CN1110554C

CN1110554C - 米曲霉5－氨基乙酰丙酸合成酶及编码此酶的核酸

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Publication number: CN1110554C
Application number: CN97193669A
Authority: CN
Inventors: S·L·爱尔罗德; J·R·查瑞
Original assignee: Novozymes Biotech Inc
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 2003-06-04
Anticipated expiration: 2017-06-09
Also published as: DK0904356T3; US5871991A; DE69734828D1; DE69734828T2; WO1997047736A1; ATE312169T1; CN1215428A; US5958747A; AU3382097A; JP2000501294A; EP0904356B1; EP0904356A1

Abstract

本发明涉及米曲霉5-氨基乙酰丙酸合成酶及含有编码此酶的核酸序列的分离核酸片段。本发明又涉及含有该核酸序列的核酸构建体、载体和重组型宿主细胞。本发明还涉及生产5-氨基乙酰丙酸合成酶的方法。

Description

米曲霉5-氨基乙酰丙酸合成酶及编码此酶的核酸

本发明涉及米曲霉5-氨基乙酰丙酸合成酶以及含有编码该酶的核酸序列的分离核酸片段。本发明还涉及含有此核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞。本发明也涉及生产5-氨基乙酰丙酸合成酶(5-aminolevulinic acid synthases)的方法。

血红素是原卟啉IX与铁的螯合复合物，可作为血红素蛋白的弥补基(prosthetic group)。原卟啉IX包含一个卟啉环，该卟啉环具有四个甲基、两个乙烯基和两个丙酸基的取代，获得一个铁原子后可形成血红素。通过甘氨酸和琥珀酰辅酶A生物合成血红素包括8个酶反应步骤。此生物合成途径中的第一种酶是5-氨基乙酰丙酸合成酶，它能催化甘氨酸和琥珀酰辅酶A缩合形成5-氨基乙酰丙酸。在肝细胞和分化红细胞内血红素的生物合成中，5-氨基乙酰丙酸合成酶是一种关键的调控酶。

脱辅基蛋白转变为血红素蛋白依赖于血红素生物合成途径提供血红素的能力。血红素蛋白的脱辅基蛋白形式与血红素结合后，产生活性血红素蛋白。活性血红素蛋白获得的构象使它在蛋白水解的攻击下比脱辅基蛋白更稳定。若微生物体内生成的血红素量低于脱辅基蛋白的生成量，脱辅基蛋白将会累积并进行蛋白降解，从而降低了活性血红素蛋白的产量。

为解决这个问题，Jesen证明，在发酵培养基中加入血红素或含血红素的物质，能显著提高米曲霉生产过氧化物酶的产量(WO93/19195)。尽管发酵培养基中补加血红素能显著提高血红素蛋白产量，但在应用于大规模生产中，这种方法有悖常理，既费钱，又难于操作。

构巢曲霉中5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆和序列测定已被公开(Bradshaw等，1993年，现代遗传学(CurrentGenetics)，第2233卷，501-507页)。

本发明的一个目的是提供几种新的5-氨基乙酰丙酸合成酶以及编码这些酶的基因。

本发明涉及来源于米曲霉的基本纯的5-氨基乙酰丙酸合成酶，以及含有编码米曲霉5-氨基乙酰丙酸合成酶的核苷酸序列的分离核酸片段。本发明还提供了含有本发明核酸片段的核酸构建体、载体和重组宿主细胞。本发明也提供了生产5-氨基乙酰丙酸合成酶的方法。

图1是质粒pSE04的限制性图谱。

图2是含有米曲霉5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的一段4.2kb基因组片段的限制性图谱。图下方给出了用千碱基对(kb)标示的刻度。箭头指示该基因开放阅读框的位置。

图3给出了米曲霉5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的核苷酸序列及由此推断出的氨基酸序列(相应为SEQ ID No：1和SEQ IDNo：2)。公认的重要转录位点CCAAT盒和TATA盒由下划线标出。方框表示两个保守的称为HRM的基元(motif)。圆圈表示参与磷酸吡哆醛辅助因子结合的甘氨酸环。星号指示重要的赖氨酸。

图4给出了多种5-氨基乙酰丙酸合成酶基因中的保守血红素调节基元。方框表示戊肽(pentapeptide)基元。

图5给出了米曲霉、构巢曲霉、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和人红细胞5-氨基乙酰丙酸合成酶推断的氨基酸序列(分别为SEQ ID No：2，16，17和18)的比较。保守的氨基酸用方框划出。

图6给出了质粒pBANe6的限制性图谱。

图7给出了质粒pSE31的限制性图谱。

图8给出了质粒pJVi9的构建过程。

图9给出了质粒pJeRS6的限制性图谱。

图10给出了质粒pJRoC50的限制性图谱。

如上述所提及，本发明涉及得自一种米曲霉菌株的5-氨基乙酰丙酸合成酶。公众已能从一系列培养物保藏中心获得此米曲霉种的菌株，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，德意志微生物保藏中心(DSM)，真菌菌种保藏中心(CBS)，国际微生物研究所(IMI)，农业研究机构专利培养物保藏中心，北方地区研究中心(NRRL)，以及日本大阪发酵研究所(IFO)。

在一个优选实施方案中，本发明涉及得自米曲霉或其突变株的5-氨基乙酰丙酸合成酶。在一个更优选的实施方案中，本发明涉及得自米曲霉IFO4177或其突变株的5-氨基乙酰丙酸合成酶，如具有SEQ ID N0：2所示氨基酸序列的5-氨基乙酰丙酸合成酶。

本发明还涉及在高严谨性条件下(即预杂交和杂交是在45℃下，在5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml已剪切和变性的鲑鱼精DNA，以及50％甲酰胺中进行)，与在相同条件下可跟SEQ ID No：1所示核酸序列杂交上的探针也能杂交上的核酸序列所编码的5-氨基乙酰丙酸合成酶。该基因或以该基因为基础的寡核苷酸，可在Southern杂交中用作探针分离任何曲霉种的同源基因。特别是，这类探针可用于按照标准的Southern杂交方法对感兴趣的种类的基因组或cDNA进行的杂交中，以鉴定和分离其中相应的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因。可将简并性PCR引物(寡核苷酸)与基因组DNA或cDNA片段一起用于扩增5-氨基乙酰丙酸合成酶特异性基因片段。

通过本文实施例中介绍的方法，利用公开可获得的曲霉菌株，可以从本文特别列举的例子以外的来源鉴定和分离5-氨基乙酰丙酸合成酶基因。

为了本发明目的，术语“得自”意指所说的5-氨基乙酰丙酸合成酶产生自一种特殊来源，如一种曲霉菌株，或产生自插入有该来源的编码5-氨基乙酰丙酸合成酶的基因的细胞。

本发明也包括与SEQ ID No：2所示氨基酸序列同源性至少约为80％，优选约为85％，更优选约为90％，最优选约为95％的5-氨基乙酰丙酸合成酶变种，以及性质上仍保留有本文所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶活性的5-氨基乙酰丙酸合成酶变种。本发明也包括与SEQ ID No：2所示氨基酸序列具有三个氨基酸，优选两个氨基酸，更优选一个氨基酸差异的氨基酸序列的5-氨基乙酰丙酸合成酶。每种差异可以是一个氨基酸的插入或缺失，或者是一个氨基酸被另一个不同的氨基酸所替代。上述种类中有用的变种包括如发生了保守氨基酸替代的变种，这种替代不显著影响蛋白质活性。保守替代意指同类氨基酸可以由该类内的其它任何一种氨基酸所替代。例如，非极性脂肪类残基Ala、Val、Leu和Ile可进行互变，碱性残基Lys和Arg可互变，酸性残基Asp和Glu也可互变。类似地，Ser和Thr相互也为保守替代，Asn和Gln也一样。

通过本领域熟知的各种技术，包括但不局限于SDS-PAGE、等电聚焦和交叉反应免疫同一性测定(cross-reactionimmunoidentity test)，可以测定本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶的物理化学性质。利用本领域已知方法可对本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶进行分析。

