JP3379133B2 - オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子およびその利用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は担子菌類アラゲカワラタ
ケから得られた新規オルニチンカルバモイルトランスフ
ェラーゼ（以下ＯＣＴと略す）遺伝子、それを含む組換
えＤＮＡおよび該組換えＤＮＡを含む形質転換体および
その利用に関する。ＯＣＴは生物においてアルギニンの
生合成経路中でオルニチンをシトルリンに変換する酵素
である。上記酵素遺伝子をＵＶ照射やＮＴＧ処理により
破壊したアルギニン要求性アラゲカワラタケ変異株を、
宿主・ベクター系における宿主微生物として利用するこ
とができる。さらに、これまで困難とされてきた種々の
タンパク質を上記宿主・ベクター系を用いて遺伝子組換
えにより安定的に、さらに大量に供給することが期待で
きる。

【０００２】

【従来の技術】現在まで、組換えＤＮＡ技術を用いて多
様なポリペプチドを産生する系として大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主とする系が主として
用いられている。しかしながら、大腸菌は宿主として適
さない場合が多い。例えば、大腸菌において、ヒトなど
高等生物由来の有用なポリペプチドを生産させる場合、
目的ポリペプチド以外にも多数の毒性物質を産生し、目
的産物の精製が非常に困難となる。上記問題点を解決す
る手段として下等真核生物の酵母を宿主として生産する
方法が盛んに研究されているが、生産性が低いという問
題点が新たに生じている。そこで、ポリペプチド産生の
ための新しい宿主・ベクター系に対する関心が高まって
いる。

【０００３】担子菌類は真核生物に属するが、酵母より
も動物細胞に近縁であると考えられている［Ｔ．Ｌ．Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ， ８６，７０６３（１９８９）］。担子菌を用い
た宿主・ベクター系はいくつか報告されているが［Ａ．
Ｍｕｎｏｚ−Ｒｉｖａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５，１０３，（１９８６）］、
実用的利用はなされていない。コリオラス属に属する担
子菌類であるアラゲカワラタケは、まだ遺伝的解析はほ
とんどなされていない。さらにこの微生物を用いた宿主
・ベクター系はまだ開発されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、担子
菌類を宿主とする新規な且つ実用的な宿主・ベクター系
を提供しようとするものである。さらには、上記宿主・
ベクター系を用いて目的とする蛋白質を培養物中に分泌
生産させる方法を提供するものである。本発明はさら
に、担子菌アラゲカワラタケにおいて目的蛋白質を製造
する方法、及びそのための遺伝子系を提供する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らはアラゲカワ
ラタケのＯＣＴ遺伝子に着目し、アラゲカワラタケの染
色体ＤＮＡ制限酵素処理断片からＯＣＴをコードするＤ
ＮＡ断片をクローン化し、これをＯＣＴ欠損アラゲカワ
ラタケ変異株に移入することにより、新規な宿主・ベク
ター系を確立することに成功し、さらに、この宿主・ベ
クター系を用いて目的とする蛋白質をアラゲカワラタケ
において生産することができることを確認し、本発明を
完成するに至った。

【０００６】従って本発明は、（１）アラゲカワラタケ
のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣ
Ｔ）をコードする構造遺伝子を提供する。この構造遺伝
子は、好ましくは配列番号１又は配列番号２に示すアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列から実質上成る。その塩
基配列の具体例は配列番号３の７８番目の塩基から１２
０２番目の塩基までの塩基配列、又は配列番号４の塩基
番号６５３から塩基番号２３４０までの塩基配列であ
る。

【０００７】本発明はさらに、（２）ＯＣＴをコードす
る構造遺伝子及び該構造遺伝子の発現を制御する配列を
含んで成るＯＣＴ遺伝子を提供する。発現を制御する配
列にはプロモーターが含まれる。この様なプロモーター
をコードする配列は例えば配列番号４で示される塩基配
列中の前記コード配列より上流の部分に含まれている。

【０００８】本発明はさらに、（３）前記（１）又は
（２）の遺伝子を含んで成る環状又は直鎖状ＤＮＡを提
供する。このＤＮＡは本発明の宿主ベクター系の一方を
構成するものであり、目的とする蛋白質の遺伝子を宿主
に導入する際のマーカーとして機能する。前記環状ＤＮ
Ａは例えばプラスミドである。

【０００９】本発明はさらに、（４）前記（１）又は
（２）の遺伝子、コリオラス担子菌において機能する発
現制御配列、及び該発現制御配列の制御下にある目的蛋
白質をコードする遺伝子を含んで成る環状又は直鎖状Ｄ
ＮＡを提供する。このＤＮＡも本発明の宿主ベクター系
の一方を構成するものである。前記発現制御配列にはプ
ロモーターが含まれ、例えばフェノールオキシダーゼ遺
伝子のプロモーター、リグニンパーオキシダーゼ遺伝子
のプロモーター、ＯＣＴ遺伝子のプロモーター等が挙げ
られる。前記目的蛋白質をコードする遺伝子の上流には
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ領域が連結されて
いてもよい。このシグナルペプチドとしては、例えばフ
ェノールオキシダーゼのシグナル配列、リグニンパーオ
キシダーゼのシグナル配列等が挙げられる。

【００１０】本発明はさらに、（５）コリオラスに属
し、ＯＣＴ発現能を欠損している担子菌を提供する。こ
の変異担子菌は本発明の宿主・ベクター系における宿主
を構成する。本発明はまた、（６）前記の（３）又は
（４）に記載の環状又は直鎖状ＤＮＡと前記（５）のＯ
ＣＴ発現能欠損変異体担子菌とから成る宿主−ベクター
系を提供する。

【００１１】本発明はまた、（７）前記（３）のＤＮＡ
と、コリオラス属担子菌において機能する発現制御配列
及び該発現制御配列の制御下にある目的蛋白質をコード
する遺伝子を含んで成る環状又は直鎖状ＤＮＡとによ
り、前記（５）の担子菌を形質転換することを特徴とす
る、目的蛋白質を生産することができるコリオラス属担
子菌の製造方法を提供する。この方法において（３）の
ＤＮＡは、目的蛋白質をコードする遺伝子及びこのため
の制御配列を宿主に導入する場合のマーカーとして機能
する。この場合も、目的蛋白質をコードする遺伝子の上
流にはシグナル配列をコードするＤＮＡが連結されてい
てもよい。発現制御配列及びシグナル配列としては、前
記４に記載したものを用いることができる。

【００１２】本発明はさらに、（８）前記（４）のＤＮ
Ａにより前記（５）の担子菌を形質転換することを特徴
とする、目的蛋白質を生産することができるコリオラス
属担子菌の製造方法を提供する。本発明はまた、（９）
前記（７）又は（８）の方法により得られるコリオラス
属担子菌の形質転換体を提供する。本発明はさらに、
（１０）前記（９）の形質転換体を培養し、その培養物
から目的蛋白質を採取することを特徴とする目的蛋白質
の製造方法を提供する。

【００１３】

【具体的な説明】本発明に用いる染色体ＤＮＡおよびｍ
ＲＮＡの供与体はアラゲカワラタケであり、具体的に
は、例えばＩＦＯ４９１７株である。アラゲカワラタケ
からの全ｍＲＮＡの抽出および、それに基づくｃＤＮＡ
ライブラリーの作製は次に記載する方法による。

【００１４】即ち、ＯＣＴ生産の誘導がかかるようにア
ルギニンだけを除いた合成培地で培養したアラゲカワラ
タケの菌体から実施例で後述する方法により全ＲＮＡを
抽出する。得られた全ＲＮＡからＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，１４０８（１９７
２）に記載の方法によりポリ（Ａ）含有ＲＮＡをオリゴ
（ｄＴ）−セルロースを用いて精製し、ポリ（Ａ）ＲＮ
Ａを得る。このポリ（Ａ）ＲＮＡからｃＤＮＡをＧｅｎ
ｅ，２５，２６３（１９８３）に記載の方法で合成し、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）に記載の
方法でファージＤＮＡλｇｔ１０に挿入し、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでパッケージを行ない、ｃＤＮＡのライブラリー
とする。

【００１５】上記で作製したｃＤＮＡライブラリーから
当該ＯＣＴ遺伝子をクローニングするには、他生物種か
ら単離されているＯＣＴ遺伝子のＤＮＡ配列［Ｂ．Ｂｅ
ｒｓｅ，ら，Ｇｅｎｅ，２５，１０９（１９８３）；
Ｆ．Ｐ．Ｂｕｘｔｏｎ，ら，Ｇｅｎｅ，６０，２５５
（１９８７）］に基づいて作製した合成ＤＮＡをプロー
ブとして用い、プラーク・ハイブリダイゼーションを行
なうことができる。またアスペルギルス・ニドランスの
ＯＣＴ遺伝子をコードしているＡＲＧＢ遺伝子断片をＤ
ＮＡプローブとして用い、プラークハイブリダイゼーシ
ョンを行なうこともできる。

【００１６】得られたｃＤＮＡの塩基配列決定は、Ｓａ
ｎｇｅｒらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］により行
なうことができる。なお、アラゲカワラタケ由来ＯＣＴ
ｃＤＮＡ遺伝子を含む大腸菌組換え体Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９／ｐＵＣＲＭは工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第１３４２４号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４
２４）として寄託されている。

【００１７】本菌株から染色体ＤＮＡを調製するには、
Ｙｅｌｔｏｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，１４７０（１９８４）］
等、通常の染色体ＤＮＡの抽出法を用いることができ
る。次に、得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で処
理し、部分分解を行なった後ショ糖密度勾配超遠心法で
分画して１０ｋｂｐ〜２５ｋｂｐの断片を得る。同じ接
着末端を生じさせる制限酵素で処理したファージＤＮＡ
に、上記で得られたＤＮＡ断片を挿入して染色体遺伝子
ライブラリーを作製する。

【００１８】当該ファージＤＮＡとしては例えばＥＭＢ
Ｌ３［Ａ−Ｍ，Ｆｒｉｓｈａｕｆ，ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１７０，８２７（１９８３）］が用いられる。
挿入後、ｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージを行ない、染色
体ＤＮＡライブラリーとする。またサブクローニングに
は常用のクローニングベクター、好ましくは大腸菌クロ
ーニングベクター、例えばｐＵＣ系ベクター、例えばｐ
ＵＣ１８［Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，ら，Ｇ
ｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］を用いる。

