MX2015002766A - Polipeptidos con actividad proteasa. - Google Patents

Polipeptidos con actividad proteasa.

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Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad proteasa y a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican las proteasas. La invención también se relaciona con constructos de ácido nucleico, vectores y células hospederas que incluyen células vegetales y animales, que comprenden secuencias de ácido nucleico así como métodos para producir y utilizar las proteasas, en particular el uso de las proteasas en alimentos para animales.

Description

POLIPÉPTIDOS CON ACTIVIDAD PROTEASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad proteasa y a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican las proteasas. La invención también se relaciona con constructos de ácido nucleico, vectores y células hospederas, que incluyen células vegetales y animales, que comprenden secuencias de ácido nucleico, así como métodos para producir y utilizar las proteasas, en particular, el uso de las proteasas en alimentos para animales.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el uso de proteasas en los alimentos para animales (in vivo) y/o el uso de tales proteasas para tratar proteínas vegetales (in vitro) , se observa que las proteínas son factores nutricionales esenciales para los animales y los seres humanos. Los seres humanos y el ganado suelen obtener las proteínas necesarias de fuentes de proteína vegetal. Algunas fuentes de proteínas vegetales importantes son, p. ej., los cultivos de colza, legumbres y cereales.
Cuando, p. ej., se incluye harina de soja en los alimentos para animales monogástricos, tales como cerdos y aves de corral, una proporción significativa de la harina de soja no es digerida de forma eficiente (la digestibilidad ileal aparente de proteínas en los lechones, cerdos de engorde y aves Ref.:254444 de corral, tales como pollos de engorde, gallinas ponedoras y gallos, es únicamente de aproximadamente un 80%).
El tubo digestivo de los animales consiste en una serie de segmentos que representan cada uñó entornos de pH diferente. En los animales monogástricos, tales como cerdos y aves de corral y muchos tipos de peces, el estómago es sumamente ácido con un pH potencialmente de tan solo 1-2, mientras que el intestino tiene un pH más neutro de aproximadamente 6-7.5. Además del estómago y el intestino, las aves de corral también tienen un buche que precede al estómago. El pH en el buche está determinado principalmente por el alimento ingerido y, por lo tanto, normalmente es un pH comprendido en el intervalo de 4-6. La digestión de proteínas por parte de una proteasa puede tener lugar a lo largo de todo el tubo digestivo, siempre que la proteasa sea activa y soporte las condiciones del tubo digestivo. Por lo tanto, las proteasas que son estables a pH muy ácido y que por lo tanto pueden soportar el entorno gástrico y al mismo tiempo ser activas de un modo eficaz en el intervalo amplio del pH fisiológico del tubo digestivo del animal diana son especialmente deseables. Las proteínas nuevas S53 de la invención son útiles a estos fines.
Debido a que el alimento para animales se formula a menudo en forma de microesferas, donde se aplica vapor en el proceso de formación de las microesferas, también es deseable que las proteasas utilizadas en los piensos para animales sean capaces de seguir siendo activas tras la exposición a el tratamiento con vapor.
Para producir una proteasa para su uso industrial, es importarte que la proteasa se produzca con rendimientos altos de modo que se disponga del producto en cantidades suficientes para poder proporcionar la proteasa a un precio favorable.
Las proteasas S53 son conocidas en la téenica. Un péptido S53 de Grifóla frondosa con el número de adhesión MER078639 (SEQ ID NO: 9) tiene una identidad de secuencia del 83.6% respecto de la SEQ ID NO: 5. Una proteasa S53 de Postia placenta (Uniprot: B8PMI5, SEQ ID NO: 10) fue aislada por Martínez et al que tiene una identidad de secuencia del 74.5% respecto de la SEQ ID NO: 5 en "Genome, transcriptome, and secretóme analysis of wood decay fungus Postia placenta supports unique mechanisms of lignocellulose conversión", 2009, Proc . Nati . Acad. Sci . EE. UU. 106:1954-1959.
Vanden Wymelenberg et al . han aislado una proteasa S53 (Uniprot: Q281W2, SEQ ID NO: 11) en "Computational analysis of the Phanerochaete chrysosporium v2.0 genome database and mass spectrometry Identification of peptides in ligninolytic cultures reveal complex mixtures of secreted proteins", 2006, Fungal Gene t . Biol . 43:343-356 que tiene una identidad de secuencia del 74.1% respecto a la SEQ ID NO: 5. Otro polipéptido S53 de Postia placenta (Uniprot:B8P431, SEQ ID NO: 12) ha sido identificado por Martínez et al . in "Genome, transcriptome, and secretóme analysis of wood decay fungus Postia placenta supports unique mechanisms of lignocellulose conversión", 2009, Proc. Nati . Acad. Se i . EE. UU. 106:1954-1959 y tiene una identidad de secuencia del 68.2% respecto de la SEQ ID NO: 5. Otros péptidos que incluyen proteasas S53 tienen una identidad de secuencia menor al 70% respecto de la SEQ ID NO: 5.
Floudas et al han publicado la secuencia de una proteasa S53 en "The Paleozoic origin of enzymatic lignin decomposition reconstructed from 31 fungal genomes", 2012, Science, 336:1715-1719 que tiene una identidad de secuencia del 80.6% respecto de la SEQ ID NO: 5. Fem andez-Fucyo et al han publicado las secuencias de tres serina proteasas en "Comparative genomics of Ceriporiopsis subvermispora and Phanerochaete chrysosporium provide insight into selective ligninolysis", 2012, Proc Nati Acad Scí EE. UU. . 109:5458-5463 (Uniprot:M2QQ01, SEQ ID NO: 26, Uniprot:M2QWH2, SEQ ID NO: 27, Uniprot:M2RD67, SEQ ID NO: 28) que tienen una identidad de secuencia del 80.8%, 79.1% y 78.6% respectivamente respecto de la SEQ ID NO: 5.
WO 02/068623 describe una proteasa de Aspergillus niger que tiene una identidad de secuencia del 49.2% respecto de la SEQ ID NO: 5 para uso en alimentos y aplicaciones para alimentos. WO 12/048334 describe las endopeptidasas tipo serina de Myceliophthora thermophila como un aditivo alimentario o para pienso con una identidad de secuencia del 47.9% respecto de la SEQ ID NO: 5.
El documento WO 95/28850 describe la combinación de una fitasa y una o más enzimas proteoliticas microbianas para mejorar la solubilidad de las proteínas vegetales. El documento WO 01/58275 describe la utilización de proteasas estables a pH ácido de la familia de las subtilisinas en alimentos para animales. WO 01/58276 describe el uso de proteasas estables en ácido derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (la proteasa 10R), así como la proteasa derivada d eNocardiopsis alba DSM 14010 en alimentos para animales. Los documentos WO 04/072221, WO 04/111220, WO 04/111223, WO 05/035747 y WO 05/123911 describen proteasas relacionadas con la proteasa 10R y su utilización en alimento para animales. El documento WO/072279 describe el uso de otras proteasas en alimentos para animales. El documento WO 04/034776 describe la utilización de una subtilisina/queratinasa PWD-1 de B. licheniformis en los alimentos para las aves de corral. El documento WO 04/077960 describe un método para incrementar la digestibilidad del forraje o grano en rumiantes mediante la aplicación de una proteasa bacteriana o fúngica.
Los productos comerciales que comprenden una proteasa y que se comercializan para su uso en alimentos para animales incluyen RONOZYME® ProAct (DSM NP/Novozymes) , Axtra® (Danisco), Avizyme® (Danisco), Porzyme® (Danisco), Allzyme™ (Alltech), Versazyme® (BioResources, Int.), Poultrygrow™ (Jefo) y Cibenza® DP100 (Novus).
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad proteasa seleccionados entre el grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 84% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4; (b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 83% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o de la SEQ ID NO: 18; (c) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o de la SEQ ID NO: 23; (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones de rigurosidad alta, o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 3, (iii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15, (iv) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 17, (v) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20, (vi) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 22, (vii) la hebra complementaria completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) o (vi); (e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 84% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: lo SEQ ID NO: 3; (f) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 83% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17; (g) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22; (h) una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones; y (i) un fragmento de un polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h) que tiene actividad proteasa.
La presente invención también se relaciona con el uso de polipéptidos aislados en alimentos para animales que tienen actividad proteasa seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; (b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; (c) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23; (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones de rigurosidad alta, o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 3, (iii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15, (iv) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 17, (v) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20, (vi) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 22, (vii) la hebra complementaria completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) o (vi); (e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3; (f) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15 O SEQ ID NO: 17; (g) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22; (h) una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones; y (i) un fragmento de un polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h) que tiene actividad proteasa.
La presente invención se relaciona con polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la presente invención, constructos de ácido nucleico, vectores de expresión recombinante, y células hospederas recombinantes que comprenden los polinucleótidos y con métodos para producir los polipéptidos.
La presente invención también se relaciona con composiciones, preferentemente, composiciones para alimentos para animales, que comprenden los polipéptidos de la invención; el uso de los polipéptidos de la invención en alimentos para animales o como aditivos alimentarios para animales; métodos para preparar una composición para uso en alimentos para animales, para mejorar el valor nutricional de un alimento para animales y métodos para tratar proteínas que se utilizarán en composiciones alimenticias para animales.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ADNc de la proteasa 3 de S53 como aislada de Meripilus giganteus .
La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos según se deduce a partir de la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de ADN de la secuencia de ADN expresada recombinante de SEQ ID NO: 1 con marcador HQ.
La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos según se deduce a partir de la SEQ ID NO: 3.
La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de la proteasa 3 madura de S53 de Meripilus giganteus.
La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de la proteasa S53 madura obtenida de SEQ ID NO.3.
La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de ADN de la proteasa !10R (WO 05/035747, SEQ ID NO: 1).
La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de la proteasa 10R (WO 05/035747, SEQ ID NO: 2).
La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Grif la frondosa (MER078639).
La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Postia placenta (Uniprot: B8PMI5).
La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Phanerochaete chrysosporium (Uniprot: Q281W2).
La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 d ePostia placenta (Uniprot: B8P431).
La SEQ ID NO: 13 es el cebador 597.
La SEQ ID NO: 14 es el cebador 598.
La SEQ ID NO: 15 es la secuencia de ADNc de la proteasa 1 de S53 aislada de Trametes cf. versicolor.
La SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos según se deduce a partir de la SEQ ID NO: 15.
La SEQ ID NO: 17 es la secuencia de ADN de la secuencia de ADN expresado recombinante de SEQ ID NO: 15.
La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos según se deduce a partir de la SEQ ID NO: 17.
La SEQ ID NO: 19 es la secuencia de aminoácidos de la proteasa S53 madura obtenida de SEQ ID NO.15 y SEQ ID NO: 17.
La SEQ ID NO: 20 es la secuencia de ADNc de la proteasa 2 de S53 aislada de Trame tes versicolor.
La SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos según se deduce a partir de la SEQ ID NO: 20.
La SEQ ID NO: 22 es la secuencia de ADN de la secuencia de ADN expresado recombinante de SEQ ID NO: 20.
La SEQ ID NO: 23 es la secuencia de aminoácidos según se deduce a partir de la SEQ ID NO: 22.
La SEQ ID NO: 24 es la secuencia de aminoácidos de la proteasa S53 obtenida de SEQ ID NO.20 y SEQ ID NO: 22.
La SEQ ID NO: 25 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Dichomitus squalens (Uniprot: R7SPH9).
La SEQ ID NO: 26 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Ceriporiopsis subvermispora (Uniprot: M2QQ01).
La SEQ ID NO: 27 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Ceriporiopsis subvermispora (Uniprot: M2QWH2).
La SEQ ID NO: 28 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Ceriporiopsis subvermispora (Uniprot: M2RD67).
Matriz de Identidad de las secuencias: BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el perfil de actividad de pH de la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en comparación con la proteasa 10R en el sustrato Suc-AAPF-pNA a 25°C.
La Figura 2 muestra el perfil de estabilidad del pH de la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en comparación con la proteasa 10R (actividad residual después de 2 horas a 37°C).
La Figura 3 muestra el perfil de actividad de la temperatura de una proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) a un pH de 4.0 en comparación con la proteasa 10R en Protazyme AK a un pH de 6.5.
La Figura 4 muestra la especificidad P1 de la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) a un pH de 4 en comparación con la proteasa 10R a un pH de 9.0 en 10 sustratos Suc-AAPX-pNA, 25°C.
La Figura 5 muestra la actividad (OD340 x factor de dilución) en harina de soja - maíz de la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en comparación con la proteasa 10R.
La Figura 6 muestra el nivel de aminas libres (OD340 x factor de dilución) en muestras de blanco T0,muestras en blanco y muestras incubadas con la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) o proteasa 10R.
La Figura 7 muestra el perfil de actividad del pH de la proteasa 1 de S53 aislada de Trametes cf. versicolor en comparación con la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en el sustrato Suc-AAPF-pNA a 25°C.
La Figura 8 muestra el perfil de la estabilidad del pH de la proteasa 1 de S53 aislada de Trametes cf . versicolor en comparación con la proteasa 3 de S53 d Meripilus giganteus (del ejemplo 2) (actividad residual después de 2 horas a 37°C).
La Figura 9 muestra el perfil de actividad de la temperatura de la proteasa 1 de S53 aislada de Trametes cf. versicolor en comparación con la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en Protazyme AK a un pH de 4.
La Figura 10 muestra la especificidad P1 de la proteasa 1 de S53 aislada de Trametes cf . versicolor en comparación con la proteasa 3 de S53 d eMeripilus giganteus (del ejemplo 2) a un pH de 4 en 10 sustratos Suc-AAPX-pNA, 25°C..
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Variante alélica: La expresión "variante alélica" se refiere a cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica aparece de manera natural debido a una mutación y puede generar polimorfismo en las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
ADNc: El término "ADNc" se refiere a una molécula de ADN que se puede preparar mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm maduro, que ya ha experimentado corte y empalme, obtenida a partir de una célula eucariota. El ADNc carece de secuencias de tipo intrón que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, que incluyen el corte y empalme, antes de aparecer como un ARNm maduro que ya ha experimentado corte y empalme.
Secuencia codificante: La expresión "secuencia codificante" se refiere a un polinucleótido que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante están determinados generalmente por un marco de lectura abierto, el cual normalmente comienza con el codón de iniciación ATG o codones de iniciación alternativos, tales como GTG y TTG, y finaliza con un codón terminador tal como TAA, TAG y TGA. La secuencia de codificación puede ser un ADN, ADNc, o polinucleótido sintético o recombinante.
Secuencias de control: El término "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o exógena (i.e., de un gen diferente) respecto del polinucleótido que codifica el polipéptido o nativos o exógenos entre sí. Las secuencias de control de este tipo incluyen, sin carácter limitante, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica, un promotor, una secuencia de tipo péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales terminadoras de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores a fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica un polipéptido.
Expresión: El término "expresión" incluye cualquier paso que intervenga en la producción del polipéptido incluidas, sin carácter limitante, la transcripción, una modificación posterior a la transcripción, la traducción, una modificación posterior a la traducción y la secreción.
Vector de expresión: La expresión "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN circular o lineal que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y que está ligada operablemente a nucleótidos adicionales que permiten su expresión.
Fragmento: El término "fragmento" significa un polipéptido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos eliminados del terminal amino y/o carboxilo de un polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad proteasa. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 330 residuos aminoacídicos (p. ej., los aminoácidos comprendidos entre el 20 y el 349 de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 5); en otro aspecto, un fragmento contiene al menos 345 residuos aminoacídicos (p. ej., los aminoácidos comprendidos entre el 10 y el 354 de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 5); en un aspecto adicional, un fragmento contiene al menos 355 residuos aminoacídicos (p. ej., los aminoácidos comprendidos entre el 5 y el 359 de la SEQ ID NO: 2o SEQ ID NO: 5). En un aspecto, un fragmento contiene al menos 330 residuos aminoacídicos (p. ej., los aminoácidos comprendidos entre el 20 y el 349 de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 20); en otro aspecto, un fragmento contiene al menos 345 residuos aminoacídicos (p. ej., los aminoácidos comprendidos entre el 10 y el 354 de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 20); en un aspecto adicional, un fragmento contiene al menos 355 residuos aminoacídicos (p. ej., los aminoácidos comprendidos entre el 5 y el 359 de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 20). En un aspecto, un fragmento contiene al menos 330 residuos aminoacídicos (p. ej., los aminoácidos comprendidos entre el 20 y el 349 de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 24); en otro aspecto, un fragmento contiene al menos 345 residuos aminoacídicos (p. ej., los aminoácidos comprendidos entre el 10 y el 354 de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 24); en un aspecto adicional, un fragmento contiene al menos 355 residuos aminoacídicos (p. ej., los aminoácidos comprendidos entre el 5 y el 359 de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 24).
Célula hospedadora: La expresión "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo de célula que es susceptible de ser transformada, transfectada, transducida y de sufrir procesos similares con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier progenie de una célula original que no es idéntica a la célula original debido a mutaciones que se producen durante la replicación.
Polinucleótido aislado: La expresión "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido que está en una forma o entorno que no está presente en la naturaleza, tal como (1) cualquier polinucleótido que no tiene un origen natural, (2) cualquier polinucleótido que haya sido separado al menos parcialmente de uno o más o todos los componentes que tienen un origen natural y con los que se asocia en la naturaleza; (3) cualquier polinucleótido que haya sido modificado por la intervención humana respecto al polinucleótido que se encuentra en la naturaleza o (4) cualquier polinucleótido que haya sido modificado incrementando la cantidad del polinucleótido respecto a otros componentes con los cuales está asociado de manera natural (p. ej., la producción recombinante en una célula hospedadora; copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; y la utilización de un promotor más fuerte que el promotor asociado de manera natural con el gen que codifica la sustancia). En un aspecto, el polinucleótido aislado tiene una pureza de al menos un 1%, p. ej., al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 40%, al menos un 60%, al menos un 80%, al menos un 90% y al menos un 95%, según se determina mediante electroforesis en agarosa. Los polinucleótidos pueden tener origen genómico, semisintético, sintético, en el ADNc, ARN o cualesquiera combinaciones de estos.
Polipéptido aislado: La expresión "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido que está en una forma o entorno que no está presente en la naturaleza, tal como (1) cualquier polipéptido que no tiene un origen natural, (2) cualquier polipéptido que haya sido separado al menos parcialmente de uno o más o todos los componentes que tienen un origen natural y con los que se asocia en la naturaleza; (3) cualquier polipéptido que haya sido modificado por la intervención humana respecto al polinucleótido que se encuentra en la naturaleza en una mezcla con otros componentes, tales como otros polipéptidos, metabolitos secundarios, sales, y otros o (4) cualquier polipéptido que haya sido modificado incrementando la cantidad del polipéptido respecto a otros componentes con los que está asociado de manera natural. En un aspecto, el polipéptido tiene una pureza de al menos un 1%, p. ej., una pureza de al menos un 5%, una pureza de al menos un 10%, una pureza de al menos un 20%, una pureza de al menos un 40%, una pureza de al menos un 60%, una pureza de al menos un 80% y una pureza de al menos un 90%, según se determina mediante SDS- PAGE.
Polipéptido maduro: El término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final con posterioridad a la traducción y toda modificación postraduccional, como el procesamiento del N-terminal, la truncación del C-terminal, glicolisación, ffoossffoorriillaacciióónn,, eettcc.. En un aspecto, el polipéptido maduro es aminoácidos 1 a 366 en la numeración de la SEQ ID NO: 2 en base a la secuencia utilizando la degradación de Edman y el análisis de peso molecular intacto del polipéptido maduro con marcador HQ C-terminal. Utilizando el programa de predicción SignalP (Nielsen et al . , 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se predice que los aminoácidos -198 a -182 en la numeración de la SEQ ID NO: 2 son el péptido señal.
En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el 1 y el 366 de la numeración de la SEQ ID NO: 17, según una secuenciación que utiliza la degradación de Edman y un análisis de peso molecular intacto del polipéptido maduro. Utilizando el programa de predicción SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se predice que los aminoácidos -199 a -183 en la numeración de la SEQ ID NO: 17 son el péptido señal.
En otro aspecto, se predice que el polipéptido maduro en la numeración de la SEQ ID NO: 23 es aminoácidos 1 a 366 y se predice que el péptido señal es aminoácidos -199 a -183 en base al programa de predicción SignalP (Nielsen et al . , 1997, Protein Engineering 10: 1-6). En la téenica existe constancia de que una célula hospedera puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido diferente en el extremo C y/o el extremo N) expresados por el mismo polinucleótido.
Secuencia que codifica el polipéptido maduro: La expresión "secuencia que codifica el polipéptido maduro" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro con actividad proteasa. En un aspecto, la secuencia que codifica el polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos comprendidos entre el 605 y el 1702 de la numeración de la SEQ ID NO: 1 en base a la determinación del polipéptido maduro mediante la degradación de Edman y el análisis de peso molecular intacto del polipéptido maduro con marcador HQ C-terminal. Además, se predice que los nucleótidos 11 a 61 en la numeración de la SEQ ID NO: 1 codifican un péptido señal en base al programa de predicción SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6).