通过本领域所知的多种方法，可纯化本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶，这些方法包括但不局限于层析法(如离子交换，亲和，疏水性，层析聚焦和尺寸排阻层析)，电泳法(如制备性等电聚焦)，差异溶解力法(differential solubility)(如硫酸铵沉淀法)，或抽提法(参见如《蛋白质纯化》，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH出版社，纽约，1989年)。如本文所定义，“基本纯的”5-氨基乙酰丙酸合成酶是指基本上不含有其它非5-氨基乙酰丙酸合成酶蛋白质的5-氨基乙酰丙酸合成酶，例如，按照SDS-PAGE所测定，至少为约20％纯，优选为约40％纯，更优选为约60％纯，更更优选为约80％纯，最优选为约90％纯，最最优选为约95％纯。

本发明还涉及含有编码本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶的核酸序列的核酸片段，以及含有本发明的核酸片段的核酸构建体。

在一个优选实施方案中，此核酸序列编码得自米曲霉的5-氨基乙酰丙酸合成酶。在一个更优选的实施方案中，该核酸序列编码获自米曲霉IFO4177的5-氨基乙酰丙酸合成酶，如SEQ ID No：1所示核酸序列。本发明也包括编码具SEQ ID No：2所示氨基酸序列的5-氨基乙酰丙酸合成酶、但由于遗传密码的简并性而不同于SEQ IDNo：1的核酸序列。本发明的核酸序列包括本文所述的基因组序列，以及相应的cDNA和RNA序列。此处所用词语“核酸序列”应理解为包括合成DNA在内的所有这类变种。

本发明也涉及含有本发明核酸片段的核酸构建体。“核酸构建体”一般可理解为意指单链或双链的核酸分子，它分离自自然界存在的基因，或是已被修饰从而含有以自然界并不存在的方式进行组合和并置的几段核酸。在一个优选实施方案中，该核酸构建体有效地与能在适宜表达宿主内指导5-氨基乙酰丙酸合成酶表达的调控区相连接。

本发明也提供了含有本发明的核酸构建体的重组载体。在一个优选实施方案中，核酸序列有效地与一段启动子序列连接。在另一个优选实施方案中，本发明的载体还含有转录终止信号和/或筛选标记。

本发明的重组载体在以活性形式表达米曲霉5-氨基乙酰丙酸合成酶基因时是很有用的。一个有用的载体包括能允许该载体稳定整合至宿主细胞基因组、或在宿主细胞内能独立于该宿主细胞基因组而进行自主复制的元件，并优选还含有便于转化的宿主细胞筛选的一个或数个表型标记。该载体还可含有一些控制序列，如启动子，核糖体结合位点，翻译起始信号，另外，还可选择性地含有一个选择标记或多种激活子(activator)或阻遏子(repressor)序列。为使表达蛋白能分泌出来，也可在该基因的编码序列前插入一段编码信号序列的核酸。为了在控制序列的指导下进行表达，将按照本发明而使用的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因与该控制序列有效连接，以便能在与控制序列相容的条件下获得编码序列的表达。

含有本发明核酸构建体的载体可以是能便利地进行重组DNA操作的任何载体。载体的选择典型地取决于欲导入此载体的宿主细胞。载体可以是自主复制型载体，即以染色体外完整形式存在、独立于染色体复制而进行复制的载体，如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。另外，载体也可以是导入至宿主细胞内时，能整合至宿主细胞基因组中并与其整合入的染色体一起复制的载体。载体系统可以是单一载体或质粒，也可以是合在一起含有待整合至基因组内的总DNA的两个或多个载体或质粒。

在载体中，DNA序列应与适当的启动子序列有效相连。所述启动子可以是在选定的宿主细胞内具有转录活性的任何DNA序列，并可得自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。能指导本发明的核酸构建体的转录尤其是在细菌宿主中转录的适当启动子的例子有大肠杆菌半乳糖(lac)操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖的淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子、原核性β-内酰胺酶基因启动子(Villa-Kamaroff等，1978，美国国家科学院院报，75：3727-3731)或tac启动子(DeBoer等，1983，美国国家科学院院报，80：21-25)。其它启动子以“重组细菌来源的有用蛋白质”为题记载于“科技美国”，1980，242：74-94，也记载于Sambrook等，“分子克隆，实验室手册”，第2版，冷泉港，纽约，1989。在酵母宿主中，有用的启动子是eno-1启动子。为了在真菌宿主中进行转录，有用的启动子的例子有得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶(acetamidase)基因的启动子。特别优选的启动子是TAKA淀粉酶、NA2-tpi(来源于编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂合体)以及glaA启动子。

本发明的载体另外也可含有适当的转录终止子以及在真核生物内，与编码本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶的DNA序列有效连接的多聚腺苷酸化序列。终止序列和多聚腺苷酸化序列可与启动子来源相同。载体还可含有能促使载体在选定宿主细胞中复制的DNA序列。这类序列的例子有质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起始点。

本发明的载体优选地含有能便于对转化细胞进行筛选的一个或多个选择性标记。选择性标记是其产物能提供对杀生物剂或对病毒的抗性、重金属抗性、营养缺陷体的原养型等的基因。该选择性标记可选自下述组，所述组中含有但并不限于amdS、pyrG、argB、niaD、sC、trpC、bar和hygB。在曲霉细胞中，优选使用构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记，以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar标记。此外，也可通过共转化完成筛选，如WO 91/17243所述，其中选择性标记包含于另一个载体中。

本发明的载体优选地还含有信号肽编码区，所述编码区编码与血红素生物合成酶氨基末端相连的一段氨基酸序列，该氨基酸序列能将5-氨基乙酰丙酸合成酶定位至特定的细胞区室中。信号肽编码序列可以是编码5-氨基乙酰丙酸合成酶的第一种核酸序列的内部片段，也可以得自外源。第一种核酸序列的编码序列的5’末端本身可能含有信号肽编码区，所述信号肽编码区与编码定位的5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码区的片段在翻译读框内自然相连；或者，编码序列的5’末端可含有编码相对于编码定位的血红素生物合成酶的编码序列部分而言是外源的信号肽编码区的核酸。信号肽编码区可得自粗糙脉孢霉ATPase基因(Viebrock等，1982，EMBO Journal1：565-571)或酿酒酵母细胞色素C过氧化物酶基因(Kaput等，1982，生物化学杂志，257：15054-15058)。然而，能够在选定的丝状真菌宿主中使5-氨基乙酰丙酸合成酶定位的任何信号肽编码区在本发明中都可使用。

为避免在获得表达的5-氨基乙酰丙酸合成酶时需破坏细胞，并使细胞内表达的5-氨基乙酰丙酸合成酶可能的降解量减到最小，优选5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的表达产物能分泌至细胞外。为达此目的，本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶可含有一个允许将此表达的蛋白质分泌至培养基中的前区域(preregion)。如果有必要的话，此前区域可以是本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶自身的，或者是由不同的前区域或信号肽所替代，后者可通过编码相应前区域的DNA序列的替代方便地完成。例如，所述前区域可以得自来源于曲霉属菌种的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、来源于芽孢杆菌属菌种的淀粉酶基因、来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶或蛋白酶基因、来源于酿酒酵母的编码α-因子的基因或是小牛前凝乳酶原(preprochymosin)基因。尤其优选的是米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、来源于芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖的淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶的前区域。真菌宿主中有效的信号序列是米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶或Rhizomucor miehei脂肪酶的信号序列。

本领域普通技术人员熟知用于连接本发明的核酸构建体、启动子、终止子和其它元件以及将它们插入至含有复制必需信息的适当载体中的方法(参见如Sambrook等，文献同上)。

本发明也涉及含有本发明核酸构建体或表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞可有利地应用于本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶的重组生产中。该细胞可利用本发明的核酸构建体、通过将此构建体整合至宿主染色体上而便利地进行转化。由于此时序列更有可能稳定地保持在细胞中，因此一般认为这种整合是更具优越性的。构建体在宿主染色体上的整合可按照常规方法进行，如同源或非同源重组。另外，对不同类型的宿主细胞，利用表达载体，可采用下述方法进行转化。

宿主细胞和载体的选择很大程度上取决于5-氨基乙酰丙酸合成酶及其来源。宿主细胞可以选择原核细胞，如细菌细胞。适当细菌的例子有革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌或浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。细菌的转化可通过如原生质体转化或利用感受态细胞以自身所知的方式进行。