【００１９】上記で得られた染色体遺伝子ライブラリー
からの当該遺伝子の単離にあたっては、前述のアラゲカ
ワラタケのｃＤＮＡライブラリーから単離したＯＣＴ遺
伝子をプローブに用いたプラークハイブリダイゼーショ
ンにより行なう。なお、ｃＤＮＡライブラリーからのＯ
ＣＴ遺伝子のクローニングに用いる前記のプローブを用
いて、染色体遺伝子ライブラリーからのＯＣＴ染色体遺
伝子の選択を行うこともできる。単離された当該ＯＣＴ
染色体遺伝子を含む断片は図１中の斜線で示す部分で表
される制限酵素地図から成っていた。

【００２０】上記断片を適当なクローニングベクター、
好ましくは細菌クローニングベクター、特に大腸菌クロ
ーニングベクター、例えばｐＵＣ系クローニングベクタ
ー、例えばｐＵＣ１８に挿入し、ＯＣＴ欠損コリオラス
属変異株、例えばアラゲカワラタケ変異株へ移入するこ
とにより宿主・ベクター系を構築することができる。な
お、前記ＯＴＴ染色体断片をｐＵＣ１８に挿入すること
により得られたプラスミドをｐＵＣＲ１と称し、図１に
示す。

【００２１】ＯＣＴ欠損コリオラス属変異株、例えばア
ラゲカワラタケ変異株は、常法通りコリオラス属の担子
胞子、分裂子または一核化したプロトプラストを用い
て、紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソーＮーニ
トロソグアニジン（以下ＮＴＧと略す）、エチルメタン
スルホン酸などの突然変異誘発物質で処理することによ
り得ることができる。

【００２２】次に、ある特異的な代謝経路に欠損のある
突然変異株の単離および同定は、例えば実施例５で詳し
く述べるように、同株が増殖に要求する栄養素を決定す
ることにより行うことができる。次に、突然変異株が欠
損している遺伝子および遺伝子産物の同定は、例えば実
施例６に述べるように欠損している酵素活性の有無を調
べることにより行なえる。

【００２３】上記のようにしてクローニングされたＯＣ
Ｔ遺伝子を含有するベクターと、ＯＣＴ遺伝子を欠損し
たコリオラス属変異株との組合わせにより新規な真核生
物宿主ベクター系が提供される。上記の遺伝子を含有す
るベクターをＯＣＴ欠損コリオラス属変異株、例えばア
ラゲカワラタケ変異株に導入した場合、該酵素が発現す
ることから、前記のＯＣＴ遺伝子は該酵素の構造遺伝子
すなわちコード領域及び該コード領域の発現に必要な制
御領域の両者を含有していることが確認される。このこ
とはまた、ＯＣＴ遺伝子の塩基配列の解析において、オ
ープンリーディングフレームの上流にプロモーター様配
列が存在することによっても確認される。

【００２４】前記のクローニングされたＯＣＴ遺伝子を
用いて宿主・ベクター系を構築するに際しては、該遺伝
子制御領域のみを他の遺伝子、例えばマーカー遺伝子等
と組合わせてベクター系を構成することもでき、また該
遺伝子制御領域及びコード領域の両者を含有するベクタ
ー系を構成することもできる。なお、アラゲカワラタケ
のＯＣＴ活性を欠損している栄養要求性変異株であるＯ
ＪＩ−１０７８、及びアラゲカワラタケ由来ＯＣＴ遺伝
子を含む大腸菌組換え株Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐ
ＵＣＲ１は工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれ
微工研菌寄第１２６７７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６７
７）及び微工研菌寄第１２６７９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
２６７９）として寄託されている。

【００２５】本発明はさらに、コリオラス属担子菌にお
いて目的蛋白質を製造する方法、及びそのための遺伝子
系を提供する。この遺伝子系は、例えば前記の宿主・ベ
クター系において使用される。このための遺伝子系は、
コリオラス属担子菌において機能するプロモーターを含
有するＤＮＡ、及び該ＤＮＡの３’−末端側に連結され
た、目的蛋白質をコードするＤＮＡを含んで成る。この
ＤＮＡの上流にはシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
が融合していることが好ましい。

【００２６】本発明の目的蛋白質をコードする遺伝子の
発現に用いるプロモーターとしては、コリオラス属担子
菌、例えばアラゲカワラタケにおいて機能するものであ
ればいずれでもよいが、好ましくはアラゲカワラタケ由
来のプロモーターを用いる方が高発現を期待できる。そ
の具体例としては、アラゲカワラタケのフェノールオキ
シダーゼ遺伝子のプロモーター［Ｙ．Ｋｏｊｉｍａ，
ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２５，１５２
２４（１９９０）］、が挙げられる。

【００２７】さらに、リグニンパーオキシダーゼ遺伝子
のプロモーターを使用することもでき、このプロモータ
ーは例えば特願平４−６０５０３号の明細書に詳細に記
載されており、該プロモーターを含むプラスミドｐＢＳ
ＬＰＯＧ７により形質転換された大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ
ＸＬ−１ ｂｌｕｅ／ｐＢＳＬＰＯＧ７が微工研菌寄第
１２６８３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６８３）として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

【００２８】さらに、アラゲカワラタケのリグニンパー
オキシダーゼ遺伝子のプロモーターが特願平４−５２６
７３号の明細書に記載されており、このプロモーターを
含むプラスミドｐＢＳＬＰＯＧ４により形質転換された
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＵＣＬＰＯＧ４が微工研菌寄第１
２６７８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６７８）として寄託さ
れている。

【００２９】シグナルペプチドをコードするＤＮＡとし
ては、コリオラス属担子菌例えばアラゲカワラタケで機
能するものであれば如何なるものでもよく、発現させた
い目的蛋白質に本来含まれているシグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡを用いるか、あるいは酵母や糸状菌の分
泌蛋白質遺伝子のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
を用いてもよい。また、これらのシグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡを化学合成したものも用いることができ
る。さらに、アラゲカワラタケ由来の分泌酵素であるフ
ェノールオキシダーゼ遺伝子のシグナルペプチド領域、
リグニンパーオキシダーゼ遺伝子のシグナルペプチド領
域、およびその改良型なども挙げられる。

【００３０】本発明において、担子菌アラゲカワラタケ
で発現される遺伝子の産物としては、高等真核生物由来
の酵素、成長因子、ホルモン、サイトカイニン、ウイル
ス蛋白質などがあり、具体例としては、ヒトリゾチー
ム、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、
ヒトＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｔｏｒ）、ヒトＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ）、成長ホルモン、インシュリン、インタ
ーフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロン
γ、インターロイキン２、ＴＮＦ（腫瘍壊子因子）、Ｂ
型肝炎ウイルス表面抗原、リンホトキシン、リグニンパ
ーオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼなどが挙げら
れる。これらの遺伝子は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、もし
くは染色体ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）のいずれ
を用いてもよく、また化学合成をしたものを用いてもよ
い。

【００３１】発現させたい遺伝子のシグナルペプチドコ
ード領域と成熟蛋白質コード領域との間にプロペプチド
をコードする領域が存在する場合には、その遺伝子をそ
のまま発現させてもよい。また、プロペプチドコード領
域が存在しない場合には、該プロペプチドコード領域を
シグナルペプチド領域と成熟蛋白質の間に挿入し、その
遺伝子を発現させてもよい。

【００３２】本発明において、発現される遺伝子の産物
として挙げられるリグニンパーオキシダーゼを野生株を
用いて生産せしめる場合、培地中の窒素源濃度を低濃度
に抑えること、培養器中の酸素分圧を高くすること、さ
らに静置培養に限ることなどの制約があり、リグニンパ
ーオキシダーゼの大量生産は困難であった。また、リグ
ニンパーオキシダーゼ遺伝子の単離が公表されているの
はファネロカエテ・クリソスポリウム［Ｎａｔｕｒｅ，
３２６，５２０（１９８７）］、カワラタケ［Ｂ．Ｂ．
Ｒ．Ｃ．，１７９，４２８（１９９１）］、コガネシワ
ウロコタケ［Ｇｅｎｅ，８５，３４３（１９８９）］の
他にはなく、これらの菌のリグニンパーオキシダーゼ遺
伝子を利用した工業生産法も幾つか検討されている
［Ｍ．Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ，ら，Ｇｅｎｅ，８５，３４
３，（１９８９）］が、これまで活性のある状態で生産
された例はない。

【００３３】しかし、ここで提供する形質転換系による
酵素生産法を用いれば、リグニンパーオキシダーゼ遺伝
子が染色体ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）、もしく
は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、また化学合成したものにか
かわらず、容易にリグニンパーオキシダーゼを生産する
ことができる。

【００３４】本発明の発現に用いる供与ＤＮＡとして
は、コリオラス属担子菌例えばアラゲカワラタケで機能
できる選択マーカーを含むベクターＤＮＡ、例えばプラ
スミドＤＮＡが挙げられ、具体的には選択マーカーとし
てアラゲカワラタケ由来のＯＣＴ遺伝子を含むベクター
ＤＮＡが挙げられる。ベクターＤＮＡとしては遺伝子操
作のために便利な宿主、例えば細菌、好ましくは大腸菌
でＤＮＡを増幅させるためのものなら如何なるものでも
よい。例えば、ｐＵＣベクター、ｐＢＲ３２２ベクタ
ー、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター等が挙げられる。
上記選択マーカーを含むプラスミドＤＮＡは環状、又は
直鎖状のいずれでもよく、あるいはＯＣＴ遺伝子部分だ
けでも、選択マーカーとして用いることができる。

【００３５】目的蛋白質、例えばリグニンパーオキシダ
ーゼを発現させるベクター（発現ベクター）の１つの態
様は、選択マーカーと、目的遺伝子を発現させるための
プロモーター及び該プロモーターの制御下にある目的遺
伝子との両者を含有するベクターであり、これは例え
ば、上記の選択マーカーを含む供与ＤＮＡにプロモータ
ーを挿入し、そのプロモーターの下流に発現させたい目
的遺伝子を連結するか、あるいは、プロモーターの下流
に目的遺伝子を連結させたＤＮＡ断片を該ベクターに挿
入することによって得られる。この場合、目的蛋白質、
例えばリグニンパーオキシダーゼをコードする遺伝子の
下流にコリオラス属担子菌例えばアラゲカワラタケで機
能できるターミネーター領域を挿入することにより目的
蛋白質、例えばリグニンパーオキシダーゼの発現量を高
めることも可能である。

【００３６】また、上記選択マーカーを含有するが目的
遺伝子を含有しない環状又は直鎖状のＤＮＡと、プロモ
ーターの制御下に目的遺伝子が連結されているＤＮＡを
含有するが選択マーカーを含有しない環状又は直鎖状の
ＤＮＡ、例えば発現ベクターを混合し、同時形質転換
（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）することによ
り形質転換体を得ることもできる。

