CN1101208A

CN1101208A - 新的细胞表面蛋白质

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Publication number: CN1101208A
Application number: CN94190012A
Authority: CN
Inventors: 川崎寿; 土屋诚; 三轮清志; 河原义雄
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1993-01-13
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 1995-04-05
Anticipated expiration: 2014-01-13
Also published as: CN1160081A; EP0644200B1; KR0164235B1; EP0644200A1; ATE165606T1; CN1124339C; CN1036850C; JP3541385B2; DE69409895D1; BR9403528A; WO1994015963A1; US5681717A; EP0644200A4; ES2115208T3; DE69409895T2; US5547864A; KR950700329A

Abstract

将含有编码来自乳酸发酵杆菌，具有下列两序列：

(1)Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu -Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Ala-Val-Gly- Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln- Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp -Thr和i：

(2)Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu -Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr-Asp-Ala-Asp -Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro- Ala-Tyr-Lys并且分子量约为63,000道尔顿的新细胞表面层蛋白质之基因的DNA片段导入棒状细菌中以得到转化体，或复制缺失该新细胞表面层蛋白质的突变菌株，用于以L-氨基酸发酵方法生产有用物质如L-氨基酸。

Description

本发明涉及以发酵工艺繁殖用于生产有用物质如L-氨基酸的微生物，以及使用上述微生物以发酵工艺生产有用物质如L-氨基酸的方法。具体地说，本发明涉及衍生于乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium Lactofermentum）的新的细胞表面层蛋白质，含有编码该蛋白质之基因的DNA片段及其应用。

棒状细菌[或称棒状杆菌或棒杆菌（Coryneform bacteria）]是大量产生L-氨基酸如L-谷氨酸或L-赖氨酸的微生物，已为改善L-氨基酸之生产能力的目的对其进行了繁殖。已进行了各种研究工作，并且迄今已报导了使用基因操作技术繁殖氨基酸生产菌的实例（Biotechnology letters，2（1980）525-530，Appln.Environ.Microbiol.144（1979）181-190，Abstruct of Lecture for the Meeting of the Society of Agricultural Chemistry of Japan（1981）8）。然而，所有这些工作都是针对着利用氨基酸微生物合成系统中的基因作为材料并通过提高基因表达来改善每个细胞之目的氨基酸的生产量，而不是针对在分析细胞表面结构的功能的基础上改善氨基酸生产能力。

顺便提到的是，用发酵工艺生产氨基酸时，通常要在纯化所生产的氨基酸的过程中进行离子交换层析，但是如果细菌细胞留在发酵培养基中，当发酵培养基通过离子交换树脂柱时就会阻塞树脂柱，因此必须有一个从发酵培养基中除去细菌细胞的步骤。此步骤通常是通过离心、过滤等方法进行的，如果能够安全而又简化地进行细胞分离则在工业上将是非常有用的。

已经知道，由于在培养后依据微生物的类型而出现细胞聚集等现象，致使微生物细胞在培养基中沉淀出来，并极其容易地从培养基中分离这些微生物细胞。然而，尚未报导过具有这种性质的用于氨基酸生产的棒状细菌，并且也还不知道提供有聚集或沉降性质之微生物细胞的方法。

WO 93/03158号的已公开文本中描述了一种与本发明的K蛋白质相似的新的细胞表面层蛋白质，但这种蛋白质显然不同于K蛋白质。此外，该说明书中公开了一种利用细胞表面层蛋白质之信号肽的蛋白质表达-分泌系统，但尚不知道此蛋白质有助于掺入棒状细菌营养素以及细菌细胞的聚集性质。

再者，虽然棒状细菌已作为L-氨基酸生产菌在工业上使用，但最近才发现它们是有高度分泌性的，并且已在利用杆菌的实践中尝试将其用于生产不同的蛋白质。上述国际公开WO 93/03158号文本中也说明了这种技术。

本发明将解决的主题是得到有助于掺入棒状细菌营养素的新的细胞表面层蛋白质及其基因，并得到经在棒状细菌细胞中扩增此基因而获得的转化体。本发明还有一个目的是使用具有产生有用物质如L-氨基酸之活性的棒状细菌作为转化体的宿主，并改善使用上述宿主细菌经发酵工艺生产有用物质如L-氨基酸的方法，以及得到缺失该新的细胞表面层蛋白质和具有聚集性质的棒状细菌，以便简化氨基酸生产工艺。

作为一个重要的研究成果，本发明人已成功地获得了一种有助于掺入细菌营养素的新的细胞表面层蛋白质和其基因，并已完成了本发明。

具体地说，本发明提供了衍生于乳糖发酵短杆菌、分子中具有以下两序列且分子量约为63，000道尔顿的新的细胞表面层蛋白质：

（1）Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Ala-Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr，和

（2）Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr-Asp-Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro-Ala-Tyr-Lys，

含有编码该蛋白质之基因的DNA片段，将该DNA片段与能够在棒状细菌细胞中自动复制之载体连接而得到的重组DNA，在棒状细菌的细胞中引入并扩增该DNA片段而得到的转化体以及以发酵工艺生产有用物质如L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养具有产生有用物质如L-氨基酸之活性的转化体，在培养基中生成并积聚有用物质，并从培养基中收集该有用物质。

本发明提供了具有细胞聚集性质并缺失上述细胞表面层蛋白质或与上述存在于棒状细菌细胞表面上的蛋白质基本相同之蛋白质的棒状细菌。

本发明还提供了具有细胞聚集性质并缺失细胞表面层蛋白质的棒状细菌，其中编码所说的细胞表面层蛋白质的基因或编码基本上与上述蛋白质相同并存在于棒状细菌细胞表面中之蛋白质的基因，由于含有至少一部分编码细胞表面层蛋白质之基因的DNA片段与染色体上与该DNA片段相同或同源的DNA序列间发生同源重组而被破坏。

本发明进一步提供了生产有用物质的工艺，其中包括：

培养具有产生有用物质如L-氨基酸之活性的棒状细菌;

在培养基中生成并积聚有用物质;

从培养基中收集有用物质，

其中棒状细菌缺失上述新的细胞表面层蛋白质并具有细胞聚集性质，该工艺还包括在完成培养后静置培养基，从而沉淀出棒状细菌细胞。

如下文所述，本发明中所指的棒状细菌是一族杆状、需氧、革兰氏阳性、不抗酸且不产孢子的微生物（如Bargeys Manual of Determinative Bacteriology，8th edition，P 599（1974）中所定义的）。属于这种棒状细菌的特定微生物在下文中也可简单地称为“棒状细菌”。另外，棒状细菌缺失本发明中所述的细胞表面层蛋白质，并且编码细胞表面层蛋白质的基因被破坏的棒状细菌有时可统称为“K蛋白质缺失菌株”。

1.新的细胞表面层蛋白质，它的基因，其转化体以及生产L-氨基酸的方法

按下述方法制得本发明新的细胞表面层蛋白质。例如使用超声波发生器（OHTAKE 5202PZT）破坏乳糖发酵短杆菌例如菌株 2256（ATCC 13869）的细胞，然后在比3000xg，4℃，5分钟，较好12000xg，4℃，1分钟更强的条件下离心细胞溶菌产物以回收上层清液。再于比100，000xg，4℃，20分钟，较好100，000xg，4℃，30分钟更强的条件下离心上层清液，以沉淀并回收细胞表面层部分。大量存在于该部分中、分子量约 63，000的蛋白质便是根据本发明的新细胞表面蛋白质，即K蛋白质。

按下述方法纯化K蛋白质。所制备的细胞表面层部分含有胞浆膜和细胞壁。然后使用表面活性剂溶解细胞浆膜以分离之。因为增溶的强度依据表面活性剂的种类和浓度、增溶处理的时间和温度以及外加甘油和/或NaCl的浓度等因素而有所不同，所以只有在找到纯化的最佳条件时才可完成本发明。已根据本发明第一次确定了所需的最佳条件。即，将30μg细胞表面层部分加到1ml含有1.25%（w/v）SDS的缓冲液（50mM磷酸钾，pH8.0，0.1mM二硫菌糖醇）中，于4℃至90℃，较好于37℃保持30分钟以上，较好1小时;然后于比145，000xg，20分钟，较好145，000xg，30分钟更强的条件下离心，并回收沉淀物。将沉淀物悬浮在含有0.1%SDS的50mM磷酸钾（pH8.0）中，以使悬浮液含有0.01-10μg蛋白质/μl，较好0.2μg蛋白质/μl，然后煮沸约3分钟使之溶解。