宿主细胞优选真核细胞，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞，或优选为真菌细胞，包括酵母和丝状真菌。例如，有用的哺乳动物细胞包括CHO或COS细胞。酵母宿主细胞可选自酵母属或裂殖酵母属的种类，如酿酒酵母。有用的丝状真菌可选自曲霉属的种类，如米曲霉或黑曲霉。另外，镰孢属种类的菌株，如尖镰孢或禾本科镰孢也可用作宿主细胞。真菌细胞可通过包括原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法，以其自身所知的方式进行转化。曲霉属宿主细胞转化的适当方法描述于EP238023。镰孢属种类转化的适当方法描述于Malardier等，1989，基因，78：147-156，或共同未决的美国流水号08/269,449。

在一个尤其优选的实施方案中，5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的表达是在真菌宿主细胞如曲霉中完成的。将5-氨基乙酰丙酸合成酶基因连接至质粒中，该质粒优选地含有米曲霉TAKA淀粉酶启动子或黑曲霉中性淀粉酶NA2启动子，并含有amdS或pyrG作为选择标记。另外，选择标记也可位于另一单独的质粒上，并用于共转化。可按照Yelton等，1984，美国国家科学院院报，81：1470-1474记载的方法，利用这个(些)质粒对曲霉属宿主细胞如米曲霉或黑曲霉进行转化。

本发明也涉及生产本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶的方法，所述方法包括：(a)在营养培养基中培养米曲霉菌株以生产5-氨基乙酰丙酸合成酶，和(b)回收5-氨基乙酰丙酸合成酶。

本发明还涉及重组生产本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶的方法，所述方法包括：(a)在利于生产该酶的条件下，对含有核酸构建体的宿主细胞进行发酵，其中所述核酸构建体含有编码5-氨基乙酰丙酸合成酶的核酸序列，和(b)回收5-氨基乙酰丙酸合成酶。若表达系统将5-氨基乙酰丙酸合成酶分泌至发酵培养基中，也可从培养基中直接回收此酶。若重组5-氨基乙酰丙酸合成酶不被分泌，则从细胞裂解物中回收此酶。

能表达或分离本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶的本领域已知的培养细胞的任何方法均可使用。例如，培养可理解为包括在实验室或工业发酵罐内适当的培养基中，允许5-氨基乙酰丙酸合成酶表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料或固相发酵)。培养是利用本领域已知方法(参见如Bennett J.W.和LaSure L.(编)，More Gene Manipulations inFungi，学术出版社，CA，1991)、在含有碳、氮源和无机盐的适当营养培养基中进行。适当的培养基可商购，或按照公开的组合物(如美国典型培养物保藏中心的目录中)配制而成。

按上述方法生产的5-氨基乙酰丙酸合成酶可通过常规方法从发酵培养基中回收，所述常规方法包括但不局限于离心、过滤、雾化-干燥、蒸发或沉淀。此回收的蛋白质随后可通过多种层析方法进一步纯化，如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

本发明也涉及5-氨基乙酰丙酸合成酶的使用方法。

可利用本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶将甘氨酸和琥珀酰辅酶A转化为可用作除草剂的5-氨基乙酰丙酸。

也可将本发明的5-氨基乙酰丙酸合成酶用于提高宿主细胞生产血红素蛋白的产量，其中5-氨基乙酰丙酸合成酶是宿主细胞生产血红素的限速步骤。这种血红素蛋白产量的提高是通过在宿主细胞中过量表达编码5-氨基乙酰丙酸合成酶的核酸序列而完成的。该方法包括：

(a)将编码5-氨基乙酰丙酸合成酶之核酸序列的一个或多个拷贝导入至能产生血红素蛋白的宿主细胞中，其中所述核酸序列与能指导5-氨基乙酰丙酸合成酶表达的调控区有效相连；

(b)在适于生产血红素蛋白和5-氨基乙酰丙酸合成酶的营养培养基中培养该细胞；以及

(c)从该细胞的营养培养基中回收血红素蛋白。

本发明由下述实施例进一步描述。这些实施不应被认为是对本发明的范围的限制。

实施例1：提取米曲霉菌株A1560基因组DNA

于32℃，250rpm下，在25ml 0.5％酵母提取物-2％葡萄糖(YEG)培养基中将米曲霉A1560菌株(IFO4177)24小时，然后通过Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)过滤收集菌丝，用25ml10mM Tris-1mM EDTA(TE)缓冲液洗涤1次，吸干菌丝上多余的缓冲液，随后将其在液氮中冷冻。在电动咖啡磨碎机中将冷冻的菌丝磨成细粉末，将粉末加入一次性塑料离心管内的20ml TE缓冲液和5ml20％w/v十二烷基硫酸钠(SDS)中，将混合物轻轻颠倒几次以确保混匀。用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)抽提2次。加入醋酸钠(3M溶液)使其终浓度为0.3M，用2.5倍体积的冰冷的乙醇沉淀核酸。以15,000×g将此管离心30分钟得到核酸沉淀。将沉淀物风干30分钟，然后重新悬浮于0.5ml TE缓冲液中。加入不含DNA酶的核糖核酸酶A至浓度为100μg/ml，将混合物在37℃下保温30分钟。然后加入蛋白酶K至浓度为200μg/ml，再在37℃下将混合物继续保温1小时。最后，如前述，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)将混合物抽提2次，再用醋酸钠和乙醇沉淀DNA。真空干燥DNA沉淀物，重新悬浮于TE缓冲液中，贮于4℃以供后面的使用。

实施例2：构建质粒pSE04

利用实施例1所述的同样方法提取构巢曲霉A26菌株(真菌遗传学保藏中心，Kansas City，KS)的基因组DNA。将通过含有构巢曲霉A26基因组DNA的扩增反应获得的PCR片段连接而构建成质粒pSE 04。扩增反应中含有下述组分：构巢曲霉A26基因组DNA50ng，dATP、dCTP、dGTP、dTTP(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)各100μM，引物ALAS3d 5’-TTTATGATGGAGGCCCTTCTCCAGCAGTCTC-3’(SEQ IDNo：3)和引物AlAS4e 5’-CTATGCATTTAAGCAGCAGCCGCGACTGG-3’(SEQ ID No：4)各50pmol，Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Branehburg，NJ)2单位，以及1×TaqDNA聚合酶缓冲液(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)。反应在Perkin-Elmer热循环仪(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)中进行30个循环，每个循环包括95℃1分钟、55℃1分钟以及72℃90秒。在40mM Tris-乙酸-1mM乙二胺四乙酸二钠(TAE)缓冲液中，利用1.1％低熔点琼脂糖凝胶(FMC，Rockland，ME)电泳后通过切割条带分离得到2kb的PCR产物，并按照制造商的说明将其亚克隆至pCRII载体中(Invitrogen，SanDiego，CA)以获得pSE04(图1)。

实施例3：米曲霉A1560菌株DNA文库及ALA合成酶(hemA)克隆的鉴定

按照制造商的说明，将E.coli Y1090 ZL细胞用作平铺和纯化重组噬菌体的宿主，将E.coli DH10BZip用作切割各个pZL1-hemA克隆的宿主，利用噬菌体克隆载体入ZipLox(Life Technologies，Gaithersburg，MD)构建米曲霉A1560菌株的基因组DNA文库。用Tsp509I部分消化按实施例1制备的总细胞DNA，并在50mM Tris-50mM硼酸盐-1mM乙二胺四乙酸二钠(TBE)缓冲液中利用1％琼脂糖凝胶进行片段大小分离。切下迁移范围在4-7kb的DNA片段，并利用Prep-a-Gene试剂(BioRad Laboratories，Hercules，CA)从凝胶中将DNA片段洗脱下来。将洗脱下来的DNA片段与已经EcoRI切割并去磷酸化的入ZipLox载体臂进行连接，并利用可商购的包装抽提物(Stratagene，La Jolla，CA)对连接混合物进行包装。在E.coli Y1090ZL细胞中平铺和扩增经包装的DNA文库。未扩增的基因组文库含有1×10⁶pfu/ml。

