CN100347190C

CN100347190C - 编码rpsL基因的核苷酸序列

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Publication number: CN100347190C
Application number: CNB028049713A
Authority: CN
Inventors: 贝蒂娜·默克尔; 布丽吉特·巴特; 斯特凡·汉斯; 卡罗琳·克罗伊策; 托马斯·赫尔曼; 瓦尔特·普费弗勒; 米夏埃尔·宾德尔
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-02-16
Filing date: 2002-01-22
Publication date: 2007-11-07
Anticipated expiration: 2022-01-22
Also published as: AU2002247644A1; BR0207284A; WO2002066651A3; EP1360298A2; BR0207284B1; US20060019357A1; CN1524089A; US20020155557A1; WO2002066651A2; US6939695B2

Abstract

本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包含选自如下一组的多核苷酸序列：a)与编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸，b)编码包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，d)包含a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。本发明还涉及使用其中至少rpsL基因是增强形式的棒状细菌经发酵制备L-氨基酸的方法，还涉及包含本发明序列的多核苷酸序列作为杂交探针的应用。

Description

编码rpsL基因的核苷酸序列

发明领域

本发明提供了来自棒状细菌(coryneform bacteria)的编码rpsL基因的核苷酸序列，及用细菌经发酵制备氨基酸的方法，所述细菌中rpsL基因是增强的。

现有技术

氨基酸，尤其L-甲硫氨酸，用于人用药及制药工业，食品工业，但尤为用于动物营养。

已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产，由于L-氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施。如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。

为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物有抗性或调节重要性代谢物是营养缺陷的并产生氨基酸的菌株。

一些年以来，重组DNA技术的方法也已经用于棒杆菌生产L-氨基酸的菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的作用而进行改良。

发明目的

本发明人目的在于为改良发酵氨基酸的生产而提供新措施。

发明概述

当下文提及L-氨基酸或氨基酸时，是指一或多种选自以下一组的氨基酸，包括其盐，所述的组由L-天冬氨酸，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，和L-精氨酸组成。优选L-赖氨酸。

当下文提及L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅指碱还指盐，例如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。

本发明提供了衍生自棒状细菌的分离的多核苷酸，包括选自如下一组的编码rpsL基因的多核苷酸序列：

a)与编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，

b)编码包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及

d)包含a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，所述多肽优选具有核糖体蛋白S12活性。

本发明还提供了上面提及的多核苷酸，其优选是能复制的DNA，包含

(i)SEQ ID NO：1的核苷酸序列，或

(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或

(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地

(iv)(i)中的中性功能有义突变，其不改变所述蛋白质/多肽的活性。

最后，本发明还提供了选自以下一组的多核苷酸：

a)包含选自SEQ ID NO：1核苷酸序列第1-499位之间的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，

b)包含选自SEQ ID NO：1核苷酸序列第500-883位之间的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，

c)包含选自SEQ ID NO：1核苷酸序列第884-1775位之间的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。

本发明还提供了：

一种多核苷酸，尤其DNA，其能复制并包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

一种多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；

一种载体，其含有本发明多核苷酸序列，特别是穿梭载体或质粒载体，以及

含有该载体或其中rpsL基因是增强的棒状细菌。

本发明还提供了多核苷酸，其基本上包含一多核苷酸序列，其可通过用包含相应于SEQ ID NO：1的本发明多核苷酸序列或其片段的探针与一棒状细菌基因文库杂交，并分离所述的多核苷酸序列来筛选获得，所述文库包括所述完整基因或其部分。

本发明的多核苷酸序列适用作RNA，cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码核糖体蛋白S12的全长核酸或多核苷酸或基因，或分离与rpsL基因具有高度序列相似性的那些核酸或多核苷酸或基因。它们也可以用作所谓“阵列”、“微阵列”或“DNA芯片”上的探针，以检测及确定相应多核苷酸或衍生自其中的序列，例如RNA或cDNA。

包含本发明序列的多核苷酸还适用作引物，借助于其通过聚合酶链反应(PCR)可以制备编码核糖体蛋白S12的基因的DNA。

作为探针或引物的这种寡核苷酸包括至少25，26，27，28，29或30个，优选至少20，21，22，23或24个，特别优选至少15，16，17，18或19个连续核苷酸。具有至少31，32，33，34，35，36，37，38，39或40个，或至少41，42，43，44，45，46，47，48，49或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。具有至少100，150，200或300个核苷酸的寡核苷酸任选地也是合适的。

“分离的”是指从其天然环境中分离出来。

“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。

本发明的多核苷酸包括SEQ ID NO：1的多核苷酸或从中制备的片段，及与SEQ ID NO：1的多核苷酸具有至少70％-80％，优选至少81％-85％，特别优选至少86％-90％，尤其优选至少91％，93％，95％，97％或99％相同性的那些多核苷酸或从中制备的片段。

“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。

本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽，特别是具有核糖体蛋白S12生物学活性的多肽。以及与SEQ ID NO：2的多肽至少70％-80％，优选至少81％-85％，特别优选至少86％-90％，尤其优选至少91％，93％，95％，97％或99％相同并具有所述活性的那些多肽。

本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸的方法，在该棒状细菌中编码rpsL基因的优选内源性核苷酸序列是增强的，尤其是过表达的，生产的氨基酸选自以下一组：L-天冬氨酸，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，和L-精氨酸。

文中术语“增强”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子或编码高活性相应酶或蛋白质的基因，及任选地组合使用这些方法。

通过增强措施，尤其过表达，相应蛋白的活性或浓度基于野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质的活性或浓度一般提高至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最大1000％或2000％。

本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸。所述微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属，在棒状菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。

棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌的合适菌株特别是以下已知野生型菌株：

谷氨酸棒杆菌ATCC 13032

醋谷棒杆菌ATCC 15806

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870

嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

黄色短杆菌ATCC 14067

乳发酵短杆菌ATCC 13869和

扩展短杆菌ATCC 14020

和从中获得的生产L-氨基酸的突变体或菌株，如生产L-赖氨酸的菌株

谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709

黄色短杆菌FERM-P 1708

乳发酵短杆菌FERM-P 1712

谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463

谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464

谷氨酸棒杆菌DM58-1

谷氨酸棒杆菌DG52-5

谷氨酸棒杆菌DSM5715和

谷氨酸棒杆菌DSM12866。

本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的编码核糖体蛋白S12的新rpsL基因。

为分离谷氨酸棒杆菌的rpsL基因或其它谷氨酸棒杆菌基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie，Weinhein，德国，1990)，或Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(冷泉港实验室出版社，1989)。一非常熟知的基因文库是由Kohara等(细胞50，495-508(1987))在λ载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252，255-265，1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987，美国科学院院报84，2160-2164)在大肠杆菌K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。

Bormann等(分子微生物学6(3)，317-316)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。

为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivan，生命科学25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19：259～268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645～4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于测序的通用载体测序，如Sanger等(美国科学院院报74：5463-5467，1977))所述。

所得DNA序列然后可以用已知的算法或序列分析程序研究，例如Staden所述程序(核酸研究14，217-232(1986))，Marck所述程序(核酸研究16，18291836(1988))，或Butler所述GCG程序(生物化学分析方法39，74-97(1998))。

已经发现编码rpsL基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，其示作SEQ ID NO：1，是本发明的一部分。另外，用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得rpsL基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO：2表示。已知宿主中内源酶可以断裂所形成的蛋白质的N-末端氨基酸甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸。

通过遗传密码的简并性产生自SEQ ID NO：1的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，保守氨基酸置换，如在蛋白质中用甘氨酸置换蛋白质丙氨酸，或用天冬氨酸置换谷氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质任何功能的改变，即是中性的。这种突变也称为中性取代。另外已知蛋白质N和/或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至稳定其功能。本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169：751-757(1987))，O’Regan等(基因77：237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3：240-247(1994))，和Hochuli等(生物/技术6：1321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式得自SEQ ID NO：2的氨基酸序列也是本发明的一部分。

同样，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。最后，用产生自SEQ ID NO：1的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的一部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15个核苷酸的长度。

通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)，以及Liebl等(国际系统细菌学杂志(1991)41：255～260)。杂交在严格条件下发生，即只有这样的杂交子形成，其中探针和靶序列即用所述探针处理的多核苷酸是至少70％相同的。已知杂交的严格性包括洗涤步骤，通过改变缓冲液组分，温度和盐浓度而影响或确定。杂交反应优选在与洗涤步骤相比相对较低严格条件下进行(Hybaid HybridisationGuide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。

例如一种5×SSC缓冲液在大约50℃-68℃可以用于杂交反应。探针也可以和与探针序列相同性低于70％的多核苷酸杂交。这种杂交子稳定性较差，通过在严格条件下洗涤除去。这可以通过例如将盐浓度降低至2×SSC及任选随后为0.5×SSC(滤膜杂交的DIG系统使用指导，Boehringer Mannheim，德国曼海姆，1995)，在设定温度大约50℃-68℃实现。任选可以将盐浓度降低至0.1×SSC。与所用探针序列例如至少70％或至少80％或至少90％-95％相同的多核苷酸，可以通过将杂交温度以大约1-2℃的幅度从50℃逐步提高至68°而分离。关于杂交的进一步指导可以所谓试剂盒形式在市场上获得(例如DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH，德国曼海姆，目录号No.1603558)。

用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册：寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。

本发明人发现，在rpsL基因增强后，棒状细菌以改良方式生产氨基酸。

为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在氨基酸发酵生产期间增强表达也是可能的。延长mRNA寿命的措施也可改良表达。另外，通过防止酶蛋白的分解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。

本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84-87(1991))，Reischeid等(应用及环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物学综述60：512-538(1996)及已知关于遗传及分子生物学的教材。

