JP3585840B2 - タンパク質の製造のための発現系 - Google Patents
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Description
本発明はトラメテス(Trametes)およびポリポラス(polyporus)の属の菌類におけるタンパク質の製造のための発現系、その製造およびその使用に関する。
【0002】
タンパク質製造のために、原核性および真核性の種々の発現系が知られている。原核性の発現系の例は、エシェリキア コリおよびバシラス サチリスである。該生物の遺伝子操作のための方法は十分に確立されている。これらの発現系特有の欠点は、就中真核性タンパク質の生産率が屡々期待はずれに少ないことである。その際生産されるタンパク質が活性形で存在することは殆どなく、かつ就中発現されたタンパク質の翻訳後修飾が不足するほど生産されたタンパク質は折り畳まれている。不足した翻訳後修飾として、例えば発現されるべきタンパク質の置換基の付加の不足またはグルコシル化の不足が挙げられる。
【0003】
原核性の発現系の欠点は真核性の発現系の使用によって回避することができる。
【0004】
広く使用される周知の真核性の発現系には、ホニュウ類細胞と同様に昆虫細胞ならびに真核性の微生物、例えば酵母もしくは糸状菌の細胞培養系が属する。一方、前記の発現系において発現されるべきタンパク質は一般に活性形で形成されるが、就中生産率は異種タンパク質の発現においては多くの場合において低すぎる。このために例として酵母サッカロマイセス セレビシエまたはアスコマイセテン(Ascomyceten)綱からの糸状菌における発現が役に立っている。
【0005】
アスペルギルスのような糸状菌での高い生産率は、就中同種タンパク質またはアスコマイセテン綱の糸状菌のタンパク質の発現のために記載されている。異種タンパク質の発現は僅かまたは高くない収率でのみ成功している。WO96/00290号は、例えばバシドマイセテン(Basidomyceten)綱の糸状菌、ポリポラス ピンシツス(Polyporus pinsitus)の綱からのラッカーゼLCC1の異種発現を記載している。アスペルギルスでの発現において、アスコマイセテン綱の糸状菌に発酵において0.35g/lまでの収率が達成された。これは、比較可能な野生株の0.1〜0.2g/lの発酵での生産能力に比して比較的僅かな収率増加である。
【0006】
バシドマイセテンおよび就中白色腐敗菌の綱からの酵素に関して特に、工業的使用に対する関心がますます増加している。例として、加水分解酵素、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼまたはリパーゼが挙げられるが、またはオキシドレダクターゼ、例えばリグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、セルビオース−キノン−オキシドレダクターゼまたはセルビオース−オキシダーゼも挙げられる。前記の酵素は、例えば木材もしくはパルプの加工において使用可能である。
【0007】
殊にバシドマイセテン中に存在する、工業的使用に大きな関心が抱かれている酵素クラスはラッカーゼ(p−ヒドロキシフェノールオキシダーゼ、EC1.10.3.2)の酵素クラスである。ラッカーゼは、いわゆる“青色銅タンパク質”のタンパク質ファミリーであり、かつ一般に4個の銅イオンを有し、1型〜3型を示す3つの銅中心に配置されている。ラッカーゼは更に、一般に分泌タンパク質であり、かつ分子量の10〜45%のグリコシル化部分を有することがあることで際立っている。高分子化合物、例えばリグニンの分解の他に、ラッカーゼは就中芳香族化合物の重合を触媒する。これに関する例として、リグニン生合成は植物において利用されており、その際に植物中に存在するラッカーゼが関与している。ラッカーゼの工業的な使用の可能性は、製紙においてあらゆる種類の重合反応、例えば下水処理においてパルプの脱リグニンをもたらす。ラッカーゼの使用は有機化学合成において、例えば芳香族炭化水素のカップリング反応または側鎖酸化において公知である。しかしながら前記の全ての方法における工業的使用のためには、ラッカーゼ酵素がコスト的に有利であり、かつより大量に提供できることが前提条件である。
【0008】
バシジオマイセス綱からの種々の糸状菌に関して、形質転換および形質転換体の選択に適当であるべきDNAベクターが記載されている。バシドマイセテン綱ファネロカエテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)に関して、同種形質転換(homologe transformation)のための方法が記載されている(M.Alic他 (1991)Curr.Genet.19,491−494)。バシドマイセテン綱のプロイロタス オステレアタス(Pleurotus sotreatus)に関しては、形質転換のためのDNA構築物が記載されている(K.Yanai他 (1996)Biosci.Biotech.Biochem.60,472−475)。US5362640号はバシドマイセテン綱コリオラス ヒルスタス(Coriolus hirsutus)の形質転換のためのDNAベクターを記載している。同様に、バシドマイセテン綱コリオラス ベルシカラー(Coriolus versicolor)の形質転換のためにDNAベクターが記載されている(Y.Iimura他(1992)5th International Conference on biotechnology in the Pulp and Paper Industry,427−431)。バシドマイセテン綱からの発現系によって、同種もしくは異種のタンパク質に関する発現率のかなりの増加が達成されることは知られていない。
【0009】
アスコマイセテン綱の糸状菌における発現のための遺伝子調節エレメントを有する公知の発現ベクターは、バシドマイセテン綱の糸状菌において効率よく発現することができない。従って該ベクターはバシドマイセテン綱の糸状菌の形質転換の際に、例えば後天的な抗生物質耐性または発色性のインジケータータンパク質の発現に基づくか、または栄養要求性の遺伝子欠損の相補に基づいてポジティブな形質転換体の選択を可能にしない。
【0010】
本発明は、糸状菌中でのタンパク質の生産のために発現系に関し、その際発現系は、
a)トラメテスおよびポリポルスの属から選択される宿主生物ならびに
b)DNAベクター、該ベクターは宿主生物の形質転換によってポジティブな形質転換体の選択を可能にするタンパク質をコードし、かつ宿主生物が耐性でない抗生物質の増殖阻害作用をうち消すタンパク質をコードする抗生物質遺伝子、発色反応の能力があるタンパク質をコードする遺伝子ならびに宿主生物の遺伝子欠損(栄養要求性)を相補する遺伝子の群から選択される選択マーカー遺伝子を有し、その際選択マーカー遺伝子の発現は宿主生物中で活性な少なくとも1種の遺伝子調節エレメントによってコントロールされ、
c)DNAベクター、該ベクターは生産されるべきタンパク質をコードする遺伝子を有し、その際、遺伝子の発現および、場合により生産されたタンパク質の分泌も宿主生物において活性な遺伝子調節エレメントによってコントロールされ、その際、選択マーカー遺伝子を有するDNAベクターおよび生産されるべきタンパク質をコードする遺伝子を有するDNAベクターが1つのDNAベクターとして存在してもよい
からなる。
【0011】
抗生物質耐性遺伝子として、有利にはハイグロマイシン、ビアラフォス(Bialaphos)、カナマイシン、ジェネティシン、ブレオマイシン、オリゴマイシン、G418、ゼオシン(Zeocin)、ベノミルおよびフレオマイシンの群からの抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子が適当である。
【0012】
有利には、発色反応の能力があるタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子、例えばグルコニダーゼ遺伝子または緑色蛍光タンパク質(GFP)のための遺伝子を他に使用してよい。
【0013】
宿主生物の遺伝子欠損(栄養要求性)を相補できる選択マーカー遺伝子が特に適当である。
【0014】
本発明による発現系のために有利な宿主生物は、トラメテスおよびポリポラスの属からの一核性の株である。
【0015】
トラメテス ベルシカラー(trametes versicolor)種の宿主生物が特に有利である。
【0016】
本発明による発現系における宿主生物は、代謝における遺伝子欠損(栄養要求性)を有し、それに基づき1種以上の増殖のために必須の代謝物がもはや合成されず、かつ前記の1種以上の代謝物の添加無しに最少培地上でもはや増殖できないという点で優れている。
【0017】
本発明は発現系に関し、その際、トラメテスおよびポリポラスの属から選択された宿主生物は代謝における遺伝子欠損(栄養要求性)を有し、それに基づき1種以上の増殖のために必須の代謝物がもはや合成されず、かつ前記の1種以上の代謝物の添加無しに最少培地上でもはや増殖できず、かつ選択マーカー遺伝子が、宿主生物の栄養要求性遺伝子欠損を相補するように選択されている。
