
本发明的一个另外的实施例是与蛋白酶10R相比，在例如60℃或以下，优选50℃或以下，更优选37℃或以下；在25℃与60℃之间，优选在25℃与50℃之间；或在25℃下或在37℃下具有改进的蛋白酶活性的分离的多肽。
本发明的一个另外的实施例是与蛋白酶10R相比，在40℃下，在pH 3.0与4.0之间，对大豆-玉米粉的改进的蛋白酶活性。
本发明的另一个实施例是当与无蛋白酶处理的空白样品相比时和当与用蛋白酶10R处理的样品相比时，在3或1小时孵育后，随着嗉囊和/或砂囊消化物中的伯胺水平的增加，对表达的肉仔鸡消化物的改进的蛋白水解活性。
酸度/碱度特性
在本发明的某些实施例中，就pH而言，本发明的蛋白酶展现了有益的特性，例如酸稳定性、pH最佳值等。该蛋白酶在较低的pH下的稳定性是有益的，因为在穿过胃之后，该蛋白酶在肠中可以具有活性。在本发明的一个实施例中，该蛋白酶在pH 3下2小时之后保留>70％的活性，例如>95％的活性，如使用实例3中所述的方法确定的。
温度-活性
可如在实例3中所述的确定该蛋白酶的温度-活性曲线。在低温度(30℃-40℃)下的活性对于在动物中蛋白的消化可以是有利的。
在一个实施例中，本发明包含一种蛋白酶，当与在50℃下的蛋白酶的活性(对比实例3)相比时，该蛋白酶具有在25℃下0.20或更高的相对活性，或在37℃下0.50或更高的相对活性的pH 4.0下的温度活性曲线。
热稳定性
可如在实例6中所述的确定热稳定性，即使用DSC测量来确定经纯化的蛋白酶蛋白的变性温度(Td)。Td指示了该蛋白的热稳定性：Td越高，热稳定性越高。因此，在一个优选的实施例中，本发明的蛋白酶具有一个Td，该Td高于参照蛋白酶的Td，其中Td是针对经纯化的蛋白酶样品(优选地具有至少90％或95％的纯度，如通过SDS-PAGE确定的)来确定的。
在优选实施例中，如通过残余活性，变性温度Td所提供的这些热特性(例如加热稳定性、温度稳定性、热稳定性、蒸汽稳定性和/或造丸稳定性)，或本发明的蛋白酶的其他参数高于SEQ ID NO:6的蛋白酶的相应的值(如残余活性或Td)，更优选地是其至少101％，或者是其至少102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、或至少110％。甚至更优选地，本发明的蛋白酶的参数(如残余活性或Td)的值是SEQ ID NO:6的蛋白酶的值的至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、或至少190％。
在优选实施例中，如通过残余活性，变性温度Td所提供的这些热特性(例如加热稳定性、温度稳定性、热稳定性、蒸汽稳定性和/或造丸稳定性)，或本发明的蛋白酶的其他参数高于SEQ ID NO:19的蛋白酶的相应的值(如残余活性或Td)，更优选地是其至少101％，或者是其至少102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、或至少110％。甚至更优选地，本发明的蛋白酶的参数(如残余活性或Td)的值是SEQ ID NO:19的蛋白酶的值的至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、或至少190％。
在优选实施例中，如通过残余活性，变性温度Td所提供的这些热特性(例如加热稳定性、温度稳定性、热稳定性、蒸汽稳定性和/或造丸稳定性)，或本发明的蛋白酶的其他参数高于SEQ ID NO:24的蛋白酶的相应的值(如残余活性或Td)，更优选地是其至少101％，或者是其至少102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、或至少110％。甚至更优选地，本发明的蛋白酶的参数(如残余活性或Td)的值是SEQ ID NO:24的蛋白酶的值的至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、或至少190％。
在仍另外的具体实施例中，本发明的热稳定的蛋白酶具有至少50℃的熔化温度Tm(或变性温度Td)，如通过在实例10(即在20mM乙酸钠，pH值4.0)中所述的差示扫描量热法(DSC)所确定的。在仍另外的具体实施例中，该Tm是至少51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或至少100℃。
蒸汽稳定性
蒸汽稳定性可以如在实例7中所述的，通过确定在85℃或90℃下蒸汽处理一个短的时间之后蛋白酶分子的残余活性来确定。
造丸稳定性
造丸稳定性可如在实例8中所述的，通过使用与饲料预混合的酶颗粒来确定。由该混合器用蒸汽将该饲料调节至95℃。在调节之后，将该饲料加压成丸并确定残余活性。
具有蛋白酶活性的多肽的来源
可以从任何属的真菌获得本发明的具有蛋白酶活性的多肽。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
该多肽可以是一种真菌多肽。例如，该多肽可以是来自如担子菌门内的具有蛋白酶活性的多肽。在一个方面中，该多肽是来自伞菌纲(Agaricomycetes)的真菌的蛋白酶，例如来自多孔菌目，或来自革菌科(Coriolaceae)，或来自亚灰树花菌属(Meripilus)或来自栓菌属。
将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些分类单元的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook(萨姆布鲁克)等人，1989，同上)。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸。
用来分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。来自此类基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从芽孢杆菌属的一种菌株或来自芽孢杆菌目的另一种或相关生物中克隆多核苷酸，并且因此，例如可以是多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种变体。
本发明还涉及与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少84％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性程度的多核苷酸或由其组成的分离的多核苷酸，这些分离的多核苷酸编码具有蛋白酶活性的多肽。
本发明还涉及与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列具有至少83％，例如至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性程度的多核苷酸或由其组成的分离的多核苷酸，这些分离的多核苷酸编码具有蛋白酶活性的多肽。
本发明还涉及与SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性程度的多核苷酸或由其组成的分离的多核苷酸，这些分离的多核苷酸编码具有蛋白酶活性的多肽。
修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与该多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语“基本上类似于”该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。该变体可以基于以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，这些多核苷酸在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)包括SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或其等位基因变体及子序列杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)，如在此所定义。
在一个方面中，该多核苷酸包括SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或SEQ ID NO:1的子序列或由其组成，该多核苷酸编码具有蛋白酶活性的SEQ ID NO:2的一个片段，例如SEQ ID NO:1的核苷酸605至1702的多核苷酸。
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，这些多核苷酸在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列、(ii)包括SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或其等位基因变体及子序列杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)，如在此所定义。
在一个方面中，该多核苷酸包括SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列或SEQ ID NO:15的子序列或由其组成，该多核苷酸编码具有蛋白酶活性的SEQ ID NO:16的一个片段，例如SEQ ID NO:15的核苷酸1207至1353、核苷酸1412至1522、核苷酸1577至1776、核苷酸1832至1969、核苷酸2031至2478以及核苷酸2531至2584的结合序列。
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，这些多核苷酸在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列、(ii)包括SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或其等位基因变体及子序列杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)，如在此所定义。
在一个方面中，该多核苷酸包括SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列或SEQ ID NO:20的子序列或由其组成，该多核苷酸编码具有蛋白酶活性的SEQ ID NO:21的一个片段，例如SEQ ID NO:20的核苷酸1206至1352、核苷酸1414至1524、核苷酸1580至1779、核苷酸1833至1970、核苷酸2032至2479以及核苷酸2532至2585的结合序列。核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个(若干个)控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个(若干个)控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子序列，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。启动子序列包括介导多肽表达的转录控制序列。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从以下基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢达莉亚(Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢奎恩(Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶、以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，包含曲霉中一种编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由来自曲霉中一种编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包含修饰的启动子，包含来自黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由来自构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导子替代)；及其突变的、截短的、以及杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的合适转录终止子序列。终止子序列与编码多肽的多核苷酸的3’-末端可操作地连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。
有用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中描述。