例如，本发明的rpsL基因已借助于附加型质粒被过表达。适当的质粒是那些在棒状细菌中复制的质粒。许多已知质粒载体例如pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64，549-554)，pEKEx1(Eikamanns等，基因102，93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107，69-74，(1991))，是基于隐蔽性质粒pHM1519，pBL1或pGA1。其它质粒载体，例如那些基于pCG4(US-A-4,489,160)，pNG2(Serwold-Davis等，FEMS微生物学信息66，119-124(1990)或pAG1(US-A-5,158,891)的质粒载体，可以相同方式使用。

其它适当的质粒载体是借助于其可以使用通过整合入染色体中进行基因扩增的那些载体，例如Reinscheid等(应用和环境微生物学60，126-132(1994))阐述了hom-thrB操纵子的复制或扩增。在这个方法中，将完整基因克隆入在宿主中(典型在大肠杆菌中)能复制的质粒载体中，但所述载体在谷氨酸棒杆菌中不能复制。可能的载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，6973(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，美国)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志269：32678-84；US-A5，487993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Holland；Bernard等，分子生物学杂志，234：534-541(1993))，pEM1(Schrumpft等，1991，细菌学杂志173：4510-4516)或pBGS8(Spratt等，1986，基因41：337-342)。然后通过接合或转化将含有要扩增的基因的质粒载体移至所需谷氨酸棒杆菌菌株中。接合方法例如Schafer等所述(应用和环境微生物学60，756-759(1994))。转化方法例如Thierbach等(应用微生物学和生物技术29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技术7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物学信息123，343-347(1994))所述。在通过“交换”事件进行同源重组后，所得菌株含有所述基因的至少两个拷贝。

另外发现在SEQ ID NO：2所示核糖体蛋白S12的氨基酸序列的第38-48位之间进行氨基酸置换会改良棒状细菌生产赖氨酸的能力。

优选地，在第43位的L-赖氨酸用除了L-赖氨酸之外任何其他蛋白中存在的氨基酸置换，优选用L-组氨酸或L-精氨酸置换。非常优选用L-精氨酸置换。

菌株DM1545中含有的等位基因rpsL-1545的碱基序列示于SEQID NO：3。所述rpsL-1545等位基因编码一种蛋白质，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。所述蛋白质在第43位含有L-精氨酸。rspL-1545等位基因的DNA序列(SEQ ID NO：3)在编码区(CDS)的第128位含有碱基鸟嘌呤，其相当于SEQ ID NO：3所示序列中的第627位。野生型基因的DNA序列(SEQ ID NO：1)在此位置含有腺嘌呤。

针对诱变，可以使用常规的诱变方法，使用诱变物质例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或紫外线。可以进一步使用体外方法进行诱变，例如用羟胺处理(Miller，J.H.：细菌遗传短期课程，针对大肠杆菌和相关细菌的实验指导和手册，冷泉港实验室出版，冷泉港，1992)，或用诱变寡核苷酸处理(T.A.Brown：遗传工程入门，SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，1993)，或用聚合酶链反应(PCR)处理，如Newton和Graham所著手册所述(PCR，Spektrum AkademischerVerlag，Heidelberg，1994)。

本发明的rpsL等位基因还可以通过基因置换方法移至合适的菌株中，如Schwarzer和Puhler(生物/技术学9，84-87(1991))或Peters-Wendisch等(微生物学144，915-927(1998))所述。将相应的rpsL等位基因克隆入在谷氨酸棒杆菌中不复制的载体中，例如pK18mobsacB(Jager等，细菌学杂志174：5462-65(1992))或pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Holland；Bernard等，分子生物学杂志，234：534-541(1993))，然后通过转化或缀合将该载体移至所需谷氨酸棒杆菌宿主中。在通过实现整合的第一次“交换”同源重组及实现在靶基因和靶序列中进行切割的合适的第二次“交换”后，使得突变得以掺入。

另外，除rpsL基因之外，特定生物合成途径，糖酵解，回补作用，柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶的增强尤其过表达，对L-氨基酸的生产可以是有益的。一般优选使用内源基因。

“内源基因”或“内源核苷酸序列”应理解为一个物种群体中存在的基因或核苷酸序列及其等位基因。

因此，除了增强rpsL基因之外，例如选自以下一组的一或多个基因可被增强尤其被过表达以生产L-赖氨酸：

·编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B 0197335)，

·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，

·编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，

·编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，

·编码葡糖6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-09224661)

·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，

·编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生物化学杂志254，395-403(1998))，

·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等(1990)，分子微生物学5(5)，1197-204(1991))，

·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，

·编码Zwal蛋白的zwal基因(DE：19959328.0，DSM 13115)，

·编码SEQ ID NO：5和6所示RNA聚合酶B的β亚单位的rpoB基因。

文中术语“弱化”是指降低或消除微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性，通过使用弱启动子或使用编码具有低活性的相应酶(蛋白质)的基因或等位基因，或灭活相应基因或酶(蛋白质)，及任选地组合使用这些方法。

通过弱化措施，相应蛋白质的活性或浓度一般降低至野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质活性或浓度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或0-5％。

除增强rpsL基因之外，对选自以下一组的一或多个基因弱化尤其降低其表达对L-氨基酸的生产也可以是有益的：

·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，

·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，

·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE：19951975.7，DSM 13114)，

·编码Zwa2蛋白的zwa2基因(DE：19959327.2，DSM 13113)。

除增强rpsL基因之外，排除非所需的二级反应对氨基酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦英国，1982)。

根据本发明产生的微生物可连续或非连续地通过分批法，补料分批法或重复补料发批法培养，以生产氨基酸。已知培养法见于由Chmiel(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。

所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(美国华盛顿D.C.，1981)。

可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。

可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。

可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中，上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。

可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃-40℃。持续培养直至所需产物形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。

本领域已知确定L-氨基酸的方法。因此可例如Spackman等所述通过离子交换层析随后茚三酮衍生化作用(分析化学，30(1958)，1190)进行该分析，或者通过反相HPLC进行，如Lindroth等所述(分析化学(1979)51：1167-1174)。

谷氨酸棒杆菌菌株DM1545的纯化培养物根据布达佩斯条约于2001年1月16日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号DSM13992。

本发明的方法用于发酵生产氨基酸，尤其L-赖氨酸。

本发明借助于以下实施例得以更详细阐述。

质粒DNA从大肠杆菌中的分离，所有限制技术，Klenow及碱性磷酸酶处理均通过Sambrook等所述方法进行(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室出版，冷泉港，NY，美国)。大肠杆菌的转化方法也见于该手册。

常用的营养培养基如LB或TY培养基的成分也可见于Sambrook等所著的该手册。

实施例1：制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组粘粒基因文库

如Tauch等(1995，质粒33：168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Diagnostics GmbH，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。将得自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体Super Cosl(Wahl等，(1987)美国科学院院报84：2160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI编码27-0948-02)酶切，并也用虾碱性磷酸酶去磷酸化。

粘粒DNA然后用限制性的内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编码27-0868-04)酶切。将以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC 13032DNA混合，并用T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理混合物。连接混合物然后用GigapackII XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。

为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)，将细菌置于10mM MgSO₄中并与噬菌体悬浮液等份混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox.1955，病毒学，1：190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组的各个克隆。

实施例2：rpsL基因的分离与测序

用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离一个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau 3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酶酶(Roche分子生物化学，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。经凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。

将得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，将DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biobech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美国科学院院报87：4645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。

重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18：1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74：5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”(产品号403044，Weiterstadt，德国)，在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism 377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29：1)(产品号A124.1，Roth，Karlsruhe，德国)中，进行凝胶电泳分离和序列分析。

所得原始序列数据然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14：217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14：217-231)进行计算机辅助编码区分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25：3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行进一步分析。

获得的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，对该核苷酸序列的分析显示一383碱基对的开放读框，其被称为rpsL基因。rpsL基因编码127个氨基酸的蛋白质。

以同样方式鉴别了位于SEQ ID NO：1上游的DNA节段，该节段示于SEQ ID NO：7。由SEQ ID NO：7延伸的rpsL基因区域示于SEQ IDNO：8。

实施例3：菌株DM1545的rpsL等位基因DNA的扩增和测序

谷氨酸棒杆菌菌株DM1545通过多重非定向诱变、选择及突变选择从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中制备。该菌株是甲硫氨酸敏感的。

从菌株DM 1545中通过常规方法分离染色体DNA(Eikmanns等，微生物学140：1817-1828(1994))。借助于聚合酶链反应，扩增携带rpsL基因或等位基因的DNA节段。基于从实施例2中已知的谷氨酸棒杆菌rpsL基因序列，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：

rpsL-1(SEQ ID No：10)

5’cag ctc tac aag agt gtc ta 3’

rpsL-2(SEQ ID No：11)

5’tgg tcg tgg tct tac cag ca 3’

所示引物通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成，通过Innis等所述方法进行PCR(PCR方案，方法与应用指导，1990，学术出版社)。用所述引物扩增出长度为大约1.78kb的一DNA节段，其携带rpsL等位基因。

携带菌株DM1545的rpsL等位基因的长度为大约1.78kb的扩增的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳而鉴别，从凝胶中分离并通过常规方法纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。

扩增的DNA片段或PCR产物的核苷酸序列通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)测序确定。PCR产物的序列示于SEQ ID NO：3。借助于Patentin程序获得的相关核糖体蛋白S12的氨基酸序列示于SEQID NO：4。

在菌株DM1545的rpsL等位基因编码区的核苷酸序列的第128位，即SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的第627位，是碱基鸟嘌呤。在野生型基因(SEQ ID NO：1)的相应位置是碱基腺嘌呤。

在菌株DM1545的核糖体蛋白S12的氨基酸序列的第43位是氨基酸精氨酸(SEQ ID NO：4)。在野生型蛋白质的相应位置是氨基酸赖氨酸(SEQ ID NO：2)。