【0018】
宿主生物における栄養要求性遺伝子欠損を相補できる選択マーカー遺伝子のための例は、OCT−遺伝子(オルニチン−カルバモイルトランスフェラーゼをコードする、US5362640号)、pyr G−遺伝子(オロチジン−5’−ホスフェート デカルボキシラーゼをコードする、Goosen et al., Curr. Genet. (1987) 11, 499−503)、trpC遺伝子(ホスホリボシル−アントラニル酸イソメラーゼ、グルタミン−アミドトランスフェラーゼおよびインドール−グリセリンホスフェートシンターゼの酵素活性を有する三機能の遺伝子産物をコードする、Yelton et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA(1984)81, 1470−1474)、またはnia D遺伝子(ニトレートレダクターゼをコードする)である。
【0019】
選択マーカーとして、オロチジン−5’−ホスフェート デカルボキシラーゼ(ウリジン代謝の酵素)をコードし、かつpyrG遺伝子に欠損を有する宿主株のウリジン栄養要求性を相補できるpyr G遺伝子が特に有利である。その際特に有利には宿主生物は、pyrG遺伝子における欠損を有するトラメテスおよびポリポラスの属からの、ウリジンに対して栄養要求性の株である。
【0020】
pyrG遺伝子は、有利にはバシドマイセテン綱、例えばアガリクス属、コリオラス、ポリポラス、プロイロタス、ファネロカエテ、シゾフィルム(Schizophyllum)またはトラメテスからの菌類に由来する。
【0021】
有利には、例えばバシドマイセテン綱からの糸状菌、シゾフィルム コミュネ(Schizophyllum commune)、アガリクス ビスポラス(Agaricus bisporus)(GAPDH Ag2遺伝子)、ファネロカエテ クリソスポリウム、トラメテス ベルシカラーからのグリセリンアルデヒド−3−ホスフェート デヒドロゲナーゼ遺伝子(GAPDH)またはラッカーゼ遺伝子、有利にはトラメテス ベルシカラーからのラッカーゼI遺伝子もしくはラッカーゼIII遺伝子のためのプロモーターエレメントおよびターミネーターエレメントがpyrG遺伝子のために適当である。
【0022】
特に、有利にはバシドマイセテンのシゾフィルム コミュネまたはバシドマイセテンのトラメテス ベルシカラーからのオロチジン−5’−ホスフェート デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrG遺伝子)が本発明による発現系のための選択マーカー遺伝子として適当である。
【0023】
有利には、バシドマイセテンのシゾフィルム コミュネからのpyrG遺伝子の発現はシゾフィルム コミュネからのpyrG遺伝子のためのプロモーターおよび場合によりターミネーターによって調節される。
【0024】
有利にはバシドマイセテンのトラメテス ベルシカラーからのpyrG遺伝子の発現は、トラメテス ベルシカラーからのpyrGのためのプロモーターによって調節される。
【0025】
本発明による発現系は、特に、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびリパーゼの群またはオキシドレダクターゼ、例えばリグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、セルビオース−キノン−オキシドレダクターゼまたはセルビオース−オキシダーゼの群からの加水分解酵素をコードする遺伝子の発現のために適当である。
【0026】
特に有利には、ラッカーゼのための遺伝子の発現に適当である。
【0027】
本発明は、更にトラメテスおよびポリポラスの属から選択された菌類の形質転換後にポジティブな形質転換体の選択を可能にする少なくとも1つの選択マーカー遺伝子を有するDNAベクターにおいて、選択マーカー遺伝子を、宿主生物が耐性でない抗生物質の増殖阻害作用をうち消すタンパク質をコードする抗生物質耐性遺伝子、発色反応の能力があるタンパク質をコードする遺伝子ならびに宿主生物の遺伝子欠損(栄養要求性)を相補する遺伝子の群から選択し、かつ該選択マーカー遺伝子が宿主生物中で活性な少なくとも1種の遺伝的調節因子によってコントロールされることを特徴とするDNAベクターに関する。
【0028】
本発明によるDNAベクターは、ポジティブな形質転換体の選択を宿主生物における栄養要求性の遺伝子欠損の相補に基づいてトラメテスおよびポリポラスの属から選択される菌類の形質転換の際に可能にする。
【0029】
特に、糸状菌トラメテス ベルシカラーの形質転換体の選択および特に有利な実施態様においてはpyrGを欠損した栄養要求性のトラメテス ベルシカラー株の形質転換体は、有利には好適な遺伝子として挙げられる遺伝子によって宿主生物における栄養要求性の遺伝子欠損の相補を可能にする。
【0030】
本発明によるDNAベクターは、トラメテスおよびポリポラスの属の宿主生物において、タンパク質をコードする遺伝子の発現のためにも適当である。またタンパク質をコードする遺伝子とは、本発明の意図としては構造遺伝子から誘導されるタンパク質のcDNA遺伝子を意味すべきである。タンパク質とは、宿主生物に対して異種のタンパク質または宿主生物に対して同種のタンパク質である。
【0031】
従って本発明のDNAベクターは、有利には発現されるべきタンパク質をコードする少なくとも1種の遺伝子を有する。
【0032】
特に有利には本発明によるDNAベクターは、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびリパーゼの群またはオキシドレダクターゼ、例えばリグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、セルビオース−キノン−オキシドレダクターゼまたはセルビオース−オキシダーゼの群からの加水分解酵素をコードする少なくとも1種の遺伝子を有する。
【0033】
特に有利には、本発明によるDNAベクターはラッカーゼのための遺伝子を有する。
【0034】
タンパク質をコードする遺伝子の発現のために必須のプロモーターは発現されるべき遺伝子に由来するか、または外来遺伝子のプロモーターを、発現されるべき遺伝子のコードされる領域と機能的に連結させて使用してもよい。
【0035】
従って本発明によるDNAベクターは、有利にはタンパク質をコードする遺伝子の発現のためのプロモーターを有する。
【0036】
特に有利には本発明によるDNAベクターは、タンパク質をコードする遺伝子の発現のためのプロモーターとして高い発現能力が保証されるプロモーターを有する。
【0037】
例えば前記の目的のために有利に使用されるプロモーターは、例えばトラメテス ベルシカラー種からのグリセリンアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)のタンパク質のための遺伝子のプロモーターである。
【0038】
本発明によるDNAベクターは、有利にはタンパク質をコードする遺伝子のための転写ターミネーターも有する。
【0039】
転写ターミネーターとして、発現されるべきタンパク質をコードする遺伝子のターミネーターを使用してよいが、または外来遺伝子のターミネーターを使用してもよい。ラッカーゼの遺伝子からの転写ターミネーターが有利である。
【0040】
タンパク質の発現は細胞内でか、または機能的シグナル配列の存在下で、分泌の目的のために細胞外でも実施できる。
【0041】
細胞からの発現されたタンパク質の分泌が望ましい場合に、本発明によるDNAベクターは有利にはタンパク質をコードする遺伝子の前に機能的シグナル配列5’を有する。更にまた、タンパク質をコードする遺伝子の5’−末端と機能的に連結するいわゆる分泌キャリヤー(Sekretionscarrier)は本発明によるDNAベクターに含まれている。
【0042】
分泌キャリヤーは、分泌されるタンパク質のための遺伝子または分泌されるタンパク質のための遺伝子の断片であってよい。分泌キャリヤーは分泌されるべきタンパク質と、融合タンパク質が分泌キャリヤーおよび分泌されるべきタンパク質から生じるように機能的に連結してよい。別の実施態様において、分泌キャリヤーおよび分泌されるべきタンパク質の連結は、分泌キャリヤーが分泌されるべきタンパク質から分離できるように構成する。これは、例えばタンパク質分解酵素のための認識配列を分泌キャリヤーと分泌されるべきタンパク質の間の連結部位に挿入することによって実施できる。このために例としては、いわゆるKEX2プロテアーゼのためのリジン−アルギニン認識部位が知られており、かつ分泌キャリヤーのための例としてアスペルギルス ニガーからのグルコアミラーゼが知られている(Contreras et al., Bio/Technology(1991) 9, 378−381, Broekhuijsen et al., J. of Biotechnology(1993) 31, 135−145)。
【0043】