根据在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Gel Electrophoresis of Proteins，IRL Press（1981）B.D.Hammes，et al.）中的迁移率估测K蛋白质的分子量。估计K蛋白质的分子量约为63，000道尔顿。

按下述方法确定K蛋白质的氨基酸序列。将纯化的K蛋白质悬浮在含有0.1%SDS的50mM Tris-HCl（pH7.3）中，以使悬浮液含有10μg-2mg蛋白质/ml，较好200μg蛋白质/ml，并将悬浮液煮沸约5分钟以溶解K蛋白质。溶液冷却后，向溶液内加入蛋白质链内切酶Lys-C（Boeringer Manhaim Co.制造），从而使可溶于表面活性剂中之蛋白质部分和Lys-C的比例约为10∶1-200∶1，较好为50∶1（w/w），并于37℃保温30分钟以上，较好3小时。

以反相层析分级分离用Lys-C部分消化的K蛋白质。可适当选择用于层析的市售层析柱，例如可使用Senshu Pac VP-318-1251 4.6Φ×250mm柱。使用梯度溶液如CH₃CN-0.1%TFA进行洗脱。流速可在1ml/分钟。使用如此得到的各层析部分中有较高肽含量的部分测定氨基酸序列。按已知方法（P.Edman，Arch.Biochem.22，475（1949）），例如使用Applied Biosystems Co.制造的470-A型气相序列仪按其操作手册所述进行序列测定。

K蛋白质分子中具有下列两个序列：

（1）Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Ala-Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr（序列表 SEQ ID NO∶1）和

（2）Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr-Asp-Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro-Ala-Tyr-Lys（序列表 SEQ ID NO∶2）.

按下述方法分离K蛋白质。首先从乳糖发酵短杆菌例如菌株2256（ATCC 13869）中，例如使用H.Saito和K.Miura在Biochem.Biophys.Acta 72，610（1963）中描述的方法提取染色体DNA，并用适当的限制酶消化之。如果通过调节反应条件例如反应时间来控制染色体DNA的消化程度，则可以使用多种不同的限制酶。

连接该DNA片段和能在埃希氏杆菌属（Escherichia）微生物的细胞中复制的载体DNA以形成重组DNA，然后用该重组DNA转化埃希氏杆菌属细菌，例如大肠杆菌菌株JM 109，以制备基因组DNA库。可使用具有从已知氨基酸序列推断之核苷酸序列的合成DNA作为探针，以集落杂交法从DNA库中分离K蛋白质基因。

具体地说，用限制酶例如Sau 3AI在高于30℃，较好37℃的温度下，以1-10单位/ml的酶浓度将乳糖发酵短杆菌菌株2256（ATCC 13869）的染色体DNA部分消化不同时间（1分钟至2小时），以得到不同大小的染色体DNA片段的混合物。使用能造成与用于消化染色体的限制酶Sau 3AI有相同末端碱基序列的限制酶例如BamHI，在高于30℃的温度下并以1-100单位/ml的酶浓度将能够在埃希氏杆菌属细菌细胞中复制的载体DNA完全切割1小时以上，较好1-3小时，以得到被切割并成线性化的DNA。然后将含有如上制得的来自乳糖发酵短杆菌菌株2256（ATCC 13869）之K蛋白质基因的DNA片段混合物与线性化的载体DNA混合，并于4至16℃的温度，以1-100单位的酶浓度，使用DNA连接酶较好是T4 DNA连接酶进行1小时以上，较好6至24小时的连接反应，以得到重组DNA。

作为可用于本发明的载体DNA，优选质粒载体DNA，例如可以是pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399和RSF1010。另外也可使用噬菌体DNA载体。为有效地表达K蛋白质基因，也可使用在微生物中发挥功能的启动子如lac、trp、PL。本文所指的重组DNA可包括以使用转座子（Berg.D.E.and Berg.C.M.Bio/Technol.，1，417（1983））、Mu噬菌体（日本专利公开90-109985）方法，或以同源重组技术（Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.（1972））将K蛋白质基因整合到染色体中所得到的重组DNA。

用上述重组DNA转化例如大肠杆菌K-12的JM109菌株，制备基因库。制备基因库的方法详见Molecular Cloning，第2版（Cold Spring Harbor Press（1989）Maniatis，et al.）。可用D.M.Morrison的方法（Methods in Enzymology 68，326，1979）或用氯化钙处理受体细胞以增加DNA通透性的方法（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159（1970））进行转化。

接着，用集落杂交方法从基因库中分离含有包括K蛋白质基因之DNA片段的重组DNA。可按照Molecular Cloning，第2版（Cold Spring Harbor Press（1989）Maniatis，et al.）中所述的方法进行集落杂交。

可使用具有从纯化之K蛋白质的氨基酸序列推断之碱基序列的合成DNA作为用于集落杂交的DNA探针。例如，可优先提到的是使用Applied Biosystems Co.制造的DNA合成仪合成的具有5′-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG-3′序列（SEQ ID No∶3）的30mer寡核苷酸。测定序列时，因存在相当于一种氨基酸残基的多个密码子而造成很大障碍。鉴于这一情况，可选择其中相当于各氨基酸之密码子的简并性程度低的区域，或者查找短杆菌属的惯用密码子来确定序列。可使用Applied Biosystems Co.制造的380B型DNA合成仪，并以phosphoamidide方法（参见Tetrahedron Letters，22，1859（1981））按常规合成寡核苷酸。

另外，也可例如借助PCR（聚合酶链反应：White T.J.et al∶Trands Genet，5，185（1989））使用H.Saito和Miura（Biochem.Biophys.Acta.，72，619（1963））的方法，从所得染色体DNA中扩增K蛋白质基因而制得K蛋白质基因。用于PCR的DNA引物互补于包括部分或完整K蛋白质基因之双股DNA的两个3′末端序列。在只扩增K蛋白质基因之部分区域的情况下，须使用上述DNA片段作为探针从基因库中筛选包括完整K蛋白质基因的DNA片段。在扩增完整基因的情况下，可用琼脂凝胶电泳法分离PCR反应混合物，然后从琼脂糖凝胶上切掉含所需DNA片段的带以回收包括K蛋白质基因的DNA片段。

使用具有从纯化的K蛋白质氨基酸序列推测之碱基序列的合成DNA作为DNA引物。测定序列的过程中，因存在相应于一种氨基酸残基的多重密码子而产生很大障碍。鉴于上述情况，可选择其中相当于各氨基酸之密码子的简并性程度低的区域，或者找出短杆菌属细菌的适用密码来确定序列。可使用Applied Biosystems Co.制造的380B型DNA合成仪并以phosphoamidide方法常规合成DNA。可使用Takara Shuzo Co.制造的PJ2000型DNA热循环器，使用Taq DNA聚合酶并按照产品提供者指定的方法进行PCR反应。

将经用PCR反应扩增的含完整K蛋白质基因或其部分区域的DNA片段连接到能够在埃希氏杆菌属细菌细胞中复制的载体DNA上，以形成重组DNA。然后将此重组DNA导入埃希氏杆菌属细菌的细胞内。这里所用的载体DNA和转化方法与以前描述者相同。在只扩增K蛋白质基因之部分区域的情况下，可用上述DNA片段作为探针从基因库中分离包含整个K蛋白质基因的DNA片段。可使用以前描述过的集落杂交法作为分离方法。

不管分离的含K蛋白质基因的DNA片段是否真的含有K蛋白质基因，都要使用用于集落杂交或PCR的合成DNA作为引物对该DNA片段进行核苷酸序列测定，并要证明测知的核苷酸序列是否编码上述氨基酸序列。可使用二脱氧方法测定核苷酸序列（参见Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press（1989），Maniatis et al.）。

不管K蛋白质是否为有助于掺入棒状细菌营养素的新的细胞表面层蛋白质，都要通过制备K蛋白质缺失菌株并检测该缺失菌株掺入铵离子的活性来证实之。结果显示，与K蛋白质非缺失型菌株的铵离子掺入活性相比，其所得数值显著降低。