控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’-末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外来信号肽编码序列。可替代地，外来信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、枯草芽孢杆菌prsA以及迟缓芽孢杆菌。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在多肽的N-末端处信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。
也可能令人希望的是添加调控序列，该调控序列允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达。调节系统的实例是引起将响应于化学或物理刺激(包含调节性化合物的存在)而开启或关闭的基因表达的那些系统。原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包含一个或多个(若干个)合宜的限制性位点以允许在这样的位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可替代地，通过将该多核苷酸或者包括该序列的核酸构建体插入到用于表达的适当载体中可以表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
载体优选地包含允许便于选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等的一个或多个(若干个)选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883披露的方法完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括与指导本发明多肽产生的一个或多个(若干个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌菌、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及变铅青链霉菌细胞。
例如，将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、通过使用感受态细胞(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、通过电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者通过接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169:5271-5278)来实现。例如，将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。例如，将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过原生质体转化和电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、通过接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或通过转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)来实现。例如，将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或通过接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)来实现。例如，将DNA引入链球菌属细胞中可以通过天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、通过原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、通过电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者通过接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)来实现。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安-倍氏菌物辞典(Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际CAB，大学出版社，剑桥(Cambridge)，英国中所定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如在霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文，第171页中所引用的)和所有有丝分裂孢子真菌(霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，出于本发明的目的，酵母应如在酵母生物学与活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)，F.A.，帕斯莫尔(Passmore)，S.M.和达文波特(Davenport)，R.R.编著，应用细菌学研讨会系列第9期(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所述进行定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginose)、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。特别优选的宿主细胞是米曲霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474中描述。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：(a)培养细胞，该细胞以其野生型形式在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；以及(b)回收该多肽。在优选的方面，细胞属于芽孢杆菌属。在一个更优选方面，该细胞是芽孢杆菌-19138。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及(b)回收该多肽。
使用本领域熟知的方法，在适合产生该多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，以及在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
以下的“核酸构建体、表达载体、重组宿主细胞和用于生产蛋白酶的方法”节段中提供了更多的细节。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法可包括使用特异抗体、形成酶产物、或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可以通过常规程序，包括但不局限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀，从营养培养基中回收该多肽。
可以通过本领域已知的多种方法纯化该多肽，该方法包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，蛋白纯化(Protein Purification)，编者J.-C.詹森(Janson)和拉尔斯赖登(Lars Ryden)，VCH出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的多肽。
在一个可替代的方面中，不回收多肽，而是使用表达多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。
植物
本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分、或植物细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生该多肽。该多肽可以从植物或植物部分回收。可替代地，可以按原样将包含该多肽的植物或植物部分用于改善食品或饲料的质量，例如，改善营养价值、适口性、以及流变性质，或用以破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆和大豆)、以及十字花科植物(十字花科)(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉层和种皮。
同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
表达多肽的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码多肽的一个或多个(若干个)表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体宜为包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调控序列可操作地连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的宿主细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
例如，调控序列(如启动子和终止子序列以及任选地信号或转运序列)的选择基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码多肽的基因的表达可以是组成型的或可诱导型的，或可以为发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，例如种子或叶。调控序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(PlantPhysiology)86:506描述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、和稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如：来自贮藏库组织(storage sink tissue)(如种子、马铃薯块茎、以及果实)(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi)，1990，遗传学年度综述(Ann.Rev.Genet.)24:275-303)、或代谢库组织(metabolic sink tissue)(如分生组织)的启动子(伊托(Ito)等人，1994，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)24:863-878)；种子特异性启动子，如来自稻的谷蛋白、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)、或白蛋白启动子(吴(Wu)等人，1998，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)39:885-889)；来自豆球蛋白B4和来自蚕豆的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(康拉德(Conrad)等人，1998，植物生理学杂志(J.Plant Physiol.)152:708-711)；来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人，1998，植物细胞生理学39:935-941)；来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子、或本技术领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(Plant Physiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，该启动子可以通过非生物处理是可诱导的，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现多肽在植物中的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码多肽的多核苷酸之间的内含子。例如，许(Xu)等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(加塞尔(Gasser)等人，1990，科学(Science)244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术(Bio/Technology)8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然(Nature)338:274)。