En otro aspecto, la secuencia que codifica el polipéptido maduro es la secuencia unida de nucleótidos 707 a 853, nucleótidos 912 a 1022, nucleótidos 1077 a 1276, nucleótidos 1332 a 1469, nucleótidos 1531 a 1978 y nucleótidos 2031 a 2084 de la SEQ ID NO: 15 o la secuencia de ADNc de este en base a la determinación del polipéptido maduro mediante la degradación de Edman y el análisis de peso molecular intacto del polipéptido maduro. Se predice que los nucleótidos 1 a 51 en la numeración de la SEQ ID NO: 15 codifican un péptido señal en base al programa de predicción SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6). En otro aspecto, la secuencia que codifica el polipéptido maduro es nucleótidos 598 a 1695 de SEQ ID NO: 17 o la secuencia de ADNc de este en base a la determinación del polipéptido maduro mediante la degradación de Edman y el análisis de peso molecular intacto del polipéptido maduro. Se predice que los nucleótidos 1 a 51 en la numeración de la SEQ ID NO: 22 codifican un péptido señal en base al programa de predicción SignalP (Nielsen et al . , 1997, Protein Engineering 10: 1-6).
En otro aspecto, se predice que la secuencia que codifica el polipéptido maduro es la secuencia unida de nucleótidos 706 a 852, nucleótidos 914 a 1024, nucleótidos 1080 a 1279, nucleótidos 1333 a 1470, nucleótidos 1532 a 1979 y nucleótidos 2032 a 2085 de la SEQ ID NO: 20 o la secuencia de ADNc de este en base al programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que predice nucleótidos 1 a 51 de SEQ ID NO: 20 codifican un péptido señal. En otro aspecto, se predice que la secuencia que codifica el polipéptido maduro es nucleótidos 598 a 1695 de SEQ ID NO: 22 o la secuencia de ADNc de este en base al programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que predice los nucleótidos 1 a 51 de SEQ ID NO: 22 codifican un péptido señal.
Constructo de ácido nucleico: La expresión "constructo de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono- o bicatenaria, la cual se aísla a partir de un gen de origen natural o se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos que de otro modo no existiría en la naturaleza o que es sintética. La expresión constructo de ácido nucleico es un sinónimo de la expresión "casete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.
Ligado/a operablemente: La expresión "ligado operablemente" se refiere a una configuración en la cual se coloca una secuencia de control en una posición adecuada respecto a la secuencia codificante del polinucleótido de modo que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificante.
Actividad proteasa: El término "actividad proteasa" significa actividad proteolítica (EC 3.4). Existen varios tipos de actividad proteasa como proteasas tipo tripsina que se escinden en el lado del terminal carboxi de los residuos Arg y Lys y proteasas tipo quimotripsina que se escinden en el lado del terminal carboxi de residuos de aminoácidos hidrófobos. Las proteasas de la invención son serina endopeptidasas (EC 3.4.21) con un pH ácido óptimo (pH óptimo < pH 7).
La actividad proteasa se puede medir utilizando cualquier ensayo, en el que se emplee un sustrato, que incluya enlaces peptídicos relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. El pH del ensayo y la temperatura del ensayo también se han de adaptar a la proteasa en cuestión. Algunos ejemplos de los valores del pH del ensayo son pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12. Los ejemplos de temperaturas de ensayo son 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, o 95°C.
Lps ejemplos de sustratos generales de proteasa son caseína, albúmina de suero bovino y hemoglobina. En el método clásico de Anson y Mirsky, se utiliza hemoglobina desnaturalizada como sustrato y, después de la incubación del ensayo con la proteasa en cuestión, se determina la cantidad de hemoglobina soluble en ácido tricloroacético como una medición de la actividad proteasa (Anson, M.L. y Mirsky, A.E., 1932, J. Gen . Physiol . 16: 59 y Anson, M.L., 1938, J. Gen . Physiol . 22: 79).
A los fines de la presente invención, la actividad proteasa se determinó utilizando ensayos que se describen en "Materials and Methods", como el ensayo de Suc-AAPF-pNA cinético, ensayo de Protazyme AK, ensayo de Suc-AAPX-pNA cinético y o-Ftaldialdehído (OPA). En el ensayo con Protazyme AK, el sustrato Protazyme AK insoluble (caseína reticulada con azurina) libera un color azul cuando se incuba con la proteasa y se determina el color como una medición de la actividad proteasa. Para el ensayo con Suc-AAPF-pNA, el sustrato Suc-AAPF-pNA incoloro libera paranitroanilina amarilla cuando se incuba con la proteasa y se determina el color amarillo como una medición de la actividad proteasa.
Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos un 20%, p. e j . ,, al menos un 40%, al menos un 50%,al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% y al menos un 100% de actividad proteasa del polipéptido de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 y/o SEQ D NO: 24.
Identidad de secuencia: El grado de correlación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia".
A los efectos de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol . Biol . 48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite", Rice et al., 2000, Trends Gene t . 16: 276-277), preferentemente la versión 3.0.0 o versiones posteriores. Se utilizó la versión 6.1.0. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por la apertura de un hueco de 10, una penalización por la extensión de un hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EBL0SUM62 (versión EMBOSS de BL0SUM62). El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación: (Residuos idénticos x 100)/(Longitud de la alineación -Número total de huecos en la alineación) A los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias desoxirribonucleótidas se determina utilizando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite", Rice et al., 2000, mencionado anteriormente), preferentemente la versión 3.0.0 o versiones posteriores. Se utilizó la versión 6.1.0. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por la apertura de un hueco de 10, una penalización por la extensión de un hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud de la alineación - Número total de huecos en la alineación) Condiciones de rigurosidad: Las diferentes condiciones de rigurosidad se definen de la siguiente manera.
La expresión "condiciones de rigurosidad muy baja" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a una prehibridación e hibridación a 42 °C en 5x SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y un 25% de formamida, siguiendo procedimientos estándar de Southern Blot durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 45 °C.
La expresión "condiciones de rigurosidad baja" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a una prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y un 25% de formamida, siguiendo procedimientos estándar de Southern Blot durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 50 °C.
La expresión "condiciones de rigurosidad media" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a una prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y un 35% de formamida, siguiendo los procedimientos estándar de Southern Blot durante 12-24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces durante 15 minutos cada vez utilizando 2X SSC, un 0.2% de SDS a 55°C.
La expresión "condiciones de rigurosidad media-alta" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a una prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y un 35% de formamida, siguiendo los procedimientos estándar de Southern Blot de 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces durante 15 minutos cada vez utilizando 2X SSC, un 0.2% de SDS a 60°C.
El término "condiciones de rigurosidad alta" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C, en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y un 50% de formamida, siguiendo los procedimientos estándar de Southern Blot de 12 a 24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 65 °C.
El término "condiciones de rigurosidad muy alta" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C, en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y un 50% de formamida, siguiendo los procedimientos estándar de Southern Blot de 12 a 24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante ' 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 70 °C.
Subsecuencia: El término "subsecuencia" se refiere a un polinucleótido en el que se han eliminado uno o más (varios) nucleótidos del extremo 5' y/o 3' de la secuencia que codifica el polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad proteasa. En un aspecto, una subsecuencia contiene al menos 990 nucleótidos (p. ej., los nucleótidos comprendidos entre el 662 y el 1651 de la SEQ ID NO: 1) y, p. ej., al menos 1035 nucleótidos (p. ej., los nucleótidos comprendidos entre el 632 y el 1666 de la SEQ ID NO: 1); p. ej., al menos 1065 nucleótidos (p. ej., los nucleótidos comprendidos entre el 617 y el 1681 de la SEQ ID NO: 1).
Polinucleótido sustancialmente puro: La expresión "polinucleótido sustancialmente puro" se refiere a un preparado polinucleotídico exento de otros nucleótidos extraños o no deseados y que se encuentra en una forma adecuada para su uso en los sistemas de producción de polipéptidos modificados genéticamente. Por lo tanto, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0.5% en peso de otro material polinucleotídico con el cual está asociado de manera natural o recombinante. Sin embargo, un polinucleótido sustancialmente puro puede incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural, tales como promotores y terminadores. Preferentemente, el polinucleótido es al menos un 90% puro p.ej., al menos un 92% puro, al menos un 94% puro, al menos un 95% puro, al menos un 96% puro, al menos un 98% puro, al menos un 98% puro, al menos un 99% puro, y al menos un 99.5% o un 100% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención se encuentran preferentemente en una forma sustancialmente pura.
Polipéptido sustancialmente puro: La expresión "polipéptido sustancialmente puro" se refiere a un preparado que contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0.5% en peso de otro material polipeptídico con el cual está asociado de manera natural o recombinante. Preferentemente, el polipéptido tiene una pureza de al menos un 92%, p. ej., una pureza de al menos un 94%, una pureza de al menos un 95%, una pureza de al menos un 96%, una pureza de al menos un 97%, una pureza al menos un 98%, una pureza de al menos un 99%, una pureza de al menos un 99.5% y una pureza de un 100% en peso respecto al material polipeptídico total presente en el preparado. Los polipéptidos de la presente invención se encuentran preferentemente en una forma sustancialmente pura. Esto se puede conseguir, por ejemplo, preparando el polipéptido mediante métodos recombinantes de uso común o mediante métodos de purificación clásicos.
Variante: El término "variante" se refiere a un polipéptido que tiene actividad proteasa que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o eliminación de uno o más (varios) residuos aminoacídicos en una o más (varias) posiciones. Una sustitución se refiere al reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una supresión se refiere a la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción se refiere a una adición de 1-3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición. Las variantes de la presente invención tienen al menos un 20% por ejemplo, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 100% de actividad proteasa del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Polipéptidos que tienen actividad proteasa Los polipéptidos que tienen actividad proteasa, o proteasas, también se denominan a veces peptidasas, proteinasas, hidrolasas peptídicas o enzimas proteolíticas. Las proteasas pueden ser del tipo exo, que hidrolizan péptidos empezando en cualquiera de sus extremos, o bien de tipo endo, que actúan internamente en las cadenas polipeptídicas (endopeptidasas). Las endopeptidasas presentan actividad en sustratos peptídicos bloqueados en los extremos N y C terminales que son relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión.
El término "proteasa" se define en la presente como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Esta definición de proteasa también se aplica a la parte proteasa de las expresiones "proteasa original" y "variante de proteasa", tal como se utilizan en la presente. El término "proteasa" incluye cualquier enzima que pertenezca al grupo de enzimas EC 3.4 (incluidas cada una de las dieciocho subclases de estas). El número EC se refiere a la Nomenclatura de enzimas de 1992 de la NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, incluidos los suplementos 1-5 publicados en 1994, Eur. J. Biochem. 223: 1-5; 1995, Eur. J. Biochem. 232: 1-6; 1996, Eur. J. Biochem. 237: 1-5; 1997, Eur. J. Biochem. 250: 1-6; y 1999, Eur. J. Biochem. 264: 610-650, respectivamente. La nomenclatura se complementa y actualiza periódicamente; remítase, p. ej., a la dirección de Internet http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzy e/índex.html.
Las proteasas de la invención y para la utilización de acuerdo con la invención se seleccionan a partir del grupo constituido por: (a) proteasas que pertenecen al grupo de enzimas EC 3.4.21.; y/o (b) proteasas que pertenecen al grupo enzimático EC 3.4.14; y/o (c) Serina proteasas de la familia peptidasa S53 que comprende dos tipos diferentes de peptidasas: tripeptidil aminopeptidasas (tipo exo) y endopeptidasas; como se describe en 1993, Biochem. J. 290:205-218 y en la base de datos de proteasas MEROPS, emisión 9.4 (31 de enero de 2011) (www.merops.ac.uk). La base de datos se describe en Rawlings, N.D., Barrett, A.J. y Bateman, A., 2010, "MEROPS: the peptidase database", Nucí . Acids Res . 38: D227-D233.
Para determinar si una proteasa particular es una serina proteasa y una proteasa de la familia S53, se hace referencia al libro de texto anterior y a los principios indicados en este. La determinación se puede llevar a cabo para todos los tipos de proteasas, ya sean proteasas de origen natural o genéticamente intactas; o proteasas sintéticas o modificadas genéticamente.
La familia de peptidasas S53 contiene endopeptidasas que actúan sobre ácidos y tripeptidil-peptidasas. Los residuos de la tríada catalítica son Glu, Asp, Ser, y hay un residuo ácido adicional, Asp, en el hueco del oxianión. El orden de los residuos es Glu, Asp, Asp, Ser. El residuo Ser es el nucleófilo equivalente a Ser en la tríada Asp, His, Ser de la subtilisina y Glu de la tríada es un sustituto para la base general, His, en subtilisina.
La mutación de cualquiera de los aminoácidos de la tríada catalítica o el hueco del oxianión provocará un cambio o una pérdida de actividad enzimática. Los aminoácidos de la tríada catalítica y el hueco del oxianión de la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (SEQ ID NO: 5) son probablemente posiciones Glu-85, Asp-89, Asp-175 y Ser-283. Los aminoácidos de la tríada catalítica y el hueco del oxanión de la proteasa 1 de S53 de Trametes versicolor (SEQ ID NO: 19) son probablemente posiciones Glu-85, Asp-89, Asp-175 y Ser-283. Los aminoácidos de la tríada catalítica y el hueco del oxianión de la proteasa 2 de S53 de Trametes versicolor (SEQ ID NO: 24) son probablemente posiciones Glu-85, Asp-89, Asp-175 y Ser-283.
Las peptidasas de la familia S53 tienden a ser más activas a pH ácido (a diferencia de las subtilisinas homologas), y esto se puede atribuir a la importancia funcional de los residuos carboxílíeos, principalmente Asp en el hueco del oxianión. Las secuencias de aminoácidos no son estrechamente similares a aquellas en la familia S8 (es decir, subtilisinas serina endopeptidasa y sus homólogos) y eso, tomado junto con los residuos de sitio activo diferentes y el pH menor resultante para la actividad maxima genera una diferencia sustancial para la familia. El pliegue proteico de la unidad peptidasa para miembros de esta familia es similar al de la subtilisina, que tiene Sb tipo clan.
Se identificó una nueva proteasa S53 de Meripilus giganteus con alta actividad a un pH bajo (3-4) en harina de maíz-soja y se clonó en relación con la invención. Para determinar si una proteasa particular es una serina proteasa y una proteasa de la familia S53, se hace referencia al libro de texto anterior y a los principios indicados en este. La determinación se puede llevar a cabo para todos los tipos de proteasas, ya sean proteasas de origen natural o genéticamente intactas; o proteasas sintéticas o modificadas genéticamente.
La presente invención proporciona polipéptidos con actividad proteasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Las proteasas de la invención son serina proteasas de la familia de peptidasas S53. Las proteasas de la invención exhiben propiedades de pH, especialmente propiedades de estabilidad del pH, que hacen que sean de interés sustancial como candidatos para uso en alimentos para animales y otras aplicaciones.
Las proteasas de la invención son proteasas ácidas con una preferencia por los residuos de aminoácidos hidrófobos como Leu, Tyr, Phe y Met en la posición P1. Las proteasas tienen alta actividad en Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA y Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA con un intervalo de pH amplio de 2 a 5 y retienen más del 95% de la actividad después de someterse 2 horas a un pH tan bajo como 3.
La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad proteasa seleccionados entre el grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 84% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; (b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 83% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; (c) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23; (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones de rigurosidad alta, o muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 3, (iii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15, (iv) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 17, (v) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20, (vi) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 22, (vii) la hebra complementaria completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) o (vi); (e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 84% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: lo SEQ ID NO: 3; (f) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 83% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15 O SEQ ID NO: 17; (g) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20 O SEQ ID NO: 22; (h) una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones; y (i) un fragmento de un polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h) que tiene actividad proteasa.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 85% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 86% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 87% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 88% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 O SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 89% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 90% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 91% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 92% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 93% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 94% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 95% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 96% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 97% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 98% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 99% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee un 100% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 O SEQ ID NO: 4.
La presente invención se relaciona con polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 de al menos un 84%, p. ej . , de al menos un 85%, de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, o un 100%, que tienen actividad proteasa. En un aspecto, el polipéptido difiere en no más de treinta aminoácidos, p. ej., en veinticinco aminoácidos, en veinte aminoácidos, en quince aminoácidos, en doce aminoácidos, en diez aminoácidos, en nueve aminoácidos, en ocho aminoácidos, en siete aminoácidos, en seis aminoácidos, en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos, en un aminoácido del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 84% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 85% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 86% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 87% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 88% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 89% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 90% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 91% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 92% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 93% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 94% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 95% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 96% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 97% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 98% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 99% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee un 100% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
La presente invención se relaciona con polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 de al menos un 83%, por ejemplo, de al menos un 84%, de al menos un 85%, de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, o un 100%, que tienen actividad proteasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren en no más de treinta aminoácidos, por ejemplo, en veinticinco aminoácidos, en veinte aminoácidos, en quince aminoácidos, en doce aminoácidos, en diez aminoácidos, en nueve aminoácidos, en ocho aminoácidos, en siete aminoácidos, en seis aminoácidos, en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos, en un aminoácido del polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 86% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 87% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 88% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 89% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 90% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 91% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 92% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 O SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 93% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 94% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 95% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 96% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 97% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 98% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee al menos un 99% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que posee un 100% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
La presente invención se relaciona con polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 de al menos un 85%, p. ej . , de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, o un 100%, que tienen actividad proteasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren en no más de treinta aminoácidos, por ejemplo, en veinticinco aminoácidos, en veinte aminoácidos, en quince aminoácidos, en doce aminoácidos, en diez aminoácidos, en nueve aminoácidos, en ocho aminoácidos, en siete aminoácidos, en seis aminoácidos, en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos, en un aminoácido del polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
La presente invención también se relaciona con el uso de polipéptidos aislados en alimentos para animales que tienen actividad proteasa seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; (b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; (c) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23; (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad media-alta, condiciones de rigurosidad alta, o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 3, (iii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15, (iv) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 17, (v) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20, (vi) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 22, (vii) la hebra complementaria completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) o (vi); (e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3; (f) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17; (g) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22; (h) una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones; y (i) un fragmento de un polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h) que tiene actividad proteasa.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 75% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 87% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 91% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 92% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 93% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 94% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 96% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 97% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 98% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia del 100% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
La presente invención se relaciona con el uso en alimentos para animales de polipéptidos que tienen una identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 de al menos un 60%, p. ej . , de al menos un 70%, de al menos un 80%, de al menos un 85%, de al menos un 87%, de al menos un %, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, o de un 100%, que tienen actividad proteasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren en no más de veinte aminoácidos, p. ej . , en quince aminoácidos, en diez aminoácidos, en ocho aminoácidos, en siete aminoácidos, en seis aminoácidos, en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos, y en un aminoácido de un polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 O SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 75% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 87% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 91% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 92% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 93% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 94% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 96% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 97% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 98% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia del 100% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
La presente invención se relaciona con el uso en alimentos para animales de polipéptidos que tienen una identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 de al menos un 60%, p. ej . , de al menos un 70%, de al menos un 80%, de al menos un 85%, de al menos un 87%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, o del 100%, que tienen actividad proteasa. En un aspecto los polipéptidos difieren en no más de veinte aminoácidos, p. ej . , en quince aminoácidos, en diez aminoácidos, en ocho aminoácidos, en siete aminoácidos, en seis aminoácidos, en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos, y en un aminoácido de un polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 75% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 87% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 91% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 92% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 93% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 94% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 96% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 97% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 98% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para uso en alimentos para animales que tiene una identidad de secuencia del 100% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
La presente invención se relaciona con el uso en alimentos para animales de polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 de al menos un 60%, p . ej . , de al menos un 70%, de al menos un 80%, de al menos un 85%, de al menos un 87%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, o del 100%, que tienen actividad proteasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren en no más de veinte aminoácidos, p. ej . , , en quince aminoácidos, en diez aminoácidos, en ocho aminoácidos, en siete aminoácidos, en seis aminoácidos, en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos, en un aminoácido del polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
En una modalidad particular, la presente invención también se relaciona con un método para preparar un alimento o aditivo alimentario para animales, que comprende preparar un alimento o composición del aditivo alimentario que comprende un alimento par animales y una proteasa seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) un polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; (b) un polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; (c) un polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23; (d) un polipéptido que tiene al menos un 60%, p.ej., al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; (e) un polipéptido que tiene al menos un 60%, p.ej., al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; y (f) un polipéptido que tiene al menos un 60%, p.ej., al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
La presente invención también se refiere a una composición de un aditivo alimentario o un alimento para animales que comprende un alimento para animales y una proteasa seleccionada a partir del grupo constituido por: (a) un polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; (b) un polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; (c) un polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23; (d) un polipéptido que tiene al menos un 60%, p.ej., al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; (e) un polipéptido que tiene al menos un 60%, p.ej., al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; y (f) un polipéptido que tiene al menos un 60%, p.ej., al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
En un aspecto, los polipéptidos difieren en no más de veinte aminoácidos, p. ej . , en quince aminoácidos, en diez aminoácidos, en ocho aminoácidos, en siete aminoácidos, en seis aminoácidos, en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos, en un aminoácido del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Las composiciones alimenticias para animales pueden tener, en modalidades particulares, la forma de una pelotilla,una pasta o composición líquida, como se describe en la presente.