接下来，将对通过连接含有K蛋白质基因的DNA片段与能够在棒状细菌细胞中自动复制的载体所得到的重组DNA，通过在细胞内引入并扩增该DNA片段所得到的棒状细菌转化体以及通过发酵工艺生产L-氨基酸的方法作出解释，其中所说的发酵工艺包括培养具有L-氨基酸生产能力的上述转化体，在培养基中生成并积聚L-氨基酸以及从培养基中收集L-氨基酸。

本发明的棒状细菌例如属于短杆菌属（Bervibacterium）或棒状杆菌属（Corynebacterium）的微生物是一族在Bargeys Manual of Determinative Bacteriology（8th edition，p599（1974））中限定的、呈杆状、需氧、革兰氏阳性、不抗酸且不产孢子的微生物。短杆菌属或棒状杆菌属微生物中，下述属于短杆菌属或棒状杆菌属的L-谷氨酸生产菌均可用于本发明中。

作为属于短杆菌属或棒状杆菌属之谷氨酸生产菌的野生型菌株，可得到的例子有：

Brevibacterium dibaricatum ATCC 14020

Brevibacterium saccharoriticum ATCC 14066

Brevibacterium immariofilm ATCC 14068

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869

Brevibacterium roseum ATCC 13825

Brevibacterium flabum ATCC 13826

Brevibacterium thiogenetallis ATCC 19240

Brevibacterium acetoacidfilum ATCC 13870

Brevibacterium acetoglutamicum ATCC 15806

Brevibacterium calnae ATCC 15991

Corymebacterium glutamicum ATCC 13032,13060

Corymebacterium lilyum ATCC 15990

Corymebacterium meracecola ATCC 17965

Microbacterium ammoniafilum ATCC 15354

任何能够在短杆菌属或棒状杆菌属的细菌细胞内复制的载体DNA均可用于本发明。可举出的具体实例如下：

(1)pAM 330 参见日本专利公开83-67699

(2)pHM 1519 参见日本专利公开83-77895

(3)pAJ 655 参见日本专利公开83-192900

(4)pAJ 611 同上

(5)pAJ 1844 同上

(6)pCG1 参见日本专利公开82-134500

(7)pCG2 参见日本专利公开83-35197

(8)pCH4 参见日本专利公开82-183799

(9)pCG11 同上

使用在独特位点切割载体DNA的限制酶切割载体DNA，或使用在其多个识别位点上切割DNA的限制酶部分切割载体DNA。

用切割编码K蛋白质基因之DNA片段的限制酶切割载体DNA并与所说的DNA片段相连接。如果用形成与编码K蛋白质基因之DNA片段有不同末端的限制酶切割载体DNA，就将具有互补于线性化载体序列末端之碱基序列的寡核苷酸接头（linker）连接到所说DNA片段的两末端，然后再将此末部接有上述接头的DNA片段与载体DNA相连接。

可按照已报道的适用于大肠杆菌K-12（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159（1970））的方法用氯化钙处理受体细胞以增加DNA通透性，或者用已报导的涉及枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）的将DNA在细胞对数生长期掺入细胞（所谓感受态细胞）内的方法（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young.F.E.，Gene，1，153（1977）），将连接有载体DNA和编码K蛋白质基因之DNA片段的重组DNA导入属于短杆菌属或棒状杆菌属受体细胞内。另外，亦可按照已知的涉及枯草芽胞杆菌、放射菌（Actinomycetes）和酵母的，将细胞改变成能够容易地掺入重组DNA之原生质体或原生质球的方法将重组DNA导入细菌细胞内（参见Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.，Genet.，168，111（1979）;Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398（1978）;Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl，Acad.Sci.，USA，75，1929（1978））。

在原生质体方法中，可以使用前述适用于枯草芽胞杆菌的方法达到足够高的转化频率，但其中也可利用如日本专利公开82-183799号中公开的于聚乙二醇、聚乙烯醇和二价金属离子存在下将DNA掺入短杆菌或棒状杆菌的原生质体中。采用促进DNA掺入的方法，例如加入羧甲基纤维素、萄聚糖、菲科尔（ficoll）或Bulronic F68（Selba Co.制造）代替聚乙二醇或聚乙烯醇也可获得相似的效果。

另外，也可用电脉冲方法（也称为电穿孔法）（Sugimoto，et al.，日本专利公开90-207791号）将重组DNA导入属于短杆菌属或棒状杆菌属的受体细菌中。

培养按前述方法制得的携带含有编码K蛋白质之DNA片段的重组DNA的L-氨基酸生产转化体，并在培养基中产生和积聚所需的L-氨基酸，然后收集该产物。

用于L-氨基酸生产的培养基是含有碳源、氮源、无机离子及必要时的其他有机成分的常用培养基。

作为碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解物等糖，甘油和山梨糖醇等醇，以及富马酸、柠檬酸和琥珀酸等有机酸。

作为氮源，可以使用硫酸铵、氯化铵和磷酸铵等无机铵盐，大豆水解物、气态氨和氢氧化铵等有机氮。

作为有机微量营养素，可在培养基中加入适当量维生素B₁和酵母提取物等必需物质。另外，必要时可加入少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、镁离子等。

培养最好在需氧条件下进行16至72小时，同时培养期间将培养温度控制在30-45℃，pH控制在5-7。可使用无机或有机酸性或碱性物质以及气态氨调整pH。可结合使用常规离子交换树脂法，沉淀法和其他已知方法从发酵液中收集L-氨基酸。

顺便提到的是，棒状细菌是大量产生L-氨基酸的微生物并已逐渐应用于发酵生产L-氨基酸。此外，棒状细菌的高分泌性质也已被利用来生产其他各种物质。

因为考虑到K蛋白质存在于细胞表面层中并且它有助于在其胞浆中掺入营养素，如果在细胞中引入并复制含K蛋白质基因的DNA片段所得到的棒状细菌转化体具有有用物质生产能力，那么也就认为可以对以发酵工艺生产有用物质的方法作出改进，所说的工艺方法包括在培养基中培养转化体，在培养基中生成和积聚有用物质以及从培养基中收集该有用物质。

上述生产有用物质的方法与本文主要部分中所描述的生产氨基酸的方法完全相同。

这里提到的有用物质包括作为调味器原料的核酸。例如，产生核酸的棒状杆菌包括日本专利公开82-22558号中公开的Corynebacterium equi AJ 11347。

另一方面，有用物质是指外来蛋白质。也就是可以提到的人干扰素、人白介素或人激素、酶或抗体等生理活性物质。已经知道了使用埃希氏杆菌或芽胞杆菌属微生物生产外来蛋白质的方法，但相似技术也已发展到使用棒状细菌。所用技术基本上包括将能够在棒状细菌细胞中自动复制的载体与能在棒状细菌细胞中发挥功能启动子以及编码外来蛋白质的DNA片段相连接以制备重组DNA，将重组DNA引入棒状细菌中并通过重组DNA上编码蛋白质之DNA的表达以产生蛋白质。例如日本专利公开87-151184或日本专利公开87-244382号中描述了这一技术。

（2）K蛋白质缺失菌株和利用它们生产L-氨基酸的方法

如上所述，业已证实根据本发明第一次发现K蛋白质有助于掺入棒状细菌的营养素，并且本发明进一步公开了棒状关细菌也对细菌细胞的聚集性质有所贡献，K蛋白质缺失性棒状细菌表现有聚集性质。

对例如乳糖发酵短杆菌的K蛋白质基因造成一种实质上不产生K蛋白质的突变而制得K蛋白质缺失菌株。另外，也可以从自然界中筛选具有实质上不产生K蛋白质之突变的自发突变菌株。

另外，也可使至少含有一部分编码K蛋白质之基因的DNA片段与染色体上K蛋白质基因之间发生同源重组，借以破坏K蛋白质基因而得到K蛋白质缺失菌株。

再者，预期甚至除乳糖发酵短杆菌以外的棒状细菌也具有与细胞表示层中K蛋白质完全相同或基本上相同的蛋白质（下文称之为“K蛋白质样蛋白质”）。例如，已公开的WO 93/03158号说明书中描述了一种与本发明的K蛋白质相似但完全可以区别开的细胞表面层蛋白质。

