JP2000501294A

JP2000501294A - アスペルギラス・オリザイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）の５―アミノレブリン酸シンターゼおよびそれをコードする核酸

Info

Publication number: JP2000501294A
Application number: JP10501730A
Authority: JP
Inventors: エル．エルロッド，スーザン; アール．チェリー，ジョエル
Original assignee: ノボノルディスクバイオテック，インコーポレイティド
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 2000-02-08
Also published as: WO1997047736A1; EP0904356A1; DK0904356T3; DE69734828T2; ATE312169T1; CN1110554C; DE69734828D1; CN1215428A; US5871991A; EP0904356B1; US5958747A; AU3382097A

Abstract

(57)【要約】本発明は、アスペルギラス・オリザイ(Aspergillus oryzae)の５-アミノレブリン酸シンターゼ、およびこの５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列を含んでいる単離された核酸断片、並びに、この核酸配列を含んでいる核酸構成体、べクターおよび組み換え宿主細胞に関する。本発明はまた、この５-アミノレブリン酸シンターゼを生産する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】アスペルギラス・オリザイ(Aspergillus oryzae)の５-アミノレブリン酸シンターゼおよびそれをコードする核酸発明の背景発明の分野本発明は、アスペルギラス・オリザイ(Aspergillus oryzae)の5-アミノレブリン酸シンターゼ（５-aminolevulinic acid synthase）および、この５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列を含んでいる単離された核酸断片に関する。本発明はまた、この核酸配列を含んでいる核酸構成体、ベクターおよび宿主細胞に関する。同様に、５-アミノレブリン酸シンターゼを生産する方法にも関する。関連技術ヘムは、プロトポルフィリンIXと鉄とのキレート複合体であり、へムタンパク質の補欠分子族として働く。プロトポルフィリンIXは、４つのメチル基、２つのビニル基、および２つのプロピオン酸基によって置換されたポルフィリン環からなり、鉄原子を獲得してヘムを形成する。グリシンとサクシニルCoAからのヘムの生合成には、８つの酵素反応ステップが関係している。この生合成経路の最初の酵素が５-アミノレブリン酸シンターゼで、グリシンとサクシニルCoAとの縮合を触媒し、５-アミノレブリン酸を形成する。肝細胞と分化中の赤血球におけるヘムの生合成にとって、５-アミノレブリン酸シンターゼは、カギとなる調節酵素である。アポタンパク質からヘムタンパク質への変換は、ヘム生合成経路から供給されるヘムの利用度に依存している。ヘムタンパク質のアポタンパク質型は、ヘムと結合して活性型ヘムタンパク質となる。活性型ヘムタンパク質は、アポタンパク質に比べると、タンパク質分解に対してより安定な構造を獲得する。微生物が生産するヘムの量が、生産されるアポタンパク質の量に比較して少ない場合は、そのアポタンパク質が集積し、タンパク質分解を受け、活性ヘムタンパク質の収量が下がる。この問題を克服するために、Jensenは、ヘムまたはヘム含有物質を発酵培地に加えることによって、アスペルギラス・オリザイが生産するぺルオキシダーゼの収量が有意に増加することを示した（WO93/19195）。発酵培地へのへムの補給は、ヘムタンパク質の収量を有意に改善するが、大規模に実施するのは適切ではなく、費用がかさみ、そして困難である。アスペルギラス・ニデュランス(A．nidulans)の５-アミノレブリン酸シンターゼのクローニングと配列決定が開示されている（Bradshaw et al.，1993，Curre nt Genetics 2233:501-507）。本発明の目的は、新しい５-アミノレブリン酸シンターゼおよびそれをコードする遺伝子を提供することである。発明の概要本発明は、アスペルギラス・オリザイから得られる実質上純粋な5-アミノレブリン酸シンターゼ、および、このアスペルギラス・オリザイの5-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列を含んでいる単離された核酸断片に関する。さらに本発明は、本発明のこの核酸断片を含んでいる核酸構成体、ベクターおよび組換え宿主細胞、ならびに５-アミノレブリン酸シンターゼを生産する方法を提供する。図の簡単な説明図１は、プラスミドpSE04の制限酵素地図を示す。図２は、アスペルギラス・オリザイの５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を含む4.2kbゲノム断片の制限酵素地図を示す。キロ塩基目盛（ｋｂ）は地図の下に示す。矢印は、遺伝子のオープンリーディングフレームの位置を示す。図３は、アスペルギラス・オリザイの５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子の塩基配列および推定されるアミノ酸配列を示す（各、配列番号１および２）。潜在的に重要な転写部位であるCCAATボックスおよびTATAボックスを下線で示す。２つの保存された推定のヘム調節モチーフ(HRM)を四角で囲む。ピリドキサールリン酸補因子の結合に関与するグリシンループを丸で囲み、そして重要なリシンを星印で示す。図４は、種々の５-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子における、保存されたヘム調節モチーフ(HRM)を示す。このぺンタペプチドモチーフを四角で囲む。図５は、アスペルギラス・オリザイ、アスペルギラス・ニデュランス、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびヒト赤血球（各、配列番号２、16、17および18）の５-アミノレブリン酸シンターゼの推定アミノ酸配列のアライメントを示す。保存されているアミノ酸を四角で示す。図６は、プラスミドpBANe6の制限酵素地図を示す。図７は、プラスミドpSE31の制限酵素地図を示す。図８は、プラスミドpJVi９の作成を示す。図９は、プラスミドpJeRS6の制限酵素地図を示す。図10は、プラスミドpJRoC50の制限酵素地図を示す。発明の詳細な説明前述したように、本発明は、アスペルギラス・オリザイ株から得られる５-アミノレブリン酸シンターゼに関する。この種の菌株は、いくつかの培養コレクション、例えば、the American Type Culture Collection（ATCC），Deutsche Sam mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM），Centraalbureau V oor Schimmelcultures（CBS），International Mycological Institute（IMI），Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regi onal Research Center（NRRL），およびInstitute for Fermentation in 0saka ，Japan（IF0）から容易に入手できる。好ましい例では、本発明は、アスペルギラス・オリザイまたはその変異株から得られる５-アミノレブリン酸シンターゼに関する。より好ましい例では、本発明は、アスペルギラス・オリザイIFO 4177またはその変異株から得られる５-アミノレブリン酸シンターゼ、例えば配列番号２に示したアミノ酸配列を有する５ -アミノレブリン酸シンターゼ、に関する。本発明はまた、高ストリンジェントな条件（すなわち、５ X SSPE、0.3% SDS 、200μg/ml分断変性サケ精子DNA、および50%ホルムアミド中、45℃でプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションする）で配列番号１に示した核酸配列にハイブリダイズするプローブを用いて、同条件でハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされる５-アミノレブリン酸シンターゼに関する。この遺伝子、またはこれに基づくオリゴヌクレオチドは、アスペルギラス属のいずれかの種の相同遺伝子を単離するために、サザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いることができる。特にこれらのプローブを用いて、注目する種の相当する５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を同定および単離するために、その種のゲノムまたはcDNAのハイブリダイゼーション、続いて標準的なサザンブロットを行うことができる。PCR用の縮重したプライマー（オリゴヌクレオチド）を用いて、ゲノムDNAまたはcDNA部分から、5-アミノレブリン酸シンターゼ特異的な遺伝子部分を増幅することができる。公に入手可能なアスペルギラス属の菌株を用いて、本例に記載された方法を利用して、本明細書に明記した例以外の起源から５-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を同定および単離することができる。本発明の目的において、「から得られる」という用語は、特定の起源、例えばアスペルギラス属の菌株か、または、その起源の５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする遺伝子が挿入された細胞によって、５-アミノレブリン酸シンターゼが生産されることを意味する。本発明はまた、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも約80%、好ましくは約85%、より好ましくは約90%、そして最も好ましくは約95%の相同性を有し、且つ本明細書に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼと質的に同じ活性を保持する５-アミノレブリン酸シンターゼの変異体を含む。