将7×10⁴个噬斑的噬菌体DNA转移至双层圆形Nytran Plus膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上，并利用地高辛(DIG)标记的探针进行探测，此探针是通过PCR扩增来自实施例2所述质粒pSE04的构巢曲霉hemA基因组DNA制备而成。扩增反应含有下述组分：1×DIG探针合成混合液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，dATP、dCTP、dTTP和dGTP各100μM，实施例2所述引物ALAS3d和引物ALAS4e各50pmol，Taq DNA聚合酶2单位，以及1×Taq DNA聚合酶缓冲液。反应在Perkin-Elmer热循环仪中进行30个循环，每个循环包括95℃1分钟，55℃1分钟，以及72℃2分钟。以2ng/ml的浓度将经变性的探针加入至杂交缓冲液中，并与经预杂交的膜一起保温过夜。预杂交和杂交是在42℃下，在5×SSC、0.1％Sarkosyl、0.02％SDS、1％Genius阻断试剂(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和30％甲酰胺中进行的。膜在5×SSC-0.1％SDS中洗涤两次，每次洗涤均是在室温下进行15分钟。按照厂商说明，于室温将洗涤好的膜对Kodak X-OMAT AR胶片曝光约2小时，再利用Konica QX-70自动胶片处理机进行显影。对初始噬斑进行再次纯化和筛选。鉴定出5个克隆，再按照厂商说明(Bethesda Research Laboratories Inc.，Gaithersburg，MD)将其切割至pZL衍生物中。将所述pZL衍生物命名为E.coli DH 5αpSE11，pSE13，pSE15，pSE17和pSE20。已发现这些克隆有所重叠，它们跨越一个4.2kb的区域，此区域的限制性图谱示于图2。

实施例4：利用5-氨基乙酰丙酸合成酶(hemA)探针进行米曲霉A1560菌株基因组DNA的Southern杂交

将按实施例1所述的方法制备的米曲霉A1560菌株基因组DNA(10μg)用BamHI或EcoRI进行限制性消化。在1％琼脂糖-TBE凝胶上电泳分离片段。按照厂商说明，利用TurboBlot装置(Schleicher & Schuell，Keene，NH)，在0.4N NaOH中将DNA转移至NytranPlus膜上。在Hybaid炉(Labnet，Woodbridge，NJ)内，将膜在5×SSC、0.1％sarkosyl、0.02％SDS、1％Genius阻断试剂(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和50％甲酰胺中于42℃预杂交2小时。通过使用DIG标记的hemA探针进行杂交，该探针如实施例3所述通过PCR扩增获得，不同之处在于使用hemA克隆pSE17作为模板，并使用引物hemA5’5’-TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3’(SEQ ID No：5)和引物hemA3’5’-TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-3’(SEQID No：6)。将DIG标记的hemA探针(1ng探针/ml溶液)加入新鲜的杂交缓冲液中，与膜一起在42℃保温过夜。随后，将膜在5×SSC-0.1％SDS中于室温洗涤2次，每次15分钟，再在2×SSC-0.1％SDS中于相同的条件下洗涤2次。于室温下将洗涤后的膜对Kodak X-OMAT AR胶片曝光约2小时，随后按照厂商说明，利用Konica QX-70自动胶片处理机进行显影。

利用米曲霉hemA探针与米曲霉基因组DNA一起进行的Southern印迹杂交结果表明杂交信号与单基因拷贝数一致。BamHI泳道上观察到的1.7kb条带可从限制性图谱上推断出来(图2)。

实施例5：米曲霉A1560 5-氨基乙酰丙酸合成酶(hemA)基因的特性

按下述方法，对实施例3中所述的E.coli DH5α pSE17进行DNA测序。DNA测序是在APPlied Biosytems的373A型DNA自动测序仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)上，使用含染料-终止剂化学的引物步行技术(Giesecke等，1992，病毒学方法杂志，38：47-60)对两条链进行的，测序中使用了M13反向引物(-48)和M13正向引物(-20)(New England Biolabs，Beverly，MA)，以及此待测序DNA的特异引物。

如图3(SEQ ID No：1)所示，此克隆基因的核苷酸序列表明其中含有一个具1911个核苷酸的开放阅读框。该编码序列中不包含任何内含子，这一点可通过cDNA克隆和序列分析得到证实；与之相反，构巢曲霉hemA基因在其5’末端含有一个内含子(Bradshaw等，1993，现代遗传学(Current Genetics)，23：501-507)。如其它真菌基因一样，此克隆基因的5’非翻译序列含有一些嘧啶富含区和AT富含区(Gurr等，1987，Kinghorn J.R.(编)，《(真核微生物的基因结构)》，pp93-139，IRL出版社，Oxford)，另外它还含有在-249位的CCAAT序列以及在-35位的公认TATA盒。此CCAAT序列是转录调节子的一致结合位点，所述的转录调节子能对氧作出反应从而调节转录，如酵母和人中的Hap2/3/4转录调节复合物(Olesen和Guarente，1990，分子和细胞生物学，12：2302-2314)。此调节复合物在哺乳动物中也是保守的。在构巢曲霉中也检测到CCAAT结合活性(Daavis等，1993，Genetica 90：133-145)。在米曲霉hemA基因中此序列的重要性仍不清楚，并且，由于序列信息有限，构巢曲霉hemA 5’区内此序列的重要性也未能确证(Bradshaw等，1993，出处同前)。米曲霉hemA基因对氧作出反应从而受到的转录调控目前还不清楚，但是甚至在氧限制条件下，构巢曲霉hemA基因也没有显现出受到转录调控(Bradshaw et al.，1993，同处同前)。有趣的是，酵母HEM1基因也是组成型表达，但其表达是通过正调控位点与负调控位点间的平衡来控制的(Keng和Guarente，1987，美国国家科学院院报，84：9113-9117)。此克隆基因的3’非翻译区存在一个(AC)₃₅重复基元(motif)。在哺乳动物和酵母基因的亚端粒、内含子和启动子区也观察到类似的重复区，尽管它们在基因扩增过程中有所参与，但它们也不具有已知的功能(Passanati等，1987，EMBO Journal 6：1967-1703)。

米曲霉A1560菌株之基因产物推断的氨基酸序列示于图3(SEQ ID No：2)。该核苷酸序列编码分子量为68kDa、含636个氨基酸的预测蛋白质。由于此酶位于线粒体中，推测其N末端含有线粒体前导序列。事实上，此蛋白质前35个氨基酸富含丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸残基，这与作为线粒体前导序列的功能是一致的。在构巢曲霉和米曲霉hemA序列(图4)推测的线粒体前导序列中都有一个可能的血红素调节基元(HRM)。估计位于前导序列中的HRM能通过与血红素直接作用而阻止将5-氨基乙酰丙酸合成酶蛋白输入小鼠线粒体中(Lathrop和Timko，1993，科学，259：522-525；Zhang和Guarente，1995，EMBO Journal 14；：313-320)。另一个可能的HRM也位于推定的成熟蛋白质序列的开始处。HRM很可能在5-氨基乙酰丙酸合成酶活性的调控中起着一定的作用。有趣的是，酿酒酵母5-氨基乙酰丙酸合成酶蛋白质序列不含有任何可能的HRM，并且，它似乎并不是酵母血红素生物合成中的一个关键调控步骤(Labbe-Bois和Labbe，于Daley，Harry A.所编，《(血红素和叶绿素的生物合成)》，McGraw Hill Publishers，纽约，pp235-285)。

总的说来，利用Applied Biosystems的GeneAssist程序(blosum 62.mat matrix)测定的结果表明图5所示的推断氨基酸序列与构巢曲霉hemA基因(SEQ ID No：16)有81％的同一性，与酿酒酵母HEM1基因(SEQ ID No：17；Urban-Grimal，1986，生物化学欧洲杂志，156：511-519)有57％的同一性，与人红细胞heml(ALAS2)基因(SEQ IDNo：18；Bishop，1990，核酸研究，18：7187-7188)有51％的同一性。然而，最高程度的保守位于蛋白质包括有催化结构域在内的C端2/3区。另外，在其它5-氨基乙酰丙酸合成酶(Ferreira等，1995，生物能和生物膜杂志(Journal ofBioenergetics and Biomembranes)，27：151-159；Ferreira，1995，蛋白质科学，4：1001-1006)中对催化活性和吡哆醛磷酸辅助因子结合有重要作用的赖氨酸和甘氨酸环(loop)在此推断的氨基酸序列中也是高度保守的。