可以期望这样的K蛋白质样蛋白质也有助于营养素的掺入或使细菌细胞具有聚集性质，而且缺失此K蛋白质样蛋白质的棒状细菌也具有聚集性质。

可按照得到K蛋白质缺失菌株的同样方法，对K蛋白质样蛋白质基因造成实质上不产生K蛋白质样蛋白质的突变，以得到缺失K蛋白质样蛋白质的棒状细菌。另外也可从自然界筛选具有实质上不产生K蛋白质样蛋白质之突变的自发突变菌株。再者，还可使至少含有一部分K蛋白质基因DNA片段与染色体上与此DNA片段同源的编码K蛋白质样蛋白质的基因发生同源重组，借以破坏编码K蛋白质样蛋白质的基因而得到缺失K蛋白质样蛋白质的棒状细菌。

以下描述得到K蛋白质缺失菌株的方法。下文描述中，如果用K蛋白质样蛋白质取代K蛋白质，则也可按同样方法得到缺失K蛋白质样蛋白质的菌株。

可用对微生物造成人工突变的常规方法如紫外光照射或用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍等诱变剂处理，对K蛋白质基因造成实质上不产生K蛋白质的突变。

作为从受到诱变的棒状细菌中选择K蛋白质缺失菌株的方法，可提到的例如有用抗K蛋白质抗体的方法如Western吸收方法。更具体地说，在薄膜如铺敷在琼脂培养皿上的尼龙薄膜上形成已突变之棒状细菌的菌落，以在薄膜上固定细胞蛋白质。在这种情况下，在分立的琼脂培养皿上制得复制板，这样即可用膜上的菌落制得1∶1对应物。然后，将薄膜相继地分别浸入含有抗K蛋白质抗体、抗被免疫动物（原用于制备抗K蛋白质抗体）之免疫球蛋白部分的酶标记第二抗体、以及通过由标记酶引起的酶促反应而显色之染料的溶液中，经保温后即在K蛋白质非缺失菌株的细胞蛋白质被固定的位置上显出颜色。从而可通过鉴定不引起染料显色的菌落并从相应于该菌落的复制板中分离菌落来选择K蛋白质缺失菌。较好的是对如此选择的K蛋白质缺失菌株之细胞表面层部分中的蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，以进一步证实实质上没有表达K蛋白质。

按照免疫和采血的常规制备方法，使用如上文（1）所示的从乳糖发酵短杆菌细胞表面层部分制备的蛋白质免疫动物如小鼠，制得抗K蛋白质抗体。也可以将用K蛋白质免疫之动物的脾细胞与具有持续生长活性的培养细胞如小鼠骨髓瘤细胞相融合，以制备杂交瘤细胞并培养所得杂交瘤细胞，从而制备并使用如此得到的抗K蛋白质单克隆抗体。

可使酶如β半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶与抗用来制备抗K蛋白质抗体之被免疫动物的免疫球蛋白部分中的抗免疫球蛋白抗体之间形成共价键，以得到酶标记的第二抗体。抗各种动物之免疫球蛋白的酶标记抗体是常用的并可从市场上购得。

下面说明从被诱变的棒状细菌中选择K蛋白质缺失菌株的另一种方法。按上文（1）中所述的方法制备各单一菌落之细胞的细胞表面层部分，并对所得到的细胞表面层部分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。检测出的在分子量约63，000处附近没有K蛋白质带的菌株即是K蛋白质缺失菌株。虽然该方法极费时间，但因为它能可靠地选择K蛋白质缺失菌株，所以可以将其用于次级筛选步骤。

使用如上所述的同样方法，可以从自然界选择出具有实质上不产生K蛋白质之突变的突变菌株。

接下来，说明用基因分割或破坏手段得到K蛋白质缺失菌株或K蛋白质样蛋白质缺失菌株的方法。将包含一部分K蛋白质基因的DNA片段引入棒状细菌的细胞中，然后使含有一部分K蛋白质基因的DNA片段和染色体上与该DNA片段相同或同源的DNA序列发生同源重组，从而能够破坏染色体DNA上的K蛋白质基因或K蛋白质样蛋白质基因，以使之缺失K蛋白质或K蛋白质样蛋白质。基因分割的机制图解显示于图1中。

具体地说，使含有部分K蛋白质基因的DNA片段与载体质粒DNA连接，以制备进行基因分割的质粒。将用于基因分割的质粒导入棒状细菌如乳糖发酵短杆菌中得到转化体。为进行导入，可以使用已报导的适用于埃希氏杆菌K-12的用氯化钙处理受体细胞而增加DNA通透性的方法（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159（1970））、已报导的用于枯草芽胞杆菌的使DNA在能够掺入DNA的细胞生长期（所谓的感受态细胞）内导入的方法（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and young，F.E.，Gene，1，153（1977））、已知用于枯草芽胞杆菌、放线菌和酵母的将细胞转变成能够容易地掺入DNA并将重组质粒导入DNA受体中之原生质体或原生质球的方法（Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.，Genet.，168，111（1979），Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398（1978）;Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929（1978）），或如上文（1）中所述的电脉冲方法（Sugimoto，et al.，日本专利公开90-207791）。

就用于制备进行基因分割之质粒的载体质粒来说，较好使用具有温度敏感性复制原点的载体，例如pHSC4（Sugimoto，et al.，法国专利公开No.2667875/1992号），并在复制抑制温度下培养所得转化体。如此可以防止质粒在细胞内染色体外自动复制，并使其中质粒掺入到染色体DNA内的转化体能够优先生长。另外，为了有利于选择转化体，期望使用这样一种具有标志基因例如药物抗性基因的载体质粒。

当在含有相应于标志基因之药物的培养基中，较好在复制抑制温度下培养其中已导入了基因分割所需质粒的棒状细菌时，只有其中该质粒已整合到染色体内的转化体才能生长。在这样的转化体细胞中，用于基因破坏的质粒通过含有该质粒中所具有的基因破坏K蛋白质基因之一部分的DNA片段与染色体上K蛋白质基因或K蛋白质样蛋白质基因间的同源重组，被整合到染色体上的K蛋白质基因中，结果即可能分割染色体的K蛋白质基因。可对转化体的细胞表面层部分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，以进一步证实如此得到的转化体是否缺失K蛋白质。另外，也可根据转化体细胞的聚集性质来证实之。

作为为了得到K蛋白质缺失菌株而欲被诱变的或者将用K蛋白质基因分割的棒状细菌，可以是如上文（1）中指出的短杆菌属或棒状杆菌属微生物。

接下来，描述生产L-氨基酸的方法，该方法包括培养具有产生L-氨基酸的活性的棒状细菌，在培养基中生成并积聚L-氨基酸并从培养基中收集L-氨基酸，其中棒状细菌缺乏K蛋白质或K蛋白质样蛋白质，并且进一步包括在完成培养后静置培养基并因此沉淀棒状细菌细胞的步骤。

培养具有产生L-氨基酸的活性并缺乏K蛋白质或K蛋白质样蛋白质的棒状细菌，并在培养基中生成和积聚所需的L-氨基酸。用于生产L-氨基酸的培养基是含有碳源、氨源、无机离子，必要时还含有其他有机成分的常用培养基。

作为碳源，可以使用例如甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜，葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物等糖，甘油和山梨糖醇等醇，以及富马酸、柠檬酸和琥珀酸等有机酸。

作为氮源，可使用例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐，大豆水解物、气态氨和氢氧化氨等有机氮。

作为有机微量营养素源，可在培养基中加入适当量维生素B₁或酵母提取物等必需物质。此外，必要时可在培养基中加入小量磷酸钾、硫酸镁、铁离子和锰离子。

培养较好在需氧条件下进行16至72小时，同时在培养期间将培养温度控制在30至45℃，pH值控制在5至7。可使用有机或无机酸性或碱性物质并进一步使用气态氨控制pH。

因为培养基组成和培养条件可对细菌细胞的聚集性质产生影响，所以可适当地选用适于所得K蛋白质缺失菌株的条件。

接着，在完成培养过程后，将培养基静置并使聚集的细菌细胞沿降下来，以将其与培养物上层清液分离开。可通过回收上层清液使沉降的细菌细胞不会侵入其中而将培养物上层清液与细菌细胞分离开。另外，可借助常规离心分离法或过滤法完成细胞分离过程，并且因细菌细胞发生聚集而有利于分离过程的完成。

