ES2908190T3 - Polipéptidos con actividad de trehalasa y polinucleótidos que los codifican - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que tiene actividad de trehalasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 21; (b) un fragmento del polipéptido de (a) que tiene actividad trehalasa; y en donde el polipéptido tiene una temperatura de desnaturalización térmica, Td, de al menos 63 ºC cuando se determina por ensayo de desplazamiento térmico.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos con actividad de trehalasa y polinucleótidos que los codifican

Referencia a un Listado de Secuencias

Esta solicitud contiene un Listado de Secuencias en formato legible por computadora.

Antecedentes de la invención

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de trehalasa y a polinucleótidos que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos, así como a métodos para producir los polipéptidos. La invención también se refiere a procedimientos para producir productos de fermentación utilizando una trehalasa de la invención.

Descripción de la Técnica Relacionada

Trehalosa es un azúcar disacárido estable que consiste en dos monómeros de azúcar (glucosa). Trehalosa se acumula en levaduras como respuesta al estrés en hasta un 10-15 % del peso seco de la célula (GrBa et al. (1975) Eur. J. Appl. Microbiol. 2:29-37). Trehalosa no puede ser metabolizada por la levadura. La enzima trehalasa escinde trehalosa en dos unidades de glucosa

Las trehalasas se clasifican en EC 3.2.1.28 (alfa,alfa-trehalasa) y EC. 3.2.1.93 (alfa,alfa-fosfotrehalasa). Las clases de EC se basan en las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB). La descripción de las clases de EC se puede encontrar en Internet, p. ej., en "http://www.expasv.org/enzvme/". A las dos clases de enzimas se las alude como "trehalasas". Ejemplos de trehalasas neutras incluyen trehalasas de Saccharomyces cerevisiae (Londesborouh et al. (1984) Characterization of two trehalases from baker's yeast" Biochem J 219, 511-518; Mucor roxii (Dewerchin et al (1984),"Trehalase activity and cyclic AMP content during early development of Mucor rouxii spores", J. Bacteriol. 158, 575-579); Phycomyces blakesleeanus (Thevelein et al (1983), "Glucose-induced trehalase activation and trehalose mobilization during early germination of Phycomyces blakesleeanus spores" J. Gen Microbiol. 129, 719-726); Fusarium oxysporium (Amaral et al (1996), "Comparative study of two trehalase activities from Fusarium oxysporium var Linii" Can. J Microbiol. 41, 1057-1062). Ejemplos de trehalasas neutras incluyen, pero no se limitan a, trehalasas de Saccharomyces cerevisiae (Parvaeh et al. (1996) Purification and biochemical characterization of the ATH1 gene product, vacuolar acid trehalase from Saccharomyces cerevisae" FEBS Lett. 391, 273-278); Neorospora crassa (Hecker et al (1973), "Location of trehalase in the ascospores of Neurospora: Relation to ascospore dormancy and germination". J. Bacteriol. 115, 592­ 599); Chaetomium aureum (Sumida et al. (1989), "Purification and some properties of trehalase from Chaetomium aureum MS-27. J. Ferment. Bioeng. 67, 83-86); Aspergillus nidulans (d'Enfert et al. (1997), "Molecular characterization of the Aspergillus nidulans treA gene encoding an acid trehalase required for growth on trehalose. Mol. Microbiol. 24, 203-216); Humicola grísea (Zimmermann et al. (1990)." Purification and properties of an extracellular conidial trehalase from Humicola grisea var. thermoidea", Biochim. Acta 1036, 41-46); Humicola grisea (Cardello et al. (1994), "A cytosolic trehalase from the thermophilhilic fungus Humicola grisea var. thermoidea', Microbiology UK 140, 1671-1677; Scytalidium thermophilum (Kadowaki et al. (1996), "Characterization of the trehalose system from the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum" Biochim. Biophys. Acta 1291, 199-205J; and Fusarium oxysporium (Amaral et al (1996), "Comparative study of two trehalase activities from Fusarium oxysporium var Linii" Can. J Microbiol. 41, 1057­ 1062).

También se conoce una trehalasa de la soja (Aeschbachetet al (1999)" Purification of the trehalase GmTRE1 from soybean nodules and cloning of its cDNA", Plant Physiol 119, 489-496).

Las trehalasas también están presentes en el intestino delgado y el riñón de los mamíferos.

El documento WO 2009/121058 (Novozymes) se refiere a un método para fermentar azúcares derivados de material vegetal en un producto de fermentación, tal como etanol, utilizando un organismo de fermentación mediante la adición de una o más trehalasas al medio de fermentación.

El documento WO 2012/027374 (Dyadic) describe una trehalasa de Myceliophthora thermophila que puede utilizarse en una mezcla de enzimas para degradar biomasa lignocelulósica en azúcares fermentables.

El documento WO 2013/148993 (Novozymes) describe un procedimiento para producir un producto de fermentación, tal como etanol, a partir de material que contiene almidón mediante la licuefacción, sacarificación y fermentación del material que contiene almidón, en el que una enzima generadora de una fuente de hidratos de carbono, una composición celulolítica y una trehalasa están presentes en la fermentación. Se describe una trehalasa de Trichoderma reesei

El documento WO 2015/065978 (Danisco US Inc.) describe un método para aumentar la producción de etanol a partir de un licuado en una reacción de fermentación que incluye fermentar el licuado con una glucoamilasa, un organismo de fermentación y una trehalasa y recuperar el etanol y otros productos de fermentación al final de la fermentación. El documento WO 2016/205127 (Novozymes) describe una trehalasa de Myceliophthora sepedonium que pertenece a la Familia 37 de Glucósido Hidrolasas ("GH37") según se define por CAZY (véase, www.cazv.org). que tiene una alta termoestabilidad y un amplio intervalo de pH. También se encontró que se puede obtener un rendimiento incrementado de etanol al añadir una trehalasa a la fermentación en un proceso de etanol.

Fujii T., et al.. 2014. Taxonomic revision of the cellulose-degrading fungus Acremonium cellulolyticus nomen nudum to Talaromyces based on phylogenetic analysis. FEMS Microbiology Letters. 351: 32-41 y Uniprot:A0A0B8MYG3 describen trehalasas de Talaromyces cellulyticus, y Uniprot:A0A1 L9RM22 describe una trehalasa de Aspergillus wentii. Una trehalasa de Talaromyces verruculosus se publicó en 2015 como parte de una secuencia del genoma en www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA 001305275.1: (polipéptido identificado como EFP5BRM8N).

Li et a/.. 2017. Scientific Reports, vol. 7. n° 1. Describe una trehalasa de Talaromyces pinophilus.

El documento WO2014/202622 describe dos trehalasas de Rasamsonia emersonii con los números de acceso BBS02793 y BBS029664.

Se han descrito trehalasas adicionales tal como UNIPROT :A0A093V3X4 y UNIPROT: Q6V7X7.

Sigue existiendo la necesidad de proporcionar enzimas o composiciones enzimáticas adecuadas para uso en procedimientos para producir productos de fermentación. tales como etanol. con mayores rendimientos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona polipéptidos que tienen actividad de trehalasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Las trehalasas de acuerdo con la invención tienen buena estabilidad frente a la degradación por proteasas y una alta termoestabilidad. Las trehalasas se obtienen preferiblemente de un hongo del género Talaromyces.

Por consiguiente. la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de trehalasa seleccionados del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 21;

(b) un fragmento del polipéptido de (a). que tiene actividad de trehalasa. y en donde el polipéptido tiene una temperatura de desnaturalización térmica. Td. de al menos 63 °C cuando se determina por ensayo de desplazamiento térmico.

En un aspecto adicional. la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican las variantes; construcciones de ácidos nucleicos. vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos; y a métodos para producir las variantes. En un aspecto adicional. la presente invención se refiere a composiciones que comprenden las variantes de la invención.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación. que comprende

(a) licuar un material que contiene almidón con una alfa-amilasa;

opcionalmente pre-sacarificar el material licuado antes de la etapa (b);

(b) sacarificar el material licuado;

(c) fermentar utilizando un organismo de fermentación;

en donde

i) una glucoamilasa;

ii) una trehalasa de la invención;

iii)

opcionalmente una composición de enzima celulolítica y/o una proteasa;

están presentes y/o se añaden durante

- la etapa de sacarificación (b);

- la etapa de fermentación (c);

- sacarificación y fermentación simultáneas;

- opcionalmente etapa de presacarificación antes de la etapa (b).

En aún aspectos adicionales, la presente invención se refiere al procedimiento de producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende:

(i) sacarificar un material que contiene almidón a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial; y

(ii) fermentar utilizando un organismo de la fermentación;

en donde la sacarificación y/o fermentación se realiza en presencia de las siguientes enzimas: glucoamilasa, alfaamilasa, trehalasa de cualquiera de la invención y, opcionalmente, una composición de proteasa y/o enzima celulolítica.

Definiciones

Trehalasa: El término "trehalasa" significa una enzima que degrada la trehalosa en su unidad de monosacáridos (es decir, glucosa). Las trehalasas se clasifican en EC 3.2.1.28 (alfa,alfa-trehalasa) y EC. 3.2.1.93 (alfa,alfa-fosfotrehalasa). Las clases de EC se basan en las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB). La descripción de las clases de EC se puede encontrar en Internet, p. ej., en "http://www.expasv.org/enzvme/". Las trehalasas son enzimas que catalizan las siguientes reacciones:

EC 3.2.1.28:

Alfa,alfa-trehalosa H²O o 2 D-glucosa;

EC 3,2.1.93:

Alfa,alfa-trehalosa 6-fosfato H²O o D-glucosa D-glucosa 6-fosfato.

Para los fines de la presente invención, la actividad de trehalasa puede determinarse de acuerdo con el procedimiento "Ensayo de Trehalasa" descrito en la sección "Materiales y Métodos". En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 20 %, p. ej., al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95% o al menos 100 % de la actividad trehalasa del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 21. En una realización, las trehalasas de acuerdo con la invención, SEQ ID NO: 21 tienen una temperatura de desnaturalización Td (medida por el ensayo TSA) de al menos 63 °C, al menos 64 °C, al menos 65 °C, al menos 66 °C, al menos 67 °C, tal como al menos 68 °C.

Variante alélica: La expresión "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural a través de mutación y puede resultar en polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Dominio catalítico: La expresión “dominio catalítico” significa la región de una enzima que contiene la maquinaria catalítica de la enzima. El dominio catalítico son los aminoácidos 387 a 769 de SEQ ID NO: 21.

ADNc: El término "ADNc" significa una molécula de ADN que puede prepararse mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura, cortada y empalmada, obtenida de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de secuencias intrónicas que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. La transcripción de ARN primaria inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de etapas, incluyendo el corte y empalme, antes de aparecer como ARNm maduro cortado y empalmado.

Secuencia codificante La expresión "secuencia codificante" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de una variante. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente mediante un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de inicio tal como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de terminación tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.

Secuencias de control: La expresión "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada una de las secuencias de control puede ser nativa ( es decir, del mismo gen) o extraña (es decir, de un gen diferente) al polinucleótido que codifica la variante o nativa o extraña entre sí. Secuencias de control de este tipo incluyen, pero no se limitan a una secuencia conductora, de poliadenilación, secuencia propeptídica, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento con las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de una variante que incluye, pero no se limita a transcripción, modificación pos-transcripcional, traducción, modificación pos-traduccional y secreción.

Vector de expresión: La expresión "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica una variante y está operativamente enlazado a secuencias de control que proporcionan su expresión.

Fragmento: El término "fragmento" significa un polipéptido que tiene uno o más (p. ej., varios) aminoácidos ausentes del extremo amino y/o carboxilo terminal de un polipéptido maduro; en donde el fragmento tiene actividad de trehalasa. En un aspecto, un fragmento contiene los aminoácidos 387 a 769 de SEQ ID NO: 21.

Condiciones de alta rigurosidad: La expresión "condiciones de alta rigurosidad" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado y 50 % de formamida, siguiendo los procedimientos estándares de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando 2X SSC, SDS al 0,2% a 65°C.

Célula huésped: La expresión "célula huésped" significa cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción o similar con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula madre que no sea idéntica a la célula madre debido a mutaciones que se producen durante la replicación.

Propiedad mejorada: La expresión "propiedad mejorada" significa una característica asociada con una variante que está mejorada en comparación con el parental. Propiedades mejoradas de este tipo incluyen, pero no se limitan a termoestabilidad, en donde la temperatura de desnaturalización (Td) medida por el Ensayo de Desplazamiento Térmico (TSA) es al menos 60 °C, al menos 61 °C, al menos 62 °C, al menos 63 °C, al menos 64 °C, al menos 65 °C, al menos 66 °C, al menos 67 °C, tal como al menos 68 °C y estabilidad frente a la degradación de proteasas, en particular degradación por la mezcla de proteasas de Aspergillus niger.

Aislado: El término "aislado" significa una sustancia en una forma o entorno que no se produce en la naturaleza. Ejemplos no limitantes de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no se produce de forma natural, (2) cualquier sustancia que incluye, pero no se limita a cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se elimine al menos parcialmente de uno o más o todos los constituyentes que se producen de forma natural con los que está asociado en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre en relación con la sustancia que se encuentra en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada al aumentar la cantidad de la sustancia con relación a otros componentes con los que se asocia de forma natural (p. ej., copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado de forma natural con el gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.

Polipéptido maduro: La expresión "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación pos-traduccional, tal como procesamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro es los aminoácidos 19 a 1038 de SEQ ID NO: 21. Es conocido en la técnica que una célula huésped puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (esdecir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresado por el mismo polinucleótido.

Secuencia codificante de polipéptido maduro: La expresión "secuencia codificante de polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad de trehalasa. En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro son los nucleótidos 55 a 2037 y 2085 a 3161 de SEQ ID NO: 20. Los nucleótidos 1 a 54 de SEQ iD NO: 20 codifican un péptido señal.

Mutante: El término "mutante" significa un polinucleótido que codifica una variante.

Construcción de ácido nucleico: La expresión "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, ya sea de cadena sencilla o de doble cadena, que se aísla de un gen que se produce de forma natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otra manera no existiría en la naturaleza o que es sintética, que comprende una o más secuencias de control. En una realización, la una o más secuencias de control son heterólogas (de diferente origen/especie) a la secuencia codificante que codifica el polipéptido de la invención.

Enlazada operativamente: La expresión "enlazada operativamente" significa una configuración en la que una secuencia de control está colocada en una posición apropiada con respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.

Precursor o trehalasa precursora: El término "precursor" o la expresión "trehalasa precursora" significa cualquier polipéptido con actividad de trehalasa en el que se realiza una alteración para producir variantes enzimáticas de la presente invención.

Identidad de la secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de la secuencia".

Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle marcada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Residuos Idénticos x 100)/(Longitud de Alineamiento - Número Total de Huecos en Alineamiento)

Para los fines de la presente invención, la identidad de la secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). La salida de Needle marcada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleótidos Idénticos x 100)/(Longitud de Alineamiento - Número Total de Huecos

en Alineamiento)

Condiciones de rigurosidad: La expresión "condiciones de alta rigurosidad" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado y 50 % de formamida, siguiendo los procedimientos estándares de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando 2X SSC, SDS al 0,2% a 65°C.

La expresión "condiciones de rigurosidad muy alta" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado y 50% de formamida, siguiendo los procedimientos estándares de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando 2X SSC, SDS al 0,2% a 702C.

Subsecuencia: El término "subsecuencia" significa un polipéptido que tiene uno o más (p. e j, varios) nucleótidos ausentes del extremo 5’ y/o 3’ de una secuencia codificante de un polipéptido maduro; en donde la subsecuencia codifica un fragmento tiene actividad de trehalasa. En un aspecto, una subsecuencia contiene al menos los nucleótidos 1159 a 2037 y 2085 a 2354 de SEQ ID NO: 20.

Variante: El término "variante" significa un polipéptido que tiene actividad de trehalasa que comprende una alteración, esdecir, una sustitución, inserción y/o deleción, en una o más (p. ej., varias) posiciones. Una sustitución significa el reemplazo del aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una deleción significa la eliminación del aminoácido que ocupa una posición; y un medio de inserción que añade un aminoácido adyacente e inmediatamente después del aminoácido que ocupa una posición Las variantes de la presente invención tienen al menos un 20 %, p. ej., al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 100 % de la actividad trehalasa del polipéptido de SEQ ID NO: 21.

Trehalasa de tipo salvaje: La expresión trehalasa de «tipo salvaje" significa una trehalasa expresada por un microorganismo que se produce de forma natural, tal como una bacteria, una levadura o un hongo filamentoso que se encuentra en la naturaleza.

Descripción detallada de la invención

Polipéptidos que Tienen Actividad de Trehalasa

En una realización, la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 21 de al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100%, que tienen actividad trehalasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren hasta en 10 aminoácidos, p. ej., ^{1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, del polipéptido maduro de SEQ ID} nO: ^21.

En una realización, el polipéptido ha sido aislado. Un polipéptido de la presente invención comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; o es un fragmento del mismo que tiene actividad trehalasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 21. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en los aminoácidos 19 a 1038 de SEQ ID NO: 21.

Los cambios de aminoácidos pueden ser de naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o a la actividad de la proteína; pequeñas deleciones, típicamente de 1-30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino- o carboxilo-terminales, tales como un residuo metionina amino-terminal; un péptido enlazador pequeño de hasta 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro de los grupos de aminoácidos de carácter básico (arginina, lisina e histidina), aminoácidos de carácter ácido (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y pequeños aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, En, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

Aminoácidos esenciales en un polipéptido pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la última técnica, se introducen mutaciones individuales de alanina en cada residuo de la molécula, y las moléculas resultantes se testan en cuanto a la actividad trehalasa para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante análisis físico de la estructura, según se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de los aminoácidos del sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también puede deducirse de un alineamiento con un polipéptido relacionado.

Se pueden realizar y testar sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos únicos o múltiples utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o mezcla aleatoria, seguidos de un procedimiento de rastreo relevante, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. ^{Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; documentos} wO ^{95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden} utilizar incluyen PCR propensa a errores, visualización de fagos (p. ej., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832­ ^{10837; Patente de} eE.UU. ^{N° 5.223.409; documento WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et} al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Métodos de mutagénesis / mezcla aleatoria pueden combinarse con métodos de selección automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células huésped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de ADN mutagenizado que codifican polipéptidos activos pueden recuperarse de las células huésped y secuenciarse rápidamente utilizando métodos estándares en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido.

El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el que una región de un polipéptido se fusiona en el extremo N o en el extremo C de una región de otro polipéptido.

El polipéptido puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión escindible en el que se fusiona otro polipéptido en el extremo N o el extremo C del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce fusionando un polinucleótido que codifica otro polipéptido a un polinucleótido de la presente invención. Técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos para que estén en el marco y que la expresión del polipéptido de fusión esté bajo el control del o de los mismos promotores y terminador. Polipéptidos de fusión también se pueden construir utilizando tecnología inteína, en la que los polipéptidos de fusión se crean post-traduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

Un polipéptido de fusión puede comprender, además, un sitio de escisión entre los dos polipéptidos. Tras la secreción de la proteína de fusión, el sitio se escinde liberando los dos polipéptidos. Ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero no se limitan a los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Fuentes de Polipéptidos que Tienen Actividad de Trehalasa

Un polipéptido que tiene actividad de trehalasa de la presente invención se puede obtener a partir de microorganismos del género Talaromyces. Para los fines de la presente invención, la expresión "obtenido de" tal como se utiliza en esta memoria en relación con una fuente dada significará que el polipéptido codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la que se ha insertado el polinucleótido de la fuente. En un aspecto, el polipéptido obtenido de una fuente dada se secreta extracelularmente.

En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Talaromyces, p. ej., un polipéptido obtenido de Talaromyces funiculosus o de Talaromyces leycettanus tal como, por ejemplo, CBS 398.68.

Se entenderá que para las especies antes mencionadas, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, p. ej., anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el que se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados.

Cepas de estas especies son de fácil acceso para el público en un cierto número de colecciones de cultivos, tales como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

El polipéptido puede identificarse y obtenerse de otras fuentes, incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., suelo, compost, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (p. ej., suelo, compost, agua, etc.) utilizando las sondas arriba mencionadas. Técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. A continuación, se puede obtener un polinucleótido que codifica el polipéptido rastreando de manera similar una colección de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mixto. Una vez que se ha detectado un polinucleótido que codifica un polipéptido con la o las sondas, el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Sambrook et al., 1989, supra).