实施例6：载体pSE31的构建

通过将PCR扩增的米曲霉hemA DNA定向克隆至pBANe6中构建成质粒pSE31(图6)。PCR扩增反应中使用了来源于实施例3所述之hemA克隆E.coli DH5αpSE17的DNA。反应中含有下述组分：50ng pSE17、2单位Vent DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，1×Vent DNA聚合酶缓冲液(New England Biolabs，Beverly，MA)，各400μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，以及各50pmol的引物hemA5’5’-TC ATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3’(SEQ IDNo：5)和引物hemA 3’5’-TC TTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-3’(SEQ ID No：6)。反应在Perkin-Elmer热循环仪中进行30个循环，每个循环包括95℃1分钟、55℃1分钟以及72℃90秒。引物hemA 5’含有一个SwaI位点(下划线)，引物hemA 3’含有一个PacI位点(下划线)，这两个位点用于将PCR产物克隆至经SwaI和PacI消化的pBANe6中以产生pSE31(图7)。

实施例7：米曲霉JRoC50.3.18A菌株的构建

按下述方法构建含有质粒pJROC50的米曲霉JRoC50.3.18A菌株。利用如下所示的特异性寡核苷酸引物(Saiki等，1988，科学，239：487-491)，通过PCR制备Coprinuscinereus IFO8371过氧化物酶cDNA片段。这些引物是依据Coprinus macrorhizus过氧化物酶的氨基酸序列(Baunsgaard等，1993，生物化学欧洲杂志，213：605-611)设计而成的：

1.5’-GCGCGAATTCGTNGGNATNGGNATNAA(CT)CA(CT)GG-3’(SEQ ID No：7)；

2.3’-TACAGNTT(GA)AC(GA)GGNGGCCTAGGCG-5’(SEQ ID NO：8)；

3.5’-GCGAATTCACNCCNCA(GA)GTNTT(CT)GA(CT)AC-3’(SEQ ID NO：9)；

4.3’-GGNAA(GA)GGNCCNCT(CT)AA(GA)CCTAGGCG-5’(SEQ ID NO：10)；

5.5’-GCGCGAATTCTGGCA(GA)TCNAC-3’(SEQ IDNO：11)；

6.5’-GCGCGAATTCTGGCA(GA)AGNATG-3’(SEQ IDNO：12)；

7.3’-CGNTACCGNTT(CT)TACAGCCTAGG-5’(SEQID NO：13).

按照厂商说明，利用Gene Amp试剂盒和仪器(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)进行PCR。与厂商说明不同之处在于，此反应中前3个循环是在28℃下进行的，以获得与第一链cDNA(由来源于Coprinus cinereus IFO8371菌株的mRNA制备而成)更好的杂交，随后PCR在65℃下进行30个循环。

对引物进行如下组合：1与2；3与4；5与7；6与7；1与4；以及3与7。PCR产物在5’末端延伸了一个EcoRI位点，在3’末端延伸了一个BamHI位点。反应产物在1％琼脂糖-TBE凝胶中进行分析，发现所有反应中均含有预期大小的条带。为了证实这些片段都对应于过氧化物酶特异性序列，对凝胶进行Southern印迹，并与位于引物3和4之间的具下述序列的寡核苷酸探针进行杂交：

5’-GT(CT)TC(GA)AT(GA)TAGAA(CT)TG-3’(SEQ IDNo：14)。

结果表明此探针能与大约130bp、420bp、540bp和240bp的条带进行杂交，由此证实观察到的DNA条带确实对应于过氧化物酶序列。

各个PCR反应来源的DNA经EcoRI和BamHI消化后，克隆至质粒pUC19(New England Biolabs，Beverly，MA)中。利用上文所述寡核苷酸探针(SEQ ID No：14)，通过杂交鉴定含有正确PCR片段的菌落。按照Sanger等所叙述的方法(1977，美国国家科学院院报，74：5463-5476)，通过限制性图谱和部分DNA序列分析，对阳性菌落的DNA进行分析。得自其中一个克隆的、通过利用引物1和4所获得的430bp片段按下述方法用于筛选Coprinus cinereus cDNA文库。

按照Boel等(1984，EMBO Journal 3：1097-1102)和Chirgwin等(1979，生物化学，18：5294-5299)所叙述的方法，在最高过氧化物酶活性的时间点收集Coprinuscinereus IFO8371菌株的菌丝并进行匀浆，从中提取总RNA。按照Aviv和Leder(1972，美国国家科学院院报，69：1408-1412)所叙述的方法，在oligo(dT)-纤维素柱上进行两轮亲和层析获得含有poly(A)的RNA。根据厂商说明，利用cDNA合成试剂盒(Invitrogen，San Diego，CA)合成cDNA。将Coprinus cinereus cDNA文库中大约50,000个E.coli重组子转移至Whatman 540滤膜上。按照Gerger等(1979，核酸研究，7：2115-2135)所叙述的方法裂解和固定菌落。在0.2×SSC-0.1％SDS中将滤膜与32P标记的430bp过氧化物酶基因特异性探针一起杂交。在65℃对滤膜进行杂交和洗涤，随后使用增感屏进行24小时放射自显影。放射自显影后，滤膜在逐渐递增的温度下洗涤并与增感屏一起放射自显影24小时。通过此途径，鉴定出50多个阳性克隆。按照标准方法(Birnboim和Doly，1979，核酸研究，7：1513-1523)，从杂交克隆中小量制备质粒DNA，再通过Sanger双脱氧法(Sanger等，1977，美国国家科学院院报，74：5463-5467)测定这些cDNA插入片段的DNA序列。从这些菌落中挑选出一个，并将此载体命名为pCiP。经过BamHI/XhoI切割，从载体上切下过氧化物酶cDNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳纯化此片段，进行电洗脱，并经各种处理以备连接反应之用。将此cDNA片段连接至经BamHI/XhoI消化的pHD414以产生pJVi9，其中，如图8所示，cDNA是在米曲霉来源的TAKA启动子和黑曲霉来源的AMG^TM(Novo Nordisk A/S，Bagsvard，Denmark)终止子的转录调控之下。

从质粒pJVi9中以BamHI/XhoI片段形式切下编码C0prinus cinereus过氧化物酶的cDNA，再克隆至质粒pJeRS6(图9)中，形成质粒pJRoC50(图10)。质粒pJRoC50中含有作为选择性标记的pyrG，以及TAKA启动子和amdS终止子。

利用5μg纯化的质粒pJRoC50，按下述方法，并作如下变动，以制备米曲霉HowB425菌株的转化子。取消琼脂覆盖层，将原生质体直接铺板于基本培养基(Minimal Medium)平板上。转化反应使用浓度为2×10⁷个/ml的原生质体。将100μl原生质体与5μg DNA一起置于冰上30分钟，加入1ml SPTC(40％PEG4000，0.8M山梨醇，0.05M Tris pH8.0，0.05MCaCl₂)，将原生质体置于34℃保温20分钟。将转化产物直接铺板于含有基本培养基的平板上。每升所述基本培养基(pH6.5)含有下述组分：6gNaNO₃，0.52gKCl，1.52g KH₂PO₄，1ml微量金属溶液，1g葡萄糖，500mg MgSO₄-7H₂O，342.3g蔗糖和20g Noble琼脂。每升微量金属溶液(1000x)含有下述组分：22g ZnSO₄-7H₂O，11g H₃BO₃，5g MnCl₂-4H₂O，5gFeSO₄-7H₂O，1.6g CoCl₂-5H₂O，1.6g(NH₄)₆Mo₇O₂₄以及50gNa₄EDTA。将平板置于34℃保温5-7天，再将转化子转移至含有同样培养基的平板上，在37℃继续保温3-5天。

按下述酶测定方法测定66个转化子中的过氧化物酶活性：在按1∶900稀释的培养上清液20μl中加入180μl底物缓冲液{20ml 0.1M磷酸钾-0.01％吐温80 pH7.0，250μl2，2’-azinobis(3-乙基苯酰噻唑啉-6-磺酸酯)(ABTS)溶液(22mg/ml)及2μl 30％过氧化氢}，利用Molecular Devices的Thermomax微量板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)迅速在25℃测定405nm处的光吸收值。在2分钟以上的时间段内不断混合，并每隔10秒钟记录一次测定值，再利用SOFTmax程序(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)计算Vmax值。以已知量的灰盖鬼伞过氧化物酶为标准绘制标准曲线，利用此标准曲线估计每毫升的过氧化物酶单位(POXU)。1POXU定义为在30℃下，每分钟催化0.88mM H₂O₂、1.67mMABTS、0.1M磷酸盐pH7.0发生1.0μ mole转变所需的酶量。利用上述同样的平板，在相同的条件下，通过孢子划线，挑选独立菌落，从而对4个具最高表达水平的转化子进行孢子纯化。