Un polipéptido de la presente invención comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, una variante alélica de este; o es un fragmento faltante, por ejemplo, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 aminoácidos del N- y/o C-terminal y tiene actividad proteasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste del polipéptido de la SEQ ID NO: 5. En otro aspecto preferido, el polipéptido comprende o consiste de aminoácidos 1 a 366 de la SEQ ID NO: 2.
Un polipéptido de la presente invención comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18, una variante alélica de este; o es un fragmento faltante, por ejemplo, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 aminoácidos del N- y/o C-terminal y tiene actividad proteasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste del polipéptido de la SEQ ID NO: 19. En otro aspecto preferido, el polipéptido comprende o consiste de los aminoácidos 1 a 366 de la SEQ ID NO: 16.
Un polipéptido de la presente invención comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23, una variante alélica de este; o es un fragmento faltante, por ejemplo 30, 25, 20, 15, 10 o 5 aminoácidos del N- y/o C-terminal y tiene actividad proteasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste del polipéptido de la SEQ ID NO: 24. En otro aspecto preferido, el polipéptido comprende o consiste de aminoácidos 1 a 366 de la SEQ ID NO: 21.
La presente invención también se relaciona con polipéptidos aislados que tienen actividad proteasa que son codificados por polinucleótidos que hibridan en condiciones de rigurosidad baja, condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad media-alta, condiciones de rigurosidad alta, o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, o (ii) la hebra complementaria completa (i) (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, ? Laboratory Manual , 2.a edición, Coid Spring Harbor, Nueva York).
El polinucleótido de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 20; o una subsecuencia de este, así como la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 o un fragmento de esta, se pueden utilizar para diseñar sondas de ácido nucleico con el fin de identificar y clonar polipéptidos que codifican ADN que tiene actividad proteasa de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con métodos muy conocidos en la téenica. En particular, este tipo de sondas se pueden utilizar en la hibridación con el ADNc o genómico del género o especie de interés, siguiendo los procedimientos estándar de la Southern Blot, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en este. Este tipo de sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben tener una longitud de al menos 14, p. ej., al menos 25, al menos 35 o al menos 70 nucleótidos. Preferentemente, la sonda de ácido nucleico tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos, p. ej., al menos 200 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos o al menos 900 nucleótidos. Se pueden utilizar sondas tanto de ADN como de ARN. Las sondas se etiquetan típicamente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidina). La presente invención abarca este tipo de sondas.
Se puede cribar una colección de ADN genómico o ADNc preparada a partir de otras cepas de este tipo para detectar ADN que se hibride con las sondas descritas anteriormente y que codifique un polipéptido que tiene actividad proteasa. El ADN genómico o de otro tipo procedente de otras cepas de este tipo se puede separar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, o mediante otras téenicas de separación. El ADN de las colecciones o el ADN separado se puede transferir a nitrocelulosa u otro material portador adecuado e inmovilizarlo sobre este. Con el fin de identificar un clon o ADN que sea homólogo con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 20 o una subsecuencia de este, el material portador se utiliza preferentemente en una Southern Blot.
A los efectos de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido se híbrida con una sonda de ácido nucleico marcada correspondiente a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 20, su hebra complementaria completa o una subsecuencia de esta en condiciones de rigurosidad muy baja a muy alta. Las moléculas con las cuales se híbrida la sonda de ácido nucleico en estas condiciones se pueden detectar utilizando, por ejemplo, una película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido en la téenica.
En un aspecto, la sonda de ácido nucleico es la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 20. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es un fragmento de esta. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21 o un fragmento de este. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 20.
Para sondas largas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, las condiciones de rigurosidad de alta a muy alta se definen como la prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y ya sea formamida al 25% para rigurosidades muy bajas y bajas, formamida al 35% para rigurosidades medias y medias-altas, o formamida al 50% para rigurosidades altas y muy altas, siguiendo los procedimientos estándar de la Southern Blot durante 12-24 horas idealmente. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 65 °C (rigurosidad alta) y a 70 °C (rigurosidad muy alta).
Para sondas cortas con una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos, se definen las condiciones de rigurosidad como una prehibridación e hibridación a una temperatura de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 10 °C por debajo de la Tf calculada utilizando los cálculos de acuerdo con Bolton y McCarthy (1962, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 48:1390) en NaCl 0.9 M, Tris-HCl 0.09 M pH 7.6, EDTA 6 mM, un 0.5% de NP-40, IX de solución de Denhardt, pirofosfato sódico 1 mM, fosfato sódico monobásico 1 mM, ATP 0.1 mM y 0.2 mg de ARN de levadura por mL, empleando a continuación los procedimientos estándar de la Southern Blot de 12 a 24 horas idealmente. Finalmente, el material portador se lava una vez en 6X SCC con un 0.1% de SDS durante 15 minutos y dos veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 6X SSC a una temperatura de 5 °C a 10 °C por debajo de la Tf calculada.
La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados con actividad proteasa codificados por polinucleótidos que poseen una identidad de secuencia respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 de al menos un 84%, p. ej., al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.
La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados con actividad proteasa codificados por polinucleótidos que poseen una identidad de secuencia respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15 de al menos un 83%, p. ej . , de al menos un 84%, de al menos un 85%, de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, o un 100%.
La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados con actividad proteasa codificados por polinucleótidos que poseen una identidad de secuencia respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20 de al menos un 85%, p. ej . , de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, o un 100%.
En otra modalidad, la presente invención se relaciona con variantes que comprenden una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia homologa a esta. Los cambios en aminoácido pueden ser de una naturaleza menor, es decir, sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos conservadores que no afectan significativamente el pliegue y/o la actividad de la proteína; pequeñas supresiones, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones del terminal amino o carboxilo, como un residuo de metionina amino-terminal; un pequeño péptido vinculante de hasta aproximadamente 20 a 25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta o u otra función, como un marcador de poli-histidina o HQ, un epítopo antigénico o un dominio vinculante.
En otra modalidad, la presente invención se relaciona con variantes que comprenden una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 o una secuencia homologa a esta. Los cambios de aminoácidos pueden ser de una naturaleza menor, es decir, sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos conservadores que no afectan significativamente el pliegue y/o la actividad de la proteína; pequeñas supresiones, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones del terminal amino o carboxilo, como un residuo de metionina amino-terminal; un pequeño péptido vinculante de hasta aproximadamente 20 a 25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta o u otra función, como un marcador de poli-histidina o HQ, un epítopo antigénico o un dominio vinculante.
En otra modalidad, la presente invención se relaciona con variantes que comprenden una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 o una secuencia homologa a esta. Los cambios de aminoácidos pueden ser de una naturaleza menor, es decir, sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos conservadores que no afectan significativamente el pliegue y/o la actividad de la proteína; pequeñas supresiones, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones del terminal amino o carboxilo, como un residuo de metionina amino-terminal; un pequeño péptido vinculante de hasta aproximadamente 20 a 25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta o u otra función, como un marcador de poli-histidina o HQ, un epítopo antigénico o un dominio vinculante.
Las sustituciones dentro del grupo de los aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos de bajo peso molecular (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) son ejemplos de sustituciones conservadoras. En la téenica existe constancia de sustituciones de aminoácidos que no alteran generalmente la actividad específica y han sido descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, Nueva York. Los intercambios que tienen lugar con mayor frecuencia y de los que se espera que no alteren sustancialmente la actividad específica son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.
De forma alternativa, los cambios de los aminoácidos son de una naturaleza tal que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos se alteran. Por ejemplo, los cambios de los aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad por el sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.
Se pueden identificar los aminoácidos esenciales en el polipéptido original de acuerdo con procedimientos de uso común en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última téenica, se introducen mutaciones de una única alanina en cada residuo de la molécula y las moléculas mutadas resultantes se evalúan para determinar su actividad proteasa con el fin de identificar los residuos aminoacídicos que son cruciales para la actividad de la molécula. Remítase también a Hilton et al., 1996, J. Biol . Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante el análisis físico de la estructura, que se determina mediante técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o mareaje de fotoafinidad, junto con la mutación de posibles aminoácidos del sitio de contacto. Remítase, por ejemplo, a de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol . Biol . 224: 899-904; Wlodaver et al . , 1992, FEBS Lett.309: 59-64. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden deducir a partir del análisis de las identidades con polipéptidos relacionados con el polipéptido original.
Las sustituciones, supresiones y/o inserciones de un único aminoácido o de múltiples aminoácidos se pueden realizar y evaluar utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o reordenamiento, seguidos de un procedimiento de cribado relevante, como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 86: 2152-2156; WO 95/17413 o WO 95/22625.
Otros métodos que pueden utilizarse incluyen PCR propensa a error, despliegue de fagos ( p. ej . , Lowman et al . , 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente de EE.UU. N.° 5.223.409; WO 92/06204), mutagénesis dirigida a una región (Derbyshire et al . , 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
Los métodos de mutagénesis/reordenamiento se pueden combinar con métodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutados clonados expresados por las células hospederas (Ness et al . , 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN utagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden recuperarse de las células hospederas y rápidamente secuenciarse utilizando métodos estándar en la téenica. Estos métodos permiten determinar rápidamente la importancia de residuos aminoacídicos individuales en un polipéptido.
La presente invención también se relaciona con polipéptidos variantes que tienen actividad proteasa y tienen una identidad de secuencia de al menos un 84%, p.ej., al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% respecto de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 que comprende al menos una sustitución, eliminación y/o inserción de al menos uno o mas (van os) aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 O SEQ ID NO: 4 O una secuencia homologa de este.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 85% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 86% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 87% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 88% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 89% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 90% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 91% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 92% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 93% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 94% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 95% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 96% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 97% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 98% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 99% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 5.
El número total de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 no es mayor que 20, p. ej . , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20.
La presente invención también se relaciona con polipéptidos variantes que tienen actividad proteasa y que tienen una identidad de secuencia de al menos un 83%, p.ej., de al menos un 84%, de al menos un 85%, de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, o de al menos un 99% respecto de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 que comprende al menos una sustitución, eliminación y/o inserción de al menos uno o más (varios) aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 o el V polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 o una secuencia homologa de este.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 84% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 85% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 86% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 87% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 88% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 89% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 90% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 91% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 92% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 93% de identidad de secuencia respectó a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 94% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 95% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 96% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 97% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 98% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 99% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 19.
El número total de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 no es mayor que 20, p. ej . , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20.
La presente invención también se relaciona con polipéptidos variantes que tienen actividad proteasa y que tienen una identidad de secuencia de al menos un 85%, p.ej., de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, o de al menos un 99% respecto de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 que comprende al menos una sustitución, eliminación y/o inserción de al menos uno o más (varios) aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 o una secuencia homologa de este.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 86% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 87% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 88% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 89% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 90% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 91% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 92% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 93% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 94% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 95% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 96% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 97% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 98% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El polipéptido variante de la invención puede tener, en una modalidad, al menos un 99% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 24.
El número total de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 no es mayor que 20, e. g. , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20.
El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el cual una porción de un polipéptido se fusiona en el extremo N o en el extremo C de una porción de otro polipéptido.
El polipéptido puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión escindible en donde otro polipéptido se fusiona en el extremo N o extremo C del polipéptido de la presente invención. Un .polipéptido fusionado se produce fusionando un polinucleótido que codifica otro polipéptido con un polinucleótido de la presente invención. Las téenicas para producir polipéptidos de fusión son de uso común en la materia e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en fase y que la expresión del polipéptido fusionado esté controlada por el mismo promotor o promotores y por el mismo terminador. Las proteínas de fusión también se pueden construir utilizando la tecnología de las inteínas, en la cual las fusiones se crean después de la traducción (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
Un polipéptido de fusión puede comprender además un sitio de escisión entre los dos polipéptidos.Al secretar la proteína de fusión, el sitio se escinde y se liberan los dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, sin carácter limitante, los sitios descritos en Martin et al . , 2003, J. Ind. Microbiol . Biotechnol . 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol . 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl . Environ. Microbiol . 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; Contreras et al., 1991,. Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Cárter et al., 1989, Proteins : Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
El polipéptido puede ser expresado por una secuencia de ADN recombinante que contenga la codificación de un marcador His o un marcador HQ para obtener, después de cualesquiera modificaciones postraduccionales, el polipéptido maduro que contenga el marcador His o HQ íntegro o parte de este. El marcador HQ que tiene la secuencia -RHQHQHQ puede escindirse total o parcialmente del polipéptido durante las modificaciones postraduccionales resultando en por ejemplo, aminoácidos -RHQHQHQ adicionales adjuntados al C-terminal del polipéptido maduro.
Las moléculas de carbohidrato suelen estar unidas a un polipéptido de una fuente fúngica durante una modificación postraduccional. Para ayudar en el análisis de espectrometría de masas, el polipéptido puede incubarse con una endoglicosidasa a un deglicosilato, cada uno en posición unida a N. Para cada sitio N- vinculado deglicosilado, una acetil hexosamina N- permanece en la proteína.
Modalidades En ciertas modalidades de la invención, la proteasa de la invención exhibe propiedades térmicas beneficiosas tales como termoestabilidad, estabilidad frente al vapor, etc., y/o propiedades relacionadas con el pH tales como la estabilidad a pH ácido, pH óptimo, etc.
Una modalidad de la invención es polipéptidos aislados que tienen mejor actividad proteasa mejorada entre pH 2 y 5, como entre pH 2 y 4, preferentemente, entre pH 3 y 5, o más preferentemente entre pH 3 y 4, a 25°C en comparación con la proteasa 10R.
Otra modalidad de la invención es polipéptidos aislados que tienen mejor actiidad proteasa en por ejemplo, 60°C o menor, preferentemente 50°C o menor, más preferentemente 37°C o menor; entre 25°C y 60°C, preferentemente entre 25°C y 50°C; o en 25°C o en 37°C en comparación con la proteasa 10R.
Una modalidad adicional de la invención es actividad proteasa mejorada en una harina de maíz-soja entre un pH 3.0 y 4.0 en 40°C en comparación con la proteasa 10R.
Otra modalidad de la invención es actividad proteolítica mejorada en el material digerido de pollos de engorde expresada como un aumento en el nivel de las aminas primarias en el material digerido del buche y/o molleja después de una incubación de 3 o 1 hora cuando se compara con la muestra en blanco no tratada con proteasa y cuando se compara a una muestra tratada con proteasa 10R.
Propiedades de acidez/alcalinidad En ciertas modalidades de la invención, la proteasa de la invención exhibe propiedades beneficiosas en lo que respecta al pH, tales como estabilidad a pH ácido, pH óptimo, etc. La estabilidad de la proteasa a pH bajo es beneficiosa, ya que la proteasa puede poseer actividad en el intestino después de pasar por el estómago. En una modalidad de la invención, la proteasa retiene > del 70% de la actividad, como >del 95% de actividad después de 2 horas a un pH de 3 como se determina utilizando el método descrito en el Ejemplo 3.
Temperatura-actividad El perfil de temperatura-actividad de la proteasa se puede determinar tal como se describe en el Ejemplo 3. La actividad a temperaturas bajas (30-40 °C) puede ser beneficiosa para la digestión de proteínas en un animal.
En una modalidad, la invención comprende una proteasa que tiene un perfil de temperatura-actividad a pH 4.0 con una actividad relativa mayor o igual a 0.20 a 25 °C, o una actividad relativa mayor o igual a 0.50 a 37 'C cuando se compara con la actividad de la proteasa a 50 °C (cf. Ejemplo 3).
Termoestabi1idad La terraoestabilidad se puede determinar tal como se describe en el Ejemplo 6, es decir, utilizando mediciones de CDB para determinar la temperatura de desnaturalización, Td, de la proteína proteasa purificada. La Td es indicativa de la termoestabilidad de la proteína: cuanto mayor sea la Td, mayor será la termoestabilidad. Por consiguiente, en una modalidad preferida, la proteasa de la invención posee una Td que es mayor que la Td de una proteasa de referencia, donde la Td se determina en muestras de proteasa purificadas (preferentemente con una pureza de al menos un 90% o 95%, según se determina por SDS-PAGE).
En modalidades preferidas, las propiedades térmicas como la estabilidad térmica, la estabilidad con la temperatura, la termoestabilidad, la estabilidad frente al vapor y/o la estabilidad en el proceso de formación de microesferas tal como las proporciona la actividad residual, la temperatura de desnaturalización Td, u otro parámetro de la proteasa de la invención es mayor que el valor correspondiente, como la actividad residual o Td, de la proteasa de SEQ ID NO: 6, más preferentemente al menos un 101% de este, o al menos un 102%, un 103%, un 104%, un 105%, un 106%, un 107%, un 108%, un 109% o al menos un 110% de este. Incluso más preferentemente, el valor del parámetro, tal como la actividad residual o Td, de la proteasa de la invención es al menos un 120%, un 130%, un 140%, un 150%, un 160%, un 170%, un 180% o al menos un 190 del valor para la proteasa de la SEQ ID NO: 6.
En modalidades preferidas, las propiedades térmicas como la estabilidad térmica, la estabilidad con la temperatura, la termoestabilidad, la estabilidad frente al vapor y/o la estabilidad en el proceso de formación de microesferas tal como las proporciona la actividad residual, la temperatura de desnaturalización Ta, u otro parámetro de la proteasa de la invención es mayor que el valor correspondiente, como la actividad residual o Ta, de la proteasa de SEQ ID NO: 19, más preferentemente al menos un 101% de este, o al menos un 102%, un 103%, un 104%, un 105%, un 106%, un 107%, un 108%, un 109% o al menos un 110% de este. Incluso más preferentemente, el valor del parámetro, tal como la actividad residual o Ta, de la proteasa de la invención es al menos un 120%, un 130%, un 140%, un 150%, un 160%, un 170%, un 180% o al menos un 190% del valor para la proteasa de la SEQ ID NO: 19.
En modalidades preferidas, las propiedades térmicas como la estabilidad térmica, la estabilidad con la temperatura, la termoestabilidad, la estabilidad frente al vapor y/o la estabilidad en el proceso de formación de microesferas tal como las proporciona la actividad residual, la temperatura de desnaturalización Ta, u otro parámetro de la proteasa de la invención es mayor que el valor correspondiente, como la actividad residual o Td, de la proteasa de SEQ ID NO: 24, más preferentemente al menos un 101% de este, o al menos un 102%, un 103%, un 104%, un 105%, un 106%, un 107%, un 108%, un 109% o al menos un 110% de este. Incluso más preferentemente, el valor del parámetro, tal como la actividad residual o Td, de la proteasa de la invención es al menos un 120%, un 130%, un 140%, un 150%, un 160%, un 170%, un 180% o al menos un 190% del valor para la proteasa de la SEQ ID NO: 24.
En otras modalidades particulares adicionales, la proteasa termoestable de la invención tiene una temperatura de fusión Tf (o una temperatura de desnaturalización, Td), según se determina mediante calorimetría diferencial de barrido (CDB) tal como se describe en el Ejemplo 10 (es decir, en acetato de sodio 20 mM, pH 4.0) de al menos 50 °C. En otras modalidades particulares adicionales, la Tf es de al menos 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o al menos 100 °C.
Estabilidad frente al vapor La estabilidad frente al vapor se puede determinar tal como se describe en el Ejemplo 7 determinando la actividad residual de las moléculas de proteasa después de un tratamiento con vapor a 85 °C o 90 °C durante un período corto.
Estabilidad de pelotillas La estabilidad de pelotillas se puede determinar tal como se describe en el Ejemplo 8 utilizando pelotillado enzimático premezclado con un alimento. Al salir de la mezcladora, el alimento se acondiciona con vapor a 95 °C. Una vez acondicionado, el alimento se comprime en forma de microesferas y se determina la actividad residual.
Fuentes de polipéptidos que tienen actividad proteasa Un polipéptido que tiene actividad proteasa de la presente invención puede obtenerse de hongos de cualquier género. A los efectos de la presente invención, la expresión "obtenido a partir de", tal como se utiliza en la presente en relación con una fuente determinada, significará que el polipéptido codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la cual se ha insertado el polinucleótido procedente de la fuente. En un aspecto, el polipéptido obtenido a partir de una fuente determinada se secreta extracelularmente.
El polipéptido puede ser un polipéptido fúngico. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido que tiene actividad proteasa de entre un filo como Basidiomycota. En un aspecto, el polipéptido es una proteasa de un hongo de la clase Agaricomycetes, como del orden de Polyporales , o de la familia Coriolaceae, o del género Meripilus o del género Trametes.
Se sobreentenderá que, para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, p. ej., anamorfos, independientemente del nombre de la especie con el cual se los conoce . Los expertos en la tecnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados .
Las cepas de estos taxones son de dominio público y se puede acceder a ellas fácilmente en una serie de colecciones de cultivos , tales como la American Type Cul ture Collection (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Centraalbureau Voor Schimmel cul tures (CBS) y Agricul tural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) .