Dominios Catalíticos

Un aspecto adicional, que no forma parte de la invención, se refiere a dominios catalíticos que tienen una identidad de secuencia con los aminoácidos 387 a 769 de SEQ ID NO: 21 de al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %. En un aspecto, los dominios catalíticos comprenden secuencias de aminoácidos que difieren hasta en 10 aminoácidos, p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, de los aminoácidos 387 a 769 de SEQ ID NO: 21.

El dominio catalítico comprende o consiste preferiblemente en los aminoácidos 387 a 769 de SEQ ID NO: 21; o es un fragmento del mismo que tiene actividad de trehalasa.

El polinucleótido que codifica el dominio catalítico comprende o consiste preferiblemente en los nucleótidos 1159 a 2037 y 2085 a 2354 de SEQ ID NO: 20.

Polinucleótidos

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican un polipéptido de la presente invención tal como se describe en esta memoria.

Las técnicas utilizadas para aislar o clonar un polinucleótido son conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento a partir de ADN genómico o ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de polinucleótidos a partir de ADN genómico puede efectuarse, p. ej., utilizando la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o rastreo de anticuerpos de colecciones de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Véase, p. ej., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Se pueden utilizar otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transcripción activada por ligamiento (LAT) y la amplificación basada en polinucleótidos (NASBA). Los polinucleótidos pueden clonarse a partir de una cepa de Talaromyces, o un organismo relacionado y, por tanto, por ejemplo, pueden ser una variante alélica o de especie de la región codificante del polipéptido del polinucleótido.

La modificación de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para sintetizar polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. La expresión "sustancialmente similares" al polipéptido se refiere a formas que no se producen de forma natural del polipéptido.

Construcciones de Ácidos Nucleicos

La presente invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido de la presente invención enlazado operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control. En una realización particular, al menos una secuencia de control es heteróloga (de diferente origen/especie) al polinucleótido que codifica la variante de la presente invención.

El polinucleótido puede manipularse de diversas formas para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.

La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. El promotor contiene secuencias de control transcripcional que median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula huésped, incluyendo los promotores variantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped bacteriana son los promotores obtenidos del gen de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), el gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen de la levansacarasa de Bacillus subtilis (sacB), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operón lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y el gen de betalactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Otros promotores se describen en “Useful proteins from recombinant bacteria” en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra. En el documento WO 99/43835 se describen ejemplos de promotores en tándem.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son los promotores obtenidos de los genes para la acetamidasa de Aspergillus nidulans, la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, la alfa-amidasa estable frente a los ácidos de Aspergillus niger, la glucoamilasa de Aspergillus nigero Aspergillus awamori (glaA), la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, la proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum (documento WO 96/00787), la amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (documento WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (documento WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (documento WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, betaglucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, xilanasa III de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, y factor de elongación de la traducción de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen de alfaamilasa neutra de Aspergillus, en el que el conductor no traducido ha sido reemplazado por un conductor no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, en el que el conductor no traducido ha sido reemplazado por un conductor no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores variantes, truncados e híbridos de los mismos. Otros promotores se describen en la Patente de EE.UU. N26.011.147.

En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes para la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneina (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura se describen por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, que es reconocido por una célula huésped para terminar la transcripción. El terminador está enlazado operativamente al extremo 3’ del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped puede utilizarse en la presente invención.

Terminadores preferidos para células huésped bacterianas se obtienen de los genes para la proteasa alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis y ARN ribosomal (rrnB) de Escherichia coli.

Terminadores preferidos para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de acetamidasa de Aspergillus nidulans, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum, betaglucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, xilanasa III de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei y factor de elongación de la traducción de Trichoderma reesei.

Terminadores preferidos para células huésped de levadura se obtienen de los genes para la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, el citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura se describen por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm aguas abajo de un promotor y aguas arriba de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresión del gen.

Ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas se obtienen de un gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (documento WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465­ 3471).

La secuencia de control también puede ser un conductor, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por parte de la célula huésped. El conductor está enlazado operativamente al extremo 5’ del polinucleótido que codifica el polipéptido. Puede utilizarse cualquier conductor que sea funcional en la célula huésped.

Conductores preferidos para las células huésped fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

Conductores adecuados para células huésped de levadura se obtienen de los genes de enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia enlazada operativamente al extremo 3’ del polinucleótido y, cuando se transcribe, la célula huésped la reconoce como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Puede utilizarse cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped.

Secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped de hongos filamentosos se obtienen de los genes para la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae y la proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levaduras se describen por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una región codificante de un péptido señal que codifica un péptido señal enlazado al extremo N de un polipéptido y dirige el polipéptido hacia la vía secretora de la célula. El extremo 5’ de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener inherentemente una secuencia codificante del péptido señal enlazada de forma natural en el marco de lectura de la traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido. Alternativamente, el extremo 5’ de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante del péptido señal que es extraña a la secuencia codificante. Puede ser necesaria una secuencia codificante de péptido señal extraña, en los casos en los que la secuencia codificante no contiene de forma natural una secuencia codificante de péptido señal. Alternativamente, una secuencia codificante del péptido señal extraño puede simplemente reemplazar la secuencia codificante del péptido señal natural con el fin de potenciar la secreción del polipéptido. Sin embargo, puede utilizarse cualquier secuencia codificante del péptido señal que dirija el polipéptido expresado a la vía secretora de una célula huésped.

Secuencias codificantes del péptido señal efectivas para células huésped bacterianas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus ( nprT, nprS, nprM) y Bacillus subtilis prsA. Otros péptidos señal se describen por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Secuencias codificantes del péptido señal efectivas para células huésped de hongos filamentosos son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

Péptidos señal útiles para las células huésped de levadura se obtienen a partir de los genes para el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y para invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias codificantes del péptido señal útiles se describen por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante del propéptido que codifica un propéptido posicionado en el extremo N de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede convertirse en un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La secuencia codificante del propéptido puede obtenerse de los genes para la proteasa alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, la proteasa neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacasa de Myceliophthora thermophila (documento WO 95/33836), proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.

En los casos en los que están presentes secuencias tanto del péptido señal como del propéptido, la secuencia del propéptido se sitúa junto al extremo N de un polipéptido y la secuencia del péptido señal se sitúa junto al extremo N de la secuencia del propéptido.

También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulen la expresión del polipéptido con relación al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que provocan que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Las secuencias reguladoras en los sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En levaduras se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, se puede utilizar el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de alfa-amilasa TAKA de Aspergillus oryzae y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae, el promotor de celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei y el promotor de celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación de genes. En los sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido estaría enlazado operativamente a la secuencia reguladora.

Vectores de Expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de parada de la transcripción y la traducción. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica el polipéptido en dichos sitios. Alternativamente, el polinucleótido puede expresarse insertando el polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante esté enlazada operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se ha de introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, esdecir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas en los que se ha integrado. Además, se puede utilizar un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

El vector contiene preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o virus, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.

Marcadores adecuados para las células huésped de levadura incluyen, pero no se limitan a ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Marcadores seleccionables para uso en una célula huésped de un hongo filamentoso incluyen, pero no se limitan a adeA (fosforribosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintasa), adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintasa), amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de las mismas. Se prefieren para uso en una célula de Aspergillus los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y un gen bar de Streptomyces hygroscopicus. Genes preferidos para uso en una célula de Trichoderma son adeA, adeB, amdS, hph y pyrG.

El marcador seleccionable puede ser un sistema de marcador seleccionable dual tal como se describe en el documento WO 2010/039889. En un aspecto, el marcador seleccionable dual es un sistema de marcador seleccionable dual hphtk.

El vector contiene preferiblemente un o unos elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una ubicación o ubicaciones precisas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integradores deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases y 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia diana correspondiente para potenciar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped mediante recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender, además, un origen de replicación que permite que el vector se replique de forma autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de la replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que medie en la replicación autónoma que funcione en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador de plásmido" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

Ejemplos de orígenes de replicación para uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6.

Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; documento WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se pueden lograr de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 00/24883.

Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula huésped para aumentar la producción de un polipéptido. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido en los casos en los que células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, con ello, copias adicionales del polinucleótido se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos utilizados para ligar los elementos arriba descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Sambrook et al., 1989, supra).

Células Huésped

La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención enlazado operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción de un polipéptido de la presente invención. En una realización particular, la célula huésped recombinante comprende el polinucleótido que codifica un polipéptido de trehalasa de la presente invención, en el que dicho polinucleótido es heterólogo (de diferente origen/especie) a la célula huésped. Una construcción o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula huésped, de modo que la construcción o el vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extra-cromosómico autorreplicante tal como se describió anteriormente. La expresión "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula madre que no sea idéntica a la célula madre debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención.

La célula huésped también puede ser un eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta u hongo.

La célula huésped puede ser una célula fúngica. "Hongos", tal como se utiliza en esta memoria incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como el filo Oomycota y todos los hongos mitospóricos (tal como se define por Hawksworth et al., En, Dictionary of The Fungi de Ainsworth y Bisby, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).

La célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. "Levadura", tal como se utiliza en esta memoria, incluye levadura ascosporógena (Endomycetales), levadura basidiosporógena y levadura perteneciente a Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Dado que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura se definirá como se describe en Biology andActivities of Yeast (Skinner, Passmore y Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series N° 9, 1980).

La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia , tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia lipolytica

La célula huésped fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (de acuerdo con lo definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se produce por elongación de las hifas y el catabolismo de carbono es obligatoriamente aerobio. Por el contrario, el crecimiento vegetativo de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se produce mediante la gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

La célula huésped de hongo filamentoso puede ser una célula de.

Por ejemplo, la célula huésped de hongo filamentoso puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

Las células fúngicas se pueden transformar mediante un procedimiento que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergillus y Trichoderma se describen en el documento EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y documento WO 96/00787. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, En Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Producción

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) cultivar una célula huésped recombinante de la presente invención en condiciones que conduzcan a la producción del polipéptido; y opcionalmente, (b) recuperar el polipéptido.

Las células huésped se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden cultivar mediante cultivo en matraz de agitación, o fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes, por lotes alimentados o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales en un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar el polipéptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con las composiciones publicadas (p. ej., en los catálogos de American Type Culture Collection). Si el polipéptido se secreta en el medio nutriente, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se secreta, se puede recuperar a partir de lisados celulares.

El polipéptido puede detectarse utilizando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección incluyen, pero no se limitan al uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido.

El polipéptido puede recuperarse utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede recuperarse del medio nutriente mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a recogida, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación. En un aspecto, se recupera un caldo de fermentación que comprende el polipéptido.

El polipéptido se puede purificar mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a cromatografía (p. ej., intercambio iónico, por afinidad, hidrófobo, cromato-enfoque y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción (véase, p. ej., Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.

En un aspecto alternativo, el polipéptido no se recupera, sino que se utiliza una célula huésped de la presente invención que expresa el polipéptido como fuente del polipéptido.

Formulaciones de Caldo de Fermentación o Composiciones Celulares

La presente invención también se refiere a una formulación de caldo de fermentación o a una composición celular que comprende un polipéptido de la presente invención. En una realización particular, la formulación de caldo completo se genera mediante la fermentación de una célula huésped recombinante de la invención. El producto de caldo de fermentación comprende además ingredientes adicionales utilizados en el procedimiento de fermentación, tales como, por ejemplo, células (incluyendo las células hospedantes que contienen el gen que codifica el polipéptido de la presente invención que se utilizan para producir el polipéptido de interés), restos celulares, biomasa, medios de fermentación, y/o productos de fermentación. En algunas realizaciones, la composición es un caldo completo de células muertas que contiene ácido o ácidos orgánicos, células muertas y/o restos celulares, y medio de cultivo.

La expresión "caldo de fermentación", como se usa aquí, se refiere a una preparación producida por fermentación celular que experimenta una recuperación y/o purificación nula o mínima. Por ejemplo, los caldos de fermentación se producen cuando los cultivos microbianos se cultivan hasta la saturación, se incuban en condiciones de limitación de carbono para permitir la síntesis de proteínas (p. ej., expresión de enzimas por parte de las células huésped) y la secreción en el medio de cultivo celular. El caldo de fermentación puede contener contenidos fraccionados o no fraccionados de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Típicamente, el caldo de fermentación no está fraccionado y comprende el medio de cultivo gastado y los restos celulares presentes después de eliminar las células microbianas (p. ej., células fúngicas filamentosas), p. ej., mediante centrifugación. En algunas realizaciones, el caldo de fermentación contiene medio de cultivo celular agotado, enzimas extracelulares, y células microbianas viables y/o no viables.

En una realización, la formulación de caldo de fermentación y las composiciones celulares comprenden un primer componente de ácido orgánico que comprende al menos un ácido orgánico de 1-5 carbonos y/o una sal del mismo, y un segundo componente de ácido orgánico que comprende al menos un ácido orgánico de 6 o más carbonos y/o una sal del mismo. En una realización específica, el primer componente de ácido orgánico es ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, una sal del mismo, o una mezcla de dos o más de los anteriores, y el segundo componente de ácido orgánico es ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, una sal del mismo, o una mezcla de dos o más de los anteriores.

En un aspecto, la composición contiene un ácido o ácidos orgánicos, y opcionalmente contiene además células muertas y/o restos celulares. En una realización, las células muertas y/o los restos celulares se eliminan de un caldo completo de células muertas para proporcionar una composición que esté libre de estos componentes.

Las formulaciones de caldo de fermentación o las composiciones celulares pueden comprender, además, un agente conservante y/o antimicrobiano (p. ej., bacteriostático), incluyendo, pero no limitados a sorbitol, cloruro sódico, sorbato potásico y otros conocidos en la técnica.

El caldo completo o la composición con células muertas puede contener los contenidos no fraccionados de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Típicamente, el caldo completo o la composición con células muertas contiene el medio de cultivo gastado y restos celulares presentes después de que las células microbianas (p. ej., células de hongos filamentosos) crezcan hasta la saturación, se incuban en condiciones de limitación de carbono para permitir la síntesis de proteínas. En algunas realizaciones, el caldo completo o composición de células muertas contiene el medio de cultivo celular gastado, enzimas extracelulares, y células fúngicas filamentosas muertas. En algunas realizaciones, las células microbianas presentes en el caldo completo o composición con células muertas pueden permeabilizarse y/o lisarse usando métodos conocidos en la técnica.

Un caldo completo o una composición celular como se describe aquí es típicamente un líquido, pero puede contener componentes insolubles, tales como células muertas, restos celulares, componentes de medios de cultivo, y/o enzima o enzimas insolubles. En algunas realizaciones, los componentes insolubles pueden eliminarse para proporcionar una composición líquida clarificada.

Las formulaciones de caldo completo y las composiciones celulares de la presente invención se pueden producir mediante un método descrito en el documento WO 90/15861 o WO 2010/096673.

Composiciones Enzimáticas

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido que tiene actividad de trehalasa de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones están enriquecidas en un polipéptido de este tipo.

El término "enriquecido" indica que la actividad de trehalasa de la composición se ha incrementado, p. ej., con un factor de enriquecimiento de al menos 1,1.

Las composiciones pueden comprender un polipéptido de la presente invención como componente enzimático principal, p. ej., una composición de un solo componente. Alternativamente, las composiciones pueden comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una o más (p. ej., varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en hidrolasa, isomerasa, ligasa, liasa, oxidorreductasa o transferasa, p. ej., una alfa-galactosidasa, alfa-glucosidasa, aminopeptidasa, amilasa, beta-galactosidasa, beta-glucosidasa, beta-xilosidasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, glucoamilasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.

En una realización, la composición comprende una trehalasa de la invención y una glucoamilasa. En una realización, la composición comprende una trehalasa de la invención y una glucoamilasa derivada de Talaromyces emersonii (p. ej., SEQ ID NO: 4). En una realización, la composición comprende una trehalasa de la invención y una glucoamilasa derivada de Gloeophyllum, tal como G. serpiarium (p. ej., SEQ ID NO: 5) o G. trabeum (p. ej., SEQ ID NO: 6). En una realización, la composición comprende una trehalasa de la invención, una glucoamilasa y una alfa-amilasa. En una realización, la composición comprende una trehalasa de la invención, una glucoamilasa y una alfa-amilasa derivada de Rhizomucor, preferiblemente una cepa de Rhizomucorpusillus, tal como un híbrido de alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus que tiene un enlazador (p. ej., de Aspergillus niger) y dominio de enlace de almidón (p. ej., de Aspergillus niger). En una realización, la composición comprende una trehalasa de la invención, una glucoamilasa, una alfaamilasa y una composición de enzima celulolítica. En una realización, la composición comprende una trehalasa de la invención, una glucoamilasa, una alfa-amilasa y una composición de enzima celulolítica, en donde la composición celulolítica se deriva de Trichoderma reesei. En una realización, la composición comprende una trehalasa de la invención, una glucoamilasa, una alfa-amilasa y una proteasa. En una realización, la composición comprende una trehalasa de la invención, una glucoamilasa, una alfa-amilasa y una proteasa. La proteasa se puede derivar de Thermoascus aurantiacus. En una realización, la composición comprende una trehalasa de la invención, una glucoamilasa, una alfa-amilasa, una composición de enzima celulolítica y una proteasa. En una realización, la composición comprende una trehalasa de la invención, una glucoamilasa, p. ej., derivada de Talaromyces emersonii, Gloeophyllum serpiarium o Gloephyllum trabeum, una alfa-amilasa, p. ej., derivada de Rhizomucor pusillus, en particular una que tiene un enlazador y un dominio de enlace de de almidón, en particular derivado de Aspergillus niger, en particular uno que tiene las siguientes sustituciones: G128D+D143N (utilizando SEQ ID NO: 7 para la numeración); una composición de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei, y una proteasa, p. ej., derivada de Thermoascus aurantiacus o Meripilus giganteus.

Ejemplos de enzimas secundarias específicamente contempladas, p. ej., una glucoamilasa de Talaromyces emersonii mostrada en SEQ ID NO: 4 en esta memoria o una glucoamilasa que tiene, p. ej., al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad con SEQ ID NO: 4 de esta memoria se puede encontrar en la sección "Enzimas" que figura más adelante. Las composiciones se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o seca. Las composiciones se pueden estabilizar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

A continuación se dan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de la presente invención. La dosificación de la composición y otras condiciones bajo las cuales se utiliza la composición pueden determinarse sobre la base de métodos conocidos en la técnica.

Usos

Procedimientos De La Invención

Producción de un producto de fermentación a partir de Material de Almidón Gelatinizado Utilizando una Trehalasa de la Invención

En este aspecto, la presente invención se refiere a la producción de un producto de fermentación, en particular etanol, a partir de material que contiene almidón gelatinizado y/o no gelatinizado o material celulósico. Los azúcares fermentables generados durante la sacarificación/hidrólisis se convierten en la fermentación deseada en cuestión, en particular etanol, durante la fermentación por un organismo de fermentación, en particular levadura.

En una realización, la invención se refiere a procedimientos para producir un producto de fermentación, en particular etanol, que comprenden

(a) licuar un material que contiene almidón con una alfa-amilasa;

opcionalmente pre-sacarificar el material licuado antes de la etapa (b);

(b) sacarificar el material licuado;

(c) fermentar utilizando un organismo de fermentación;

en donde

i) una glucoamilasa;

ii) una trehalasa de la invención;

iii) opcionalmente una composición de enzima celulolítica y/o una proteasa;

están presentes y/o se añaden durante

□ la etapa de sacarificación (b);

□ la etapa de fermentación (c);

□ sacarificación y fermentación simultáneas;

□ opcionalmente etapa de presacarificación antes de la etapa (b).

Etapa de licuefacción (a)

De acuerdo con procedimientos de la invención, la licuefacción en la etapa (a) se lleva a cabo sometiendo el material que contiene almidón a una temperatura por encima de la temperatura de gelatinización inicial, en particular a una temperatura entre 80-90 °C, a una alfa-amilasa y opcionalmente una proteasa y otras enzimas, tales como una glucoamilasa, una pululanasa y/o una fitasa.