他にタンパク質をコードする遺伝子の3’−末端の転写ターミネーターとして発現されるタンパク質の発現および分泌に関与しているDNA配列は同様に本発明によるDNAベクター中に含まれている。それに関する例として、ノイロスポラ クラッサからのラッカーゼのための遺伝子が提供され、該遺伝子の3’−末端は13個のアミノ酸のための配列を有し、該配列はタンパク質の分泌の間に除去され、かつ未成熟のタンパク質をもはや含まない(Germann et al., J. Biol. Chem. (1988) 263, 885−896)。
【0044】
本発明によるDNAベクターの製造は、先行技術において公知の方法によって実施する。種々の可能性を実施例に説明する。そこに記載される方法は当業者によって別の任意のベクター、耐性遺伝子、調節エレメントおよび構造遺伝子を用いて使用される。
【0045】
本発明によるDNAベクターは、タンパク質の効率のよい発現および分泌を可能にする菌類株の製造のために適当である。
【0046】
従って本発明は、タンパク質の効率のよい発現および分泌を可能にする菌類株の製造方法に関する。
【0047】
前記の方法は、宿主生物として栄養要求性の遺伝子欠損を有するトラメテスおよびポリポラスの属から選択される菌類を使用し、その際、該菌類は宿主株における栄養要求性遺伝子欠損の相補のための遺伝子を有するDNAベクターを使用して自体公知の方法によって形質転換され、かつ形質転換混合物から、DNAベクターで形質転換したクローンを栄養要求性の遺伝子欠損の相補による選択によって選択し、その際、宿主株における栄養要求性の遺伝子欠損の相補のための遺伝子発現は、宿主株中で活性な遺伝子調節エレメントによってコントロールされていることを特徴とする。
【0048】
遺伝子発現のための宿主として使用してよい糸状菌はトラメテスおよびポリポラスの属に属する。
【0049】
遺伝子発現のための宿主として、トラメテスおよびポリポラスの属からの一核性のバシドマイセが有利である。
【0050】
更に、挙げられるバシドマイセテン綱からの宿主株が栄養要求性の遺伝子欠損を有する場合に有利であり、該遺伝子欠損はポジティブな形質転換体を同定するための選択マーカーとして使用できる。例えばOCT−遺伝子、pyrG遺伝子、trpC遺伝子またはniaD遺伝子に遺伝子欠損を有するバシドマイセテン綱からの宿主株を使用してもよい。
【0051】
遺伝子発現のための宿主としては、pyrG遺伝子に欠損を有するトラメテスおよびポリポラスの属から選択された菌類が有利である。
【0052】
遺伝子発現のためには、pyrG遺伝子に欠損を有し、かつウリジンに対して栄養要求性であるトラメテス ベルシカラー種の宿主が特に有利である。
【0053】
宿主株の形質転換は、先行技術に相当する方法によって実施する。前記の方法には、CaCl2/PEG法によるプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーションによる形質転換またはDNAを有する微小弾丸を打ち込むことによる形質転換が属する。前記の方法は標準的な教科書に記載されている。
【0054】
例えば公知の方法で形質転換させるべき遺伝子を本発明によるDNAベクター中にクローニングし、挙げられた方法によってトラメテスおよびポリポラスの属から選択される糸状菌中に導入する。
【0055】
しかしながら形質転換されるべき遺伝子を、選択マーカー遺伝子を有さない発現ベクター中にクローニングし、かつ宿主株の栄養要求性の遺伝子欠損を相補するベクターと一緒に使用(同時形質転換)して形質転換体を得てもよい。
【0056】
形質転換のために有利な株は、トラメテスおよびポリポラスの属から選択される糸状菌である。バシドマイセテン綱からの当該株は一核性であってよいが、または二核性の株であってもよい。有利な実施態様においては、pyrG遺伝子中に欠損を有するウリジン栄養要求性株が対象である。
【0057】
形質転換のためには、トラメテス ベルシカラー種からの一核性のウリジン栄養要求性のpyrG欠損株が特に有利である。
【0058】
ポジティブな形質転換体の選択は、例えばプロトプラストをベクターDNAによる形質転換の後に、プロトプラストの浸透安定化のために、例えばソルビトール、マンニトールもしくはサッカロースのような添加物が添加され、かつ相補されるpyrG遺伝子を使用して形質転換体の選択を可能にする培地上に播種して実施する。
【0059】
本発明の有利な実施態様においては、糸状菌トラメテス ベルシカラーを同種系中でトラメテス ベルシカラーからのラッカーゼの遺伝子で形質転換する。それによって、前記のラッカーゼのための発現率の向上が達成され、それによって先行技術によって得られる生産率は0.1gのラッカーゼ/培養培地のリットルの発酵において大いに改善される。
【0060】
有利には付加的にラッカーゼ遺伝子自体のプロモーターまたはトラメテス ベルシカラーからの強力に発現される遺伝子のためのプロモーターを使用する。有利には4で単離されるラッカーゼ遺伝子IおよびIIIのプロモーターを使用する。
【0061】
例を記載する。その際、ラッカーゼI遺伝子のなかでも、有利には配列番号1に含まれる塩基1〜1192の配列断片を使用する。ラッカーゼIII遺伝子の中でも、有利には配列番号2に含まれる塩基1〜547の配列断片を使用する。他の強力に発現される遺伝子のプロモーターは、トラメテス ベルシカラーからのグリセリンアルデヒド−3−ホスフェートヒドロゲナーゼのためのGAPDHプロモーターである。GAPDHは5において単離している。例を記載する。GAPDHプロモーター配列は配列番号3の塩基1〜1542に挙げられる配列断片に相当する。特に配列番号3の塩基1365〜1542ならびに該配列断片と相同の73%より高いホモロジーを有する配列が発現のために適当なことが明らかである。有利には、更に以下の配列断片の少なくとも1つは本発明による調節エレメント上になお同様に存在する:
配列番号3:塩基1005〜1123ならびに該配列断片と相同の52%より高いホモロジーを有する配列、または
配列番号3:塩基817〜947ならびに該配列断片と相同の44%より高いホモロジーを有する配列、または
配列番号3:塩基640〜728ならびに該配列断片と相同の50%より高いホモロジーを有する配列。
【0062】
本発明において、全ての挙げられるホモロジー値は、コンピュータプログラム“ウィスコンシン パッケージ バージョン9.1(Winsconsin Package Version 9.1)、ジェネティクス コンピュータ グループ(GCG)、マジソン、ウィスコンシン”によって得られた結果に関連している。ホモロジー決定は、サブプログラム“ファスタ(fasta)”および前調節値(ワードサイズ6)を使用するデータベースにおけるサーチによって実施する。次いで最も類似した配列のホモロジーをサブプログラム“ギャップ(gap)”を使用して調べる。その際、前調節されたパラメーター“ギャップ クリエーション ペナルティー50(gap creation penalty 50)”および“ギャップ エクステンション ペナルティー3(gap extension penalty 3)”を使用した。更に、サブプログラム“ギャップ”および前記に挙げた前調節されたパラメーターを使用してJP09047289号に開示されているが、依然としてデータベースで使用可能でないコリオラス ヒルスツス(Coriolus hirsutus)からのGAPDH遺伝子のプロモーター配列のホモロジーを調べる。
【0063】
従って本発明はトラメテスまたはポリポラスにおいて活性な調節エレメントにおいて、配列番号1に含まれる塩基1〜1192の配列断片または配列番号2に含まれる塩基1〜547の配列断片または配列番号3に含まれる塩基1365〜1542の配列断片ならびに該配列と相同の73%より高いホモロジーを有する配列を含むことを特徴とする調節エレメントに関する。
【0064】
有利には、pyrG遺伝子のための機能的に発現される選択マーカー遺伝子で形質転換されたトラメテス ベルシカラーのかかる形質転換体のみが増殖できる選択培地が使用される。2におけるものが対象である。例えばウリジン不在の前記の最少培地上では、トラメテス ベルシカラーのpyrG栄養要求性株はもはや増殖できないか、もしくはウリジンの添加によって初めて再び増殖できる。
【0065】
選択系としてpyrG遺伝子を有する本発明によるDNAベクターの効果的な使用は、トラメテス形質転換体における選択マーカー遺伝子の効果的な発現に依存している。効果的な発現のためには、相当する発現シグナルが必須である。
【0066】
トラメテス ベルシカラーにおいて、バシドマイセテンからの発現シグナルは、別の方法で使用できるアスコマイセテンからの発現シグナルよりも意想外に著しく高い効率で機能的発現をもたらす。従って、本発明によるDNAベクターにおいて、有利にはバシドマイセテンからの遺伝子調節エレメントのコントロール下、特に有利にはトラメテスおよびポリポラスの属から選択された係る調節エレメントのコントロール下にpyrG選択マーカー遺伝子を配置する。
【0067】