在摇瓶中，将每种转化子约5×10⁶个孢子接种于25mlMY25培养基中，进行最终分析。MY25培养基含有下述组分：1％酵母提取物，2.5％麦芽糖，0.2％尿素，以及1×MY盐溶液，pH6.5。每升1×MY盐溶液含有下述组分：2gMgSO₄-7H₂O，2gK₂HPO₄、10g KH₂PO₄，2g柠檬酸，0.5ml微量金属溶液，以及1ml 10％CaCl₂-2H₂O。每升微量金属溶液含有下述组分：13.9g FeSO₄-7H₂O，8.5g MnSO₄-H₂O，14.28g ZnSO₄-7H₂O，1.63g CuSO₄，0.24g NiCl₂-6H₂O，以及3.0g柠檬酸。将在50mM NaOH中新鲜制备的氯高铁血红素(hemin)10mg/ml储存液加入摇瓶中至终浓度0.01mg/ml。将摇瓶于34℃、200rpm保温7-8天。将能生产最大量过氧化物酶的转化子命名为JRo C50.3.18A。

实施例8：利用pSE31转化米曲霉JRoC50.3.18A菌株

利用pSE31转化米曲霉JRoC50.3.18A菌株以测定hemA基因的过量表达是否会提高过氧化物酶的生产水平。

转化反应使用浓度为2×10⁷个/ml的原生质体。在34℃，将100μl原生质体与10μg DNA和200μl 60％PEG4000-10mM HEPES-10mM CaCl₂溶液一起保温30分钟。加入3ml SPTC(40％PEG4000，0.8M山梨醇，0.05M TrispH8.0，0.05M CaCl₂)，立即将原生质体平铺于COVE转化板(每升含有：0.52g KCl，0.52g MgSO₄-7H₂O，1.52g KH₂PO₄，1ml实施例7所述的微量金属溶液，342.3g蔗糖，25g Noble琼脂，10ml 1M乙酰胺，以及10ml 3M CsCl)中以进行amdS转化。将平板于34℃保温5-7天。再将转化子转移至含有同样培养基的平板上，于34℃保温3-5天。然后利用这些板，在同样的条件下通过孢子划线、挑出独立菌落从而对转化子进行纯化。

实施例9：hemA转化子中过氧化物酶的生产

在24孔微滴定板的各个孔中以约1×10⁵个孢子/孔的接种量分别接种实施例8来源的转化子，这些孔中含有1ml四分之一强度的MY25培养基和1×MY盐(参见实施例1)，所述四分之一强度的MY25培养基中含有0.25％酵母提取物，0.63％麦芽糖及0.05％尿素，pH6.5。在湿润摇床中，于34℃、100rpm将微滴定板保温5天。

利用实施例7所述的酶测定法测定过氧化物酶生产水平。微滴定板测试结果表明，hemA转化子的平均POXU/ml比仅转化载体的载化子平均水平高1.4倍，而最好的hemA转化子的过氧化物酶生产量提高了1.6倍。

小部分hemA转化子(39％)与大部分仅含载体的对照具有相似的过氧化物酶水平。利用按实施例1所述方法从各个转化子中分离的基因组DNA 50ng，按实施例2所述方法进行PCR。与实施例2所述方法不同之处在于，此处使用引物hemA3’(见实施例4)和引物5’-TCTCTTCCTTCCTGAATCCTC-3’(SEQ ID NO：15)。此分析结果表明hemA转化子含有表达盒。

在摇瓶中培养以上获得的11个最好的hemA转化子，以便更好地分析对过氧化物酶生产的影响。为了进行摇瓶分析，在25ml MY25培养基中接种约5×10⁶个孢子的各个转化子。所述MY25培养基中含有1％酵母提取物，2.5％麦芽糖，0.2％尿素以及1×MY盐溶液pH6.5(见实施例7)。将摇瓶在34℃、200rpm保温7-8天。按照上述方法进行过氧化物酶分析。

结果表明，5个转化子：SE01-15、SE01-20、SE01-26、SE01-28和SE01-32产生的过氧化物酶水平高于仅含载体的对照菌株，其中3个转化子表达的过氧化物酶水平比对照的过氧化物酶平均水平高1.9倍。剩下的6个hemA转化子的过氧化物酶水平与对照相当。

以高水平麦芽糖浆作碳源，利用标准的分批补料方法，在2升发酵液中培养转化子SE01-28和对照菌株SE05-18(单独pBANe6载体的转化子)。在批料和补料中添加FeCl₃至约0.4mM。在两种培养物中维持正溶解氧压，并在第3-8天以每小时约2g糖化物/升的速率添加补料。在第2和3天后以逐步的方式达到此水平。发酵期间两种培养物的生物量大致相等。

据观察，SE01-28的过氧化物酶活性化对照菌株SE05-18高2倍，SE01-28的多肽水平也比对照菌株SE05-18高2倍。

所有结果表明hemA基因的过量表达能提高过氧化物酶产量约2倍，这些数据进一步说明hemA可能在丝状真菌的血红素生物合成中代表一个关键的调控点，在缺乏氯高铁血红素补给时，hemA在遗传调控的水平上能提高血红素蛋白的产量。

如下菌株已按照布达佩斯条约保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心(NRRL)，北方地区研究实验室，1815University Street，Peoria，Illinois 61604，USA。

菌株保藏号保藏日期E.coli DH5α(pSE17) NRRL B-21563 1996年4月22日

此菌株已在一定条件下被保藏，能确保在此专利申请未决期间由专利和商标官员决定根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授予可获得所述菌株之权利的人可得到所述菌株培养物。保藏物代表每种保藏菌株的基本上纯的培养物。当在外国提交本申请的副本或其子申请时，如外国专利法需要，也可得到该保藏物。然而，应理解保藏物的可获得性在由政府行为授予的专利权的部分废除时不构成对操作本发明的许可。

本文所述和要求权利的发明并不局限于本文所公开的具体的实施方案的范围，因为这些实施方案只想阐明本发明的几个方面。任何等价的实施方案都在本发明的范围之内。实际上，根据前文的描述，除了本文所示和所述的以外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员而言都是显而易见的，这种修饰也欲包括在所附权利要求书的范围内。

本文提及很多参考文献，它们所公开内容都全文列入本文作为参考。

序列表(1)一般资料

(i)申请人：

(A)名称：Novo Nordisk Biotech，Inc.

(B)街道：1445 Drew Avenue

(C)城市：Davis，California

(D)国家：美国

(E)邮编代码(邮编)：95616-4880

(F)电话：(916)757-8100

(G)传真：(916)758-0317

(ii)发明名称：米曲霉5-氨基乙酰丙酸合成酶及编码此酶的核酸

(iii)序列数：18

(iv)联系地址：

(A)联系人：Novo Nordisk of North America，Inc.

(B)街道：405 Lexington Avenue，Suite 6400

(C)城市：纽约

(D)州：纽约

(E)国家：美国

(F)邮编：10174

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM兼容机

(C)操作系统：DOS

(D)软件：Windows 2.0版的FastSEQ

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：60/019，399

(B)申请日：1996年6月10日

(C)分类号：

(viii)代理人/代理机构资料：

(A)姓名：Lambiris，Elias J.