实施例4：用rpsL-1545等位基因置换菌株DSM5715的rpsL野生型基因

4.1分离携带rpsL-1545等位基因的DNA片段

通过常规方法从菌株DM1545中分离染色体DNA(Eikmanns等，微生物学140：1817-1828(1994))。借助于聚合酶链反应扩增一个携带rpsL-1545等位基因的DNA节段，其在编码区(CDS)的第128位含有碱基鸟嘌呤，在野生型基因中该位置含有的是碱基腺嘌呤。基于从实施例2中已知的谷氨酸棒杆菌rpsL基因的序列，选择以下引物寡核苷酸进行聚合酶链反应：

rpsL-XL-A1(SEQ ID NO：12)

5’ga tct aga-ggt tgc cgg taa tcc tgt tg3’

rpsL-XL-E1(SEQ ID NO：13)

5’ga tct aga-cgc agg ctg cca gct tat tc3’

所示引物通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成，并通过Innis等所述标准PCR方法进行PCR(PCR方案，方法与应用指导，1990，学术出版社)。用所述引物扩增出携带rpsL-1545等位基因的长度为大约1.59kb的一DNA节段(SEQ ID NO：9)。该引物还含有限制性内切酶XbaI的切割位点序列，在上述核苷酸序列中以下划线示出。

将携带rpsL-1545等位基因的长度为大约1.59kb的扩增的DNA片段用限制性内切酶XbaI切割，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳而鉴别，然后从该凝胶中分离并通过常规方法纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。

4.2构建置换载体pK18mobsacB_rpsL-1545

将实施例4.1中描述的含有rpsL-1545等位基因并用限制性内切酶XabI切割的长度为大约1.58kb的DNA片段，借助于Schafer等所述sacB系统(基因14，69-73(1994))，通过置换诱变掺入谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715的染色体中。这个系统能产生并选择通过同源重组发生的等位基因置换。

将能动的克隆载体pK18mobsacB用限制酶XbaI消化，用碱性磷酸酶将末端去磷酸化(碱性磷酸酶，德国曼海姆Boehringer)。以此方式制备的载体与大小为大约1.58kb的rpsL-1545片段混合，并将此混合物用DNA连接酶处理(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)。

然后将大肠杆菌菌株S17-1(Simon等，生物/技术1：784-791，1993)用连接混合物(Hanahan，DNA克隆实践方案，第1卷，ILR出版社，冷泉港，纽约，1989)转化。携带质粒的细胞通过将转化混合物铺板于补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港，纽约，1989)上进行选择。

借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒，从转化体中分离质粒DNA，并通过用酶PstI限制酶切，随后进行琼脂糖凝胶电泳而检测。该质粒称为pK18mobsacB_rpsL-1545，并示于图1。

4.3DSM5715中载体pK18mobsacB_rpsL-1545的整合及等位基因置换

通过Schafer等所述方法(微生物学杂志172：1663-1666(1990))，将实施例4.2中所述载体pK18mobsacB_rpsL-1545通过接合转移至谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715中。该载体在DSM5715中不能独立复制，只有由于重组而整合在染色体中的情况下才保留在细胞中。通过将接合混合物铺板于补加15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港，纽约，1989)上选择转接合子。将卡那霉素抗性转接合子铺板于具有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上，在33℃温育24小时。将卡那霉素抗性转接合子称为DSM5715∷pK18mobsacB_rpsL-1545。通过载体的整合，除了rpsL野生型基因之外，其在染色体中携带rpsL-1545等位基因。

为选择其中由于第二次重组事件而发生质粒切除的突变体，将菌株DSM5715∷pK18mobsacB_rpsL-1545的细胞在LB液体培养基中非选择性培养30小时，然后铺板于具有10％蔗糖的LB琼脂上，温育16小时。

与起始质粒pK18mobsacB相似，质粒pK18mobsacB_rpsL-1545除了卡那霉素抗性基因之外，还含有一个拷贝的编码得自Bacillus subtilis的果聚糖蔗糖酶的sacB基因。可以由蔗糖诱导的表达导致果聚糖蔗糖酶形成，其催化对谷氨酸棒杆菌有毒性的果聚糖产物合成。因此只有其中整合的pK18mobsacB-rpsL-1545由于第二次重组已经被切除的那些克隆在LB琼脂上生长。根据第二次重组相对于突变位点的位置，等位基因置换或突变的掺入随切除而发生，或者原始拷贝保留在宿主染色体中。

对大约40-50个菌落测试表型“在存在蔗糖情况下生长”和“在存在卡那霉素的情况下不生长”。在显示出表型“在存在蔗糖情况下生长”和“在存在卡那霉素的情况下不生长”的4个菌落中，通过GATCBiotech AG(Constance，德国)，从测序引物rL-1(SEQ ID NO：14)开始对跨越rpsL-1545突变的rpsL基因区域进行测序，以证实rpsL-1545等位基因突变存在于染色体中。通过GATC合成为此所用引物rL-1：

rL-1(SEQ ID NO：14)

5’atg agg ttg tcc gtg aca tg 3’

以此方式鉴别一个克隆，其在rpsL基因的编码区(CDS)第128位含有碱基鸟嘌呤，并因此具有rpsL-1545等位基因。这个克隆称为菌株DSM5715_rpsL-1545。

实施例5：制备赖氨酸

将实施例4中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715∷pK18mobsacB_rpsL-1545和DSM5715rpsL-1545在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。

首先，在33℃将菌株在琼脂板上温育24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是MM培养基。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物24小时。在每种情况中，从这些预培养物中接种主培养物，由此主培养物的起始光密度(波长660nm)为0.1。培养基MM也用作主培养物。

培养基MM：

CSL 5g/l

MOPS 20g/l

葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l

(NH₄)₂SO₄ 25g/l

KH₂PO₄ 0.1g/l

MgSO₄·7H₂O 1.0g/l

CaCl₂·2H₂O 10mg/l

FeSO4·7H₂O 10mg/l

MnSO₄·H₂O 5.0mg/l

生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l

硫胺素·HCl(过滤灭菌) 0.2mg/l

L-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/l

CaCO₃ 25g/l

用氨水将CSL(玉米浆)，MOPS(吗啉代丙磺酸)和所述盐溶液的pH调节为7，并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，以及在干燥状态下高压灭菌的CaCO₃。

在具有挡板的100ml锥形瓶中以10ml体积进行培养。在33℃和80％湿度下进行培养。

72小时后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长下测定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。

实验结果示于表1。

表1

菌株	OD(660nm)	盐酸赖氨酸g/l
菌株	OD(660nm)	盐酸赖氨酸g/l	DAM5715	8.2	13.57
DSM5715∷pK18mobsacB_rpsL-1545	9.2	15.28	DAM5715	8.2	13.57
DSM5715∷pK18mobsacB_rpsL-1545	9.2	15.28	DSM5715rpsL-1545	7.9	14.74

序列表

<110>德古萨股份公司

<120>编码rpsL基因的核苷酸序列

<130>DEDEG0199

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1775

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>CDS

<222>(500)..(880)

<223>rpsL野生型基因

<400>1

cagctctaca agagtgtcta agtggcgggc attccatgct ttggaggagc gatcttcaaa 60

ttcctccaaa gtgagttgac ctcgggaaac agctgcagaa agttcatcca cgacttggtt 120

tcggttaagg tcagtggcga gcttctttgc tggttcgttt ccttgaggaa cagtcatggg 180

aaccattcta acaagggatt tggtgttttc tgcggctagc tgataatgtg aacggctgag 240

tcccactctt gtagttggga attgacggca cctcgcactc aagcgcggta tcgcccctgg 300

ttttccggga cgcggtggcg catgtttgca tttgatgagg ttgtccgtga catgtttggt 360

cgggccccaa aaagagcccc cttttttgcg tgtctggaca ctttttcaaa tccttcgcca 420

tcgacaagct cagccttcgt gttcgtcccc cgggcgtcac gtcagcagtt aaagaacaac 480

tccgaaataa ggatggttc atg cca act att cag cag ctg gtc cgt aag ggc 532

Met Pro Thr Ile Gln Gln Leu Val Arg Lys Gly

1 5 10

cgc cac gat aag tcc gcc aag gtg gct acc gcg gca ctg aag ggt tcc 580

Arg His Asp Lys Ser Ala Lys Val Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser

15 20 25

cct cag cgt cgt ggc gta tgc acc cgt gtg tac acc acc acc cct aag 628

Pro Gln Arg Arg Gly Val Cys Thr Arg Val Tyr Thr Thr Thr Pro Lys

30 35 40

aag cct aac tct gct ctt cgt aag gtc gct cgt gtg cgc ctt acc tcc 676

Lys Pro Asn Ser Ala Leu Arg Lys Val Ala Arg Val Arg Leu Thr Ser

45 50 55

ggc atc gag gtt tcc gct tac atc cct ggt gag ggc cac aac ctg cag 724

Gly Ile Glu Val Ser Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gln

60 65 70 75

gag cac tcc atg gtg ctc gtt cgc ggt ggt cgt gtt aag gac ctc cca 772

Glu His Ser Met Val Leu Val Arg Gly Gly Arg Val Lys Asp Leu Pro

80 85 90

ggt gtc cgt tac aag atc gtc cgt ggc gca ctg gat acc cag ggt gtt 820

Gly Val Arg Tyr Lys Ile Val Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gln Gly Val