El polipéptido puede identif icarse y obtenerse de otras fuentes que incluyen microorganismos aislados de muestras naturales ( p. ej . , suelo, compuestos, agua, etc. ) o de ADN obtenidas directamente de materiales naturales {p. ej . , suelo, abono, agua, etc. ) utilizando las sondas anteriormente mencionadas. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente a partir de hábitats naturales son de uso común en la técnica. Un polinucleótido que codifica el polipéptido puede obtenerse mediante el análisis similar de una colección de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo o una muestra de ADN mezclada. Una vez que el polinucleótido que codifica un polipéptido ha sido detectado con las sondas, el polinucleótido puede aislarse o clonarse utilizando técnicas que son conocidas por los entendidos en la técnica (ver, p. ej . , Sambrook et al . , 1989 , supra) .
Polinucleótidos La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de la presente invención.
Las téenicas utilizadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica un polipéptido son de uso común en la materia e incluyen el aislamiento a partir de ADN genómico, la preparación a partir de ADNc o una combinación de estas. La clonación de polinucleótidos a partir de ADN genómico de este tipo se puede efectuar, p. ej., utilizando la conocidísima reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) o el cribado con anticuerpos de las colecciones de expresión para detectar fragmentos de ADN clonado con características estructurales compartidas. Remítase, p. ej., a Innis et al . , 1990, PCR: A Guide t o Methods and Applicat on, Academic Press, Nueva York. Se pueden utilizar otros procedimientos de ampliación del ácido nucleico como la reacción de la cadena ligasa (LCR, por sus siglas en inglés), una transcripción activada por ligación (LAT, por sus siglas en inglés) y ampliación en base al polinucleótido (NASBA, por sus siglas en inglés). Los polinucleótidos pueden clonarse a partir de una cepa de Bacillus sp., o un organismo diferente o relacionado del orden Bacillales y, por tanto, pueden ser, por ejemplo, una variante alélica o de especie de la región del polinucleótido que codifica el polipéptido.
La presente invención también se relaciona con polinucleótidos aislados que comprenden o consisten de polinucleótidos que tienen un grado de identidad de secuencia respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 de al menos un 84%, p. ej . , de al menos un 85%, de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, o un 100%, que codifican un polipéptido que tiene actividad proteasa.
La presente invención también se relaciona con polinucleótidos aislados que comprenden o consisten de polinucleótidos que tienen un grado de identidad de secuencia respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15 de al menos un 83%, p. ej . , de al menos un 84%, de al menos un 85%, de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, o un 100%, que codifica un polipéptido que tiene actividad proteasa.
La presente invención también se relaciona con polinucleótidos aislados que comprenden o consisten de polinucleótidos que tienen un grado de identidad de secuencia respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20 de al menos un 85%, p. ej . , de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93 de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, o un 100%, que codifican un polipéptido que tiene actividad proteasa.
Puede que sea necesario modificar un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención para sintetizar polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. La expresión "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas del polipéptido que no son de origen natural. Estos polipéptidos pueden diferir en cierto modo modificado del polipéptido aislado a partir de su fuente nativa, p. ej., variantes que difieren en la actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo o similares. La variante puede construirse a partir del polinucleótido presentado como la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 20, p. ej., una subsecuencia de esta, y/o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que no provocan un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero las cuales corresponden al uso del codón del organismo hospedador destinado a la producción de la enzima, o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para consultar una descripción general de una sustitución de nucleótidos, remítase a, p. ej., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos de la presente invención, los cuales se hibridan en condiciones de rigurosidad muy baja, condiciones de rigurosidad baja, condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad media-alta, condiciones de rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, o (iii) la hebra complementaria completa de (i) o (ii); o variantes alélicas y subsecuencias de estas (Sambrook et al., 1989, anteriormente), tal como se definen en la presente.
En un aspecto, el polinucleótido comprende o está constituido por la SEQ ID NO: 1, la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, o una subsecuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica un fragmento de la SEQ ID NO: 2 que tiene actividad proteasa, como el polinucleótido de los nucleótidos 605 a 1702 de SEQ ID NO: 1.
La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos de la presente invención, los cuales se hibridan en condiciones de rigurosidad muy baja, condiciones de rigurosidad baja, condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad media-alta, condiciones de rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipeptido maduro de la SEQ ID NO : 15 , ( ii ) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 15 , o ( iii) la hebra complementaria completa de ( i) o ( ii) ; o variantes alélicas y subsecuencias de estas (Sambrook et al . , 1989 , anteriormente) , tal como se definen en la presente .
En un aspecto, el polinucleót ido comprende o está constituido por la SEQ ID NO : 15 , la secuencia que codif ica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 15 , o una subsecuencia de la SEQ ID NO : 15 que codifica un fragmento de la SEQ ID NO : 16 que tiene actividad proteasa, como la secuencia unida de los polinucleótidos 1207 a 1353 , nucleótidos 1412 a 1522 , nucleótidos 1577 a 1776 , nucleótidos 1832 a 1969 , nucleótidos 2031 a 2478 y nucleótidos 2531 a 2584 de la SEQ ID NO : 15.
La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos de la presente invención, los cuales se hibridan en condiciones de rigurosidad muy baja, condiciones de rigurosidad baja, condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad media-alta, condiciones de rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20, o (iii) la hebra complementaria completa de (i) o (ii) ; o variantes alélicas y subsecuencias de estas (Sambrook et al . , 1989, anteriormente) , tal como se def inen en la presente .
En un aspecto, el polinucleótido comprende o está constituido por la SEQ ID NO: 20, la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20, o una subsecuencia de la SEQ ID NO: 20 que codifica un fragmento de la SEQ ID NO: 21 que tiene actividad proteasa, como la secuencia unida de los nucleótidos 1206 a 1352, nucleótidos 1414 a 1524, nucleótidos 1580 a 1779, nucleótidos 1833 a 1970, nucleótidos 2032 a 2479 y nucleótidos 2532 a 2585 de la SEQ ID NO: 20. Constructos de ácido nucleico La presente invención también se refiere a constructos de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido de la presente invención ligado operablemente a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un polinucleótido se puede manipular de diferentes maneras para hacer posible la expresión del polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las téenicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son conocidas en la técnica.
La secuencia de control puede ser una secuencia promotora, un polinucleótido que es reconocido por una célula hospedadora para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. La secuencia promotora contiene secuencias de control de la transcripción que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad de transcripción en la célula hospedadora elegida, incluidos los promotores híbridos, truncados y mutados, y se puede obtener a partir de genes que codifiquen polipéptidos intracelulares o extracelulares, tanto homólogos como heterólogos respecto a la célula hospedadora.
Algunos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera bacteriana son los promotores obtenidos a partir del gen de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens ( amyQ), gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis ( amyL ) , gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis ( penP ) , gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus ( amyM ) , gen de la levansacarasa de Bacillus subtilis ( sacB), genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, gen crylIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operón de E. coli lac, promotor de E. coli t re (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gen de la agarasa Streptomyces coelicolor (dagA) , y gen de betalactamasa procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 80: 21-25). Se describen otros promotores en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American, 242: 74-94; y en Sambrook et al . , 1989, mencionado anteriormente. En el documento WO 99/43835 se describen ejemplos de promotores en tándem.
Algunos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula hospedadora de un hongo filamentoso son los promotores obtenidos a partir de los genes de la acetamidasa de Aspergillus nidulans, la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, la alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, la glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori { glaA), la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, la triosa-fosfato-isomerasa de Aspergillus oryzae, .la proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daría de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , lipasa de Rhizomucor miehei , aspártico-proteinasa de Rhizomucor miehei , beta-glucosidasa de Trichoderma reesei , celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei , celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei , endoglucanasa I dé Trichoderma reesei , endoglucanasa II de Trichoderma reesei , endoglucanasa III de Trichoderma reesei , endoglucanasa IV de Trichoderma reesei , endoglucanasa V de Trichoderma reesei , xilanasa I de Trichoderma reesei , xilanasa II de Trichoderma reesei , beta-xilosidasa de Trichoderma reesei , así como el promotor de NA2-tpi (un promotor modificado que incluye un gen que codifica una alfa-amilasa neutra en Aspergilli en el cual el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido procedente del gen que codifica la triosa-fosfato-isomerasa en Aspergilli ; los ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados, incluido el gen que codifica la alfa-amilasa neutra en Aspergillus niger en el cual el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido procedente del gen que codifica la triosa-fosfato-isomerasa en Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae) ; y promotores híbridos, truncados y mutados de estos.
En un hospedador de levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae , alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae , y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para células hospederas de tipo levadura se describen en Romanos et al . , 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, la cual es reconocida por una célula hospedadora para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está ligada operablemente al extremo 3' del polinucleótido que codifica el polipéptido. En la presente invención se puede utilizar cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora que se haya elegido.
Los terminadores preferidos para las células hospederas bacterianas se obtienen a partir de los genes de la proteasa alcalina de Bacillus clausii ( aprH ) , alfa-amilasa de Bacillus licheniformis ( amyL ) y ARN ribosómico de Escherichia coli (rrnB) .
Los terminadores preferidos para las células hospederas de tipo hongo filamentoso se obtienen a partir de los genes de la antranilato-sintasa de Aspergillus nidulans , glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, la TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y la proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum.
Los terminadores preferidos para las células hospederas de tipo levadura se obtienen a partir de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae , el citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) y la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células hospederas de tipo levadura se describen en Romanos et al . , 1992 , mencionado anteriormente.
La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm en dirección 31 de un promotor y en dirección 5' de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresión del gen.
Algunos ejemplos de regiones estabilizadores de ARNm adecuadas se obtienen a partir de un gen crylIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis(Hue et al . , 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).
La secuencia de control también puede ser un líder, una región no traducida de un ARNm que sea importante para la traducción por parte de la célula hospedera. El líder está unido operativamente al extremo 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Se puede utilizar cualquier líder que sea funcional en la célula hospedera.
Los líderes preferidos para las células hospederas de tipo hongo filamentoso se obtienen a partir de los genes de la TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa-fosfato-isomerasa de Aspergillus nidulans.
Los líderes adecuados para las células hospederas de tipo levadura se obtienen a partir de los genes de la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, la 3-fosfoglicerato-cinasa de Saccharomyces cerevisiae, el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la alcohol-deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae .
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia ligada operablemente al extremo 3’ del polinucleótido y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedadora como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede utilizar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedadora que se haya elegido.
Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células hospedadoras de tipo hongo filamentoso se obtienen a partir de los genes de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans , proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.
Las secuencias de poliadenilación útiles para las células hospederas de tipo levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Mol . Cellular Biol . 15: 5983-5990.
La secuencia de control también puede ser una región que codifique un péptido señal, la cual codifica un péptido señal ligado al extremo N de un polipéptido y dirige el polipéptido a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener de manera intrínseca una secuencia que codifique un péptido señal ligada de manera natural en el marco de lectura de la traducción al segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia que codifique un péptido señal que sea exógena respecto a la secuencia codificante. La secuencia que codifica un péptido señal exógena puede ser necesaria cuando la secuencia codificante no contenga de manera natural una secuencia que codifique un péptido señal.De manera alternativa, la secuencia que codifica un péptido señal exógena puede simplemente reemplazar a la secuencia que codifica un péptido señal natural con el fin de mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, puede utilizarse cualquier secuencia que codifique un péptido señal que dirija el polipéptido expresado a la vía secretora de la célula hospedadora elegida.
Las secuencias que codifican el péptido señal efectivo para células hospederas bacterianas son las secuencias que codifica el péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltógena de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa Bacillus stearothermophilus, proteasas neutrales de Bacillus stearothermophilus ( nprT, nprS, nprM) , Bacillus suhtilis prsA y Bascillus lentus. Se describen otros péptidos señal en Simonen y Palvá, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Las secuencias codificantes del péptido de señal efectivas para las células hospedadoras del tipo hongo filamentoso son las secuencias codificantes del péptido de señal obtenidas de los genes para amilasa neutral de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens , lipasa de Humicola lanuginosa, y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei .
Los péptidos señal útiles para las células hospederas de tipo levadura se obtienen a partir de los genes del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y de la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias que codifican péptidos señal útiles se describen en Romanos et al . , 1992, mencionado anteriormente.
La secuencia de control también puede ser una secuencia que codifique un propéptido, la cual codifica un propéptido situado en el extremo N de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o un propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Generalmente, un propolipéptido es inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo mediante la escisión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La secuencia que codifica un propéptido puede obtenerse a partir de los genes de la proteasa alcalina ( aprE ) de Bacillus subtilis, la proteasa neutra ( nprT ) de Bacillus subtilis , la lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae .
Cuando tanto la secuencia del propéptido como la del péptido señal están presentes en el extremo N de un polipéptido, la secuencia del propéptido se coloca a continuación del extremo N de un polipéptido y la secuencia del péptido señal se coloca a continuación del extremo N de la secuencia del propéptido.
También puede ser conveniente añadir - secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido respecto al crecimiento de la célula hospedadora. Algunos ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que provocan la expresión del gen que se ha de activar o desactivar como respuesta a un estímulo físico o químico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procariotas incluyen los sistemas operadores lac, tac y tr p. En levaduras, se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongo filamentoso, se puede utilizar el promoter glucoamilasa de Aspergillus niger, promotor TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae, y promotor glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato-reductasa, que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de las metalotioneínas, que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido estaría ligado operablemente a la secuencia reguladora.
Vectores de expresión La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales terminadoras de la transcripción y la traducción. Los diferentes nucleótidos y secuencias de control se pueden unir entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica el polipéptido en tales sitios. De manera alternativa, el polinucleótido se puede expresar insertando el polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que comprenda la secuencia en un vector adecuado para la expresión. Cuando se crea el vector de expresión, la secuencia codificante se sitúa en el vector de modo que la secuencia codificante esté ligada operablemente a las secuencias de control adecuadas para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o un virus) que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y que pueda propiciar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual se vaya a introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que exista como una entidad extracromosómica, cuya replicación sea independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación. Como alternativa, el vector puede ser aquel que, cuando se introduzca en la célula hospedera, se integre en el genoma y se replique junto con el o los cromosomas en los cuales se haya integrado. Además, se puede utilizar un vector o plásmido único o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total a introducirse en el genoma de la célula hospedera, o transposón.
El vector contiene preferentemente uno o más (varios) marcadores seleccionables que permiten una selección sencilla de las células transformadas, transíectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a virus o biocidas, resistencia a metales pesados, prototrofia a los auxótrofos y similares.
Los ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son genes Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis dal, o marcadores que confieren resistencia antibiótica como resistencia a la ampicilina, al cloranfenicol, a la canamicina, a la neomicina, espectinomicina o tetracielina. Algunos marcadores adecuados para células hospederas de tipo levadura incluyen, sin carácter limitante, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables que se pueden utilizar en una célula hospedera de tipo hongo filamentoso incluyen, sin carácter limitante, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina-acetiltransferasa), hph (higromicina-fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato-adeniltransferasa) y t rpC (antranilato-sintasa), así como también sus equivalentes. Para uso en una célula de Aspergillus se prefieren genes d eAspergillus nidulans o Aspergillus oryzae amdS y pyrG y un gen de Streptomyces hygroscopicus bar.
El vector contiene preferentemente uno o más elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula hospedera o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
La integración del vector en el genoma de la célula hospedadora puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homologa o no homologa. Como alternativa, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homologa en el genoma de la célula hospedera en una o más ubicaciones concretas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación concreta, los elementos de integración deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como entre 100 y 10000 pares de bases, entre 400 y 10000 pares de bases y entre 800 y 10000 pares de bases, que posean un grado de identidad de secuencia elevado respecto a la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de una recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia diana en el genoma de la célula hospedera. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos codificantes o no codificantes. Por otra parte, el vector se puede integrar en el genoma de la célula hospedera mediante recombinación no homologa.
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que .permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula hospedera en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que regule la replicación autónoma que esté en funcionamiento en una célula.La expresión "origen de replicación" o "replicador plasmídico" se refiere a un polinucleótido que permite la replicación in vivo de un plásmido o vector.
Algunos ejemplos de orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184,que permiten la replicación en E. coli, y pUBU O, pE194, pTA1060 y pAMSl, que permiten la replicación en Bacillus .
Algunos ejemplos de orígenes de replicación que se pueden utilizar en células hospederas de tipo levadura son los orígenes de replicación de 2 mieras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.
Algunos ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de tipo hongo filamentoso son AMA1 y ANSI (Gems et al. , 1991, Gene 98: 61-67; Cullen efc al. , 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen pueden lograrse de conformidad con los métodos descritos en WO 00/24883.
Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula hospedadora para incrementar la producción de un polipéptido. Se puede conseguir aumentar el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedera o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido, donde las células que contengan copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, de este modo, copias adicionales del polinucleótido, se puedan seleccionar mediante el cultivo de las células en presencia del agente de selección apropiado.
Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente con el fin de construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son muy conocidos por los expertos en la téenica (remítase, p. ej., a Sambrook et al . , 1989, mencionado anteriormente).
Células hospederas La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención ligado operablemente a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la producción de un polipéptido de la presente invención. Un constructo o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula hospedera de modo que el constructo o vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante, tal como se ha descrito anteriormente. La expresión "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran medida del gen que codifique el polipéptido y de su fuente.
La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención, p. ej., una célula procariota o eucariota.
La célula hospedera procariota puede ser cualquier bacteria grampositiva o gramnegativa. Las bacterias grampositivas incluyen, sin carácter limitante, Bacillus, Clostridium, Enterococcus , Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias gramnegativas incluyen, sin carácter limitante, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter , Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.
La célula hospedera bacteriana puede ser cualquier célula Bacillus que incluye a modo no taxativo, células Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii , Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Geobacillus stearothermophilus , Bacillus lautus , Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis , y Bacillus thuringiensis .
La célula hospedera bacteriana puede ser además cualquier célula Streptococcus que incluye, a modo no taxativo, células Streptococcus equisimilis , Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, y Streptococcus equi subsp. Zooepi demicus .
La célula hospedera bacteriana puede ser además cualquier célula Streptomyces que incluye a modo no taxativo, células Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, y Streptomyces lividans .
La introducción de ADN en una célula de Bacillus se puede efectuar, por ejemplo, mediante la transformación del protoplasto (remítase, p. ej., a Chang y Cohén, 1979, Mol . Gen. Gene t . 168: 111-115), utilizando células competentes (remítase, p. ej., a Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol . 81: 823-829, o Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol . Biol . 56: 209-221), mediante electroporación (remítase, p. ej., a Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) o mediante conjugación (remítase, p. ej., a Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol . 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli se puede efectuar, por ejemplo, mediante la transformación del protoplasto (remítase, p. ej., a Hanahan, 1983, J. Mol . Biol . 166: 557-580) o electroporación (remítase, p. ej., a Dower et al . , 1988, Nucleic Acids Res . 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula Streptomyces puede, por ejemplo, producirse mediante transformación y electroporación del protoplasto (véase, por ejemplo, Gong et al . , 2004, Folia Microbiol . (Praha) 49: 399-405), mediante conjugación (remítase, p. ej., a Mazodier et al . , 1989, J. Bacteriol . 171: 3583-3585) o mediante transducción (remítase, p. ej., a Burke et al . , 2001, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula Pseudomonas puede producirse, por ejemplo, medianteelectroporación (véase, por ejemplo, Choi et al . , 2006, J. Microbiol . Methods 64: 391-397) o mediante conjugación (remítase, p. ej., a Pinedo y Smets, 2005, Appl . Environ. Microbiol . 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula Streptococcus puede producirse, por ejemplo, mediante competencia natural (véase, por ejemplo, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect . Immun. 32: 1295-1297), mediante la transformación del protoplasto (remítase, p. ej., a Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), mediante electroporación (remítase, p. ej., a Bucklcy et al . , 1999, Appl . Environ . Microbiol . 65: 3800-3804) o mediante conjugación (remítase, p. ej., a Clewell, 1981, Microbiol . Rev. 45: 409-436). Sin embargo, se puede utilizar cualquier método conocido en la téenica para introducir ADN en una célula hospedera.
La célula hospedera también puede ser una célula eucariota tal como una célula vegetal, fúngica, de mamífero o insecto.
La célula hospedera puede ser una célula fúngica. "Hongo" como se utiliza en la presente incluye la familia Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (como es definido por Hawksworth et al., en, Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungí , 8° edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) así como Oomycota (citado por Hawksworth et al., 1995, supra, page 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra) .
La célula hospedadora fúngica puede ser una célula de tipo levadura. El término "levadura", tal como se utiliza en la presente, incluye levaduras que se reproducen por ascosporas ( Endomycetales ) , levaduras que se reproducen por basidiosporas y levaduras que pertenecen a los hongos imperfectos ( Blastomycetes ) . Debido a que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, a los efectos de esta invención, las levaduras se definirán según se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. y Davenport, R.R., eds, Soc . App . Bacteriol . Symposium Series N.° 9, 1980).