在分离出细菌细胞后，可结合使用常规离子交换层析法、沉淀法和其他已知方法从发酵培养基中收集L-氨基酸。通常在将发酵溶液的pH值调到4左右后用阳离子交换层析法纯化碱性氨基酸如L-赖氨酸。因为本发明的K蛋白质缺失菌株在pH值约为4时可进一步增加聚集性质，所以如果在调整pH后实施细胞沉降步骤，即可在较短时间内完成沉降，从而能够更有效地分离细菌细胞。再者，培养物上层清液与细菌细胞分离开后原料通过阴离子交换树脂柱。

本发明显示K蛋白质对细胞的聚集性质有贡献，并且这一概念也可应用于除生产L-氨基酸以外的发酵工业中下游阶段的细胞清除步骤，应用于细胞循环型生物反应器，以及进一步应用于改善活性菌泥的沉降作用，而且可适用于生产L-氨基酸以外的发酵工业。

例如，当具有产生有用物质活性的棒状细菌缺失K蛋白质或K蛋白质样蛋白质并具有细胞聚集性质时，即可改善以发酵工艺生产有用物质的方法，该方法包括在培养基中培养上述细菌，在培养基中生成并积聚有用物质并从培养物中收集该有用物质。这是因为在这些生产工艺中细胞分离操作也是必不可少的步骤。

即是说，在以发酵工艺生产有用物质的方法中，也可以与如上所述的氨基酸生产工艺的同样方式有助于细胞分离操作，所说的方法包括培养具有产生有用物质之活性的棒状细菌、在培养基中生成并积聚有用物质以及从培养基中收集有用物质，其中棒状细菌缺失K蛋白质或K蛋白质样蛋白质并具有细胞聚集性质，该方法还进一步包括在完成培养后静置培养基的步骤，从而沉降出棒状细菌细胞。

这里所指的有用物质包括作为调味品之原料的核酸。产生核酸的棒状细菌包括例如日本专利公开82-22558号中公开的Corynebacterium equi AJ 11347。

另外，有用物质也包括外来蛋白质。即，可提到的有人干扰素或人白介素（interleukin）等生理活性物质、酶或抗体。使用微生物生产外来蛋白质的方法已知主要涉及属于埃希氏杆菌属或芽胞杆菌属的细菌，并且也已发展了涉及使用棒状细菌的同样技术。这些技术基本上包括将能够在棒状细菌细胞内自动复制的载体与能够在棒状细菌细胞内发挥功能的启动子和编码外来蛋白质的DNA相连接以形成重组DNA，将重组DNA导入棒状细菌中并通过在重组DNA上表达编码蛋白质的DNA来生产该蛋白质。该技术例如已公开在日本专利公开87-151184号中。

附图简要说明

图1：借助同源重组进行基因分割的示意图。

图2：显示K蛋白质对铵离子掺入的贡献。

○…K蛋白质非缺失菌株（AEC^r2256）

●…K蛋白质非缺失菌株（AEC^r2256），加CCCP

□…K蛋白质缺失菌株（AJ 12760）

■…K蛋白质缺失菌株（AJ 12760）加CCCP

图3：图解显示K蛋白质缺失菌株和K蛋白质非缺失菌株的沉降度（碳源：蔗糖、完成培养后将培养基调到pH 4.0）。

×…2256菌株（ATCC 13869）

+…YSR菌株

◇…AEC^r2256菌株

△…AJ 12760

▲…AJ 12956

上列符号也用于图4-6。

图4：图解显示K蛋白质缺失菌株和K蛋白质非缺失菌株的沉降度（碳源：蔗糖，完成培养后将培养基调到pH4.0）。

图5：图解显示K蛋白质缺失菌株和K蛋白质非缺失菌株的沉降度（碳源：葡萄糖，完成培养后不调整培养基的pH）。

图6：图解显示K蛋白质缺失菌株和K蛋白质非缺失菌株的沉降度（碳源：蔗糖，完成培养后不调整培养基的pH）。

CCCP：羰基氰化物m-氯苯基肼。

现借助实施例更具体地描述本发明。

实施例1：新的细胞表面层蛋白质K蛋白质

（1）新的细胞表面层蛋白质的发现

在CM2G培养基（酵母提取物10g，bacto tryptone 10g，葡萄糖5g，NaCl5g，加水至1升）中将乳糖发酵短杆菌ATCC13869于30℃振荡培养过夜，并从1ml培养液中收集细胞。用缓冲溶液A（50mm磷酸钾，pH8.0，10mM硫酸镁）洗净后，将细胞悬浮在1ml缓冲液A中，冷冻和融化，并保持于0℃时用超声波破碎机（OHTAKE 5202 PZT）破碎细胞。然后以12，000xg于4℃将溶胞产物离心1分钟并回收上层清液。再次以100，000xg于4℃下将所得上层清液离心30分钟并回收作为细胞表面层部分的沉淀。这些部分中对相当于5×10⁹细胞的部分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果，在分子约63，000处附近具有以大量存在的蛋白带，并将此蛋白质命名为K蛋白质。

本发明期望该细胞表面层蛋白质具有促使其从细菌细胞外部摄入营养素的功能，并进行了下述实验。

（2）K蛋白质的纯化

首先，按照以前（1）中所述的方法制备细胞表面层部分。细胞表面层部分含有胞浆膜和细胞壁。然而，试图使用表面活性剂增加胞浆膜可溶性以分离之。作为对表面活性剂的种类和浓度、增溶化的时间与温度、以及加入甘油的效果和加入NaCl的效果进行详细研究的结果，表明可用下述方法纯化K蛋白质。将3.0μg细胞表面层部分的蛋白质（用Bio Rad Co.制造的BC蛋白质检测药盒进行定量）悬浮在1ml含1.25%（w/v）SDS的缓冲液（50mM磷酸钾，pH 8，0.1mM二硫苏糖醇）中并将悬浮液于37℃保持1小时。然后将悬浮液以145，000×g离心30分钟并回收沉淀物。将沉淀物悬浮在含有0.1%SDS的50mM磷酸钾，pH8.0中以使其中含有0.2μg蛋白质/μl，并煮沸3分钟。对表面活性剂不溶性部分的15μg蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，进一步证实其为具有分子量63，000的均一蛋白质。

（3）K蛋白质的性质

（3-1）分子量

根据在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率估计K蛋白质的分子量约为63，000。

（3-2）部分氨基酸序列的确定

将按上文（2）中所述方法纯化的K蛋白质悬浮在50mMTris-HCl，pH7.3，0.1%SDS中以使蛋白质浓度为200μg/ml，并煮沸5分钟以溶解之。冷却后，向溶液内加入蛋白内切酶Lys-C，使作为表面活性剂不溶性部分的蛋白质与Lys-C的比例为50∶1（w/w），并于37℃保温3小时。

为使用Lys-C对K蛋白质溶液进行限制性消化，用反相层析法分级分离相当于500 pmole K蛋白质的部分。所使用的层析柱为Senshu Pac VP-318-1251 4.6Φ×250mm。使用CH₃CN梯度（24%CH₃CN，0.1%TFA-66%CH₃CN，0.1%TFA）以1ml/分钟的流速进行洗脱。从各洗脱液部分中取两个高肽含量的部分（即用55.7-57.0%CH₃CN和59.3-60.5%CH₃CN洗脱的部分），使用Applied Biosystems Co.制造的气相序列仪470-A测定氨基酸序列。按照Applied Biosystems Co.的使用说明书进行氨基酸序列测定。结果发现K蛋白质分子中具有下示两个序列：

（1）Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Ala-Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr（SEQ ID NO∶1），和

（2）Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr-Asp-Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro-Ala-Tyr-Lys（SEQ ID NO∶2）.