La expresión "temperatura de gelatinización inicial" significa la temperatura más baja a la que comienza la gelatinización del material que contiene almidón. En general, el almidón calentado en agua comienza a gelatinizar entre aproximadamente 50 °C y 75 °C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y puede ser determinada fácilmente por el experto en la materia. Por lo tanto, la temperatura de gelatinización inicial puede variar de acuerdo con la especie vegetal, la variedad particular de la especie vegetal, así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención, la temperatura de gelatinización inicial de un material que contiene almidón dado se puede determinar como la temperatura a la que se pierde la birrefringencia en el 5 % de los gránulos de almidón utilizando el método descrito por Gorinstein y Lii, 1992, Starch/Starke 44(12): 461 -466.

De acuerdo con la invención, la licuefacción en la etapa (a) se lleva a cabo típicamente a una temperatura en el intervalo de 70-100 °C. En una realización, la temperatura de licuefacción está entre 75-95 °C, tal como entre 75-90 °C, preferiblemente entre 80-90 °C, tal como entre 82-88 °C, tal como alrededor de 85 °C. El pH en la licuefacción puede estar en el intervalo de 3 a 7, preferiblemente de 4 a 6, o más preferiblemente de 4,5 a 5,5.

De acuerdo con la invención, se puede llevar a cabo una etapa de cocción a chorro antes de la licuefacción en la etapa (a). La cocción a chorro puede llevarse a cabo a una temperatura entre 110-145 °C, preferiblemente 120-140 °C, tal como 125-135 °C, preferiblemente alrededor de 130 °C durante aproximadamente 1-15 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 3-10 minutos, especialmente alrededor de aproximadamente 5 minutos.

En una realización, el procedimiento de la invención comprende, además, antes de la etapa de licuefacción (a), las etapas de:

x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente mediante molienda en seco;

z) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua.

De acuerdo con la invención, el contenido en sólidos secos (DS) en la licuefacción se encuentra en el intervalo de 20­ 55 % en peso, preferiblemente 25-45 % en peso, más preferiblemente 30-40 % en peso o 30-45 % en peso.

El material de partida que contiene almidón, tal como granos enteros, puede reducirse en el tamaño de partícula, p. ej., mediante molienda, con el fin de abrir la estructura, aumentar el área superficial y permitir un procesamiento adicional. Generalmente hay dos tipos de procedimientos: molienda en húmedo y en seco. En la molienda en seco, se muelen y utilizan granos enteros. La molienda en húmedo da una buena separación de germen y harina (gránulos de almidón y proteína). La molienda en húmedo se aplica a menudo en lugares en donde el hidrolizado de almidón se utiliza en la producción de, p. ej., jarabes. Tanto la molienda en seco como la molienda en húmedo son bien conocidas en la técnica del procesamiento del almidón. De acuerdo con la presente invención, se prefiere la molienda en seco.

En una realización, el tamaño de partícula se reduce entre 0,05 y 3,0 mm, preferiblemente entre 0,1 y 0,5 mm, o de modo que al menos el 30 %, preferentemente al menos el 50 %, más preferiblemente al menos el 70 %, incluso más preferiblemente al menos el 90 % de el material que contiene almidón pasa a través de un tamiz con una malla de 0,05 a 3,0 mm, preferiblemente una malla de 0,1 -0,5 mm. En otra realización, al menos el 50 %, preferiblemente al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el 80 %, especialmente al menos el 90 % del material que contiene almidón pasa a través de un tamiz con malla n° 6.

La licuefacción en la etapa (a) se puede llevar a cabo durante 0,5-5 horas, tal como 1-3 horas, tal como, típicamente, alrededor de 2 horas.

La alfa-amilasa y otras enzimas opcionales, tales como proteasa, pueden añadirse inicialmente a la suspensión acuosa para iniciar la licuefacción (dilución). En una realización, solo se añade una parte de las enzimas (p. ej., aproximadamente 1/3) a la suspensión acuosa, mientras que el resto de las enzimas (p. ej., aproximadamente 2/3) se agregan en la etapa de licuefacción (a).

Se puede encontrar una lista no exhaustiva de ejemplos de alfa-amilasas más adelante en la sección "Alfa-Amilasa Presente y/o Añadida en la Licuefacción". En una realización preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa bacteriana. Las alfa-amilasas bacterianas son típicamente termoestables. En una realización preferida, la alfa-amilasa se deriva del género Bacillus, tal como una cepa de Bacillus stearothermophilus, en particular una variante de una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, tal como la mostrada en SEQ iD NO: 3 en el documento WO 99/019467 o SEQ ID NO: 8 en esta memoria.

En una realización, la alfa-amilasa utilizada en la etapa de licuefacción (a) es una variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en SEQ ID NO: 8 en esta memoria, en particular con las deleciones dobles en I181 *+G 182*, y opcionalmente con una sustitución de N193F, y truncada para tener una longitud de alrededor de 491 aminoácidos, p. ej., de 480-495 aminoácidos de longitud.

Ejemplos de variantes adecuadas de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus se pueden encontrar más adelante en la sección "Alfa-Amilasa Termoestable" e incluyen uno del siguiente grupo de variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con deleciones dobles I181 *+G 182*, y opcionalmente sustitución N193F, y adicionalmente las siguientes sustituciones:

- E129V+K177L+R179E;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+ Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V;

- V59A+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; y

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (utilizando SEQ ID NO: 8 para la numeración).

De acuerdo con los procedimientos de la invención, la licuefacción en la etapa (a) se puede llevar a cabo utilizando una combinación de alfa-amilasa (p. ej., alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en SEQ ID NO: 8) y proteasa (p. ej., Pyrococcus furiosus (pfu proteasa) mostrada en SEQ ID NO: 9). También puede estar presente una glucoamilasa, tal como la derivada de Penicillium oxalicum mostrada en SEQ ID NO: 10 en esta memoria (véase la sección "Glucoamilasa Presente y/o Añadida en la Etapa de Licuefacción (a)" que figura más adelante.

Sacarificación y Fermentación

Una trehalasa de la invención, una glucoamilasa y, opcionalmente, una proteasa y/o una composición de enzima celulolítica pueden estar presentes y/o añadirse en la etapa de sacarificación (b); etapa de fermentación (c); sacarificación y fermentación simultáneas (SSF); opcionalmente una etapa de presacarificación antes de la etapa (b).

En una realización preferida, la glucoamilasa se añade junto con una alfa-amilasa fúngica, en particular alfa-amilasa fúngica ácida. Se pueden encontrar ejemplos de glucoamilasas en la sección "Glucoamilasas Presentes y/o Añadidas en la Sacarificación y/o Fermentación" que figura más adelante.

Cuando se realiza la sacarificación y la fermentación secuenciales, la etapa de sacarificación (b) puede llevarse a cabo en condiciones bien conocidas en la técnica, es decir, adecuadas para la sacarificación enzimática. Por ejemplo, la etapa de sacarificación (b) puede durar hasta aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas.

En una realización, la presacarificación se realiza antes de la sacarificación en la etapa (b). La pre-sacarificación se realiza típicamente durante 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65 °C, típicamente aproximadamente 60 °C. En una realización la pre-sacarificación es seguida de sacarificación durante la fermentación en sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). La sacarificación se lleva a cabo típicamente a una temperatura de 20-75 °C, preferiblemente de 40-70 °C, típicamente alrededor de 60 °C, y a un pH entre 4 y 5, normalmente a aproximadamente pH 4,5.

La sacarificación y fermentación simultáneas ("SSF") se utiliza ampliamente en procedimientos de producción de productos de fermentación a escala industrial, especialmente en los procedimientos de producción de etanol. Al hacer SSF, la etapa de sacarificación (b) y la etapa de fermentación (c) se llevan a cabo simultáneamente. No existe una etapa de mantenimiento para la sacarificación, lo que significa que se pueden añadir juntos un organismo de fermentación, en particular levadura, y enzimas. Sin embargo, también se contempla añadir el organismo de fermentación y las enzimas por separado. La SSF de acuerdo con la invención se lleva a cabo típicamente a una temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferiblemente alrededor de aproximadamente 32 °C. En una realización, la fermentación continúa durante 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas. En una realización, el pH está entre 4-5.

En una realización de la invención, una composición celulolítica está presente y/o se añade en la etapa de sacarificación (b), etapa de fermentación (c) o sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) o pre-sacarificación antes de la etapa (b). Se pueden encontrar ejemplos de composiciones celulolíticas de este tipo en la sección "Composición de Enzima Celulolítica presente y/o añadida durante la Sacarificación y/o Fermentación" que figura más adelante. La composición de enzima celulolítica opcional puede estar presente y/o añadirse junto con la glucoamilasa y la trehalasa de la invención. Se pueden encontrar ejemplos de proteasas en la sección "Proteasas Presentes y/o Añadidas en la Sacarificación y/o Fermentación" que figura más adelante.

En una realización preferida, la trehalasa está presente y/o se añade en una cantidad entre 0,01-20 ug de trehalasa EP/g de DS, tal como entre 0,05-15 ug de trehalasa EP/g de DS, tal como entre 0,5 y 10 ug de trehalasa EP/g de DS.

Materiales que Contienen Almidón

De acuerdo con la invención, se puede utilizar cualquier material de partida que contenga almidón adecuado. El material de partida se selecciona generalmente en base al producto de fermentación deseado, en particular etanol. Ejemplos de materiales de partida que contienen almidón, adecuados para uso en procedimientos de la presente invención, incluyen cereales, tubérculos o granos. Específicamente, el material que contiene almidón puede ser maíz, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, avena, arroz, guisantes, judías o batatas, o mezclas de los mismos. También se contemplan tipos cerosos y no cerosos de maíz y cebada.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es maíz.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es trigo.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es cebada.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es centeno.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es milo.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es sagú.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es mandioca.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es tapioca.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es sorgo.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es arroz.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es guisantes.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es judías.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es batatas.

En una realización preferida, el material de partida que contiene almidón es avena.

Producción de un Producto de Fermentación a partir de Material de Almidón No Gelatinizado Utilizando una Trehalasa de la Invención

Una trehalasa de la invención puede utilizarse adecuadamente en un proceso de hidrólisis de almidón bruto (RSH) para producir productos de fermentación deseados, en particular etanol. En los procesos RSH el almidón no gelatiniza ya que el proceso se lleva a cabo a temperaturas inferiores a la temperatura de gelatinización inicial del almidón en cuestión (definida anteriormente).

El producto de fermentación deseado puede ser en una realización etanol producido a partir de granos no gelatinizados (es decir, sin cocer), preferiblemente molidos, tales como maíz, o granos pequeños, tales como trigo, avena, cebada, centeno, arroz, o cereales tal como sorgo. Ejemplos de materiales de partida que contienen almidón adecuados se enumeran en la sección "Materiales que Contienen Almidón" - sección anterior.

Por consiguiente, en este aspecto, la invención se refiere a procedimientos de producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprenden:

(a) sacarificar un material que contiene almidón a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial; y

(b) fermentar utilizando un organismo de fermentación; y

(c) opcionalmente recuperar el producto de fermentación;

en donde la sacarificación y/o fermentación se realiza en presencia de las siguientes enzimas: glucoamilasa, alfaamilasa, trehalasa de la invención y, opcionalmente, una composición de enzima celulolítica y/o una proteasa. Antes de la etapa (a) se puede preparar una suspensión acuosa de material que contiene almidón, tal como almidón granular, que tiene 10-55 % en peso de sólidos secos (DS), preferiblemente 25-45 % en peso de sólidos secos, más preferiblemente 30-40 % de material que contiene almidón. La suspensión puede incluir agua y/o aguas de procedimiento, tales como vinaza ("backset"), agua de depuración, condensado o destilado del evaporador, agua de extracción lateral de destilación o agua de procedimiento de otras plantas de productos de la fermentación. Debido a que un proceso de hidrólisis de almidón bruto de la invención se lleva a cabo por debajo de la temperatura de gelatinización inicial y, por lo tanto, no tiene lugar un aumento significativo de la viscosidad, si se desea, se pueden usar altos niveles de vinaza. En una realización, la suspensión acuosa contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 70 % en volumen, preferiblemente 15-60 % en volumen, especialmente de aproximadamente 30 a 50 % en volumen de agua y/o aguas del proceso, tales como aguas residuales (retroceso), agua de depuración, condensado o destilado de evaporador, agua de extracción lateral de destilación o agua de proceso de otras plantas de productos de fermentación, o combinaciones de los mismos, o similares.

En una realización, se añade "backset", u otra corriente reciclada, a la suspensión antes del etapa (a), o a la sacarificación (etapa (a)), o a los etapas de sacarificación y fermentación simultáneos (etapa (a) y etapa (b) combinados).

Un proceso de RSH de la invención se lleva a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, lo que significa que la temperatura a la que se lleva a cabo una etapa separada (a) típicamente se encuentra en el intervalo entre 25-75 °C, tal como entre 30-70 °C, o entre 45-60 °C.

En una realización preferida, la temperatura durante la fermentación en el etapa (b) o sacarificación y fermentación simultáneas en los etapas (a) y (b) está entre 25 °C y 40 °C, preferiblemente entre 28 °C y 36 °C, tal como entre 28 °C y 35 °C, tal como entre 28 °C y 34 °C, tal como alrededor de 32 °C.

En una realización de la invención, la fermentación se lleva a cabo durante 30 a 150 horas, preferiblemente de 48 a 96 horas. 66.

En una realización, la fermentación se lleva a cabo de modo que el nivel de azúcar, tal como el nivel de glucosa, se mantenga en un nivel bajo, tal como por debajo del 6 % en peso, tal como por debajo de aproximadamente 3 % en peso, tal como por debajo de aproximadamente 2 % en peso, tal como por debajo de aproximadamente 1 % en peso, tal como por debajo de aproximadamente 0,5 %, o por debajo del 0,25 % en peso, como por debajo de aproximadamente 0,1 % en peso. Niveles bajos de azúcar de este tipo se pueden lograr simplemente empleando cantidades ajustadas de enzimas y organismos fermentadores. Una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente qué dosis/cantidades de enzima y organismo fermentador a utilizar. Las cantidades empleadas de enzima y organismo fermentador también pueden seleccionarse para mantener bajas concentraciones de maltosa en el caldo de fermentación. Por ejemplo, el nivel de maltosa se puede mantener por debajo de aproximadamente 0,5 % en peso, tal como por debajo de aproximadamente 0,2 % en peso.

El procedimiento de la invención se puede llevar a cabo a un pH de 3 a 7, preferiblemente de 3 a 6, o más preferiblemente de 3,5 a 5,0.

La expresión "almidón granular" significa almidón bruto sin cocer, es decir, almidón en su forma natural que se encuentra, p. ej., en cereales, tubérculos o granos El almidón se forma dentro de las células vegetales como pequeños gránulos insolubles en agua. Cuando se colocan en agua fría, los gránulos de almidón pueden absorber una pequeña cantidad de líquido y expandirse. A temperaturas de alrededor de 50 °C a 75 °C, la expansión puede ser reversible. Sin embargo, a temperaturas más altas comienza una expansión irreversible denominada "gelatinización". El almidón granular puede ser un almidón altamente refinado, preferiblemente al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 % o al menos 99,5 % puro, o puede ser un almidón más bruto que contiene materiales que comprenden granos enteros (p. ej., molidos) incluyendo fracciones no amiláceas tales como residuos de gérmenes y fibras.

El material bruto, tal como granos enteros, puede reducirse en el tamaño de partícula, p. ej., mediante molienda, con el fin de abrir la estructura superficial y permitir un procesamiento adicional. En los documentos US4514496 y WO2004/081193 se describen ejemplos de tamaños de partículas adecuados. Se prefieren dos procedimientos de acuerdo con la invención: molienda en húmedo y en seco. En la molienda en seco, se muelen y utilizan granos enteros. La molienda en húmedo proporciona una buena separación de germen y harina (gránulos de almidón y proteína) y se aplica a menudo en lugares donde el hidrolizado de almidón se utiliza en la producción de, p. ej., jarabes. Tanto la molienda en seco como la molienda en húmedo son bien conocidas en la técnica del procesamiento del almidón.

En una realización, el tamaño de partícula se reduce entre 0,05 y 3,0 mm, preferiblemente entre 0,1-0,5 mm, o de modo que al menos el 30 %, preferiblemente al menos el 50 %, más preferiblemente al menos el 70 %, incluso más preferiblemente al menos el 90 % del material que contiene almidón pasa a través de un tamiz con una malla de 0,05 a 3,0 mm, preferiblemente una malla de 0,1-0,5 mm. En una realización preferida, el material que contiene almidón se prepara reduciendo el tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente mediante molienda, de manera que al menos el 50 % del material que contiene almidón tenga un tamaño de partícula de 0,1-0,5 mm.

En una realización preferida, la trehalasa está presente y/o se añade en una cantidad entre 0,01-20 ug de trehalasa EP/g de DS, tal como entre 0,05-15 ug de trehalasa EP/g de DS, tal como entre 0,5 y 10 ug de trehalasa EP/g de DS.

De acuerdo con la invención, las enzimas se añaden de modo que la glucoamilasa esté presente en una cantidad de 0,001 a 10 UAG/g de DS, preferiblemente de 0,01 a 5 UAG/g de DS, especialmente de 0,1 a 0,5 UAG/g de DS.

De acuerdo con la invención, las enzimas se añaden de modo que la alfa-amilasa esté presente o se añada en una cantidad de 0,001 a 10 UAFA/g de DS, preferiblemente de 0,01 a 5 UAFA/g de DS, especialmente de 0,3 a 2 UAFA/g de DS o 0,001 a 1 UAFA/g de DS, preferiblemente 0,01 a 1 UAFA/g de DS.

De acuerdo con la invención, las enzimas se añaden de modo que la composición de enzima celulolítica esté presente o se añada en una cantidad de 1 -10.000 microgramos de EP/g de DS, tal como 2-5.000, tal como 3 y 1.000, tal como 4 y 500 microgramos de EP/g de DS.

De acuerdo con la invención, las enzimas se añaden de modo que la composición de enzima celulolítica esté presente o se añada en una cantidad en el intervalo de 0,1-100 UFP por gramo de sólidos totales (TS), preferiblemente 0,5-50 UFP por gramo de TS, especialmente 1 -20 UFP por gramo de TS.

En una realización de la invención, las enzimas se añaden de modo que la proteasa esté presente en una cantidad de 0,0001 -1 mg de proteína enzimática por g de DS, preferiblemente de 0,001 a 0,1 mg de proteína enzimática por g de DS. Alternativamente, la proteasa está presente y/o se añade en una cantidad de 0,0001 a 1 ULAP/g de DS, preferiblemente 0,001 a 0,1 ULAP/g de d S y/o 0,0001 a 1 mAU-RH/g de DS, preferiblemente 0,001 a 0,1 mAU-RH/g de DS.

En una realización de la invención, las enzimas se añaden de modo que la proteasa esté presente o se añada en una cantidad en el intervalo de 1-1.000 pg de EP/g de DS, tal como 2-500 pg de EP/g de DS, tal como 3-250 pg de PE/g de DS.

En una realización preferida, la relación entre glucoamilasa y alfa-amilasa está entre 99:1 y 1:2, tal como entre 98:2 y 1:1, tal como entre 97:3 y 2:1, tal como entre 96:4 y 3:1, tal como 97:3, 96:4, 95:5, 94:6, 93:7, 90:10, 85:15, 83:17 o 65:35 (mg de EP glucoamilasa: mg de EP alfa- amilasa).

En una realización preferida, la dosis total de glucoamilasa y alfa-amilasa es, de acuerdo con la invención, de 10-1.000 pg/g de DS, por ejemplo de 50 a 500 pg/g de DS, tal como 75-250 pg/g de DS.

En una realización preferida, la dosis total de composición de enzima celulolítica añadida es de 10-500 pg/g de DS, tal como de 20-400 pg/g de DS, tal como de 20-300 pg/g de DS.

En una realización, la glucoamilasa, tal como la derivada de Trametes cingulata, utilizada en la fermentación o SSF, presenta al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o incluso un 100 % de identidad con la parte madura de SEQ ID NO: 11.

En una realización, la glucoamilasa, tal como la derivada de Pycnoporus sanguineus, utilizada en la fermentación o SSF, presenta al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o incluso un 100 % de identidad con la parte madura de s Eq ID NO: 12.

En una realización, la alfa-amilasa utilizada en la fermentación o SSF, presenta al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o incluso un 100 % de identidad con la parte madura de SEQ ID NO: 7.