本発明はまた、配列番号２に示したアミノ酸配列に比べて、３アミノ酸、好ましくは２アミノ酸、そしてより好ましくは１アミノ酸相違するアミノ酸配列を有する５- アミノレブリン酸シンターゼの変異体にも向けられている。各相違は、アミノ酸の挿入もしくは除去であるか、または異なるアミノ酸によるアミノ酸残基置換であってよい。上に定義したカテゴリーに含まれる有用な変異体には、例えば、タンパク質活性に有意な影響を与えない保存的なアミノ酸置換が成された変異体が含まれる。保存的置換とは、あるクラスのアミノ酸が、それと同じクラスの他のいかなるアミノ酸によっても置換され得ることを意味する。例えば、非極性脂肪性残基、Ala、Val、LeuおよびIleは交換可能で、塩基性残基LysおよびA rg、または酸性残基AspおよびGluも交換して良い。同様に、SerおよびThrは互いに保存的置換でき、AsnおよびGlnも同様である。本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼの物理化学的性質は、当業界に周知な種々な技法、限定しないが、例えばSDS-PAGE、等電点電気泳動、および免疫交差同定テスト(cross-reaction immunoidentity test)を用いて決定してよい。本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼは、当業界に既知の方法によって測定してよい。本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼは、当業界に既知な種々な方法、限定しないが、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、調製的等電点電気泳動）、分画的溶解(differential solubility)（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、または抽出を用いて精製してよい（例えば、Protei n Purification，eds．J.-C．Janson and Lars Ryden，VCH Publishers，New Yo rk，1989を参照する）。ここで定義するように、「実質上純粋な」５-アミノレブリン酸シンターゼとは、５-アミノレブリン酸シンターゼでない他のタンパク質が本質的に含まれていない５-アミノレブリン酸シンターゼのことで、例えば、SDS-PAGEで決定した場合、少なくとも純度約20%、好ましくは純度約40%、より好ましくは純度約60%、さらに好ましくは純度約80%、最も好ましくは純度約90% 、そしてさらに最も好ましくは、少なくとも純度約95%の場合である。本発明はまた、本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列を含んでいる核酸断片、および本発明の核酸断片を含んでいる核酸構成体に関する。好ましい実施例では、核酸配列は、アスペルギラス・オリザイから得られる５ -アミノレブリン酸シンターゼをコードする。より好ましい実施例では、核酸配列は、アスペルギラス・オリザイIFO 4177から得られる５-アミノレブリン酸シンターゼをコードするもので、例えば配列番号１に示した核酸配列である。本発明はまた、配列番号２に示したアミノ酸配列を有する５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列で、遺伝子コードの縮重によって配列番号１とは相違している核酸配列を含む。本発明の核酸配列は、本明細書に記載されたゲノム配列、並びにそれに対応するcDNAおよびRNA配列を含み、本明細書で使われている「核酸配列」という語句は、合成DNAを含む全てのこの様な種類の配列を意味している。本発明はまた、本発明の核酸断片を含んでいる核酸構成体に関する。一般に「核酸構成体」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかで、天然の遺伝子から単離された核酸分子を意味するか、または、自然には存在しない様に結合および並置された核酸部分を含む様に修飾された核酸分子を意味する。好ましい例では、核酸構成体は、適当な発現宿主において、５-アミノレブリン酸シンターゼの発現を指令することができる調節領域に作用可能に連結されている。本発明はまた、本発明の核酸構成体を含む組換えベクターを提供する。好ましい実施例では、核酸配列はプロモーター配列に作用可能に連結されている。別の好ましい実施例では、本発明のベクターはさらに、転写停止シグナルおよび/または選択マーカーを含む。本発明の組換えベクターは、アスペルギラス・オリザイの活性型5-アミノレブリン酸シンターゼを遺伝子発現させるために有用である。有用なベクターは、ベクターが宿主細胞ゲノムヘ安定に組込まれる様にする要素か、またはべクターが宿主細胞のゲノムとは独立に宿主細胞中で自律複製できる様にする要素、および好ましくは、形質転換された宿主細胞を簡単に選択できる様にする一つまたは複数の表現型マーカーを含む。べクターはまた、プロモーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルなどの調節配列および、任意には選択マーカーまたは種々のアクチベーター配列もしくはリプレッサー配列を含んでもよい。発現したタンパク質が分泌される様にするために、シグナル配列をコードする核酸を、本遺伝子のコード配列の前に挿入してよい。調節配列の指令下に発現させるためには、本発明で用いられる５-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を作用可能に調節配列に連結し、この様にして調節配列に合致する条件下にコード配列を発現させる。本発明の核酸構成体を保持するべクターは、組換えDNA技法で便利に操作できるいかなるべクターであってもよい。べクターの選択は、典型的には、べクターを導入する宿主細胞に依存する。ベクターは、自律的に複製するべクター、すなわち、染色体外に存在し、染色体複製から独立して複製するべクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入した場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そして組み込まれた染色体とともに複製するべクターであってもよい。べクター系は、単一のべクターもしくはプラスミドであるか、または、合計するとゲノムに組み込まれるべきDNAをすべて含む、２つ以上のベクターもしくはプラスミドであってもよい。ベクターにおいては、DNA配列は、適当なプロモータ配列に作用可能に連結されるべきである。そのプロモーターは、選択した宿主細胞で転写活性を示すいかなるDNA配列でもよく、そして宿主細胞に固有であるかまたは異種性であるタンパク質をコードする遺伝子から得ることができる。本発明の核酸構成体の転写を指令する適当なプロモーターは、特に細菌宿主においては、例えば、大腸菌のlac オペロンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリコロ(Streptomyces coelicolor)のアガラーゼ遺伝子dagAのプロモーター、バチラス・リシェニフォルミス(B．licheniformis)のα −アミラーゼ遺伝子(amyL)のプロモーター、バチラス・ステアロサーモフィラス (B．stearothermophilus)のマルトジェニックアミラーゼ遺伝子(amyM)のプロモーター、バチルス・アミロリクエフェイシェンス（B．amyloliquefaciens）のα アミラーゼ遺伝子(amyQ)のプロモーター、バチルス・サブチリス(B．subtilis) のxylAおよびxylB遺伝子のプロモーター、原核生物のβラクタマーゼのプロモーター(Villa-Kamaroff et al.,1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731)またはtacプロモーター(DeBoer et al.，1983，Pro ceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)である。さらにプロモーターは、“Useful proteins from recombinant bacteria”Scientifi c American，1980，242: 74-94;およびSambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor，New York，1989に記載されている。酵母宿主では、有用なプロモーターは、eno-１プロモーターである。真菌宿主では、転写のために有用なプロモーターは、例えば、アスペルギラス・オリザイのTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)のアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー(A．niger)の中性αアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーの酸に安定なαアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーもしくはアスペルギラス・アワモリ(A．awamori)のグルコアミラーゼ(gla A)、リゾムコール・ミーヘイのリパーゼ、アスペルギラス・オリザイのアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギラス・オリザイのトリオースリン酸イソメラーゼ、またはアスペルギラス・ニデュランスのアセトアミダーゼ、をコードする遺伝子から得られたプロモーターである。特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2-tpi（アスペルギラス・ニガーの中性αアミラーゼおよびアスペルギラス・オリザイのトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子のプロモーターのハイブリッド）、およびgl aAのプロモーターである。本発明のベクターはまた、適当な転写ターミネーター、および真核生物ではポリアデニル化配列を含んでよく、これらは、本発明の5-アミノレブリン酸シンターゼをコードするDNA配列に作用可能に連結される。停止配列およびポリアデニル化配列は、プロモーターの場合と同じ起源から得ることかできる。