实施例2：K蛋白质基因的分离

（1）基因库的制备

按Saito和Miura的方法（Biochem.Biophys.Acta.，8278（1963）619-629）以乳糖发酵短杆菌2256（ATCC 13869）制备染色体DNA。在50μg染色体DNA中加入2单位Sau 3AI并于37℃保持40分钟进行部分消化。在蔗糖密度梯度（10%-40%）情况下以120，000×g将反应混合物离心26小时以分级分离DNA片段。

回收约1，500至6，000bps的（1.5ml体积），并于4℃将其对TE缓冲液（100mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0）透析。使用Sanko Junyaku Co.制造的Seamless Cellulose Tubing Size 8/32作为透析管。对2升缓冲液透析4小时，交换缓冲液后再进行2小时。

透析后，按照Maniatis等人的方法（Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press（1989）Maniatis，et al.）用2-丁醇提取，1，500-6，000bp的染色体DNA，然后使用T4DNA连接酶（Takara Shuzo Co.制造）将此DNA片段连接到在先已用BamHI（Takara Shuzo Co.制造）切断的载体pSTV 28上。按照Takara Shuzo Co.的说明书用所得的连接混合物转化大肠杆菌JM109（Takara Shuzo Co.生产），以制备由5，000个克隆组成的基因库。考虑到如果以高比率表达K蛋白质基因，则可导致携带其中已克隆了K蛋白质基因片段之载体的宿主细胞死亡，因此要使用低拷贝载体pSTV28。

（2）K蛋白质基因的克隆

基于实施例1（3-2）中的氨基酸序列，使用Applied Biosystems Co.制造的DNA合成仪合成有序列5′-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG-3′（SEQ ID No∶3）的30mer寡核苷酸，作为用于菌落杂交的探针。确定序列过程中，因相对于一种氨基酸残基存在多个密码子而造成很大障碍，而如何解决这一问题是很重要的。在本发明中，可以基于下述两点考虑来制备好的探针，而这正是成功的重要因素。这两点是：（1）因为可以确定相对长区域的氨基酸序列，所以有可能选择其中相对于各氨基酸之密码子的简并性程度低的氨基酸区域;（2）虽然关于短杆菌的密码子使用频率还没有肯定的知识，但Tsuchiya等人提出的关于克隆脂酶的知识（日本专利公开92-271780号）可供参考。

用集落杂交法从如此制得的基因库中得到与探针杂交的集落。用Hybond-N（Amersham Co.制造）膜制取集落的复制物，于50°下杂交40小时，然后在40℃，1小时条件下将滤膜洗4次。经集落杂交法对如此得到的杂交阳性集落进行二次筛选。使用上述寡核苷酸作为探针并使用Hybond-N（Amersham Co.制造）作为滤膜制备复制物，于50℃杂交24小时并于4℃，1小时条件下洗3次，再于50℃，1小时条件下洗2次。在二次筛选中选择出12个克隆。用碱-SDS方法从这12个在二次筛选中呈阳性的集落回收质粒DNA。根据用EcoRI和HindⅢ（均为Takara Shuzo Co.生产）消化这些质粒后检查酶切图谱的结果，证实各质粒均有在pSTV 28的BamHI位点插入的DNA片段。

按照制造商推供的操作说明书，使用VacuGene（Pharmacia LKB Biotechnology Co.生产）将如此得到的DNA片段吸收到Hybond-N滤膜上，并使用上述寡核苷酸探针进行Southern杂交。在50℃，26小时条件下进行杂交，并于40℃一次洗1小时。于50℃再一次洗1小时。结果发现，在二次筛选中12个阳性克隆中有6个与探针杂交，并可基于限制性酶切图谱将此6个克隆分类为3个类型。

使用上述寡核苷酸作引物，以二脱氧方法检测所得到的三种类型已插入DNA片段的核苷酸序列，发现其中一种类型的已插入之DNA片段含有序列5′-AACAATGCAGATCAGGCTGCACGTGAGCTCTTCCTCGATTGGGACACC-3′（SEQ ID No∶4）。该序列编码位于在先前确定的氨基酸序列中用于决定探针序列之部分的羧基末端侧的氨基酸序列，即Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr（相当于SEQ ID No∶1中的氨基酸序号25-40），据此可确认该DNA片段至少含有所需基因的一部分。

然后，用二脱氧法确定全长度已插入DNA片段的核苷酸序列。所测得的碱基序列示于序列表SEQ ID No∶5中。发现该片段编码K蛋白质。根据此核苷酸序列推定的K蛋白质的氨基酸序列也示于序列表SEQ ID No∶5中。

实施例3：K蛋白质缺失菌株的制备

（1）K蛋白质缺失菌株的制备

使用乳糖发酵短杆菌2256菌株（ATCC 13869）作为亲代菌株，用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（NTG）对整个细胞进行突变处理。在2xTY培养基（1.6%Bacto trypton，1%酵母提取物，0.5%NaCl）中培养2256菌株的细胞，当培养基在660nm处的吸光率达到约0.3时收集细胞。用具有表1所示组分的TM缓冲液洗净细胞后，将其悬浮在NTG溶液中（NTG以0.2mg/ml的浓度溶解在TM缓冲液中），并于37℃保温0-90分钟。用TM缓冲液和2xTY培养基洗净细胞，然后在2xTY培养基中培养过夜以使突变得以固定。

表1

成分浓度

Tris 50mM

马来酸 50mM

(NH₄)₂SO₄1g/1

MgSO₄·7H₂O 0.1g/1

Ca(NO₃)₂5mg/1

FeSO₄·7H₂O 0.25mg/1

用NaOH调到pH6.0

对按上述方法用NTG诱发突变的细胞进行单菌落分离并分离大约1，000个菌落。检查形成这些菌落的各克隆是否缺失K蛋白质。用实施例1（1）中所述方法制备各克隆的细胞表面层部分并使用制得的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。用这种方法，如在相应菌株细胞表面层部分的分子量63，000附近未检测到K蛋白质带时，即可得到K蛋白质缺失菌株。该菌株被命名为乳糖发酵短杆菌YSR。

检查如此得到的YSR菌株的染色体DNA，以了解是否该菌株缺失K蛋白质的原因在于基因的缺陷。即，从YSR菌株克隆K蛋白质基因，以按照实施例1所述同样方法进行结构分析。

按Saito-Miura所述方法（Biochem.Biophys.Acta.，8278（1963）619-629）从YSR菌株制备染色体DNA。约50μgDNA中加入2单位Sau3AI并于37℃保温40分钟以进行部分消化。然后在蔗糖密度梯度（10%至40%）情况下离心（12，000xg，26小时）以分级分离经过消化的DNA。

收集相当于约1，500-6，000bp的部分（1.5ml体积），并于4℃下对TE缓冲液（10mM Tris/HCl，1mM EDTA，pH8.0）透析。使用Sanko Junyaku Co.制造的Seamless Cellulose Size 8/32作为透析管。对2升缓冲液透析4小时后，更换缓冲液继续透析2小时。

按照Maniatis等人的方法（Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Press（1989）Maniatis，et al.）用2-丁醇提取所得到的1，500-6，000bp染色体DNA部分并使用T4DNA连接酶连接到已用BamHI（由Takara Shuzo Co.生产）切断的载体pUC18上。按照Takara Shuzo Co.的操作说明书用此连接混合物转化大肠杆菌JM109（Takara Shuzo Co.生产），以制备基因库。

使用有下示序列的合成DNA作为探针以集落杂交法从所得基因库中筛选具有K蛋白质基因的克隆：5′-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG-3′（见实施例2）。使用Hybond-N滤膜（Amersham Co.制造）制备集落的复制物，于50℃下杂交40小时并于40℃，1小时条件下洗4次。用集落杂交法对杂交阳性集落进行二次筛选。使用上述DNA作为探针并使用Hybond-N（Amersham Co.制造）膜制备复制物，于50℃杂交24小时并在40℃，1小时条件下洗3次，再于50℃，1小时条件下洗2次。

用碱-SDS法从这些在该二次筛选中呈阳性的集落中回收质粒DNA。用二脱氧法检测核苷酸序列，根据限制性酶切图可知待测克隆中已插入的DNA片段含有K蛋白质基因的完整区域。根据这一结果，已证明从YSR菌株中分离的K蛋白质基因具有序列表中SEQ ID No∶6所示的序列。将该序列与SEQ ID No∶5相比较，发现YSR的K蛋白质基因具有下表所示的突变。表2中的核苷酸序号相当于SEQ ID No∶6中的碱基序号。