【００３７】本発明における発現ベクターを構築するた
めの方法は公知であり、文献たとえば、［Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ．，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ／２ｎｄ Ｅｄ
ｉｔｉｏｎ（１９８９）］に記載されている。リグニン
パーオキシダーゼ発現プラスミドの具体例としては、実
施例８、９、１０、１１、１２及び１３に記載されてい
るpPgHLC1 、pPcHLC1 、pPSgHL1 、pPSproHL1 、pRPgHL
1 及びpRPgHLC1などが挙げられる。

【００３８】上記のようにして得られた発現ベクターを
用いてコリオラス属担子菌例えばアラゲカワラタケを形
質転換する。形質転換の方法は実施例７記載の方法で調
製したプロトプラストを用い、ポリエチングリコール法
やエレクトロポーレーション法などにより行なうことが
できる。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法の
場合にはＰＥＧ終濃度が１０〜５０％の範囲で行なうの
が好ましい。またカルシウム濃度に関しては２５〜２０
０ｍＭの範囲で用いるのが好ましい。

【００３９】このようにして得られた形質転換株をそれ
自体公知の方法で培養する。培地としては、例えばグル
コース・ペプトン培地などが挙げられる。培養は通常１
５℃〜４０℃、好ましくは２４℃〜３７℃で７日間行な
う。振盪培養でも静置培養でもよいが、必要に応じて通
気や攪拌を加えることもできる。

【００４０】培養終了後、それ自体公知の方法で細胞と
上清とを分離する。分泌された遺伝子産物は、通常の蛋
白質精製法、例えば塩析、等電点沈澱、ゲル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣなど）
などを用いることにより、精製することができる。細胞
内に残存する遺伝子産物は、当分野における通常の方
法、例えば、超音波破砕法、フレンチプレスなどを利用
した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵素に
よる破砕法などにより細胞を破砕する。

【００４１】さらに必要ならば、トリトン−Ｘ１００、
デオキシコーレートなどの界面活性剤を加えることによ
って産生された遺伝子産物を抽出する。このようにして
得られた抽出液中に含まれる遺伝子産物は上記の蛋白質
精製法を用いることにより精製することができる。

【００４２】上記で得られるリグニンパーオキシダーゼ
活性は、例えばベラトリルアルコールを酸化して生じる
ベラトルアルデヒドの生成に伴う吸光度の増加を指標と
した方法［Ｍ．Ｔｉｅｎ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，２２８０，（１９８
４）］で測定することができる。以下に、本発明を実施
例をもって、さらに詳しく説明するが、本発明はこれに
限定されることはない。

【００４３】

【実施例】以下、実施例によって本発明を詳細に述べ
る。実施例１．ｃＤＮＡライブラリーの作製 アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９１７株）の平板寒天培養
から直径５mmの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、グ
ルコース・ペプトン培地（グルコース２％、ポリペプト
ン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．１
％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂ Ｏ ０．０５％、りん酸でｐＨ
４．５に調製）２００ｍｌに植菌し、２８℃で７日間回
転振盪培養を行ない、菌体を集菌後、１Ｌの滅菌水で菌
体を洗浄した。

【００４４】この菌体をアルギニンだけを除いた合成培
地（グルコース２％、 (ＮＨ₄)₂ ＨＰＯ₄ ０．１５％、
ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．０５％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．１％、Ｍｇ
ＳＯ ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．１５％、塩酸チアミン０．１２ｐ
ｐｍ、Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（Ｄｉ
ｆｃｏ）０．６７％、りん酸でｐＨ５．６に調製、アミ
ノ酸含量はリジン一塩酸塩７０ｐｐｍ、メチオニン７０
ｐｐｍ、システイン一塩酸塩１２０ｐｐｍ、ロイシン７
０ｐｐｍ、イソロイシン７０ｐｐｍ、バリン６０ｐｐ
ｍ、フェニルアラニン８０ｐｐｍ、チロシン９０ｐｐ
ｍ、トリプトファン１００ｐｐｍ、ヒスチジン一塩酸塩
８０ｐｐｍ、スレオニン６０ｐｐｍ、グルタミン酸９０
ｐｐｍ、プロリン６０ｐｐｍ、アスパラギン酸７０ｐｐ
ｍ、アラニン４０ｐｐｍ、グリシン４０ｐｐｍ、セリン
５０ｐｐｍ）５００ｍｌに植菌し、２８℃で４日間回転
振盪培養を行い、集菌後液体窒素で凍結した。この凍結
菌体５ｇを乳鉢を用いて粉砕した。

【００４５】以下に使用する器具、試薬類は常法により
［Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
／２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）］ジエチルピロ
カーボネート処理したものを用いた。粉砕した菌体をフ
ァルマシア社製ＲＮＡ抽出キットを用い、そのマニュア
ルに従って全ＲＮＡを抽出した。

【００４６】該全ＲＮＡ画分２mgを、ファルマシア社製
のｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用
い、そのマニュアルに従ってｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡ画
分を調製した。次に５μｇのｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡか
らアマシャム社製のｃＤＮＡ合成キットを用いて、その
マニュアルに従って２本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成し
た２本鎖ｃＤＮＡからアマシャム社製のｃＤＮＡクロー
ニングキットを用い、そのマニュアルに従ってλｇｔ１
０でのｃＤＮＡライブラリーを作製した。その結果、５
ｘ１０⁷ プラーク／μｇインサートｃＤＮＡの力価を有
するｃＤＮＡライブラリーが作製できた。さらに、直径
９０ｍｍのシャーレに２，０００〜３，０００のプラー
クが出るようにＥ．ｃｏｌｉ ＮＭ５１４にファージを
感染させ、当該遺伝子のクローニングを行なった。

【００４７】実施例２．ｃＤＮＡライブラリーからＯＣ
Ｔ遺伝子の単離 上記ｃＤＮＡライブラリーからのＯＣＴ遺伝子の単離は
常法のプラークハイブリダイゼーション［Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら著、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ／２ｎｄ Ｅｄ
ｉｔｉｏｎ（１９８９）］により行なった。

【００４８】プラークハイブリダイゼーションに用いた
プローブは次の配列を持つ合成オリゴマー（17mer,２
本） 5'-TTTATGCATTGTCTICC-3' 5'-CCATAAAAAACCTCATC-3' C C C G G G T G C T

【００４９】および麹カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のＡＲＧＢ遺伝子ＳａｌＩ０．
８ｋｂ断片を³²Ｐで放射能標識したものである。続い
て、プレハイブリダイゼーション溶液（５ｘＳＳＣ，５
ｘデンハート溶液、１％ＳＤＳ、変性１００μｇ／ｍｌ
仔牛胸線ＤＮＡ）中で６５℃一晩振盪し、さらにハイブ
リダイゼーション溶液１ｍｌにつき、１ｘ１０⁶ ｃｐｍ
のＤＮＡプローブを加えて４５℃２４時間ハイブリダイ
ゼーションを行なった。

【００５０】ハイブリダイゼーション後のメンブランは
常法に従い、数回洗浄し、乾燥後増感紙を用いたオート
ラジオグラフィーにより陽性プラークを選抜した。その
結果、約８０，０００個のプラークの中から上記３種類
のＤＮＡプローブがハイブリダイズする１個のクローン
を選抜することができた。

【００５１】陽性プラークから常法に従って、液体培養
によりファージＤＮＡを調製し、制限酵素ＢａｍＨＩで
切断後１％アガロースゲルにより分画して１．３ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を得た。該断片を常法に従って宝酒造社製
プラスミドベクターｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサイトにサ
ブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し
た。サブクローニングしたＤＮＡを大量に調製し、超遠
心（５０，０００ｒｐｍ，１６ｈｒ，２０℃）で精製し
て塩基配列を決定した。塩基配列の決定はＵｎｉｔｅｄ
Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製のシーケ
ナーゼのキットを用いて行なった。

【００５２】その結果、配列番号３に示す１１２５ｂｐ
から成るオープンリーディングフレームが見い出され、
得られたＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列は、プ
ローブとして用いた麹カビ（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）Ａ
ＲＧＢのアミノ酸配列や他の生物種由来のＯＣＴと比較
して高い類似性が認められ、さらにＯＣＴに共通の配列
を持つカルバモイル基結合領域が認められた。従って、
今回単離した１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片はアラゲカワラ
タケのＯＣＴ遺伝子であることが判明した。なお、この
オープンリーディングフレームによりコードされている
アミノ酸配列を配列番号１に示す。

【００５３】この１．３ｋｂｐのｃＤＮＡ断片を用いた
染色体遺伝子のクローニングを実施例３、４に示す。な
お、得られたアラゲカワラタケ由来ＯＣＴｃＤＮＡ遺伝
子を含む大腸菌形質転換株Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／
ｐＵＣＲＭは工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第１３４２４号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２４）とし
て寄託され、そしてＦＥＲＭ ＢＰ−４２０２としてブ
ダペスト条約に基く国際寄託に移管された。

【００５４】実施例３．染色体遺伝子ライブラリーの作
製 アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９１７株）の平板寒天培養
から直径５mmの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、実
施例１で述べたグルコース・ペプトン培地２００ｍｌに
植菌し、２８℃で７日間回転振盪培養を行なった。菌体
を集菌後、１Ｌの滅菌水で菌体を洗浄し、液体窒素で凍
結した。

【００５５】この凍結菌体５ｇを乳鉢を用いて粉砕し
た。粉砕した菌体を遠心管に移し、Ｌｙｓｉｓ緩衝液
（１００ｍＭトリス（ｐＨ８）、１００ｍＭＥＤＴＡ、
１００ｍＭ ＮａＣｌさらにプロテイナーゼＫを１００
μｇ／ｍｌとなるように添加）１０ｍｌを加え、５５℃
で３時間インキュベートした。インキュベート後、フェ
ノール抽出、クロロホルム抽出を行ない、抽出した水層
部分にエタノールを徐々に添加しＤＮＡが析出したとこ
ろで染色体ＤＮＡを巻取り、ＴＥ溶液に懸濁した。

【００５６】得られた染色体ＤＮＡ１００μｇを制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解し、５〜２０％ショ糖密度勾
配超遠心分離（３０，０００ｒｐｍ，１８時間）により
分画し、１０〜２５ｋｂｐ断片区分を集めた。この断片
区分を東洋紡社製ファージλＥＭＢＬ３−ＢａｍＨＩア
ームにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、得られたフ
ァージＤＮＡをＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ギガパックゴ
ールドを用いてパッケージング後、大腸菌Ｐ２３９２株
に感染せしめ染色体ＤＮＡライブラリーとした。

【００５７】実施例４．染色体ＤＮＡライブラリーから
のＯＣＴ遺伝子の単離 上記染色体ＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダ
イゼーションによりＯＣＴ遺伝子を含むクローンの選抜
を行なった。この一連の操作は常法［Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら著、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ／２ｎｄ Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ（１９８９）］によった。