有利にはpyrG遺伝子を、その上流の5’−プロモーター領域ならびにその下流の3’−ターミネーター領域のコントロール下に配置する。シゾフィルム コミュネからのpyrG遺伝子がシゾフィルム コミュネからのpyrG遺伝子の発現シグナルのコントロール下に配置されているDNA断片はFroeliger他、Gene(1989)83,387−393によって記載されている。更にpyrG遺伝子は、pyrG遺伝子とは異なるバシドマイセテンからの発現シグナルのコントロール下に配置されていてよい。機能を満たす発現シグナルには、バシドマイセテン綱からの糸状菌、例えばコリオラス ヒルスツス、ファネロカエテ クリソスポリウム、アガリクス ビスポラスまたはトラメテス ベルシカラーのGAPDH−プロモーター、コリオラス ヒルスツスからのOCTプロモーター、トラメテス ベルシカラーからのラッカーゼIもしくはラッカーゼIIIのプロモーターならびにアガリクス ビスポラスからのGAPDH遺伝子のターミネーターまたはトラメテス ベルシカラーからのラッカーゼIもしくはラッカーゼIII遺伝子のターミネーターが属する。
【0068】
3におけるベクターが特に有利である。シゾフィルム コミュネからのpyrG遺伝子がシゾフィルム コミュネからのpyrG遺伝子の発現シグナルのコントロール下に配置されている例を記載する。
【0069】
pyrG遺伝子は、オロチジン−5’−ホスフェートデカルボキシラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子であってよい。有利にはpyrG遺伝子はバシドマイセテン綱からの糸状菌、例えばアガリクス ビスポラス、ファネロカエテ クリソスポリウム、コリオラス ヒルスツス、ポリポラス ピンシツス、シゾフィルム コミュネまたはトラメテス ベルシカラーに由来する。
【0070】
シゾフィルム コミュネおよびトラメテス ベルシカラーからのpyrG遺伝子が特に有利である。
【0071】
更に、本発明はトラメテスおよびポリポラスの属から選択される菌類株において、これらが本発明によるDNAベクターを有することを特徴とする菌類株に関する。
【0072】
これらの菌類株は、タンパク質の効果的発現および分泌を可能にする。
【0073】
従って、本発明は特にトラメテスおよびポリポラスの属の糸状菌において、これらが本発明によるDNAベクターを有することを特徴とする糸状菌に関する。
【0074】
発現されかつ分泌されるタンパク質とは異種タンパク質であるが、同種タンパク質であってもよい。
【0075】
有利にはラッカーゼが対象である。かかるラッカーゼは、例えばトラメテス ベルシカラー株から知られている(ラッカーゼ遺伝子のための例はラッカーゼI:配列番号1の塩基1193〜3312またはラッカーゼIII:配列番号2の塩基548〜2542のための遺伝子である)。
【0076】
従って本発明はタンパク質を製造するための方法において、本発明による発現系をタンパク質製造のために自体公知の方法で使用するか、または本発明による方法によって製造した菌類株を自体公知の方法で培養することを特徴とする、タンパク質の製造方法に関する。
【0077】
かかる製造方法は、例えばCA:AN 96−203142、Eggert他、Appl.Environ.Microbiol.(1996)62,1151,Martinez他、Appl.Microbiol.Biotechnol(1994)41,500−504またはWO93/08272号から知られている。
【0078】
以下の実施例は本発明の更なる説明に役立つ。実施例に使用されるDNAまたはRNAの取り扱い、例えば制限エンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、逆転写酵素等のための標準的方法ならびに細菌の形質転換、サザンおよびノーザン分析、DNA配列決定、放射性標識、スクリーニングおよびPCR技術のような標準的方法は、特に記載がない限り、製造者が推奨するように実施するか、または製造者の説明書が存在しない場合、標準的な教科書から公知の先行技術に従って実施する。
【0079】
1.実施例:
トラメテスのプロトプラストの製造および菌類コロニーの再生
プロトプラストの製造のために、二核菌株トラメテス ベルシカラーTV−1(Trametes versicolor TV−1 : DSMZ (Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D−38124 Braunschweig)に寄託番号DSM11523で寄託)、トラメテス ベルシカラー38070(American Type Culture Collection, Rockville, MD20852 USAから入手可能)および単核菌株トラメテス ベルシカラーF2 100(DSMZ (Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D−38124 Braunschweig)に寄託番号DSM11972で寄託)を使用した。最初に、トラメテス ベルシカラーの菌糸体を麦芽寒天プレート(麦芽エキス3%、大豆粉からのペプトン0.3%、寒天1.5%、pH5.0)上で28℃で7日間培養することにより獲得した。この麦芽寒天プレートから3個打ち抜き、これで500ml三角フラスコ中の滅菌した1.5%麦芽エキス培地(麦芽エキス3%、大豆粉からのペプトン0.3%、pH5.0)100mlもしくは162cm2の細胞培養容器中の該滅菌培地125mlを接種した。この培地を、培養液が菌糸体のマットで密に覆われるまで、振盪することなく28℃で7日間インキュベーションした。培養液を傾瀉除去し新鮮な培地を添加した(100mlの培養物の菌糸体に関して30ml)。この菌糸体をウルトラ・チュラックス(Ultra Turrax, 9500rpm, 4分)を用いて均質化し、100rpmで振盪下に28℃で更に18時間インキュベーションした。
【0080】
このようにして製造された菌糸体懸濁液を1500rpm(2000×g)で5分間遠心分離することにより収穫し、この際得られた菌糸体を3回MgSO40.1M、サッカロース0.6M、ホスフェート0.1M、pH5.8(OMT−培地)と共に懸濁させ、引き続き遠心分離することにより洗浄した。単離した菌糸体が得られ、溶解酵素で処理するまで4℃で保存した。
【0081】
プロトプラストを次のように製造した:滅菌三角フラスコ中で配合量の菌糸体を新たに製造し、かつOMT−培地中の溶解酵素混合物Novozym234(3mg/ml、Novo Nordisk, Bagsvaerd, Daenemark)の滅菌濾過した溶液15ml中に懸濁させた。酵素溶液中に再懸濁させた菌糸体を振盪インキュベーター(Infos)上で、低い回転数(80rpm)で、30℃で1〜3時間インキュベーションした。インキュベーションの間、プロトプラストの形成を顕微鏡中で観察した。自由に可動性のプロトプラストは通常1時間後に観察することができる。プロトプラスト形成の最終時点は顕微鏡の視覚による観察で決定し、このプロトプラストをガラスフィルター中のガラスウールを介する濾過により残りの菌糸体から分離した。ガラスウールを氷冷OMT−培地で十分に洗浄した。プロトプラストを懸濁液の遠心分離により滅菌試料容器中で単離した(2000rpm;2500×g、4℃、10分間)。細胞の更なる操作は4℃で実施した。プロトプラストペレットをOMT−培地中に懸濁させることにより洗浄し、かつ遠心分離により再単離した。必要であれば、洗浄工程を繰り返した。プロトプラストの濃度を顕微鏡下に計算室中で決定した。プロトプラスト懸濁液をプロトプラスト再生のための試験のために、または形質転換のためにプロトプラスト1×108/mlの濃度に調節した。
【0082】
再生実験のためには、このプロトプラスト懸濁液から希釈列を製造し、麦芽エキス1.5%、トリプチカーゼペプトン(Trypticase Pepton)0.1%、グルコース2%、寒天1.5%および浸透圧安定化のためにマンニトール0.4Mを含有する寒天プレート上に塗布した。このようにして、生存可能な細胞の割合を測定し、得られたプロトプラストが菌糸体状の増殖に再生可能かどうか試験した。同様にして、浸透圧的に安定化していないプレート(マンニトールなし)上で、浸透圧的に安定な細胞(例えば、菌糸体フラグメント)の割合を測定した。28℃で7日間インキュベーションした後、得られたクローンを数えた。一連のプロトプラスト調製物からの生存可能な細胞の割合は約0.5%であった。この結果はトラメテス ベルシカラーから形質転換実験のために生存可能であり、かつ再生可能なプロトプラストが製造される得ることを示す。
【0083】
実施例2
トラメテス ベルシカラーのpyrG−欠損突然変異体の単離
ピリミジン物質代謝に遺伝子欠損を有するトラメテス ベルシカラーの栄養要求性突然変異体(pyr−突然変異体)をベーケ等(Boeke et al. Methods Enzymol. (1987) 154, 164−175)による方法に従って、単離した。選択性の薬剤としては、遺伝毒性の物質5−フルオロ−オロチン酸(FOA)を使用した。トラメテス ベルシカラープロトプラストの突然変異誘発はUV−処理により行った。
【0084】
A:UV−突然変異誘発:
突然変異誘発のために、実施例1に記載された単核菌株トラメテス ベルシカラーF2 100を使用した。この菌株のプロトプラストを実施例1に記載の方法と同様にして、製造した。