En una realización preferida, la invención se refiere a procedimientos de producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprenden:

(a) sacarificar un material que contiene almidón a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial; y

(b) fermentar utilizando un organismo de fermentación;

en donde la sacarificación y/o fermentación se realiza en presencia de las siguientes enzimas:

i) glucoamilasa;

ii) alfa-amilasa;

iii) trehalasa de la invención;

iv) opcionalmente una composición de enzima celulolítica y/o una proteasa.

En una realización preferida, las enzimas pueden añadirse como una composición enzimática de la invención. En una realización preferida, las etapas (a) y (b) se llevan a cabo simultáneamente (es decir, fermentación en una sola etapa). Sin embargo, las etapas (a) y (b) también pueden llevarse a cabo secuencialmente.

Fermentación

La fermentación se lleva a cabo en un medio de fermentación. El medio de fermentación incluye el sustrato de fermentación, es decir, la fuente de hidratos de carbono que es metabolizada por el organismo fermentador. De acuerdo con la invención, el medio de fermentación puede comprender nutrientes y estimulador o estimuladores del crecimiento para el organismo u organismos fermentadores. El nutriente y los estimuladores del crecimiento se usan ampliamente en la técnica de la fermentación, e incluyen fuentes de nitrógeno, tales como amoniaco; urea, vitaminas y minerales, o combinaciones de los mismos.

Organismos de Fermentación para la Fermentación Basada en Almidón

La expresión “organismo fermentador” se refiere a cualquier organismo, incluyendo organismos bacterianos y fúngicos, especialmente levaduras, adecuados para uso en un procedimiento de fermentación, y capaces de producir el producto de fermentación deseado. Organismos de fermentación especialmente adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir azúcares, tales como glucosa o maltosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado, tal como, en particular, etanol. Ejemplos de organismos de fermentación incluyen organismos fúngicos tales como, en particular, levadura. La levadura preferida incluye cepas de Saccharomyces spp., en particular, Saccharomyces cerevisiae. En una realización particular la S. cerevisiae expresa la trehalasa de la invención.

Concentraciones adecuadas del organismo de fermentación viable durante la fermentación, tal como SSF, son bien conocidas en la técnica, o se pueden determinar fácilmente por el experto en la técnica. En una realización, el organismo de fermentación, tal como la levadura de fermentación de etanol, (p. ej., Saccharomyces cerevisiae) se añade al medio de fermentación de modo que el recuento de organismos de fermentación viables, tales como la levadura, por mL de medio de fermentación esté en el intervalo de 105 a 1012, preferiblemente de 107 a 1010, en especial aproximadamente 5x107.

Ejemplos de levadura comercialmente disponibles incluyen, p. ej., levadura RED STAR™ y ETHANOL RED™ (disponible de Fermentis/Lesaffre, EE.UU.), FALI (disponible de Fleischmann’s Yeast, EE.UU.), levadura fresca SUPERSTART y THERMOSACC™ (disponible de Ethanol Technology, WI, EE.UU.),BIOFERM AFT y XR (disponible de NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EE.UU.), Ge RT STRAn D (disponible de Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de DSM Specialties).

Recuperación

Después de la fermentación, p. ej., SSF, el producto de fermentación, en particular etanol, puede separarse del medio de fermentación. La suspensión puede destilarse para recuperar/extraer el producto de fermentación deseado (es decir, etanol). Alternativamente, el producto de fermentación deseado (es decir, etanol) puede extraerse del medio de fermentación mediante técnicas de microfiltración o filtración por membrana. El producto de fermentación (es decir, etanol) también puede recuperarse mediante extracción u otro método bien conocido en la técnica.

Alfa-Amilasa Presente y/o Añadida en la Licuefacción

De acuerdo con la invención, una alfa-amilasa está presente y/o se añade en la licuefacción opcionalmente junto con otras enzimas, tales como una proteasa, una glucoamilasa, fitasa y/o pululanasa.

La alfa-amilasa añadida en el etapa de licuefacción (a) puede ser cualquier alfa-amilasa. Se prefieren las alfa-amilasas bacterianas, que normalmente son estables a las temperaturas utilizadas en la licuefacción.

Alfa-Amilasa Bacteriana

La expresión "alfa-amilasa bacteriana" significa cualquier alfa-amilasa bacteriana clasificada bajo EC 3.2.1.1. Una alfaamilasa bacteriana utilizada de acuerdo con la invención puede derivar, p. ej., de una cepa del género Bacillus, al que a veces también se alude como el género Geobacillus. En una realización, la alfa-amilasa de Bacillus se deriva de una cepa de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, o Bacillus subtilis, pero también se puede derivar de otras especies de Bacillus.

Ejemplos específicos de alfa-amilasas bacterianas incluyen la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/19467 o SEQ ID NO: 8 en esta memoria, la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 5 en el documento WO 99/19467, y la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis de SEQ ID n O: 4 en el documento WO 99/19467. En una realización, la alfa-amilasa puede ser una enzima que tiene un grado de identidad de al menos un 60 %, p. ej., al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID n Os : 3, 4 o 5, respectivamente, en el documento WO 99/19467.

En una realización, la alfa-amilasa puede ser una enzima que tiene un grado de identidad de al menos un 60 %, p. ej., al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/19467 o SEQ ID NO: 8 aquí.

En una realización preferida, la alfa-amilasa se deriva de Bacillus stearothermophilus. La alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus puede ser un tipo salvaje maduro o una variante madura de la misma. Las alfa-amilasas maduras de Bacillus stearothermophilus pueden truncarse de forma natural durante la producción recombinante. Por ejemplo, la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus puede estar truncada, por lo que tiene alrededor de 491 aminoácidos, p. ej., de modo que es entre 480-495 aminoácidos de larga, por lo que carece de su dominio de unión al almidón funcional (en comparación con SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/19467) o SEQ ID NO: 8 en esta memoria.

La alfa-amilasa de Bacillus también puede ser una variante y/o un híbrido. Se pueden encontrar ejemplos de una variante de este tipo en cualquiera de los documentos WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, w O 99/19467, WO 00/60059 y WO 02/10355. Variantes específicas de alfa-amilasa se describen en las patentes de EE.UU. N°s 6.093.562, 6.187.576, 6.297.038 y 7.713.723 e incluyen variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (a la que se alude a menudo como alfa-amilasa BSG) que tienen una deleción de uno o dos aminoácidos en las posiciones R179, G180, 1181 y/o G182, preferiblemente una deleción doble descrita en el documento WO 96/23873 - véase, p. ej., la página 20, líneas 1-10, preferiblemente correspondiente a la deleción de las posiciones 1181 y G182 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus recogida en SEQ ID NO: 3 descrita en el documento WO 99/19467 o SEQ ID NO: 8 en esta memoria o la deleción de los aminoácidos R179 y G180 utilizando SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/19467 o SEQ ID NO: 8 en esta memoria para la numeración. Incluso más preferidas son las alfa-amilasas de Bacillus, especialmente las alfa-amilasas de Bacillus stearothermophilus, que tienen una deleción doble correspondiente a una deleción de las posiciones 181 y 182 y, además, comprenden una sustitución N193F (también denominada I181* G182* N193F) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa de BSG de tipo salvaje recogida en SEQ ID NO: 3 descrita en el documento WO 99/19467 o SEQ ID NO: 8 en esta memoria. La alfa-amilasa bacteriana también puede tener una sustitución en una posición correspondiente a S239 en la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en SEQ ID NO: 4 en el documento WO 99/19467, o una variante S242 y/o E188P de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/19467 o SEQ ID NO: 8 en esta memoria.

En una realización, la variante es una variante S242A, E o Q, preferiblemente una variante S242Q, de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (utilizando SEQ ID NO: 8 en esta memoria para la numeración).

En una realización, la variante es una variante de posición E188, preferiblemente variante E188P de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (utilizando SEQ ID NO: 8 en esta memoria para la numeración).

La alfa-amilasa bacteriana puede ser en una realización una alfa-amilasa de Bacillus truncada. Especialmente el truncamiento es tal que, p. ej., la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/19467 o s Eq ID NO: 8 en esta memoria, tiene una longitud de alrededor de 491 aminoácidos, tal como de 480 a 495 aminoácidos de larga, o por lo que carece de un dominio de unión de almidón funcional.

Alfa-Amilasas Bacterianas Híbridas

La alfa-amilasa bacteriana también puede ser una alfa-amilasa bacteriana híbrida, p. ej., una alfa-amilasa que comprende 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (mostrada en SEQ ID NO: 4 del documento WO 99/19467) y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada en SEQ ID NO: 5 del documento WO 99/19467). En una realización preferida, este híbrido tiene una o más, especialmente todas, de las siguientes sustituciones:

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (utilizando la numeración de Bacillus licheniformis en SEQ ID NO: 4 del documento WO 99/19467). También se prefieren variantes que tengan una o más de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes en otras alfa-amilasas de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o la deleción de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferiblemente la deleción de E178 y G179 (utilizando la SEQ ID NO: 5 del documento WO 99/19467 para la numeración de posiciones).

En una realización, la alfa-amilasa bacteriana es la parte madura de la alfa-amilasa quimérica descrita en Richardson et al. (2002), The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, N° 29, Número de 19 de julio, pp. 267501-26507, a la que se alude como BD5088 o una variante de la misma. Esta alfa-amilasa es la misma que la mostrada en SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2007134207. La secuencia de enzima madura comienza después del aminoácido "Met" inicial en la posición 1.

Alfa-Amilasa Termoestable

La alfa-amilasa puede ser una alfa-amilasa termoestable, tal como una alfa-amilasa bacteriana termoestable, preferiblemente de Bacillus stearothermophilus.

En una realización de la invención, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa bacteriana, preferiblemente derivada del género Bacillus, especialmente una cepa de Bacillus stearothermophilus, en particular Bacillus stearothermophilus tal como se describe en el documento WO 99/019467 tal como SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 8 en esta memoria) con uno o dos aminoácidos eliminados en las posiciones R179, G180, 1181 y/o G182, en particular con R179 y G180 eliminados, o con 1181 y G182 eliminados, con mutaciones en la siguiente lista de mutaciones.

En realizaciones preferidas, las alfa-amilasas de Bacillus stearothermophilus tienen una doble deleción I181 G182 y, opcionalmente, una sustitución N193F, que comprende, además, mutaciones seleccionadas de la siguiente lista:

Se puede encontrar información específica sobre la termoestabilidad de las variantes de alfa-amilasas anteriores en el documento WO12/088303 (Novozymes).

En una realización preferida, la alfa-amilasa se selecciona del grupo de variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus que tienen una doble deleción en I181+G182, y opcionalmente una sustitución en N193F, y sustituciones de la siguiente lista

- E129V+K177L+R179E;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V;

- V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+ M284V; y

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (utilizando SEQ ID NO: 8 en esta memoria para la numeración).

Debe entenderse que cuando se hace referencia a la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus y variantes de la misma, normalmente se producen en forma truncada. En particular, el truncamiento puede ser tal que la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/19467 o SEQ ID NO: 8 en esta memoria, está truncada en el extremo C-terminal y típicamente son de alrededor de 491 aminoácidos de largo, tal como de 480-495 aminoácidos de largo, o de modo que carezca de un dominio de unión de almidón funcional.

En una realización, la variante de alfa-amilasa puede ser una enzima que tiene un grado de identidad de al menos un 60 %, p. ej., al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, pero menos de un 100 % con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/19467 o SEQ ID NO: 8 en esta memoria.

En una realización, la alfa-amilasa bacteriana, p. ej., la alfa-amilasa de Bacillus, tal como especialmente la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, o variante de la misma, se dosifica para licuefacción en una concentración entre 0,01 -10 UKN-A/g de DS, p. ej., entre 0,02 y 5 UKN-A/g de DS, tal como 0,03 y 3 UKN-A, preferiblemente 0,04 y 2 UKN-A/g de DS, tal como especialmente 0,01 y 2 UKN-A/g de DS. En una realización, la alfa-amilasa bacteriana, p. ej., la alfaamilasa de Bacillus, tal como especialmente alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, o variante de la misma, se dosifica para licuefacción en una concentración entre 0,0001-1 mg de EP (proteína enzimática)/g de DS, p. ej., 0,0005­ 0,5 mg de EP/g de DS, tal como 0,001-0,1 mg de EP/g de DS.

Proteasa Presente y/o Añadida en la Licuefacción

De acuerdo con la invención, una proteasa puede estar opcionalmente presente y/o añadida en la licuefacción junto con la alfa-amilasa y una glucoamilasa, fitasa y/o pululanasa opcionales.

Las proteasas se clasifican según su mecanismo catalítico en los siguientes grupos: serina proteasas (S), cisteína proteasas (C), proteasas aspárticas (A), metaloproteasas (M), y proteasas desconocidas, o aún no clasificadas (U), véase Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J.Barrett, N.D.Rawlings, J.F.Woessner (eds), Academic Press (1998), en particular la parte de introducción general.

En una realización preferida, la proteasa termoestable usada según la invención es una "metaloproteasa" definida como una proteasa perteneciente a EC 3.4.24 (metaloendopeptidasas); preferiblemente EC 3.4.24.39 (metaloproteinasas ácidas).

Para determinar si una proteasa dada es una metaloproteasa o no, se hace referencia al “Handbook of Proteolytic Enzymes” anterior y los principios indicados en el mismo. Una determinación de este tipo se puede llevar a cabo para todos los tipos de proteasas, ya sean proteasas que se producen de forma natural o de tipo salvaje; o proteasas genéticamente manipuladas o sintéticas.

La actividad de proteasa se puede medir usando cualquier ensayo adecuado, en el que se emplee un sustrato, que incluya enlaces peptídicos relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. Asimismo, el pH del ensayo y la temperatura del ensayo deben adaptarse a la proteasa en cuestión. Los ejemplos de valores de pH de ensayo son pH 6, 7, 8, 9, 10, u 11. Ejemplos de temperaturas de ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 o 80°C.

Los ejemplos de sustratos de proteasa son caseína, tal como caseína reticulada con azurina (AZCL-caseína). A continuación se describen dos ensayos de proteasa en la sección "Materiales y métodos", de los cuales el denominado “ensayo de AZCL” -caseína es el ensayo preferido.

No existen limitaciones sobre el origen de la proteasa usada en un procedimiento de la invención siempre que cumpla con las propiedades de termoestabilidad definidas a continuación.

En una realización, la proteasa es de origen fúngico.

La proteasa puede ser una variante de, p. ej., una proteasa de tipo salvaje, siempre que la proteasa sea termoestable. En una realización preferida, la proteasa termoestable es una variante de una metaloproteasa como se definió anteriormente. En una realización, la proteasa termoestable utilizada en un procedimiento de la invención es de origen fúngico, tal como una metaloproteasa fúngica, tal como una metaloproteasa fúngica derivada de una cepa del género Thermoascus, preferiblemente una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente de Thermoascus aurantiacus CGMCC N20670 (clasificada como EC 3.4.24.39).

En una realización, la proteasa termoestable es una variante de la parte madura de la metaloproteasa mostrada en la SEQ ID NO: 2 descrita en el documento WO 2003/048353, o la parte madura de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2010/008841 y mostrada como SEQ ID NO: 13 en esta memoria, además con mutaciones seleccionadas de la siguiente lista:

- S5*+D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+A112P+T124V+D142L;

- S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L;

- N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L;

- T46R+D79L+S87P+T116V+D142L;

- D79L+P81 R+S87P+A112P+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L;

- D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L;

- D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L;

- S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L;

- D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L;

- D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C;

- S36P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- A37P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- S49P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- S50P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+D104P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

- S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L;

- S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L;

- Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L;

- Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+D142L.

Se puede encontrar información específica sobre la termoestabilidad de las variantes de proteasas anteriores en el documento WO12/088303 (Novozymes).

En una realización preferida, la proteasa termoestable es una variante de la metaloproteasa descrita como la parte madura de SEQ ID NO: 2 descrita en el documento WO 2003/048353, o la parte madura de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2010/008841 o SEQ ID NO: 13 aquí, con las siguientes mutaciones:

D79L+S87P+A112P+D142L;

D79L+S87P+D142L; o

A27K+ D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

En una realización, la variante de proteasa tiene al menos 75% de identidad, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, incluso más preferiblemente al menos 93%, lo más preferiblemente al menos 94%, e incluso lo más preferible al menos 95%, tal como incluso al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, pero menos de 100% de identidad con la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO: 2 descrita en el documento WO 2003/048353, o la parte madura de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2010/008841 o SEQ ID NO: 13 aquí.

La proteasa termoestable también se puede derivar de cualquier bacteria siempre que la proteasa tenga las propiedades de termoestabilidad definidas de acuerdo con la invención.

En una realización, la proteasa termoestable se deriva de una cepa de la bacteria Pyrococcus, tal como una cepa de Pyrococcus furiosus (pfu proteasa).

En una realización, la proteasa es la que se muestra como SEQ ID NO: 1 en la patente de EE.UU. N° 6.358.726-B1 (Takara Shuzo Company), o SEQ ID NO: 9 en esta memoria.

En otra realización, la proteasa termoestable es la descrita en SEQ ID NO: 22 aquí, o una proteasa que tiene al menos 80% de identidad, tal como al menos 85%, tal como al menos 90%, tal como al menos 95%, tal como al menos 96%, tal como al menos 97%, tal como al menos 98%, tal como al menos 99% de identidad con SEQ ID NO: 1 en la patente US n° 6.358.726-B1 o SEQ ID NO: 9 aquí. La proteasa de Pyroccus furiosus puede adquirirse de Takara Bio, Japón.

Glucoamilasa Presente y/o Añadida en la Licuefacción

De acuerdo con la invención, una glucoamilasa puede estar opcionalmente presente y/o ser añadida en la etapa de licuefacción (a). En una realización preferida, la glucoamilasa se añade junto con o por separado de la alfa-amilasa y la proteasa, fitasa y/o pululanasa opcionales.

En una realización específica y preferida, la glucoamilasa, preferiblemente de origen fúngico, preferiblemente un hongo filamentoso, es de una cepa del género Penicillium, especialmente una cepa de Penicillium oxalicum, en particular la glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/127802 y mostrada en SEQ ID NO: 10 en esta memoria.

En una realización, la glucoamilasa tiene al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, lo más preferiblemente al menos un 94 % e incluso lo más preferiblemente al menos un 95 %, tal como incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/127802 o SEQ ID NO: 10 en esta memoria.

En una realización preferida, la glucoamilasa es una variante de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/127802 y mostrada en SEQ ID NO: 10 en esta memoria, que tiene una sustitución K79V (utilizando la secuencia madura mostrada en SEQ ID NO: 10 en esta memoria para numeración). La variante de glucoamilasa K79V tiene una sensibilidad reducida a la degradación de la proteasa en relación con la precursora tal como se describe en el documento WO 2013/036526.

En una realización, la glucoamilasa se deriva de Penicillium oxalicum.

En una realización, la glucoamilasa es una variante de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/127802) y mostrada en SEQ ID NO: 10 en esta memoria. En una realización, la glucoamilasa de Penicillium oxalicum es la descrita como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/127802) y mostrada en SEQ ID NO: 10 en esta memoria que tiene Val (V) en la posición 79 (utilizando SEQ ID NO: 23 en esta memoria para numeración).

Variantes de glucoamilasa de Penicillium oxalicum contempladas se describen en el documento WO 2013/053801. En una realización, estas variantes tienen una sensibilidad reducida a la degradación de la proteasa.

En una realización, estas variantes tienen una termoestabilidad mejorada en comparación con la precursora.