目前，根癌农杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物的所选方法(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)19:15-38)，并且还可被用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其他的转化方法。目前，用于产生转基因单子叶植物的所选方法是粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(Plant J.)2:275-281；岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术(Bio/Technology)10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由奥米儒勒(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学21:415-428所描述。根据本披露使用的另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204中所述的那些(这二者都通过引用以其全文结合在此)。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化株，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可以通过将具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可以将编码多肽的构建体通过杂交引入具体植物品种，而根本无需直接转化那个给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。这种后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体或根据本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例进一步明确表达于美国专利号7,151,204中。
植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包含：(a)在有益于产生多肽的条件下，培养包括编码该多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；并且(b)回收该多肽。
组合物
本发明还涉及包括本发明的蛋白酶的组合物。优选地，这些组合物富集了这样一种蛋白酶。术语“富集”指示该组合物的蛋白酶活性已经增加，例如，以至少1.1的一个富集因子。
在一个方面中，该组合物包括具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽具有至少60％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少60％序列一致性；
(c)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少60％序列一致性；
(d)一种多肽，该多肽由在中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列，
(iv)SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列，
(v)SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列，
(vi)SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列，
(vii)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的全长互补链；
(e)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少84％序列一致性的多核苷酸编码；
(f)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少83％序列一致性的多核苷酸编码；
(g)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列具有至少85％序列一致性的多核苷酸编码；
(h)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少75％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有100％序列一致性。
在一个方面中，该组合物包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面中，该组合物包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或由其组成。在一个另外的方面中，该组合物包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多肽或由其组成。在另一个方面中，该组合物包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至366、SEQ ID NO:4的氨基酸1至366、SEQ ID NO:5的氨基酸1至366或SEQ ID NO:6的氨基酸1至366或由其组成。
在一个实施例中，包括SEQ ID NO:3的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的该变体与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少70％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少75％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少80％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有100％序列一致性。
在一个方面中，该组合物包括SEQ ID NO:19，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面中，该组合物包括SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽或由其组成。在一个另外的方面，该组合物包括SEQ ID NO:19的多肽或由其组成。在另一个方面，该组合物包括SEQ ID NO:16的氨基酸1至366、SEQ ID NO:18的氨基酸1至366或SEQ ID NO:19的氨基酸1至366或由其组成。
在一个实施例中，包括SEQ ID NO:19的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的该变体与SEQ ID NO:19，或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少75％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少80％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包括一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:24的多肽，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有100％序列一致性。
在一个方面中，该组合物包括SEQ ID NO:24，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面中，该组合物包括SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽或由其组成。在一个另外的方面，该组合物包括SEQ ID NO:24的多肽或由其组成。在另一个方面，该组合物包括SEQ ID NO:21的氨基酸1至366、SEQ ID NO:23的氨基酸1至366或SEQ ID NO:24的氨基酸1至366或由其组成。
在一个实施例中，包括SEQ ID NO:24的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的该变体与SEQ ID NO:24，或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列一致性。
在一个优选实施例中，该组合物是一种动物饲料组合物，该动物饲料组合物进一步包括一种或多种淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、β-葡聚糖酶、或其任何混合物。
在另一个优选实施例中，该组合物是一种动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂进一步包括至少一种脂-溶性维生素和/或至少一种水-溶性维生素和/或至少一种痕量矿物质。该动物饲料添加剂可以进一步包括一种或多种淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、β-葡聚糖酶、或其任何混合物。
该组合物可以包括本发明的蛋白酶作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。可以例如通过微生物(如细菌或真菌)或通过植物或通过动物产生另外的一种或多种酶。这些组合物可以根据本领域已知的方法制备并且可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。该蛋白酶可以根据本领域中已知的方法稳定化。
用途
本发明还针对用于使用具有蛋白酶活性的多肽或其组合物，例如用于动物饲料的方法。
在动物饲料中的用途
本发明还针对在动物饲料中使用具有蛋白酶活性的蛋白酶的方法，以及包含本发明蛋白酶的饲料组合物和饲料添加剂。
术语动物包括所有动物。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如，动物，如绵羊、山羊、和牛，例如，肉牛、奶牛和牛犊。在具体实施例中，动物为非反刍动物。非-反当动物包含单胃动物，如猪(pig或swine)(包括但不限于小猪、生长中的猪和大母猪)；家禽，如火鸡，鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡、蛋鸡)；马(包括但不限于热血动物、冷血动物和温血动物)，小牛；和鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；以及甲壳类动物(包括但不限于河虾和对虾)。
术语饲料或饲料组合物意指适于或者意在由动物摄入的任何化合物、制剂、混合物或组合物。
在根据本发明的用途中，可在饮食之前，之后或同时给动物饲喂蛋白酶。优选后者。
在一个具体实施例中，明确限定了处于向饲料中添加的蛋白酶或当被包括在饲料添加剂中时的形式的蛋白酶-。明确限定指的是如经大小排阻色谱法(参见WO 01/58275的实例12)测定的，蛋白酶制品至少为50％纯。在其他具体实施例中，如经此方法测定的，蛋白酶制剂至少为60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％、或至少为95％纯。
明确限定的蛋白酶制剂是有利的。例如，对于实质上不受其他蛋白酶干扰或污染的蛋白酶而言，更容易确定它在饲料中的正确剂量。术语正确剂量具体指得到一致和恒定的结果的目标，和基于所希望的效果能够优化剂量。
然而，为了在动物饲料中使用，蛋白酶不必那么纯；它可以例如包含其他酶，此时可将其称为蛋白酶制剂。
该蛋白酶制剂可以(a)直接加入饲料(或者直接用于蛋白处理过程)，或者(b)它可以用于一种或多种随后加入饲料(或者用于处理过程中)的中间组合物，如饲料添加剂或者预混合物的生产。不论是否根据上述(a)或(b)来使用，上文所述的纯度指的都是原始蛋白酶制剂的纯度。
具体地说，使用重组生产方法即可获得纯度为上述数量级的蛋白酶制剂，然而，当通过传统的发酵方法生产蛋白酶时，要想获得这些蛋白酶制剂却并非易事，而且，批次与批次之间会有较高的差异。
此类蛋白酶制剂当然可以与其他酶混合。