【００５８】プラークハイブリダイゼーションに用いた
プローブは実施例２で得られたｃＤＮＡ断片を［α−³²
Ｐ］ｄＣＴＰで放射能標識したものである。その結果、
約４０，０００個のプラークの中から６個の陽性クロー
ンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従
って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で
消化し、上記１．３ｋｂｐｃＤＮＡをプローブとして用
いてサザンハイブリダイゼーションを行なった。その結
果、制限酵素ＳａｌＩで消化して得られた断片中に単一
のＤＮＡバンドとして５．５ｋｂにハイブリダイズする
クローンが認められた。

【００５９】上記ＳａｌＩ断片５．５ｋｂｐをアガロー
スゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＵ
Ｃ１８のＳａｌＩサイトにサブクローン化し、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株へ形質転換した。サブクローン化したＤＮＡ
を大量に調製し、超遠心操作（５０，０００ｒｐｍ，１
６ｈｒｓ，２０℃）で精製し、ＯＣＴ欠損アラゲカワラ
タケ変異株への供与ＤＮＡ試料とした。

【００６０】なお、得られたアラゲカワラタケ由来ＯＣ
Ｔ遺伝子を含む大腸菌形質転換株Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０９／ｐＵＣＲ１は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研寄託菌寄第１２６７９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６
７９）として寄託され、そしてＦＥＲＭ ＢＰ−４２０
１としてブダペスト条約に基く国際寄託に移管された。
さらに、サブクローニングしたＤＮＡの塩基配列を決定
した。塩基配列の決定はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製のシーケナーゼのキットを
用いて行なった。

【００６１】その結果、配列番号４に示すようにアラゲ
カワラタケ由来染色体ＯＣＴ遺伝子は４つのイントロン
により分断されていることが判明した。また翻訳開始点
（６５３ｂｐ）上流にはいくつかのＴＡＴＡ−ｂｏｘ様
配列やＣＡＡＴ−ｂｏｘ様配列、さらにアミノ酸合成系
遺伝子に認められるｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ配列も存在し
ていた。さらに実施例２において単離したｃＤＮＡ遺伝
子と比較してオープンリーディングフレーム内に２１ヶ
所の塩基置換が認められたが、２０ヶ所の塩基置換はア
ミノ酸をコードするコドンの第３番目の塩基が異なって
いるだけでアミノ酸自身の置換は認められなかった。

【００６２】唯一、配列番号４における１４１４番目か
ら１４１６番目に対応するアミノ酸がアルギニンからリ
ジンへ置換されていたが共に塩基性のアミノ酸となり性
質に変化は認められなかった。従って、実施例２で単離
したｃＤＮＡ遺伝子と実施例４で単離した染色体遺伝子
は対立遺伝子の関係にあることが推定される。上記染色
体由来のＯＣＴ遺伝子によりコードされているＯＣＴの
アミノ酸配列を配列番号２に示す。

【００６３】実施例５．栄養要求性変異株の単離 アラゲカワラタケの子実体を誘導するために、１Ｌの三
角フラスコにラディアータ・パイン由来のメカニカルパ
ルプ２０ｇとポテト・デキストロース培地１３０ｍｌを
加え、アラゲカワラタケ野生株（ＩＦＯ４９１７）を接
種し、光照射下で２８℃にて８週間培養した。得られた
子実体の一部を切り取り滅菌水で洗浄することにより担
子胞子を遊離させ、ポアサイズ６０ミクロンのナイロン
メッシュを通して子実体を除き、担子胞子懸濁液を作製
した。上記胞子懸濁液を段階的に希釈して、グルコース
・ペプトン寒天培地に塗布し、２８℃で一昼夜培養後、
実体顕微鏡で観察しながら、シングルコロニーを単離し
た。単離株をクランプの有無と核染色により一核である
株を選抜した。

【００６４】上記で作製した一核菌糸を最小培地（グル
コース ２％、（ＮＨ₄ ）₂ ＨＰＯ ₄ ０．１５％、Ｋ
Ｈ₂ ＳＯ₄ ０．０５％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．１％、Ｍ
ｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．１５％、塩酸チアミン ０．
１２ppm)にカザミノ酸を１０ｇ／ｌおよび寒天を１３ｇ
／ｌ添加した寒天培地上で２８℃で７から１０日間培養
した。上記寒天培地に生育した菌糸上に滅菌水を注ぎ、
分裂子懸濁液とした。次に、６０ミクロンのナイロンメ
ッシュで濾過して菌糸体を除き、濾液を１５００×ｇで
１０分間、室温で遠心してペレットを集め、得られた分
裂子を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し
た。

【００６５】上記分裂子懸濁液２ｍｌにフィルター滅菌
したＮＴＧ溶液を５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、
２８℃で６０分間、ゆっくりと振盪した。この変異操作
は生存率が３〜５％程度となるように行った。変異処理
を施された分裂子を１，５００×ｇで１０分間遠心し
て、上清を捨て、上記リン酸バッファー１０ｍｌを注
ぎ、さらに遠心した。この洗浄操作を３回繰り返した。
洗浄後、リン酸バッファーに再懸濁し、数段階に希釈し
て上記最小寒天培地に塗布し、コロニーが１ｍｍ程度ま
で増殖したらグルコース・ペプトン軟寒天培地（完全培
地）を重層し、新たに増殖が認められたクローンを選抜
した。

【００６６】上記で選抜したクローンに関してどのアミ
ノ酸代謝系遺伝子に突然変異的欠損があるかを次に示す
ように決定した。アミノ酸プールは、以下のように、そ
れぞれ４種ならびに５種の異なるアミノ酸のＬ−異性体
を濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解して調製し
た。

【００６７】

【表１】

【００６８】上記のように、アミノ酸プール１はそれぞ
れ１０ｍｇ／ｍｌ のグリシン、ヒスチジン、フェニル
アラニン、グルタミン酸を含み；アミノ酸プール２はそ
れぞれ１０ｍｇ／ｍｌ のアスパラギン、ロイシン、チ
ロシンおよびセリンを含み、以下同様である。第１０番
目のアミノ酸プールは、１ｇのカザミノ酸を１Ｌの滅菌
水に溶解することにより調製した。アミノ酸プール１〜
１０を２００μｌずつ別々に最小寒天培地（直径９０ｍ
ｍのシャーレに２０ｍｌの培地を含む）に添加し、アミ
ノ酸プレートを作製した。これらのプレートを一晩乾燥
後、使用した。

【００６９】与えられた突然変異株の突然変異的欠損
は、多種のアミノ酸プールプレート上における成長パタ
ーンの検定により決定し得る。上記のようにアルギニン
合成経路に欠損のある変異株はアミノ酸プールプレート
５、９および１０でのみ生育し、それ以外のアルギニン
が添加されていないプレート上では生育しなかった。さ
らに、上記で得られた変異株を同様の変異処理を行うこ
とによりロイシン合成経路上にも欠損が認められる変異
株（ＯＪＩ−１０７８）が得られた。

【００７０】実施例６．ＯＣＴ活性欠損アラゲカワラタ
ケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）突然変異株
の同定 上記実施例５で得られた二重栄養要求性突然変異株にお
けるアルギニン合成経路上の欠損遺伝子部位の同定は、
以下に示す５種類のプレート上での生育の有無を調べる
ことにより行なった。

【００７１】（１） 最小寒天培地＋１５０μｇ／ｍｌ
ロイシン＋２００μｇ／ｍｌシトルリン （２） 最小寒天培地＋１５０μｇ／ｍｌロイシン＋２
００μｇ／ｍｌオルニチン （３） 最小寒天培地＋１５０μｇ／ｍｌロイシン＋２
００μｇ／ｍｌアルギニン （４） 最小寒天培地＋１５０μｇ／ｍｌロイシン （５） 最小寒天培地＋０．２％カザミノ酸

【００７２】上記５種のプレートに接種した変異株を２
８℃で少なくとも４８時間培養した。その結果、得られ
た突然変異株は、プレート（１）、（３）および（５）
上では生育するが、プレート（２）、（４）では生育し
ないことが認められ、ＯＣＴ活性が欠損していることが
判明した。なお、このＯＣＴ活性を欠損しているアラゲ
カワラタケ栄養要求性変異株ＯＪＩ−１０７８は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研寄託菌寄第１２６７
７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６７７）として寄託され、そ
してＦＥＲＭ ＢＰ−４２１０としてブダペスト条約に
基く国際寄託に移管された。

【００７３】実施例７．アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏ
ｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）形質転換法 ａ．一核菌糸培養 直径６mm前後のガラスビーズを約３０個入れた５００ｍ
ｌ容の三角フラスコにＳＭＹ培地（シュークロース１
％、麦芽エキス１％、酵母エキス０．４％）１００ｍｌ
を分注して滅菌後、アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕ
ｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）ＯＪＩ−１０７８の平板寒天培
地から直径５mmの寒天片をコルクボーラーで打ち抜きＳ
ＭＹ培地に植菌し、２８℃で７日間静置培養した（前培
養）。

【００７４】ただし、菌糸を細分化するために、１日に
１〜２回振り混ぜた。次に、１Ｌ容の三角フラスコにＳ
ＭＹ培地２００ｍｌを分注し、さらに攪拌子を入れ、滅
菌後、前培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）
で濾集し、全量を植菌し、２８℃で培養した。なお、ス
ターラーで１日２時間攪拌することにより菌糸を細分化
した。この培養を４日間行なった。もしくは、実施例６
で作製したアラゲカワラタケ栄養要求性一核菌糸体ＯＪ
Ｉ−１０７８株から実施例５に示す方法で分裂子懸濁液
を作製し、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁
した。

【００７５】ｂ．プロトプラストの調製 上記液体培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）
で濾集し、浸透圧調節溶液（０．５Ｍ ＭｇＳＯ₄ 、５
０ｍＭマレイン酸バッファー（ｐＨ ５．６））で洗浄
した。次に湿菌体１００ｍｇあたり１ｍｌの細胞壁分解
酵素液に懸濁し、緩やかに振盪しながら２８℃で４時間
インキュベートしてプロトプラストを遊離させた。細胞
壁溶解酵素として、次の市販酵素製剤を組み合わせて使
用した。即ち、セルラーゼ・オノズカ（ｃｅｌｌｕｌａ
ｓｅ ＯＮＯＺＵＫＡ ＲＳ）ヤクルト社製５ｍｇ、ノ
ボザイム２３４（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ２３４）ノボ社製１
０ｍｇを上記浸透圧調節溶液１ｍｌに溶解して酵素液と
して用いた。