べクターはさらに、そのベクターが該当の宿主細胞中で複製できる様にするDNA配列を含んでよい。その様な配列の例は、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pA MB1、およびpIJ702の複製起点である。本発明のベクターは、好ましくは、形質転換細胞を容易に選択できる様にする、１つまたは複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、殺生物剤耐性、ウイルス耐性、重金属耐性、および原栄養体から栄養要求体への変換などを付与する産物の遺伝子である。選択マーカーは、限定しないが、amdS，pyrG，argB，niaD ，sC，trpC,bar,およびhygBからなる群から選択してよい。アスペルギラス属の細胞で用いるには、アスペルギラス・ニデュランスまたはアスぺルギラス・オリザイのamdSおよびpyrGマーカー、ならびにストレプトミセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)のbarマーカーが好ましい。さらに、W091/1724 3に記載のように、選択マーカーが別のべクター中にあり、同時形質転換することによって選択してもよい。好ましくは、本発明のべクターはまた、シグナルペプチドのコード領域を含み、コードされているアミノ酸配列は本ヘム生合成酵素のアミノ末端に連結されて、この５-アミノレブリン酸シンターゼを特定の細胞内部位に局在化できる様にする。シグナルペプチドのコード領域は、５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする第一の核酸配列に固有であってもよいし、または外来の起源から得てもよい。第一の核酸配列のコード配列の５'末端は、局在化している５-アミノレブリン酸シンターゼをコードするコード領域部分に翻訳枠内で天然に連結されているシグナルペプチドのコード領域を、元々含んでいてもよい。あるいは、このコード配列の５'末端は、この局在化しているヘム生合成酵素をコードするコード配列部分に対して外来的であるシグナルペプチドのコード領域をコードする核酸配列を含んでもよい。シグナルペプチドのコード領域は、ニューロスポラ・クラサ(Neurospora crassa)のATPase遺伝子（Viebrock et al.,1982，EMBO Journal 1:565-571）またはサッカロミセス・セレビシエのチトクロームｃぺルオキシダーゼ遺伝子（Kaput et al.，1982，Journal of Biological Chemistry 257:1505 4-15058）から得ることができる。しかし本発明においては、選択した糸状真菌宿主において、５-アミノレブリン酸シンターゼを局在化できる様にするいかなるシグナルペプチドのコード領域を用いてもよい。発現させた５-アミノレブリン酸シンターゼを、細胞破壊しないで得るために、そして発現させた５-アミノレブリン酸シンターゼの細胞内での潜在的な分解量を最小限にするために、５-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子が発現すると、生産物が細胞外に分泌されることが好ましい。この目的で、本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼは、発現されるタンパク質が培地中へ分泌される様にするプレ領域を含んでよい。このプレ領域は、本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼに固有であってもよいし、または、異なるプレ領域もしくはシグナル配列を用いて置換されてもよく、都合がよいことに各プレ領域をコードするDNA配列によって置換することができる。プレ領域は、例えば、アスペルギラス属の種のグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、バチルス属の種のアミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミーヘイのリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエのα因子遺伝子、または子ウシのプレプロキモシン遺伝子から得ることができる。特に、アスペルギラス・オリザイのTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーの中性アミラーゼ、バチルス属NCIB11837のマルトジェニックアミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラスのαアミラーゼ、またはバチルス・リシェニフォルミスのサブチリシンのプレ領域が好ましい。真菌宿主に有効なシグナル配列は、アスペルギラス・オリザイのTAKAアミラーゼのシグナル、リゾムコール・ミーヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼのシグナル、またはリゾムコール・ミーヘイのリパーゼのシグナルである。本発明の核酸構成体、プロモーター、ターミネーターおよびその他の要素を連結する方法、ならびに、それらを複製に必要な情報を含んでいる適切なべクターに挿入する方法は、同業者に周知である（例えば、前記Sambrook et al.,を参照する）。本発明はまた、本発明の核酸構成体または発現ベクターを含んでいる宿主細胞に関し、これは、本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼの組換え体の生産において有利に用いられる。都合がよいことには、本発明の核酸構成体を宿主細胞の染色体に組込むことによって、その細胞を形質転換できる。この配列は細胞内で安定に保持される可能性が高いので、一般的には、この組込みは有益であると考えられる。この構成体の宿主染色体への組込みは、通常の方法、例えば相同または非相同組換えによって達成される。あるいは、種々のタイプの宿主細胞に関して、以下に記述する発現べクターによって細胞を形質転換できる。宿主細胞およびべクターの選択は、５-アミノレブリン酸シンターゼとその起源に大きく依存するだろう。宿主細胞は、原核生物、例えば細菌から選択してよい。適当な細菌の例には、バチルス・サブチリス(B．subtilis)、バチルス・リシェニフォルミス（B．licheniformis）、バチルス・レンタス(B．lentus)、バチルス・ブレビス(B．brevis)、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス(B．alkalophilus)、バチルス・アミロリクエフェイシェンス(B．amyloliquefaciens)、バチルス・コアグランス（B．coagulans）、バチルス・シルクランス(B．circulans)、バチルス・ラウタス(B．lautus)、バチルス・メガテリウム（B．megaterium）、バチルス・チューリンゲネシス(B．thuring iensis)、または、ストレプトミセス・リビダンス(S．lividans)もしくはストレプトミセス・ムリヌス(S．murinus)などのグラム陽性細菌か、あるいは大腸菌などのグラム陰性細菌がある。細菌の形質転換は、例えば、周知のプロトプラスト形質転換によるか、またはコンピテント細胞を利用して行うことができる。宿主細胞は、好ましくは真核生物、例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞であるか、または、好ましくは、酵母および糸状真菌を含む真菌細胞である。例えば、有用な哺乳類細胞にはCHO細胞またはCOS細胞がある。酵母宿主細胞は、サッカロミセスまたはシゾサッカロミセス属の種、例えばサッカロミセス・セレビシエから選択してよい。有用な糸状真菌は、アスペルギラス属の種、例えばアスペルギラス・オリザイまたはアスペルギラス・ニガーから選択してよい。あるいは、フサリウム(Fusarium)属の種の菌株、例えば、フサリウム・オキシスポラム(F．oxysporum)またはフサリウム・グラミネラム (F．graminearum)を宿主細胞として用いてもよい。真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生からなる周知の工程によって形質転換することができる。アスペルギラス属の宿主細胞の形質転換に適した方法は、EP 238 023に記載されている。フサリウム属の種を形質転換するのに適した方法は、Malardier et al.，1989，Gene 78:147-156または米国特許出願0 8/269449に記載されている。特に好ましい実施例では、５-アミノレブリン酸シンターゼは、アスペルギラス属などの真菌宿主細胞において遺伝子発現させる。5-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を、好ましくはアスペルギラス・オリザイのTAKAアミラーゼのプロモーターまたはアスペルギラス・ニガーの中性アミラーゼNA2のプロモーター、および、選択マーカーとしてamdSまたはpyrGを有するプラスミドに連結する。あるいは、選択マーカーは別のプラスミド上にあり、同時形質転換において用いてもよい。Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy Sciences USA 81:1470-1474に記載された方法に従って、これらのプラスミドを用いて、アスペルギラス・オリザイまたはアスペルギラス・ニガーなどアスペルギラス属の種の宿主細胞を形質転換する。本発明はまた、本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼを生産する方法で、（ａ）５-アミノレブリン酸シンターゼを生産させるために栄養培地中でアスペルギラス・オリザイ株を培養すること、および（ｂ）５-アミノレブリン酸シンターゼを回収することを含んでいる方法に関する。本発明はまた、本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼを組換えによって生産する方法で、（ａ）酵素の生産を誘導する条件下で、５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列を含んでいる核酸構成体を含んでいる宿主細胞を培養すること、および（ｂ）５-アミノレブリン酸シンターゼを回収することを含んでいる方法に関する。発現系が、５-アミノレブリン酸シンターゼを発酵培地に分泌する場合には、この酵素を培地から直接回収することができる。