该蛋白可以是一种动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉；或者他可以是一种植物性蛋白。
本文所用术语植物性蛋白指的是包含至少一种衍生自或源自植物的蛋白，包含修饰的蛋白和蛋白衍生物的任何化合物，组合物，制品或混合物。在具体实施例中，这些植物性蛋白的蛋白含量至少为10％、20％、30％、40％、50％或60％(w/w)。
植物性蛋白可以衍生自植物性蛋白来源，如豆类和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)，十字花科，藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉，羽扇豆粉和油菜籽粉。
在具体实施例中，植物性蛋白来源是得自蝶形花科的一种或多种植物，如大豆，羽扇豆，豌豆或蚕豆的材料。
在另一个具体实施例中，植物性蛋白来源是得自藜科的一种或多种植物，如甜菜，糖甜菜，菠菜或奎奴亚藜的材料。
植物性蛋白来源的其他实例为油菜籽、向日蔡籽、棉籽和卷心菜。
大豆为优选的植物性蛋白来源。
植物性蛋白来源的其他实例为谷类，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦和高粱。
在处理过程的具体实施例中，所讨论的这种或这些种蛋白酶影响这些蛋白如植物性蛋白或蛋白来源(或对其发挥作用或施加水解或降解影响)。为了达到此目的，一般将蛋白或蛋白来源悬浮于溶剂，例如含水溶剂，如水中，并适当关注所讨论的酶的特征，以调节pH和温度值。例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的pH值下进行处理。类似地，例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的温度下进行处理。上述活性百分比指示是相对于最大活性而言的。持续进行酶促反应直至获得所需结果，然后可以通过例如热-处理步骤灭活酶来终止反应，或者也可以不终止反应。
在本发明处理过程的另一个具体实施例中，蛋白酶作用被维持，这意味着例如将蛋白酶加入这些蛋白，但其水解影响可以说尚未开启，直到后来当有此需求时，一旦建立了适当的水解条件，或一旦灭活了任何酶抑制剂，或不论使用何种其他方式延迟了酶的作用，才会开启其水解影响。
在一个实施例中，处理是预-处理动物饲料或用于动物饲料的蛋白，即这些蛋白是在摄入之前被水解的。
术语改善动物饲料的营养价值指的是提高饲料中的营养的可利用性。在本发明中，改善营养价值具体指的是改善饲料的蛋白部分的可利用性，从而导致蛋白提取的增加，较高的蛋白产量，和/或蛋白利用的改善。当饲料的营养价值增加时，蛋白和/或氨基酸消化率增加，并且该动物的生长速率和/或体重增加量和/或饲料转化(即相对于体重增加的饲料摄取量)可被改善。
能以任何形式将蛋白酶添加至饲料中，如它是相对纯的蛋白酶，或与欲添加至动物饲料的其他组分的混合物，即以动物饲料添加剂的形式，例如所谓的动物饲料预混物。
在另一方面，本发明涉及用于动物饲料的组合物，如动物饲料和动物饲料添加剂，如预混合物。
除本发明的蛋白酶外,本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素和/或至少一种水溶性维生素和/或至少一种微量矿物质和/或至少一种大量矿物质。
另外，可任选的，饲料添加成分是着色剂例如类胡萝卜素如β-胡萝卜素、虾青素、和叶黄素；稳定剂；生长改善添加剂和芳香化合物/调味品，例如甲氧甲酚，茴香脑，十-、十一-和/或十二-内酯，紫罗酮、鸢尾酮、姜辣素、哌啶、亚丙基苯酞、亚丁基苯酞、辣椒素和/或丹宁酸；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸(PUFA)；活性氧生产种类；另外，可以使用一种支持物，其可包含例如按重量计40％-50％的木质纤维、按重量计8％-10％的硬脂酸、按重量计4％-5％的姜黄粉、按重量计4％-58％的迷迭香粉、按重量计22％-28％的石灰岩、按重量计1％-3％的树胶如阿拉伯树胶、按重量计5％-50％的糖和/或淀粉以及按重量计5％-15％的水。
本发明的一种饲料或饲料添加剂还可包含选自以下各项之中的至少一种其他的酶：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；另外的蛋白酶(EC 3.4)；磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶如，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；溶菌酶(EC 3.2.1.17)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
在一个具体实施例中，本发明的饲料或饲料添加剂还包括一种植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)。
在一个具体实施例中，本发明的饲料或饲料添加剂还包括一种木聚糖酶(EC3.2.1.8)。
本发明的饲料或饲料添加剂还可以包括至少一种益生菌或直接饲喂微生物(DFM)，该益生菌或直接饲喂微生物任选地与选自以下各项之中的一种或多种其他的酶一起：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；另外的蛋白酶(EC 3.4)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，例如，像α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
该直接饲喂微生物可以是一种来自以下属的一种或多种的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉杆菌属、丙酸菌属、双歧杆菌属、梭菌属以及巨球形菌属或其任何组合，优选来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、屎肠球菌、肠球菌属、以及片球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、嗜酸乳杆菌、嗜酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis ssp.animalis)、路氏乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius ssp.salivarius)、埃氏巨球形菌、丙酸杆菌属并且更优选来自以下枯草芽孢杆菌菌株3A-P4(PTA-6506)；15A-P4(PTA-6507)；22C-P1(PTA-6508)；2084(NRRLB-500130)；LSSA01(NRRL-B-50104)；BS27(NRRL B-50105)；BS18(NRRL B-50633)；以及BS 278(NRRL B-50634)。
在具体实施例中，这些其他酶被明确定义(如上对蛋白酶制剂定义的)。
抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、林可霉素(Leucocin)A、Tritrpticin、Protegrin-1、死亡素(Thanatin)、防卫肽、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽、和Ovispirin如Novispirin(罗伯特·莱勒(Robert Lehrer)，2000)、菌丝霉素(Plectasins)以及他汀类，包含在WO 03/044049和WO 03/048148中所披露的化合物和多肽，以及以上的保留了抗微生物活性的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的肽，连同其保留了抗真菌活性的变体和片段，如在WO 94/01459和WO 02/090384中披露的。
多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚麻酸。
产生活性氧的种类的实例为化学品，如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；和酶，如氧化酶、加氧酶或合成酶。
通常，脂溶性和水溶性维生素，以及微量矿物质形成部分所谓的意在加入饲料中的预混合物，而大量矿物质通常单独加入饲料。这些组合物的任一个类型，当富含于本发明的蛋白酶时，都是本发明的动物饲料添加剂。
在具体实施例中，本发明的动物饲料添加剂以0.01％至10.0％，更具体0.05％至5.0％或0.2％至1.0％(％指g添加剂/100g饲料)的水平包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中。具体地说，对预混物也是如此。
下文列出了这些组分的非-排他性实例：
脂-溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E、以及维生素K，例如维生素K3。
水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如Ca-D-泛酸盐。
痕量矿物质的实例为锰、锌、铁、铜、碘、硒以及钴。
大量矿物质的实例为钙、磷和钠。
这些组分的营养需求(以家禽和小猪/猪举例)列于WO 01/58275中的表A中。营养需求意指应在饮食中以所示浓度提供这些组分。
在可替代的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275中的表A所详细说明的单个组分中的至少一种。至少一种意指一种或两种或三种或四种等直至所有十三种，或直至所有十五种单个组分中的任一种，一种或多种。更具体地，本发明的添加剂包含该至少一种单个组分，其含量能使其在饲料中的浓度落入表A第4或第5或第6栏所示的范围。
在仍另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含以下维生素中的至少一种，优选地以在下表1中所详细说明的饲料内浓度范围提供(分别对于小猪饮食和肉仔鸡饮食)。
表1：典型的维生素建议
本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白含量。家禽和猪饮食的特征如WO 01/58275，表B第2-3栏所示。鱼食可被表征为该表B第4栏中所指示的。此外，此类鱼食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
WO 01/58275对应于US 09/779334，将其通过引用而特此结合。
根据本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且此外还包括至少一种如在此所要求的蛋白酶。
此外，或替代地(对于以上所示的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在具体实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量落入WO 01/58275，表B，范围2、3、4或5中的任何一个中(R.2-5)。
粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)X 6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定氮含量(A.O.A.C.，1984，官方分析方法(Official Methodsof Analysis)第14版，官方分析化学家集(Association of Official AnalyticalChemists)，华盛顿特区)。
可代谢能的计算是基于下述文献的：NRC公布的猪的营养需求，第九修订版1988，猪营养小组委员会，动物营养委员会，农业委员会，国家研究委员会，国家学术出版社(National Academy Press)，华盛顿特区(Washington，D.C.)，第2-6页，以及欧洲家禽饲料能量值表，Spelderholt centre for poultry research and extension，7361，DA比克波登，荷兰，Grafisch bedrijf Ponsen&looijen BV，瓦赫宁根，国际标准书号90-71463-12-5。
完整的动物食料中钙、有效磷和氨基酸的饮食含量根据如Veevoedertable 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde wanvoedermiddelen，Central Veevoederbureau，Runderweg 6,8219pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7计算。