【００７６】ｃ．プロトプラストの精製 上記酵素反応液からナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）
で菌糸断片を除いた後、プロトプラストの回収を高める
ため、ナイロンメッシュ上に残存する菌糸断片とプロト
プラストを上記浸透圧調節溶液で１回洗浄した。得られ
たプロトプラスト懸濁液を遠心分離（１，０００×ｇ、
５分間）し、上清を除去し、４ｍｌの１Ｍシュークロー
ス（２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ６．３）で再懸濁
後、遠心操作を繰り返し、上記１Ｍシュークロース溶液
で２回洗浄した。沈澱物に１Ｍソルビトール溶液（２０
ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．４）に４０ｍＭ塩化カルシウム
を加えた溶液500 μｌに懸濁し、プロトプラスト溶液と
した。この溶液を４℃で保存した。

【００７７】プロトプラスト濃度は血球計算盤を用いて
直接検鏡により求めた。全ての遠心操作はスウィングロ
ーターで１，０００×ｇ、５分間、室温下で行なった。
尚、分裂子からのプロトプラストの調製は、１ｍｌの浸
透圧調節溶液あたり、未発芽の分裂子１０⁸ 個を含む溶
液に対し、上記菌糸からのプロトプラスト調製法と同様
の方法で行ない、精製法ではナイロンメッシュの濾過操
作のみを省略した。両者のプロトプラスト再生率は５〜
１５％の範囲であった。

【００７８】ｄ．形質転換 実施例４で作製したプラスミドｐＵＣＲ１を制限酵素Ｓ
ａｌＩで切断し、アラゲカワラタケ由来ＯＣＴ遺伝子部
分のみをアガロースゲル電気泳動法により取り出した。
１０⁶ 個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液１００
μｌに対し、上記ＤＮＡ断片２μｇを添加し、３０分間
氷冷した。つぎに、液量に対し２／３のＰＥＧ溶液（２
５％ ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ
６．４）を加え、３０分間氷冷した。

【００７９】つぎに、６０分間室温で放置した後、０．
５Ｍシュークロースと１５０μｇ／ｍｌのロイシンを含
む最小軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒
いた。上記プレートを２８℃で数日間培養を行ない、形
質転換体を得た。この時における形質転換効率は３００
コロニー／μｇ形質転換ＤＮＡであった。なお、プラス
ミドベクターｐＵＣ１８だけのＤＮＡ供与体を用いた対
照実験では形質転換体は全く得られなかった。

【００８０】同様に、制限酵素で処理していない環状の
ハイブリッドＤＮＡｐＵＣＲ１を用いた場合も上記と同
じ頻度で形質転換体が得られた。なお、プラスミドベク
ターｐＵＣ１８だけのＤＮＡ供与体を用いた対照実験で
は形質転換体は全く得られなかった。

【００８１】実施例８．リグニンパーオキシダーゼ発現
プラスミドの構築（１） 担子菌アラゲカワラタケ用のリグニンパーオキシダーゼ
発現プラスミドｐＰｇＨＬＣ１はフェノールオキシダー
ゼ遺伝子のプロモーター領域（特開平３−１５３９２；
微工研菌寄第１００４８号）の下流にリグニンパーオキ
シダーゼ染色体遺伝子（特願平４−６０５０３；ｐＢＳ
ＬＰＯＧ７；微工研菌寄第１２６８３号）の構造遺伝子
領域を連結し、さらに下流にはフェノールオキシダーゼ
遺伝子のターミネーター領域を連結し発現プラスミドと
した。

【００８２】具体的には、フェノールオキシダーゼ染色
体遺伝子ＨｉｎｄＩＩＩ断片５．５ｋｂをＥｘｏｎｕｃ
ｌｅａｓｅＩＩＩとＭｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａ
ｓｅを用いて、フェノールオキシダーゼコード領域を除
去し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結を行ない２．０ｋ
ｂのフェノールオキシダーゼプロモーター領域を含むプ
ラスミドｐＰ１を得た（図２）。

【００８３】他方、前記フェノールオキシダーゼ遺伝子
を含むプラスミドをＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩにより消化
し、ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩ及びＭｕｎｇ ｂｅ
ａｎｎｕｃｌｅａｓｅで処理し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼに
より連結し、さらにＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、Ｋｌ
ｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ処理し、ＢａｍＨＩリンカ
ーと共に連結して、６００ｂｐのターミネーター領域を
含むプラスミドを得、このプラスミドを制限酵素Ｂａｍ
ＨＩとＳａｃＩで消化してターミネーター領域を含む６
００ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法によ
り切り出し、これを前記プラスミドｐＰ１のＢａｍＨＩ
−ＳａｃＩ部位に挿入することによりプラスミドｐＰＣ
１を得た（図２）。

【００８４】一方、リグニンパーオキシダーゼ染色体遺
伝子（特願平４−６０５０３）を大腸菌ベクターｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ⁺ のＢａｍＨＩサイトとＥｃｏ
ＲＩサイト間にサブクローニングした組換え体ＤＮＡで
あるｐＢＳＬＰＯＧ７を上記と同様にＥｘｏｎｕｃｌｅ
ａｓｅＩＩＩとＭｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ
で処理し、今回はリグニンパーオキシダーゼのプロモー
ター領域だけを除去し、ＳａｌＩリンカーを連結した
後、制限酵素ＳａｌＩで処理し、アガロースゲル電気泳
動法により１．８ｋｂのリグニンパーオキシダーゼ構造
遺伝子部分だけを含むＤＮＡ断片を得た。

【００８５】最後に、プロモーター領域とターミネータ
ー領域を含むプラスミド（ｐＰＣ１）を制限酵素Ｓａｌ
Ｉで切断後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、上記１．８ｋ
ｂのリグニンパーオキシダーゼ構造遺伝子部分を挿入し
たのち、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を
行ない、アンピシリン耐性の形質転換株からプラスミド
を単離し、これをｐＰｇＨＬＣ１と命名した（図３）。

【００８６】実施例９．リグニンパーオキシダーゼ発現
プラスミドの構築（２） リグニンパーオキシダーゼｃＤＮＡ遺伝子（特願平４−
６０５０３）を大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ＋のＢａｍＨＩサイトにサブクローニングした組
換え体ＤＮＡであるｐＢＳＬＰＯＣ７（微工研菌寄第１
２６８０号）を制限酵素ＮｃｏＩで切断後、Ｍｕｎｇ
ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅで処理し、平滑化した後、
ＢａｍＨＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
する。さらに、制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、アガロー
スゲル電気泳動法により１．３ｋｂのリグニンパーオキ
シダーゼｃＤＮＡ遺伝子断片を得た。

【００８７】一方、実施例８で用いたプラスミドｐＰＣ
１を制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、上記１．３ｋｂのリ
グニンパーオキシダーゼｃＤＮＡ遺伝子断片を挿入した
後、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株形質転換を行な
い、アンピシリン耐性の形質転換株からプラスミドを単
離し、これをｐＰｃＨＬＣ１と命名した（図４）。

【００８８】実施例１０．リグニンパーオキシダーゼ発
現プラスミドの構築（３） フェノールオキシダーゼ染色体遺伝子（特開平３−１５
３９２；微工研菌寄第１００４８号）ＨｉｎｄＩＩＩ断
片５．５ｋｂをファージベクターＭ１３ｍｐ１９のＨｉ
ｎｄＩＩＩサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、これを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、一本鎖フ
ァージＤＮＡを調製した。次に、２１個のシグナルペプ
チドをコードしている遺伝子の相補鎖（図５断片１に示
す）を合成ＤＮＡ機で化学合成し、上記一本鎖ファージ
ＤＮＡにアニーリングを行ない、プライマー伸長法によ
りフェノールオキシダーゼのプロモーターおよびシグナ
ルペプチド領域だけを合成し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
で切断することにより２．１ｋｂのＤＮＡ断片を調製し
た（断片１）。

【００８９】一方、リグニンパーオキシダーゼの成熟型
酵素をコードしている遺伝子領域を取り出すため、プラ
スミドｐＢＳＬＰＯＧ７（特願平４−６０５０３；微工
研菌寄第１２６８３号）を基礎とし、図５の断片２に示
すプライマーを用いて上記と同様のプライマー伸長法に
よりＤＮＡを合成し、制限酵素ＳａｌＩで切断し、リグ
ニンパーオキシダーゼのシグナルペプチドコード領域お
よびプロ領域を除去した１．７ｋｂのＤＮＡ断片を得た
（断片２）。

【００９０】大腸菌ベクターｐＵＣ１８を制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切断し、上記２種類のＤＮＡ断
片を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、大
腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行ない、アンピシリン耐
性の形質転換株の中から２種類のＤＮＡ断片が同時に挿
入されているプラスミドを単離し、これをｐＰＳｇＨＬ
１と命名した（図５）。

【００９１】実施例１１．リグニンパーオキシダーゼ発
現プラスミドの構築（４） リグニンパーオキシダーゼのプロ型酵素をコードしてい
る遺伝子領域を取り出すため、実施例１０と同様に、プ
ラスミドｐＢＳＬＰＯＧ７（微工研菌寄第１２６８３
号；特願平４−６０５０３）を基礎とし図６の断片３に
示すプライマーを用いてプライマー伸長法によりＤＮＡ
を合成し、制限酵素ＳａｌＩで切断し、リグニンパーオ
キシダーゼのシグナルペプチド領域のみを除去した１．
７ｋｂのＤＮＡ断片を得た（断片３）。

【００９２】大腸菌ベクターｐＵＣ１８を上記と同様に
制限酵素で切断し、上記の（断片１）と（断片３）を混
合して、連結を行ない、２種類のＤＮＡ断片が同時に挿
入されているプラスミドを単離し、これをｐＢＳｐｒｏ
ＨＬと命名した（図６）。

【００９３】実施例１２．リグニンパーオキシダーゼ発
現プラスミドの構築（５） 担子菌アラゲカワラタケ用のリグニンパーオキシダーゼ
発現プラスミドｐＲＰｇＨＬ１はＯＣＴ遺伝子のプロモ
ーター領域の下流にリグニンパーオキシダーゼ遺伝子の
構造遺伝子領域を連結し、作製した発現プラスミドであ
る。具体的には実施例１０と同様にＯＣＴ染色体遺伝子
を含むプラスミドｐＵＣＲ１を基礎とし図７の断片４に
示すプライマーを用いてプライマー伸長法によりＤＮＡ
を合成し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ＯＣＴ染色体
遺伝子のプロモーター領域のみを取り出した０．６ｋｂ
のＤＮＡ断片を得た（断片４）。

【００９４】またリグニンパーオキシダーゼ構造遺伝子
部分の取り出しはプラスミドｐＢＳＬＰＯＧ７を基礎と
し図６の断片５に示すプライマーを用いて上記ＤＮＡ断
片と同様にＤＮＡ断片を作製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断することによりリグニンパーオキシダーゼ構造
遺伝子部分のみからなる１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得
た（断片５）。