組換え５-アミノレブリン酸シンターゼが分泌されない場合には、これを細胞溶解物から回収する。本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼを発現または単離するために、当業界に既知のいかなる細胞培養法を用いてもよい。例えば、培養とは、適切な培地中で、５-アミノレブリン酸シンターゼを発現または単離することができる条件下で実施するもので、振とうフラスコ培養、実験室用または工業用発酵槽中での小規模または大規模発酵（例えば連続式、バッチ式、給送バッチ(fed-batch)式、または固相式による発酵）を含んでいる。当業界に既知の方法を用いて、炭素源および窒素源、並びに無機塩を含んでいる適切な栄養培地中で発酵を行う（例えばBennet,J.W．and LaSure,L.(eds)，More Gene Manipulations in Fungi，Ac ademic Press,CA,1991を参照すること）。適切な培地は、企業から入手するか、または公表されている組成に従い調製してもよい（例えば、American Type Cult ure Collectionのカタログを参照する）。前記の方法で生産した５-アミノレブリン酸シンターゼを、限定しないが、遠心、濾過、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿などの通常の方法によって発酵培地から回収することができる。さらに、回収したタンパク質を、様々なクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーまたはその類似法によって精製することができる。本発明はまた５-アミノレブリン酸シンターゼを用いる方法にも向けられる。本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼを、グリシンおよびサクシニル-CoA を、除草剤として有用な５−アミノレブリン酸に変換するために用いてよい。本発明の５-アミノレブリン酸シンターゼを、５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列を宿主細胞で過剰発現させることによって、宿主細胞が生産するヘムタンパク質の収量を増加させるために用いてよい。５-アミノレブリン酸シンターゼは、宿主細胞においてヘム生産の律速段階である。この方法は、（ａ）ヘムタンパク質を生産することができる宿主細胞に、５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列のコピーをーつ以上導入すること、ここでこの核酸配列は、５-アミノレブリン酸シンターゼの発現を指令することができる調節領域に作用可能に連結されていること；（ｂ）ヘムタンパク質および５-アミノレブリン酸シンターゼの生産に適した栄養培地中で細胞を培養すること；および（ｃ）その細胞の栄養培地からヘムタンパク質を回収することを含んで成る。本発明を、次の実施例によってさらに記述するが、これを本発明の範囲を限定するように解釈するべきではない。実施例例１：アスペルギラス・オリザイ株A1560のゲノムDNAの抽出アスペルギラス・オリザイ株A1560 (IFO4177)を0.5%酵母エキス-２%グルコース(YEG)培地25ml中、24時間、32℃、250回転で増殖させた。次に菌糸体をMiracl oth （Calbiochem，La Jolla，CA）を通して濾過することで集菌し、10mMトリス-1mMEDTA(TE)バッファ25mlを用いて１回洗った。過剰のバッファを菌糸体から流し去り、続いて液体窒素で凍結した。凍結した菌糸体を電気コヒーひき器でひいて細粉末にし、そしてこの粉末を、20mlのTEバッファおよび５mlの20 % w/vドデシル硫酸ナトリウム(SDS)が入った使い捨てプラスティック遠心チューブに加えた。混合物を穏やかに数回反転して完全に混合させ、そして等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1 v/v/v)によって２回抽出した。酢酸ナトリウム(３M液）を終濃度0.3Mになる様に加え、続いて2.5倍量の氷冷エタノールを加えて核酸を沈殿させた。それから15000gで30分間チューブを遠心することで核酸をぺレットにした。ぺレットは30分間風乾させ、0.5mlのTE バッファに再縣濁した。デオキシリボヌクレアーゼ非混在のリボヌクレアーゼA を濃度100μg/mlになる様に加え、その混合液を30分間、37℃で放置した。それからプロテアーゼＫを濃度200μg/mlになる様に加え、さらにその混合液を１時間37℃で放置した。最後に、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール (25:24:1 v/v/v)によって、その混合液を２回抽出し、前述のように酢酸ナトリウムおよびエタノールによってDNAを沈殿させた。DNAぺレットを真空乾燥した後、TEバッファに再縣濁して、次の使用まで４℃で保存した。例２：プラスミドpSE04の作成例１の記載と同じ方法を用いてアスペルギラス・ニドュランス株Ａ26(Fungal Genetics Stock Center，Kansas City，KS)からゲノムDNAを得た。アスペルギラス・ニドュランスＡ26のゲノムDNAを用いた増幅反応から得られたPCR断片を連結することによって、プラスミドpSE04を作成した。増幅反応は次の成分を含む：アスペルギラス・ニドュランスＡ26のゲノムDNA 50ng、dATP，dCTP，dGTPおよび dTTP各100μM(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、各50pmolの５-アミノレブリン酸シンターゼ用のプライマーALAS3d 5′-TTTATGATGGAGGCCCTTCTCCAGCAG TCTC-3′（配列番号３）およびAL AS4e 5′-CTATGCATTTAAGCAGCAGCCGCGACTGG-3（配列番号４）、Taq DNA ポリメラーゼ２単位(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)、１×Taq DNAポリメラーゼ用バッファ(Perkin-Elmer Corp.，Branch burg，NJ)。パーキンエルマーサーマルサイクラー(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)を用いて95℃１分間、55 ℃１分間、および72℃90秒間を１サイクルとして30サイクル反応させた。1.1％の低融点アガロースゲル(FMC，Rockland，ME)上で、40mMトリス酢酸−１mM EDTA 2ナトリウム塩(TAE)バッファによって電気泳動した後、切りだして、２kbのPCR 産物を単離した。取扱い説明書に従って、これをpCRIIべクター(Invitrogen，Sa n Diego，CA)にサブクローン化してpSE04を作成した（図１）。例３：アスペルギラス・オリザイ株A1560 DNAライブラリーの作成および５-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子(hemA)クローンの同定アスペルギラス・オリザイ株Al56OのゲノムDNAライブラリーを、取扱い説明書に従って、バクテリオファージクローニングベクターλZipLox(Life Technologi es，Gaithersburg，MD)を用いて作成した。プレーティングおよび組換えバクテリオファージの精製用の宿主として、大腸菌Y1090ZL細胞を使用し、各pZL1-hemA クローンの取り出し用の宿主として、大腸菌DH10Bzipを使用した。例１に記載した様に調製した細胞の総DNAをTsp509Iによって部分切断し、１％アガロースゲル上で、50mMトリス−50mMホウ酸塩−１mM EDTA2ナトリウム塩(TBE)バッファを用いて、サイズ分画した。４−７kbのサイズ範囲に移動したDNA断片を切りだし、P rep-a-Gene試薬(BioRad Laboratories，Hercules，CA）を使ってゲルから抽出した。EcoRIで切断した後に脱リン酸化したλZipLoxベクターアームを、抽出したD NA断片に連結した。その連結混合液を、市販のパッケージング抽出液を用いて、パッケージングした(Stratagene，La Joll a，CA)。パッケージングされたDNAライブラリーを、プレーティングし、大腸菌Y 1090 ZL中で増幅した。増幅前のゲノムライブラリーは、１×10⁶ pfu/mlであった。７×10⁴プラークのバクテリオファージDNAを、円形のNytran Plus膜(Schleich er & Schuell，Keene，NH)２枚に転写し、そして、例２のプラスミドpSE04からP CRで増幅したアスペルギラス・ニドュランスのhemAのゲノムDNAを、ジゴキシゲニン(DIG)で標識したプローブを用いてスクリーニングした。増幅反応は次の成分を含む：１×DIGプローブ合成混合液(Boehringer Mannhei m， Indianapolis，IN）、dATP，dCTP，dGTPおよびdTTP各100μM、例２に記載したプライマーALAS3dおよびALAS4e各50pmol、Taq DNAポリメラーゼ２単位、および１×Taq DNAポリメラーゼ用バッファー。反応は、パーキンエルマーサーマルサイクラーによって、95℃１分間、55℃１分間、および72℃２分間のサイクルを30サイクル行った。変性プローブを濃度２ng/mlになる様にハイブリダイゼーションバッファに加え、プレハイブリダイズした膜とともに一晩放置した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、５×SSC,0.1％サルコシル、0.02％SDS,１％Geniusブロッキング試薬(Boehringer Mannheim，Indian apolis，IN)、および30％ホルムアミド中で、42℃で行った。その膜を、５×SSC -0.1％SDSで２回洗い、続けて２×SSC-0.1％SDSで２回洗った。各洗浄は、室温で15分間行った。洗浄した膜を、室温で約２時間コダックX-OMAT ARフィルムに露出した後、取扱い説明書に従い、コニカQX-70自動フィルムプロセッサーを用いて現像した。１次プラークを分離し、２度目のスクリーニングを行った。５つのクローンを同定し、取り扱い説明書に従って切り出してpZL誘導体を作成した( Bethesda Research Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD) 。