【0085】
突然変異誘発のためにはBioRad UV−リンカー(5.8W/cm2、UV−源からの距離16cm)を使用した。突然変異誘発のために使用したプロトプラストの数は8×109個であった。トラメテス ベルシカラーのプロトプラストをペトリシャーレ中に入れ、UV−光で異なる長さの時間の間照射した。この際、前記条件下に60秒間の照射が、これに続く栄養要求突然変異体の選択に最適であることが明らかになった。
【0086】
B:ウリジン栄養要求性突然変異体の選択:
ウリジン栄養要求性突然変異体の選択のためには次の最少培地(MM)を使用した:
グルコース 20g/l
寒天 15g/l
リン酸二水素カリウム 1g/l
硫酸マグネシウム 0.5g/l
リン酸一水素二ナトリウム 0.1g/l
アデニン 27.5mg/l
DL−フェニルアラニン 0.15g/l
L−アスパラギン 2.5g/l
チアミン 0.48mg/l
塩化カルシウム 10mg/l
硫酸鉄 10mg/l
硫酸銅 2mg/l
硫酸亜鉛 1mg/l
硫酸マグネシウム 1mg/l
硫酸でpH5.0に調節。
【0087】
プロトプラストの浸透圧安定化のために、MMにサッカロース0.6Mを補充した(MMS)。液体培養のためには寒天なしにMMを製造した。
【0088】
開始のために、MMSに異なる濃度のFOSならびにウリジン10mMを添加し、種々のトラメテス菌株に関して選択培地上での成長特性を特徴付けた。FOA1.5mg/mlおよびウリジン10mMを含有するMMS(選択性MMS)は試験したトラメテス菌株を完全に抑制した。
【0089】
選択性MMSを有するプレートをUV−突然変異プロトプラスト(工程A中に記載)で接種し、28℃で21日間インキュベーションした。突然変異していないプロトプラストとは異なり、35コロニーの成長が観察された。ウリジン栄養要求性表現型をより詳細に特徴付けるために、この潜在的なpyr−欠損突然変異体を、MM−プレート、ウリジン10mMを含有するMM−プレートおよび選択性MM−プレート上に担持し、その成長を出発菌株F2 100に対して比較した。その際、採取した35個のコロニーの内、3個のトラメテス突然変異体が明らかに、pyr−欠損表現型を示した。このことは第1表に示されている。
【0090】
【表1】
【0091】
C:pyrG−突然変異体の同定
FOAでの突然変異誘発はpyrF遺伝子(オロト酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ)中で、または所望のpyrG遺伝子(オロチジン−5′−リン酸デカルボキシラーゼ)中で突然変異体に導く。pyrG突然変異体およびpyrF突然変異体はシゾフィルム コミュネ(Schizophyllum commune)からのpyrG遺伝子で形質転換することにより区別された(プラスミドpSCpyrGは実施例3参照)。
【0092】
プラスミドpSCpyrGで形質転換した後、第1表に記載された3つのpyr−欠損突然変異体からコロニーが観察された。このことは3つ全ての突然変異体がpyrG遺伝子中に欠損を有していることを示した。しかしながら、pyrG−欠損トラメテス ベルシカラー菌株F2 100B11は約10倍高い頻度で形質転換するので、この菌株をこの後の実験に使用した。
【0093】
菌株トラメテス ベルシカラーF2 100B11、F2 100B14およびF2 100B16はトラメテス ベルシカラーの最初にこれまで記載したpyrG−欠損菌株である。これらのpyrG−欠損菌株はトラメテス ベルシカラーの従来記載されていない形質転換体のための宿主生物として使用することができ、こうして担子菌類の綱からの糸状菌の中でのタンパク質発現およびタンパク質分泌のために重要な新規宿主生物である。この目的のための菌株F2 100B11の使用を以下の実施例に記載する。
【0094】
実施例3
シゾフィルム コミュネからのpyrG−遺伝子でのpyrG栄養要求性トラメテス ベルシカラー菌株の形質転換
A:シゾフィルム コミュネからのpyrG遺伝子の単離
シゾフィルム コミュネからのpyrG遺伝子の単離およびDNA−配列(文献中ではURA1遺伝子として命名)はフロエリガー等(Froeliger et al., Gene (1989) 83, 387−393)により記載されている。シゾフィルム コミュネの菌糸体(菌株ATCC44201、ATCC American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockvill, Maryland 20852−1776, USAによる)を麦芽エキス培地中でトラメテス ベルシカラーに関して実施例1に記載したように製造した。染色体DNAの単離をトラメテス ベルシカラーに関する方法と同様に行い、実施例4に記載する。pyrG遺伝子をシゾフィルム コミュネの染色体DNAからPCRにより増幅した。このためには、プライマーAおよびBを使用し(Froeliger et al., Gene (1989) 83, 387−393中で公開された配列から誘導された)、これでもってコード領域の他に、プロモーターおよびターミネーター配列も増幅することができた。
【0095】
【外1】
【0096】
PCR−増幅を製造者(StratageneのPCRキット)の指示書に従って、公知技術により実施した:シゾフィルム コミュネの染色体DNA200ngを、製造者により調製された緩衝剤を含有し、更に1.25U Pfuポリメラーゼ、4つのdNTP(dATP、dCTP、cGTP、dTTP)を各0.2mMおよびプライマーAおよびB各100pmolを含有するPCR100μl中に添加した。所望のPCR−生成物の特異的増幅のための、その他の条件は:94℃で5分間、引き続き25サイクルの94℃で1分間、50℃で1.5分間および72℃で2.5分間を実施し、ならびに72℃で5分間、である。約1.6kbの大きさの所望のPCR−生成物をアガロースゲル電気泳動により精製し、PCR−スクリプトSK(+)ベクター(Stratagene)中でクローニングし、E.コリ中に形質転換した。培養した形質転換E.コリからプラスミドを単離した。プラスのクローンに関して、挿入物のDNA−配列分析により、シゾフィルム コミュネpyrG遺伝子が増幅されたことが確認された。シゾフィルム コミュネpyrG遺伝子を有するこのプラスミドをpSCpyrG(図1)と命名した。
【0097】
B:トラメテス ベルシカラーpyrG欠損菌株の形質転換
トラメテス ベルシカラーF2 100B11のプロトプラスト(実施例2参照)を実施例1中に記載された方法で製造した。この際培地に栄養要求性菌株のためにウリジン10mMを補充した。ベクターpSCpyrG(工程Aに記載)で形質転換した。
【0098】
実施例1に記載したように、トラメテス ベルシカラーF2 100B11のプロトプラストを製造し、かつ最終濃度108/mlに懸濁した。容積12mlのインキュベーション容器中で、プロトプラストの分割量0.1mlをプラスミドのDNA各10μgと混合し、かつ30分間氷上でインキュベーションした。その後、ゆっくりと混合を繰り返してPEG4000溶液1.25mlを形質転換配合物に加えた。室温で更に20分間インキュベーションした後、反応容器を実施例1に記載したOMT−培地で充填し、混合し、かつ4℃で2000×gで10分間遠心分離した。このペレットを再懸濁し、浸透圧に関して安定化したウリジンを有しないMMS−プレート上に塗布した(実施例2中に記載)。このプレートを28℃で14日間インキュベーションし、コロニーの成長に関して試験した。種々異なる実験においてプラスミドDNA1μgあたり形質転換体0.1〜3の形質転換率が達せられた。
【0099】
C:形質転換体の精製
得られた形質転換体の菌糸体を採取し、MMを有する新鮮なプレート上に塗布することにより精製した。この際、接種物をプレートの中心に点状に担持した。28℃で7〜14日間インキュベーションした後、放射状の菌糸体成長を観察することができた。この精製工程を繰り返したが、この際接種物のための菌糸体は最初の精製プレートの縁から採取した。次いで、MMプレートを第二の精製プレートの接種物で新たに接種し、プレートが完全に菌糸体で覆われるまで28℃でインキュベーションした。
【0100】
D:形質転換体の分析
トラメテス ベルシカラーの形質転換体をサザンブロット分析法によりプラスミドpSCpyrGの組み込みに関して試験した。このためには種々の形質転換体からおよび参照としてpyrG欠損菌株F2 100B11から、菌糸体を液体培地中で製造した(実施例1参照、ウリジン10mMを添加した麦芽エキス培地)。単離した菌糸体から染色体DNAを後記の実施例4中に記載されているように単離した。
【0101】
実験菌株から、それぞれ染色体DNA1μgおよびプラスミドpSCpyrG100ngをNotIおよびEcoRIを用いて、ダブル消化により切断し、引き続きアガロースゲル電気泳動により分離し、ナイロンフィルター(Quiagen)上にブロッティングし、シゾフィルム コミュネからのpyrG遺伝子に関して特異的である放射性標識したDNA−プローブとハイブリダイズした。