在一个具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含如上定义的至少一种植物性蛋白。
本发明的动物饲料组合物还可以包含动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉，通常量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可以包括具有可溶物的干酒糟(DriedDistillers Grains)，典型地量为0-30％。
在另一具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％的大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-25％的鱼粉；和/或0-25％的肉和骨粉；和/或0-20％的乳清。
可将动物饮食制备成例如糊状饲料(非丸状)或丸状饲料。通常，混合研磨的饲料并根据所讨论的这些种类的说明加入必需维生素和矿物质的足够量。以固体或液体酶配制品的形式加入酶。例如，对于糊状饲料，在成分混合步骤前或期间可加入固体或液体酶配制品。对于丸状饲料，在饲料成分步骤前或期间还可加入该(固体或液体)蛋白酶/酶制剂。典型地，在造丸步骤之后加入一种液体蛋白酶/酶制剂。也可以将酶掺入饲料添加剂或预混物。
饮食中最终的酶浓度范围为0.01-200mg酶蛋白/kg饮食，例如在0.5-25mg酶蛋白/kg动物饮食的范围内。
当然，应该以有效量，即足以改善饲料的水解、消化性和/或改善营养价值的量使用该蛋白酶。目前期望以下述量(剂量范围)中的一种或多种施用酶：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50或0.10-10，所有这些范围都是每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数(ppm)。
为了测定每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数，从饲料组合物中纯化蛋白酶，并且使用相关试验(参见蛋白酶活性，底物和试验)测定经纯化的蛋白酶的比活性。使用相同试验测定该饲料组合物的蛋白酶活性，并且在这两次测定的基础上计算出以每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数计的剂量。
使用相同的原理测定饲料添加剂中的蛋白酶蛋白mg数。当然，如果可获得制备饲料添加剂或饲料所用蛋白酶的样品，可由该样品测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化蛋白酶)。
核酸构建体、表达载体、重组宿主细胞和用于生产蛋白酶的方法
本发明还涉及包含编码本发明的蛋白酶的这类多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。
本发明还涉及产生蛋白酶的方法，该方法包括：(a)对包括这种多核苷酸的重组宿主细胞进行培养；并且(b)回收该蛋白质。
该蛋白质对于宿主细胞来说可以是原生的或异源的。术语“蛋白”在此并不是指特定长度的编码产物并且，因此，包含肽、寡肽和蛋白。术语“蛋白质”还涵盖组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。
优选地，该蛋白是一种蛋白酶。例如，该蛋白可以是一种水解酶，例如蛋白水解酶或蛋白酶。
该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
材料与方法
培养基
DAP4C-1培养基由以下构成：0.5g酵母提取物、10g麦芽糖、20g右旋糖、11g硫酸镁七水合物、1g磷酸氢二钾、2g一水合柠檬酸、5.2g磷酸钾三元一水化物、1ml Dowfax 63N10(消泡剂)、2.5g碳酸钙，补充以1ml KU6金属溶液以及补足至1000ml的去离子水。
KU6金属溶液由以下构成：6.8g ZnCl2、2.5g CuSO4.5H2O、0.13gNiCl2、13.9gFeSO4.7H2O、8.45g MnSO4.H2O、3g C6H8O7.H2O以及补足至1000ml的去离子水。
LB板由以下构成：10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-tryptone)、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂及补足至1000ml的去离子水。
LB培养基由以下构成：10g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物及10g的氯化钠，以及补足至1000ml的去离子水。
COVE-蔗糖-T板由以下构成：342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液以及补足至1000ml的去离子水。该培养基通过在15psi下高压灭菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册(Bacteriological Analytical Manual)，第8版，修订A，1998)。将该培养基冷却至60℃并且添加10mM乙酰胺、以及TritonX-100(50μl/500ml)。
COVE-N-琼脂管由以下构成：218g山梨糖醇、10g右旋糖、2.02g KNO3、25g琼脂、50ml Cove盐溶液以及补足至1000ml的去离子水。
COVE盐溶液由以下构成：26g的MgSO4·7H2O、26g的KCl、26g的KH2PO4、50ml的COVE痕量金属溶液以及补足至1000ml的去离子水。
COVE痕量金属溶液由以下构成：0.04g的Na2B4O7·10H2O、0.4g的CuSO4·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、0.7g的MnSO4·H2O、0.8g的Na2MoO4·2H2O、10g的ZnSO4·7H2O以及补足至1000ml的去离子水。
蛋白酶测定法
动力学Suc-AAPF-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1400)。
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、及11.0。
将20μl蛋白酶样品(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解于1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
端点Suc-AAPF-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨L-1400)。
温度：受控的(分析温度)。
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％Triton X-100，pH 4.0
将200μl pNA底物(50mg，溶解于1.0ml DMSO中，并进一步地用测定缓冲液稀释45倍)吸取进艾本德离心管(Eppendorf tube)中并放置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释于0.01％Triton X-100中)。通过将艾本德离心管转移至设定为测定温度的艾本德恒温混匀仪(Eppendorf thermomixer)来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm.)下孵育15分钟。通过将该管转移回冰浴中并且添加600μl 500mM H3BO3/NaOH，pH9.7来终止孵育。将该管混合并且将200μl混合物转移至微量滴定板，将其在OD405下读数。在该测定法中包括空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。OD405(样品)–OD405(空白)是蛋白酶活性的量度。
Protazyme AK测定：
底物：Protazyme AK片(交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司(Megazyme))
温度：受控的(分析温度)。
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％Triton X-100，pH 6.5。
通过温和搅拌，将一片Protazyme AK悬浮于中2.0ml 0.01％Triton X-100中。将500μl的这种悬液和500μl的分析缓冲液分散在微量离心管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释于0.01％Triton X-100中)。通过将艾本德离心管转移至设定为测定温度的艾本德恒温混匀仪(Eppendorf thermomixer)来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm.)下孵育15分钟。通过转移该管返回至冰浴停止孵育。随后将该管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板，将其在OD650下读数。在该测定法中包括空白缓冲液(代替酶)。OD650(样品)–OD650(空白)是蛋白酶活性的量度。
动力学Suc-AAPX-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPA-pNA(瑞士巴亨L-1775)
Suc-AAPR-pNA(瑞士巴亨L-1720)
Suc-AAPD-pNA(瑞士巴亨L-1835)
Suc-AAPI-pNA(瑞士巴亨L-1790)
Suc-AAPM-pNA(瑞士巴亨L-1395)
Suc-AAPV-pNA(瑞士巴亨L-1770)
Suc-AAPL-pNA(瑞士巴亨L-1390)
Suc-AAPE-pNA(瑞士巴亨L-1710)
Suc-AAPK-pNA(瑞士巴亨L-1725)
Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨L-1400)
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 4.0或pH 9.0。
将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解于1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
邻苯二甲醛(OPA)测定法：
这一测定检测伯胺并且因此可以将肽键由一种蛋白酶的切割测量为蛋白酶处理的样品与对照样品之间的吸光度的差异。基本上根据尼尔森(Nielsen)等人(尼尔森(Nielsen)，PM，彼得森(Petersen)，D，达姆麦妮(Dampmann)，C.用于确定食物蛋白水解程度的改进方法(Improved method for determining food protein degree ofhydrolysis)，食品科学杂志(J Food Sci)，2001，66:642-646)进行该测定。
将500μl样品通过100kDa微量浓缩(Microcon)离心过滤器(60min，11,000rpm，5℃)过滤。将这些样品在去离子水中稀释大约(例如10倍、50倍或100倍)，并将25μL的每份样品装载到96孔微量滴定板中(5个重复)。将200μl OPA试剂(100mM四硼酸二钠十水合物，3.5mM十二烷基硫酸钠(SDS)，5.7mM二硫苏糖醇(DDT)，6mM邻苯二甲醛)分配在所有孔中，振荡该板(10sec，750rpm)并且在340nm下测量吸光度。
菌株
菌株大型亚灰树花菌由诺维信公司(Novozymes)于1993年分离自收集于丹麦的子实体。
将通过ITS(内转录间隔区测序)鉴定的内部(in-house)变色栓菌对比种菌株用作蛋白酶基因SEQ ID NO:15的来源。
将由加拿大基因组(Genome Canada)(www.fungalgenomics.ca)测序的第二种变色栓菌菌株用于鉴定蛋白酶基因SEQ ID NO:20。
将购自英杰公司(Invitrogen)(美国生命技术公司(Life Technologies)，卡尔巴斯德，加利福利亚州，美国)的大肠杆菌Top-10菌株用于繁殖表达载体。
将米曲霉MT3568菌株用于编码与具有蛋白酶活性的多肽具有同源性的多肽的基因的异源表达。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO2002/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)修复pyrG营养缺陷体。
实例1：来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(SEQ ID NO:3)的重组表达