各pZL誘導体を、大腸菌DH5αのpSE11，pSE13，pSE15，pSE17、およびpSE20とした。これらのクローンは重複していて、全長4.2kb領域にわたることが判明した。図２に制限酵素地図を示す。例４：５-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子(hemA)プローブによるアスペルギラス・オリザイ株A1560のゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーション例１の記載どおり調製したアスペルギラス・オリザイ株A1560のゲノムDNA(10 μg)をBamHIまたはEcoRIで制限切断した。断片を１％アガロース−TBEゲルを用いた電気泳動によって分離した。取扱い説明書に従い、TurboBlot装置(Schleich er & Schuell，Keene，NH）を用いて、0.4N NaOH中で、DNAをNytran Plus膜へ転写した。Hybaidオーブン(Labnet，Woodbridge，NJ)で、42℃、２時間、５×SSC, 0.1％サルコシル、0.02％SDS,１％Geniusブロッキング試薬(Boehringer Mannhei m，Indianapolis，IN)，および50％ホルムアミド中で、膜をプレハイブリダイズした。プライマーhemA５′５′-TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3'（配列番号５）およびプライマーhemA３′５′-TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-３′ （配列番号６）を用い、テンプレートとしてhemAクローンpSE17を用いること以外は、例３の記載どおりにPCR増幅してDIG標識hemAプローブを作成して、ハイブリダイゼーションを行った。DIG標識hemAプローブ（１ngプローブ/ml溶液）を、新鮮なハイブリダイゼーション用バッファに加え、膜とともに42℃で一晩放置した。続いて、５×SSC-0.1％SDSを用いて、室温で15分間、膜を２回洗浄し、続けて２×SSC-0. 1％SDSを用いて、同条件で膜を２回洗浄した。洗浄した膜を、室温で約２時間、コダックX-OMATARフィルムに露出した後、取扱い説明書に従い、コニカQX-70自動フィルムプロセッサーで現像した。アスペルギラス・オリザイのhemAプローブを用いてアスペルギラス・オリザイのゲノムDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションをしたところ、遺伝子の１コピー数に相当するハイブリダイゼーションのシグナルの存在が示された。制限酵素地図（図２）からは、BamHIレーンにおいて1.7kbバンドが観察されると予測された。例５：アスペルギラス・オリザイA1560の5-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子(hemA)の特性次の手法に従って、例３記載の大腸菌DH5α pSE17のDNA配列を決定した。アプライドバイオシステムモデル373A自動DNAシークエンサー(Applied Biosystems ，Inc.，Foster City，CA)を使って、ダイターミネーター法(Giesecke et al.， 1992，Journal of Virol．Methods 38:47-60）を行った。両ストランドについて、M13 reverse(−48)およびM13 forward(−20)プライマー(New England Biolabs ，Beverly，MA)、ならびに決定されたDNA配列に特異なプライマーを用いて、プライマー歩行してDNAの配列を決定した。クローン化した遺伝子のヌクレオチド配列は、図３（配列番号１）に示すとおり、1911ヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有することが判明した。cDNAクローニングおよび配列解析によって確認されたコーディング配列には、いかなるイントロンも含まれていない。これとは対照的に、アスペルギラス・ニドュランスのhemA遺伝子は、５′末端に１つイントロンを含む（Bradshaw et al.，1993，Current Genetics 23:501-507）。５′側の非翻訳配列には、他の真菌遺伝子に見られる様ないくつかのピリミジンに富む領域およびATに富む領域(Gurr et al.，1987，In Kinghorn，J．R．(ed.)，Gene Structure in Eukary otic Microbes，pp.93-139，IRL Press，Oxford)があり、位置-249にはCCAAT配列、位置-35には推定のTATAボックスがある。CCAAT配列は、酸素に反応して転写を調節する転写調節因子、例えば酵母およびヒトのHap2/3/4転写調節複合体が結合する共通部位である（Olesen and Guarente，1990，Molecular and Cellula r Biology 12:2302-2314）。この調節複合体は、哺乳類においても保存されていて、そしてCCAAT結合活性はアスペルギラス・ニドュランスで同定されている(Da vis et al.,1993，Genetica 90:133-145)。この配列の重要性は、アスペルギラス・オリザイのhemA遺伝子においては知られておらず、そして配列情報が限られているので、アスペルギラス・ニドュランスのhemA５′領域においては確認されていない(Bradshaw et al.，1993，前述)。酸素に反応するアスペルギラス・オリザイのhemA遺伝子の転写調節は現在知られていないが、アスペルギラス・ニドュランスのhemA遺伝子は、酸素を制限した条件下でさえ転写調節されないと思われる(Bradshaw et al.，1993，前述)。おもしろいことに、酵母HEM1遺伝子は構成的に発現されているが、その発現は正と負の調節部位間のバランスによって調節されている(Keng and Guarente，1987，Proceedings of the National Academ y of Sciences USA 84:9113-9117)。３′側の非翻訳領域には、(AC)₃₅反復モチーフがある。同様な反復構造は、哺乳類および酵母遺伝子のサブテロメア、イントロン、およびプロモーター領域にも見つかっており、そしてこれは遺伝子の増幅現象に関係しているが、その機能は知られていない(Passananti et al.，1987 ，EMBO Journal 6:1697-1703)。アスペルギラス・オリザイ株A1560遺伝子産物の推定アミノ酸配列を図３（配列番号２）に示す。この核酸配列は、636アミノ酸からなる分子量68KDaのタンパク質をコードしていると予測される。この酵素はミトコンドリアに局在しているので、Ｎ末端には、ミトコンドリアのリーダー配列が含まれると予測される。事実、ミトコンドリアのリーダーとしての機能に一致して、最初の35アミノ酸は、セリン、スレオニン、リシン、およびアルギニン残基に富む。潜在的なヘム調節モチーフ(HRM)は、アスペルギラス・ニドュランスおよびアスペルギラス・オリザイの両方のhemA配列上の推定されたミトコンドリアのリーダー配列上に存在している（図４）。リーダー配列上に局在しているHRMは、マウスにおいては、へムとの直接相互作用を介して、５-アミノレブリン酸シンターゼタンパク質がミトコンドリア内へ転入するのを抑制していると考えられている（Lathrop and Timko，1993，Science 259:522-525;Zhang and Guarente，1995，EMB0 Journal 14:313-320)。別の潜在的なHRMは、推定された成熟タンパク質配列の最初の部分に存在する。HRMは、５-アミノレブリン酸シンターゼ活性の調節において機能しているらしい。おもしろいことに、サッカロミセス・セレビシエの５-アミノレブリン酸シンターゼタンパク質配列は、いかなる推定HRMも含んでおらず、酵母のヘム生合成においては、主要な調節ステップであるとは思われない(Labbe-Boi s and Labbe，In Daley，Harry A.，ed.，Biosynthesis of Heme and Chlorophy lls，1990，McGraw Hill Publishers，New York，pp235-285）。全体として、図５に示す様に、推定アミノ酸配列は、アスペルギラス・ニドュランスのhemA遺伝子（配列番号16）に対して81％の同一性、サッカロミセス・セレビシエのHEM1遺伝子(配列番号17;Urban-Grimal，1986，European Journal of Biochemistry 156:511-519)に対して57％の同一性、そしてヒト赤血球のhem1(AL AS2)遺伝子（配列番号18;Bishop，1990，Nucleic Acids Research 18:7187-7188 ）に対して51％の同一性を有する。これらの同一性はアプライドバイオシステムのGeneAssistプログラム(blosum62.mat matrix)を用いて決定した。しかし、最も高い保存性は、触媒ドメインを含んでいる、タンパク質Ｃ末端の３分の２において見られる。さらに、他の５-アミノレブリン酸シンターゼ酵素において触媒活性およびピリドキサールリン酸補因子結合に重要である、リシンおよびグリシンループもまた高く保存されている(Ferreira et al.，1995，Journal of Bioenergetics and Biomembra nes 27:151-159;Ferreira，1995，Protein Science 4:1001-1006)。例６：プラスミドpSE31の作成 PCRで増幅したアスペルギラス・オリザイのhemAのDNAを、pBANe6に直接クローニングして、プラスミドpSE31を作成した（図６）。PCR増幅反応は、例３に記載したhemAクローンE．coli DH5α pSE17のDNAを用いて行った。反応は次の成分を含む:pSE17 50ng,Vent DNAポリメラーゼ２単位(New England Biolabs，Beverly ，MA),１×Vent DNAポリメラーゼ用バッファ(New England Biolabs，Beverly，M A)，dATP，dCTP，dGTP，およびdTTP各400μM(Boehringer Mannheim，Indianapol is，IN)、および各50pmoleのプライマーhemA５′５′-TCATTTAAATGATGGAGTCTCTT CTCC-３′（配列番号５）およびプライマーhemA３′５′-TCTTAATTAATCAGCTCACA TGCGGG-３′（配列番号６）。