【0102】
プラスミドpSCpyrGをNotIおよびEcoRIを用いて、ダブル消化により切断し、かつその際得られたpyrG遺伝子の1.4kbの長さのDNAフラグメントを調製ゲル電気泳動で単離することにより、DNA−プローブを準備した。1.6kbの長さのpyrG−特異的DNA−フラグメントをα−[32P]−dATPで放射性に標識した(“Random Priming”キット、Boehringer Mannheim)。遊離の放射活性をSephadex G25(Pharmacia)を介してクロマトグラフィーを行うことにより分離した。放射性に標識したDNA−プローブの特異的活性は1×107cpm/μgDNAであった。ナイロンフィルター上にブロッティングしたDNAと放射性標識DNA−プローブとのハイブリダイゼーション温度は60℃であった。その他にはサザンブロット法に関して専門書中に記載されている条件を保持した。サザンブロットをオートラジオグラフィーで評価した。その際、1.6kbの長さのpyrG−特異的DNA−フラグメントは形質転換体中にのみ検出され、ウリジン−栄養要求性菌株F2 100B11中には検出されなかった。この結果は、ウリジン−栄養要求性菌株トラメテス ベルシカラーF2 100B11の形質転換の際には、プラスミドpSCpyrGはゲノム中に組み込まれており、選択マーカー遺伝子pyrGの生産的発現に導き、これによりこの菌株のウリジン栄養要求性は補足された、ということを証明した。意外にも、この際担子菌類シゾフィルム コミュネからのpyrG遺伝子の発現シグナルはトラメテス ベルシカラー中でも機能性であることが初めて確認された。
【0103】
実施例4
トラメテス ベルシカラー・ラッカーゼ遺伝子のクローニング
A:トラメテス ベルシカラーからの染色体ジーンライブラリーの製造
トラメテス ベルシカラーのゲノムDNAを振盪フラスコ培地の菌糸体から単離した。トラメテス ベルシカラーの菌糸体1gを液体窒素の存在下に乳鉢および乳棒で粉砕し微細な粉末にした。この粉末を滅菌試料容器中に取り入れ、即座に抽出溶液(Tris−HCl 0.1M、pH8.0、EDTA0.1M、NaCl0.25M、プロテイナーゼK0.6mg/ml)5mlおよび10%(W/V)ナトリウムラウリルサルコシン溶液0.5mlと混合した。50℃で少なくとも2時間インキュベーションした後、この混合物を5M NaCl 0.85mlおよび0.7M NaCl中の10%(W/V)CTAB−溶液0.7mlと混合し、65℃で30分間インキュベーションする。クロロホルム−イソアミルアルコール混合物(24:1)7mlの添加後、この配合物を振盪し、両方の相を遠心分離により分離する。水相を除き、染色体DNAをイソプロパノール0.6容積部を添加することにより沈殿させる。引き続き、この沈殿したDNAをカラム(Quiagen Genomic Tip)を介して精製する。このようにして、菌糸体16gから遺伝子DNA0.5mgを単離することができた。
【0104】
染色体ジーンライブラリーの製造のためにはトラメテス ベルシカラーTV−1の染色体DNA90μgをSau3Aでの部分消化において切断し、アガロースゲル電気泳動により分離した。染色体DNA−フラグメントを5〜20kbの範囲の大きさおよび20kbより大きい範囲に単離し、それぞれBamHIで前切断したλ−ファージ中でクローニングした(Stratagene Klonierungssystem)。5〜20kbDNA−フラクションからはファージ4×104/μgベクターDNAがおよび20kbより大きいDNA−フラクションからはファージ5×104/μgベクター−DNAが得られた。このファージをE.コリ菌株XL−1ブルーMRF′の感染により増幅した。
【0105】
B:ラッカーゼ特異的DNAプローブの単離
ラッカーゼ遺伝子の単離のためのDNA−プローブを変性プライマーを用いてトラメテス ベルシカラーゲノムDNAからPCR−増幅により製造した。変性プライマーは公知のラッカーゼ遺伝子の配列比較により作成された。EMBL遺伝子データバンクに保有されている、アカバンカビ(Neurospora crassa)コリオラス ヒルスタス(Coriolus hirsutus)、フレビア ラジアタ(Phlebia radiata)、アガリクス ビスポラス(Agaricus bisporus)のラッカーゼ遺伝子および詳細に特徴付けされていない担子菌類の亜網からの菌糸状菌のラッカーゼ遺伝子のアミノ酸配列を比較した。この配列比較により、全てのラッカーゼ中に完全に保存されている、長さ5〜7のアミノ酸を有する4つのペプチドを同定することができた。縮重コドンを考慮して、これらのペプチドをDNAに翻訳し、変性プライマーを製造した。このプライマーは次の配列を有した:
【0106】
【外2】
【0107】
プライマーEおよびFは5′−領域にBamHI切断部位(下線)を有し、これにそれぞれ相応する変性ラッカーゼ配列が結合している。PCR−増幅を製造者の(Perkin ElmerのPCRキット)指示書に従って公知技術に相応して実施した:最初のPCRにおいてトラメテス ベルシカラーの染色体DNA200ngを、製造者により調製された緩衝剤を含有し、更に1.25U Taqポリメラーゼ、MgCl21.25mM、4つのdNTP(dATP、dCTP、cGTP、dTTP)を各0.2mMおよびプライマーCおよびD各100pmolを含有するPCR100μl中に添加した。所望のPCR−生成物の特異的増幅のための、その他の条件は:94℃で5分間、引き続き7サイクルの94℃で0.5分間、40℃で1分間および60℃で2.5分間、ならびに30サイクルの94℃で0.5分間、50℃で1分間および72℃で2.5分間である。最初のPCRの1μlを第二のPCRに使用し、このPCRは更に1.25U Taqポリメラーゼ、MgCl21.25mM、4つのdNTPを各0.2mMおよびプライマーEおよびF各100pmolを含有する。所望のPCR−生成物の特異的増幅のための、その他の条件は:94℃で5分間、引き続き7サイクルの94℃で0.5分間、40℃で1分間および60℃で2.5分間、ならびに30サイクルの94℃で0.5分間、50℃で1分間および72℃で2.5分間、である。約1.1kbの大きさのPCR−生成物が得られた。このPCR−生成物をアガロースゲル電気泳動により精製し、制限酵素BamHIを用いて切断し、BamHIを用いて切断したpUC18ベクター中でクローニングし、E.コリ中に形質転換した。形質転換E.コリの培養物からプラスミドを単離した。5′−および3′−末端のDNA−配列分析はクローニングしたDNA−フラグメントがラッカーゼ遺伝子のフラグメントであることを証明した。
【0108】
ラッカーゼ遺伝子のスクリーニングのためのDNA−プローブを製造するために、BamHIで処理することによりラッカーゼ特異的なPCR−フラグメントを切断し、アガロース電気泳動を介して単離し、α−[32P]−dATPで放射性に標識した(“Random Priming”キット、Boehringer Mannheim)。遊離の放射性をSephadex G25(Pharmacia)を介してクロマトグラフィーを実施することにより分離した。放射性標識したDNA−プローブの特異的活性は1×107cpm/μgDNAであった。
【0109】
C:染色体ラッカーゼ遺伝子の単離
工程A中に記載されているトラメテス ベルシカラーTV−1の染色体ジーンライブラリーを使用した。ゲノムラッカーゼ遺伝子によるスクリーニングは公知技術により行った。最初のスクリーニングの回においては、E.コリXL−1ブルーMRF′を10個のペトリシャーレ上で最初に培養し、次いでペトリシャーレあたり染色体ジーンライブラリー(5〜20kbフラクション、実施例4のA参照)ファージ50000個で感染した。37℃で一夜インキュベーションした後、新たに形成されたファージをナイロンフィルター(Stratagene)に移した。次いで、このフィルターを製造者の指示書に相応して放射性に標識されたラッカーゼ−特異的プローブ(工程B参照)とハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション温度は50%ホルムアミド含量のハイブリダイゼーション緩衝液中で45℃であった。プラスのクローンを採取し、スクリーニング法を繰り返すことにより精製した。個別化を3回行った後、スクリーニングにおいて強力にハイブリダイズするファージクローン20個が単離され、これを製造者(Stratagene)の指示書に従って、“in vivo 切り出し”によりpBKCMVベクター(Stratagene)中で再クローニングした。制限エンドヌクレアーゼでの消化およびDNA−配列決定によるクローンの分析は、15〜20個のクローンがラッカーゼクローンであるということを示した。2種の異なるラッカーゼクローンが得られた。
【0110】