95 100 105

aag gac cgc aag cag gct cgt tcc ccg cta cgg cgc gaa gag ggg ata 868

Lys Asp Arg Lys Gln Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile

110 115 120

att aaa aat gcg taaatcagca gctcctaagc gtccagtagt tcaggaccct 920

Ile Lys Asn Ala

125

gtatacaagt ccgagctcgt tacccagctc gtaaacaaga tcctcatcgg tggcaagaag 980

tccaccgcag agcgcatcgt ctacggtgca ctcgagatct gccgtgagaa gaccggcacc 1040

gatccagtag gaaccctcga gaaggctctc ggcaacgtgc gtccagacct cgaagttcgt 1100

tcccgccgtg ttggtggcgc tacctaccag gtgccagtgg atgttcgccc agagcgcgca 1160

aacaccctcg cactgcgttg gttggtaacc ttcacccgtc agcgtcgtga gaacaccatg 1220

atcgagcgtc ttgcaaacga acttctggat gcagccaacg gccttggcgc ttccgtgaag 1280

cgtcgcgaag acacccacaa gatggcagag gccaaccgcg ccttcgctca ctaccgctgg 1340

tagtactgcc aagacatgaa agcccaatca cctttaagat caacgcctgc cggcgccctt 1400

cacatttgaa taagctggca gcctgcgttt cttcaaggcg actgggcttt tagtctcatt 1460

aatgcagttc accgctgtaa gatagctaaa tagaaacact gtttcggcag tgtgttacta 1520

aaaaatccat gtcacttgcc tcgagcgtgc tgcttgaatc gcaagttagt ggcaaaatgt 1580

aacaagagaa ttatccgtag gtgacaaact ttttaatact tgggtatctg tcatggatac 1640

cccggtaata aataagtgaa ttaccgtaac caacaagttg gggtaccact gtggcacaag 1700

aagtgcttaa ggatctaaac aaggtccgca acatcggcat catggcgcac atcgatgctg 1760

gtaagaccac gacca 1775

<210>2

<211>127

<212>PRT

<213>Corynebacterium glutamicum

<400>2

Met Pro Thr Ile Gln Gln Leu Val Arg Lys Gly Arg His Asp Lys Ser

1 5 10 15

Ala Lys Val Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser Pro Gln Arg Arg Gly

20 25 30

Val Cys Thr Arg Val Tyr Thr Thr Thr Pro Lys Lys Pro Asn Ser Ala

35 40 45

Leu Arg Lys Val Ala Arg Val Arg Leu Thr Ser Gly Ile Glu Val Ser

50 55 60

Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gln Glu His Ser Met Val

65 70 75 80

Leu Val Arg Gly Gly Arg Val Lys Asp Leu Pro Gly Val Arg Tyr Lys

85 90 95

Ile Val Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gln Gly Val Lys Asp Arg Lys Gln

100 105 110

Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile Ile Lys Asn Ala

115 120 125

<210>3

<211>1775

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>CDS

<222>(500)..(880)

<223>rpsL-1545等位基因

<220>

<221>mutation

<222>(627)..(627)

<223>腺嘌呤交换为鸟嘌呤

<400>3

cagctctaca agagtgtcta agtggcgggc attccatgct ttggaggagc gatcttcaaa 60

ttcctccaaa gtgagttgac ctcgggaaac agctgcagaa agttcatcca cgacttggtt 120

tcggttaagg tcagtggcga gcttctttgc tggttcgttt ccttgaggaa cagtcatggg 180

aaccattcta acaagggatt tggtgttttc tgcggctagc tgataatgtg aacggctgag 240

tcccactctt gtagttggga attgacggca cctcgcactc aagcgcggta tcgcccctgg 300

ttttccggga cgcggtggcg catgtttgca tttgatgagg ttgtccgtga catgtttggt 360

cgggccccaa aaagagcccc cttttttgcg tgtctggaca ctttttcaaa tccttcgcca 420

tcgacaagct cagccttcgt gttcgtcccc cgggcgtcac gtcagcagtt aaagaacaac 480

tccgaaataa ggatggttc atg cca act att cag cag ctg gtc cgt aag ggc 532

Met Pro Thr Ile Gln Gln Leu Val Arg Lys Gly

1 5 10

cgc cac gat aag tcc gcc aag gtg gct acc gcg gca ctg aag ggt tcc 580

Arg His Asp Lys Ser Ala Lys Val Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser

15 20 25

cct cag cgt cgt ggc gta tgc acc cgt gtg tac acc acc acc cct agg 628

Pro Gln Arg Arg Gly Val Cys Thr Arg Val Tyr Thr Thr Thr Pro Arg

30 35 40

aag cct aac tct gct ctt cgt aag gtc gct cgt gtg cgc ctt acc tcc 676

Lys Pro Asn Ser Ala Leu Arg Lys Val Ala Arg Val Arg Leu Thr Ser

45 50 55

ggc atc gag gtt tcc gct tac atc cct ggt gag ggc cac aac ctg cag 724

Gly Ile Glu Val Ser Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gln

60 65 70 75

gag cac tcc atg gtg ctc gtt cgc ggt ggt cgt gtt aag gac ctc cca 772

Glu His Ser Met Val Leu Val Arg Gly Gly Arg Val Lys Asp Leu Pro

80 85 90

ggt gtc cgt tac aag atc gtc cgt ggc gca ctg gat acc cag ggt gtt 820

Gly Val Arg Tyr Lys Ile Val Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gln Gly Val

95 100 105

aag gac cgc aag cag gct cgt tcc ccg cta cgg cgc gaa gag ggg ata 868

Lys Asp Arg Lys Gln Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile

110 115 120

att aaa aat gcg taaatcagca gctcctaagc gtccagtagt tcaggaccct 920

Ile Lys Asn Ala

125

gtatacaagt ccgagctcgt tacccagctc gtaaacaaga tcctcatcgg tggcaagaag 980

tccaccgcag agcgcatcgt ctacggtgca ctcgagatct gccgtgagaa gaccggcacc 1040

gatccagtag gaaccctcga gaaggctctc ggcaacgtgc gtccagacct cgaagttcgt 1100

tcccgccgtg ttggtggcgc tacctaccag gtgccagtgg atgttcgccc agagcgcgca 1160

aacaccctcg cactgcgttg gttggtaacc ttcacccgtc agcgtcgtga gaacaccatg 1220

atcgagcgtc ttgcaaacga acttctggat gcagccaacg gccttggcgc ttccgtgaag 1280

cgtcgcgaag acacccacaa gatggcagag gccaaccgcg ccttcgctca ctaccgctgg 1340

tagtactgcc aagacatgaa agcccaatca cctttaagat caacgcctgc cggcgccctt 1400

cacatttgaa taagctggca gcctgcgttt cttcaaggcg actgggcttt tagtctcatt 1460

aatgcagttc accgctgtaa gatagctaaa tagaaacact gtttcggcag tgtgttacta 1520

aaaaatccat gtcacttgcc tcgagcgtgc tgcttgaatc gcaagttagt ggcaaaatgt 1580

aacaagagaa ttatccgtag gtgacaaact ttttaatact tgggtatctg tcatggatac 1640

cccggtaata aataagtgaa ttaccgtaac caacaagttg gggtaccact gtggcacaag 1700

aagtgcttaa ggatctaaac aaggtccgca acatcggcat catggcgcac atcgatgctg 1760

gtaagaccac gacca 1775

<210>4

<211>127

<212>PRT

<213>Corynebacterium glutamicum

<400>4

Met Pro Thr Ile Gln Gln Leu Val Arg Lys Gly Arg His Asp Lys Ser

1 5 10 15

Ala Lys Val Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser Pro Gln Arg Arg Gly

20 25 30

Val Cys Thr Arg Val Tyr Thr Thr Thr Pro Arg Lys Pro Asn Ser Ala

35 40 45

Leu Arg Lys Val Ala Arg Val Arg Leu Thr Ser Gly Ile Glu Val Ser

50 55 60

Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gln Glu His Ser Met Val

65 70 75 80

Leu Val Arg Gly Gly Arg Val Lys Asp Leu Pro Gly Val Arg Tyr Lys

85 90 95

Ile Val Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gln Gly Val Lys Asp Arg Lys Gln

100 105 110

Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile Ile Lys Asn Ala

115 120 125

<210>5

<211>5099

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>CDS

<222>(702)..(4196)