La célula hospedera de levadura puede ser una célula Candida, Hansenula , Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces , Schizosaccharomyces , o Yarrowia como una célula Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus , Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norhensis, Saccharomyces oviformis , o Yarrowia lipolytica.
La célula hospedera fúngica puede ser una célula de tipo hongo filamentoso. La expresión "hongos filamentosos" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según definen Hawksworth et al . , 1995, mencionado previamente). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por tener una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo tiene lugar mediante la elongación de la hifa y el catabolismo del carbono es obligatoriamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo de levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae , tiene lugar mediante la gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.
La célula hospedera de hongo filamentoso puede ser una célula Acremonium, Aspergillus , Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis , Chrysosporium, Coprinus , Coriolus , Cryptococcus , Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces , Penicilliu , Phanerochaete, Phlebia, Piromyces , Pleurotus , Schizophyllum, Talaromyces , Thermoascus , Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma .
Por ejemplo, la célula hospedera de hongo filamentoso puede ser una célula Aspergillus awamori , Aspergillus foetidus , Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans , Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina , Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens , Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora , Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola , Chrysosporium que ensl andi cum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus , Coriolus hirsutus , Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium t orulosum, Fusarium trichothecioides , Fusarium venena tum, Humicola insolens , Humicola lanuginose, Mucor iehei , Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii , Thielavia terrestris , Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei , o Trichoderma viride. Una célula hospedera específicamente preferida es una célula Aspergillus oryzae.
Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de protoplastos y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos para la transformación de las células hospederas Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238023 y Yelton et al . , 1984, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 81: 1470-1474. Se describen métodos adecuados para transformar especies de Fusarium en Maladier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente en Abelson, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide t o Yeast Gene íes and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, págs.182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol . 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 75: 1920.
Métodos de producción La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que -comprende: (a) cultivar una célula, la cual produce en su forma natural el polipéptido, en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. En un aspecto preferido, la célula es del género Bacillus. En un aspecto más preferido, la célula es Bacillus sp-19138.
La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende: (a) cultivar una célula hospedadora recombinante de la presente invención en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
Las células hospedadoras se cultivan en un medio de nutrientes adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos de uso común en la téenica. Por ejemplo, la célula puede cultivarse mediante el cultivo en un matraz agitado y la fermentación a pequeña escala o gran escala (incluidas las fermentaciones continua, discontinua, de lote alimentado o de estado sólido), en termentadores de laboratorio o industriales, llevada a cabo en un medio adecuado y en condiciones que permitan que el polipéptido se exprese y/o se aísle. El cultivo tiene lugar en un medio de nutrientes adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados se pueden adquirir de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con las composiciones publicadas (p. ej., en los catálogos de la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo). Si el polipéptido se secreta en el medio nutriente, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se secreta, se puede recuperar a partir de los U sados celulares.
Se proporciona información más detallada más adelante en la sección de "Constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión, células hospederas recombinantes y métodos para la producción de proteasas".
El polipéptido se puede detectar utilizando métodos de uso común en la téenica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido.
El polipéptido se puede recuperar utilizando métodos de uso común en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutriente mediante procedimientos convencionales, que incluyen, sin carácter limitante, la centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.
El polipéptido se puede purificar mediante diferentes procedimientos de uso común en la técnica, que incluyen, sin carácter limitante, la cromatografía (p. ej., de intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforáticos (p. ej., isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación con sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción (remítase, p. ej., a Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.
En un aspecto alternativo, no se recupera el polipéptido, sino que en su lugar se utiliza una célula hospedadora de la presente invención que expresa un polipéptido como fuente del polipéptido.
Plantas La presente invención también se refiere a plantas, p. ej., una planta transgénica, parte de una planta o célula vegetal, que comprenden un polinucleótido aislado de la presente invención para que de este modo expresen y produzcan el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar a partir de la planta o parte de la planta. Como alternativa, la planta o parte de la planta que contiene el polipéptido se puede utilizar tal cual para mejorar la calidad de un alimento para los seres humanos o animales, p. ej., mejorando su valor nutricional, palatabilidad y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.
La planta transgénica puede ser una dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot). Algunos ejemplos de plantas monocotiledóneas son las gramíneas, tales como la espiguilla (pasto azul, Poa), pasto forrajero tal como Festuca, Lolium, pasto de zonas templadas, tal como Agrostis, y cereales, p. ej., trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz.
Algunos ejemplos de plantas dicotiledóneas son el tabaco, las legumbres, tales como altramuces, papa, remolacha azucarera, chícharo, frijol y soja, y las plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tales como la coliflor, la colza, y el organismo modelo Arabidopsis t haliana estrechamente relacionado.
Algunos ejemplos de las partes de una planta son el tallo, callo, hojas, raíces, frutos, semillas y tubérculos, así como también los tejidos individuales que comprenden estas partes, p. ej., epidermis, mesofilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemos. También se considera que los compartimientos celulares vegetales específicos, tales como los cloroplastos, apoplastos, mitocondria, vacuolas, peroxisomas y citoplasma, son una parte de la planta. Asimismo, se considera que cualquier célula vegetal, independientemente del origen del tejido, es una parte de la planta. Asimismo, las partes de una planta tales como las células y los tejidos específicos aislados para facilitar la utilización de la invención también se consideran partes de una planta, p. ej., los embriones, endospermos, y las capas de aleurona y seminales.
También se incluyen dentro del alcance de la presente invención la progenie de tales plantas, partes de una planta y células vegetales.
La planta o célula vegetal transgénica que expresa un polipéptido se puede construir de acuerdo con métodos de uso común en la téenica. Resumiendo, la planta o célula vegetal se construye incorporando uno o más (varios) constructos de expresión que codifican un polipéptido en el genoma hospedador vegetal o el genoma cloroplástico y propagando la planta o célula vegetal modificada resultante en forma de una planta o célula vegetal transgénica.
El constructo de expresión es convenientemente un constructo de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido ligado operablemente a secuencias reguladoras adecuadas requeridas para la expresión del polinucleótido en la planta o parte de la planta seleccionada. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable que sea útil para identificar células hospedadoras en las que se ha integrado el constructo de expresión y secuencias de ADN que sean necesarias para introducir el constructo en la planta en cuestión (esta última depende del método de introducción de ADN que se vaya a utilizar).
La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente secuencias señal o de tránsito, se determina, por ejemplo, en función de cuándo, dónde y cómo se desee que se exprese el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica para el desarrollo, una fase o un tejido, y el producto génico puede dirigirse a un tejido o parte de una planta específico tal como las semillas o las hojas. Se describen secuencias reguladoras, por ejemplo, en Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
Para la expresión constitutiva, se pueden utilizar el promotor 35S-CaMV, de la ubiquitina 1 del maíz y de la actina 1 del arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al . , 1992, Plant Mol . Biol .18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Los promotores específicos para un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de papa y frutos (Edwards y Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Gene t .24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemos (Ito et al., 1994, Plant Mol . Biol . 24: 863-878), un promotor específico para las semillas tal como el promotor de la glutelina, prolamina, globulina o albúmina del arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol . 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen de la proteína seminal desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol . 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo graso seminal (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol . 39: 935-941), el promotor de la proteína de almacenamiento napA de Brassica napus o cualquier otro promotor específico para las semillas conocido en la téenica, p. ej., como los descritos en el documento WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico para las hojas tal como el promotor rbcs del arroz o el tomate (Kyozuka et al . , 1993, Plant Physiol . 102: 991-1000), el promotor del gen de la adenina-metiltransferasa del virus de la clórela (Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol . Biol . 26: 85-93), el promotor del gen aldP del arroz (Kagaya et al . , 1995, Mol . Gen. Gen t . 248: 668-674) o un promotor inducible por lesión tal como el promotor pin2 de la papa (Xu et al., 1993, Plant Mol . Biol . 22 : 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducible mediante tratamientos abióticos, tales como temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad, o puede ser inducido por sustancias aplicadas de forma exógena que activen el promotor, p. ej., etanol, estrógenos, hormonas vegetales tales como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico, y metales pesados.
También se puede emplear un elemento potenciador del promotor para conseguir una mayor expresión de un polipéptido en la planta. Por ejemplo, el elemento potenciador del promotor puede ser un intrón que esté situado entre el promotor y el polinucleótido que codifica un polipéptido. Por ejemplo, Xu et al . , 1993, mencionado anteriormente, describen el uso del primer intrón del gen de actina 1 del arroz para potenciar la expresión.
El gen marcador seleccionable y cualesquiera otras partes del constructo de expresión se pueden seleccionar entre las disponibles en la téenica.
El constructo de ácido nucleico se incorpora en el genoma vegetal de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en la técnica, que incluyen la transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, icroinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/ Technology 8: 535; Shimamoto et al . , 1989, Nature 338: 274).
En la actualidad, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método preferido para generar dicotiledóneas transgénicas (para consultar un artículo de revisión sobre este tema remítase a Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Mol . Biol . 19: 15-38) y también se puede utilizar para transformar monocotiledóneas, aunque también es habitual que se utilicen otros métodos de transformación para estas plantas. En la actualidad, el método preferido para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas de wolframio u oro recubiertas con el ADN transformante) de callos embriónicos o embriones en fase de desarrollo (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin . Biotechnol . 5: 158-162; Vasil et al . , 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos tal como se describe en Omirulleh et al . , 1993, Plant Mol . Biol . 21: 415-428. Los métodos de transformación adicionales que se pueden utilizar de acuerdo con la presente descripción incluyen aquellos descritos en las patentes de EE. UU. N.os 6.395.966 y 7.151.204 (de las cuales las dos se incorporan a la presente en su totalidad por referencia).
Tras la transformación, se seleccionan los transformantes que han incorporado el constructo de expresión y se regeneran en forma de plantas completas de acuerdo con métodos conocidos en la téenica. Habitualmente el procedimiento de transformación está diseñado para la eliminación selectiva de genes de selección, ya sea durante la regeneración o en las siguientes generaciones utilizando, por ejemplo, la cotransformación con dos constructos de ADN-T independientes o la escisión específica para el sitio del gen de selección mediante una recombinasa específica.
Además de la transformación directa de un genotipo vegetal particular con un constructo preparado de acuerdo con la presente invención, las plantas transgénicas se pueden crear cruzando una planta que contenga el constructo con una segunda planta que carezca del constructo. Por ejemplo, un constructo que codifica un polipéptido se puede introducir en una variedad de planta particular por cruzamiento, sin necesidad de tener que transformar directamente una planta de esa variedad en ningún momento. Por lo tanto, la presente invención no abarca únicamente una planta regenerada directamente a partir de células que han sido transformadas de acuerdo con la presente invención, sino también la progenie de tales plantas. El término "progenie", tal como se utiliza en la presente, se puede referir a la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada de acuerdo con la presente invención. La progenie puede incluir un constructo de ADN preparado de acuerdo con la presente invención o una porción de un constructo de ADN preparado de acuerdo con la presente invención. El cruzamiento da como resultado la introducción de un transgén en una línea vegetal por polinización cruzada de una línea inicial con una línea vegetal donante. Algunos ejemplos no limitantes de estos pasos se explican más detalladamente en la Patente de EE. UU. N.°: 7,151,204.
Se pueden generar plantas mediante un proceso de conversión por retrocruzamiento. Por ejemplo, las plantas incluyen plantas denominadas híbridas, endogámicas, de línea o genotipo convertido por retrocruzamiento.
Se pueden utilizar marcadores genéticos para facilitar la introgresión de uno o más transgenes de la invención de un contexto genético a otro. La selección asistida por marcadores ofrece ventajas frente al cultivo selectivo convencional, ya que se puede utilizar para evitar errores debidos a las variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proporcionar datos referentes al grado relativo del germoplasma élite en la progenie individual de un cruzamiento particular. Por ejemplo, cuando una planta con un rasgo deseado, que por lo demás tiene un contexto genético no deseable desde un punto de vista agronómico, se cruza con un progenitor élite, se pueden emplear marcadores genéticos para seleccionar la progenie que no solamente posea el rasgo de interés, sino que también posea una proporción relativamente grande del germoplasma deseado. De este modo, se minimiza el número de generaciones requeridas para introgresar uno o más rasgos en un contexto genético particular.
La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprenden: (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
Composiciones La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden una proteasa de la presente invención. Preferentemente, las composiciones están enriquecidas en una proteasa de este tipo. El término "enriquecido" indica que se ha incrementado la actividad proteasa de la composición, p. ej., con un factor de enriquecimiento de al menos 1.1.
En un aspecto, la composición comprende un polipéptido aislado que tiene una actividad proteasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; (b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; (c) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23; (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad media-alta, condiciones de rigurosidad alta, o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 3, (iii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15, (iv) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 17, (v) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20, (vi) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 22, (vii) la hebra complementaria completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) O (vi); (e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 84% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 O SEQ ID NO: 3; (f) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 83% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17; (g) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22; (h) una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones; y (i) un fragmento de un polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h) que tiene actividad proteasa.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 75% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 87% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 91% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 92% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 93% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 94% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad*de secuencia de al menos un 96% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 97% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 98% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia del 100% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
En otro aspecto, la composición comprende o está constituida por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o una variante alélica de esta; o es un fragmento de esta que tiene actividad proteasa. En otro aspecto, la composición comprende o está constituida por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. En un aspecto adicional, la composición comprende o está constituida por el polipéptido de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. En otro aspecto, la composición comprende o está constituida por los aminoácidos comprendidos entre el 1 y el 366 de la SEQ ID NO: 2, y los aminoácidos comprendidos entre el 1 y el 366 de la SEQ ID NO: 4, y los aminoácidos comprendidos entre el 1 y el 366 de la SEQ ID NO: 5 o los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 366 de la SEQ ID NO: 6.
En una modalidad, la variante que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 tiene una identidad de secuencia de al menos un 60%, p.ej., de al menos un 70%, de al menos un 75%, de al menos un 80%, de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, pero menos de un 100% respecto de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 75% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 87% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 91% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 92% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 93% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 94% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 96% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 97% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 98% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia del 100% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
En otro aspecto, la composición comprende o está constituida por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 o una variante alélica de esta; o es un fragmento de esta que tiene actividad proteasa. En otro aspecto, la composición comprende o está constituida por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18. En un aspecto adicional, la composición comprende o está constituida por el polipéptido de la SEQ ID NO: 19. En otro aspecto, la composición comprende o está constituida por los aminoácidos comprendidos entre el 1 y el 366 de la SEQ ID NO: 16, y los aminoácidos comprendidos entre el 1 y el 366 de la SEQ ID NO: 18 o los aminoácidos comprendidos entre el 1 y el 366 de la SEQ ID NO: 19.
En una modalidad, la variante que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 tiene una identidad de secuencia de al menos un 60%, p.ej., de al menos un 70%, de al menos un 75%, de al menos un 80%, de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, pero menos de un 100% respecto de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 75% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 87% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 91% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 92% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 93% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 94% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 96% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 97% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 98% respecto al polipeptido de la SEQ ID NO : 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 21 o SEQ ID NO : 23 .
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codif icado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO : 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 21 o SEQ ID NO : 23 .
Una modalidad de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia del 100% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO : 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 21 o SEQ ID NO : 23 .
En otro aspecto, la composición comprende o está constituida por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 o una variante alélica de esta; o es un fragmento de esta que tiene actividad proteasa. En otro aspecto, la composición comprende o está constituida por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23. En un aspecto adicional, la composición comprende o está constituida por el polipéptido de la SEQ ID NO : 24 . En otro aspecto, la composición comprende o está constituida por los aminoácidos comprendidos entre el 1 y el 366 de la SEQ ID NO: 21, y los aminoácidos comprendidos entre el 1 y el 366 de la SEQ ID NO: 23 o los aminoácidos comprendidos entre el 1 y el 366 de la SEQ ID NO: 24 .
En una modalidad, la variante que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 tiene una identidad de secuencia de al menos un 60%, p.ej., de al menos un 70%, de al menos un 75%, de al menos un 80%, de al menos un 86%, de al menos un 87%, de al menos un 88%, de al menos un 89%, de al menos un 90%, de al menos un 91%, de al menos un 92%, de al menos un 93%, de al menos un 94%, de al menos un 95%, de al menos un 96%, de al menos un 97%, de al menos un 98%, de al menos un 99%, pero menos de un 100% respecto de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 En una modalidad preferida, la composición es una composición de alimentos para animales que comprende una o más amilasas, fitasas, xilanasas, galactanasas, alfa-galactosidasas, proteasas, fosfolipasas, beta-glucanasas, o cualquier mezcla de estos.
En otra modalidad preferida, la composición es un aditivo alimentario para animales que comprende además, al menos una vitamina soluble en grasa y/o al menos una vitamina soluble en agua, y/o un oligoelemento. El aditivo alimentario para animales puede comprender una o más amilasas, fitasas, xilanasas, galactanasas, alfa-galactosidadas , proteasas, fosfolipasas, beta-glucanasas, o cualquier mezcla de estos.
La composición puede comprender una proteasa de la presente invención como componente enzimático principal, p. ej . , una composición monocomponente . Como alternativa, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas tales como una aminqpeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina-glicosiltransferasa, desaxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, halcperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa , fitasa, polif enoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa . La enzima o enzimas adicionales pueden ser producidas , por ej emplo, por microorganismos tales como bacterias u hongos , o por plantas o por animales . Las composiciones se pueden preparar de acuerdo con metodos conocidos en la técnica y se pueden presentar en forma de una composición líquida o seca . Por ej emplo, la composición se puede presentar en forma de un pelotillado o un micropelot illado . La proteasa se puede estabilizar de acuerdo con métodos de uso común en la técnica .
Usos La presente invención está dirigida a métodos para utilizar los polipéptidos que tienen actividad proteasa o composiciones de estos, por ejemplo, alimentos para animales.
Uso en alimentos para animales La presente invención también se refiere a métodos para utilizar las proteasas que tienen actividad proteasa en alimentos para animales, así como también a composiciones alimenticias y aditivos alimentarios que comprenden las proteasas de la invención.
El término "animal" incluye todos los animales. Algunos ejemplos de animales son los rumiantes y los no rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como ovejas, cabras y ganado, p. ej., ganado vacuno, vacas y terneros. En una modalidad particular, el animal es un animal que no es rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, p.ej., cerdos o porcinos (que incluyen, a modo no taxativo, lechones, cerdos de engorde y cerdas); aves de corral, como pavos,patos y pollos (que incluyen, a modo no taxativo, pollos de engorde, pollos ponedores); caballos (que incluyen, a modo no taxativo, de sangre caliente, de sangre fría y de sangre tibia), terneros; y peces (que incluyen, a modo no taxativo, salmón, trucha, tilapia, bagre y carpas); y crustáceos (que incluyen, a modo no taxativo, langostinos y gambas).
El término "alimento" o "composición alimenticia" se refiere a cualquier composición, mezcla, preparado o compuesto adecuado para ser consumido por un animal o destinado a serlo.
En el uso de acuerdo con la invención, la proteasa se puede administrar al animal antes, después o a la vez que la dieta. Se prefiere este último caso.
En una modalidad particular, la proteasa, en la forma en la que se añade al alimento, o cuando se incluye en un aditivo alimentario, está bien definida. La expresión "bien definida/o" quiere decir que el preparado de proteasa tiene una pureza de al menos un 50% según se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño (remítase al Ejemplo 12 del documento WO 01/58275). En otras modalidades particulares, el preparado de proteasa tiene una pureza de al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o al menos un 95% según se determina mediante este método.
Un preparado de proteasa bien definido es conveniente. Por ejemplo, es mucho más fácil incluir en el alimento una dosis correcta de una proteasa que esté esencialmente exenta de otras proteasas interferentes o contaminantes. La expresión "dosis correcta" se refiere en particular al objetivo de obtener resultados constantes y coherentes, y a la capacidad de optimizar la dosis en función del efecto deseado.
Sin embargo, para el uso en alimentos para animales, la proteasa no necesita ser tan pura; puede incluir, p. ej., otras enzimas, en cuyo caso se podría denominar preparado de proteasa.
El preparado de proteasa se puede (a) añadir directamente al alimento (o utilizar directamente en un proceso de tratamiento de proteínas), o (b) se puede utilizar en la producción de una o más composiciones intermedias, tales como premezclas o aditivos alimentarios, que se añaden posteriormente al alimento (o se utilizan en un proceso de tratamiento). El grado de pureza descrito anteriormente se refiere a la pureza del preparado de proteasa original, independientemente de que se utilice de acuerdo con el apartado (a) o (b) anteriores.
Los preparados de proteasa con purezas de este orden de magnitud se pueden obtener en particular utilizando métodos de producción recombinantes, mientras que no se obtienen tan fácilmente y además están supeditados a una variación de lote a lote mucho mayor cuando la proteasa se produce mediante métodos de fermentación tradicionales.
Naturalmente, estos preparados de proteasas se pueden mezclar con otras enzimas.
La proteína puede ser una proteína de origen animal, tal como harina de huesos y carne, harina de plumas y/o harina de pescado; o puede ser una proteína vegetal.