パーキンエルマーサーマルサイクラーを用いて、9 5℃１分間、55℃１分間、72℃90秒間を１サイクルとして30サイクル行い反応させた。プライマーhemA５′はSwaI部位（下線）を、そしてhemA３′プライマーは PacI部位（下線）を含んでおり、これらの部位を利用して、SwaIおよびPacIで切断したpBANe6にクローニングして、pSE31を作成した（図７）。例７：アスペルギラス・オリザイ株JRoC50.3.18Aの作成プラスミドpJRoC50を含んでいるアスペルギラス・オリザイ株JRoC50.3.18Aを、次の様にして作成した。コプリヌス・シネレウス(Coprinus cinereus)IFO8371のぺルオキシダーゼのcD NA断片をPCRによって調製した。コプリヌス・マクロルヒザス(Coprinus macrorhizus)のぺルオキシダーゼのアミノ酸配列(Baunsgaar d et al.，1993，European Journal of Biochemistry 213:605-611)に基づいて作成した、下記に示す特異的オリゴヌクレオチドプライマー(Saiki et al.，198 8，Science 239:487-491)を用いた：１．５′-GCGCGAATTCGTNGGNATNGGNATNAA(CT)CA(CT)GG-３′（配列番号７）２．３′-TACAGNTT(GA)AC(GA)GGNGGCCTAGGCG-５′（配列番号８）３．５′-GCGAATTCACNCCNCA(GA)GTNTT(CT)GA(CT)AC-３′（配列番号９）４．３′-GGNAA(GA)GGNCCNCT(CT)AA(GA)CCTAGGCG-５′（配列番号10）５．５′-GCGCGAATTCTGGCA(GA)TCNAC-３′（配列番号11）６．５′-GCGCGAATTCTGGCA(GA)AGNATG-３′（配列番号12）７．３′-CGNTACCGNTT(CT)TACAGCCTAGG-５′（配列番号13） Gene Amp Kitおよび装置(Perkin Elmer Centus，Norwalk，CT)を用いて、取り扱い説明書に従い、PCRを行った。ただし、（コプリヌス・シネレウス株IFO8371 から得たmRNAから調製した）cDNAの第一ストランドへのハイブリダイゼーションをより良くするために、最初の３サイクルは28℃で行い、続いて65℃で30サイクル反応させた。プライマーを次の組み合わせで用いた：１および２；３および４；５および７；６および７；１および４；そして３および７。PCR断片の５′末端にEcoRI部位、そして３′末端にBamHI部位を付加して伸長した。１％アガロース−TBEゲルを用いて分析したところ、すべての反応において、期待どおりのサイズのバンドが見つかった。それらのバンドがぺルオキシダーゼ特異的配列に相当することを確認するために、このゲルについて、プライマー３とプライマー４との間に位置する、次の配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブにして、サザンブロットを行った：５′-GT(CT)TC(GA)AT(GA)TAGAA(CT)TG-３′（配列番号14）このプローブが、約130bp，420bp，540bpおよび240bpのバンドにハイブリダイズすることがわかり、観察されたDNAバンドがぺルオキシダーゼの配列に相当することが確認された。種々のPCR反応で得たDNAをEcoRIおよびBamHIで切断し、そしてプラスミドpUC1 9(New England Biolabs，Beverly，MA)にクローン化した。適格なPCR断片を含むコロニーを、前記オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号14）を用いたハイブリダイゼーションによって同定した。陽性コロニーから得たDNAについて、制限酵素地図を作成して、DNAの部分配列をSanger et al.(1977，Proceedings of Nati onal Academy of Sciences USA 74:5463-5467）の方法で決定して解析した。プライマー１および４を使って得られたクローンのひとつから得た430bp断片を用いて、コプリヌス・シネレウスcDNAライブラリーを、下記のとおりスクリーニングした。 Boel et al.(1984，EMBO Journal 3:1097-1102)およびChirgwin et al.(1979 ，Biochemistry 18:5294-5299)の方法に従い、ぺルオキシダーゼ活性の最大時に集菌し、ホモジナイズしたコプリヌス・シネレウスIFO8371株から、総RNAを抽出した。Aviv and Leder(1972，Proceedings of National Academy of Sciences U SA 69:1408-1412)の記載どおりに、オリゴ(dT)セルロースの親和性クロマトグラフィーを２回行い、ポリ(A)含有RNAを得た。取り扱い説明書に従い、cDNA合成キット(Invitrogen，San Diego，CA)を用いてcDNAを合成した。コプリヌス・シネレウスのcDNAライブラリーから約50000個の大腸菌組換え体をワットマン540ペーパーフィルターに転写した。Gerger et al.(1979，Nucleic Acids Research 7:2115-2135）の記載どおりに、コロニーを溶解し、固定化した。³²Ｐ標識した430bpのぺルオキシダーゼ特異的プローブを用いて、0.2×SSC-0.１％SDS中で、そのフィルターをハイブリダイズした。フィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄は65℃で行い、その後増感スクリーンを使って24時間オートラジオグラフィーした。この様にして、50個以上の陽性クローンを同定した。標準の方法(Birnboimand Doly，1979 ，Nucleic Acids Research 7:1513-1523）によって、ハイブリダイズしたコロニーから、プラスミドDNAを少量調製し、そしてサンガーのダイデオキシ法によって、挿入されているcDNAのDNA配列を決定した(Sanger et al.，1977，Proceedin gs of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467)。この中からひとつのコロニーを選択し、このべクターをpCiPとした。このべクターをBamHI/XhoI で切断して、ぺルオキシダーゼcDNA断片を切りだした。アガロースゲル電気泳動によって分離した後、電気抽出し、連結反応に備えた。このcDNA断片を、BamHI/ XhoIで切断したpHD414に連結して、pJVi９を作成した。このべクターのcDNAは、図８に示す様に、アスペルギラス・オリザイのTAKAプロモーターおよびアスark)ターミネーターの転写調節下にある。コプリヌス・シネレウスのぺルオキシダーゼをコードするcDNAを、BamHI-XhoI 断片としてプラスミドpJVi９から切りだし、プラスミドpJeRS6（図９）にクローン化して、プラスミドpJRoC50(図10)を作成した。このプラスミドは、選択マーカーとしてpyrG，TAKAプロモーター、およびamgターミネーターを含む。５μｇの精製プラスミドpJRoC50を用いて、アスペルギラス・オリザイ株HowB4 25の形質転換体を、次の点を変更して下記のとおりに作成した。アガーの重層を省略し、最小培地プレート上に直接、プロトプラストをまいた。形質転換は、濃度２×10⁷プロトプラスト／mlのプロトプラストを用いて行った。プロトプラスト100μlを５μgのDNAと混ぜ、氷上で30分間放置した。１ml SPTC(40％PEG4000，0.8Mソルビトール、0.05M トリスpH8.0，0.05M Ca Cl₂)を加え、そのプロトプラストを34℃で20分間放置した。その形質転換体を、最小培地のプレート上に直接プレーティングした。最小培地微量金属１ml、１gグルコース、500mg MgSO₄-7H₂O，342.3ｇスクロース、および 20ｇ Nobleアガーから作成した。微量金属液(1000×) ｇ FeSO₄-7H₂O，1.6ｇ CoCl₂-5H₂O，1.6ｇ(NH₄)₆ Mo₇O₂₄、および50ｇ Na₄EDTA から作成した。プレートを34℃で５−７日間放置した。形質転換体を、同じ培地のプレートに転写し、37℃で３−５日間放置した。次の酵素測定法で、66個の形質転換体のぺルオキシダーゼ活性を測定した：基質バッファ180μl｛20mlの0.1Ｍリン酸カリウム−0.01％Tween 80 pH7.0，2,2′ -azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS)液(22mg/ml)250μl、および30％過酸化水素２μl｝を、１：900に希釈した培養上清20μlに加え、すばやく、Molecular Devices Thermomaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devi ces，Sunnyvale，CA)を用いて、25℃で405nmの吸光を測定した。測定結果を、２分間かく拌しながら10秒毎に記録し、SOFTmaxプログラム(Molecular Devices，S unnyvale，CA)を用いて、Vmax値を計算した。１mlあたりのぺルオキシダーゼ活性単位(POXU)は、即知量のシネレウス・コプリヌスのぺルオキシダーゼを基準にして作成した標準曲線から推定した。１POXUは、0.88mM H₂O₂，1.67m M ABTS，0.1Mリン酸塩pH7.0において、30℃で１分間に1.0μmolの変換を触媒する酵素量として定義した。前記と同じ条件下で、同じプレート上で胞子を画線培養し、独立したコロニーをひろって、発現レベルが最も高い４つの形質転換体を単離した。各形質転換体の胞子約５×10⁶を、１％酵母エキス、2.5％マルトース、0.2％尿素、および１×MY塩pH6.5を含んだMY25培地25mlに接種し、振とうフラスコで培養して最終評価した。１×MY塩はン酸、微量金属液0.5ml、および10％CaCl₂-2H₂O 1mlから作成した ,14.28ｇ ZnSO₄-7H₂O,1.63ｇ CuSO₄，0.24ｇ NiCl₂-6H₂O、および3.0ｇクエン酸から作成した。