Más específicamente, en una realización, la glucoamilasa tiene una sustitución K79V (utilizando SEQ ID NO: 10 en esta memoria para numeración), (variante PE001) y, además, comprende al menos una de las siguientes sustituciones o combinación de sustituciones:

T65A;o

Q327F; o

E501V;o

Y504T; o

Y504*; o

T65A Q327F; o

T65A E501V; o

T65A Y504T; o

T65A Y504*; o

Q327F E501V; o

Q327F Y504T; o

Q327F Y504*; o

E501V Y504T; o

E501V Y504*; o

T65A Q327F E501V; o

T65A Q327F Y504T; o

T65A E501V Y504T; o

Q327F E501V Y504T; o

T65A Q327F Y504*; o

T65A E501V Y504*; o

Q327F E501V Y504*; o

T65A Q327F E501V Y504T; o

T65A Q327F E501V Y504*;

E501V Y504T; o

T65A K161S; o

T65A Q405T; o

T65A Q327W; o

T65A Q327F; o

T65A Q327Y; o

P11F T65A Q327F; o

R1K D3W K5Q G7V N8S T10K P11S T65A Q327F; o P2N P4S P11F T65A Q327F; o

P11F D26C K33C T65A Q327F; o

P2N P4S P11F T65A Q327W E501V Y504T; o

R1E D3N P4G G6R G7A N8A T10D+ P11D T65A Q327F; o P11F T65A Q327W; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T; o

P11F T65A Q327W E501V Y504T; o

T65A Q327F E501V Y504T; o

T65A S105P Q327W; o

T65A S105P Q327F; o

T65A Q327W S364P; o

T65A Q327F S364P; o

T65A S103N Q327F; o

P2N P4S P11F K34Y T65A Q327F; o

P2N P4S P11F T65A Q327F D445N V447S; o

P2N P4S P11F T65A I172V Q327F; o

P2N P4S P11F T65A Q327F N502*; o

P2N P4S P11F T65A Q327F N502T P563S K571 E; o

P2N P4S P11F R31S K33V T65A Q327F N564D K571S; o P2N P4S P11F T65A Q327F S377T; o

P2N P4S P11F T65A V325T+ Q327W; o

P2N P4S P11F T65A Q327F D445N V447S E501V Y504T; o P2N P4S P11F T65A I172V Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F S377T E501V Y504T; o

P2N P4S P11F D26N K34Y T65A Q327F; o

P2N P4S P11F T65A Q327F I375A E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A K218A K221D Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A S103N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S T10D T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S F12Y T65A Q327F E501V Y504T; o

K5A P11F T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S T10E E18N T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N T10E E18N T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T T568N; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T K524T G526A; o

P2N P4S P11F K34Y T65A Q327F D445N V447S E501V Y504T; o P2N P4S P11F R31S K33V T65A Q327F D445N V447S E501V Y504T; o P2N P4S P11F D26N K34Y T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A F80* Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A K112S Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T T516P K524T G526A; o P2N P4S P11F T65A Q327F E501V N502T Y504*; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A S103N Q327F E501V Y504T; o

K5A P11F T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T T516P K524T G526A; o P2N P4S P11F T65A V79A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A V79G Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A V79I Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A V79L Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A V79S Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A L72V Q327F E501V Y504T; o

S255N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A E74N V79K Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A G220N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Y245N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q253N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A D279N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F S359N E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F D370N E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F V460S E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F V460T P468T E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F T463N E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F S465N E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F T477N E501V Y504T.

En una realización preferida, la variante de glucoamilasa de Penicillium oxalicum tiene una sustitución K79V (utilizando la SEQ ID NO: 10 en esta memoria para numeración), correspondiente a la variante PE001 y, además, comprende al menos una de las siguientes mutaciones:

P11F T65A Q327F; o

P2N P4S P11F T65A Q327F; o

P11F D26C K33C T65A Q327F; o

P2N P4S P11F T65A Q327W E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T; o

P11F T65A Q327W E501V Y504T.

La glucoamilasa se puede añadir en cantidades de 0,1-100 microgramos de EP/g, tal como 0,5-50 microgramos de EP/g, tal como 1-25 microgramos de EP/g, tal como 2-12 microgramos de EP/g de DS.

Trehalasa Presente y/o Añadida en la Sacarificación y/o Fermentación

De acuerdo con el procedimiento de la invención, una trehalasa de la invención está presente y/o se añade durante - la etapa de sacarificación (b);

- la etapa de fermentación (c);

- sacarificación y fermentación simultáneas;

- opcionalmente etapa de presacarificación antes de la etapa (b).

En una realización preferida, la trehalasa madura descrita en SEQ ID NO: 21. En una realización preferida, la trehalasa madura descrita en SEQ ID NO: 23. En una realización preferida, la trehalasa está presente y/o se añade en una cantidad entre 0,01 -20 ug de trehalasa EP (proteína enzimática)/g de DS, tal como entre 0,05-15 ug de trehalasa EP/g de DS, tal como entre 0,5 y 10 ug de trehalasa EP/g de DS.

Glucoamilasa Presente y/o Añadida en la Sacarificación y/o Fermentación

La glucoamilasa presente y/o añadida durante la etapa de sacarificación (b); etapa de fermentación (c); sacarificación y fermentación simultáneas; o la presacarificación antes de la etapa (b), puede derivarse de cualquier fuente adecuada, p. ej., derivarse de un microorganismo o una planta. Glucoamilasas preferidas son de origen fúngico o bacteriano, seleccionadas del grupo que consiste en glucoamilasas de Aspergillus, en particular glucoamilasas G1 o G2 de Aspergillus niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), o variantes de las mismas, como las descritas en los documentos W o 92/00381, w O 00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); la glucoamilasa de A. awamori descrita en el documento WO 84/02921, la glucoamilasa de Aspergillus oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949), o variantes o fragmentos de la misma. Otras variantes de glucoamilasa de Aspergillus incluyen variantes con estabilidad térmica potenciiada. G137A y G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9, 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); enlaces disulfuro, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704; e introducción de residuos Pro en la posición A435 y S436 (Li et al. (1997), Protein Eng. 10, 1199-1204.

Otras glucoamilasas incluyen Athelia rolfsii (previamente designada glucoamilasa de Corticium rolfsii) (véase la patente de EE.UU. n° 4.727.026 y (Nagasaka et al. (1998) "Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii, Appl Microbiol Biotechnol 50:323-330), Talaromyces glucoamylases, en particular derivada de Talaromyces emersonii (documento WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente de EE.UU. n° Re.

32,153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente de EE.UU. n° 4.587.215). En una realización preferida, la glucoamilasa utilizada durante la sacarificación y/o la fermentación es la glucoamilasa de Talaromyces emersonii descrita en el documento WO 99/28448.

Glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del género Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (documento EP 135,138) y C. thermohydrosulfuricum (documento WO 86/01831). Glucoamilasas fúngicas contempladas incluyen las de Trametes cingulate (SEQ ID NO: 11), Pachykytospora papyracea; y Leucopaxillus giganteus todas descritas en el documento WO 2006/069289; o de Peniophora rufomarginata descrita en el documento WO2007/124285; o una mezcla de las mismas. También se contemplan glucoamilasas híbridas de acuerdo con la invención. Ejemplos incluyen las glucoamilasas híbridas descritas en el documento WO 2005/045018. Ejemplos incluyen la glucoamilasa híbrida descrita en las Tablas 1 y 4 del Ejemplo 1.

En una realización, la glucoamilasa se deriva de una cepa del género Pycnoporus, en particular una cepa de Pycnoporus sanguineus como se describe en el documento WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 o 6), en particular la ^{mostrada como SEQ ID NO: 12 de esta memoria (correspondiente a SEQ ID NO: 4 en el documento} Wo ^2011/066576) o de una cepa del género Gloeophyllum, tal como una cepa de Gloeophyllum sepiarium o Gloeophyllum trabeum, en particular una cepa de Gloeophyllum como se describe en el documento WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16). En una realización preferida, la glucoamilasa es SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/068803 o SEQ ID NO: 5 en esta memoria (es decir, glucoamilasa de Gloeophyllum sepiarium). En una realización preferida, la glucoamilasa es SEQ ID NO: 6 en esta memoria (es decir, glucoamilasa de Gloeophyllum trabeum descrita como SEQ ID NO: 3 en el documento WO2014/177546).

También se contemplan glucoamilasas que exhiben una alta identidad con cualquiera de las glucoamilasas arriba mencionadas, es decir, al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o incluso un 100 % de identidad con una cualquiera de las partes maduras de las secuencias enzimáticas arriba mencionadas, tales como cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 11,5, 6 o 12 en esta memoria, respectivamente.

En una realización, la glucoamilasa utilizada en la fermentación o SSF, exhibe al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o incluso un 100 % de identidad con la parte madura de SEQ ID NO: 6 en esta memoria.

En una realización, la glucoamilasa utilizada en la fermentación o SSF, exhibe al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o incluso un 100 % de identidad con la parte madura de SEQ ID NO: 12 en esta memoria.

En una realización, las glucoamilasas pueden añadirse a la sacarificación y/o fermentación en una cantidad de 0,0001­ 20 UAG/g DS, preferiblemente 0,001-10 UAG/g DS, especialmente entre 0,01-5 UAG/g de DS, tal como 0,1-2 UAG/g de DS.

En una realización, las glucoamilasas pueden añadirse a la sacarificación y/o fermentación en una cantidad de 1 -1.000 gg de EP/g de DS, preferiblemente 10-500 gg/g de DS, especialmente entre 25-250 gg/g de DS.

En una realización, la glucoamilasa se añade como una combinación que comprende, además, una alfa-amilasa. En una realización preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa fúngica, especialmente una alfa-amilasa fúngica ácida. La alfa-amilasa es típicamente una actividad secundaria.

En una realización, la glucoamilasa es una combinación que comprende glucoamilasa de Talaromyces emersonii descrita en el documento WO 99/28448 como SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 4 en esta memoria (y glucoamilasa de Trametes cingulata descrita como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 06/069289 y SEQ ID NO: 11 en esta memoria.

En una realización, la glucoamilasa es una combinación que comprende glucoamilasa de Talaromyces emersonii descrita en SEQ ID NO: 4 en esta memoria, glucoamilasa de Trametes cingulata descrita como SEQ ID NO: 11 en esta memoria, y alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y SBD descrita como V039 en la Tabla 5 en el documento WO 2006/069290 o SEQ ID NO: 7 en esta memoria.

En una realización, la glucoamilasa es una combinación que comprende glucoamilasa de Gloeophyllum sepiarium mostrada como SEQ ID NO: 5 en esta memoria y alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con un enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y dominio de unión a almidón (SBD), descrita en SEQ ID NO: 7 en esta memoria, con las siguientes sustituciones: G128D+D143N.

En una realización, la alfa-amilasa puede derivar de una cepa del género Rhizomucor, preferiblemente una cepa de Rhizomucor pusillus, como la mostrada en SEQ ID NO: 3 en el documento WO2013/006756, o el género Meripilus, preferiblemente una cepa de Meripilus giganteus. En una realización preferida, la alfa-amilasa se deriva de un Rhizomucor pusillus con un enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y un dominio de unión a almidón (SBD), descrito como V039 en la Tabla 5 en el documento WO 2006/069290 o SEQ ID NO: 7 en esta memoria..

En una realización, la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus o la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con un enlazador y un dominio de unión a almidón (SBD), preferiblemente un enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y un SBD, tiene al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S Y141W; A76G Y141W; G128D Y141W; G128D D143N; P219C Y141W; N142D D143N; Y141W K192R; Y141W D143N; Y141W N383R; Y141W P219C A265C; Y141W N142D D143N; Y141W K192R V410A; G128D Y141W D143N; Y141W D143N P219C; Y141W D143N K192R; G128D D143N K192R; Y141W D143N K192R P219C; G128D Y141W D143N K192R; o G128D Y141W D143N K192R P219C (utilizando la SEQ ID NO: 3 en el documento WO 2013/006756 para la numeración o SEQ ID NO: 7 en esta memoria). En una realización preferida, la combinación de glucoamilasa comprende glucoamilasa de Gloeophyllum sepiarium (p. ej., SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/068803 o SEQ ID NO: 5 en esta memoria) y alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus

En una realización preferida, la combinación de glucoamilasa comprende glucoamilasa de Gloeophyllum sepiarium mostrada como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/068803 o SEQ ID NO: 5 en esta memoria y Rhizomucor pusillus con un enlazador y un dominio de unión a almidón (SBD), preferiblemente enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y SBD, descrito en SEQ ID NO: 3 en el documento WO 2013/006756 y SEQ ID NO: 7 en esta memoria, con las siguientes sustituciones: G128D+D143N.

Composiciones comercialmente disponibles que comprenden glucoamilasa incluyen AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL, SPIRIZYME ACHIEVE™ y AMG™ E (de Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (de DuPont-Danisco); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (de DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ y G990 ZR (de DuPont-Danisco).

Composición de Enzimas Celulolíticas Presente y/o Añadida en la Sacarificación y/o Fermentación

De acuerdo con la invención, una composición de enzimas celulolíticas puede estar presente en la sacarificación, fermentación o sacarificación y fermentación simultáneas (SSF).

La composición de enzimas celulolíticas comprende una beta-glucosidasa, una celobiohidrolasa y una endoglucanasa.

Se pueden encontrar ejemplos de composiciones celulolíticas adecuadas en los documentos WO 2008/151079 y WO 2013/028928.

En realizaciones preferidas, la composición de enzimas celulolíticas se deriva de una cepa de Trichoderma, Humicola o Chrysosporium.

En una realización, la composición de enzima celulolítica se deriva de una cepa de Trichoderma reesei, Humicola insolens y/o Chrysosporium lucknowense.

En una realización, la composición de enzimas celulolíticas comprende una beta-glucosidasa, preferiblemente una derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, como la descrita en el documento WO 2002/095014 o la proteína de fusión que tiene actividad beta-glucosidasa descrita en el documento WO 2008/057637 (en particular, la proteína de fusión variante de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae mostrada en SEQ ID NOs: 73 y 74, respectivamente, en el documento WO 2008/057637 o la proteína de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae mostrada en SEQ ID NOs: 75 y 76, respectivamente, en el documento WO 2008/057637), o Aspergillus fumigatus, como la descrita en el documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 14 en esta memoria o una variante de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus descrita en el documento WO 2012/044915 (Novozymes), tal como como una con una o más, tales como todas, de las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y; o una cepa del género Penicillium, tal como una cepa de Penicillium brasilianum descrita en el documento WO 2007/019442, o una cepa del género Trichoderma, tal como una cepa de Trichoderma reesei.

En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, tal como uno derivado del género Thermoascus, tal como una cepa de Thermoascus aurantiacus, como la descrita en el documento WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 15 en esta memoria; o uno derivado del género Thielavia, tal como una cepa de Thielavia terrestris, tal como la descrita en el documento WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 7 y SEQ ID n O: 8; o uno derivado de una cepa de Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita en el documento WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; o uno derivado de una cepa derivada de Penicillium, tal como una cepa de Penicillium emersonii, tal como la descrita en el documento WO 2011/041397 como SEQ ID n O: 2 o SEQ ID n O: 16 en esta memoria.

En una realización, la composición celulolítica comprende una celobiohidrolasa I (CBH I), tal como una derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como Cel7a CBH I descrita en SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/057140 o s Eq ID NO: 17 en esta memoria, o una cepa del género Trichoderma, tal como una cepa de Trichoderma reesei.

En una realización, la composición celulolítica comprende una celobiohidrolasa II (CBH II, tal como una derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, descrita en SEQ ID NO: 18 en esta memoria; o una cepa del género Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, o una cepa del género Thielavia, tal como una cepa de Thielavia terrestris, tal como celobiohidrolasa II CEL6A de Thielavia terrestris.

En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica y una beta-glucosidasa.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa y un CBH I.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, una CBH I y una CBH II.

En una realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que comprende, además, el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (SeQ ID n O: 2 en el documento WO 2005/074656 o SEQ ID NO: 15 en esta memoria), y proteína de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (documento WO 2008/057637).

En una realización, la composición celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que comprende, además, el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (SeQ ID NO: 2 en el documento WO 2005/074656 o SEQ ID NO: 15 en esta memoria) y beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 14 en esta memoria).

En una realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que comprende, además, el polipéptido GH61A de Penicillium emersonii que tiene actividad potenciadora celulolítica descrito como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/041397 o SEQ ID NO: 16 en esta memoria y betaglucosidasa de Aspergillus fumigatus descrito como SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/047499 o SEQ ID No : 14 en esta memoria) o una variante de la misma con las siguientes sustituciones F100D, S283G, N456E, F512Y (utilizando SEQ ID NO: 14 en esta memoria para la numeración).

En una realización preferida, la composición de enzimas celulolíticas comprende uno o más de los siguientes componentes:

(i) una celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus;

(ii) una celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus;

(iii) una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus o variante de la misma; y

(iv) un polipéptido GH61 de Penicillium sp. que tiene actividad potenciadora celulolítica; u homólogos de los mismos.

En una realización preferida, la composición de enzimas celulolíticas se deriva de Trichoderma reesei que comprende el polipéptido GH61A que tiene actividad potenciadora celulolítica derivada de una cepa de Penicillium emersonii (SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/041397 o SEQ ID NO: 16 en esta memoria), beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 14 en esta memoria), con las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y (descrita en el documento WO 2012/044915); Cel7A CBH I de Aspergillus fumigatus descrita como SEQ ID NO: 6 en WO2011/057140 o SEQ ID NO: 6 en esta memoria, y CBH II de Aspergillus fumigatus descrita como SEQ ID NO: 17 en el documento WO 2011/057140 o SEQ ID NO: 18 aquí.

En una realización, la composición celulolítica se dosifica de 0,0001-3 mg de EP/g de DS, preferiblemente, 0,0005-2 mg de EP/g de DS, preferiblemente 0,001-1 mg/g de DS, más preferiblemente 0,005-0,5 mg de EP/g de DS e incluso más preferiblemente 0,01-0,1 mg de EP/g de DS.

Proteasas Presentes y/o Añadidas en la Sacarificación y/o Fermentación

Puede añadirse cualquier proteasa adecuada en la sacarificación y/o fermentación, tal como SSF.

En una realización preferida, la proteasa es una metaloproteasa o una serina proteasa. En una realización, la composición enzimática comprende una metaloproteasa, preferiblemente derivada de una cepa del género Thermoascus, preferiblemente una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC N° 0670, tal como la metaloproteasa descrita como la parte madura de SEQ ID NO : 2 descrita en el documento WO 2003/048353 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 13 en esta memoria.

En una realización, la proteasa tiene al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 75 % de identidad, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, lo más preferiblemente al menos un 94 % e incluso lo más preferiblemente al menos un 95 %, tal como incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO: 13 en esta memoria.

En una realización, la proteasa se deriva de una cepa de Pyrococcus, tal como una cepa de Pyrococcus furiosus tal como la proteasa mostrada en SEQ ID NO: 1 en el documento US 6.358.726 o SEQ ID NO: 9 en esta memoria.

En una realización, la proteasa es la secuencia madura de la proteasa 3 de Meripilus giganteus (proteasa de la familia de peptidasas S53) en cuestión en el Ejemplo 2 en el documento WO 2014/037438. En una realización, la proteasa es la secuencia de proteasa 3 madura de una cepa de Meripilus, en particular Meripilus giganteus mostrada como SEQ ID NO: 5 en el documento WO 2014/037438 y SEQ ID NO: 19 en esta memoria.

En una realización, la proteasa tiene al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 75 % de identidad, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, lo más preferiblemente al menos un 94 % e incluso lo más preferiblemente al menos un 95 %, tal como incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO: 19 mostrada en esta memoria como los aminoácidos 1-547.

Alfa-amilasa Presente y/o Añadida en la Sacarificación y/o Fermentación

Cualquier alfa-amilasa adecuada, tal como alfa-amilasa ácida fúngica, puede estar presente y/o ser añadida en la sacarificación y/o fermentación.

En una realización preferible, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa fúngica, en particular una que tiene al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 75 % de identidad, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, lo más preferiblemente al menos un 94 % e incluso lo más preferiblemente al menos un 95 %, tal como incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO: 7. En una realización preferida, la alfa-amilasa tiene una o más de las siguientes sustituciones: G128D, D143N, en particular G128D+D143N.

Procedimientos de Producir un Producto de Fermentación a partir de Material Celulósicos Utilizando una Trehalasa de la Invención

En una realización, la invención se refiere a procedimientos de producir productos de fermentación a partir de material celulósico pretratado, que comprenden:

(a) hidrolizar dicho material celulósico pretratado con una composición de enzima celulolítica;

(b) fermentar utilizando un organismo de fermentación; y

(c) opcionalmente recuperar el producto de fermentación,

en el que una trehalasa de la invención se añade y/o está presente en la etapa de hidrólisis (a) y/o la etapa de fermentación (b).