表2

核苷酸序号突变类型

932 G 插入

945 T→C 突变

948 A 插入

1031 A 插入

1215-1216 CG 插入

1238 T 插入

1551-1579 29 碱基插入

1688 C 插入

1789-1790 C 缺失

2203-2204 AG 插入

2274 C 插入

2422 C 插入

2438 T 插入

已发现YSR菌株染色体上的K蛋白质基因由于上述核苷酸的缺失或插入而造成移码，结果YSR菌株不再表达K蛋白质。含有突变K蛋白质基因片段的质粒被命名为pMAK 701。携带质粒pMAK 701的大肠杆菌AJ 12759已于1993年1月11日以保藏登记号FERM P-13364保藏在National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology（1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，Japan，zip code 305），并于1994年1月1日由原保藏单位转为布达佩斯条约规定的国际保藏登记号为FERM BP-4533，后又于1994年2月17日保藏在中国典型培养物保藏中心（中国湖北省武汉大学校内），保藏号为CCTCC M94003。

顺便说明的是，实施例2中包含有序列表SEQ ID No∶5中所述碱基序列之DNA片段的质粒没有保藏。但本领域技术人员显然可以使用例如PCR方法或按照利用含U单股DNA的方法对基因进行位点特异性诱变。因此，可以很容易地使用pMAK 701作为起始材料制备包含有序列表SEQ ID No∶5中所示碱基序列之DNA片段的质粒。

（2）K蛋白质基因分割菌株的制备

从实施例3（1）中制得的含K蛋白质突变基因的DNA片段上切下长度约650碱基对的Bam HI-SalI片段，并与具有温度敏感性复制起始点之载体pHSC 4（Sugimoto，et al.，法国专利公开号2667875/1992）的Bam HI-SalI位点连接，以制备用于基因分割的质粒pMAK 705。借助电脉冲法（Sugimoto，et al.，日本专利公开号90-207791）将pMAK 705导入乳糖发酵短杆菌2256（ATCC 13869）中，该菌株具有AEC（S-（2-氨乙基）-L-半胱氨酸）抗性（以下称之为ACE^r2256菌株）。在质粒复制抑制温度下培养所得到的转化体，以通过在K蛋白质基因之BamHI-SalI区域的同源重组破坏染色体K蛋白质基因。图1中图解显示了基因分割的机制。突变K蛋白质基因的BamHI-SalI片段相当于SEQ ID No∶6中所示序列的BamHI（核苷酸序号1156-1161）至SalI位点（1704-1709），该片段存在于SEQ ID No∶5中所示的ORF（开放读码）内。因此，由于同源重组而产生的被破坏K蛋白质基因的两拷贝之一缺失OFR的3′侧大部分，而另一拷贝则缺失ORF的5′侧大部分。实验详述如下。

在含有5μg/ml氯霉素的CM2G培养基中过夜培养携带pMAK 705的AECr2256菌株。用CM2G培养基稀释培养液至10^-3并将其100μl分散于含有5μg/ml氯霉素的CM2G平皿上。于34℃（复制抑制温度）培养过夜以选择氯霉素抗性细菌。按实施例1中所述方法制备如此得到的两个氯霉素抗性菌株的细胞表面层部分，对其进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析以证实K蛋白质缺失情况。如此得到的两个K蛋白质缺失菌株分别定名为AJ 12760和AJ 12956。AJ 12760和AJ 12956的生长速度与AECr2256菌株的生长速度等同。

K蛋白质缺失菌株AJ 12760已于1993年1月11日以保藏登记号FERM P-13365保藏在National Instituteof Industrial Science and Technology（1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan;zip code 305），并已按照布达佩斯条约于1994年1月11日将原始保藏转为国际保藏，保藏登记号为FERM BP-4534。另外，K蛋白质缺失菌株AJ 12956已于1994年1月11日按布达佩斯条约的国际保藏规定保藏在上述保藏单位，保藏登记号为FERM BP-4532。K蛋白质缺失菌株AJ 12760和AJ 12956后来又于1994年2月17日保藏在中国典型培养物保藏中心（中国湖北省武汉大学校内），保藏号分别为CCTCC M 94004和CCTCC M 94005。

（3）K蛋白质缺失菌株的铵掺入活性

当检测上述（1）中制备的K蛋白质缺失菌株AJ 12760的铵掺入活性时，如图2所示，与AEC^r2256菌株相比这一活显著降低。按照迅速过滤法（A.Jayakumar，et al.，Analytical Biochemistry，135（1983）475-478）使用¹⁴C标记的甲基铵（一种铵离子类似物）作为底物检测铵掺入。结果证明，K蛋白质是一种有助于棒状细菌掺入营养素的新的细胞表面层蛋白质。

有关检测K蛋白质缺失菌株AJ 12760之铵掺入活性的实验详述如下。将待检测此掺入活性的细菌细胞从CM2G琼脂培养基接种到CM2G液体培养基中并于30℃培养过夜。在冰水中冷却培养液后收集细胞，用预先以冰冷却的缓冲液B（50mM Tris-HCl，pH 6.8，100mM NaCl）将细胞洗两次并悬浮在缓冲液B中达到密度为2.0×10⁸细胞/ml。将100μl细胞悬浮液置于Milipore Co.制造的Multi-Screen HA的小井内，向其中加入终浓度为10mM的葡萄糖作为能源并于30℃保温5分钟。在此过程中，必要时可一同加入作为脱偶联剂的CCCP（Carbonylcyanide M-chlorophenylhydrazone，Sigma Co.生产）。

向各井内加入终浓度为20μm的¹⁴C标记的甲基铵以开始氨掺入反应。于25℃保持预定的时间后，从各小井内迅速吸出反应溶液以终止反应。吸出反应溶液后用缓冲液C（50mM Tris-HCl，pH6.8，1MNaCl）洗净保持在Multi-Screem HA膜上的细胞，将膜干燥后使用生物影象分析仪（BAS-2000 Fuji Photographic Film Inc.制造）检测掺入细胞内的¹⁴C放射活性。

实施例4：K蛋白质缺失菌株的沉降性质

估价培养基中K蛋白质缺失菌株的沉降性质。使用K蛋白质基因分割菌株AJ 12760和AJ 12956和K蛋白质缺失菌株YSR菌株作为待估价的K蛋白质缺失菌株。另外，使用乳糖发酵短杆菌2256（ATCC 13869）和K蛋白质缺失菌AEC^r2256作为对照。在含有20μg/ml氯霉素的CM2G平板将AJ 12760、AJ 12956、YSR、2256和ACE^r2256各菌株培养过夜，将2白金耳各菌株细胞（相当于平板的1/40）接种到主液体培养基中并于31.5℃培养24小时。为制备用于主培养的液体培养基，将20ml有下列组成的液体培养基加入500ml体积Sakaguchi烧瓶中，用KOH调到pH8.0并于115℃加热灭菌10分钟，然后再加入在200℃下干热灭菌3小时的CaCO₃。

表3培养基的组成

成分混合量(终浓度)

葡萄糖或蔗糖 10g/100ml

(NH₄)₂SO₄5.5g/100ml

KH₂PO₄0.1g/100ml

MgSO₄·7H₂O 0.1g/100ml

FeSO₄·7H₂O 0.001g/100ml

MnSO₄·4H₂O 0.001g/100ml

“豆浓”(大豆蛋白的水解物)^*0.05g/ml

(以总氮量计)

维生素B1盐酸盐 200g/1

生物素 500g/1

GD-113(消泡剂:Nippon Yushi 0.002g/100ml

Co.生产)

CaCO₃(200℃干热灭菌

3小时) 5.0g/100ml

＊：“豆浓”含有3.49g氮/100ml

使用加有葡萄糖的培养基和加有蔗糖的培养基重复系列培养各K蛋白质基因破坏菌株、K蛋白质缺失突变体和K蛋白质非缺失菌株。表4列出所用碳源和对各培养区（样品序号）培养后测得的pH。