【００９５】さらに、大腸菌ベクターｐＵＣ１９を制限
酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記２種類
のＤＮＡ断片を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し
たのち、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行ない、アン
ピシリン耐性の形質転換株の中から２種類のＤＮＡ断片
が同時に挿入されているプラスミド単離し、これをｐＲ
ＰｇＨＬ１と命名した（図７）。

【００９６】実施例１３．リグニンパーオキシダーゼ発
現プラスミドの構築（６） マーカー遺伝子を含むプラスミドｐＵＣＲ１を制限酵素
ＥｃｏＲＩで処理し、次にｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅ
ｎｔで突出部分を埋め、平滑末端とした。さらに８ｍｅ
ｒのＨｉｎｄＩＩＩリンカーを付与し、新規にＨｉｎｄ
ＩＩＩサイトを作出した。さらに、制限酵素ＳａｌＩで
処理し、上記と同様に突出部分を埋め、ハイブリッドＤ
ＮＡを自己連結することにより、ＳａｌＩサイトを欠損
させた。

【００９７】次に、上記ハイブリッドＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、アガロースゲル電気泳動法に
より４．２ｋｂのＯＣＴ染色体遺伝子部分を含むＤＮＡ
断片を得（図８）、実施例８で作製したプラスミドｐＰ
Ｃ１のＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入したハイブリッドＤ
ＮＡｐＲＰＣ１を得た（図９）。さらに、ハイブリッド
ＤＮＡｐＲＰＣ１を制限酵素ＳａｌＩで処理し、実施例
８で作製した１．８ｋｂのリグニンパーオキシダーゼ構
造遺伝子部分だけを含むＤＮＡ断片を挿入し、リグニン
パーオキシダーゼ発現プラスミドｐＲＰｇＨＬＣ１を得
た（図１０）。

【００９８】実施例１４．リグニンパーオキシダーゼを
分泌生産するアラゲカワラタケ形質転換体の作製 実施例８で得たｐＰｇＨＬＣ１、実施例９で得たｐＰｃ
ＨＬＣ１、実施例１０で得たｐＰＳｇＨＬ１、実施例１
１で得たｐＰＳｐｒｏＨＬ１および実施例１２で得たｐ
ＲＰｇＨＬ１を用いてアルギニン要求性アラゲカワラタ
ケ（ＯＪＩ−１０７８）を形質転換する場合、選択マー
カーとしてアラゲカワラタケ由来のＯＣＴ遺伝子を保持
するプラスミド（ｐＵＣＲ１）を同時に導入すること
（ＰＥＧ法、もしくはエレクトロポーレーション法な
ど）により形質転換体ｐＰｇＨＬＣ１／ＯＪＩ−１０７
８、ｐＰｃＨＬＣ１／ＯＪＩ−１０７８、ｐＰＳｇＨＬ
１／ＯＪＩ−１０７８、ｐＰＳｐｒｏＨＬ１／ＯＪＩ−
１０７８、およびｐＲＰｇＨＬ１／ＯＪＩ−１０７８を
得た。

【００９９】さらに、実施例１３で得たｐＲＰｇＨＬＣ
１だけを用いてアルギニン要求性アラゲカワラタケ（Ｏ
ＪＩ−１０７８）を形質転換する場合も上記と同様にＰ
ＥＧ法、もしくはエレクトロポーレーション法などによ
り目的遺伝子を導入して、形質転換体ｐＲＰｇＨＬＣ１
／ＯＪＩ−１０７８を得た。ここで、形質転換に供与す
るＤＮＡは環状、もしくは直鎖状にかかわらず目的とす
る形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件
を記す。

【０１００】約１０⁷ 個／１００μｌ濃度のプロトプラ
スト溶液１００μｌに対し実施例８、実施例９、実施例
１０、実施例１１及び実施例１２で作製したプラスミド
２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マ
ーカーとしてｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間
氷冷した。同様に実施例１３で作製したプラスミドだけ
を２μｇ添加し、３０分管氷冷した。

【０１０１】次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３
４００、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、
３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースを含む実施
例１記載の合成軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレ
ートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行
ない、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤ
ＮＡを調製し、目的とするリグニンパーオキシダーゼ発
現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリ
ダイゼーションにより確認した。

【０１０２】実施例１５．形質転換株の培養およびリグ
ニンパーオキシダーゼの活性測定 上記実施例１４で得られた形質転換体５株（ｐＰｇＨＬ
Ｃ１／ＯＪＩ−１０７８、ｐＰｃＨＬＣ１／ＯＪＩ−１
０７８、ｐＰＳｇＨＬ１／ＯＪＩ−１０７８、ｐＰＳｐ
ｒｏＨＬ１／ＯＪＩ−１０７８及びｐＲＰｇＨＬＣ１／
ＯＪＩ−１０７８）を５００ｍｌ容の三角フラスコに１
００ｍｌのグルコースペプトン液体培地（グルコース２
０ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、Ｋ
Ｈ₂ ＰＯ ₄ １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．５ｇ
／Ｌ、リン酸でｐＨ４．５に調製）に接種し、２８℃で
１０日間、振盪下で培養した。得られる培養液を遠心分
離し、その上清を得た。

【０１０３】また、形質転換体（ｐＲＰｇＨＬ１／ＯＪ
Ｉ−１０７８）は実施例１で用いた合成培地１００ｍｌ
に接種し、２８℃で１０日間、振盪下で培養した。得ら
れる培養液を遠心分離し、その上清を得た。活性測定法
は８ｍＭベラトリルアルコール５０μｌ、０．５Ｍ酒石
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）２００μｌ、酵素液
７００μｌおよび５．４ｍＭ過酸化水素５０μｌを充分
に混合し、反応の結果生じるベラトルアルデヒドの３１
０ｎｍの吸光度を時間を追って記録することにより行な
い、上記培養上清中にベラトリルアルコールをベラトル
アルデヒドへ変換する酵素活性が２０〜８０ユニット／
ｍｌの範囲で認められた。ここで酵素活性単位は１分間
にベラトルアルデヒド１μｍｏｌ増加させる活性を１ユ
ニットとした。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを
含まないＯＪＩ−１０７８株の培養上清には本活性は認
められなかった。

【０１０４】実施例１６．フェノールオキシダーゼ発現
プラスミドの構築 アラゲカワラタケ由来ＯＣＴ遺伝子に相当するＤＮＡ断
片はコーディング領域の開始コドンＡＴＧ上流に約２ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片が存在し、プロモーター領域を含むこ
とより、このＯＣＴ遺伝子の制御領域の下流にフェノー
ルオキシダーゼの構造遺伝子（シグナルペプチドコード
領域と成熟型酵素コード領域から成る）を連結し、アラ
ゲカワラタケＯＪＩ−１０７８株に導入することによる
フェノールオキシダーゼの生産性向上を試みた。

【０１０５】具体的には実施例１０と同様にＯＣＴ遺伝
子ＳａｌＩ断片５．５ｋｂをファージベクターＭ１３ｍ
ｐ１９のＳａｌＩサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、図７の断片４に示すプライマーを用いてプライ
マー伸長法によりＤＮＡを合成し、制限酵素ＥｃｏＲＩ
で切断し、ＯＣＴ染色体遺伝子のプロモーター領域のみ
を取り出した０．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た（断片
４）。

【０１０６】一方、フェノールオキシダーゼ染色体遺伝
子を含むプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、フ
ァージベクターＭ１３ｍｐ１９のＥｃｏＲＩサイトに挿
入し、図１１の断片５に示すプライマーを用いてプライ
マー伸長法によりＤＮＡを合成し、制限酵素ＥｃｏＲＩ
で切断することによりフェノールオキシダーゼ構造遺伝
子部分のみを含む４．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（断片
６）。

【０１０７】大腸菌ベクターｐＵＣ１８を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで切断し、上記２種類のＤＮＡ断片を混合して、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、大腸菌ＪＭ１０９
株の形質転換を行ない、アンピシリン耐性の形質転換株
の中から２種類のＤＮＡ断片が同時に挿入されているプ
ラスミドを単離し、これをｐＲＰｇＰＯ１と命名した
（図１１）。

【０１０８】実施例１７．フェノールオキシダーゼ発現
プラスミドによるアラゲカワラタケの形質転換体の作製 上記プラスミドｐＲＰＰＯＭ１を用いて、実施例１４に
記載の方法でアラゲカワラタケＯＪＩ−１０７８株を形
質転換し、形質転換体ｐＲｃＰＯ１／ＯＪＩ−１０７８
を得た。またフェノールオキシダーゼ染色体遺伝子（特
開平３−１５３９２；微工研菌寄第１００４８号）を導
入することによる遺伝子量効果を期待する形質転換体ｐ
ＰＯ１／ＯＪＩ−１０７８を得た。

【０１０９】実施例１８．フェノールオキシダーゼの分
泌生産および活性測定 実施例１７．で得られた形質転換体アラゲカワラタケｐ
ＲＰＰＯＭ１／ＯＪＩ−１０７８を実施例１記載の合成
培地１００ｍｌに接種し、実施例１４に記載の方法と同
様に２８℃で２０日間振盪下で培養を行なった。得られ
る培養液を遠心分離し、その上清を得た。また、ｐＰＯ
１／ＯＪＩ−１０７８を前述のグルコースペプトン培地
を用い、上記と同条件で培養を行なった。上記のように
して得られた培養上清中にフェノールオキシダーゼ活性
が、それぞれのコントロールとなる供与ＤＮＡを含まな
いＯＪＩ−１０７８株に比べ２０〜５０％増加している
ことが認められた。

【０１１０】実施例１９．ルシフェラーゼ発現プラスミ
ドの構築 市販のルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミド（ピッカ
ジーン）（東洋インキ製造（株））、エンハンサーベク
ターをＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、アガロース
ゲル電気泳動法によりルシフェラーゼ構造遺伝子を含む
約３ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、実施例８記載のプラ
スミドｐＰＣ１のＢａｍＨＩサイトに挿入し、目的とす
るルシフェラーゼ発現プラスミドｐＰＬＵＣＣ１を構築
した（図１２）。

【０１１１】実施例２０．ルシフェラーゼ発現プラスミ
ドによるアラゲカワラタケの形質転換体の作製及び活性
測定 実施例１９で得たｐＰＬＵＣＣ１を用いて、実施例１４
記載の方法でアラゲカワラタケＯＪＩ−１０７８株を形
質転換し、形質転換体ｐＰＬＵＣＣ１／ＯＪＩ−１０７
８を得た。得られた形質転換体ｐＰＬＵＣＣ１／ＯＪＩ
−１０７８を実施例１記載のグルコース・ペプトン培地
１００ｍｌに接種し、実施例１４記載の方法と同様に２
８℃で７日間振盪培養を行なった。培養終了後、遠心分
離により菌体を集菌し、数回滅菌水で洗浄した。