La expresión "proteínas vegetales", tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier compuesto, composición, preparado o mezcla que incluya al menos una proteína derivada de una hortaliza u originada a partir de esta, incluidas las proteínas modificadas y los derivados proteicos. En modalidades particulares, el contenido proteico de las proteínas vegetales es de al menos un 10, 20, 30, 40, 50 o un 60% (p/p).
Las proteínas vegetales se pueden derivar de fuentes de proteínas vegetales, tales como legumbres y cereales, por ejemplo, materiales procedentes de plantas de las familias Fabaceae ( Leguminosae ) , Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tales como la harina de soja, harina de altramuz y harina de colza.
En una modalidad particular, la fuente de proteínas vegetales es material de una o más plantas de la familia Fabaceae, por ejemplo, soja, altramuz, chícharo o frijol.
En otra modalidad particular, la fuente de proteínas vegetales es un material procedente de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, p. ej., remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinoa.
Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son la colza, la semilla de girasol, la semilla de algodón y la col.
La soja es una fuente de proteínas vegetales preferida.
Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son los cereales tales como la cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, triticale y sorgo.
En una modalidad particular de un proceso de tratamiento, la proteasa o las proteasas en cuestión afectan (o actúan o ejercen su influencia hidrolizante o degradante sobre) las proteínas, tales como proteínas vegetales o fuentes de proteínas. Para conseguir esto, la proteína o la fuente de la proteína normalmente se suspende en un disolvente, p. ej., un disolvente acuoso tal como el agua, y se ajustan los valores del pH y la temperatura teniendo en cuenta las características de la enzima en cuestión. Por ejemplo, el tratamiento puede tener lugar a un valor de pH al cual la actividad de la presente proteasa sea de al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o al menos un 90%. Asimismo, por ejemplo, el tratamiento puede tener lugar a una temperatura a la cual la actividad de la presente proteasa sea de al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o al menos un 90%. Las indicaciones de actividad porcentual anteriores son relativas a las actividades máximas. La reacción enzimática continúa hasta obtener el resultado deseado, después de lo cual se puede detener o no mediante la inactivación de la enzima, p. ej., mediante un paso de tratamiento con calor.
En otra modalidad particular de un proceso de tratamiento de la invención, la acción de la proteasa se mantiene, lo cual quiere decir que, p. ej., la proteasa se añade a las proteínas, pero su influencia hidrolizante no se enciende, por así decirlo, hasta más tarde cuando se desee, una vez que se hayan establecido las condiciones hidrolizantes adecuadas o una vez que se hayan inactivado los posibles inhibidores enzimáticos o cualesquiera otros medios que se hayan podido aplicar para posponer la acción de la enzima.
En una modalidad, el tratamiento es un pretratamiento de alimentos para animales o proteínas que se pueden utilizar en alimentos para animales, es decir, las proteínas se hidrolizan antes de su consumo.
La expresión "mejorar el valor nutricional de un alimento para animales" se ref iere a la mej ora de la disponibilidad de los nutrientes en el alimento . En esta invención, "mejorar los valores nutricionales " se refiere en particular a la mejora de la disponibilidad de la fracción proteica del alimento, lo cual hace que aumente la extracción de las proteínas , aumenten los rendimientos proteicos y/o mej ore la utilización de las proteínas . Cuando el valor nutricional del alimento aumenta, la digestibilidad de las proteínas y/o los aminoácidos aumenta, y la velocidad de crecimiento y/o el aumento de peso y/o la conversión del alimento (es decir, el peso de alimento ingerido relativo al aumento de peso) del animal puede mejorar .
La proteasa puede añadirse a los alimentos en cualquier forma, ya sea como una proteasa relativamente pura o mezclada con otros componentes para la adición a los alimentos para animales, es decir, en forma de aditivos alimentarios para animales, tales como las denominadas premezclas para alimentos para animales.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones que se pueden utilizar en alimentos para animales, tales como alimentos para animales y aditivos alimentarios para animales, p. e j . , premezclas.
Aparte de la proteasa de la invención, los aditivos alimentarios para animales de la invención contienen al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble , y/o al menos un mineral traza, y/o al menos un macromineral .
Además , algunos ingredientes opcionales de los aditivos para alimentos son agentes colorantes , por ej emplo, carotenoides tales como el beta-caroteno, astaxantina y luteína; estabilizantes; aditivos que mejoran el crecimiento y aromatizantes/saborizantes , p. ej . , creosol, anetol, deca- , undeca- y/o dodecalactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, ftálida de propilideno, ftálida de butilideno, capsaicina y/o tanino; peptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliinsaturados (PUFA, por sus siglas en inglés) ; especies que generan oxígeno reactivas; además, se puede utilizar un soporte que contenga, por ejemplo, un 40-50% en peso de fibras de madera, un 8-10% en peso de estearina, un 4-5% en peso de cúrcuma en polvo, un 4-58% en peso de romero en polvo, un 22-28% en peso de caliza, un 1-3% en peso de una goma, tal como goma arábiga, un 5-50% en peso de azúcar y/o almidón, y un 5-15% en peso de agua.
Un alimento o aditivo alimentario de la invención puede comprender al menos otra enzima selecciona de f itasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89) ; alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4); fosfol ipasa Al (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4) ; amilasa como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) ; lisozima (EC 3.2.1.17) ; y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6) .
En una modalidad particular, el alimento o aditivo alimentario de la invención también comprende una fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26) .
En una modalidad particular, el alimento o aditivo alimentario de la invención tambien comprende una xilanasa (EC 3.2.1.8) .
Un alimento o aditivo alimentario de la invención también puede comprender al menos un probiótico o agente microbiano de administración directa (DFM) opcionalmente con una o más enzimas seleccionadas de f itasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26) ; xilanasa (EC 3.2.1.8) ; galactanasa (EC 3.2.1.89) ; alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22) ; proteasa (EC 3.4), fosfolipasa Al (EC 3.1.1.32) ; fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4) ; lisof osf olipasa (EC 3.1.1.5) ; fosfolipasa C (3.1.4.3) ; fosfolipasa D (EC 3.1.4.4) ; amilasa, como por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) ; y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6) .
El agente microbiano de administración directa puede ser una bacteria de uno o más de los siguientes géneros: Lactobacillus , Lactococcus , Streptococcus , Bacillus , Pediococcus , Enterococcus , Leuconostoc, Camobacterium, Prcpionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium y Megasphaera o cualquier combinación de estos, preferentemente de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliguefaciens, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, and Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farci inus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius , Megasphaera elsdenii , Propionibacteria sp y más preferentemente de cepas de Bacillus subtilis 3A-P4 (PTA-6506) ; 15A-P4 (PTA-6507) ; 22C-P1 (PTA-6508) ; 2084 (NRRL B-500130 ) ; LSSA01 (NRRL-B-50104 ) ; BS27 (NRRL B-501 05 ) ; BS 18 (NRRL B-50633 ) ; y BS 278 (NRRL B-50634 ) .
En una modalidad particular, estas enzimas diferentes están bien definidas (conforme con la definición anterior para los preparados de proteasa) .
Algunos ej emplos de peptidos antimicrobianos (AMP, por sus siglas en inglés) son CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina y Ovispirina, tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000) , Plectasinas y Estatinas, incluidos los compuestos y los polipéptidos descritos en los documentos WO 03/044049 y WO 03/048148 , así como también las variantes o los fragmentos de los péptidos anteriores que retienen la actividad antimicrobiana .
En los documentos WO 94/01459 y WO 02/090384 se describen ej emplos de polipéptidos antifúngicos (AFP, por sus siglas en inglés) que son los péptidos de Aspergillus giganteus y Aspergillus niger, así como también variantes y fragmentos de estos que retienen la actividad antifúngica .
Algunos ej emplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18 , C20 y C22 tales como el ácido araquidónico, ácido docosohexanoico, ácido eicosapentaenoico y ácido gamma-linoleico .
Los ejemplos de especies que generan oxígeno reactivas incluyen agentes químicos tales como el perborato, persulfato o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.
Normalmente las vitaminas lipo- e hidrosolubles, así como también los minerales traza forman parte de la denominada premezcla destinada a ser añadida al alimento, mientras que los macrominerales se suelen añadir por separado al alimento. Cualquiera de estos tipos de composiciones, cuando están enriquecidos en una proteasa de la invención, son un aditivo alimentario para animales de la invención.
En una modalidad particular, el aditivo alimentario para animales de la invención está destinado a ser incluido (o se prescribe para que sea incluido) en dietas o alimentos para animales en niveles comprendidos entre un 0.01 y un 10.0%; más particularmente entre un 0.05 y un 5.0%; o entre un 0.2 y un 1.0% (el % se refiere a los g de aditivo por 100 g de alimento). Esto es así en particular para las premezclas.
Las siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes: Algunos ejemplos de vitaminas liposolubles son la vitamina A, vitamina D3, vitamina E y vitamina K,p.ej., la vitamina K3.
Algunos ejemplos de vitaminas hidrosolubles son la vitamina B12, biotina y colina, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, p. ej., Ca-D-pantotenato.
Los ejemplos de minerales traza incluyen el manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio y cobalto.
Los ejemplos de macrominerales incluyen calcio, fósforo y sodio.
Los requisitos nutricionales de estos componentes (ejemplificados con aves de corral y lechones/cerdos) se enumeran en la Tabla A del documento WO 01/58275. La expresión "requisito nutricional" quiere decir que estos componentes se deben proporcionar en la dieta en las concentraciones indicadas.
Como alternativa, el aditivo alimentario para animales de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la Tabla A del documento WO 01/58275. La expresión "al menos uno" se refiere a uno o más, uno o dos o tres o cuatro y así sucesivamente hasta un total de trece o hasta un total de quince componentes individuales. Más específicamente, este componente o componentes individuales se incluyen en el aditivo de la invención en una cantidad tal que proporcione una concentración en el alimento comprendida en el intervalo indicado en la columna cuatro o la columna cinco o la columna seis de la Tabla A.
En otra modalidad adicional, el aditivo alimentario para animales de la invención comprende al menos una de las siguientes vitaminas, preferentemente para proporcionar una concentración en el alimento comprendida en los intervalos indicados a continuación en la Tabla 1 (para dietas para lechones y dietas para pollos de engorde, respectivamente).
Tabla 1: Recomendaciones típicas de vitaminas La presente invención también se refiere a composiciones alimenticias para animales. Las composiciones alimenticias o dietas para animales tienen un contenido relativamente alto de proteína. Las dietas para aves de corral y cerdos se pueden caracterizar tal como se indica en la Tabla B del documento WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas para peces se pueden caracterizar tal como se indica en la columna 4 de esta Tabla B. Además, estas dietas para peces normalmente tienen un contenido de grasa cruda de al menos 200-310 g/kg.
El documento WO 01/58275 se corresponde con el documento US 09/779334, el cual se incorpora a la presente por referencia.
Una composición alimenticia para animales de acuerdo con la invención tiene un contenido de proteína cruda de 50-800 g/kg y comprende además al menos una proteasa como la reivindicada en la presente.
Además o como alternativa (al contenido de proteína cruda indicado anteriormente), la composición alimenticia para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0.1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina junto con cisteína de 0.1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0.5-50 g/kg.
En modalidades particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina junto con cisteína y/o lisina está comprendido dentro de cualquiera de los intervalos 2, 3, 4 o 5 de la Tabla B del documento WO 01/58275 (R.2-5).
La proteína cruda se calcula como el nitrógeno (N) multiplicado por un factor de 6.25, es decir, proteína cruda (g/kg)= N (g/kg) x 6.25. El contenido de nitrógeno se determina por el método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14.a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).
La energía metabolizable se puede calcular en función de los requisitos sobre nutrientes en suidos de la publicación del NRC, novena edición revisada de 1988, subcomité sobre la nutrición de suidos, comité sobre la nutrición de animales, consejo de agricultura y consejo nacional de investigación. National Academy Press, Washington, D.C., págs.2-6, y la tabla europea de valores de energía para los alimentos para aves de corral, centro Spelderholt de investigación y extensión sobre aves de corral, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.
El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en las dietas completas para animales se calcula en función de tablas alimenticias tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.
En una modalidad particular, la composición alimenticia para animales de la invención contiene al menos una proteína vegetal tal como se ha definido anteriormente.
La composición alimenticia para animales de la invención tambien contiene proteína de origen animal , tal como harina de huesos y carne , harina de plumas y/o harina de pescado, normalmente en una cantidad comprendida entre un 0 y un 25% . La composición alimenticia para animales de la invención también puede comprender granos secos de destilería con solubles (DDGS , por sus siglas en inglés) , normalmente en cantidades comprendidas entre un 0 y un 30% .
En otras modalidades particulares adicionales , la composición alimenticia para animales de la invención contiene un 0 -80% de maíz ; y/o un 0-80% de sorgo; y/o un 0 -70% de trigo; y/o un 0-70% de cebada ; y/o un 0-30% de avena ; y/o un 0-40% de harina de soj a ; y/o un 0 -25% de harina de pescado; y/o un 0-25% de harina de huesos y carne ; y/o un 0-20% de suero lácteo.
Las dietas para animales se pueden fabricar, p. e j . , como un alimento en forma de harina (no pelotillado) o alimento pelotillado. Normalmente, los alimentos molidos se mezclan y se añaden cantidades suficientes de vitaminas y minerales esenciales de acuerdo con las especificaciones para las especies en cuestión. Se pueden añadir enzimas como formulaciones enzimáticas líquidas o sólidas. Por ejemplo, para los alimentos en forma de afrecho se puede añadir una formulación enzimática líquida o sólida antes o durante el paso de mezcla de los ingredientes . Para los alimentos en microesf eras , el preparado de proteasa/enzima ( líquido o sólido) también se puede añadir antes o durante el paso de los ingredientes del alimento. Normalmente, el preparado de proteasa/enzima líquido se añade después del paso de formación de microesferas. La enzima también se puede incorporar en una premezcla o aditivo alimentario.
La concentración de enzima final en la dieta está comprendida dentro del intervalo de 0.01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por ejemplo, en el intervalo de 0.5-25 mg de proteína enzimática por kg de dieta para animales.
Naturalmente, la proteasa se debe aplicar en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad adecuada para mejorar la hidrólisis, digestabilidad y/o mejorar el valor nutricional del alimento. En la actualidad, se contempla que la enzima se administre en una o más de las siguientes cantidades (intervalos de dosis): 0.01-200; 0.01-100; 0.5-100; 1-50; 5-100; 10-100; 0.05-50; o 0.10-10 - siendo todos estos intervalos ee mg de proteína proteasa por kg de alimento (ppm).
Para determinar los mg de proteína de tipo proteasa por kg de alimento, la proteasa se purifica a partir de la composición alimenticia y la actividad específica de la proteasa purificada se determina utilizando un ensayo relevante (remítase a la sección de la actividad proteasa, los sustratos y los ensayos). La actividad proteasa de la composición alimenticia como tal también se determina utilizando el mismo ensayo y, sobre la base de estas dos determinaciones, se calcula la dosis en mg de proteína proteasa por kg de alimento.
Los mismos principios se aplican para determinar los mg de proteína de tipo proteasa en aditivos alimenticios. Naturalmente, si se dispone de una muestra de la proteasa empleada para preparar el aditivo alimentario o el alimento, la actividad específica se determina a partir de esta muestra (sin necesidad de purificar la proteasa de la composición alimenticia o el aditivo alimentario).
Constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión, células hospedadoras recombinantes y métodos para la producción de proteasas La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión y células hospedadoras recombinantes que comprenden polinucleótidos de este tipo que codifican las proteasas de la invención.
La presente invención también se refiere a métodos para producir una proteasa que comprenden: (a) cultivar una célula hospedadora recombinante que comprende un polinucleótido de este tipo; y (b) recuperar la proteína.
La proteína puede ser nativa o heteróloga respecto a la célula hospedadora. No se pretende que en la presente el término "proteína" se refiera a una longitud específica del producto codificado y, por tanto, abarca péptidos, oligopéptidos y proteínas. El término "proteína" también abarca dos o más polipéptidos combinados para formar el producto codificado. Las proteínas también incluyen polipéptidos híbridos y polipéptidos fusionados.
Preferentemente, la proteína es una proteasa. Por ejemplo, la proteína puede ser una hidrolasa, tal como una enzima proteolítica o proteasa.
El gen puede obtenerse a partir de cualquier procariota, eucariota u otra fuente.
La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.
EJEMPLOS Materiales y métodos Medios El medio DAP4C-1 estaba compuesto de 0.5 g de extracto de levadura, 10 g de maltosa, 20 g de dextrosa, 11 g de sulfato de magnesio pentahidratado, 1 g de fosfato dipotásico, 2 g de ácido cítrico monohidrato, 5.2 g de potasio de fosfato tribásico monohidrato, 1 mi de Dowfax 63N10 (agente antiespumante), 2.5 g de carbonato de calcio, complementado con 1 mi de solución metálica KU6 y 1000 mi de agua desionizada.
La solución metálica KU6 estaba compuesta de 6.8 g de ZnCl2, 2.5 g de CuSQ .5H2O, 0.13 g de NiCl2, 13.9 g de FeSO4.7H20, 8.45 g de MnS04.H20, 3 g C6H807.H20, y 1000 mi de agua desionizada.
Las placas LB estaban compuestas de 10 g de Bacto-triptona, 5g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio, 15 g de bacto-agar, y 1000 mi de agua desionizada.
El medio LB estaba compuesto de 10 g de Bacto-triptona, 5 g de extracto de levadura, y 10 g de cloruro de sodio y 1000 mi de agua desionizada .
Las placas de sacarosa T de COVE estaban compuestas de 342 g de sacarosa, 20 g de polvo de agar, 20 mi de solución salina de COVE, y 1000 mi de agua desionizada. El medio se esterilizó mediante autoclavado a 15 psi durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998) . El medio se enfrió a 60°C y se agregaron acetamida 10 mM, Tritón X-100 (50 m1/500 mi) .
Los tubos de N-agar de COVE estaban compuestos de 218 g de Sorbitol, 10 g de Dextrosa, 2.02 g de KNO3, 25 g de Agar, 50 mi de solución salina de COVE, y hasta 1000 mi de agua desionizada.
La solución salina de COVE estaba compuesta de 26 g de MgS04 - 7H2O, 26 g de KCL, 26 g de KH2PO4 , 50 mi de solución metálica traza de COVE y 1000 mi de agua desionizada .
La solución metálica traza de COVE estaba compuesta de 0 . 04 g de Na2B407 · 10H20 , 0.4 g de CuS04 - 5H20, 1. 2 g de FeS04 - 7H20, 0 .7 g de MnS04 -H20, 0. 8 g de Na2MoÜ4 · 2H20, 10 g de ZnS04 - 7H20, y 1000 mi de agua desionizada .
Ensayos de proteasas Ensayo de Suc-AAPF-pNA cinetico: Sustrato de pNA : Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400).
Temperatura : Temperatura ambiente (25°C) Amortiguadores de ensayo : ácido succínico 100 mM, HEPES 100 M, CHES 100 mM, CABS 100 mM, CaCl2lmM, KCl 150 mM, 0.01% de Tritón X-100 ajustado a los valores de pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, y 11.0 con HCl o NaOH. 20m1 de muestra de proteasa (diluida en un 0.01% de Tritón X-100) se mezcló con Iqqml de amortiguador de ensayo. El ensayo se inició añadiendo 100 ml de sustrato pNA (50 mg disueltos en 1.0 mL de DMSO y diluidos adicionalmente 45x con Tritón X-100 al 0.01%). El incremento en la DO405 se monitorizó como una medición de la actividad proteasa.
Ensayo de Suc-AAPF-pNA de punto final: Sustrato de pNA : Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400).
Temperatura: controlada (temperatura del ensayo).
Amortiguador de ensayo: ácido succinico lOOmM, HEPES lOOmM, CHES lOOmM, CABS lOOmM, CaCl2lmM, KCl 150mM, 0.01% de Tritón X-100, pH 4.0 200m1 de sustrato de pNA (50mg disueltos en 1.Oml de DMSO y diluidos 45x con amortiguador de ensayo) se colocaron en pipetas en un tubo Eppendorf y se dispusieron en hielo. Se añadieron 20 m? de la muestra de proteasa (diluida en Tritón X-100 al 0.01%). El ensayo se inició transfiriendo el tubo Eppendorf a un termomezclador Eppendorf, el cual se fijó a la temperatura de ensayo. El tubo se incubó durante 15 minutos en el termomezclador Eppendorf a la mayor velocidad de agitación (1400 rpm). La incubación se detuvo mediante la transferencia del tubo nuevamente al baño de hielo y la incorporación de 600m1 HsBOs/NaOH 500mM, pH 9.7. El tubo se mezcló y la mezcla de 200m1 se transfirió a una placa de microtitulación, que se lcyó a OD405. Se incluyó un amortiguador como control negativo en el ensayo (en lugar de la enzima). OD405(muestra) OD405(ciego) fue una medición de la actividad proteasa.
Ensayo con Protazyme AK: Sustrato: comprimido de Protazyme AK (caseína teñida y reticulada, de Megazyme) Temperatura: controlada (temperatura del ensayo).