为了获得用于测试并表征来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3的材料，将来自SeqID NO:1的DNA序列在曲霉属表达载体中克隆并在米曲霉中表达。
通过使用以下引物，用标准PCR技术，从cDNA质粒克隆pA2PR22扩增不具有Seq IDNO:1中的DNA的终止密码子的编码区而将来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3亚克隆进曲霉属表达载体pMStr100(WO 10/009400)中：
597TAGGGATCCTCACGATGGTCGCCACCAGCT(SEQ ID NO:13)
598CAGGCCGACCGCGGTGAG(SEQ ID NO:14)
将PCR产物用BamHI加以限制并连接进pMStr100的BamHI和NruI位点中，从而在表达载体中产生具有C-末端标记序列RHQHQHQH(终止序列)的框内融合。对所得曲霉属表达构建体pMStr121中的S53蛋白酶3基因测序，并且确认该序列的蛋白酶编码部分与SEQ ID NO:1的原始编码序列相符。还确认了与标记编码序列的框内融合，从而在SEQ ID NO:3中形成该序列，该序列在SEQ ID NO:4中编码肽序列。
使用如由克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物技术(Biotechnology)6，1419-1422和WO 04/032648描述的标准技术，用pMStr121转化米曲霉菌株BECh2(WO 00/39322)。为了鉴定产生重组蛋白酶的转化株，将这些转化株与BECh2在30℃和200RPM下培养于10ml的YP+2％葡萄糖培养基中。在生长3天之后取出样品并用SDS-PAGE分解以鉴定重组蛋白酶产生。在转化株的培养物中观察到了一条35与50kDa之间的新颖条带，这在未转化的BECh2的培养物中并未观察到。将似乎以高水平表达重组蛋白酶的若干转化株在30℃和200RPM下进一步培养于500ml摇瓶中的100ml的YP+2％葡萄糖培养基中。在生长2、3和4天后取出样品并且通过用SDS-PAGE分解这些样品来比较表达水平。选择一个以相对较高的水平表达重组蛋白酶的单个转化株并将其指定为EXP01737。通过在包含0.01％X-100的选择性培养基上稀释划线分生孢子而将EXP01737分离两次以限制菌落大小并且如以上所描述的于摇瓶中的YP+2％葡萄糖培养基中发酵以提供用于纯化的材料。在生长4天后收获摇瓶培养物并且通过使发酵液过滤穿过Miracloth(卡尔生化公司(Calbiochem))而回收真菌菌丝体，然后如实例2中所描述进行纯化。
YP+2％葡萄糖培养基
10g酵母提取物
20g蛋白胨
补足至1L的水
在121℃下高压灭菌20分钟
添加100ml 20％无菌葡萄糖溶液
实例2：来自大型亚灰树花菌的具有C-末端HQ标记的S53蛋白酶3的纯化
将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余曲霉属宿主细胞。将0.2μm滤液转移至G25交联葡聚糖柱(来自GE医疗集团(GE Healthcare))上的10mM琥珀酸//NaOH，pH 3.5。将G25交联葡聚糖转移的酶施加至在10mM琥珀酸/NaOH，pH 3.5中平衡的Q-交联琼脂糖FF柱(来自GE医疗集团)上。收集具有10mM琥珀酸/NaOH，pH 3.5的流通(run-through)和洗涤液并使其包含S53蛋白酶(使用pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定确认活性)。用1M HCl将流通和洗涤级分的pH调节至pH 3.25，同时彻底地混合该级分。将pH-调节的溶液施加至在10mM琥珀酸/NaOH，pH 3.25中平衡的SP--交联琼脂糖FF柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)洗脱超过十个柱体积。分析来自该柱的级分的蛋白酶活性(使用在pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定法)，并且合并峰级分。将固体硫酸铵添加至合并物中，至2.0M终(NH4)2SO4浓度。将酶溶液施加至在10mM琥珀酸/NaOH，2.0M(NH4)2SO4，pH 3.25中平衡的苯基-Toyopearl柱(来自东曹公司(TosoHaas))上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将S53蛋白酶用在平衡缓冲液与10mM琥珀酸/NaOH，pH 3.25之间的线性梯度洗脱超过十个柱体积。分析来自该柱的级分的蛋白酶活性(使用pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定法)。合并具有高活性的级分并且转移至G25交联葡聚糖柱(来自GE医疗集团)上的10mM琥珀酸/NaOH，pH 3.5。将G25交联葡聚糖转移的蛋白酶施加至在10mM琥珀酸/NaOH，pH 3.5中平衡的SP-交联葡聚糖HP柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)洗脱超过五个柱体积。将来自该柱的构成主峰的级分合并为纯化产物。通过SDS-PAGE分析该纯化产物并且在凝胶上见到一条主带和三条次带。这些条带的埃德曼N-末端测序显示，所有这些条带均与S53蛋白酶相关并且因此我们预期这些次要带表示一些S53蛋白酶分子的切口。将该纯化产物用于进一步表征。
实例3：来自大型亚灰树花菌的具有C-末端HQ标记的S53蛋白酶3的表征
将动力学Suc-AAPF-pNA测定法用于获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线(在指示的pH值下2小时之后的残余活性)。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释10x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH4.0测定缓冲液中，使该蛋白酶孵育的pH转至与残余活性测定之前相同的pH值。使用端点Suc-AAPF-pNA测定法以获得在pH 4.0下的温度-活性曲线。使用动力学Suc-AAPX-pNA测定法和十种不同的Suc-AAPX-pNA底物以获得该酶在pH 4.0下的P1-特异性。
结果示于下表2-5中。蛋白酶10R的数据被包括在这些表中。对于表2，活性是相对于酶的最佳pH而言。对于表3，活性是相对于保持在稳定条件下的样品的残余活性(来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)为5℃，pH 4.0；蛋白酶10R为5℃，pH 9.0)。对于表4，活性是相对于酶的最适温度(来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)为pH 4.0；蛋白酶10R为pH 6.5)。对于表5，活性是相对于酶的最佳底物(来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)为Suc-AAPL-pNA)。使用Protazyme AK测定法以获得蛋白酶10R在pH 6.5下的温度-活性曲线。
与蛋白酶10R的数据相比，来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)对Suc-AAPF-pNA底物的pH-活性、pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后的残余活性)、在pH 4.0下对Suc-AAPF-pNA的温度活性曲线以及在pH 4.0下对10种Suc-AAPF-pNA底物的P1-特异性也示于图1-4中。对于蛋白酶10R，温度活性曲线是pH 6.5下对Protazyme AK的温度活性曲线并且P1-特异性是在pH 9.0下的P1-特异性。
表2：使用动力学Suc-AAPF-pNA测定法确定的25℃下的pH-活性曲线
表3：使用动力学Suc-AAPF-pNA测定法确定的pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后 的残余活性)
表4：使用端点Suc-AAPF-pNA测定法确定的pH 4.0或pH 6.5下的温度活性曲线
表5：使用动力学Suc-AAPX-pNA测定法确定的，在37℃下，在pH 4.0或pH 9.0下，对 10种Suc-AAPX-pNA底物的P1-特异性
来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)的其他特征
确定N-端序列为：AIPASCASTI。
如通过SDS-PAGE所确定的相对分子量大约是Mr＝43kDa。
附接至成熟序列的C-末端HQ标记的确认
使用配备有10kDa截留过滤器的Vivaspin超滤装置，将此样品与50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)进行缓冲液交换。缓冲液交换之后，添加2μL的内切糖苷酶H并且然后将该样品在5℃下孵育过夜。注意：对于每个去糖基化的N-连接的位点而言，在蛋白质骨架上剩余一个N-乙酰己糖胺残基，从而将每个位点的分子量增加203.19Da。然后通过质谱法分析该样品。
通过整体分子量分析确定的主峰的分子量为38088.6Da，对应于成熟序列加–RHQHQ加一个单个乙酰己糖胺和一个非交联半胱氨酸残基的1.8Da内。
通过整体分子量分析确定的次级峰的分子量为37961Da，对应于成熟序列加–RHQH加一个单个乙酰己糖胺和一个非交联半胱氨酸残基的2.3Da内。
成熟序列(来自埃德曼N-末端测序数据和整体分子量分析)：
AIPASCASTITPACLQAIYGIPTTKATQSSNKLAVSGFIDQFANKADLKSFLAQFRKDISSSTTFSLQTLDGGENDQSPSEAGIEANLDIQYTVGLATGVPTTFISVGDDFQDGNLEGFLDIINFLLGESNPPQVLTTSYGQNENTISAKLANQLCNAYAQLGARGTSILFASGDGGVSGSQSAHCSNFVPTFPSGCPFMTSVGATQGVSPETAAAFSSGGFSNVFGIPSYQASAVSGYLSALGSTNSGKFNRSGRGFPDVSTQGVDFQIVSGGQTIGVDGTSCASPTFASVISLVNDRLIAAGKSPLGFLNPFLYSSAGKAALNDVTSGSNPGCSTNGFPAKAGWDPVTGLGTPNFAKLLTAVGLRHQHQ(SEQ ID NO:6)。
来自此成熟序列的计算的分子量为37882.6Da。
实例4：大豆-玉米粉活性测定法
使用采用大豆-玉米粉作为底物的终点测定法以获得在pH 3-7时该蛋白酶的活性曲线。
底物：将大豆粉-玉米粉以30:70比例混合。
测定缓冲液：制备包含100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CAPS，1mMCaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100的9种缓冲液并使用HCl或NaOH调节至一pH值这样使得在将大豆-玉米粉底物(1g)与测定缓冲液(10mL)混合之后给出一种浆体，该浆体的终pH是以下pH之一：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0以及11.0。
在添加蛋白酶之前将底物浆体(2mL)混合30min并在40℃下孵育(500rpm)3小时。将蛋白酶(200mg酶蛋白/kg干物质)溶解于100μl 100mM乙酸钠缓冲液(9.565g/L NaOAc，1.75g/L乙酸，5mM CaCl2，0.01％BSA，0.01％吐温20，pH 6.0)中并且添加。将样品离心(10min，4000rpm，0℃)并且将收集的上清液使用邻苯二甲醛(OPA)测定法进行分析。
结果示于下表6中。来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)对大豆-玉米粉的蛋白水解活性在pH 3下是其最高活性并且随pH升高而下降。在pH 5下，来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)对大豆-玉米粉与蛋白酶10R一样有活性，而在pH 3和pH4下，来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)比蛋白酶10R有活性得多。这些结果指示，来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)可以有效获得蛋白质在单胃动物(如，例如猪和家禽)的上部胃肠道中的水解，从而在这些物种中引起饲料蛋白的改进利用。