両方のラッカーゼ遺伝子はラッカーゼIおよびラッカーゼIIIという名称を有した。両方のラッカーゼ遺伝子を有するプラスミドをpLac100(配列番号1)およびpLac300(配列番号2)と命名した。両方のラッカーゼ遺伝子は構造遺伝子(コードする領域)に関する配列情報の他に、ATG−開始コドン前の5′領域(プロモータ領域)中の配列情報ならびに終止コドンの後の3′領域(ターミネーター領域)中の情報を含有している。この際、担子菌類の綱からの糸状菌中の遺伝子発現のためのDNA−ベクターを製造するために使用することができる、トラメテス ベルシカラーのための新規遺伝学的制御エレメントに関する。第2表は配列番号1(ラッカーゼI遺伝子)および配列番号2(ラッカーゼIII遺伝子)中の相応する配列領域に関して概要を示す。
【0111】
実施例5
トラメテス ベルシカラーGAPDH−遺伝子のクローニング
A:トラメテス ベルシカラーからのGAPDHDNA−プローブの単離
菌株トラメテス ベルシカラーTV−1(実施例1を参照)を使用した。TV−1の培養および染色体DNAの単離は実施例1もしくは実施例4中に記載されているように行った。
【0112】
ファネロカエテ クリソスポリウム(Fanerochaete chrysosporium; M.C.Harmsen et al., (1992), Curr. Genet. 22, 447−454)からのGAPDH−遺伝子およびコリオラス ヒルスタス(Coriolus hirsutus, JP 9−47289)からのGAPDH−遺伝子の公開されたDNA配列を基にして、GAPDH−特異的遺伝子フラグメントのPCR−増幅のためのプライマーを作成した。このプライマーは次のDNA−配列を有した:
【0113】
【外3】
【0114】
PCR−増幅を公知技術に従って実施した:PCRにおいてトラメテス ベルシカラーの染色体DNA200ngを、製造者により調製された緩衝剤を含有し、更に1.25U Taqポリメラーゼ、MgCl21.25mM、4つのdNTP(dATP、dCTP、cGTP、dTTP)を各0.2mMおよびプライマーGおよびH各100pmolを含有するPCR100μl中に添加した。所望のPCR−生成物の特異的増幅のための、その他の条件は:94℃で5分間、引き続き7サイクルの94℃で0.5分間、47℃で1分間および72℃で1分間、ならびに30サイクルの94℃で0.5分間、50℃で1分間および72℃で1分間、である。約0.43kbのPCR−生成物が得られた。
【0115】
このPCR−生成物をアガロースゲル電気泳動により精製し、ベクターPCR−スクリプトSK(+)(Stratagene)中でクローニングし、E.コリ中で形質転換した。形質転換E.コリの培養物からプラスミドを単離した。5′−および3′−末端のDNA−配列分析はクローニングしたDNA−フラグメントがファネロカエテ クリソスポリウムGAPDH−遺伝子のフラグメントであるということを証明した。
【0116】
ラッカーゼ遺伝子のスクリーニングのためのDNA−プローブを製造するために、NotIおよびEcoRIで処理することによりラッカーゼ特異的なPCR−フラグメントを切り出し、アガロース電気泳動を介して単離し、α−[32P]−dATPで放射性に標識した(“Randam Priming”キット、Boehringer Mannheim)。遊離の放射性をSephadex G25(Pharmacia)を介してクロマトグラフィーを実施することにより分離した。放射性標識したDNA−プローブの特異的活性は1×107cpm/μgDNAであった。
【0117】
B:トラメテス ベルシカラーからの染色体GAPDH−遺伝子の単離:
実施例4の工程Aに記載したトラメテス ベルシカラーTV−1の染色体ジーンライブラリーを使用した。染色体GAPDH−遺伝子によるスクリーニングは公知技術により行った。最初のスクリーニングの回において、E.コリXL−1ブルーMRF′を10個のペトリシャーレ上で最初に培養し、次いでペトリシャーレあたりジーンライブラリー(5〜20kbフラクション、実施例4参照)のファージ50000個で感染した。37℃で一夜インキュベーションした後、新たに形成されたファージをナイロンフィルター(Stratagene)上に移した。次いで、このフィルターを製造者の提案に相応して放射性に標識されたGAPDH−特異的プローブ(工程A参照)とハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション温度は58℃であった。成長温度は58℃であった。28個のプラスのクローンを採取した。これらの内の10個のクローンをスクリーニング法を繰り返すことにより精製した。個別化を3回行った後、スクリーニングにおいて強力にハイブリダイズするファージクローン9個が単離され、これを製造者(Stratagene)の指示書に従って、“in vivo 切り出し”によりpBKCMVベクター(Stratagene)中で再クローニングした。制限エンドヌクレアーゼでの消化およびDNA−配列決定によるクローンの分析は、9個のクローン全てがGAPDH−クローンであるということを示した。制限分析により、9個のクローンを6個のクラスに分類することができた。最も大きなGAPDH−遺伝子フラグメントを有するクローンをpGAPTV(配列番号3)として命名し、これから提供可能なコード領域(配列番号3、bp1543−2387)およびATG開始コドンの前の5′プロモータ領域の約1.5kb(配列番号3、bp1−1542)が決定された。
【0118】
実施例6
GAPDH−プロモータとラッカーゼIIIの遺伝子との機能的結合
A:pBluescriptベクター中でのラッカーゼIII遺伝子のクローニング
更なる操作のために、pLac300からのラッカーゼIII遺伝子をベクターpBluescript中に再クローニングした。このためには実施例4で得られたpBKCMVベクターからラッカーゼIIIを3.5kbのSpeI−SmaIフラグメントとして単離し、SpeIおよびSmaIで予め切断したpBluescriptベクター中でサブクローニングした。この際生じた6.5kbのプラスミドをpLac301と命名した。pLac301はGAPDH−プロモータと結合するために、pBluescriptから由来するNotI切断部位を有し、これを介してGAPDH−プロモータの3′−末端と機能的結合をすることができる(この実施例の工程Bを参照)。
【0119】
B:ラッカーゼIII遺伝子のATG翻訳開始コドンとGAPDH−プロモータとの機能的結合
実施例4において単離されたGAPDH−遺伝子の1.5kbの長さのプロモータ領域をpGAPTV(配列番号3、実施例5参照)からNotI−BspLu11Iフラグメントとして単離した。この際、NotI切断部位はpBKCMVベクター部分から、およびBspLu11I切断部位はGAPDH遺伝子の開始ATG−コドンから由来する。
【0120】
ベクターpLac301をNotIでおよび部分的にBspLu11Iで切断し、ラッカーゼIII遺伝子の0.55kbの大きさのプロモータ部分だけ短くなった6kbの大きさのベクターフラグメントが単離された。
【0121】
1.5kbの長さのNotI−BspLu11IGAPDHプロモータフラグメントをpLac301の6kbの大きさのNotI−BspLu11Iベクターフラグメントと連結し、E.コリ中に形質転換した。形質転換したE.コリの培養物からプラスミドを単離した。プラスのクローンを制限分析およびDNA−配列決定により試験した。その中でラッカーゼIII構造遺伝子がGAPDH−遺伝子のプロモータと機能的に結合している7.5kbの長さのベクターをpLac3gap(図2)と命名した。pLac3gap中ではGAPDH−プロモータ領域がBspLu11I切断部位を介してラッカーゼIII遺伝子の翻訳開始ATG−コドンと機能的に結合している。
【0122】
C:ベクターpLac3gap中への選択マーカー遺伝子pyrGの組み込み
準備のために、ベクターpSCpyrGにおいて、pCR−スクリプトSK(+)ベクターのポリリンカーから由来するEcoRI切断部位に付加的なNotI切断部位を組み込んだ。このためには次の配列を有するアダプターAを使用した:
【0123】
【外4】
【0124】
ベクターpSCpyrGをEcoRIで線状にし、アルカリ性ホスファターゼで5′−脱リン酸化した。引き続き、線状にされたpSCpyrGベクターを種々異なる濃度のアダプターAと連結し、E.コリ中に形質転換した。プラスのクローンを単離したプラスミドDNAのNotIでの消化により同定し、この際第二のNotI切断部位の導入によりシゾフィルム コミュネ遺伝子フラグメントの1.6kbの大きさのフラグメントが遊離された。このベクターをpSCpyrG−Notと命名した。
【0125】
ベクターpSCpyrG−NotをNotIで処理し、この際遊離した1.6kbの大きさのpyrGフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離した。
【0126】
ベクターpLac3gapをNotIで線状にし、引き続き7.5kbの大きさのフラグメントをアルカリ性ホスファターゼで処理し、5′−リン酸基を切断した。
【0127】