表4

样品序号菌株碳源 pH

1 2256 葡萄糖 6.48

2 2256 蔗糖 6.30

3 YSR 葡萄糖 6.28

4 YSR 蔗糖 6.18

5 AEC^r2256 葡萄糖 6.20

6 AEC^r2256 蔗糖 6.32

7 AJ 12760 葡萄糖 5.93

8 AJ 12760 蔗糖 5.74

9 AJ 12956 葡萄糖 5.88

10 AJ 12956 蔗糖 5.78

11 2256 葡萄糖 6.28

12 2256 蔗糖 6.20

13 YSR 葡萄糖 6.24

14 YSR 蔗糖 6.14

15 AEC^r2256 葡萄糖 6.26

16 AEC^r2256 蔗糖 6.38

17 AJ 12760 葡萄糖 5.99

18 AJ 12760 蔗糖 5.79

19 AJ 12956 葡萄糖 5.90

20 AJ 12956 蔗糖 5.77

在加葡萄糖的培养基和加蔗糖的培养基中培养的双培养区中，对于一个系列（样品序号1-10）培养后留下培养基进行沉降试验;对于另一个系列（样品序号1-20）则于培养后将培养基的pH调到4.0。pH4.0通常是以离子交换层析法纯化L-赖氨酸-HCl时所需的条件。

按下述方法进行沉降试验。培养后将各1.5ml培养基移入内径15mm的试管内并静置以使细胞自动沉降。经过一定时间后，测出细胞沉降后所得上层清液与其中悬浮有细胞的沉淀部分之间界面处的位置，以按照下述公式计算出相对沉降度，其中假设从培养基表面到界面的距离b与培养基表面的高度a间的比例为“上层清液比例”。基于对培养基作26倍稀释后在562nm处的吸光率（OD₅₆₂）测定细胞浓度。另外，当将15ml培养基移入试管中时，培养基表面的高度a为9cm。按照先前制定的转换式转换OD₅₆₂值，计算出干细胞重量。

（相对沉降度）＝ (（沉淀部分中的细胞密度）)/(（总细胞浓度）) ×100

上层清液比例＝（b/a）×100

a：培养基表面的高度（即上层清液部分和沉淀部分的总高度）

b：培养基表面到界面的距离（即从a减去界面高度得到的数值）（干细胞重量）＝1.586（OD₅₆₂）³-1.446（OD₅₆₂）²-1.396（OD₅₆₂）-0.013

在将培养基转移到试管内之后立即、之后10分钟、30分钟、60分钟、180分钟和23小时测定各培养区中的总细胞密度（总细胞OD）、从培养基表面到界面（b）的距离、培养基表面的高度（a）及上层清液中的细胞密度（上层清液OD），结果示于表5和表6中。计算出各时间的相对沉降度数值，结果示于表7和表8中。另外，附图中分别图解显示了样品1、3、5、7和9（图3），样品2、4、6、8和10（图4），样品11、13、15、17和19（图5）以及样品12、14、16、18和20（图6）在不同时间里相对沉降度的变化。下表中“上清”表示“上层清液”。

表7

相对沉淀度

样品

No. 0分后 10分后 30分后 60分后 180分后 23小时后

1 100 100 100 100 100 100

2 100 100 100 100 100 100

3 100 100 100 203 145 444

4 100 100 247 254 317 298

5 100 100 100 100 100 104

6 100 100 100 100 100 102

7 100 168 197 229 298 263

8 100 216 223 219 285 340

9 100 158 180 189 232 238

10 100 188 214 221 458 277

表8

相对沉淀度

样品

No. 0分后 10分后 30分后 60分后 180分后 23小时后

11 100 100 100 171 282 633

12 100 100 100 178 249 600

13 100 100 117 126 193 380

14 100 100 100 138 126 567

15 100 100 177 175 203 600

16 100 100 120 133 140 533

17 100 170 268 269 312 475

18 100 187 239 280 298 340

19 100 153 225 239 238 340

20 100 170 265 313 370 475

从前述结果可以看出，对于K蛋白质基因分割菌株AJ 12760和AJ 12956，不管使用何种碳源，也不论是否在完成培养后调整培养基的pH值，细胞均在短时间（10-30分钟）内沉淀。另外，还发现当使用蔗糖作为碳源进行培养并在完成培养后没有调整pH进行静置时，K蛋白质缺失突变株YSR的细胞也以如K蛋白质基因分割菌株的同样方式在短时间内沉淀。反之，作为K蛋白质非缺失菌株的AEC^r2256和2256细胞，既使在完成培养后培养基静置30分钟也基本上没有沉降。特别是，在没有调整培养基pH的情况下，甚至静置23小时后也没有看出细胞沉淀现象。

另外，就细胞沉降度来说，测定细胞聚集物的沉降常数可得到与按上述方法测得的相对沉降度的相同结果。

本发明提供了有助于棒状细菌掺入营养素的新的细胞表面层蛋白质及其基因，同时提供了在棒状细菌细胞中导入和扩增该基因所得到的转化体。此外，它还能改善使用具有产生L-氨基酸之活性的棒状细菌作为转化体的宿主，以发酵方法生产L-氨基酸的工艺，并可改善使用该宿主细菌以发酵方法生产L-氨基酸的工艺。

再者，本发明提供了缺失细胞表面层蛋白质并具有聚集性质的新的棒状细菌，从而能够在利用它们生产L-氨基酸的过程中节省能源。

序列表

序列编号：1（SEQ ID No∶1）

序列长度：40个氨基酸

序列类型：氨基酸

拓扑学：线性

来源：乳酸发酵短杆菌2256（ATCC 13869）

序列说明：

序列编号：2（SEQ ID No∶2）

序列长度：32个氨基酸

序列类型：氨基酸

拓扑学：线性

来源：乳酸发酵短杆菌2256（ATCC 13869）

序列说明：

序列编号：3（SEQ ID No∶3）

序列长度：30bp（碱基对）

序列类型：核酸

链数：双链

拓扑学：线性

序列说明：

TTCATCGCTG CTGTCGGCAA CATCAACGAG 30

序列编号：4（SEQ ID No∶4）

序列长度：48bp

序列类型：核酸

链数：双链

拓扑学：线性

分子类型：基因组DNA

来源：乳酸发酵短杆菌2256（ATCC 13869）

序列说明：

ACAATGCAG ATCAGGCTGC ACGTGAGCTC TTCCTCGATT GGGACACC 48

序列编号：5（SEQ ID No∶5）

序列长度：2653bp

序列类型：核酸

链数：双链

拓扑学：线性

分子类型：基因组DNA

来源：乳酸发酵杆菌2256（ATCC 13869）

序列说明：

序列编号：6（SEQ ID No∶6）

序列长度：2693bp

序列类型：核酸

链数：双链

拓扑学：线性

分子类型：基因组DNA

来源：乳酸发酵短杆菌YSR菌株

序列说明：

Claims

1、分子中有

(1)Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Ala-Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr和

(2)Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr-Asp-Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro-Ala-Tyr-Lys这2个序列且分子量约为63，000道尔顿，得自乳酸发酵短杆菌的细胞表面层蛋白质。

2、含有编码权利要求1中所述细胞表面层蛋白质之基因的DNA片段。

3、权利要求2中所述的DNA片段与能够在棒状细菌细胞中自动复制的载体相连接而得到的重组DNA。

4、在棒状细菌细胞内扩增权利要求2中所述的DNA片段所得到的转化体。

5、以发酵工艺生产有用物质的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求4中所述的具有产生有用物质的活性的转化体，在培养基中生成并积聚所说的有用物质并从培养基中回收所说的有用物质。

6、如权利要求5中限定的方法，其中有用物质是L-氨基酸。

7、具有细胞聚集性质并缺失权利要求1所述之细胞表面层蛋白质或与所说的细胞表面层蛋白质实质上相同之蛋白质的棒状细菌。

8、如权利要求7中所述的棒状细菌，其中编码权利要求1中所述之蛋白质的基因或编码实质上与所说细胞表面蛋白质相同并存在于棒状细菌细胞表面层中之蛋白质的基因通过含有至少一部分编码细胞表面层蛋白质之所说基因的DNA片段与染色体上相同或同源于所说DNA片段之DNA序列间的同源重组而被分割。

9、如权利要求7或8中限定的棒状细菌，其中棒状细菌是乳酸发酵短杆菌。

10、生产有用物质的方法，该方法包括培养具有产生有用物质之活性的棒状细菌，在培养基中生成并积聚所说的有用物质;从培养基中收集所说的有用物质，其中棒状杆菌是权利要求7-9中任一项所限定的棒状细菌，该方法进一步包括在完成培养后静置培养基并使所说棒状细菌的细胞沉淀的步骤。

11、如权利要求10中限定的方法，其中有用物质是L-氨基酸。