表6：在pH 3.0、4.0、5.0、6.0及7.0下对大豆-玉米粉的蛋白酶活性(OD340x稀释因 子)
图5示出了来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)与10R蛋白酶相比，对大豆-玉米粉的活性(OD340x稀释因子)。
实例5：对来自肉仔鸡的嗉囊、砂囊和回肠消化物的蛋白水解活性
收集来自喂食玉米-大豆饮食的21天大的肉仔鸡的嗉囊、砂囊和回肠消化物材料；冻干并用小型磨咖啡机进行研磨。将这些研磨的样品悬浮(47％w/v)于以下缓冲液中并且使其在4℃与水合过夜(不搅拌)：
嗉囊缓冲液：100mM HEPES，1mM CaCl2·2H2O，150mM KCl，0.01％Triton X-100，使用HCl调节至pH 5
砂囊缓冲液：100mM琥珀酸，1mM CaCl2·2H2O，150mM KCl，0.01％Triton X-100，使用HCl调节至pH 1.67
回肠缓冲液：100mM HEPES，1mM CaCl2·2H2O，150mM KCl，0.01％Triton X-100，使用HCl调节至pH 7.2
所得pH是：在嗉囊样品中pH 5；在砂囊样品中pH 3；以及在回肠样品中pH 7。将悬浮液加热至40℃并将1ml分配到多个管中，保持在40℃下。将代表空白(T0)的三个管即刻离心(3000x g，0℃，10min)并冷冻上清液。向这些管中添加在50μL 100mM乙酸钠缓冲液(9.565g/l NaOAc，1.75g/l乙酸，5mM CaCl2，0.01％BSA，0.01％吐温20，pH 6.0)中的酶(200mg酶蛋白/kg底物)或用于空白样品的仅仅乙酸钠缓冲液(50μL)，并且在40℃下伴随振荡(500rpm)，将嗉囊和回肠样品孵育3小时(T3)而将砂囊样品孵育1小时(T1)。将这些样品离心(3000x g，0℃，10min)并且回收并冷冻上清液。使用邻苯二甲醛(OPA)测定法通过分析伯胺确定蛋白水解活性。
结果示于表7中。对于这些消化物类型(嗉囊、砂囊和回肠)中的每种，在空白T0样品中的伯胺的水平之间具有显著差异，并将这些空白样品孵育1或3小时。这一差异可归于底物中存在的以及源自饮食原料或动物的蛋白酶的活性。在孵育嗉囊和砂囊消化物过程中，与空白样品相比，来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)进一步提高了伯胺的水平，证明在给定的条件下该蛋白酶对该底物具有蛋白水解活性。在嗉囊和砂囊孵育过程中，来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)表现显著优于蛋白酶10R，表明来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)对于家禽的上部胃肠道中的饲料蛋白质水解而言可以是更有效的，从而引起改进的蛋白质消化率。正如所料，在pH 7下孵育回肠的过程中，来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)并未显著提高游离胺的水平。
表7：与蛋白酶10R相比，当用肉仔鸡消化物孵育时，来自大型亚灰树花菌的S53蛋 白酶3(来自实例2)的蛋白水解活性，并表示为由OPA测定法(OD340x稀释因子)所测量的伯胺 的水平
在一栏中的没有通过相同的上标字母连贯的a,b,c值是通过图基克雷默检验(α＝0.05)(由ANOVA程序(SAS研究所有限公司)提供)确定的具有统计性差异。
图6示出了空白T0样品、空白样品和用来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)或10R蛋白酶孵育的样品中的游离胺的水平(OD340x稀释因子)。用于孵育的底物是来自肉仔鸡的嗉囊、砂囊和回肠消化物材料。
实例6：热稳定性
将蛋白酶的蛋白样品的等分部分(如实例2或12中所述的经过纯化的)脱盐或使用预装PD-10柱改变缓冲液为20mM乙酸钠，pH 4.0或在4℃下以2-3h步骤针对2x500ml20mM乙酸钠，pH 4.0进行透析，随后是一个过夜步骤。将该样品进行0.45μm过滤并用缓冲液稀释至大约2A280单位。在差示扫描量热法(DSC)中使用该透析缓冲液作为参照。使用真空抽吸对这些样品进行脱气并搅拌大约10分钟。
以1.5℃/min的恒定扫描速率从20℃-90℃在MicroCal VP-DSC上进行DSC扫描。使用MicroCal原点软件(Origin software)(4.10版本)进行数据处理，并将变性温度Td(也称为熔解温度Tm)定义为温度自记曲线的峰尖端的温度。
实例7：蒸汽稳定性
可以使用以下测定法评价蒸汽处理后该蛋白酶的残余活性。
在这些试验中，使用经修改的设置从而该蒸汽是从蒸汽发生器中提供的并被导入到箱中。当温度达到约93℃-94℃时，通过抽屉将放置在板上的这些样品插入到该箱中。插入这些样品后，温度即降低4℃。当温度停留在大约恒定的90℃时，孵育30秒。此后，将盘快速地从盒中移除，将样品放置在冰上，重悬浮，并且使用例如Suc-AAPF-pNA或邻苯二醛(OPA)测定来针对蛋白酶活性进行评估。将每个酶样品与未经过蒸汽处理的相似样品进行比较以计算残余活性。
实例8：造丸稳定性测试
如美国专利号4,106,991，实例1中所述的方式进行酶粒化。将获得的颗粒在流化床中干燥至含水量低于1％并过筛以获得具有250μm至850μm粒子范围的产物。最终，将该产物用棕榈油和碳酸钙以如在美国专利号4,106,991，实例22中所述的方式进行包衣。
在小型卧式搅拌器中，大致地将50g酶颗粒与10kg饲料预混合10分钟。在大型卧式搅拌器中将该预混合物与90kg饲料混合10分钟。将该饲料从该搅拌器中以大约300kg/小时的速率导至调节器(带有蒸汽注入的串联搅拌器)。该调节器通过注入蒸汽将该饲料加热至95℃(在排气口进行测量)。在该调节器中的停留时间是30秒。将该饲料从该调节器中导至配备有3.0x35mm水平冲模的西蒙黑森(Simon Heesen)压力机中并将其压缩成具有15mm左右的长度的丸。在压缩后，将这些丸放置在冷气机中并冷却15分钟。
使用Suc-AAPF-pNA测定法，在造丸之前测量蛋白酶活性，并在造丸之后测量该饲料丸中的蛋白酶活性。通过将丸状饲料中的蛋白酶活性相对于非丸状饲料中的活性相比较以确定造丸稳定性。
实例9：从变色栓菌对比种和变色栓菌克隆两个蛋白酶基因
基于鉴定的基因序列(来自变色栓菌对比种菌株(参见菌株部分)的SEQ ID NO:15和来自变色栓菌菌株(参见菌株部分)的SEQ ID NO:20)，设计两个具有用于米曲霉表达的密码子优化的合成编码DNA序列(CDS)(分别为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:22)。在pMA-T载体中，以5μg规模，用与表达载体pDAu109(WO 2005042735)相容的5’中的BamHI和3’中的HindIII两个侧翼位点，通过(美国生命技术公司，卡尔巴斯德，加利福利亚州，美国)合成这两个CDS序列。随后，遵循制造商的建议，将1μg的这些质粒用来自NEB(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，法兰克福，德国)的限制性内切酶消化，并且使用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳分离所得片段。将对应于合成的蛋白酶基因的1.7kb片段切离凝胶并且遵循制造商的说明书，使用PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(PCR DNA and Gel Band Purification Kit)(GE医疗集团，希勒勒，丹麦)进行纯化。将100ng的这些插入片段在表达载体pDAu109(WO 2005042735)中克隆，遵循制造商的说明书，该表达载体先前通过与来自NEB(新英格兰生物实验室，法兰克福，德国)的T4连接酶连接而用BamHI和HindIII消化。
将2.5μl体积的稀释的连接混合物用于转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(美国生命技术公司，卡尔巴斯德，加利福利亚州，美国)。在包含100μg的氨比西林/ml的LB琼脂板中针对每个构建体选择三个菌落并在3ml的补充有100μg的氨比西林/ml的LB培养基中培养过夜。根据制造商的说明书，使用凯杰公司旋转迷你制备型试剂盒(Qiagen Spin Miniprepkit)(目录号27106)(凯杰公司(QIAGEN GmbH)，希尔登，德国)纯化质粒DNA。在异源表达之前，通过桑格测序(Sanger sequencing)验证变色栓菌对比种和变色栓菌蛋白酶合成序列。选择被指定为MDQM0673-1和MDQM0584-1的质粒(分别保留CDS SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:22)，用于在米曲霉宿主细胞MT3568(描述于菌株章节中)中进行原生质体转化与其编码蛋白酶的异源表达。
实例10：用编码来自变色栓菌对比种和变色栓菌的蛋白酶的基因转化米曲霉与最佳转化株的选择
根据WO 95/002043制备米曲霉MT3568(参见菌株章节)的原生质体。将一百μl的原生质体与2.5-10μg的曲霉属表达载体MDQM0673-1和MDQM0584-1(实例9)、250μl的60％PEG4000(艾普利公司(Applichem)，达姆施塔特，德国)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)混合并轻轻混合。将该混合物在37℃下孵育30分钟并且将这些原生质体涂布到COVE板上用于选择。在37℃下孵育4-7天之后，将八个转化株的孢子接种到96深孔板中的0.5ml的补充有乳酸并补充有磷酸氢二铵的DAP4C-1培养基中。在30℃下培养4天之后，将培养液通过SDS-PAGE使用4％-20％Tris-甘氨酸凝胶(英杰公司(Invitrogen Corporation)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)进行分析，以鉴定产生来自变色栓菌的最大量的重组蛋白酶的转化株。
基于SDS-PAGE凝胶的条带强度，将最佳转化株的孢子涂布于包含0.01％X-100的COVE-蔗糖-T板上，以分离单个菌落。在COVE-蔗糖-T板上总共重复两次涂布，并且然后将单个菌落涂布于COVE-N-琼脂管上，直至孢子形成。
实例11：用编码来自变色栓菌对比种和变色栓菌的蛋白酶的基因转化的米曲霉的发酵
将150ml的补充有5ml的20％乳酸和3.5ml的50％磷酸氢二铵及来自最佳转化株的孢子的DAP4C-1培养基在30℃的温度下于100rpm搅动下在4天过程中培养于摇瓶中。通过使用0.2μm过滤器装置过滤而收获培养液并用于进一步表征。
实例12：来自变色栓菌对比种的S53蛋白酶1的纯化
将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余曲霉属宿主细胞。将0.2μm滤液转移至G25交联葡聚糖柱(来自GE医疗集团)上的10mM琥珀酸//NaOH，pH 3.5。将G25交联葡聚糖转移的酶施加至在10mM琥珀酸/NaOH，pH 3.5中平衡的SP-交联琼脂糖FF柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->1.0M)洗脱超过十个柱体积。分析来自该柱的级分的蛋白酶活性(使用在pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定法)，并且通过SDS-PAGE分析峰级分。将考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上的仅具有一条条带的级分合并为纯化产物。将该纯化产物用于进一步表征。
实例13：来自变色栓菌对比种的S53蛋白酶1(SEQ ID NO:19)的表征
使用动力学Suc-AAPF-pNA测定法以获得pH-活性曲线。使用端点Suc-AAPF-pNA测定法以获得pH-稳定性曲线(在指示的pH值下2小时之后的残余活性)和pH 4.0下的温度-活性曲线。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释7x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH 4.0测定缓冲液中，使该蛋白酶孵育物的pH转至与残余活性测定之前相同的pH值。使用动力学Suc-AAPX-pNA测定法和十种不同的Suc-AAPX-pNA底物以获得该酶在pH 4.0下的P1-特异性。
结果示于下表8-11中。来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(来自实例2)和蛋白酶10R的数据被包括在这些表中。对于表8，活性是相对于酶的最适pH而言。对于表9，活性是相对于保持在稳定条件(5℃，pH 4.0)下的样品的残余活性。对于表10，活性是相对于酶在pH4.0下的最佳温度而言。对于表11，活性是相对于酶的最佳底物(来自变色栓菌对比种的S53蛋白酶1为Suc-AAPL-pNA)。