<223>rpoB基因

<400>5

acaatgtgac tcgtgatttt tgggtggatc agcgtaccgg tttggttgtc gatctagctg 60

aaaatattga tgatttttac ggcgaccgca gcggccagaa gtacgaacag aaattgcttt 120

tcgacgcctc cctcgacgat gcagctgtct ctaagctggt tgcacaggcc gaaagcatcc 180

ctgatggaga tgtgagcaaa atcgcaaata ccgtaggtat tgtgatcggt gcggtattgg 240

ctctcgtggg cctggccggg tgttttgggg cgtttgggaa gaaacgtcga gaagcttaac 300

ctgctgttca aatagatttt ccctgtttcg aattgcggaa accccgggtt tgtttgctag 360

ggtgcctcgt agaaggggtc aagaagattt ctgggaaacg cgcccgtgcg gttggttgct 420

aatagcacgc ggagcaccag atgaaaaatc tcccctttac tttcgcgcgc gattggtata 480

ctctgagtcg ttgcgttgga attcgtgact ctttttcgtt cctgtagcgc caagaccttg 540

atcaaggtgg tttaaaaaaa ccgatttgac aaggtcattc agtgctatct ggagtcgttc 600

agggggatcg ggttcctcag cagaccaatt gctcaaaaat accagcggtg ttgatctgca 660

cttaatggcc ttgaccagcc aggtgcaatt acccgcgtga g gtg ctg gaa gga ccc 716

Met Leu Glu Gly Pro

1 5

atc ttg gca gtc tcc cgc cag acc aag tca gtc gtc gat att ccc ggt 764

Ile Leu Ala Val Ser Arg Gln Thr Lys Ser Val Val Asp Ile Pro Gly

10 15 20

gca ccg cag cgt tat tct ttc gcg aag gtg tcc gca ccc att gag gtg 812

Ala Pro Gln Arg Tyr Ser Phe Ala Lys Val Ser Ala Pro Ile Glu Val

25 30 35

ccc ggg cta cta gat ctt caa ctg gat tct tac tcc tgg ctg att ggt 860

Pro Gly Leu Leu Asp Leu Gln Leu Asp Ser Tyr Ser Trp Leu Ile Gly

40 45 50

acg cct gag tgg cgt gct cgt cag aag gaa gaa ttc ggc gag gga gcc 908

Thr Pro Glu Trp Arg Ala Arg Gln Lys Glu Glu Phe Gly Glu Gly Ala

55 60 65

cgc gta acc agc ggc ctt gag aac att ctc gag gag ctc tcc cca atc 956

Arg Val Thr Ser Gly Leu Glu Asn Ile Leu Glu Glu Leu Ser Pro Ile

70 75 80 85

cag gat tac tct gga aac atg tcc ctg agc ctt tcg gag cca cgc ttc 1004

Gln Asp Tyr Ser Gly Asn Met Ser Leu Ser Leu Ser Glu Pro Arg Phe

90 95 100

gaa gac gtc aag aac acc att gac gag gcg aaa gaa aag gac atc aac 1052

Glu Asp Val Lys Asn Thr Ile Asp Glu Ala Lys Glu Lys Asp Ile Asn

105 110 115

tac gcg gcg cca ctg tat gtg acc gcg gag ttc gtc aac aac acc acc 1100

Tyr Ala Ala Pro Leu Tyr Val Thr Ala Glu Phe Val Asn Asn Thr Thr

120 125 130

ggt gaa atc aag tct cag act gtc ttc atc ggc gat ttc cca atg atg 1148

Gly Glu Ile Lys Ser Gln Thr Val Phe Ile Gly Asp Phe Pro Met Met

135 140 145

acg gac aag gga acg ttc atc atc aac gga acc gaa cgc gtt gtg gtc 1196

Thr Asp Lys Gly Thr Phe Ile Ile Asn Gly Thr Glu Arg Val Val Val

150 155 160 165

agc cag ctc gtc cgc tcc ccg ggc gtg tac ttt gac cag acc atc gat 1244

Ser Gln Leu Val Arg Ser Pro Gly Val Tyr Phe Asp Gln Thr Ile Asp

170 175 180

aag tca act gag cgt cca ctg cac gcc gtg aag gtt att cct tcc cgt 1292

Lys Ser Thr Glu Arg Pro Leu His Ala Val Lys Val Ile Pro Ser Arg

185 190 195

ggt gct tgg ctt gag ttt gac gtc gat aag cgc gat tcg gtt ggt gtt 1340

Gly Ala Trp Leu Glu Phe Asp Val Asp Lys Arg Asp Ser Val Gly Val

200 205 210

cgt att gac cgc aag cgt cgc cag cca gtc acc gta ctg ctg aag gct 1388

Arg Ile Asp Arg Lys Arg Arg Gln Pro Val Thr Val Leu Leu Lys Ala

215 220 225

ctt ggc tgg acc act gag cag atc acc gag cgt ttc ggt ttc tct gaa 1436

Leu Gly Trp Thr Thr Glu Gln Ile Thr Glu Arg Phe Gly Phe Ser Glu

230 235 240 245

atc atg atg tcc acc ctc gag tcc gat ggt gta gca aac acc gat gag 1484

Ile Met Met Ser Thr Leu Glu Ser Asp Gly Val Ala Asn Thr Asp Glu

250 255 260

gca ttg ctg gag atc tac cgc aag cag cgt cca ggc gag cag cct acc 1532

Ala Leu Leu Glu Ile Tyr Arg Lys Gln Arg Pro Gly Glu Gln Pro Thr

265 270 275

cgc gac ctt gcg cag tcc ctc ctg gac aac agc ttc ttc cgt gca aag 1580

Arg Asp Leu Ala Gln Ser Leu Leu Asp Asn Ser Phe Phe Arg Ala Lys

280 285 290

cgc tac gac ctg gct cgc gtt ggt cgt tac aag atc aac cgc aag ctc 1628

Arg Tyr Asp Leu Ala Arg Val Gly Arg Tyr Lys Ile Asn Arg Lys Leu

295 300 305

ggc ctt ggt ggc gac cac gat ggt ttg atg act ctt act gaa gag gac 1676

Gly Leu Gly Gly Asp His Asp Gly Leu Met Thr Leu Thr Glu Glu Asp

310 315 320 325

atc gca acc acc atc gag tac ctg gtg cgt ctg cac gca ggt gag cgc 1724

Ile Ala Thr Thr Ile Glu Tyr Leu Val Arg Leu His Ala Gly Glu Arg

330 335 340

gtc atg act tct cca aat ggt gaa gag atc cca gtc gag acc gat gac 1772

Val Met Thr Ser Pro Asn Gly Glu Glu Ile Pro Val Glu Thr Asp Asp

345 350 355

atc gac cac ttt ggt aac cgt cgt ctg cgt acc gtt ggc gaa ctg atc 1820

Ile Asp His Phe Gly Asn Arg Arg Leu Arg Thr Val Gly Glu Leu Ile

360 365 370

cag aac cag gtc cgt gtc ggc ctg tcc cgc atg gag cgc gtt gtt cgt 1868

Gln Asn Gln Val Arg Val Gly Leu Ser Arg Met Glu Arg Val Val Arg

375 380 385

gag cat atg acc acc cag gat gcg gag tcc att act cct act tcc ttg 1916

Glu Arg Met Thr Thr Gln Asp Ala Glu Ser Ile Thr Pro Thr Ser Leu

390 395 400 405

atc aac gtt cgt cct gtc tct gca gct atc cgt gag ttc ttc gga act 1964

Ile Asn Val Arg Pro Val Ser Ala Ala Ile Arg Glu Phe Phe Gly Thr

410 415 420

tcc cag ctg tct cag ttc atg gtc cag aac aac tcc ctg tct ggt ttg 2012

Ser Gln Leu Ser Gln Phe Met Val Gln Asn Asn Ser Leu Ser Gly Leu

425 430 435

act cac aag cgt cgt ctg tcg gct ctg ggc ccg ggt ggt ctg tcc cgt 2060

Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu Gly Pro Gly Gly Leu Ser Arg

440 445 450

gag cgc gcc ggc atc gag gtt cga gac gtt cac cca tct cac tac ggc 2108

Glu Arg Ala Gly Ile Glu Val Arg Asp Val His Pro Ser His Tyr Gly

455 460 465

cgt atg tgc cca att gag act ccg gaa ggt cca aac att ggc ctg atc 2156

Arg Met Cys Pro Ile Glu Thr Pro Glu Gly Pro Asn Ile Gly Leu Ile

470 475 480 485

ggt tcc ttg gct tcc tat gct cga gtg aac cca ttc ggt ttc att gag 2204

Gly Ser Leu Ala Ser Tyr Ala Arg Val Asn Pro Phe Gly Phe Ile Glu

490 495 500

acc cca tac cgt cgc atc atc gac ggc aag ctg acc gac cag att gac 2252

Thr Pro Tyr Arg Arg Ile Ile Asp Gly Lys Leu Thr Asp Gln Ile Asp

505 510 515

tac ctt acc gct gat gag gaa gac cgc ttc gtt gtt gcg cag gca aac 2300

Tyr Leu Thr Ala Asp Glu Glu Asp Arg Phe Val Val Ala Gln Ala Asn

520 525 530

acg cac tac gac gaa gag ggc aac atc acc gat gag acc gtc act gtt 2348

Thr His Tyr Asp Glu Glu Gly Asn Ile Thr Asp Glu Thr Val Thr Val

535 540 545

cgt ctg aag gac ggc gac atc gcc atg gtt ggc cgc aac gcg gtt gat 2396

Arg Leu Lys Asp Gly Asp Ile Ala Met Val Gly Arg Asn Ala Val Asp

550 555 560 565

tac atg gac gtt tcc cct cgt cag atg gtt tct gtt ggt acc gcg atg 2444

Tyr Met Asp Val Ser Pro Arg Gln Met Val Ser Val Gly Thr Ala Met

570 575 580

att cca ttc ctg gag cac gac gat gct aac cgt gca ctg atg ggc gcg 2492

Ile Pro Phe Leu Glu His Asp Asp Ala Asn Arg Ala Leu Met Gly Ala

585 590 595

aac atg cag aag cag gct gtg cca ctg att cgt gcc gag gct cct ttc 2540

Asn Met Gln Lys Gln Ala Val Pro Leu Ile Arg Ala Glu Ala Pro Phe

600 605 610

gtg ggc acc ggt atg gag cag cgc gca gca tac gac gcc ggc gac ctg 2588

Val Gly Thr Gly Met Glu Gln Arg Ala Ala Tyr Asp Ala Gly Asp Leu

615 620 625

gtt att acc cca gtc gca ggt gtg gtg gaa aac gtt tca gct gac ttc 2636

Val Ile Thr Pro Val Ala Gly Val Val Glu Asn Val Ser Ala Asp Phe

630 635 640 645

atc acc atc atg gct gat gac ggc aag cgc gaa acc tac ctg ctg cgt 2684

Ile Thr Ile Met Ala Asp Asp Gly Lys Arg Glu Thr Tyr Leu Leu Arg

650 655 660

aag ttc cag cgc acc aac cag ggc acc agc tac aac cag aag cct ttg 2732

Lys Phe Gln Arg Thr Asn Gln Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Pro Leu