De acuerdo con el procedimiento de la invención, la hidrólisis y la fermentación pueden llevarse a cabo por separado o simultáneamente. En una realización, el procedimiento de la invención se lleva a cabo como hidrólisis y fermentación separadas (SHF); sacarificación y fermentación simultáneas (SSF); sacarificación y co-fermentación simultáneas (SSCF); hidrólisis y fermentación híbrida (HHF); hidrólisis separada y co-fermentación (SHCF); hidrólisis híbrida y co fermentación (HHCF); o conversión microbiana directa (DMC), a veces también denominado bioprocesamiento consolidado (CBP). La SHF utiliza etapas de procedimiento separadas para hidrolizar primero enzimáticamente el material celulósico a azúcares fermentables, por ejemplo monómeros de glucosa, celobiosa y pentosa, y después fermentar los azúcares fermentables a etanol. En la SSF, la hidrólisis enzimática del material celulósico y la fermentación de azúcares a etanol se combinan en una sola etapa. La SSCF implica la co-fermentación de múltiples azúcares (Sheehan, J. y Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy's research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). HHF implica una etapa de hidrólisis separada, y además, una etapa de sacarificación e hidrólisis simultáneas, que se pueden llevar a cabo en el mismo reactor. Las etapas en un procedimiento HHF pueden llevarse a cabo a diferentes temperaturas, es decir, hidrólisis enzimática a alta temperatura seguida de SSF a una temperatura más baja que la cepa de fermentación puede tolerar. DMC combina los tres procedimientos (producción de enzimas, hidrólisis y fermentación) en una o más (p. ej., varias) etapas, en que se utiliza el mismo organismo para producir las enzimas para la conversión del material celulósico en azúcares fermentables y para convertir los azúcares fermentables en un producto final.

De acuerdo con la invención, el material celulósico son fragmentos de material vegetal, segmentos de tallos de plantas y/o tallos de plantas enteras. En una realización, el material celulósico se selecciona del grupo que comprende arundo, bagazo, bambú, mazorca de maíz, fibras de maíz, rastrojo de maíz, miscanthus, piel de naranja, paja de arroz, pasto varilla, paja de trigo. En una realización preferida, la fuente del material celulósico es rastrojo de maíz, mazorcas de maíz y/o paja de trigo.

De acuerdo con la invención, se puede utilizar cualquier pretratamiento. En una realización preferida se utiliza un pretratamiento químico, un pretratamiento físico o un pretratamiento químico y un pretratamiento físico. En una realización preferida, el material celulósico se trata previamente con un ácido, tal como un tratamiento previo con ácido diluido. En una realización, el material celulósico se prepara pretratando el material celulósico a alta temperatura y alta presión con un ácido.

En una realización, la hidrólisis se lleva a cabo a una temperatura entre 20-70 °C, tal como 30-60 °C, preferiblemente 45-55 °C, a un pH en el intervalo de 4-6, tal como 4,5-5,5.

En una realización, el material celulósico está presente en 1-20 % (p/p) de TS, tal como 2-10 % (p/p) de TS, tal como alrededor de 5 % (p/p) de TS durante la hidrólisis.

En una realización, la hidrólisis se lleva a cabo durante 1-20 días, preferiblemente entre 5-15 días.

En una realización, la composición de enzima celulolítica se deriva de una cepa de Trichoderma reesei, Humicola insolens o Chrysosporium lucknowense.

Composición de enzimas celulolítica: La expresión "composición de enzimas celulolíticas'' significa una o más (p. ej., varias) enzimas que hidrolizan un material celulósico. Enzimas de este tipo incluyen endoglucanasa(s), celobiohidrolasa(s), beta-glucosidasa(s), o combinaciones de las mismas. Los dos enfoques básicos para medir la actividad celulolítica incluyen: (1) medir la actividad celulolítica total y (2) medir las actividades celulolíticas individuales (endoglucanasas, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas) tal como se revisa en Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. La actividad celulolítica total se mide habitualmente utilizando sustratos insolubles, incluyendo papel de filtro Whatman N°1, celulosa microcristalina, celulosa bacteriana, celulosa de algas, algodón, lignocelulosa pretratada, etc. El ensayo de actividad celulolítica total más común es el ensayo de papel de filtro que utiliza papel de filtro Whatman N°1 como el sustrato El ensayo fue establecido por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

Para los fines de la presente invención, la actividad de la enzima celulolítica se determina midiendo el aumento en la hidrólisis de un material celulósico por parte de enzima(s) celulolítica(s) bajo las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulosa en PCS (u otro material celulósico pretratado) durante 3-7 días a una temperatura adecuada, p. ej., 50 °C, 55 °C o 60 °C, en comparación con una hidrólisis de control sin adición de proteína de enzima celulolítica. Condiciones típicas son reacciones de 1 ml, PCS lavado o sin lavar, 5 % de sólidos insolubles, acetato de sodio 50 mM pH 5, MnSO4 1 mM, 50 °C, 55 °C o 60 °C, 72 horas, análisis de azúcar por columna HPX-87H AMINEX® (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU.).

Se pueden encontrar ejemplos de composiciones celulolíticas en la sección "Composición de Enzimas Celulolíticas presente y/o añadida durante la Sacarificación y/o Fermentación" que figura arriba.

Material celulósico: La expresión “material celulósico” significa cualquier material que contenga celulosa. El polisacárido predominante en la pared celular primaria del material celulósico es la celulosa, el segundo más abundante es la hemicelulosa y el tercero es la pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula ha dejado de crecer, también contiene polisacáridos, y está reforzada por lignina polimérica reticulada covalentemente a hemicelulosa. La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa, y de este modo es un beta-(1 4)-D-glucano lineal, mientras que las hemicelulosas incluyen una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos, y mananos en estructuras ramificadas complejas con un espectro de sustituyentes. Aunque generalmente es polimorfa, la celulosa se encuentra en el tejido vegetal principalmente como una matriz cristalina insoluble de cadenas de glucanos paralelas. Las hemicelulosas suelen unirse por enlaces de hidrógeno a la celulosa, así como a otras hemicelulosas, que ayudan a estabilizar la matriz de la pared celular.

La celulosa se encuentra generalmente, por ejemplo, en los tallos, hojas, vainas, cáscaras, y mazorcas de plantas, u hojas, ramas, y madera de árboles. El material celulósico puede ser, pero no se limita a, restos agrícolas, material herbáceo (incluyendo cultivos energéticos), restos sólidos urbanos, restos de fábricas de pulpa y papel, papel de desecho, y madera (incluyendo restos forestales) (véanse, por ejemplo, Wiselogel et al., 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), p. 105-118, Taylor y Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, editor gerente, Volumen 65, pp.23-40, Springer-Verlag, Nueva York). Se entiende aquí que la celulosa puede estar en forma de lignocelulosa, un material de la pared celular vegetal que contiene lignina, celulosa y hemicelulosa en una matriz mixta. En un aspecto preferido, el material celulósico es cualquier material de biomasa. En otro aspecto preferido, el material celulósico es lignocelulosa, que comprende celulosa, hemicelulosas y lignina.

En un aspecto, el material celulósico es un residuo agrícola. En otro aspecto, el material celulósico es material herbáceo (incluyendo cultivos energéticos). En otro aspecto, el material celulósico es residuo sólido municipal. En otro aspecto, el material celulósico es residuo de fábrica de pasta papelera y papel. En otro aspecto, el material celulósico es papel usado. En otro aspecto, el material celulósico es madera (incluyendo residuos forestales).

En otro aspecto, el material celulósico es arundo. En otro aspecto, el material celulósico es bagazo. En otro aspecto, el material celulósico es bambú. En otro aspecto, el material celulósico es mazorca de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es fibra de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es rastrojo de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es miscanthus. En otro aspecto, el material celulósico es piel de naranja. En otro aspecto, el material celulósico es paja de arroz. En otro aspecto, el material celulósico es pasto varilla. En otro aspecto, el material celulósico es paja de trigo. En otro aspecto, el material celulósico es paja de arroz. En otro aspecto, el material celulósico es pasto varilla. En otro aspecto, el material celulósico es paja de trigo.

En otro aspecto, el material celulósico es álamo temblón. En otro aspecto, el material celulósico es eucalipto. En otro aspecto, el material celulósico es abeto. En otro aspecto, el material celulósico es pino. En otro aspecto, el material celulósico es chopo. En otro aspecto, el material celulósico es picea. En otro aspecto, el material celulósico es sauce.

En otro aspecto, el material celulósico es celulosa de algas. En otro aspecto, el material celulósico es celulosa bacteriana. En otro aspecto, el material celulósico es borra de algodón. En otro aspecto, el material celulósico es papel de filtro. En otro aspecto, el material celulósico es celulosa microcristalina. En otro aspecto, el material celulósico es celulosa tratada con ácido fosfórico.

En otro aspecto, el material celulósico es biomasa acuática. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión “biomasa acuática” significa biomasa producida en un entorno acuático mediante un proceso de fotosíntesis. La biomasa acuática puede ser algas, plantas emergentes, plantas de hojas flotantes, o plantas sumergidas.

El material celulósico puede usarse tal cual, o puede someterse a un pretratamiento, usando métodos convencionales conocidos en la técnica, como se describe en el presente documento. En un aspecto preferido, el material celulósico se trata previamente.

Beta-glucosidasa: El término “beta-glucosidasa” significa una beta-D-glucósido glucohidrolasa (E.C. 3.2.1.21) que cataliza la hidrólisis de restos terminales de beta-D-glucosa no reductores con la liberación de beta-D-glucosa. Para los fines de la presente invención, la actividad de beta-glucosidasa se determina utilizando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido como sustrato de acuerdo con el procedimiento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Una unidad de beta-glucosidasa se define como 1,0 gmol de anión pnitrofenolato producido por minuto a 25 °C, pH 4,8 a partir de p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido 1 mM como sustrato en citrato de sodio 50 mM que contiene TWEEN® 20 al 0,01 % (monolaurato de polioxietilen sorbitán).

Beta-xilosidasa: El término “beta-xilosidasa” significa una beta-D-xilósido xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.37) que cataliza la exohidrólisis de beta (1^4)-xilooligosacáridos cortos para eliminar sucesivos restos de D-xilosa de los extremos no reductores. Para los fines de la presente invención, una unidad de beta-xilosidasa se define como 1,0 gmol de anión p-nitrofenolato producido por minuto a 40 °C, pH 5 a partir de p-nitrofenil-beta-D-xilósido 1 mM como sustrato en citrato de sodio 100 mM que contiene TWEEN® 20 al 0,01 %.

Celobiohidrolasa: El término “celobiohidrolasa” significa una 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91) que cataliza la hidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, celo-oligosacáridos o cualquier polímero que contiene glucosa enlazada a beta-1,4, que libera celobiosa de los extremos reductores o no reductores de la cadena (Teeri, 1997, Crystalline celulosa degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). La actividad de celobiohidrolasa se determina de acuerdo con los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288; y Tomme et al., 1988, Eur. Biochem.

170: 575-581. En la presente invención, el método de Tomme et al. se puede utilizar para determinar la actividad de celobiohidrolasa.

Endoglucanasa: El término "endoglucanasa" significa una endo-1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 4-glucanohidrolasa (EC 3.2.1.4) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D -glicosídicos en celulosa, derivados de celulosa (tales como carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa), liquenina, enlaces beta-1,4 en beta-1,3 glucanos mixtos, tales como beta-D-glucanos o xiloglucanos de cereales, y otro material vegetal que contiene componentes celulósicos. La actividad de endoglucanasa se puede determinar midiendo la reducción en la viscosidad del sustrato o el aumento en los extremos reductores determinados por un ensayo de azúcar reductor (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para los fines de la presente invención, la actividad de endoglucanasa se determina utilizando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato de acuerdo con el procedimiento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem.

59: 257-268, a pH 5, 40°C.

Familia 61 glicósido hidrolasa: La expresión "Familia 61 glicósido hidrolasa" o "Familia GH61" o "GH61" significa un polipéptido que pertenece a la Familia 61 glicósido hidrolasa de acuerdo con Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat y Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. Las enzimas de esta familia se clasificaron originalmente como una familia de glicósido hidrolasas basándose en la medición de la actividad de endo-1,4-beta-D-glucanasa muy débil en un miembro de la familia. La estructura y el modo de acción de estas enzimas no son canónicos y no pueden considerarse glicosidasas de buena fe. Sin embargo, se mantienen en la clasificación CAZy sobre la base de su capacidad de potenciar la descomposición de la celulosa cuando se utilizan junto con una celulasa o una mezcla de celulasas.

Enzima hemicelulolítica o hemicelulasa: La expresión "enzima hemicelulolítica" o "hemicelulasa" significa una o más (p.ej., varias) enzimas que hidrolizan un material hemicelulósico. Véase, por ejemplo, Shallom y Shoham, 2003, Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology 6(3): 219-228). Las hemicelulasas son componentes clave en la degradación de la biomasa vegetal. Ejemplos de hemicelulasas incluyen, pero no se limitan a una acetilmanano esterasa, una acetilxilano esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa de ácido cumárico, una feruloil esterasa, una galactosidasa, una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa y una xilosidasa. Los sustratos de estas enzimas, las hemicelulosas, son un grupo heterogéneo de polisacáridos ramificados y lineales que se unen mediante enlaces hidrógeno a las microfibrillas de celulosa en la pared celular de la planta, entrecruzándolas en una red robusta. Las hemicelulosas también se unen covalentemente a la lignina, formando junto con la celulosa una estructura muy compleja. La estructura y organización variables de las hemicelulosas requieren la acción concertada de muchas enzimas para su completa degradación. Los módulos catalíticos de las hemicelulasas son glucósido hidrolasas (GH) que hidrolizan enlaces glucosídicos, o carbohidrato esterasas (CE), que hidrolizan enlaces de éster de acetato o de grupos laterales de ácido ferúlico. Estos módulos catalíticos, basados en la homología de su secuencia primaria, pueden asignarse a las familias GH y CE. Algunas familias, con un pliegue general similar, se pueden agrupar en clanes, marcados alfabéticamente (p. ej., GH-A). Una clasificación más informativa y actualizada de estas y otras enzimas activas de carbohidratos está disponible en la base de datos de enzimas activas de carbohidratos (CAZy). Las actividades de las enzimas hemicelulolíticas se pueden medir según Ghose y Bisaria, 1987, Pure & Appl. Chem. 59: 1739-1752, a una temperatura adecuada, p.ej., 50 °C, 55 °C o 60 °C, y pH, p. ej., 5,0 o 5,5.

Polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica: La expresión "polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica" significa un polipéptido GH61 que cataliza la potenciación de la hidrólisis de un material celulósico por una enzima que tiene actividad celulolítica. Para los fines de la presente invención, la actividad potenciadora celulolítica se determina midiendo el aumento de azúcares reductores o el aumento del total de celobiosa y glucosa a partir de la hidrólisis de un material celulósico por enzima celulolítica en las siguientes condiciones: 1 -50 mg de proteína total/g de celulosa en PCS, en donde la proteína total se compone de 50-99,5 % p/p de proteína de enzima celulolítica y 0,5-50 % p/p de proteína de un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica durante 1-7 días a una temperatura adecuada, p.ej., 50 °C, 55 °C o 60 °C, y pH, p.ej., 5,0 o 5,5, en comparación con una hidrólisis de control con la misma carga de proteína total sin actividad potenciadora celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS). En un aspecto, una mezcla de CELLUCLAST® 1.5L (Novozymes A/S, Bagsv^rd, Dinamarca) en presencia de 2-3 % del peso total de proteína de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (producida de forma recombinante en Aspergillus oryzae de acuerdo con el documento WO 02/095014 ) o 2-3 % del peso total de proteína de beta-glucosidasa Aspergillus fumigatus (producida de forma recombinante en Aspergillus oryzae como se describe en el documento WO 2002/095014) de la carga de proteína de celulasa se utiliza como la fuente de la actividad celulolítica.

Los polipéptidos GH61 que tienen actividad potenciadora celulolítica potencian la hidrólisis de un material celulósico catalizada por una enzima que tiene actividad celulolítica al reducir la cantidad de enzima celulolítica requerida para alcanzar el mismo grado de hidrólisis, preferiblemente al menos 1,01 veces, p. ej., al menos 1,05 veces. al menos 1,10 veces, al menos 1,25 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos menos 20 veces.

Xilanasa: El término “xilanasa” significa una 1,4-beta-D-xilano-xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.8) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-xilosídicos en xilanos. Para los fines de la presente invención, la actividad de xilanasa se determina con AZCL-arabinoxilano al 0,2 % como sustrato en TRITON® X-100 al 0,01 % y tampón fosfato de sodio 200 mM pH 6 a 37 °C. Una unidad de actividad de xilanasa se define como 1,0 gmol de azurina producida por minuto a 37 °C, pH 6 a partir de AZCL-arabinoxilano al 0,2 % como sustrato en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 6.

Organismo de Fermentación para la Fermentación Basada en Celulosa

La expresión "organismo de fermentación" o "microorganismo de fermentación" se refiere a cualquier organismo, incluyendo los organismos bacterianos y fúngicos, adecuado para su uso en un proceso de fermentación deseado para producir un producto de fermentación. El organismo de fermentación puede ser un organismo de fermentación de hexosa y/o pentosa, o una combinación de los mismos. Tanto los organismos fermentadores de hexosa como de pentosa son bien conocidos en la técnica. Microorganismos fermentadores adecuados son capaces de fermentar, es decir., convertir azúcares, tales como glucosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, maltosa, manosa, galactosa y/u oligosacáridos, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de organismos fermentadores bacterianos y fúngicos que producen etanol se describen por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol.

69: 627-642.

Ejemplos de organismos fermentadores que pueden fermentar azúcares de hexosa incluyen organismos bacterianos y fúngicos, tales como levaduras. Levaduras preferidas incluyen cepas de Candida, Kluyveromyces, y Saccharomyces, p. ej., Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus, y Saccharomyces cerevisiae.

Ejemplos de organismos fermentadores que pueden fermentar azúcares de azúcares de pentosa en su estado nativo incluyen organismos bacterianos y fúngicos, tales como algunas levaduras. Levaduras fermentadoras de xilosa preferidas incluye cepas de Candida, preferiblemente C. sheatae o C. sonorensis; y cepas de Pichia, preferiblemente P. stipitis, tales como P. stipitis CBS 5773. Levaduras fermentadoras de pentosa preferidas incluye cepas de Pachysolen, preferiblemente P. tannophilus. Los organismos que no son capaces de fermentar azúcares de pentosa, tales como xilosa y arabinosa, pueden modificarse genéticamente para que lo hagan mediante métodos conocidos en la técnica.

Ejemplos de bacterias que pueden fermentar eficientemente hexosa y pentosa a etanol incluyen, por ejemplo, Bacillus coagulans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum, y Zymomonas mobilis (Philippidis, 1996, supra).

Otros organismos fermentadores incluyen cepas de Bacillus, tales como Bacillus coagulans; Candida, tales como C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii, C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii, C. utilis, y C. scehatae; Clostridium, tales como C. acetobutylicum, C. thermocellum, y C. phytofermentans; E. coli, especially E. coli cepas que han sido modificadas genéticamente para mejorar el rendimiento de etanol; Geobacillus sp.; Hansenula, tales como Hansenula anomala; Klebsiella, tales como K oxytoca; Kluyveromyces, tales como K. marxianus, K lactis, K. thermotolerans, y K fragilis; Schizosaccharomyces, tales como S. pombe; Thermoanaerobacter, tales como Thermoanaerobacter saccharolyticum; y Zymomonas, tales como Zymomonas mobilis.

En un aspecto preferido, la levadura es una Bretannomyces. En un aspecto más preferido, la levadura es Bretannomyces clausenii. En otro aspecto preferido, la levadura es una Candida. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida sonorensis. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida boidinii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida blankii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida brassicae. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida diddensii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida entomophiliia. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida pseudotropicalis. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida scehatae. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida utilis. En otro aspecto preferido, la levadura es una Clavispora. En otro aspecto más preferido, la levadura es Clavispora lusitaniae. En otro aspecto más preferido, la levadura es Clavispora opuntiae. En otro aspecto preferido, la levadura es una Kluyveromyces. En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces fragilis. En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces marxianus. En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces thermotolerans. En otro aspecto preferido, la levadura es una Pachysolen. En otro aspecto más preferido, la levadura es Pachysolen tannophilus. En otro aspecto preferido, la levadura es una Pichia. En otro aspecto más preferido, la levadura es una Pichia stipitis. En otro aspecto preferido, la levadura es una Saccharomyces spp. En un aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces cerevisiae. En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces distaticus. En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces uvarum.

En un aspecto preferido, la bacteria es un Bacillus. En un aspecto más preferido, la bacteria es Bacillus coagulans. En otro aspecto preferido, la bacteria es un Clostridium. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium acetobutylicum. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium phytofermentans. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium thermocellum. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Geobacilus sp. En otro aspecto más preferido, la bacteria es un Thermoanaerobacter. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Thermoanaerobacter saccharolyticum. En otro aspecto preferido, la bacteria es un Zymomonas. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Zymomonas mobilis.