表8：使用动力学Suc-AAPF-pNA测定法确定的25℃下的pH-活性曲线
表9：使用动力学Suc-AAPF-pNA测定法确定的pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后 的残余活性)
表10：使用端点Suc-AAPF-pNA测定法确定的pH 4.0或pH 6.5下的温度活性曲线
表11：使用动力学Suc-AAPX-pNA测定法确定的，在37℃下，在pH 4.0或pH 9.0下， 对10种Suc-AAPX-pNA底物的P1-特异性
与来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3的数据相比较，来自变色栓菌对比种的S53蛋白酶1对Suc-AAPF-pNA底物的pH-活性、pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后的残余活性)、在pH 4.0下对Suc-AAPF-pNA的温度活性曲线以及在pH 4.0下对10种Suc-AAPF-pNA底物的P1-特异性也如下图1-4所示。
来自变色栓菌对比种的S53蛋白酶1的其他特征
确定N-端序列为：AIPASCASTI。
如通过SDS-PAGE所确定的相对分子量大约是Mr＝42kDa。
来自变色栓菌对比种的S53蛋白酶1的成熟序列的确认
使用配备有10kDa截留过滤器的Vivaspin超滤装置，将纯化样品与50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)进行缓冲液交换。缓冲液交换后，添加内切糖苷酶H并将样品在30℃下孵育3小时。注意：对于每个去糖基化的N-连接的位点而言，在蛋白质骨架上剩余一个N-乙酰己糖胺残基，从而将每个位点的分子量增加203.19Da。然后通过质谱法分析该样品。
通过整体分子量分析确定的主峰的分子量为37467.6Da，对应于成熟序列加一个单个乙酰己糖胺和一个非交联半胱氨酸残基的0.41Da内。
成熟序列(来自埃德曼N-末端测序数据和整体MS数据)：
AVPASCASTITPACLQALYGIPTTKATQSSNKLAVSGFIDQFANSADLKTFLGKFRTDISSSTTFTLQTLDGGSNSQSSSQAGVEANLDIQYTVGLASAVPTIFISVGDDFQDGDLEGFLDIINFLLNESAPPQVLTTSYGQNENTISAKLANQLCNAYAQLGARGTSILFASGDGGVSGSQSSSCSKFVPTFPSGCPFMTSVGATQGINPETAADFSSGGFSNVFARPSYQSTAVSSYLTALGSTNSGKFNTSGRAFPDIATQGVDFEIVVSGRTEGVDGTSCASPTLAAIISLLNDRLIAAGKSPLGFLNPFLYSAAGTAALTDITSGSNPGCNTNGFPAKAGWDPVTGLGTPNFAKLLTAVGL(SEQ IDNO:19)。
来自此成熟序列的计算的分子量为37263.0Da。

Claims (38)

1.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的成熟多肽具有至少99％序列一致性，其中所述多肽获自大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)或能从大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)获得；
(e)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少99％序列一致性的多核苷酸编码，其中所述多肽获自大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)或能从大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)获得。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQID NO:6组成。
3.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与蛋白酶10R相比，在25℃下在pH 2与5之间具有改进的蛋白酶活性。
4.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与蛋白酶10R相比，在60℃或更低温度下具有改进的蛋白酶活性。
5.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与蛋白酶10R相比，在40℃下，在pH 3.0与4.0之间，对大豆-玉米粉具有改进的蛋白酶活性。
6.如权利要求1所述的多肽，其中当与无蛋白酶处理的空白样品相比时和当与用蛋白酶10R处理的样品相比时，所述多肽对肉仔鸡消化物具有改进的蛋白水解活性，其表示为在3或1小时孵育后嗉囊和/或砂囊消化物中的伯胺水平的增加。
7.一种包括具有蛋白酶活性的多肽的组合物，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的成熟多肽具有至少99％序列一致性，其中所述多肽获自大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)或能从大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)获得；
(e)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少99％序列一致性的多核苷酸编码，其中所述多肽获自大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)或能从大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)获得。
8.如权利要求7所述的组合物，其中包含在所述组合物中的所述多肽与蛋白酶10R相比，在25℃下在pH 2与5之间具有改进的蛋白酶活性。
9.如权利要求7所述的组合物，其中包含在所述组合物中的所述多肽与蛋白酶10R相比，在60℃或更低温度下具有改进的蛋白酶活性。
10.如权利要求7所述的组合物，其中包含在所述组合物中的所述多肽与蛋白酶10R相比，在40℃下，在pH 3.0与4.0之间，对大豆-玉米粉具有改进的蛋白酶活性。
11.如权利要求7所述的组合物，其中当与无蛋白酶处理的空白样品相比时和当与用蛋白酶10R处理的样品相比时，包含在所述组合物中的所述多肽对肉仔鸡消化物具有改进的蛋白水解活性，其表示为在3或1小时孵育后嗉囊和/或砂囊消化物中的伯胺水平的增加。
12.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽在动物饲料中的用途，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的成熟多肽具有至少99％序列一致性，其中所述多肽获自大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)或能从大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)获得；
(e)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少99％序列一致性的多核苷酸编码，其中所述多肽获自大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)或能从大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)获得。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述多肽与蛋白酶10R相比，在25℃下在pH 2与5之间具有改进的蛋白酶活性。
14.如权利要求12所述的用途，其中所述多肽与蛋白酶10R相比，在60℃或更低温度下具有改进的蛋白酶活性。
15.如权利要求12所述的用途，其中所述多肽与蛋白酶10R相比，在40℃下，在pH 3.0与4.0之间，对大豆-玉米粉具有改进的蛋白酶活性。
16.如权利要求12所述的用途，其中当与无蛋白酶处理的空白样品相比时和当与用蛋白酶10R处理的样品相比时，所述多肽对肉仔鸡消化物具有改进的蛋白水解活性，其表示为在3或1小时孵育后嗉囊和/或砂囊消化物中的伯胺水平的增加。
17.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-6中任一项所述的多肽。
18.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求17所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至在表达宿主细胞内指导该多肽产生的一个或多个控制序列上。
19.一种重组表达宿主细胞，该重组表达宿主细胞包括如权利要求17所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列上。
20.如权利要求19所述的宿主细胞，其中该宿主是一种丝状真菌或一种酵母。
21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中该宿主是曲霉属、木霉属或镰刀菌属。
22.如权利要求20所述的宿主细胞，其中该宿主是毕赤酵母属或酵母属。
23.如权利要求20或21所述的宿主细胞，其中该宿主是一种曲霉。
24.如权利要求23所述的宿主细胞，其中该宿主是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉。
25.如权利要求19所述的宿主细胞，其中该宿主是一种芽孢杆菌。
26.如权利要求25所述的宿主细胞，其中该宿主是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。
27.一种产生如权利要求1-6中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)培养一种细胞，该细胞以其野生型形式在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；并且
(b)回收该多肽。
28.一种产生如权利要求1-6中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求20-26中任一项所述的一种宿主细胞；并且
(b)回收该多肽。
29.一种产生如权利要求1-6中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养用编码如权利要求1-6中任一项所述的多肽的多核苷酸转化的转基因植物或植物细胞；并且
(b)回收该多肽。
30.一种动物饲料组合物，该组合物包括如权利要求1-6中任一项所述的多肽。
31.如权利要求30所述的动物饲料组合物，该组合物进一步包括一种或多种淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、β-葡聚糖酶、或其任何混合物。
32.权利要求1-6中任一项所述的至少一种多肽在以下各项中的用途
在动物饲料中；
在动物饲料添加剂中；
在用于在动物饲料中使用的组合物的制备中；
用于改善动物饲料的营养价值；
用于增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白；
用于增加动物饮食中的蛋白的水解程度；和/或
用于处理蛋白。
33.一种用于改进动物饲料的营养价值的方法，其中向该饲料中添加如权利要求1-6中任一项所述的至少一种多肽。
34.一种动物饲料添加剂，包括
至少一种如权利要求1-6中任一项所述的多肽；以及
至少一种脂-溶性维生素，和/或
至少一种水-溶性维生素，和/或
至少一种痕量矿物质。
35.如权利要求34所述的动物饲料添加剂，进一步包括以下各项中的一种或多种：淀粉酶；植酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶，β-葡聚糖酶，或其任何混合物。
36.一种动物饲料，具有50至800g/kg的粗蛋白含量，并且包括如权利要求1-6中任一项所述的至少一种多肽。
37.一种用于处理蛋白的方法，包括将如权利要求1-6中任一项所述的至少一种多肽添加至至少一种蛋白或蛋白来源中的步骤。
38.如权利要求37所述的方法，其中大豆或大豆粉被包括在该至少一种蛋白来源中。
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