(B)登记号：33，728

(C)参考文献/文档号：4808.204-WO

(ix)电信资料：

(A)电话：212-878-9652

(B)传真：212-878-9655

(C)电传：(2)SEQ ID No：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：4157个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID No：1：ACCATTGACT CTCAAGCTAT GGATCGTGCT CACCGTCTCG GCCAGACAAG ACAGGTCACG 60GTGTATCGCC TGATTACTCG CGGCACCATT GAGGAGCGTA TTCGCAAGCG AGCTTTGCAG 120AAGGAGGAAG TGCAGCGTGT CGTCATCTCA GGTGGCGCAG CTGGTGGGGT TGACTTCAAT 180ACTCGCAACC GCGAGAGCCG AACCAAGGAC ATCGCCATGT GGCTGGCAGA TGATGAACAG 240GCGGAGCTTA TTGAGCAAAA GGAGAAGGAA GCGCTGGACC GAGGCGAAGT GTTTGGCGCT 300AGTAAAGGCG GGAAGAAGGC TGCTCAGAAG AGAAAGAGAG ATATCACGCT GGATGATATG 360TATCATGAAG GTATGTGAAT CTGATCAAAG CTCTTCGTTC CGGGGAGGCT TCTGGAAATA 420GTACTAACCG CGTCAATCTA TAGGCGAAGG GAACTTTGAC GATGCCAGTG CAAAGCCATC 480AGGAGCGGCC ACTCCTGTGT CGACTGCAGA GAATTTAGGC ACCCCATCCT CCACGCCAGT 540TCCTAAACGA GGACGTGGAA GGGGGACAGG AAAGGGCACG TCTAAAAGAG CCAAAACTAC 600CAAGGAGAGA TTACGTCTCA TTGATGGCGA CGGAGGCTTA GGGCCTAGTT GATTTAATCG 660ATCTGTGCCT CAATAATGGA CACGGCTGGT TATGGTCATG GCGTTCAGAG ATTGCATTTC 720TTTCCCACCC TTTATCTTTC TTTCTTTCCT CTTAAACCCC TCTTTTTTGT TTTTCTTTTT 780ATCGGACTTT ACTTGTGGGC AGCTTACGTT CTGCCTTGTA TTAACAGCAT ATATTCCTGA 840TTCCTGATGT ACGAAGCGAT TTAAGAGTCA TTGAAGACGA AGGATGAAAC CCGTGGTAAT 900CAGCCGATAA TGGCAAAGAG AAGGAGAAGA AAAAAATCAA GTGCGAGTTT TGAAATTGAT 960GGCAAGATAG ACATTGTATC CTGTACCTGT TCTTGGGCTG TGACGGGGGG GGTGAAATTG 1020ACGGTCATCA CCCGGCTATT ATTACTATTG TTGTACTGTA CATCCGGATC CTGCTGGTCT 1080GTATCTAGTT AGGGCAATAT TCCCCGTCGC CAGGCCTCTT GGGTTATGAA TGATTTCATA 1140GGTGAAGTTT CGTATCCGTA CGCACCGAGA GATTTCTTAG TATTACTTGT ATTATGAAAA 1200TGCACTTGCC GAGTTAAGTC CGCCGGCCAA TCACGGCGGA GGATATGGTA AGCCGAAAAG 1260TCTCGCCGAA GTCCCCGACT TACTCTTACT GGAAGTGGCT TAGTGCCCTC AGCGCCCCCT 1320CGCCCTCAGT CCATCAGCCA GATTGACTCT TATTTCTCTC TCCTCTTCGC CGCGGGTGAC 1380ATATCCCTCT CCTTCTCCCT CTCCCTCTTG ACAACATTTC ATCTTCGCTT CCTTTTGTGA 1440TATAGTCAGT TTCGCTATCC ATTGAAGCAT CACTCATGGA GTCTCTTCTC CAGCAGTCCC 1500GGGCGATGTG CCCGTTCCTT AAGCGCACAT CTCCATCTTC TCTGCGTACG CTGGCAACCG 1560CGACTCGACC TAGCACTAGT TCCGGTGGAG GCACTATGTC TAATCTCCAG GTCATTGCCC 1620GTCGCTGCCC TGTCATGAGC AAGGCTCTGG CCGTGCAGAG CGCTCGCATG GCCGGTACCA 1680AAAGATTCAC CTCATGTGCT GCCGGCATCA CCGGTCTCGG CAACAAGCAT TGCCGTGCTC 1740CTACTGGGAA GAGAACCCTG CACTCCACCT CCGGTAACGG CGCCAATGTG AGCGCAGAGA 1800TCTACAAGAA CACCCAGCGA GATCCCGCCG GTTTCTCGAA GATCAAGACC CCTGCCAATG 1860CTACCGCCGC TGCCGCTACG TCTGGCCCTC GTCCAGAGGC TCCCGTGGCG AAGCCTTTCA 1920ACTACAATTC TTTCTACAAC ACCGAATTGG AAAAGAAACA CAAGGACAAG TCGTATCGCT 1980ATTTCAACAA CATCAATCGT CTCGCTCAGG AGTTTCCCCG GGCTCACACC ACATCTGCCG 2040AGGAACGTGT GACGGTCTGG TGCTCGAACG ATTATCTCGG CATGGGCCGC AACCCCGAGG 2100TTCTGGCCAC CATGCATAAG ACATTGGACA CCTACGGAGC CGGTGCGGGA GGTACTCGCA 2160ACATTTCAGG TCACAATCAA CATGCCGTGA GCCTGGAGAA CACCCTGGCC AAATTGCACG 2220GCAAGGAGGC GGCATTAGTC TTCAGCTCAT GCTTCGTGGC TAACGATGCC ACCCTCGCAA 2280CCCTGGGTAG CAAGTTGCCC GACTGTGTTA TTCTGTCCGA TAGCCTGAAT CATGCATCGA 2340TGATTCAGGG TATTCGCCAT TCAGGCGCCA AGAAAATGGT TTTCAAGCAT AATGATCTGG 2400TCGACCTTGA GGCCAAGTTG GCAGCTCTAC CTCTTCATGT CCCCAAGATT ATTGCATTCG 2460AATCAGTTTA TAGCATGTGC GGATCTATTG CCCCAATTGA GAAGATCTGT GATCTTGCAG 2520ACAAGTACGG TGCCATTACT TTCCTGGATG AAGTCCACGC TGTGGGAATG TACGGACCTC 2580ACGGAGCAGG TGTGGCAGAG CACCTTGACT ATGACATCTA TGCTTCCCAA GATACGGTCA 2640ACCCGCGCAG TACTAAGGGA ACCGTGATGG ACCGAATCGA TATTATCACC GGTACTCTGG 2700GCAAGGCCTA CGGATGTGTC GGGGGCTACA TTGCTGGATC CGCTGCGATG GTTGACACCA 2760TCCGCTCCCT CGCCCCTGGC TTCATCTTCA CCACGTCCTT GCCGCCCGCC ACCATGGCTG 2820GTGCAGACAC TGCTATCCAG TACCAGGCTC GTCACCAGGG CGACCGCGTC CTGCAGCAGT 2880TGCACACCCG CGCGGTCAAA GCAGCTTTCA AGGAGTTGGA TATTCCTGTA ATTCCCAACC 2940CCTCCCATAT CATTCCGCTC CTGGTTGGGG ATGCCGAGGT TGCTAAGAAG GCCTCGGACA 3000AGCTTCTGGA GGAGCATGGA ATTTATGTAC AAGCCATCAA CTACCCAACC GTGCCTCGGG 3060GTGAAGAGCG GCTTCGTATC ACGCCCACCC CGGGACATAT CAAGGAGCAC CGCGACCACC 3120TGGTGCAAGC CGTCCAAACA GTCTGGAACG AACTGGGCAT CAAACGCACC AGCGATTGGG 3180AAGCGCAAGG CGGCTTCGTC GGCGTGGGTG TCGATGGCGC CGAGGCTGAG AACCAGCCGA 3240TTTGGAATGA TGTGCAGCTG GGGCTGAAGG AAAACGAAGC CATTGAGGCT GCTGTGGAAC 3300GCGAGTTTGC CGAGGCCCCC ATGCGGACCG CCACCCGTCC TGCCGCGGCT GCTGCTTCGT 3360CAATCCCGGT GGGTGTGGCT GCCTGAAGTG GCTGCCCGCA TGTGAGCTGA AATCGACGTG 3420GAATTCTATA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA 3480CACACACACA CACACACACT AACACACACT ATGTTATAAA TTCCACATCC ACTCCTTTGT 3540CCCTTGTTGG ACGTAATTGG TATTTGGACT ATTAGTTAGA ACCAGTCAGT CGTTACCATG 3600TGTTTCGGTT CGACTCGAAA TCTGACATGT TGTCTGCCCC CATGCCACTT CATCTCCTCC 3660GTAACCGCAG GGCTTCAAAT ACACTGCCCA GTAATTGTAG TCAATATAGC AGTTAACTAA 3720CCTTCACCAA TTTCCTAATA ACAATAGAAG GGGCCATACA CGCAGTACCA AAGATCACCT 3780ACCTCCGATC AATATCCGAA CCTCAGGCTA CATACATCAA GTCGCATTAA TCGATTCCGA 3840CCTCTGTTTA TCCCTGAAAA TAACTAAGAT CATGATCTAC GTTTGGTAAG TGGGACACCT 3900ACCTACACTG GGAGGTATTG AATAAAGGCA TCATTCATAT AGTCACAAGA TGCCAGGGCC 3960AATTCATGAT ATGGATAGCT ACTTCCAAAC ATAATTCAGA GGTATCATTC TGCTCTTCAG 4020ACAGTTCTTC TCGAAGATCA GTAGGAGCCA GTTTTGACCA TTAACTTGTA ATGTAATTGC 4080GATTGTAGTA GATCCGAGAT CCATTCACTT TCTAAGGGTT AATTGATTCA TTTTACTGAT 4140ACCTCACCCA CCATATT 4157(2)SEQ ID No：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：636个碱基对