665 670 675

gtt aac ttg ggc gag cgc gtt gaa gct ggc cag gtt att gct gat ggt 2780

Val Asn Leu Gly Glu Arg Val Glu Ala Gly Gln Val Ile Ala Asp Gly

680 685 690

cca ggt acc ttc aat ggt gaa atg tcc ctt ggc cgt aac ctt ctg gtt 2828

Pro Gly Thr Phe Asn Gly Glu Met Ser Leu Gly Arg Asn Leu Leu Val

695 700 705

gcg ttc atg cct tgg gaa ggc cac aac tac gag gat gcg atc atc ctc 2876

Ala Phe Met Pro Trp Glu Gly His Asn Tyr Glu Asp Ala Ile Ile Leu

710 715 720 725

aac cag aac atc gtt gag cag gac atc ttg acc tcg atc cac atc gag 2924

Asn Gln Asn Ile Val Glu Gln Asp Ile Leu Thr Ser Ile His Ile Glu

730 735 740

gag cac gag atc gat gcc cgc gac act aag ctt ggc gcc gaa gaa atc 2972

Glu His Glu Ile Asp Ala Arg Asp Thr Lys Leu Gly Ala Glu Glu Ile

745 750 755

acc cgc gac atc cct aat gtg tct gaa gaa gtc ctc aag gac ctc gac 3020

Thr Arg Asp Ile Pro Asn Val Ser Glu Glu Val Leu Lys Asp Leu Asp

760 765 770

gac cgc ggt att gtc cgc atc ggt gct gat gtt cgt gac ggc gac atc 3068

Asp Arg Gly Ile Val Arg Ile Gly Ala Asp Val Arg Asp Gly Asp Ile

775 780 785

ctg gtc ggt aag gtc acc cct aag ggc gag acc gag ctc acc ccg gaa 3116

Leu Val Gly Lys Val Thr Pro Lys Gly Glu Thr Glu Leu Thr Pro Glu

790 795 800 805

gag cgc ttg ctg cgc gca atc ttc ggt gag aag gcc cgc gaa gtt cgc 3164

Glu Arg Leu Leu Arg Ala Ile Phe Gly Glu Lys Ala Arg Glu Val Arg

810 815 820

gat acc tcc atg aag gtg cct cac ggt gag acc ggc aag gtc atc ggc 3212

Asp Thr Ser Met Lys Val Pro His Gly Glu Thr Gly Lys Val Ile Gly

825 830 835

gtg cgt cac ttc tcc cgc gag gac gac gac gat ctg gct cct ggc gtc 3260

Val Arg His Phe Ser Arg Glu Asp Asp Asp Asp Leu Ala Pro Gly Val

840 845 850

aac gag atg atc cgt atc tac gtt gct cag aag cgt aag atc cag gac 3308

Asn Glu Met Ile Arg Ile Tyr Val Ala Gln Lys Arg Lys Ile Gln Asp

855 860 865

ggc gat aag ctc gct ggc cgc cac ggt aac aag ggt gtt gtc ggt aaa 3356

Gly Asp Lys Leu Ala Gly Arg His Gly Asn Lys Gly Val Val Gly Lys

870 875 880 885

att ttg cct cag gaa gat atg cca ttc ctt cca gac ggc act cct gtt 3404

Ile Leu Pro Gln Glu Asp Met Pro Phe Leu Pro Asp Gly Thr Pro Val

890 895 900

gac atc atc ttg aac acc cac ggt gtt cca cgt cgt atg aac att ggt 3452

Asp Ile Ile Leu Asn Thr His Gly Val Pro Arg Arg Met Asn Ile Gly

905 910 915

cag gtt ctt gag acc cac ctt ggc tgg ctg gca tct gct ggt tgg tcc 3500

Gln Val Leu Glu Thr His Leu Gly Trp Leu Ala Ser Ala Gly Trp Ser

920 925 930

gtg gat cct gaa gat cct gag aac gct gag ctc gtc aag act ctg cct 3548

Val Asp Pro Glu Asp Pro Glu Asn Ala Glu Leu Val Lys Thr Leu Pro

935 940 945

gca gac ctc ctc gag gtt cct gct ggt tcc ttg act gca act cct gtg 3596

Ala Asp Leu Leu Glu Val Pro Ala Gly Ser Leu Thr Ala Thr Pro Val

950 955 960 965

ttc gac ggt gcg tca aac gaa gag ctc gca ggc ctg ctc gct aat tca 3644

Phe Asp Gly Ala Ser Asn Glu Glu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Asn Ser