Levaduras comercialmente disponibles, adecuadas para la producción de etanol incluyen, p. ej., BIOFERM™ AFT y ^{XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA,} E^e.UU.), ^levadura ETHAⁿO^{l r}E^{d™ (Fermentis/Lesaffre,} EE.UU.), FALI™ (Fleischmann's Yeast, EE.UU.), FERMIOL™ (DSM Specialties), GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suecia) y levadura fresca SUPERSTART™ y THERMOSACC™ (Ethanol Technology, WI, EE.UU.).

En un aspecto preferido, el microorganismo de fermentación ha sido modificado genéticamente para proporcionar la capacidad de fermentar azúcares de pentosa, tales como microorganismos que utilizan xilosa, que utilizan arabinosa y que co-utilizan xilosa y arabinosa.

La clonación de genes heterólogos en diversos microorganismos fermentadores ha conducido a la construcción de organismos capaces de convertir hexosas y pentosas en etanol (co-fermentación) (Chen y Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, levadura Saccharomyces manipulada genéticamente, capaz de co­ fermentar glucosa y xilosa de forma eficaz, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter y Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylosemetabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, xilosa isomerasa).

En un aspecto preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Candida sonorensis. En otro aspecto preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Escherichia coli. En otro aspecto preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Klebsiella oxytoca. En un aspecto preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Kluyveromyces marxianus. En otro aspecto preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Saccharomyces cerevisiae. En otro aspecto preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Zymomonas mobilis.

Es bien conocido en la técnica que los organismos arriba descritos también se pueden utilizar para producir otras sustancias, tal como se describe en esta memoria.

El microorganismo fermentador se añade típicamente al material celulósico degradado o al hidrolizado y la fermentación se realiza durante aproximadamente 8 a aproximadamente 96 horas, p.ej., aproximadamente 24 a aproximadamente 60 horas. La temperatura está típicamente entre aproximadamente 26 °C y aproximadamente 60 °C, p.ej., aproximadamente 32 °C o 50 °C, y aproximadamente a pH 3 a aproximadamente pH 8, p. ej., pH 4-5, 6 o 7.

En un aspecto, la levadura y/u otro microorganismo se aplican al material celulósico degradado y la fermentación se realiza durante aproximadamente 12 a aproximadamente 96 horas, tal como típicamente 24-60 horas. En otro aspecto, la temperatura está preferiblemente entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 60 °C, p.ej., aproximadamente 25 °C a aproximadamente 50 °C, aproximadamente 32 °C a aproximadamente 50 °C, o aproximadamente 32 °C a aproximadamente 50 °C, y el pH es generalmente de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7, p. ej., aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 7. Sin embargo, algunos organismos fermentadores, p. ej., bacterias, tienen una temperatura óptima de fermentación más elevada. La levadura u otro microorganismo se aplica preferiblemente en cantidades de aproximadamente 105 a 1012, preferiblemente de aproximadamente 107 a 1010, en especial aproximadamente un recuento de 2 x 108 células viables por ml de caldo de fermentación. Se puede encontrar orientación adicional con respecto al uso de levadura para la fermentación en p.ej., "The Alcohol Textbook" (Editores K. Jacques, T.P. Lyons y D.R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999).

Para la producción de etanol, después de la fermentación, la suspensión fermentada se destila para extraer el etanol. El etanol obtenido de acuerdo con los procedimientos de la invención se puede utilizar como, p. ej., etanol para combustible, etanol para beber, es.decir., alcoholes neutros potables o etanol industrial.

Se puede utilizar un estimulador de la fermentación en combinación con cualquiera de los procedimientos descritos en esta memoria para mejorar adicionalmente el procedimiento de fermentación y, en particular, el rendimiento del microorganismo fermentador, tal como la mejora de la velocidad y el rendimiento de etanol. Un "estimulador de la fermentación" se refiere a estimuladores para el crecimiento de microorganismos fermentadores, en particular, levaduras. Los estimuladores de la fermentación preferidos para el crecimiento incluyen vitaminas y minerales. Ejemplos de vitaminas incluyen multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, mesoinositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina, y vitaminas A, B, C, D, y E. Véase, por ejemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002). Los ejemplos de minerales incluyen minerales y sales minerales que pueden suministrar nutrientes, que comprenden P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, y Cu.

Productos de fermentación

De acuerdo con la invención, la expresión "producto de fermentación" puede ser cualquier sustancia derivada de la fermentación. El producto de fermentación puede ser, sin limitación, un alcohol (p. ej., arabinitol, n-butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etilenglicol, 1,3-propanodiol [propilenglicol], butanodiol, glicerina, sorbitol y xilitol); un alcano (p.ej., pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano y dodecano), un cicloalcano (p.ej., ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano y ciclooctano), un alqueno (p.ej., penteno, hexeno, hepteno y octeno); un aminoácido (p.ej., ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina, serina y treonina); un gas (p.ej., metano, hidrógeno (H²), dióxido de carbono (CO²) y monóxido de carbono (CO)); isopreno; una cetona (p.ej., acetona); un ácido orgánico (p.ej., ácido acético, ácido acetónico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiónico, ácido succínico y ácido xilónico); y policétido. El producto de fermentación también puede ser proteína como un producto de alto valor.

En un aspecto preferido, el producto de fermentación es un alcohol. Se entenderá que el término "alcohol" abarca una sustancia que contiene uno o más (p. ej., varios) restos hidroxilo. En un aspecto más preferido, el alcohol es n-butanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es isobutanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es etanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es metanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es arabinitol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es butanodiol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es etilenglicol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerina. En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es 1,3-propanodiol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es sorbitol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es xilitol. Véase, por ejemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemania, 65: 207-241; Silveira, M. M. y Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam y Singh, 1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30(2): 117-124; Ezeji et al., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19(6): 595-603.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un alcano. El alcano puede ser un alcano no ramificado o uno ramificado. En otro aspecto más preferido, el alcano es pentano. En otro aspecto más preferido, el alcano es hexano. En otro aspecto más preferido, el alcano es heptano. En otro aspecto más preferido, el alcano es octano. En otro aspecto más preferido, el alcano es nonano. En otro aspecto más preferido, el alcano es decano. En otro aspecto más preferido, el alcano es undecano. En otro aspecto más preferido, el alcano es dodecano.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un cicloalcano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclopentano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclohexano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es cicloheptano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclooctano.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un alqueno. El alqueno puede ser un alqueno no ramificado o uno ramificado. En otro aspecto más preferido, el alqueno es penteno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es hexeno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es hepteno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es octeno.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un aminoácido. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido aspártico. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es ácido glutámico. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es glicina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es lisina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es serina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es treonina. Véase, por ejemplo, Richard y Margaritis, 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87(4): 501-515.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un gas. En otro aspecto más preferido, el gas es metano. En otro aspecto más preferido, el gas es H². En otro aspecto más preferido, el gas es CO². En otro aspecto más preferido, el gas es CO. Véase, por ejemplo, Kataoka, Miya y Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36(6-7): 41-47; y Gunaseelan, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review, Biomass and Bioenergy, 13(1-2): 83-114.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es isopreno.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es una cetona. Se entenderá que el término ''cetona'' abarca una sustancia que contiene uno o más (p. ej., varios) restos de cetona. En otro aspecto más preferido, la cetona es acetona. Véase, por ejemplo, Qureshi y Blaschek, 2003, supra.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un ácido orgánico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acético. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acetónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es el ácido adípico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido ascórbico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido cítrico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es el ácido 2,5-diceto-D-glucónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido fórmico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido fumárico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucárico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucurónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glutárico. En otro aspecto preferido, el ácido orgánico es ácido 3-hidroxipropiónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido itacónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido láctico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido málico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido malónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido oxálico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido propiónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido succínico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es el ácido xilónico. Véase, por ejemplo, Chen y Lee, 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

Recuperación

El o los productos de fermentación se recuperan opcionalmente después de la fermentación utilizando cualquier método conocido en la técnica que incluye, pero no se limita a cromatografía, procedimientos electroforéticos, solubilidad diferencial, destilación o extracción. Por ejemplo, el alcohol, tal como etanol, se separa del material fermentado y se purifica mediante métodos convencionales de destilación. Se puede obtener etanol con una pureza de hasta aproximadamente 96 % en vol, el cual se puede utilizar, por ejemplo, como etanol combustible, etanol potable, es decir., alcoholes neutros potables o etanol industrial.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Materiales y Métodos

Enzimas y levaduras utilizadas:

Alfa-Amilasa BE369 (AA369): alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilusdescrita en esta memoria como SEQ ID NO: 8, y que tiene además las mutaciones: I181* G182* N193F+ V59A+ Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V truncada a 491 aminoácidos (utilizando SEQ ID NO: 8 para la numeración).

Proteasa PfuS mostrada en SEQ ID NO: 9 en esta memoria.

Glucoamilasa X: Combinación que comprende glucoamilasa de Talaromyces emersoniidescrita como SEQ ID NO: 34 en el documento WO99/28488 (SEQ ID NO: 4 en esta memoria), glucoamilasa de Trametes cingulata descrita como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 06/69289 (SEQ ID NO: 11 en esta memoria) y alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con un enlazador de glucoamilasa de Aspergillus n igery dominio de unión a almidón (SBD), descrita en SEQ ID NO: 7 aquí, que tiene las siguientes sustituciones G128D+D143N usando la SEQ ID NO: 7 para la numeración (la relación de actividad en UAG:UAG:UFA-F es aproximadamente 29:8:1).

Levadura: Ethanol Red®

Ensayo de Trehalasa:

PRINCIPIO:

T rehalosa H²O Trehalasa > 2 Glucosa

T = 37 °C, pH = 5,7, A 340 nm, Recorrido de la luz = 1 cm

Determinación de la Tasa de Parada Espectrofotométrica

Definición de unidad:

Una unidad convertirá 1,0 mmol de trehalosa en 2,0 mmol de glucosa por minuto a pH 5,7 a 37 °C (glucosa liberada determinada a pH 7,5).

(Véase Dahlqvist, A. (1968) Analytical Biochemistry 22, 99-107)

Ensayo de trehalasa utilizado en el Ejemplo 3.

Se mezclaron diez microlitros de muestra con 190 pl de solución de sustrato (trehalosa al 1 % en acetato de sodio 50 mM, pH 4,3) y se incubó a 32 °C durante 1 hora. A continuación se extrajeron 10 pl de la solución y se añadieron 200 pl de glucosa CII test WAKO. A505 se midió después de 15 min de incubación a temperatura ambiente.

Cepas

Se construyó un sistema huésped/vector de Aspergillus oryzae mejorado equiparable al descrito en el ejemplo 5 descrito en el documento WO 2016026938A1. La mejora se realizó para reducir el tamaño del ADN transformante moviendo el casete de expresión de FLPase ubicado en la PARTE II del plásmido pDAu724 (véase la página 34, figura 7 y SEQ ID NO: 30 en el documento WO 2016026938A1) al locus de integración amy2 en el genoma de la cepa huésped. La clonación del casete de expresión FLPase en pDAu703 (documento WO 2016026938A1, página 32 y Figura 6 y SEQ ID:29) se realizó mediante la amplificación del casete de expresión FLPase de pDAu724 y la clonación entre FRT-F3 y el marcador de selección amdS de pDAu703 para dar el plásmido pDAu770. Se utilizó el mismo protocolo que se describe en el documento WO 2016026938A1, página 33, para transformar el plásmido pDAu770 linearizado en protoplastos de la cepa Jal 1338 de A. oryzae (descrito en el documento WO12160097A1). Los transformantes se seleccionaron en placas de selección AmdS para obtener la cepa Dau785. La cepa huésped recombinante resultante DAu785 tiene un locus amy2 modificado equiparable al de DAU716 (documento WO 2016026938A1) con la adición del casete de expresión de FLPase. La cepa huésped DAu785 expresa constitutivamente la recombinasa específica para el sitio FLPase, permitiendo la integración en los sitios FRT del ADN transformante, en este caso los fragmentos de PCR obtenidos mediante la reacción de PCR de Extensión Solapada que se describe más adelante. Esta cepa se utilizó para la expresión heteróloga de los polipéptidos trehalasa SEQ ID NO: 21, y SEQ ID NO: 23.

Talaromyces funiculosus NRRL 1035 se obtuvo amablemente en febrero de 1992 del Pr. Jens Frisvad (Universidad Técnica de Dinamarca, Departamento de Biotecnología y Biomedicina). T. funiculosus fue aislado originalmente por George Smith en Inglaterra en 1936. La cepa se inoculó en una placa PDA y se incubó durante 8 días a 26 °C en la oscuridad. Se inocularon varios tapones de micelio-PDA en matraces de agitación de 500 ml que contenían 100 ml de medio YPG. Los matraces de agitación se incubaron durante 5 días a 26 °C con agitación a 100 rpm para la producción de biomasa.

Talaromyces leycettanus referencia CBS 398.68 (aislada en 1968 en Inglaterra) se adquirió de CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, Paises Bajos se inoculó en una placa PDA y se incubó durante 8 días a 26 °C en la oscuridad. Se inocularon varios tapones de micelio-PDA en matraces de agitación de 500 ml que contenían 100 ml de medio YPG. Los matraces se incubaron durante 5 días a 26 °C con agitación a 100 rpm para la producción de biomasa.

Medios y Soluciones

Las placas PDA estaban compuestas por 39 g de agar de patata y dextrosa (ref. 70139) (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) y agua desionizada hasta 1000 ml. El medio se esterilizó en autoclave a 15 psi (1,03 bares) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edición, Revisión A, 1998).

LB-Bouillon estaba compuesto por 25 g de LB-Bouillon (ref. L3152) (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) y agua desionizada hasta 1000 ml. El medio se esterilizó en autoclave a 15 psi (1,03 bares) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edición, Revisión A, 1998).

El agar de LB y ampicilina estaba compuesto por 37 g de agar LB (ref. L3027) (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania), 5 g de almidón soluble, K2PO4 0,01 M, glucosa al 0,04 % y agua desionizada hasta 1000 ml. El medio se esterilizó en autoclave a 15 psi (1,03 bares) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edición, Revisión A, 1998). El medio se enfrió a 50°C y se añadió ampicilina 50 mM.

Las placas COVE-N-agar estaban compuestas por 218 g de sorbitol, 25 g de polvo de agar, 50 ml de solución salina COVE y agua desionizada hasta 1000 ml. El medio se esterilizó en autoclave a 15 psi (1,03 bares) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edición, Revisión A, 1998). El medio se enfrió a 50°C y se añadieron acetamida 10 mM y Triton X-100 (50 pl/500 ml).

Agar de sacarosa NaNO3 10 mM estaba compuesto por 342 g de sacarosa, 20 g de polvo de agar, 20 ml de solución salina COVE y agua desionizada hasta 1000 ml. El medio se esterilizó en autoclave a 15 psi (1,03 bares) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edición, Revisión A, 1998). El medio se enfrió a 50°C y se añadieron NaNO3 10 mM y Triton X-100 (50 pl/500 ml).

La solución salina COVE estaba compuesta por 26 g de MgSO4.7H2O, 26 g de KCl, 76 g de KH2PO4, 50 ml de solución de metales traza COVE y agua desionizada hasta 1000 ml. La solución se filtró en condiciones estériles.

La solución de metales traza COVE estaba compuesta por 0,04 g de Na2B4O7.10H2O, 0,4 g de CuSO4.5H2O, 1,2 g de FeSO4.7H2O, 0,7 g de MnSO4.H2O, 0,8 g de Na2MoO4.2H2O, 10 g de ZnSO4.7H2O y agua desionizada a 1000 ml. La solución se filtró en condiciones estériles.

El medio DAP4C-1 estaba compuesto por 0,5 g de extracto de levadura, 10 g de maltosa, 20 g de dextrosa, 11 g de MgSO4.7H2O, 1 g de KH2PO4, 2 g de C6H8O7.H2O, 5,2 g de K3PO4.H2O, 1 ml de Dowfax 63N10 (agente antiespumante), 2,5 g de carbonato de calcio, complementado con 0,5 ml de solución de metales traza KU6 y agua desionizada hasta 1000 ml. El medio se esterilizó en autoclave a 15 psi (1,03 bares) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edición, Revisión A, 1998). Antes de su uso, se añadieron 3,5 ml de (NH4)2HPO4 al 50 % estéril y 5 ml de ácido láctico al 20 % estéril por cada 150 ml de medio DAP4C-1.

El medio MDU-2 estaba compuesto por 45 g de maltosa, 1 g de MgSO4.7H2O, 1 g de NaCl, 2 g de K2SO4, 12 g de KH2PO4, 0,5 ml de metales traza KU6, 0,1 ml de Dowfax 63N10 (agente antiespumante) y agua desionizada hasta 1000 ml. El pH se ajustó a pH5 y el medio se esterilizó en autoclave a 15 psi (1,03 bares) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edición, Revisión A, 1998). Se añadieron 15 ml de urea filtrada en condiciones estériles al 50 % después del autoclave.

La glucosa YP2% estaba compuesta por 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona Bacto, 20 g de dextrosa y agua desionizada hasta 1000 ml. El medio se esterilizó en autoclave a 15 psi (1,03 bares) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edición, Revisión A, 1998).

La solución de metales traza KU6 estaba compuesta por 6,8 g de ZnCl2, 2,5 g de CuSO4.5H2O, 0,13 g de NiCl2, 13,9 g de FeSO4.7H2O, 8,45 g de MnSO4.H2O, 3 g de C6H8O7.H2O y agua desionizada hasta 1000 ml. La solución se filtró en condiciones estériles.

Ejemplo 1: Clonación de la secuencia de trehalasa

Secuencias de ADN de Talaromyces se amplificaron mediante PCR a partir de ADNg de Talaromyces funiculosus y Talaromyces leycettanus y se clonaron mediante PCR de extensión solapada. El plásmido pDAu724 (véase la sección de Cepas anterior) se utilizó como molde de ADN para amplificar dos productos de PCR (F1 y F3) en reacciones compuestas por 10 pl de tampón de polimerasa KAPA 5x, 1 pl de mezcla de nucleótidos KAPA PCR 10 mM, 1 pl de 10 pM de cebadores directos apropiados (SEQ ID NO: 24 para F1 y SEQ ID NO: 26 para F3), 1 pl de 10 pM de los cebadores inversos apropiados (s Eq ID NO: 25 para F1 y SEQ ID NO: 27 para F3), 1 a 10 ng de plásmido pDAu724, 1 pl de polimerasa KK2502 de KAPA Biosystems (1 unidad) y agua de calidad PCR hasta 50 pL. Las reacciones de amplificación por PCR se llevaron a cabo en un ciclador térmico de bloque dual DYAD® (MJ Research Inc., Waltham, MA, EE.UU.) programado para 2 min. a 98 °C y seguido de 35 ciclos de 10 s a 98 °C y 2 min a 72 °C y un ciclo final de 10 min a 72 °C. Se analizaron cinco pl de la reacción de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % utilizando tampón TAE donde se observaron bandas de ADN del tamaño apropiado. Las reacciones de PCR restantes se purificaron utilizando un kit de purificación de bandas de gel y ADN de PCR ILLUSTRA™ GFX™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las reacciones de PCR de extensión solapada para clonar genes de trehalasa amplificados de Talaromyces funiculosus y Talaromyces leycettanus respectivamente estaban compuestos de 10 pl de tampón de polimerasa KAPA (5X), 1 pl de mezcla de nucleótidos KAPA PCR 10 mM, 50 ng de fragmento F1 de PCR y cantidades equimolares de fragmento de PCR F3 y genes de trehalasa que codifican SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23, 1 pl de polimerasa KK2502 de KAPA Biosystems (1 unidad) y agua de calidad PCR hasta 48 pL. Las reacciones se incubaron en un termociclador de bloque dual DYAD® (MJ Research Inc., Waltham, MA, EE.UU.) utilizando un programa compuesto por 2 min a 98 °C, seguido de 5 ciclos cada uno compuesto de 10 s a 98 °C, 30 s a 68 °C y 5 min a 72 °C y completado por una extensión final de 8 min a 72 °C. Durante las reacciones de PCR de extensión solapada, la reasociación entre el fragmento F1 y los genes de trehalasa que codifican SEQ ID NO: 21, y SEQ ID NO: 23 se aseguró mediante la secuencia de solapamiento SEQ ID NO: 28 incluida en los cebadores de clonación directa (SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 30). La reasociación entre el fragmento F3 y los genes de trehalasa que codifican SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 se aseguró mediante la secuencia de solapamiento SEQ ID NO: 29 incluida en los cebadores de clonación inversa (SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 32). Se añadió un pl de cebador 10 pM SEQ ID NO: 24 y 1 pl de cebador 10 pM SEQ ID NO: 27 a las reacciones de PCR de Extensión Solapada después de los cinco ciclos iniciales y las reacciones se incubaron por segunda vez en un termociclador de bloque dual DYAD® (MJ Research Inc., Waltham, MA, EE.UU.) utilizando un programa compuesto por 2 min a 98 °C; seguido de 25 ciclos cada uno compuesto de 10 s a 98 °C, y 4 min a 72 °C y completado por una extensión final de 10 min a 72 °C. Las reacciones de PCR dieron como resultado dos productos: SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22. Se analizaron cinco pl de las reacciones PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % utilizando tampón TAE, en que se observaron bandas de ADN del tamaño apropiado. Las reacciones PCR restantes se concentraron hasta 20 pl calentando los tubos a 60 °C. Diez pl de esas reacciones se utilizaron para la transformación de protoplastos de Aspergillus oryzae DAu785.