【０１１２】得られた菌体を液体窒素下で凍結し、乳鉢
ですりつぶし、細胞破砕物を３０ｍｌ容コーニング製遠
心チューブに加え、細胞溶解剤（２５ｍＭトリス・リン
酸ｐＨ７．８、２ｍＭＤＴＴ、２ｍＭ１，２−ｄｉａｍ
ｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−
ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄｓ、１０％グリセロ
ール、１％トリトンＸ−１００）に懸濁し、室温で１０
〜１５分間放置した。放置後、遠心操作（約５秒間）に
より菌体を除去し、その上清２０μｌと添付の発光基質
液１００μｌを室温にて混和したところ、暗所にて発光
が認められた。

【０１１３】

【発明の効果】本発明は、これまで遺伝子組換え技術に
よる酵素生産が困難とされていた酵素タンパク質を、活
性のある形で生産するための新規な形質転換系を提供す
るものである。また、これまでにクローニングされた担
子菌由来の種々の染色体遺伝子には、多数のイントロン
が存在していることが報告されている。従って、イント
ロンを含む他の生物種由来の染色体遺伝子をアラゲカワ
ラタケで発現させるための形質転換系を提供するもので
ある。

【０１１４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３７５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：アラゲカワラタケ（Coriolus hirsutus) 株名：ＩＦＯ４９１７ 配列の特徴 1-375 P mat peptide 配列： Met Ala Leu Ser Thr Lys Val Pro His Leu Met Thr Leu Ala Asp 5 10 15 Leu Thr Pro Gly Gln Ile Gln Arg Ile Ile Thr His Ser Tyr His 20 25 30 Leu Lys Arg Thr Ala Gln Pro Trp Leu Ala Pro Gln Gly Arg Ala 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Lys Tyr Ser Asn Ala Pro His Lys Leu Arg Met 50 55 60 Pro Ser Gln Ser Leu Phe Ser Lys Ser Ile Ala Leu Leu Phe Ser 65 70 75 Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser Ala Glu Thr Ala Ala Leu 80 85 90 Leu Leu Gly Gly Gln Ala Leu Phe Leu Gly Arg Glu Asp Ile Gln 95 100 105 Leu Gly Val Asn Glu Thr Val Pro Asp Ser Ala Arg Val Ile Gly 110 115 120 Gly Met Cys Gln Gly Ile Phe Ala Arg Val Gly Asp His Ser Glu 125 130 135 Ile Glu Glu Leu Ala Arg Tyr Ser Pro Val Pro Val Leu Asn Ala 140 145 150 Leu Ser Ser Leu Trp His Pro Thr Gln Val Leu Ala Asp Ile Leu 155 160 165 Thr Leu His Glu His Ala Ala Leu Phe Asp Pro Ala Ser Ala Ser 170 175 180 Pro Thr Pro Ser Ala Ala Asp Ala Phe Ser Gln Lys Tyr Thr Lys 185 190 195 Leu Gly Glu Val Gly Pro Leu Thr Val Ala Tyr Val Gly Asp Ser 200 205 210 Ala Asn Val Leu His Asp Met Leu Val Thr Tyr Pro Arg Leu Gly 215 220 225 His Gln Leu Ala Val Ala Ser Pro Glu Asn Asp Lys Tyr Arg Ala 230 235 240 Pro Lys Ala Val Trp Asp Arg Val Val Glu Leu Gly Cys Asp Lys 245 250 255 Asn Ile Phe Trp Thr Ala Asp Pro Arg Ala Ala Val Lys Gly Ala 260 265 270 Asp Leu Val Val Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Ala 275 280 285 Glu Lys Ala Gln Arg Leu Lys Asp Phe Ala Gly Tyr Gln Val Thr 290 295 300 Glu Ala Leu Cys Arg Glu Gly Gly Ala Asn Pro Asp Trp Lys Phe 305 310 315 Met His Cys Leu Pro Arg Lys Gln Asp Glu Val Asp Asp Glu Val 320 325 330 Phe Tyr Gly Pro Arg Ser Leu Val Phe Gln Glu Ser Asp Asn Arg 335 340 345 Lys Trp Thr Ile Met Ala Leu Phe Asp Leu Leu Phe Gly Lys Trp 350 355 360 Ser Leu Leu Ala Arg Asn Gly Glu Gly Ala Asp Ala Gly Ser Glu 365 370 375

【０１１５】配列番号：２ 配列の長さ：３７５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：アラゲカワラタケ（Coriolus hirsutus) 株名：ＩＦＯ４９１７ 配列の特徴 1-375 P mat peptide 配列： Met Ala Leu Ser Thr Lys Val Pro His Leu Met Thr Leu Ala Asp 5 10 15 Leu Thr Pro Gly Gln Ile Gln Arg Ile Ile Thr His Ser Tyr His 20 25 30 Leu Lys Arg Thr Ala Gln Pro Trp Leu Ala Pro Gln Gly Arg Ala 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Lys Tyr Ser Asn Ala Pro His Lys Leu Arg Met 50 55 60 Pro Ser Gln Ser Leu Phe Ser Lys Ser Ile Ala Leu Leu Phe Ser 65 70 75 Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser Ala Glu Thr Ala Ala Leu 80 85 90 Leu Leu Gly Gly Gln Ala Leu Phe Leu Gly Arg Glu Asp Ile Gln 95 100 105 Leu Gly Val Asn Glu Thr Val Pro Asp Ser Ala Arg Val Ile Gly 110 115 120 Gly Met Cys Gln Gly Ile Phe Ala Arg Val Gly Asp His Ser Glu 125 130 135 Ile Glu Glu Leu Ala Arg Tyr Ser Pro Val Pro Val Leu Asn Ala 140 145 150 Leu Ser Se Leu Trp His Pro Thr Gln Val Leu Ala Asp Ile Leu 155 160 165 Thr Leu His Glu His Ala Ala Leu Phe Asp Pro Ala Ser Ala Ser 170 175 180 Pro Thr PrO Ser Ala Ala Asp Ala Phe Ser Gln Lys Tyr Thr Lys 185 190 195 Leu Gly Glu Val Gly Pro Leu Thr Val Ala Tyr Val Gly Asp Ser 200 205 210 Ala Asn Val Leu His Asp Met Leu Val Thr Tyr Pro Arg Leu Gly 215 220 225 His Gln Leu Ala Val Ala Ser Pro Glu Asn Asp Arg Tyr Arg Ala 230 235 240 Pro Lys Ala Val Trp Asp Arg Val Val Glu Leu Gly Cys Asp Lys 245 250 255 Asn Ile Phe Trp Thr Ala Asp Pro Arg Ala Ala Val Lys Gly Ala 260 265 270 Asp Leu Val Val Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Ala 275 280 285 Glu Lys Ala Gln Arg Leu Lys Asp Phe Ala Gly Tyr Gln Val Thr 290 295 300 Glu Ala Leu Cys Arg Glu Gly Gly Ala Asn Pro Asp Trp Lys Phe 305 310 315 Met His Cys Leu Pro Arg Lys Gln Asp Glu Val Asp Asp Glu Val 320 325 330 Phe Tyr Gly Pro Arg Ser Leu Val Phe Gln Glu Ser Asp Asn Arg 335 340 345 Lys Trp Thr Ile Met Ala Leu Phe Asp Leu Leu Phe Gly Lys Trp 350 355 360 Ser Leu Leu Ala Arg Asn Gly Glu Gly Ala Asp Ala Gly Ser Glu 365 370 375

【０１１６】配列番号：３ 配列の長さ：１２８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：アラゲカワラタケ (Coriolus hirsutus) 株名：ＩＦＯ４９１７ 配列の特徴 78-1202 P CDS 配列： GCACAGAGCG ACAGCCTGAC TCGTCCCGCG CGCCTCCCAA CCGGCCAGTC 50 GTCCTCTCAT CCGCTCCTTG ACCCGCCATG GCGCTCTCGA CGAAAGTGCC 100 GCACCTGATG ACGCTCGCGG ACCTGACCCC GGGCCAGATC CAGCGCATCA 150 TCACGCACTC CTACCACCTC AAGCGCACCG CCCAGCCCTG GCTCGCGCCC 200 CAGGGGCGCG CAGGCAGCGG CGGCAAGTAC AGCAACGCCC CGCACAAGCT 250 GCGCATGCCG TCGCAGTCGC TGTTCAGCAA GTCCATCGCC CTCCTGTTTT 300 CAAAGCGGAG CACGCGCACG CGGCTCTCCG CCGAGACCGC CGCCCTCCTC 350 CTCGGCGGGC AGGCGCTCTT CCTCGGGCGG GAGGACATCC AGCTCGGCGT 400 GAACGAGACC GTGCCCGACT CGGCGCGGGT CATCGGCGGG ATGTGCCAGG 450 GCATCTTCGC GCGGGTGGGG GACCATTCCG AGATCGAGGA ACTCGCCCGG 500 TACTCGCCCG TGCCGGTGCT CAACGCGCTC TCCTCGCTCT GGCACCCGAC 550 GCAGGTGCTC GCGGACATCC TCACGCTGCA CGAGCACGCC GCGCTCTTCG 600 ACCCGGCCTC CGCGAGCCCC ACGCCCTCCG CCGCGGACGC GTTCTCGCAA 650 AAGTACACCA AGCTCGGCGA GGTGCGCCCG CTCACGGTCG CGTACGTCGG 700 CGACAGCGCG AACGTCCTGC ACGACATGCT CGTCACGTAC CCGCGCCTCG 750 GCCACCAGCT GCGCGTCGCG AGCCCCGAGA ACGACAAGTA CCGCGCGCCG 800 AAGGCGGTGT GGGACCGCGT CGTCGAGCTC GGCTGCGATA AGAACATCTT 850 CTGGACGGCG GACCCGCGGG CGGCGGTGAA GGGCGCCGAT TTGGTCGTTA 900 CTGACACCTG GATCTCGATG GGCCAAGAGG CCGAGAAGGC ACAGCGACTG 950 AAAGACTTTG CAGGCTACCA AGTGACGGAG GCGCTGTGCC GGGAAGGCGG 1000 GGCCAACCCG GACTGGAAGT TTATGCATTG TCTTCCTCGG AAGCAGGACG 1050 AGGTGGACGA CGAGGTGTTC TACGGGCCGC GATCGCTGGT GTTCCAGGAG 1100 TCGGACAACC GGAAGTGGAC GATCATGGCG TTGTTCGACC TTCTCTTTGG 1150 AAAATGGTCG CTGCTCGCGC GGAACGGGGA GGGCGCAGAT GCGGGGTCGG 1200 AGTAGACACA GATAGCGTAG ACGGAGTAAT GCTGGCACAA CGAACGTCTG 1250 TCCGTGCGGG GTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1280