Amortiguador de ensayo: ácido succínico lOOmM, HEPES lOOmM, CHES lOOmM, CABS lOOmM, CaCl2lmM, KC1 150mM, 0.01% de Tritón X-100, pH 6.5.
Se suspendió un comprimido de Protazyme AK en 2.0 mL de Tritón X-100 al 0.01% mezclando suavemente. Se dispensaron 500 mB de esta suspensión y 500 ml del amortiguador de ensayo en un tubo Eppendorf y se colocaron en hielo. Se añadieron 20 m? de la muestra de proteasa (diluida en Tritón X-100 al 0.01%). El ensayo se inició transfiriendo el tubo Eppendorf a un termomezclador Eppendorf, el cual se fijó a la temperatura de ensayo. El tubo se incubó durante 15 minutos en el termomezclador Eppendorf a la mayor velocidad de agitación (1400 rpm). La incubación se detuvo transfiriendo el tubo de nuevo al baño de hielo. Posteriormente, el tubo se centrifugó en un centrífugo con hielo durante unos minutos y los 200m1 del sobrenadante se transfirieron a una placa de microtitulación, que se lcyó a ODeso. Se incluyó un amortiguador como control negativo en el ensayo (en lugar de la enzima). OÜ650(muestra) - ODÉSO(ciego) fue una medición de la actividad proteasa.
Ensayo de Suc-AAPX-pNA cinetico: Sustratos pNA : Suc-AAPA-pNA (Bachem L-1775) Suc-AAPR-pNA (Bachem L-1720) Suc-AAPD-pNA (Bachem L-1835) Suc-AAPI-pNA (Bachem L-1790) Suc-AAPM-pNA (Bachem L-1395) Suc-AAPV-pNA (Bachem L-1770) Suc-AAPL-pNA (Bachem L-1390) Suc-AAPE-pNA (Bachem L-1710) Suc-AAPK-pNA (Bachem L-1725) Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400) Temperatura : Temperatura ambiente (25°C) Amortiguador de ensayo: ácido succínico lOOmM, HEPES lOOmM, CHES lOOmM, CABS lOOmM, CaCl2lmM, KCl 150mM, 0.01% de Tritón X-100, pH 4.0 o pH 9.0.
Se mezclaron 20 ml.de proteasa (diluidos en Tritón X-100 al 0.01%) con 100 ml,de amortiguador de ensayo. El ensayo se inició añadiendo 100 m]5 de sustrato pNA (50 mg disueltos en 1.0 mL de DMSO y diluidos adicionalmente 45x con Tritón X-100 al 0.01%). El incremento en la DO405 se monitorizó como una medición de la actividad proteasa.
Ensayo con o-ftaldialdehido (OPA): Este ensayo detecta aminas primarias y, por lo tanto, puede medirse la escisión de enlaces peptídicos por una proteasa como la diferencia en absorbancia entre la muestra tratada con proteasa y una muestra de control. El ensayo se realiza esencialmente de acuerdo con Nielsen et al . (Nielsen, PM, Petersen, D, Dampmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. J Food Sci, 2001, 66: 642-646).
Se filtran 500 mL de la muestra a través de un filtro centrífugo de 100 kDa Microcon (60 min, 11000 rpm, 5°C). Las muestras se diluyen adecuadamente (p. ej., 10, 50 o 100 veces) en agua desionizada y se colocan 25 pL de cada muestra en una placa de microtitulación de 96 pocilios (5 réplicas).200 pl de reactivo OPA (decahidrato de tetraborato disódico 100 mM, dodecilsulfato sódico (SDS) 3.5 mM, di-tiotreitol (DDT) 5.7 mM, o-ftaldehído 6 mM) se coloca en todos los pocilios, la placa se agita (10 sec, 750 rpm) y la absorbancia se mide a 340 nm.
Cepa La cepa Meripilus giganteus se aisló de un cuerpo fructífero recolectado en Dinamarca 1993 por Novozymes.
Una cepa Trametes cf. versicolor interna identificada por secuenciación ITS (Internal Transcribed Spacer) se utilizó como la fuente del gen de proteasa de la SEQ ID NO: 15.
Una segunda cepa Trametes vesicolor secuenciada por Genome Cañada (www.fungalgenomics.ca) se utilizó para identificar el gen de proteasa de la SEQ ID NO: 20.
La cepaEscherichia coli Top-10 adquirida de Invitrogen (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) se utilizó para propagar los vectores de expresión.
La cepa Aspergillus oryzae MT3568 se utilizó para la expresión heteróloga de los polipéptidos codificadores de genes que tienen homología con polipéptidos con actividad proteasa. A. oryzae MT3568 es un gen amdS (acetamidasa) interrumpido derivado de Aspergillus oryzae JaL355 (W0 2002/40694) en dondela auxotrofia pyrG se restauró interrumpiendo el gen A. oryzae acetamidasa ( amdS) con el gen pyrG.
Ejemplo 1: La expresión recombinante de la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (SEQ ID NO: 3) Para obtener el material para probar y caracterizar la Proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus, la secuencia de ADN de la SEQ ID NO: 1 se clonó en un vector de expresión de Aspergillus y se expresó en Aspergillus oryzae .
El gen 3 de S53 de Meripilus giganteus se subclonó en el vector de expresión Aspergillus pMStrlOO (WO 10/009400) ampliando la región de codificación sin el codón terminador del ADN en la SEQ ID NO: 1 del clon del plásmido de ADNc, pA2PR22, con téenicas PCR estándar utilizando los siguientes cebadores: 597 TAGGGATCCTCACGATGGTCGCCACCAGCT (SEQ ID NO: 13) 598 CAGGCCGACCGCGGTGAG (SEQ ID NO: 14) El producto PCR se restringió con BamHl y se ligó en los sitios BamHl y NruI de pMStrlOO, resultando en una fusión con la secuencia marcadora C-terminal RHQHQHQH(ter inador) en el vector de expresión. La proteasa 3 de S53 en el constructo de expresión Aspergillus resultante, pMStrl21, se secuenció, y la porción de codificación de la proteasa se confirmó para coincidir con la secuencia de codificación original de la SEQ ID NO: 1. La fusión en marco a la secuencia de codificación del marcador se confirmó resultando en la secuencia en la SEQ ID NO: 3, que codifica la secuencia peptídica en SEQ ID NO: 4.
La cepa Aspergillus oryzae BECh2 (WO 00/39322) se transformó con pMStrl21 utilizando técnicas estándar descritas por Christensen et al . , 1988, Biotechnology 6, 1419-1422 y WO 04/032648. Para identificar los transformantes productores de la proteasa recombinante, los transformantes y BECh2 se cultivaron en 10 mi de YP+2% del medio de glucosa a 30°C y 200RPM. Las muestras se tomaron después de un cultivo de 3 días y se resolvieron con SDS-PAGE para identificar la producción de la proteasa recombinante. Una nueva banda entre 35 y 50 kDa que no se observó en cultivos de BECh2 no transformado se observó en cultivos de transformantes. Varios transformantes que parecieron expresar la proteasa recombinante a niveles altos se cultivaron en 100ml de YP+2% de medio de glucosa en matraces de 500 mi a 30°C y 200 RPM. Las muestras se tomaron después de un cultivo de 2, 3 y 4 días y los niveles de expresión se compararon resolviendo las muestras con SDS-PAGE. Un transformante único que expresó la proteasa recombinante en niveles relativamente altos se seleccionó y designó EXP01737. EXP01737 se aisló dos veces mediante dilución de la conidia en un medio selectivo que contiene un 0.01% de TRITON® X-100 para limitar el tamaño de la colonia fermentada en YP+2% de medio de glucosa en matraces como se describió anteriormente para generar material para purificación. Los cultivos de los matraces se cultivaron después de un cultivo de 4 días y los micelios fúngicos se removieron filtrando el caldo de fermentación a través de Miracloth (Calbiochem) posteriormente se purificaron como se describe en el ejemplo 2.
YP+2% de medio de glucosa lOg de extracto de levadura 20g de peptona 1L de agua autoclave a 121°C, 20 minutos agregar 100ml de un 20% de solución de glucosa estéril Ejemplo 2: La purificación de la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus con marcardor HQC- terminal Se centrifugó el caldo de cultivo (20 000 x g, 20 min) y se decantó cuidadosamente el sobrenadante del precipitado. El sobrenadante se filtró a traves de una unidad de filtración de 0.2pm de Nalgene para remover el resto de las células hospederas Aspergillus . El filtrado de 0.2pm se transfirió ácido succínico/NaOH lOmM, pH 3.5 en una columna G25 Sephadex (de GE Healthcare) . La enzima transferida de Sephadex G25 se aplicó a una columna FF de Q-sepharose (de GE Healthcare) equilibrada en ácido succínico/NaOH lOmM, pH 3.5. La ejecución y lavado con ácido succínico/NaOH lOmM, pH 3.5 se recolectó y contenía la proteasa S53 (actividad confirmada utilizando el ensayo de Suc-AAPF-pNA cinético a pH 4 ) . El pH de la ejecución y fracción de lavado se ajustó a un pH de 3.25 con HC1 1M mientras se mezclaba la fracción. La solución con pH ajustado se aplicó en una columna FF de SP-sepharose (de GE Healthcare) equilibrada en ácido succínico/NaOH lOmM, pH 3.25. Después de lavar la columna extensamente con el amortiguador de equilibrio, la proteasa se eluyó con un gradiente de NaCl lineal (0 --> 0.5M) en el mismo amortiguador en diez volúmenes de columna. Las fracciones de la columna se analizaron para la actividad proteasa (utilizando un ensayo de Suc-AAPF-pNA cinético a un pH de 4) y se recolectaron las fracciones de pico. Se agregó sulfato de amonio sólido al grupo a una concentración final de (NH4)2SO4 de 2.0M. La solución enzimática se aplicó a una columna de f enilo-Toyopearl (de TosoHaas) equilibrada en ácido succínico/NaOH lOmM, 2.0M de (NH4)2S04, pH 3.25. Despues del lavado de la columna con amortiguador de equilibro, la proteasa S53 se eluyó con un gradiente lineal entre el amortiguador de equilibrio y ácido succínico/NaOH lOmM, pH 3.25 en diez volúmenes de columna. Las fracciones de la columna se analizaron para la actividad proteasa (utilizando un ensayo de Suc-AAPF-pNA cinético a un pH de 4) . Las fracciones con actividad alta se agruparon y transfirieron a ácido succínico/NaOH lOmM, pH de 3.5 en una columna G25 de Sephadex (de GE Healthcare) . La proteasa transferida a G25 de Sephadex se aplicó a una columna HP de SP-sepharose (de GE Healthcare) equilibrada en ácido succínico/NaOH 10mM, pH 3.5. Después de lavar la columna exhaustivamente con el amortiguador de equilibración, la proteasa se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0 0.5 M) en el mismo amortiguador durante cinco volúmenes de columna. Las fracciones que constituyen el pico principal de la columna se agruparon como el producto purificado. El producto purificado se analizó mediante SDS-PAGE y se vio una banda principal en el gel y tres bandas menores. La secuencia N-terminal de EDMAN de las bandas demostró que todas las bandas estaban relacionadas con la proteasa S53 y por ende, esperamos que las bandas menores representen cortes de algunas de las moléculas de proteasa S53. El producto purificado se utilizó para mayor caracterización.
Ejemplo 3: La caracterización de la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus con marcador HQC-terminal.
El ensayo de Suc-AAPF-pNA cinético se utilizó para obtener el perfil de actividad del pH y el perfil de estabilidad del pH (actividad residual después de 2 horas a los valores de pH indicados). Para el perfil pH-estabilidad se diluyó la proteasa lOx en los distintos amortiguadores de ensayo hasta alcanzar los valores de pH de estos amortiguadores y a continuación se incubó durante 2 horas a 37 °C. Tras la incubación, el pH de las incubaciones de la proteasa se ajustó al mismo valor de pH, antes del ensayo para determinar la actividad residual, mediante dilución en el amortiguador de ensayo de pH 4.0. El ensayo de Suc-AAPF-pNA de punto final se utilizó para obtener el perfil de actividad-temperatura a un pH de 4.0. El ensayo de Suc-AAPX-pNA cinético y diez sustratos de Suc-AAPX-pNA diferentes se utilizaron para obtener la especificidad ml de la enzima a un pH de 4.0.
Los resultados aparecen en las tablas 2 a 5 a continuación. Los datos para la proteasa 10R se incluyen en las tablas. En la tabla 2, las actividades son relativas al pH óptimo para las enzimas. En la tabla 3, las actividades son actividades residuales relativas a las muestras, las cuales se mantienen en condiciones estables (5°C, pH 4.0 para la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2); 5°C, pH 9.0 para la proteasa 10R). En la tabla 4, las actividades son relativas a la temperatura óptima para la enzima (pH 4.0 para la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2); pH 6.5 para la proteasa 10R). En la tabla 5, las actividades son relativas al mejor sustrato para las enzimas (Suc-AAPL-pNA para la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2)). El ensayo de Protazyme AK se utilizó para obtener el perfil de actividad-temperatura a un pH de 6.5 para la Proteasa 10R.
La actividad del pH en el sustrato Suc-AAPF-pNA, el perfil de estabilidad del pH (actividad residual después de 2 horas a 37°C), el perfil de actividad de la temperatura en Suc-AAPF-pNA a un pH de 4.0 y la especificidad P1 en 10 sustratos Suc-AAPF-pNA a un pH de 4.0 para la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en comparación con los datos para la Proteasa 10R también aparecen en las figuras 1-4. Para la Proteasa 10R, el perfil de actividad de la temperatura está en Protazyme AK a un pH de 6.5 y la especificidad P1 tiene un pH de 9.0.
Tabla 2: perfil de actividad del pH a 25°C co o se determina utilizando el ensayo de Suc-AAPF-pNA cinético Tabla 3: perfil de estabilidad del pH (actividad residual después de horas a 37°C) determinado utilizando el ensayo de Suc-AAPF-pNA cinético Tabla 4: El perfil de actividad de temperatura a un pH de 4.0 o pH de 6.5 como se determinó utilizando el ensayo de Suc- APPF-pNA de punto final.
Tabla 5: La especificidad P1 en 10 sustratos de Suc-AAPX-pNA a un pH de 4.0 o pH de 9.0 a 37°C como se determinó utilizando el ensayo de Suc-AAPX-pNA cinetico Otras características para la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) La determinación de la secuencia N-terminal fue: AIPASCASTI.
El peso molecular relativo como fue determinado por SDS-PAGE fue de aprox. Mr 43kDa.
Confirmación del marcador HQ C-terminal adjuntado a la secuencia madura Esta muestra sufrió un intercambio de amortiguador con amortiguador de acetato 50mM a un pH de 5.5 utilizando una unidad de ultrafiltración de Vivaspin adaptada con un filtro de corte de lOkDa. Después del intercambio de amortiguador, se agregaron 2pL de endoglicosidasa H y la muestra se incubó a 5°C durante la noche. Nota: Para cada sitio enlazado a deglicosilado, un residuo de N-acetil hexosamina permanece en el esqueleto de la proteína aumentando el peso molecular con 203.10 Da por sitio. La muestra se analizó con espectrometría de masas.
El peso molecular determinado por análisis de peso molecular intacto del pico principal fue: 38088.6 Da, que corresponde a 1.8Da de la secuencia madura más -RHQHQ más una acetil hexosamina única y un residuo de cisteína no reticulado.
El peso molecular determinado por análisis del peso molecular intacto del pico secundario fue: 37961 Da, que corresponde a 2.3Da de la secuencia madura más -RHQHQ más una acetil hexosamina única y un residuo de cisteína no reticulado.
La secuencia madura (de los datos de secuenciación de N-terminal de EDMAN y análisis del peso molecular intacto): AIPASCASTITPACLQAIYGIPTTKATQSSNKLAVSGFIDQFANKADLKSFLAQFR KDISSSTTFSLQTLDGGENDQSPSEAGIEANLDIQYTVGLATGVPTTFISVGDDFQDGNLE GFLDIINFLLGESNPPQVLTTSYGQNENTISAKLANQLCNAYAQLGARGTSILFASGDGGV SGSQSAHCSNFVPTFPSGCPFMTSVGATQGVSPETAAAFSSGGFSNVFGIPSYQASAVSGY LSALGSTNSGKFNRSGRGFPDVSTQGVDFQIVSGGQTIGVDGTSCASPTFASVISLVNDRL IAAGKSPLGFLNPFLYSSAGKAALNDVTSGSNPGCSTNGFPAKAGWDPVTGLGTPNFAKLL TAVGLRHQHQ (SEQ ID NO: 6).
El peso molecular calculado de esta secuencia madura es 37882.6 Da.
Ejemplo 4: Ensayo de actividad en harina de soja-maíz Se empleó un ensayo de punto final utilizando harina de soja-maíz como sustrato para obtener el perfil de actividad de las proteasas a pH 3-7.
Sustrato: La harina de soja-maíz se mezclan con una relación de 30:70.
Amortiguadores de ensayo: Se prepararon 9 amortiguadores que contenían ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM, CHES 100 mM, CAPS 100 mM, CaCl21 mM, KC1150 mM, un 0.01% de Tritón X-100 y se ajustó su pH utilizando HCl o NaOH hasta un valor tal que, después de haber mezclado el sustrato de harina de soja-maíz (1 g) con el amortiguador de ensayo (10 mL) para obtener una suspensión densa, el pH final de la suspensión densa fuera uno de los siguientes: 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 y 11.0.
La suspensión del sustrato (2 mL) se mezcló durante 30 minutos antes de la incorporación de la proteasa y se incubó durante 3 horas a 40°C (500 rpm). La proteasa (200 mg de proteína enzimática/kg de material seca) se disolvió en 100 pL de amortiguador de acetato de sodio 100 mM (9.565 g/L de NaOAc, 1.75 g/L de ácido acético, CaCl25 mM, 0.01% de BSA, 0.01% de Tween20, pH 6.0) y se añadió. Se centrifugaron las muestras (10 min, 4000 rpm, 0 °C) y se recogieron los sobrenadantes para su análisis utilizando el ensayo con o-ftadialdehído (OPA).
Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 6. La actividad proteolítica de la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en harina de soja - maíz está en su punto más alto a un pH de 3 y disminuye con el pH creciente. A un pH de 5, la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) es tan activa en la harina de soja-maíz como en la Proteasa 10R, mientras que a un pH de 3 y de 4 la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) es mucho más activa que la Proteasa 10R. Estos resultados indican que la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) podría ser eficiente para obtener la hidrólisis proteica en el tracto gastrointestinal superior de animales monogástricos como, por ejemplo, cerdos y aves de corral, lo que deriva en una mejor utilización de la proteína alimentarias en estas especies.
Tabla 6: La actividad proteasa (OD34Q x factor de dilución) en la harina de soja-maíz a un pH de 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 y 7.0 La Figura 5 muestra la actividad (OD340 x factor de dilución) en la harina de soja-maíz de la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en comparación con la proteasa 10R.
Ejemplo 5: La actividad proteolítica en el material digerido en el buche, la molleja y el íleon de pollos de engorde Se recogió material digerido en el buche, la molleja y el íleon de pollos de engorde de 21 días de edad alimentados con una dieta de maíz-soja; se liofilizó y se molió con un molinillo de café pequeño. Las muestras molidas se suspendieron (un 47% p/v) en los siguientes amortiguadores y se dejaron hidratar a 4°C durante la noche (sin agitación): Amortiguador del buche: HEPES 100 mM, CaCl2·2 H2O 1 mM, KC1 150 mM, 0.01% de Tritón X-100, ajustado a pH 5 utilizando HCl Amortiguador de la molleja: ácido succínico 100 mM, CaCl · 2H20 1 mM, KCl 150 mM, un 0.01% de Tritón X-100, ajustado a pH 1.67 utilizando HC1 Amortiguador del íleon: HEPES 100 mM, CaCl · 2 H2O 1 mM, KCl 150 mM, 0.01% de Tritón X-100, ajustado a pH 7.2 utilizando HC1 El pH resultante fue: pH 5 en muestras de buche; pH 3 en muestras de molleja; y pH 7 en muestras de íleon. Las suspensiones se calentaron a 40 °C y se dispensó lml en tubos mantenidos a 40°C. Tres tubos que representan blanco (To) se centrifugaron inmediatamente (3000 x g, 0°C, 10 min) y los sobrenadantes se congelaron. Ya sea la enzima (200 mg de proteína enz imát ica/kg de sustrato) en 50 pL de amortiguador de acetato de sodio 100 mM (9.565 g/1 de NaOAc, 1.75 g/1 de ácido acetico, CaCl2 5 mM , 0.01% de BSA , 0.01% de Tween20, pH 6.0) o solo amortiguador de acetato de sodio (50 pL) para las muestras en blanco se agregaron a los tubos y las muestras de buche e íleon se incubaron durante 3 horas (T ) mientras que las muestras de molleja se incubaron durante 1 hora (T ) a 40°C mientras se agitó (500 rpm) . Las muestras se centrifugaron (3000 x g, 0 °C, 10 min) , y los sobrenadantes se extrajeron y se congelaron. La actividad proteolítica se determinó analizando las aminas primarias utilizando un ensayo de o-f taldialdehído (OPA) .