50mM NaOHで調製した新鮮な10mg/ml保存液からヘミンを終濃度0. 01mg/mlになる様に加えた。この振とうフラスコを、34℃で７から８日間、200回転で培養した。ぺルオキシダーゼを最も多く生産する菌体をJRoC50.3.18Aとした。例８：pSE31によるアスペルギラス・オリザイJRoC50.3.18Aの形質転換 hemA遺伝子の過剰発現によってぺルオキシダーゼの生産が増加するかどうか決定するために、アスペルギラス・オリザイ株JRoC50.3.18AをpSE31によって形質転換した。形質転換は、濃度２×10⁷プロトプラスト／mlのプロトプラストを用いて行った。プロトプラスト100μlを10μｇのDNAおよび２00μlの60％ PEG4000-10mM HE PES-10mM CaCl₂液と混ぜて、34℃で30分間放置した。3mlのSPTC（40％PEG4000， 0.8Mソルビトール、0.05MトリスpH8.0，0.05M CaCl₂）を加え、amdSによる形質転換体あたり、0.52g KCl，0.52g MgSO,-7H₂O₄，1.52g KH₂PO₄、例７記載の微量金属液１ml、342.3ｇスクロース、25ｇ Nobleアガー、1Mアセトアミド10m l、および3M CsCl 10ml）上に直接プレーティングした。プレートを34℃で５− ７日間放置した。形質転換体を、同じ培地のプレートに転写し、34℃で３−５日間放置した。形質転換体は、同条件下で、同じプレート上で胞子を画線培養し、独立したコロニーをひろい単離した。例９：hemA形質転換体によるぺルオキシダーゼ生産例８で得られた形質転換体を、24ウエルマイクロタイタープレート上で培養した。0.25％酵母エキス、0.63％マルトース、0.05％尿素pH6.5、および１×MY塩（例７参照）から作成した1/4強度のMY25培地１mlを含むウエルに約１×10⁵の胞子を各々接種した。マイクロタイタープレートを、34℃で５日間、100回転で保湿チャンバー内に放置した。ぺルオキシダーゼの生産レベルを、例７に記載した酵素測定法を用いて決定した。マイクロタイタープレートを用いた試験の結果、hemA形質転換体の平均活性 POXU/mlは、べクターのみによる形質転換体の平均より1.4倍高く、最も優れたhe mA形質転換体では、ぺルオキシダーゼの生産が1.6倍増加した。少数のhemA形質転換体(39％)は、べクターのみによる多数のコントロール形質転換体と同程度のぺルオキシダーゼのレベルを示した。例１の記載どおりに各形質転換体から単離したゲノムDNA 50ngを用いて、hemA３′プライマー（例４参照）およびプライマー５′-TCTCTTCCTTCCTGAATCCTC-３′（配列番号１５）を使うこと以外は例２の記載どおりにPCR増幅を行った。この分析から、これらのhemA 形質転換体は発現カセット(expression cassette)を含でいることが示された。ぺルオキシダーゼ生産への効果をさらに評価するため、上で得られた最高のhemA形質転換体11体を、振とうフラスコで培養した。振とうフラスコで評価するために、１％酵母エキス、2.5％マルトース、0.2％尿素、および１× MY塩pH6.5（例７参照）を含んでいるMY25培地25mlに、各形質転換体の胞子約５ ×10⁶を接種した。振とうフラスコを34℃で７から８日間、200回転で培養した。ぺルオキシダーゼ測定は前記どおり行った。その結果から、５つの形質転換体SE01-15，SE01-20，SE01-26，SE01-28および SE01-32が、ベクターのみによるコントロール株より高いレベルのぺルオキシダーゼを生産すること、そのうち３つの形質転換体は、コントロール株のぺルオキシダーゼの平均レベルより、1.9倍高くぺルオキシダーゼを発現することが証明された。残りの６つのhemA形質転換体では、ぺルオキシダーゼレベルはコントロール株のレベルに相当することが示された。形質転換体SE01-28およびコントロール株SE05-18(pBANe6ベクターのみによる形質転換体）を、炭素源として高マルトースシロップを使った標準的な給送バッチ(fed-batch)法によって、２リットル発酵増殖させた。約0.4mM FeCl₃をバッチおよび供給元に補充した。両培養では３日目から８日目まで、１時間１リットルあたり約２ｇの割合で糖類を添加する様に給送を行い、溶存酸素圧を正に維持した。２日目および３日目では、逐次的に、このレベルを維持した。両培養における生物量は、発酵期間中ほとんど等しかった。コントロール株SE05-18に対してSE01-28では、ぺルオキシダーゼ活性は２倍増加することが観察された。ポリペプチドレベルにおいてもまた、コントロール株 SE05-18に対してSE01-28では、２倍の増加があった。結果を総合すると、hemA遺伝子の過剰発現によって、ぺルオキシダーゼ収量は２倍増加することが証明された。さらにデータから、糸状真菌においては、hemAは、ヘム生合成系路の主要な調節ポイントであり、これの遺伝的操作によって、ヘミンの補充なしに、ヘムタンパク質の生産を改善できる可能性が示めされた。微生物の寄託ブタペスト条約に従い、次の株を、Agricultural Research Service Patent C ulture Collection(NRRL)，Norther Regional Research Laboratory，1815 Univ ersity Street，Peoria，Illinois 61604，USAに寄託した。株アクセス番号寄託日付 E．coli DH5α (pSE17) NRRL B-21563 1996年4月22日本明細書に記載して請求した発明は、ここに開示した具体例によって、その範囲を限定されない。なぜなら、これらの例は、本発明のいくつかの観点を説明することを意図しているからである。すベての相当な具体例は、本発明の範囲に含まれると考える。実際、ここに記載された例の他に、本発明の様々な改修は、前述の記載から当業者にとっては明かであろう。この様な改修も請求の範囲に含まれると考える。本明細書にて様々な参考を引用しているが、その内容を引用することによって本明細書に組み入れる。

【手続補正書】【提出日】１９９９年２月１７日（１９９９．２．１７）【補正内容】 (1) 明細書第３頁、９行目から10行目の文章「潜在的に重要な転写部位であるCCAATボックスおよびTATAボックスを下線で示す。」を削除する。 (2) 明細書第11頁、５行目「第一の」を削除する。 (3) 明細書第11頁、７行目「第一の核酸配列のコード配列」を『５−アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列』に変更する。 (4) 明細書第27頁、25行目「amg」を『AMG』に変更する。 (5) 請求の範囲を別紙の通り補正する。請求の範囲１．（ａ）アスペルギラス・オリザイ(Aspergillus oryzae)株から得られるか；（ｂ）配列番号２に示したアミノ酸配列に対して、少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を有するか；または（ｃ）高いストリンジェント条件で配列番号１に示した核酸配列にハイブリダイズするプローブを用いて、同じ条件でハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされる、実質上純粋な５-アミノレブリン酸シンターゼ。２．アスペルギラス・オリザイIFO4177またはその変異株から得られる、請求項１に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼ。３．配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼ。４．配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも85％相同であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼ。５．配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも90％相同であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼ。６．配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも95％相同であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼ。７．配列番号２に示したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載されている５ -アミノレブリン酸シンターゼ。８．配列番号２に示したアミノ酸配列に対して多くて３アミノ酸が相違するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼ。９．配列番号２に示したアミノ酸配列に対して多くて２アミノ酸が相違するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼ。 10．配列番号２に示したアミノ酸配列に対して１アミノ酸が相違するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼ。 11．高いストリンジェント条件で配列番号１に示した核酸配列にハイブリダイズするプローブを用いて、同じ条件でハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされる、請求項１に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼ。 12．請求項１の５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列を含んでいる、単離された核酸断片。 13．核酸配列が、アスペルギラス・オリザイIFO 4177から得られる５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする、請求項12に記載されている核酸断片。 14．核酸配列が、配列番号１に示されている、請求項13に記載されている核酸断片。 15．５-アミノレブリン酸シンターゼが、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を有する、請求項12に記載されている核酸断片。 16．