【０１１７】配列番号：４ 配列の長さ：２５４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：アラゲカワラタケ（Coriolus hirsutus) 株名：ＩＦＯ４９１７ 配列の特徴 653-2340 P CDS 1064-1116 intron 1539-1928 intron 2083-2140 intron 2215-2276 intron 配列： GAATTCTGAA GCTCTCCGGC AGCCGTTCGT GTGCAAACGT GAAGGTCGTC 50 ATCGAGCCCT CCGTCTCCAA CTTCCGTGCC TCAGCGCGCG TCGTCGGCAA 100 CTTCCCGTCA TGCTTGAACC CCTCCTTCCC AAGCTCGACC GCAAGCCACC 150 GCGGGAAATG GAAGCGAAAG ATAGCGTCGG GACGCGCTAT CTCGGGGGCC 200 GGGCGCGACG GCGGGCGATG CGAGATGTAG AGGCGCTGCC AGCGCGCGAC 250 GATCAAAATC TGGGTGACGC GTTTCGGCGC TTAATGTGAC CCGTGACATC 300 ACGCGTTTCC ATACTTTTAG CGCCCACTAG TAGTATAACA TCTGGAGATA 350 AACCTCCAAT TGTATAACAT GCCCCGACTT CAGCTGGGCA GACCCCATGG 400 CATGTGAACA ATATATGATA CAGTATATAC TGTGCTACAC AATGGCACCA 450 TCGGCCTGCC AGGCTATATC CCTCATGTCT AGGGGCCAAT CCGGCGCCAG 500 TTCCATACCG TTGGCGCCCG CGAGCATCCG GGTGACAAGG TGTGTAGGCG 550 CCCGAGACTC CTCTACCAGC GACGGCACAG AGCGACAGCC TGACTCGTCC 600 CGCACGACTC TCAACCGCGC CAGTCGTCCT CTCATCCGCT CCTTGACCCG 650 CCATGGCGCT CTCGACGAAA GTGCCGCACC TGATGACGCT CGCGGACCTG 700 ACCCCGGGCC AGATCCAGCG CATCATCACG CACTCCTACC ACCTCAAGCG 750 CACCGCCCAG CCCTGGCTCG CGCCCCAGGG GCGCGCAGGC AGCGGCGGCA 800 AGTACAGCAA CGCCCCGCAC AAGCTGCGCA TGCCGTCGCA GTCGCTCTTC 850 AGCAAGTCCA TCGCCCTCCT GTTTTCGAAG CGGAGCACGC GCACGCGGCT 900 CTCCGCCGAG ACCGCCGCCC TCCTCCTCGG CGGGCAGGCG CTCTTCCTCG 950 GGCGGGAGGA CATCCAGCTC GGCGTGAACG AGACCGTGCC GGACTCGGCG 1000 CGCGTCATCG GCGGGATGTG CCAGGGCATC TTCGCGCGCG TGGGGGACCA 1050 TTCGGAGATC GAGGTGCGTC TTTACAGCCG TGCCGTCCAC GCTCGTCACG 1100 CTCACCCATC CCCCAGGAAC TCGCCCGGTA CTCGCCCGTG CCCGTGCTCA 1150 ACGCGCTCTC CTCGCTCTGG CACCCGACGC AGGTGCTCGC GGACATCCTC 1200 ACGCTGCACG AGCACGCCGC GCTCTTCGAC CCGGCCTCCG CGAGCCCCAC 1250 GCCCTCCGCC GCCGACGCGT TCTCGCAAAA GTACACCAAG CTCGGCGAGG 1300 TGCGCCCGCT CACGGTCGCG TACGTCGGCG ACAGCGCGAA CGTGCTGCAC 1350 GACATGCTCG TCACGTACCC GCGCCTCGGC CACCAGCTGC GCGTCGCGAG 1400 CCCCGAGAAC GATAGGTACC GCGCGCCCAA GGCGGTGTGG GACCGCGTCG 1450 TCGAGCTCGG CTGCGATAAG AACATCTTCT GGACGGCGGA CCCGCGGGCG 1500 GCGGTGAAGG GCGCGGACTT GGTCGTCACT GACACCTGGT GAGTCCCCCT 1550 ATACCCTGAG TGGTGGTGAA GTGCAGGATC GCTGCGAACG TATCCGGCGC 1600 GCAAGACCTT TCTCATACGC TGCAGCTGCG TTCACGAATG CACAAACGAT 1650 GGTCAACCAC GGGCATACAA CGCTGGTGTC CGCGTAGACG CCGTCGATGG 1700 AGAGGCTCCG TCTGATATCG CGTACGGAGT GTTTACTAGC CGTAATCTTC 1750 CGGTCGCCCA ACTGTCGGAG AGCGATCTCT GCTTATGGTC GCGCACAACC 1800 TTCAAGTTCG GTCCGACAAC AGAGCTTCGG GTTGCGATTA GATTTGCCCG 1850 ACAGCATGGG CCTCTTCCGC ATCTGTTACC CTGGCGATCC ACGAACGTGT 1900 ACACAGAATA CTGACAGCTG AGTTACAGGA TCTCGATGGG CCAAGAGGCC 1950 GAGAAGGCGC AGCGACTGAA AGACTTTGCA GGGTACCAAG TGACGGAGGC 2000 GCTGTGCCGG GAAGGCGGGG CGAACCCGGA TTGGAAGTTC ATGCATTGTC 2050 TTCCTCGGAA GCAGGACGAG GTGGACGACG AGGTTCGTCG TGCGTCGATC 2100 CCGAGAATTG AGATAGGCTG ACGGGGCCGC ATCGCGACAG GTGTTCTACG 2150 GGCCGCGGTC GCTGGTGTTC CAGGAGTCGG ACAACCGGAA GTGGACGATC 2200 ATGGCGTTGT TCGAGTGCGT TCTCGCGTTA GTTGTGCTGA TACGCCCGAT 2250 GTAGGAGTGC TGATCACGTT CTGCAGCCTT CTCTTTGGAA AGTGGTCGCT 2300 GCTCGCGCGG AACGGGGAGG GCGCAGATGC GGGGTCGGAG TAGACACAGA 2350 TAGCGTAGAC GGAGTAATGC TGGCACAACG ATCGTCTGTC CGTGCGGGGT 2400 ATGTTGCGCG TGAATGTTCC TGGAGACTTG CCTGGAATGG ACAAGATTGG 2450 CCACGTGCCG CGCATGACGT CTGCCAGTCC GGGGTAGCGC CCAGCCCGGC 2500 CGAGCTCTGT TCTCCTCCTC CTCCCCTTCT TCCCTCTCTT 2540

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、アルギニン要求性アラゲカワラタケ変
異株への形質転換に使用されるプラスミドｐＵＣＲ１で
ある。

【図２】図２は、実施例８に示した発現ベクターｐＰＣ
１の構築図を示す。

【図３】図３は、実施例８に示したリグニンパーオキシ
ダーゼ発現プラスミドｐＰｇＨＬＣ１の構築図を示す。

【図４】図４は、実施例９に示したリグニンパーオキシ
ダーゼ発現プラスミドｐＰｃＨＬＣ１の構築図を示す。

【図５】図５は、実施例１０に示したリグニンパーオキ
シダーゼ発現プラスミドｐＰＳｇＨＬ１の構築図を示
す。

【図６】図６は、実施例１１に示したリグニンパーオキ
シダーゼ発現プラスミドｐＰＳｐｒｏＨＬ１の構築図を
示す。

【図７】図７は、実施例１２に示したリグニンパーオキ
シダーゼ発現プラスミドｐＲＰｇＨＬ１の構築図を示
す。

【図８】図８は、実施例１３に示したオルニチンカルバ
モイルトランスフェラーゼ遺伝子断片の作製方法を示
す。

【図９】図９は、実施例１３に示したプラスミドｐＲＰ
Ｃ１の構築図を示す。

【図１０】図１０は、実施例１４に示したリグニンパー
オキシダーゼ発現プラスミドｐＲＰｇＨＬＣ１の構築図
を示す。

【図１１】図１１は、実施例１５に示したフェノールオ
キシダーゼ発現プラスミドｐＲＰｃＰＯ１の構築図を示
す。

【図１２】図１２は、実施例１９に示したルシフェラー
ゼ発現プラスミドｐＰＬＵＣＣ１の構築図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (56)参考文献 Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ. （1986），204，ｐ．349−354 Ｇｅｎｅ（1987），60，ｐ．255−266 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＰｕｂＭｅｄ

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１又は２に示すアミノ酸配列
   を有するアラゲカワラタケのオルニチンカルバモイルト
   ランスフェラーゼ（ＯＣＴ）をコードする構造遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号：４に示す塩基配列を有するＯ
   ＣＴをコードする構造遺伝子及び該構造遺伝子の発現を
   制御する配列を含んで成るＯＣＴ遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１又は請求項２に記載の遺伝子を
   含んで成る環状又は直鎖状ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項１又は請求項２に記載の遺伝子、
   コリオラス属担子菌において機能する発現制御配列、及
   び該発現制御配列の制御下にある目的蛋白質をコードす
   る遺伝子を含んで成る環状又は直鎖状ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hir
   sutus)種に属し、ＯＣＴ発現能を欠損している担子菌。
6. 【請求項６】 請求項３又は４に記載のＤＮＡと請求項
   ５に記載の担子菌とからなる宿主−ベクター系。
7. 【請求項７】 請求項５に記載の担子菌を、請求項３に
   記載のＤＮＡと、コリオラス属担子菌において機能する
   発現制御配列及び該発現制御配列の制御下にある目的蛋
   白質をコードする遺伝子を含んで成る環状又は直鎖状Ｄ
   ＮＡとにより同時形質転換することを特徴とする、目的
   蛋白質を生産することができるコリオラス属担子菌の製
   造方法。
8. 【請求項８】 請求項５に記載の担子菌を、請求項４に
   記載のＤＮＡにより形質転換することを特徴とする、目
   的蛋白質を生産することができるコリオラス属担子菌の
   製造方法。
9. 【請求項９】 請求項７又は８に記載の方法により得ら
   れるコリオラス属担子菌形質転換体。
10. 【請求項１０】 請求項９記載のコリオラス属担子菌形
    質転換体を培養し、その培養物から目的蛋白質を採取す
    ることを特徴とする蛋白質の製造方法。