970 975 980

cgt cca aac cgc gac ggc gac gtc atg gtt aac gcg gat ggt aaa gca 3692

Arg Pro Asn Arg Asp Gly Asp Val Met Val Asn Ala Asp Gly Lys Ala

985 990 995

acg ctt atc gac ggt cgc tcc ggt gag cct tac ccg tac ccg gtt 3737

Thr Leu Ile Asp Gly Arg Ser Gly Glu Pro Tyr Pro Tyr Pro Val

1000 1005 1010

tcc atc ggc tac atg tac atg ctg aag ctg cac cac ctc gtt gac 3782

Ser Ile Gly Tyr Met Tyr Met Leu Lys Leu His His Leu Val Asp

1015 1020 1025

gag aag atc cac gca cgt tcc act ggt cct tac tcc atg att acc 3827

Glu Lys Ile His Ala Arg Ser Thr Gly Pro Tyr Ser Met Ile Thr

1030 1035 1040

cag cag cca ctg ggt ggt aaa gca cag ttc ggt gga cag cgt ttc 3872

Gln Gln Pro Leu Gly Gly Lys Ala Gln Phe Gly Gly Gln Arg Phe

1045 1050 1055

ggc gaa atg gag gtg tgg gca atg cag gca tac ggc gct gcc tac 3917

Gly Glu Met Glu Val Trp Ala Met Gln Ala Tyr Gly Ala Ala Tyr

1060 1065 1070

aca ctt cag gag ctg ctg acc atc aag tct gat gac gtg gtt ggc 3962

Thr Leu Gln Glu Leu Leu Thr Ile Lys Ser Asp Asp Val Val Gly

1075 1080 1085

cgt gtc aag gtc tac gaa gca att gtg aag ggc gag aac atc ccg 4007

Arg Val Lys Val Tyr Glu Ala Ile Val Lys Gly Glu Asn Ile Pro

1090 1095 1100

gat cca ggt att cct gag tcc ttc aag gtt ctc ctc aag gag ctc 4052

Asp Pro Gly Ile Pro Glu Ser Phe Lys Val Leu Leu Lys Glu Leu

1105 1110 1115

cag tcc ttg tgc ctg aac gtg gag gtt ctc tcc gca gac ggc act 4097

Gln Ser Leu Cys Leu Asn Val Glu Val Leu Ser Ala Asp Gly Thr

1120 1125 1130

cca atg gag ctc gcg ggt gac gac gac gac ttc gat cag gca ggc 4142

Pro Met Glu Leu Ala Gly Asp Asp Asp Asp Phe Asp Gln Ala Gly

1135 1140 1145

gcc tca ctt ggc atc aac ctg tcc cgt gac gag cgt tcc gac gcc 4187

Ala Ser Leu Gly Ile Asn Leu Ser Arg Asp Glu Arg Ser Asp Ala

1150 1155 1160

gac acc gca tagcagatca gaaaacaacc gctagaaatc aagccataca 4236

Asp Thr Ala

1165

tcccccggac attgaagaga tgttctgggg ggaaagggag ttttacgtgc tcgacgtaaa 4296

cgtcttcgat gagctccgca tcggcctggc caccgccgac gacatccgcc gttggtccaa 4356

gggtgaggtc aagaagccgg agaccatcaa ctaccgaacc ctcaagcctg agaaggacgg 4416

tctgttctgc gagcgtatct tcggtccaac tcgcgactgg gagtgcgcct gcggtaagta 4476

caagcgtgtc cgctacaagg gcatcatctg tgaacgctgt ggcgttgagg tcaccaagtc 4536

caaggtgcgc cgtgagcgca tgggacacat tgagctcgct gcaccagtaa cccacatttg 4596

gtacttcaag ggcgttccat cacgcctcgg ctaccttttg gaccttgctc caaaggacct 4656

ggacctcatc atctacttcg gtgcgaacat catcaccagc gtggacgaag aggctcgcca 4716

cagcgaccag accactcttg aggcagaaat gcttctggag aagaaggacg ttgaggcaga 4776

cgcagagtct gacattgctg agcgtgctga aaagctcgaa gaggatcttg ctgaacttga 4836

ggcagctggc gctaaggccg acgctcgccg caaggttcag gctgctgccg ataaggaaat 4896

gcagcacatc cgtgagcgtg cacagcgcga aatcgatcgt ctcgatgagg tctggcagac 4956

cttcatcaag cttgctccaa agcagatgat ccgcgatgag aagctctacg atgaactgat 5016

cgaccgctac gaggattact tcaccggtgg tatgggtgca gagtccattg aggctttgat 5076

ccagaacttc gaccttgatg ctg 5099

<210>6

<211>1165

<212>PRT

<213>Corynebacterium glutamicum

<400>6

Met Leu Glu Gly Pro Ile Leu Ala Val Ser Arg Gln Thr Lys Ser Val

1 5 10 15

Val Asp Ile Pro Gly Ala Pro Gln Arg Tyr Ser Phe Ala Lys Val Ser

20 25 30

Ala Pro Ile Glu Val Pro Gly Leu Leu Asp Leu Gln Leu Asp Ser Tyr

35 40 45

Ser Trp Leu Ile Gly Thr Pro Glu Trp Arg Ala Arg Gln Lys Glu Glu

50 55 60

Phe Gly Glu Gly Ala Arg Val Thr Ser Gly Leu Glu Asn Ile Leu Glu

65 70 75 80

Glu Leu Ser Pro Ile Gln Asp Tyr Ser Gly Asn Met Ser Leu Ser Leu

85 90 95

Ser Glu Pro Arg Phe Glu Asp Val Lys Asn Thr Ile Asp Glu Ala Lys

100 105 110

Glu Lys Asp Ile Asn Tyr Ala Ala Pro Leu Tyr Val Thr Ala Glu Phe

115 120 125

Val Asn Asn Thr Thr Gly Glu Ile Lys Ser Gln Thr Val Phe Ile Gly

130 135 140

Asp Phe Pro Met Met Thr Asp Lys Gly Thr Phe Ile Ile Asn Gly Thr

145 150 155 160

Glu Arg Val Val Val Ser Gln Leu Val Arg Ser Pro Gly Val Tyr Phe

165 170 175

Asp Gln Thr Ile Asp Lys Ser Thr Glu Arg Pro Leu His Ala Val Lys

180 185 190

Val Ile Pro Ser Arg Gly Ala Trp Leu Glu Phe Asp Val Asp Lys Arg

195 200 205

Asp Ser Val Gly Val Arg Ile Asp Arg Lys Arg Arg Gln Pro Val Thr

210 215 220

Val Leu Leu Lys Ala Leu Gly Trp Thr Thr Glu Gln Ile Thr Glu Arg

225 230 235 240

Phe Gly Phe Ser Glu Ile Met Met Ser Thr Leu Glu Ser Asp Gly Val

245 250 255

Ala Asn Thr Asp Glu Ala Leu Leu Glu Ile Tyr Arg Lys Gln Arg Pro

260 265 270

Gly Glu Gln Pro Thr Arg Asp Leu Ala Gln Ser Leu Leu Asp Asn Ser

275 280 285

Phe Phe Arg Ala Lys Arg Tyr Asp Leu Ala Arg Val Gly Arg Tyr Lys

290 295 300

Ile Asn Arg Lys Leu Gly Leu Gly Gly Asp His Asp Gly Leu Met Thr

305 310 315 320

Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ala Thr Thr Ile Glu Tyr Leu Val Arg Leu

325 330 335

His Ala Gly Glu Arg Val Met Thr Ser Pro Asn Gly Glu Glu Ile Pro

340 345 350

Val Glu Thr Asp Asp Ile Asp His Phe Gly Asn Arg Arg Leu Arg Thr

355 360 365

Val Gly Glu Leu Ile Gln Asn Gln Val Arg Val Gly Leu Ser Arg Met

370 375 380

Glu Arg Val Val Arg Glu Arg Met Thr Thr Gln Asp Ala Glu Ser Ile

385 390 395 400

Thr Pro Thr Ser Leu Ile Asn Val Arg Pro Val Ser Ala Ala Ile Arg

405 410 415

Glu Phe Phe Gly Thr Ser Gln Leu Ser Gln Phe Met Val Gln Asn Asn

420 425 430

Ser Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu Gly Pro

435 440 445

Gly Gly Leu Ser Arg Glu Arg Ala Gly Ile Glu Val Arg Asp Val His

450 455 460

Pro Ser His Tyr Gly Arg Met Cys Pro Ile Glu Thr Pro Glu Gly Pro

465 470 475 480

Asn Ile Gly Leu Ile Gly Ser Leu Ala Ser Tyr Ala Arg Val Asn Pro

485 490 495

Phe Gly Phe Ile Glu Thr Pro Tyr Arg Arg Ile Ile Asp Gly Lys Leu

500 505 510

Thr Asp Gln Ile Asp Tyr Leu Thr Ala Asp Glu Glu Asp Arg Phe Val

515 520 525

Val Ala Gln Ala Asn Thr His Tyr Asp Glu Glu Gly Asn Ile Thr Asp

530 535 540

Glu Thr Val Thr Val Arg Leu Lys Asp Gly Asp Ile Ala Met Val Gly

545 550 555 560

Arg Asn Ala Val Asp Tyr Met Asp Val Ser Pro Arg Gln Met Val Ser

565 570 575

Val Gly Thr Ala Met Ile Pro Phe Leu Glu His Asp Asp Ala Asn Arg

580 585 590

Ala Leu Met Gly Ala Asn Met Gln Lys Gln Ala Val Pro Leu Ile Arg

595 600 605

Ala Glu Ala Pro Phe Val Gly Thr Gly Met Glu Gln Arg Ala Ala Tyr

610 615 620

Asp Ala Gly Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Ala Gly Val Val Glu Asn

625 630 635 640

Val Ser Ala Asp Phe Ile Thr Ile Met Ala Asp Asp Gly Lys Arg Glu

645 650 655

Thr Tyr Leu Leu Arg Lys Phe Gln Arg Thr Asn Gln Gly Thr Ser Tyr

660 665 670

Asn Gln Lys Pro Leu Val Asn Leu Gly Glu Arg Val Glu Ala Gly Gln

675 680 685

Val Ile Ala Asp Gly Pro Gly Thr Phe Asn Gly Glu Met Ser Leu Gly

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Arg Asn Leu Leu Val Ala Phe Met Pro Trp Glu Gly His Asn Tyr Glu

705 710 715 720

Asp Ala Ile Ile Leu Asn Gln Asn Ile Val Glu Gln Asp Ile Leu Thr

725 730 735

Ser Ile His Ile Glu Glu His Glu Ile Asp Ala Arg Asp Thr Lys Leu

740 745 750

Gly Ala Glu Glu Ile Thr Arg Asp Ile Pro Asn Val Ser Glu Glu Val

755 760 765

Leu Lys Asp Leu Asp Asp Arg Gly Ile Val Arg Ile Gly Ala Asp Val

770 775 780

Arg Asp Gly Asp Ile Leu Val Gly Lys Val Thr Pro Lys Gly Glu Thr

785 790 795 800

Glu Leu Thr Pro Glu Glu Arg Leu Leu Arg Ala Ile Phe Gly Glu Lys

805 810 815

Ala Arg Glu Val Arg Asp Thr Ser Met Lys Val Pro His Gly Glu Thr

820 825 830

Gly Lys Val Ile Gly Val Arg His Phe Ser Arg Glu Asp Asp Asp Asp

835 840 845

Leu Ala Pro Gly Val Asn Glu Met Ile Arg Ile Tyr Val Ala Gln Lys

850 855 860

Arg Lys Ile Gln Asp Gly Asp Lys Leu Ala Gly Arg His Gly Asn Lys

865 870 875 880

Gly Val Val Gly Lys Ile Leu Pro Gln Glu Asp Met Pro Phe Leu Pro

885 890 895

Asp Gly Thr Pro Val Asp Ile Ile Leu Asn Thr His Gly Val Pro Arg

900 905 910

Arg Met Asn Ile Gly Gln Val Leu Glu Thr His Leu Gly Trp Leu Ala

915 920 925

Ser Ala Gly Trp Ser Val Asp Pro Glu Asp Pro Glu Asn Ala Glu Leu

930 935 940

Val Lys Thr Leu Pro Ala Asp Leu Leu Glu Val Pro Ala Gly Ser Leu

945 950 955 960

Thr Ala Thr Pro Val Phe Asp Gly Ala Ser Asn Glu Glu Leu Ala Gly

965 970 975

Leu Leu Ala Asn Ser Arg Pro Asn Arg Asp Gly Asp Val Met Val Asn

980 985 990

Ala Asp Gly Lys Ala Thr Leu Ile Asp Gly Arg Ser Gly Glu Pro Tyr

995 1000 1005

Pro Tyr Pro Val Ser Ile Gly Tyr Met Tyr Met Leu Lys Leu His

1010 1015 1020

His Leu Val Asp Glu Lys Ile His Ala Arg Ser Thr Gly Pro Tyr

1025 1030 1035

Ser Met Ile Thr Gln Gln Pro Leu Gly Gly Lys Ala Gln Phe Gly

1040 1045 1050

Gly Gln Arg Phe Gly Glu Met Glu Val Trp Ala Met Gln Ala Tyr

1055 1060 1065

Gly Ala Ala Tyr Thr Leu Gln Glu Leu Leu Thr Ile Lys Ser Asp

1070 1075 1080

Asp Val Val Gly Arg Val Lys Val Tyr Glu Ala Ile Val Lys Gly

1085 1090 1095

Glu Asn Ile Pro Asp Pro Gly Ile Pro Glu Ser Phe Lys Val Leu

1100 1105 1110

Leu Lys Glu Leu Gln Ser Leu Cys Leu Asn Val Glu Val Leu Ser

1115 1120 1125

Ala Asp Gly Thr Pro Met Glu Leu Ala Gly Asp Asp Asp Asp Phe

1130 1135 1140

Asp Gln Ala Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asn Leu Ser Arg Asp Glu