Ejemplo 2: Expresión heteróloga de trehalasas

Se prepararon protoplastos de la cepa DAu785 de Aspergillus oryzae de acuerdo con el documento WO 95/002043. Se mezclaron 100 pl de protoplastos de A. oryzae con 10 pl de PCR de extensión solapada concentrada al alza que codifica polipéptido de trehalasa de Talaromyces funiculosus, y Talaromyces leycettanus (aminoácidos 19-1038 de SEQ ID NO: 21 y los aminoácidos 21-1089 de SEQ ID NO: 23) y 270 pl de PEG 4000 al 60 % (Applichem, Darmstadt, Alemania) (polietilenglicol, peso molecular 4000), CaCl2 10 mM y Tris-HCl 10 mM pH 7,5 y se mezcla suavemente. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 minutos y los protoplastos se extendieron sobre placas de agar de sacarosa que contenían NaNO3 10 mM. Después de la incubación durante 4-7 días a 37 °C, se inocularon esporas de ocho colonias en medio MDU-2 en una placa de microtitulación PS de 96 pocillos X50 de ThermoFisher (Life Technologies Europe BV, N^rum, Dinamarca) y se cubrieron con cinta semipermeable. Después de 4 días de incubación estática a 30 °C, los caldos de cultivo se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio para identificar las colonias que producían la mayor cantidad de polipéptidos de trehalasa. Las esporas del mejor transformante se extendieron sobre placas de agar de sacarosa que contenían TRITON® X-100 al 0,01 % y NaNO3 10 mM para aislar colonias individuales. La extensión se repitió dos veces.

Ejemplo 3: Caracterización de trehalasas de la invención

Purificación

La purificación de las enzimas trehalasa se llevó a cabo mediante dos etapas, columna de desalinización y columna de cromatografía de intercambio catiónico. Finalmente, la muestra se dializó frente a 10 L de tampón de acetato de sodio 20 mM (pH 4,0) utilizando una membrana de diálisis de MWCO (corte de peso molecular) de 12k - 14k y luego se concentró utilizando una unidad de filtro centrífugo de MWCO de 30k.

Determinación de termoestabilidad (TSA)

La enzima purificada se diluyó a 0,5 mg/ml con tampón acetato de sodio 50 mM (pH 4,5) y se mezcló con un volumen igual de SYPRO Orange (Invitrogen) diluido con agua Milli-Q. Se transfirieron dieciocho microlitros de solución de mezcla a una Placa de 384 Multipocillos LightCycler 480 (Roche Diagnostics) y se selló la placa.

Parámetros del equipo de TSA:

Aparato: LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science)

Velocidad de escaneo: 0,02°C/s.

Intervalo de barrido: 37 - 96°C

Tiempo de integración: 1,0 s

Longitud de onda de excitación 465 nm

Longitud de onda de emisión 580 nm

La señal de fluorescencia obtenida se normalizó en un intervalo de 0 y 1. La temperatura de desnaturalización (Td) se definió como la temperatura a la que el valor normalizado está más próximo a 0,5.

La temperatura a la que la intensidad máxima de la señal (el valor normalizado es 1) se definió como Td2 y se utilizó para un índice de termoestabilidad de las variantes M-tre PE.

Ensayo de trehalasa

Se mezclaron diez microlitros de muestra con 190 gl de solución de sustrato (trehalosa al 1 % en acetato de sodio 50 mM, pH 4,3) y se incubó a 32 °C durante 1 hora. A continuación se extrajeron 10 gl de la solución y se añadieron 200 gl de glucosa CII test WAKO. A505 se midió después de 15 min de incubación a temperatura ambiente.

Cultivo de SF para la preparación de cócteles de proteasa

Cepas de Aspergillus niger utilizadas para preparar el cóctel de proteasas son derivados de NN059095, que fue aislado por Novozymes y modificado genéticamente para alterar la expresión de las actividades de amiloglucosidasa de Aspergillus niger NN049184 aislado del suelo.

Se inocularon esporas de cepas de Aspergillus niger en 100 ml de medio MLC y se cultivaron a 30 °C durante 2 días. Se inocularon 10 ml de MLC en 100 ml de medio MU-1 y se cultivaron a 30 °C durante 7 días. El sobrenadante se obtuvo por centrifugación.

MLC se compone de 40 g de glucosa, 50 g de polvo de soja, 4 g de ácido cítrico (pH 5) y agua hasta 1 litro.

MU-1 -glu se compone de 260 g de glucosa, 3 g de MgSO4-7H2O, 5 g de KH² PO⁴ , 6 g de K²SO⁴ , 0,5 ml de solución de metales traza y 2 g de urea (pH 4,5) y agua hasta 1 litro.

La solución de metales traza está compuesta por ^{6 , 8} g de ZnCl² -⁷ H²O, 2,5 g de CuSO⁴-⁵ H²O, 0,24 g de NiCl² -⁶ H²O, 13,9 g de FeSO⁴ -⁷ H²O, 13,5 g de MnSO⁴ -H²O y 3 g de ácido cítrico y agua hasta 1 litro.

Ensayo de estabilidad de proteasa

La enzima purificada se diluyó a 2 mg/ml con tampón acetato de sodio 50 mM, pH 4,0, y 100 gl de la muestra se mezclaron con 100 gl del cóctel de proteasa preparado. A continuación, la solución se incubó a -20, 4, 30 y 40 °C durante 3 días y la actividad residual se midió mediante el ensayo de trehalasa.

Resultados

Ejemplo 4: Termoestabilidad de las trehalasas de acuerdo con la invención en comparación con dos trehalasas de la técnica anterior

Termoestabilidad de las trehalasas de la invención, descritas en esta memoria como SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23, en comparación con dos trehalsas de la técnica anterior; una de Talaromyces cellulolyticus (SEQ ID NO: 34) (Fujii T, Hoshino T, Inoue H, Yano S. 2014. Taxonomic revision of the cellulose-degrading fungus Acremonium cellulolyticus nomen nudum to Talaromyces based on phylogenetic analysis. FEMS Microbiology Letters. 351: 32-41) y una de Talaromyces verruculosus (SEQ ID NO: 35) (publicado en 2015 como parte de una secuencia genómica en www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA 001305275.1; polipéptido identificado como EFP5BRM8N). La termoestabilidad se midió como temperatura de desnaturalización utilizando un ensayo de desplazamiento térmico (TSA).

Muestras

Cultivo de cepas

Se inocularon trozos de agar de una cepa cultivada en placa de agar COVE N-gly durante 1 semana a 30 °C en 100 ml de MS9 en un matraz de agitación de 500 ml y se cultivó a 30 °C durante 1 día con agitación a 220 rpm. Se transfirieron tres ml del cultivo de siembra a 100 ml de MDU-2BP-FuPE en un matraz de agitación de 500 ml y se cultivó a 30 °C durante 3 días con agitación a 220 rpm. El sobrenadante del cultivo se filtró con un filtro de acetato de celulosa de 0,2 pm. Los componentes de los medios se describen a continuación.

Agar COVE Ngly

218 g/L de sorbitol, 10 g/L de glicerol, 2,02 g/L de nitrato de potasio, 50 ml/L de solución salina para COVE, pH 5,3 Solución salina para COVE

26 g/L de cloruro de potasio, 26 g/L de sulfato de magnesio heptahidrato, 76 g/L de dihidrogenofosfato de potasio, 50 ml/L de solución de metales traza para COVE

Solución de metales traza para COVE

0,04 g/L de tetraborato de sodio decahidrato, 0,4 g/L de sulfato de cobre (II) pentahidrato, 1,2 g/L de sulfato de hierro (II) heptahidrato, 1 g/L de sulfato de manganeso (II) pentahidrato, 0,8 g/L de molibdato de sodio dihidrato, 10 g/L de sulfato de zinc heptahidrato

MS9

30 g/L de polvo de soja, 20 g/L de glicerol

MDU-2BP FuPE

45 g/L de maltodextrina, 7 g/L de extracto de levadura, 1 g/L de sulfato de magnesio heptahidrato, 1 g/L de cloruro de sodio, 2 g/L de sulfato de potasio, 0,75 g/L de cloruro de amonio, 12 g/L de dihidrogenofosfato de potasio, 0,5 ml/L de solución de metales traza para AMG (MU-1)

Solución de metales traza para AMG (MU-1)

1,39 % de sulfato de hierro (II) heptahidrato, 1,356 % de sulfato de manganeso (II) pentahidrato, 0,68 % de cloruro de zinc, 0,25 % de sulfato de cobre (II) pentahidrato, 0,024 g/L de cloruro de níquel (II) hexahidrato, 0,3 % de ácido cítrico Purificación

La purificación de trehalasas WT se llevó a cabo mediante dos etapas, columna de desalinización y columna de cromatografía de intercambio catiónico. Finalmente, la muestra se dializó frente a 10 L de tampón acetato de sodio 20 mM (pH 4,0) utilizando una membrana de diálisis de MWCO de 12k - 14k y luego se concentró utilizando una unidad de filtro centrífugo de MWCO de 30k.

Determinación de termoestabilidad (TSA)

La enzima purificada se diluyó a 0,5 mg/ml con tampón acetato de sodio 50 mM (pH 4,5) y se mezcló con un volumen igual de SYPRO Orange (Invitrogen) diluido con agua Milli-Q. Se transfirieron dieciocho microlitros de solución de mezcla a una Placa de 384 Multipocillos LightCycler 480 (Roche Diagnostics) y se selló la placa.

Parámetros del equipo de TSA

Aparato: LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science)

Velocidad de escaneo: 0,02°C/s.

intervalo de barrido: 37 - 96°C

Tiempo de integración: 1,0 s

Longitud de onda de excitación 465 nm

Longitud de onda de emisión 580 nm

La señal de fluorescencia obtenida se normalizó en un intervalo de 0 y 1. La temperatura de desnaturalización (Td) se definió como la temperatura a la que el valor normalizado está más próximo a 0,5. Las Td se enumeran en la TABLA 1.

TABLA 1 Lista de Td

Ejemplo 5: Uso de Tf-trehalasa de la invención en un procedimiento para producir etanol.

Enzimas y levaduras utilizadas:

Alfa-Amilasa BE369 (AA369): alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus descrita aquí como SEQ ID NO: 8, y que tiene además las mutaciones: I181* G182* N193F+ V59A+ Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V truncada a 491 aminoácidos (utilizando SEQ ID NO: 8 para la numeración).

Proteasa PfuS mostrada en SEQ ID NO: 9 aquí.

Glucoamilasa X: Combinación que comprende glucoamilasa de Talaromyces emersoniidescrita como SEQ ID NO: 34 en el documento WO99/28488 (SEQ ID NO: 4 en esta memoria), glucoamilasa de Trametes cingulata descrita como SEQ ID NO: 2 en el documento W o 06/69289 (SEQ ID NO: 11 en esta memoria) y alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con un enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y dominio de unión a almidón (SBD), descrita en SEQ ID NO: 7 aquí, que tiene las siguientes sustituciones G128D+D143N usando la SEQ ID NO: 7 para la numeración (la relación de actividad en UAG:UAG:FAU-F es alrededor de 29:8:1).

Levadura: Ethanol Red®

La capacidad de la trehalasa para reducir la trehalosa se evaluó ejecutando una sacarificación y fermentación (SSF) utilizando la combinación X de glucoamilasa sola o con la adición de trehalasa Ms o Tf. La dosis de Ms trehalasa se fijó en 1 pg de proteína enzimática (EP) por gramo de sólidos secos (DS), mientras que se utilizaron tres dosis de trehalosa Tf para la comparación (0,6, 0,7 y 0,8 ug de EP/g de DS). La mezcla de glucoamilasa X se dosificó a 0,6 UAG/g de DS y de acuerdo con el siguiente cálculo. Se utilizaron dos macerados de plantas (almidón de maíz licuado utilizando alfa-amilasa BE369 o BE369 y proteasa PfuS). El macerado 1 representó BE369 PfuS y el macerado 2 representó macerado BE369. Para el macerado 1, BE369 y PfuS se dosificaron a 2,3 pg de EP/g de DS y 2,6 pg de EP/g de DS, respectivamente. Para el macerado 2 BE369 la dosis fue de 2,81 pg de EP/g de DS. La dosis de urea para macerado 1 y macerado 2 fue de 400 ppm y 1000 ppm, respectivamente.

T l 2: Tr mi n nzim i n F m r l n in ri l

Las combinaciones se evaluaron en una SSF utilizando dos macerados de maíz de planta industrial licuados macerado 1 y macerado 2. Los macerados se complementaron con 3 ppm de penicilina. La cantidad de urea añadida al macerado 1 y al macerado 2 fue de 400 ppm y 1000 ppm, respectivamente. El pH de ambos macerados de plantas se ajustó a pH 5,1 utilizando H²SO⁴ al 40% antes de dispensar el macerado a los matraces. Se añadieron aproximadamente 60 g (55 ± 0,03) de macerado a cada 125 mL y se procesaron por duplicado. Matraz Erlenmeyer desechable Corning que tenía un orificio de 0,048" (0,12 cm) en la tapa para ventilación. Cada uno de los matraces se dosificó con enzimas de acuerdo con la Tabla 2 y 1,2 mL de levadura roja de etanol rehidratada. El rojo de etanol se rehidrató resuspendiendo 5,5 g de levadura con 100 mL de agua del grifo y se incubó a 32 °C durante 30-40 min. Los matraces se incubaron durante un total de 52 h a 32 °C mientras se agitaban a 120 rpm. Las muestras se recogieron a las 52 h. Las muestras recogidas se prepararon para HPLC eliminando aproximadamente 4 gramos de muestra de fermentación y se mezcló con 40 uL de H²SO⁴ al 40 %. La mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 3500 x g, y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de nailon Whatman de 0,2 pM. Las muestras filtradas se analizaron en un HPLC Agilent serie 1100/1200 con el software Chemstation. Las muestras se separaron en la columna de exclusión de iones Bio-Rad HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) con un cartucho protector de cationes H. La fase móvil, H²SO⁴5 mM, se procesó a razón de 0,8 ml/min a 65 °C y la temperatura del detector RI se fijó en 55 °C. El método cuantifica varios analitos utilizando patrones de calibración (calibración de 4 puntos con cero forzado) para dextrinas (DP4+), maltotriosa (DP3), maltosa (DP2), glucosa (DP1), fructosa, ácido acético, ácido láctico, glicerol y etanol. Los resultados de HPLC en etanol, DP2 (maltosa) se muestran en la Tabla 3. Se analizó DP2, ya que este azúcar también contiene trehalosa. Además del análisis por HPLC, también se analizaron muestras filtradas de solo macerado 1 en una cromatografía iónica (IC) Dionex ICS-3000 utilizando el software Chromeleon 5 para separar la trehalosa de otros azúcares DP2 (tales como isomaltosa, maltosa y celobiosa). Las muestras se separaron utilizando la columna Carbopack PA1. La fase móvil fue agua, NaOH 0.2 M, acetato de sodio 1 M y el caudal fue de 1 mL/min y tanto la columna como el detector (detector PAD con electrodo de oro desechable) estaban a 30 °C. La IC se ejecutó durante 65 minutos y el nivel de trehalosa se informó en la Tabla 4. La Tf-trehalasa tiene un rendimiento ligeramente mejor que la Ms-trehalasa, ya que 0,6-0,8 ug de EP de Tf tenían un nivel similar de DP2 después de SSF durante 52 h. Sin adición alguna de trehalasa, quedaba una cantidad significativa de DP2 al final de la fermentación. Los niveles de etanol se compararon entre los tratamientos Ms- y Tf-trehalasa en ambos macerados vegetales y no hubo significancia estadística entre ellos. Por lo tanto, la Tf-trehalasa, con una dosis de proteína entre un 20 % y un 40 % más baja con relación a la Ms-trehalasa, tiene un rendimiento de aplicación similar al de la Ms-trehalasa en SSF utilizando dos tipos diferentes de macerados vegetales.

Tabla 3: Niveles de etanol DP2 después de SSF en dos macerados ve etales durante 52 h

Tabla 4 Niveles de trehalasa después de SSF en dos macerados ve etales durante 52 h

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que tiene actividad de trehalasa, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 21;

(b) un fragmento del polipéptido de (a) que tiene actividad trehalasa; y

en donde el polipéptido tiene una temperatura de desnaturalización térmica, Td, de al menos 63 °C cuando se determina por ensayo de desplazamiento térmico.

2. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 1.

3. Una formulación de caldo completo o una composición de cultivo celular que comprende el polipéptido de la reivindicación 1.

4. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

5. Una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4 enlazado operativamente a una o más secuencias de control heterólogas que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

6. Una célula huésped recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. La célula huésped recombinante de la reivindicación 6, en donde la célula es una célula de levadura, particularmente una célula de Candida, tal como una célula de.

8. La célula recombinante de la reivindicación 7, que es Saccharomyces cerevisiae.

9. Un método para producir un polipéptido que tiene actividad de trehalasa de la reivindicación 1, que comprende cultivar la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en condiciones propicias para la producción del polipéptido.

10. Un procedimiento para producir un producto de fermentación, que comprende

(a) licuar un material que contiene almidón con una alfa-amilasa;

opcionalmente pre-sacarificar el material licuado antes de la etapa (b);

(b) sacarificar el material licuado;

(c) fermentar utilizando un organismo de fermentación;

en donde

i) una glucoamilasa;

ii) una trehalasa de la reivindicación 1;

iii) opcionalmente una composición de enzima celulolítica y/o una proteasa;

están presentes y/o se añaden durante

- la etapa de sacarificación (b);

- la etapa de fermentación (c);

- la sacarificación y fermentación simultáneas;

- opcionalmente la etapa de presacarificación antes de la etapa (b).

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que una alfa-amilasa está presente y/o se añade durante la etapa de sacarificación (b); etapa de fermentación (c); sacarificación y fermentación simultáneas; o la etapa de presacarificación opcional antes de la etapa (b).

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en el que la alfa-amilasa se deriva de un Rhizomucor pusillus, en particular con un enlazador de glucoamilasa de Aspergillus n igery un dominio de unión a almidón (SBD), preferiblemente el descrito como SEQ ID NO: 7 en esta memoria, preferiblemente con una o más de las siguientes sustituciones: G128D, D143N, preferiblemente G128D D143N (utilizando SEQ ID NO: 7 para la numeración), y en donde la variante de alfa-amilasa tiene tiene al menos un 60 % de identidad, tal como al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 % de identidad, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, lo más preferiblemente al menos un 94 % e incluso lo más preferiblemente al menos un 95 %, tal como incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, pero menos de 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO: 7 en esta memoria.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que el organismo de fermentación se deriva de una cepa de Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae.

14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que el organismo fermentador de levaduras expresa la trehalasa de acuerdo con la reivindicación 1.

15. Un procedimiento para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende:

(i) sacarificar un material que contiene almidón a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial; y

(ii) fermentar utilizando un organismo de la fermentación;

en donde la sacarificación y/o fermentación se realiza en presencia de las siguientes enzimas: glucoamilasa, alfaamilasa, trehalasa de la reivindicación 1 y, opcionalmente, una composición de proteasa y/o enzima celulolítica.