Los resultados se muestran en la Tabla 7. Para cada uno de los tipos de material digerido (en el buche, la molleja y el íleon) hubo una diferencia significativa entre el nivel de aminas primarias en la muestra de blanco T0 y en las muestras de blanco incubadas durante 1 o 3 horas. Esta diferencia puede atribuirse a la actividad de proteasas presentes en el sustrato y que provienen de la materia prima de la dieta o el animal. Durante la incubación del material digerido de buche y molleja, la proteasa 3 de S53 de Meripi l us giganteus (del ejemplo 2) aumentó aun más el nivel de las aminas primarias en comparación con la muestra en blanco, lo que demuestra que la proteasa tuvo una actividad proteolítica en este sustrato en las condiciones dadas. La proteasa 3 de S53 de Meripi lus giganteus (del ejemplo 2) tuvo un rendimiento significativamente mejor durante la incubación de buche y molleja que la Proteasa 10R, lo que indica que la proteasa 3 de S53 de Meripi l us giganteus (del ejemplo 2) pudo ser más eficiente para la hidrólisis de la proteína alimentaria en el tracto gastrointestinal superior de las aves de corral, lo que derivó en una mejor digestión proteica. Como se esperaba, la proteasa 3 de S53 de Meripi l us giganteus (del ejemplo 2) no aumentó significativamente el nivel de aminas libres durante la incubación del íleon a pH 7.
Tabla 7: La actividad proteolítica de la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en comparación con la Proteasa 10R cuando se incubó con material digerido de pollos de engorde y expresada como nivel de las aminas primarias medidas mediante el ensayo OPA (OD340 x factor de dilución) a-b-c Los valores dentro de una columna que no están conectados por las mismas letras en superíndice son estadísticamente diferentes según se determinó por la prueba de Tukey Kramer (a=0. 05) proporcionada por el procedimiento ANOVA ( Instituto SAS Inc . ) .
La Figura 6 muestra el nivel de aminas l ibres ( OD x f actor de di luc ión ) en muestras de blanco To , las muestras de blanco y las muestras incubadas con proteasa 3 de S53 de Meripi l us giganteus ( del ej emplo 2 ) o la proteasa 10R . El sustrato para la incubación fue material digerido de buche , mol lej a o íleon de pollos de engorde.
Ejemplo 6: Ter oestabllldad Una alícuota de la muestra proteica de la proteasa (purificada como se describe en el Ejemplo 2 o 12) está desalada o se cambió el amortiguador a Na-acetato 20 mM, pH 4.0 utilizando una columna PD-10 preenvasada o se sometió a diálisis contra 2 x 500 mi de Na-acetato 20 mM, pH 4.0 a 4°C en una etapa de 2 a 3 horas seguido por una etapa de noche completa. La muestra se filtra a través de un filtro de 0.45 mm y se diluye con amortiguador hasta aproximadamente 2 unidades de A280. El amortiguador de diálisis se utiliza como referencia en la calorimetría diferencial de barrido (CDB). Las muestras se desgasifican utilizando succión al vacío y agitando durante aproximadamente 10 minutos.
Se realiza un barrido de CDB en un MicroCal VP-DSC con una velocidad de barrido constante de 1.5 °C/min desde 20 hasta 90 °C. Se realiza un estudio de los datos utilizando el software MicroCal Origin (versión 4.10), y la temperatura de desnaturalización, Td (denominada también temperatura de fusión, Tf) se define como la temperatura en el ápice del pico en el termograma.
Ejemplo 7: Estabilidad frente al vapor La actividad residual de la proteasa después del tratamiento con vapor se puede evaluar utilizando el siguiente ensayo.
En estos experimentos, se utiliza una configuración modificada mediante la cual el vapor se obtiene de un generador de vapor y se dirige a la caja. Las muestras colocadas en una placa se insertan en la caja a través de un cajón cuando la temperatura alcanza aprox.93-94 °C. Tras la inserción de las muestras, la temperatura se reduce 4 °C. Se realiza una incubación durante 30 segundos mientras que la temperatura se mantiene aproximadamente constante a 90 °C. A continuación, la placa se retira rápidamente de la caja, las muestras se colocan sobre hielo, se vuelven a suspender y se evalúan con respecto a la actividad proteasa utilizando, p. ej., el ensayo de Suc-AAPF-pNA u o-ftaldialdehído (OPA). Cada muestra enzimática se compara con una muestra similar que no ha sido tratada con vapor con el fin de calcular la actividad residual.
Ejemplo 8: Pruebas de estabilidad frente a la formación de microesferas La granulación enzimática se lleva a cabo de una forma como la que se describe en el Ejemplo 1 de la patente de EE. UU. N.° 4,106,991. El pelotillado obtenido se seca en un lecho fluido hasta un contenido de agua inferior a un 1% y se tamiza para obtener un producto con un tamaño de partícula comprendido entre 250 mm y 850 pm. Por último, el producto se recubre con aceite de palma y carbonato de calcio de una forma como la que se describe en el Ejemplo 22 de la patente de EE. UU. N.° 4,106,991.
Se premezclan aproximadamente 50 g de pelotillado enzimático con 10 kg de alimento durante 10 minutos en una mezcladora horizontal pequeña. Esta premezcla se mezcla con 90 kg de alimento durante 10 minutos en una mezcladora horizontal más grande. Desde la mezcladora el alimento se dirige al acondicionador (una mezcla en cascada con inyección de vapor) a una velocidad de aproximadamente 300 kg/hora. El acondicionador calienta el alimento hasta 95 °C (medida a la salida) inyectando vapor. El tiempo de permanencia en el acondicionador es de 30 segundos. Desde el acondicionador el alimento se dirige a una prensa Simón Heesen equipada con un troquel horizontal de 3.0x35 mm y se prensa en forma de microesferas con una longitud de aproximadamente 15 mm..Después de prensar, las microesferas se colocan en un refrigerador por aire y se enfrían durante 15 minutos.
La actividad proteasa se mide utilizando el ensayo con Suc-AAPF-pNA antes de la formación de microesferas y en las microesferas de alimento después de la formación de microesferas. La estabilidad de la formación de microesferas se determina comparando la actividad proteasa en el alimento pelotillado en relación con la actividad en alimento no pelotillado.
Ejemplo 9: La clonación de dos genes de proteasa de Trametes cf. versicolor y Trametes versicolor En base a las secuencias genéticas identificadas, SEQ ID NO: 15 de una cepa de Trametes cf. versicolor <2181 (véase sección de cepa) y SEQ ID NO: 20 de una cepa de Trametes versicolor (véase sección de cepa) se diseñaron dos secuencias de ADN de codificación sintética con optimización del codón para la expresión de Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 22, respectivamente). Las dos secuencias de CDS se sintetizaron mediante GeneArt (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) en un vector pMA-T vector a una escala de 5 mg con dos sitios de acompañamiento BamHI en 5' y HindIII en 3' compatibles con el vector de expresión pDAul09 (WO 2005042735). 1 pg de los plásmidos se digirió posteriormente con las enzimas de restricción BamHI y HindIII de NEB (New England Biolabs, Frankfurt am Main Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante, y los fragmentos resultantes se separaron mediante electroféresis con 1% de gel de agarosa utilizando amortiguador TAE. El fragmento de 1.7 kb correspondiente a los genes de proteasa sintética se extrajeron del gel y se purificaron utilizando un kit de purificación de banda de Gel y PCR ADN de GFX (GE Healthcare, Hillerod, Dinamarca) siguiendo las instrucciones del fabricante. 100 ng de los insertos se clonaron en el vector de expresión (WO 2005042735) previamente digerido con BamHI y HindIII por ligue con una ligasa T4 de NEB (New England Biolabs, Frankfurt am Main Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Un volumen de 2.5 ml de la mezcla de ligue diluida se utilizó para transformar células químicamente competentes TOPIO de E. coli (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU). Se seleccionaron tres colonias de las placas de agar LB que contenían 100 mg de ampicilina por mi para cada constructo y se cultivaron durante la noche en 3 mi de medio LB complementado con 100 pg de ampicilina por mi. El ADN plásmido se purificó utilizando un kit Miniprep Spin Qiagen (Cat.27106) (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las secuencias sintéticas de proteasa Trametes cf. versicolor y Trametes versicolor se verificaron mediante secuenciación de Sanger antes de la expresión heteróloga. Los plásmidos designados como MDQM0673-1 y MDQM0584-1 (que tienen CDS SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 22 respectivamente) se seleccionaron de la transformación de protoplastos y la expresión heteróloga de sus proteasas codificadas en una célula hospedera de Aspergillus oryzae MT3568 (descrita en el capítulo de cepas).
Ejemplo 10: La transformación de Aspergillus oryzae con las proteasas codificadoras de genes de Trametes cf. versicolor y Trametes versicolor y la selección de los mejores transformantes Se prepararon protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 (véase capítulo de cepas) de conformidad con WO 95/002043. Cien ml de protoplastos se mezclaron con 2.5-10 pg de alguno de los vectores de expresión de Aspergillus MDQM0673-1 y MDQM0584-1 (Ejemplo 9), 250 ml de un 60% de PEG 4000 (Applichem, Darmstadt, Alemania) (polietilenglicol, peso molecular 4,000), CaCl210 mM, y Tris-HCl 10 mM pH 7.5 y se mezclaron cuidadosamente. La mezcla se incubó a 37°C durante 30 minutos y los protoplastos se distribuyeron en placas de COVE para su selección. Después de la incubación durante 4 a 7 días a 37°C las esporas de ocho transformantes se inocularon en 0.5 mi de ácido láctico complementado con un medio DAP4C-1 y con fosfato de diamonio en placas de 96 pocilios. Después de un cultivo de 4 días a 30°C, los caldos de cultivo se analizaron mediante SDS-PAGE utilizando un 4 a un 20% de gel de Tris-glicina Novex® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.) para identificar los transformantes que producen la mayor cantidad de proteasa recombinante de Trametes versicolor .
En base a la intensidad de banda del gel SDS-PAGE, las esporas del mejor transformante se distribuyeron en placas de sacarosa-T de COVE que contenían un 0.01% de TRITON® X-100 para aislar las colonias independientes. La distribución se repitió dos veces en total en placas de Sacarosa-T de COVE y luego una colonia independiente se distribuyó en un tubo de N-Agar de COVE hasta la esporulación.
Ejemplo 11: Fermentación de Aspergillus oryzae transformado con las proteasas codificadoras de genes de Trametes cf. versicolor y Tr mete versicolor 150 mi de medio DAP4C-1 complementado con 5 mi de un 20% de ácido láctico y 3.5 mi de un 50% de fosfato de diamonio y esporas de los mejores transformantes se cultivaron en matraces durante 4 días a una temperatura de 30°C en una agitación a 100 rpm. Los caldos de cultivo se cosecharon por filtración utilizando un dispositivo de filtro de 0.2 mm y se utilizaron para mayor caracterización.
Ejemplo 12: La purificación de la proteasa 1 de S53 de Trametes cf versicolor Se centrifugó el caldo de cultivo (20000 x g, 20 min) y se decantó cuidadosamente el sobrenadante del precipitado. El sobrenadante se filtró a través de una unidad de filtración de 0.2pm para remover el resto de células hospederas de Aspergillus . El filtrado de 0.2pm se transfirió a ácido succínico/NaOH lOmM, pH 3.5 en una columna Sephadex G25 (de GE Healthcare). La enzima transferida de Sephadex G25 se aplicó a una columna FF de SP-sepharose (de GE Healthcare) equilibrada en ácido succínico/NaOH lOmM, pH 3.5. Después de lavar la columna con el amortiguador de equilibrio, la proteasa se eluyó con un gradiente de NaCl lineal (0 --> 1.0M) en el mismo amortiguador en diez volúmenes de columna. Las fracciones de la columna se analizaron para la actividad proteasa (utilizando el ensayo de Suc-AAPF-pNA cinético a pH 4) y las fracciones pico fueron analizadas por SDS-PAGE. Las fracciones con una banda únicamente en el gel de SDS-PAGE teñido con coomassie se agruparon como el producto purificado. El producto purificado se utilizó para su mayor caracterización.
Ejemplo 13: La caracterización de la proteasa 1 de S53 de Trametes cf versicolor (SEQ ID NO: 19) El ensayo de Suc-AAPF-pNA cinético se utilizó para obtener el perfil de actividad del pH. El ensayo de Suc-AAPF-pNA de punto final se utilizó para obtener el perfil de estabilidad del pH (actividad residual después de 2 horas a los valores de pH indicados) y el perfil de actividad de la temperatura pH 4.0. Para el perfil de estabilidad del pH, la proteasa se diluyó 7x en los diferentes amortiguadores de ensayo para alcanzar los valores de pH de estos amortiguadores y se incubaron durante 2 horas a 37°C. Tras la incubación, el pH de las incubaciones de la proteasa se ajustó al mismo valor de pH, antes del ensayo para determinar la actividad residual, mediante dilución en el amortiguador de ensayo de pH 4.0. El ensayo de Suc-AAPX-pNA cinético y diez sustratos de Suc-AAPX-pNA diferentes se utilizaron para obtener la especificidad P1 de la enzima a un pH de 4.0.
Los resultados se muestran a continuación en las Tablas 8-11. Los datos para la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) y la proteasa 10R se incluyen en las tablas. En la Tabla 8, las actividades son relativas al pH óptimo para las enzimas. En la Tabla 9, las actividades son actividades residuales en relación con muestras, que se mantienen en condiciones estables (5°C, pH 4.0). En la Tabla 10, las actividades son relativas respecto a la temperatura óptima de la enzima a pH 4.0. En la Tabla 11, las actividades son relativas al mejor sustrato para las enzimas (Suc-AAPL-pNA para la proteasa 1 de S53 de Trametes cf versicolor) .
Tabla 8: perfil de actividad del pH a 25°C como se determina utilizando el ensayo de Suc-AAPF-pNA cinético Tabla 9: perfil de estabilidad del pH (actividad residual despues de 2 horas a 37°C) como se determinó utilizando el ensayo de Suc-AAPF-pNA cinético Tabla 10: El perfil de actividad de la temperatura a pH 4.0 o pH 6.5 como se determinó utilizando el ensayo de Suc-AAPF-pNA de punto final Tabla 11: Especificidad P1 en 10 sustratos Suc-AAPX-pNA a un pH 4.0 o pH 9.0 a 37°C como se determinó utilizando el ensayo de Suc-AAPX-pNA cinetico La actividad de pH en el sustrato Suc-AAPF-pNA, el perfil de estabilidad del pH (actividad residual después de 2 horas a 37°C), el perfil de actividad de la temperatura en Suc-AAPF-pNA a pH 4.0 y la especificidad P1 en 10 sustratos Suc-AAPF-pNA a pH 4.0 para la proteasa 1 de S53 de Trametes cf versicolor en comparación con los datos para la proteasa 3 de S53 de Meripilus giganteus también aparecen en las Figuras 1 a 4 a continuación.
Otras características para la proteasa 1 de S53 de Trametes cf versicolor La determinación de la secuencia N-terminal fue: AIPASCASTI.
El peso molecular relativo como ha sido determinado por SDS-PAGE fue de approx. Mr = 42kDa.
Confirmación de la secuencia madura para la proteasa 1 de S53 de Trametes cf versicolor La muestra purificada sufrió un intercambio de amortiguador con amortiguador de acetato de sodio 50mM, pH 5.5 utilizando una unidad de ultrafiltración de Vivaspin con lOkDa de filtro de corte. Con posterioridad al intercambio de amortiguador, se agregó Endoglicosidasa H y la muestra se incubó a 30°C durante 3 horas.Nota: Para cada sitio N-vinculado deglicosilado, un residuo de N-acetil hexosamina permanece en el esqueleto de la proteína aumentando el peso molecular con 203.19Da por sitio. La muestra se analizó posteriormente mediante espectrometría de masa.
El peso molecular determinado por análisis de peso molecular intacto del pico principal fue: 37467.6Da, que corresponde a 0.41 Da de la secuencia madura más una acetil hexosamina única y un residuo de cisteína reticulado.
La secuencia madura (de los datos de secuencia del N-terminal de EDMAN y datos de Intact MS): AVPASCASTITPACLQALYGIPTTKATQSSNKLAVSGFIDQFANSADLKTFLGKFR TDISSSTTFTLQTLDGGSNSQSSSQAGVEANLDIQYTVGLASAVPTIFISVGDDFQDGDLE GFLDIINFLLNESAPPQVLTTSYGQNENTISAKLANQLCNAYAQLGARGTSILFASGDGGV SGSQSSSCSKFVPTFPSGCPFMTSVGATQGINPETAADFSSGGFSNVFARPSYQSTAVSSY LTALGSTNSGKFNTSGRAFPDIATQGVDFEIW SGRTEGVDGTSCASPTLAAIISLLNDRL IAAGKSPLGFLNPFLYSAAGTAALTDITSGSNPGCNTNGFPAKAGWDPVTGLGTPNFAKLL TAVGL (SEQ ID NO: 19).
El peso molecular calculado de esta secuencia madura es 37263.ODa.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un polipéptido aislado con actividad proteasa, caracterizado porque es seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 84% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; (b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 83% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; (c) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23; (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones de rigurosidad alta, o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 3, (iii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15, (iv) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 17, (v) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20, (vi) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 22, (vii) la hebra complementaria completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) o (vi); (e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 84% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3; (f) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 83% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17; (g) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20 O SEQ ID NO: 22; (h) una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones; y (i) un fragmento de un polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h) que tiene actividad proteasa.
2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende o consiste de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24.
3. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque es un fragmento de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 donde el fragmento tiene actividad proteasa.
4. Un polipéptido variante que tiene actividad proteasa caracterizado porque comprende una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.
5. Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido que tiene actividad proteasa, seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 84% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; (b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 83% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; (c) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23; (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones de rigurosidad alta, o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 3, (iii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15, (iv) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 17, (v) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20, (vi) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 22, (vii) la hebra complementaria completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) o (vi); (e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 84% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3; (f) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 83% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15 O SEQ ID NO: 17; (g) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22; (h) una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones; y (i) un fragmento de un polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h) que tiene actividad proteasa.
6. El uso de un polipéptido aislado en alimento para animales que tiene actividad proteasa, seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; (b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; (c) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23; (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones de rigurosidad alta, o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 3, (iii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15, (iv) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 17, (v) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20, (vi) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 22, (vii) la hebra complementaria completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) o (vi); (e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3; (f) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17; (g) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 60% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22; (h) una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 24 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (varias) posiciones; y (i) un fragmento de un polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h) que tiene actividad proteasa.
7. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Un constructo de ácido nucleico o un vector de expresión caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, ligado operablemente a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en una célula hospedadora de expresión.
9. Una célula hospedera de expresión recombinante caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, ligado operablemente a una o más secuencias de control que dirijen la producción del polipéptido.
10. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el hospedero es un hongo filamentoso como Aspergillus , Trichoderma o Fusarium, o una levadura como Pichia o Saccharomyces .
11. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el hospedero es Aspergillus , como Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus , Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.
12. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el hospedero es Bacillus como Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans , Bacillus firmus, Geobacillus stearothermophilus , Bacillus lautus, Bacillus lentus , Bacillus licheniformis , Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis , o Bacillus thuringi ensis .
13. Un método de producción del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula, que en su forma natural produce el polipéptido en condiciones propicias a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
14. Un método de producción del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en condiciones propicias a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
15. Una planta, parte de una planta o célula vegetal transgénica transformada con un polinucleótido caracterizada porque codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
16. Un método de producción del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una planta o célula vegetal transgénica de conformidad con la reivindicación 15 en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
17. Una composición alimentaria para animales caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
18. La composición alimentaria para animales de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque comprende además una o más amilasas, fitasas, xilanasas, galactanasas, alfa-galactosidasas, proteasas, fosfolipasas, beta-glucanasas o cualquier mezcla de estos.
19. El uso de al menos un polipéptido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en alimentos para animales; en aditivos alimentarios para animales; en la preparación de una composición que se puede utilizar en alimentos para animales; para mejorar el valor nutricional de un alimento para animales; para incrementar la proteína digestible y/o soluble en alimentos para animales; para incrementar el grado de hidrólisis de proteínas en dietas para animales; y/o para el tratamiento de proteínas.
20. Un método para mejorar el valor nutricional de un alimento para animales, caracterizado porque se añade al menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, al alimento.
21. Un aditivo alimentario para animales caracterizado porque comprende al menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y al menos una vitamina liposoluble y/o al menos una vitamina hidrosoluble y/o al menos un mineral traza.
22. El aditivo alimentario para animales de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende además una o más amilasas; fitasas; xilanasas; galactanasas; alfa-galactosidasas; proteasas; fosfolipasas; beta-glucanasas; o cualquier mezcla de estos.
23. Un alimento para animales caracterizado porque posee un contenido de proteína cruda de 50 a 800 g/kg y comprende al menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
24. Un método para el tratamiento de proteínas, caracterizado porque comprende el paso de añadir al menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, a al menos una proteína o fuente de proteína.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la soja o la harina de soja se incluyen entre la fuente o las fuentes proteicas.
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