1.6kbの大きさのpyrGフラグメントをNotIで線状にし、脱リン酸化したpLac3gap中にクローニングし、E.コリ中で形質転換し、プラスのE.コリ形質転換体からプラスミドDNAを単離した。プラスの形質転換体は1.6kbの大きさのpyrG遺伝子フラグメントを有した。制限分析により、pyrG選択マーカー遺伝子の方向がラッカーゼIII遺伝子の方向と同じであるクローンが同定された。ラッカーゼIII遺伝子の他にpyrG選択マーカー遺伝子をも含有する、9.1kbの長さのベクターをpL3GpyrG(図3)と命名した。
【0128】
実施例7
トラメテス ベルシカラー中でのラッカーゼIIIの過剰生産
A:トラメテス ベルシカラーの形質転換
トラメテス ベルシカラーのプロトプラストを実施例1に記載した方法で製造し、実施例6中に記載されたベクターpL3GpyrGで形質転換した。
【0129】
実施例2中に記載したように、pyrG−欠損菌株トラメテス ベルシカラーF2 100B11のプロトプラストを製造し、かつ最終濃度108/mlに懸濁した。容積12mlのインキュベーション容器中で、プロトプラストの分割量0.1mlをプラスミドpL3GpyrGのDNA10μgと共に、かつ30分間氷上でインキュベーションした。その後、ゆっくりと混合を繰り返してPEG4000溶液1.25mlを形質転換配合物中に加えた。室温で更に20分間インキュベーションした後、反応容器を実施例2に記載したOMT−培地で充填し、混合し、かつ4℃で2000×gで10分間遠心分離した。このペレットを再懸濁し、浸透圧に関して安定化したウリジンを有しないMM上に塗布した(実施例2中に記載)。このプレートを28℃で14日間インキュベーションし、コロニーの成長に関して試験した。異なる実験においてプラスミドDNA1μgあたり形質転換体0.5〜3個の形質転換率が達せられた。
【0130】
B:形質転換体の精製
得られた形質転換体の菌糸体を採取し、ウリジンを有しないMM−選択培地を有する新鮮なプレート上に塗布することにより精製した。この際接種物をプレートの中心に点状に担持した。28℃で7〜14日間インキュベーションすることにより、放射状の菌糸体成長を観察することができた。この精製工程を繰り返したが、この際接種物のための菌糸体は最初の精製プレートの縁から採取した。次いで、選択プレートを第二の精製プレートの接種物で新たに接種し、このプレートを完全に菌糸体が覆った後に、ラッカーゼ生産を振盪フラスコ培養物中で試験した。
【0131】
C:振盪フラスコ中での培養
振盪フラスコ中での培養のためには完全に成長したプレートから菌糸体2cm2を取出し、滅菌遠心分離し、かつこれで麦芽エキスの培地(実施例1参照)50mlの予培地(250mlフラスコ中)を接種した。予培地を振盪下に28℃で6日間、120rpmでインキュベートした。6日目に予培地を9500rpmで30秒間ウルトラ・チュラックスを用いて均質化し、これでもって1l三角フラスコ中の主培地(組成は実施例1参照)250mlを接種した。次いで主培地を再び28℃で120rpmで振盪下にインキュベーションした。ラッカーゼの生産を培養2日目から毎日測光により測定した。ラッカーゼの活性を基質ABTS(2,2′−アジノ−ビス(3−エチル−ベンズチアゾリン−6−スルホン酸))を用いて、420nmで測定した。420nmでのABTSの吸光係数ε420:3.6×104[1×mol−1×cm−1]。その際、1Uラッカーゼ活性は、37℃、pH4.5におけるABTS1μmol/分の変換率に相当する。振盪フラスコ培養物中でのラッカーゼ生産の最大には主培養の開始後8〜10日で達する。第3表は種々異なる形質転換体と形質転換していない出発菌株トラメテス ベルシカラーF2 100との比較を示す。形質転換していない菌株F2 100に関しては更に文献中に記載されている誘発物質2,5−キシリジン(Yaver et al., Applied and Environmental Microbiology (1966) 62, 834−841)での誘発後に、ラッカーゼ生産を測定した。第3表から明らかなように、形質転換していない出発菌株に比較して、菌株F2 100の最良の形質転換体において、振盪フラスコ中でのラッカーゼ生産は、約ファクター12(誘発なし)もしくは約ファクター5(誘発あり)だけ上昇した。
【0132】
【表2】
【0133】
【外5】
【0134】
【外6】
配列表
【0135】
【外7】
【0136】
【外8】
【0137】
【外9】
【0138】
【外10】
【0139】
【外11】
【0140】
【外12】
【0141】
【外13】
【0142】
【外14】
【0143】
【外15】
【0144】
【外16】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、シゾフィルム コミュネpyrG遺伝子を有するプラスミドpSCpyrGを示している。
【図2】図2は、ラッカーゼIII構造遺伝子がGAPDH−遺伝子のプロモータと機能的に結合している7.5kbの長さのベクターpLac3gapを示している。
【図3】図3は、ラッカーゼIII遺伝子の他にpyrG選択マーカー遺伝子をも含有する、9.1kbの長さのベクターpL3GpyrGを示している。
Claims (10)
- 配列番号3に含まれる塩基1〜1542の配列断片を含む、トラメテスまたはポリポラスにおいて活性なプロモーター活性を有する調節エレメント。
- トラメテスおよびポリポラスの属から選択される宿主生物における形質転換後にポジティブな形質転換体の選択を可能にするタンパク質をコードする少なくとも1種の選択マーカー遺伝子を有するDNAベクターにおいて、選択マーカー遺伝子が、宿主生物が耐性でない抗生物質の増殖阻害作用をうち消すタンパク質をコードする抗生物質耐性遺伝子、発色反応の能力があるタンパク質をコードする遺伝子ならびに宿主生物の遺伝子欠損(栄養要求性)を相補する遺伝子の群から選択され、かつ選択マーカー遺伝子が、宿主生物において活性な少なくとも1種の請求項1記載の遺伝子調節エレメントによってコントロールされることを特徴とする、DNAベクター。
- 糸状菌においてタンパク質を製造するための、
a)トラメテスおよびポリポラスの属から選択される宿主生物ならびに、
b)宿主生物の形質転換の後にポジティブな形質転換体の選択を可能にするタンパク質をコードし、かつ宿主生物が耐性でない抗生物質の増殖阻害作用をうち消すタンパク質をコードする抗生物質耐性遺伝子、発色反応の能力があるタンパク質をコードする遺伝子ならびに宿主生物の遺伝子欠損(栄養要求性)を相補する遺伝子の群から選択される選択マーカー遺伝子を有し、その際、選択マーカー遺伝子の発現が宿主生物において活性な少なくとも1つの遺伝子調節エレメントによってコントロールされる請求項2記載のDNAベクター、および
c)製造されるべきタンパク質をコードする遺伝子を有し、その際、該遺伝子の発現および、場合によりこうして製造されたタンパク質の分泌が宿主生物において活性な請求項1記載の1つの遺伝子調節エレメントによってコントロールされるDNAベクター
からなり、その際、選択マーカー遺伝子を有するDNAベクターと製造されるべきタンパク質をコードする遺伝子を有するDNAベクターとが1つのDNAベクターとして存在してもよい発現系。 - 宿主生物がトラメテスまたはポリポラスの属からの一核性の株である、請求項3記載の発現系。
- 宿主生物がトラメテス ベルシカラーである、請求項3又は4記載の発現系。
- 宿主生物がオロチジン−5’−ホスフェート デカルボキシラーゼ(pyrG遺伝子)に欠損を有し、かつウリジンに対して栄養要求性であり、かつ選択マーカー遺伝子がpyrG遺伝子である、請求項3から5までのいずれか1項記載の発現系。
- 宿主生物において活性な遺伝子調節エレメントがグリセリンアルデヒド−3−ホスフェート デヒドロゲナーゼ遺伝子(GAPDH遺伝子)のためのプロモーターエレメントおよび、場合によりターミネーターエレメントならびにラッカーゼ遺伝子のためのプロモーターエレメントおよびターミネーターエレメントから選択される、請求項3から6までのいずれか1項記載の発現系。
- 発現されるべきタンパク質がラッカーゼである、請求項3から7までのいずれか1項記載の発現系。
- タンパク質の効率よい発現および分泌を可能にする菌類株を製造するための方法において、宿主株としてトラメテスおよびポリポラスの属から選択されるウリジン栄養要求性遺伝子欠損の菌類を使用し、その際、該菌類は自体公知の方法によって、宿主株における栄養要求性の遺伝子欠損の相補のための遺伝子を有するDNAベクターで形質転換し、かつ形質転換混合物から前記DNAベクターで形質転換したクローンを栄養要求性の遺伝子欠損の相補による選択によって選択し、その際、宿主株における栄養要求性の遺伝子欠損の相補のための遺伝子発現を宿主生物において活性な請求項1記載の1つの遺伝子調節エレメントによってコントロールすることを特徴とする、菌類株の製造方法。
- タンパク質を製造するための方法において、請求項3から7までのいずれか1項記載の発現系を、自体公知の方法でタンパク質製造のために使用するか、または請求項9記載の方法によって製造した菌類株を自体公知の方法で培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
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