５-アミノレブリン酸シンターゼが、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも85％相同であるアミノ酸配列を有する、請求項12に記載されている核酸断片。 17．５-アミノレブリン酸シンターゼが、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも90％相同であるアミノ酸配列を有する、請求項12に記載されている核酸断片。 18．５-アミノレブリン酸シンターゼが、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも95％相同であるアミノ酸配列を有する、請求項12に記載されている核酸断片。 19．高いストリンジェント条件で配列番号１に示した核酸配列にハイブリダイズするプローブを用いて、同じ条件でハイブリダイズすることができる、請求項 12に記載されている核酸断片。 20．適切な発現宿主において５-アミノレブリン酸シンターゼの発現を指令することができる調節領域に作用可能に連結された請求項12の核酸断片を含んでいる、核酸構成体。 21．請求項20の核酸構成体を含んでいる組換えべクター。 22．核酸配列が、プロモーター配列に作用可能に連結されている、請求項21に記載されているべクター。 23．さらに転写停止シグナルを含んでいる、請求項22に記載されているべクター。 24．さらに選択マーカーを含んでいる、請求項22に記載されているべクター。 25．請求項20の核酸構成体を含んでいる、組換え宿主細胞。 26．核酸構成体がべクター上に含まれる、請求項25に記載されている宿主細胞。 27．宿主細胞が細菌細胞である、請求項25に記載されている宿主細胞。 28．宿主細胞が真菌細胞である、請求項25に記載されている宿主細胞。 29．真菌細胞が糸状真菌細胞である、請求項28に記載されている宿主細胞。 30．糸状真菌細胞が、アクレモニウム(Acremonium)属、アスペルギラス(Asper gillus）属、フサリウム(Fusarium)属、ヒュミコラ(Humicola)属、マイセリオフトラ(Myceliophthora)属、ムコーラ(Mucor)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、ぺニシリウム(Penicillium)属、シーラビア(Thielavia)属、トリポクラジウム (Tolypocladium)属、またはトリコデルマ(Trichoderma)属の種の細胞である、請求項29に記載されている宿主細胞。 31．真菌細胞が酵母細胞である、請求項28に記載されている宿主細胞。 32．酵母細胞がサッカロミセス(Saccharomyces)属またはシゾサッカロミセス( Schizosaccharomyces)属の菌株である、請求項31に記載されている宿主細胞。 33．核酸構成体が宿主細胞ゲノムに組込まれている、請求項25に記載されている宿主細胞。 34．（ａ）５-アミノレブリン酸シンターゼを生産させるためにアスペルギラス・オリザイ株を培養すること；および（ｂ）５-アミノレブリン酸シンターゼを回収することを含んで成る、請求項１の５-アミノレブリン酸シンターゼを製造する方法。 35．（ａ）５-アミノレブリン酸シンターゼの発現を誘導する条件で、５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列を含む核酸構成体を含んでいる宿主細胞を培養すること；および（ｂ）５-アミノレブリン酸シンターゼを回収することを含んで成る、請求項１の５-アミノレブリン酸シンターゼを製造する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:69） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）アスペルギラス・オリザイ(Aspergillus oryzae)株から得られ；（ｂ）配列番号２に示したアミノ酸配列に対して、少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を有するか；または（ｃ）高いストリンジェント条件で配列番号１に示した核酸配列にハイブリダイズするプローブを用いて、同じ条件でハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされる、実質上純粋な５−アミノレブリン酸シンターゼ。２．アスペルギラス・オリザイIFO 4177またはその変異株から得られる、請求項１に記載されている５−アミノレブリン酸シンターゼ。３．配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも80%相同である、好ましくは、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも85%相同である、より好ましくは、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも90%相同である、そして、最も好ましくは、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも95%相同であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載されている５- アミノレブリン酸シンターゼ。４．配列番号２に示したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載されている５ −アミノレブリン酸シンターゼ。５．配列番号２に示したアミノ酸配列に対して多くて３アミノ酸が相違する、好ましくは、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して多くて２アミノ酸が相違する、そして最も好ましくは、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して１アミノ酸が相違するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼ。６．高いストリンジェント条件で配列番号１に示した核酸配列にハイブリダイズするプローブを用いて、同じ条件でハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされる、請求項１に記載されている５-アミノレブリン酸シンターゼ。７．請求項１の５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列を含んでいる、単離された核酸断片。８．核酸配列が、アスペルギラス・オリザイIFO 4177から得られる５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする、請求項７に記載されている核酸断片。９．核酸配列が、配列番号１に示されている、請求項８に記載されている核酸断片。 10．５-アミノレブリン酸シンターゼが、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも80%相同である、好ましくは、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも85%相同である、より好ましくは、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも90%相同である、そして、最も好ましくは、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも95%相同であるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載されている核酸断片。 11．高いストリンジェント条件で配列番号１に示した核酸配列にハイブリダイズするプローブを用いて、同じ条件でハイブリダイズすることができる、請求項７に記載されている核酸断片。 12．適切な発現宿主において５-アミノレブリン酸シンターゼの発現を指令することができる調節領域に作用可能に連結された請求項７の核酸断片を含んでいる、核酸構成体。 13．請求項12の核酸構成体を含んでいる組換えベクター。 14．核酸配列が、プロモーター配列に作用可能に連結されている、請求項13に記載されているべクター。 15．さらに転写停止シグナルを含んでいる、請求項14に記載されているべクター。 16．さらに選択マーカーを含んでいる、請求項14に記載されているべクター。 17．請求項12の核酸構成体を含んでいる、組換え宿主細胞。 18．核酸構成体がべクター上に含まれている、請求項17に記載されている宿主細胞。 19．宿主細胞が細菌細胞である、請求項17に記載されている宿主細胞。 20．宿主細胞が真菌細胞である、請求項17に記載されている宿主細胞。 21．真菌細胞が糸状真菌細胞である、請求項20に記載されている宿主細胞。 22．糸状真菌細胞が、アクレモニウム(Acremonium)属、アスペルギラス(Asper gillus)属、フサリウム(Fusarium)属、ヒュミコラ(Humicola)属、マイセリオフトラ(Myceliophthora)属、ムコール(Mucor)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、ぺニシリウム(Penicillium)属、シーラビア(Thielavia)属、トリポクラジウム (Tolypocladium)属、またはトリコデルマ(Trichoderma)属の種の細胞である、請求項21に記載されている宿主細胞。 23．真菌細胞が酵母細胞である、請求項20に記載されている宿主細胞。 24．酵母細胞がサッカロミセス(Saccharomyces)属またはシゾサッカロミセス( Schizosaccharomyces)属の菌株である、請求項23に記載されている宿主細胞。 25．核酸構成体が宿主細胞ゲノムに組込まれている、請求項17に記載されている宿主細胞。 26．（ａ）5-アミノレブリン酸シンターゼを生産させるためにアスペルギラス・オリザイ株を培養すること；および（ｂ）５-アミノレブリン酸シンターゼを回収することを含んでいる、請求項１の５-アミノレブリン酸シンターゼを生産する方法。 27．（ａ）５-アミノレブリン酸シンターゼの発現を誘導する条件で、５-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列を含んでいる核酸構成体を含んでいる宿主細胞を培養すること；および（ｂ）５-アミノレブリン酸シンターゼを回収することを含んでいる、請求項１の５-アミノレブリン酸シンターゼを生産する方法。