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(v)片断类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID No：2Met Glu Ser Leu Leu Gln Gln Ser Arg Ala Met Cys Pro Phe Leu Lys1 5 10 15Arg Thr Ser Pro Ser Ser Leu Arg Thr Leu Ala Thr Ala Thr Arg Pro

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(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID No：3：

TTTATGATGG AGGCCCTTCT CCAGCAGTCT C 31(2)SEQ ID No：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID No：4：CTATGCATTT AAGCAGCAGC CGCGACTGG 29(2)SEQ ID No：5的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID No：5：TCATTTAAAT GATGGAGTCT CTTCTCC 27(2)SEQ ID No：6的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID No：6：

TCTTAATTAA TCAGCTCACA TGCGGG 26(2)SEQ ID No：7的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

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(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID No：7：GCGCGAATTC GTNGGNATNG GNATNAAYCA YGG 33(2)SEQ ID No：8的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID No：8：

GCGGATCCGG NGGRCARTTN GACAT 25(2)SEQ ID No：9的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

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(D)拓扑结构：线性

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GCGAATTCAC NCCNCARGTN TTYGAYAC 28(2)SEQ ID No：10的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

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(i)序列特征：

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(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性

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(i)序列特征：

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

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(i)序列特征：

(A)长度：649个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：无

(xi)序列描述：SEQ ID No：16：Met Glu Ala Leu Leu Gln Gln Sar Arg Ala Met Cys Pro Phe Leu Lys1 5 10 15Arg Ser Ser Pro Asn Thr Leu Arg Ser Leu Ala Thr Ala Thr Arg Pro

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610 615 620Ala Lys Ala Lys Pro Val Gly Ser Ile Ala Ala Asn Pro Ile Gly Ala625 630 635 640Ser Ile Pro Val Ala Ala Ala Ala Glx

645(2)SEQ ID No：17的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：548个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：无

(xi)序列描述：SEQ ID No：17：Met Gln Arg Ser Ile Phe Ala Arg Phe Gly Asn Ser Ser Ala Ala Val1 5 10 15Ser Thr Leu Asn Arg Leu Ser Thr Thr Ala Ala Pro His Ala Lys Asn

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(i)序列特征：

(A)长度：587个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：无

(xi)序列描述：SEQ ID No：18：Met Val Thr Ala Ala Met Leu Leu Gln Cys Cys Pro Val Leu Ala Arg1 5 10 15Gly Pro Thr Ser Leu Leu Gly Lys Val Val Lys Thr His Gln Phe Leu

20 25 30Phe Gly Ile Gly Arg Cys Pro Ile Leu Ala Thr Gln Gly Pro Asn Cys

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260 265 270Leu Pro Gly Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Ala Gly Asn His Ala Ser Met

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325 330 335Ile Cys Pro Leu Glu Glu Leu Cys Asp Val Ser His Gln Tyr Gly Ala

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355 360 365Gly Ala Gly Ile Gly Glu Arg Asp Gly Ile Met His Lys Ile Asp Ile

370 375 380Ile Ser Gly Thr Leu Gly Lys Ala Phe Gly Cys Val Gly Gly Tyr Ile385 390 395 400Ala Ser Thr Arg Asp Leu Val Asp Met Val Arg Ser Tyr Ala Ala Gly

405 410 415Phe Ile Phe Thr Thr Ser Leu Pro Pro Met Val Leu Ser Gly Ala Leu

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500 505 510Glu Glu Leu Leu Arg Leu Ala Pro Ser Pro His His Ser Pro Gln Met

515 520 525Met Glu Asp Phe Val Glu Lys Leu Leu Leu Ala Trp Thr Ala Val Gly

530 535 540Leu Pro Leu Gln Asp Val Ser Val Ala Ala Cys Asn Phe Cys Arg Arg545 550 555 560Pro Val His Phe Glu Leu Met Ser Glu Trp Glu Arg Ser Tyr Phe Gly

565 570 575Asn Met Gly Pro Gln Tyr Val Thr Thr Tyr Ala

580 585

Claims

1.一种基本纯的5-氨基乙酰丙酸合成酶，其特征在于：

(a)得自一种米曲霉菌株；或

(b)由在高严谨性条件下与SEQ ID No：1所示核酸序列可发生杂交的核酸序列所编码。

2.按照权利要求1的5-氨基乙酰丙酸合成酶，其得自米曲霉IFO4177。

3.按照权利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶，其具有SEQ IDNo：2所示氨基酸序列。

4.按照权利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶，其具有与SEQID No：2所示氨基酸序列之间不超过3个氨基酸不同的氨基酸序列。

5.按照权利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶，其具有与SEQID No：2所示氨基酸序列之间不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列。

6.按照权利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶，其具有与SEQID No：2所示氨基酸序列之间不超过1个氨基酸不同的氨基酸序列。

7.按照权利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶，其特征在于，它是由在高严谨性条件下，与SEQ ID No：1所示核酸序列可发生杂交的核酸序列所编码的。

8.一种分离的核酸片段，其由编码权利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶的核酸序列所组成。

9.按照权利要求8的核酸片段，其中所述核酸序列编码来自米曲霉IFO4177的5-氨基乙酰丙酸合成酶。

10.按照权利要求9的核酸片段，其中所述核酸序列示于SEQ IDNo：1中。

11.按照权利要求8的核酸片段，其特征在于，它在高严谨性条件与SEQ ID No：1所示核酸序列可发生杂交。

12.一种核酸构建体，其特征在于，它含有权利要求8-11任一项所述的核酸片段，该核酸片段有效地与能在合适表达宿主内指导5-氨基乙酰丙酸合成酶表达的调控区相连接。

13.一种重组载体，它包含权利要求12的核酸构建体。

14.按照权利要求13的载体，其中所述核酸序列有效地与一段启动子序列连接。

15.按照权利要求14所述的载体，它还含有转录终止信号。

16.按照权利要求14所述的载体，它还含有选择性标记。

17.一种重组宿主细胞，它含有权利要求12所述的核酸构建体。

18.按照权利要求17的宿主细胞，其中所述核酸构建体位于载体上。

19.按照权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞。

20.按照权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真菌细胞。

21.按照权利要求20的宿主细胞，其中所述真菌细胞是一种丝状真菌细胞。

22.按照权利要求21的宿主细胞，其中所述丝状真菌细胞是一种Acremonium属、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毁丝霉属(Myceliophthora)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium属或木霉属(Trichoderma)细胞。

23.按照权利要求20的宿主细胞，其中所述真菌细胞是一种酵母细胞。

24.按照权利要求23的宿主细胞，其中所述酵母细胞是酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的一个菌株。

25.按照权利要求17的宿主细胞，其中所述核酸构建体被整合至宿主细胞基因组中。

26.生产权利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶的方法，它包含以下步骤：

(a)培养一种米曲霉菌株以生产该5-氨基乙酰丙酸合成酶；以及

(b)回收该5-氨基乙酰丙酸合成酶。

27.生产权利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶的方法，它包含以下步骤：

(a)在能促进该5-氨基乙酰丙酸合成酶表达的条件下培养含有核酸构建体的宿主细胞，该核酸构建体含有编码该5-氨基乙酰丙酸合成酶的核酸序列；以及

(b)回收该5-氨基乙酰合成酶。