1145 1150 1155

Arg Ser Asp Ala Asp Thr Ala

1160 1165

<210>7

<211>151

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>misc_feature

<223>上游区

<400>7

ggttgccggt aatcctgttg cggacaatat ttacaggatc tgacacattg ggcatcgctg 60

ggggagtggt ctcgtaggcc gccggcgcat aggaggcgcc gggaaattgc tgaccaagca 120

gagtgtaggg attgtcgttc acatcagaga t 151

<210>8

<211>1926

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<400>8

ggttgccggt aatcctgttg cggacaatat ttacaggatc tgacacattg ggcatcgctg 60

ggggagtggt ctcgtaggcc gccggcgcat aggaggcgcc gggaaattgc tgaccaagca 120

gagtgtaggg attgtcgttc acatcagaga tcagctctac aagagtgtct aagtggcggg 180

cattccatgc tttggaggag cgatcttcaa attcctccaa agtgagttga cctcgggaaa 240

cagctgcaga aagttcatcc acgacttggt ttcggttaag gtcagtggcg agcttctttg 300

ctggttcgtt tccttgagga acagtcatgg gaaccattct aacaagggat ttggtgtttt 360

ctgcggctag ctgataatgt gaacggctga gtcccactct tgtagttggg aattgacggc 420

acctcgcact caagcgcggt atcgcccctg gttttccggg acgcggtggc gcatgtttgc 480

atttgatgag gttgtccgtg acatgtttgg tcgggcccca aaaagagccc ccttttttgc 540

gtgtctggac actttttcaa atccttcgcc atcgacaagc tcagccttcg tgttcgtccc 600

ccgggcgtca cgtcagcagt taaagaacaa ctccgaaata aggatggttc atgccaacta 660

ttcagcagct ggtccgtaag ggccgccacg ataagtccgc caaggtggct accgcggcac 720

tgaagggttc ccctcagcgt cgtggcgtat gcacccgtgt gtacaccacc acccctaaga 780

agcctaactc tgctcttcgt aaggtcgctc gtgtgcgcct tacctccggc atcgaggttt 840

ccgcttacat ccctggtgag ggccacaacc tgcaggagca ctccatggtg ctcgttcgcg 900

gtggtcgtgt taaggacctc ccaggtgtcc gttacaagat cgtccgtggc gcactggata 960

cccagggtgt taaggaccgc aagcaggctc gttccccgct acggcgcgaa gaggggataa 1020

ttaaaaatgc gtaaatcagc agctcctaag cgtccagtag ttcaggaccc tgtatacaag 1080

tccgagctcg ttacccagct cgtaaacaag atcctcatcg gtggcaagaa gtccaccgca 1140

gagcgcatcg tctacggtgc actcgagatc tgccgtgaga agaccggcac cgatccagta 1200

ggaaccctcg agaaggctct cggcaacgtg cgtccagacc tcgaagttcg ttcccgccgt 1260

gttggtggcg ctacctacca ggtgccagtg gatgttcgcc cagagcgcgc aaacaccctc 1320

gcactgcgtt ggttggtaac cttcacccgt cagcgtcgtg agaacaccat gatcgagcgt 1380

cttgcaaacg aacttctgga tgcagccaac ggccttggcg cttccgtgaa gcgtcgcgaa 1440

gacacccaca agatggcaga ggccaaccgc gccttcgctc actaccgctg gtagtactgc 1500

caagacatga aagcccaatc acctttaaga tcaacgcctg ccggcgccct tcacatttga 1560

ataagctggc agcctgcgtt tcttcaaggc gactgggctt ttagtctcat taatgcagtt 1620

caccgctgta agatagctaa atagaaacac tgtttcggca gtgtgttact aaaaaatcca 1680

tgtcacttgc ctcgagcgtg ctgcttgaat cgcaagttag tggcaaaatg taacaagaga 1740

attatccgta ggtgacaaac tttttaatac ttgggtatct gtcatggata ccccggtaat 1800

aaataagtga attaccgtaa ccaacaagtt ggggtaccac tgtggcacaa gaagtgctta 1860

aggatctaaa caaggtccgc aacatcggca tcatggcgca catcgatgct ggtaagacca 1920

cgacca 1926

<210>9

<211>1594

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1594)

<223>人工序列的描述：含有rpsL-1545等位基因的PcR产物

<220>

<221>allele

<222>(659)..(1039)

<223>rpsL-1545等位基因

<220>

<221>mutation

<222>(786)..(786)

<223>腺嘌呤交换为鸟嘌呤

gatctagagg ttgccggtaa tcctgttgcg gacaatattt acaggatctg acacattggg 60

catcgctggg ggagtggtct cgtaggccgc cggcgcatag gaggcgccgg gaaattgctg 120

accaagcaga gtgtagggat tgtcgttcac atcagagatc agctctacaa gagtgtctaa 180

gtggcgggca ttccatgctt tggaggagcg atcttcaaat tcctccaaag tgagttgacc 240

tcgggaaaca gctgcagaaa gttcatccac gacttggttt cggttaaggt cagtggcgag 300

cttctttgct ggttcgtttc cttgaggaac agtcatggga accattctaa caagggattt 360

ggtgttttct gcggctagct gataatgtga acggctgagt cccactcttg tagttgggaa 420

ttgacggcac ctcgcactca agcgcggtat cgcccctggt tttccgggac gcggtggcgc 480

atgtttgcat ttgatgaggt tgtccgtgac atgtttggtc gggccccaaa aagagccccc 540

ttttttgcgt gtctggacac tttttcaaat ccttcgccat cgacaagctc agccttcgtg 600

ttcgtccccc gggcgtcacg tcagcagtta aagaacaact ccgaaataag gatggttcat 660

gccaactatt cagcagctgg tccgtaaggg ccgccacgat aagtccgcca aggtggctac 720

cgcggcactg aagggttccc ctcagcgtcg tggcgtatgc acccgtgtgt acaccaccac 780

ccctaggaag cctaactctg ctcttcgtaa ggtcgctcgt gtgcgcctta cctccggcat 840

cgaggtttcc gcttacatcc ctggtgaggg ccacaacctg caggagcact ccatggtgct 900

cgttcgcggt ggtcgtgtta aggacctccc aggtgtccgt tacaagatcg tccgtggcgc 960

actggatacc cagggtgtta aggaccgcaa gcaggctcgt tccccgctac ggcgcgaaga 1020

ggggataatt aaaaatgcgt aaatcagcag ctcctaagcg tccagtagtt caggaccctg 1080

tatacaagtc cgagctcgtt acccagctcg taaacaagat cctcatcggt ggcaagaagt 1140

ccaccgcaga gcgcatcgtc tacggtgcac tcgagatctg ccgtgagaag accggcaccg 1200

atccagtagg aaccctcgag aaggctctcg gcaacgtgcg tccagacctc gaagttcgtt 1260

cccgccgtgt tggtggcgct acctaccagg tgccagtgga tgttcgccca gagcgcgcaa 1320

acaccctcgc actgcgttgg ttggtaacct tcacccgtca gcgtcgtgag aacaccatga 1380

tcgagcgtct tgcaaacgaa cttctggatg cagccaacgg ccttggcgct tccgtgaagc 1440

gtcgcgaaga cacccacaag atggcagagg ccaaccgcgc cttcgctcac taccgctggt 1500

agtactgcca agacatgaaa gcccaatcac ctttaagatc aacgcctgcc ggcgcccttc 1560

acatttgaat aagctggcag cctgcgtcta gatc 1594

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>引物

<222>(1)..(20)

<223>rpsL-1

<400>10

cagctctaca agagtgtcta 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>引物

<222>(1)..(20)

<223>rpsL-2

<400>11

tggtcgtggt cttaccagca 20

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<223>rpsL_XL-A1

<400>12

gatctagagg ttgccggtaa tcctgttg 28

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<223>rpsL_XL-E1

<400>13

gatctagacg caggctgcca gcttattc 28

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>引物

<222>(1)..(20)

<223>rL-1

<400>14

atgaggttgt ccgtgacatg 20

Claims

1、一种来自于棒状细菌的分离的多核苷酸，其由选自下列一组的编码rpsL基因的多核苷酸序列组成：

a)与编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列所组成的多肽的多核苷酸至少95％相同的多核苷酸，

b)编码由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列所组成的多肽的多核苷酸，和

c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，

所述多肽具有核糖体蛋白S12的活性。

2、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是一种能在棒状细菌中复制的重组DNA。

3、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。

4、权利要求2的多核苷酸，其由SEQ ID NO：1所示的核酸序列组成。

5、权利要求2的多核苷酸，其是能复制的DNA，所述多核苷酸选自：

(i)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，

(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或

(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，其中所述杂交在相当于最高2×SSC的严格条件下进行。

6、权利要求1的多核苷酸，其编码由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所组成的多肽。

7、一种棒状细菌，其含有如权利要求1的rpsL基因，该基因被过表达。

8、谷氨酸棒杆菌菌株DM1545，保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号DSM13992。

9、一种发酵制备L-赖氨酸的方法，该方法包括进行以下步骤：

a)发酵生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中至少如权利要求1的rpsL基因或编码其的核苷酸序列被过表达；

b)浓缩培养基或细菌细胞中的L-赖氨酸，及

c)分离L-赖氨酸。

10、权利要求9的方法，其中所述过表达通过用一质粒载体转化所述细菌而获得，且此质粒载体携带编码rpsL基因的权利要求1的核苷酸序列。

11、权利要求9的方法，其中为制备L-赖氨酸，发酵这样的棒状微生物，该微生物中选自以下一组的一或多种基因被同时过表达：

11.1编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因

11.2编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因

11.3编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因

11.4编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因

11.5编码葡糖6-磷酸脱氢酶的zwf基因

11.6编码丙酮酸羧化酶的pyc基因

11.7编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因

11.8编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因

11.9编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因

11.10编码Zwa1蛋白的zwa1基因

11.11编码RNA聚合酶B的rpoB基因。

12、权利要求9的方法，其中为制备L-赖氨酸，发酵这样的棒状微生物，该微生物菌中选自以下一组的一或多种基因被同时弱化：

12.1编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因

12.2编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因

12.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因

12.4编码Zwa2蛋白的zwa2基因。

13、一种棒状细菌，其含有一种携带有权利要求1的多核苷酸的载体。

14、权利要求9-12中任一项的方法，其中应用谷氨酸棒杆菌菌种的微生物。

15、一种揭示RNA，cDNA和DNA以分离核酸或多核苷酸或基因的方法，所述核酸或多核苷酸或基因编码核糖体蛋白S12或与rpsL基因的序列具有高度相似性，该方法包括应用含有权利要求1，2，3或4的多核苷酸序列的多核苷酸作为杂交探针。

16、权利要求13的方法，其中应用了阵列，微阵列或DNA芯片。

17、源自棒状细菌并编码核糖体S12蛋白的一种DNA，其编码如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，该序列在第43位含有L-精氨酸。

18、如权利要求17所述的DNA，在其编码区第128位含有碱基鸟嘌呤，对应于如SEQ ID NO：3所示序列的第627位。

19.一种分离的多核苷酸，其由SEQ ID NO：1的至少15个连续核苷酸或与SEQ ID NO：1互补的序列的至少15个连续核苷酸组成，所述多核苷酸是用于合成编码具有核糖体蛋白S12的活性的与SEQ ID NO：2的多肽至少95％相同的多肽的多核苷酸的引物。

20.一种棒状细菌，其含有如权利要求17或18的DNA。