CN101027389B - L-精氨酸、l-鸟氨酸或l-瓜氨酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有(i)序列号1表示的氨基酸序列的自N末端起的第20-38位的氨基酸序列中1个以上的氨基酸被取代的氨基酸序列，或者(ii)序列号1表示的氨基酸序列的自N末端起的第20-38位的氨基酸序列中1个以上的氨基酸被取代并且第1-19位或第39-294位的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列，并且具有N-乙酰谷氨酸激酶活性的多肽。
Description
技术领域
本发明涉及L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸的制备方法。
背景技术
在微生物中，由L-谷氨酸通过8个阶段的反应生物合成L-精氨酸。L-鸟氨酸和L-瓜氨酸是L-精氨酸的生物合成途径上的中间体。L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的生物合成，与其它氨基酸同样受到调节。
例如棒状细菌中，由精氨酸抑制子(以下称为ArgR)，抑制由编码与L-精氨酸的生物合成相关的酶的基因构成的操纵子(以下，简称为精氨酸操纵子)的转录(参照专利文献1)。此外，还已知在棒状细菌中，在自L-谷氨酸至L-精氨酸的生物合成途径上的第2个酶N-乙酰谷氨酸激酶(EC：2.7.2.8，以下也简称为ArgB)受L-精氨酸所产生的反馈抑制(参照非专利文献2)。
与其它氨基酸一样，L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸也是使用微生物生产的。并且，与其它氨基酸的情况相同，使用突变和DNA重组等方法进行了使这些氨基酸的产率获得提高的研究。
例如，据报道，用含有与L-精氨酸的生物合成相关的基因的DNA片段转化谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，再通过实施突变处理，获得了精氨酸的产率提高的谷氨酸棒杆菌K65(FERMBP-1115)株(参照专利文献2)。
此外，解除了精氨酸生物合成系统酶的抑制的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)(参照非专利文献1)，解除了精氨酸生物合成系统酶的抑制，进而对由L-精氨酸所产生的反馈抑制脱敏，并且采用突变法获得了L-精氨酸的膜渗透性增大的谷氨酸棒杆菌(参照非专利文献3)等。
此外，采用DNA重组法获得了破坏了编码ArgR的DNA的棒状细菌(参照专利文献1)。
但是，至今为止，还没有关于在编码ArgB和ArgR的DNA中导入变异的株中，如果在编码ArgB和ArgR的DNA中导入何种变异，可以提高L-精氨酸的产率的报道。
专利文献1：特开2002-51790号公报
专利文献2：特开昭63-79597号公报
非专利文献1：Agricultural&Biological Chemistry，1979年，第43卷，p.105-111
非专利文献2：Journal of Bacteriology，1966年，第91卷，p.617
非专利文献3：Agricultural&Biological Chemistry，1972年，第36卷，p.1675-1684
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种有效的L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸的制备方法。
用于解决问题的手段
本发明涉及以下(1)-(18)。
(1)具有(i)序列号1表示的氨基酸序列的自N末端起的第20-38位的氨基酸序列中1个以上的氨基酸被取代的氨基酸序列，或者
(ii)序列号1表示的氨基酸序列的自N末端起的第20-38位的氨基酸序列中1个以上的氨基酸被取代，并且第1-19位或第39-294位的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列，
并且具有N-乙酰谷氨酸激酶活性的多肽。
(2)具有(i)序列号1表示的氨基酸序列的自N末端起的第26-31位的氨基酸序列中1个以上的氨基酸被取代的氨基酸序列，或者
(ii)序列号1表示的氨基酸序列的自N末端起的第26-31位的氨基酸序列中1个以上的氨基酸被取代，并且第1-25位或第32-294位的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列，
并且具有N-乙酰谷氨酸激酶活性的多肽。
(3)具有(i)序列号1表示的氨基酸序列的自N末端起的第26或31位的氨基酸被取代的氨基酸序列，
(ii)序列号1表示的氨基酸序列的自N末端起的第26和31位的氨基酸被取代的氨基酸序列，或者
上述(i)或(ii)的氨基酸序列中，被取代的部位之外缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列，
并且具有N-乙酰谷氨酸激酶活性的多肽。
(4)具有(i)选自序列号3，5，7，9和11表示的氨基酸序列的氨基酸序列，
(ii)选自序列号3，5和7表示的氨基酸序列的氨基酸序列中，各个序列的第26位氨基酸之外的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列，
(iii)在序列号9表示的氨基酸序列中，第31位氨基酸之外的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列，或者
(iv)在序列号11表示的氨基酸序列中，第26和31位氨基酸之外的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列，
并且具有N-乙酰谷氨酸激酶活性的多肽。
(5)编码上述(1)-(4)任一项中的多肽的DNA。
(6)具有从序列号4，6，8，10和12表示的碱基序列中选出的碱基序列的DNA。
(7)一种DNA，与由编码具有序列号1表示的氨基酸序列的多肽的DNA的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交，并且
(i)编码相应于序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第26位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-丙氨酸之外的氨基酸的多肽的DNA，
(ii)编码相应于序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第31位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-蛋氨酸之外的氨基酸的多肽的DNA，或
(iii)编码相应于序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第26位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-丙氨酸之外的氨基酸，并且对应于第31位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-蛋氨酸之外的氨基酸的多肽的DNA，
并且编码具有N-乙酰谷氨酸激酶活性的多肽的DNA。
(8)上述(7)的DNA，相应于序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第26位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-缬氨酸，L-亮氨酸或L-异亮氨酸，对应于第31位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-缬氨酸。
(9)与由编码具有序列号1表示的氨基酸序列的多肽的DNA的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交，并且是
(i)具有相应于序列号2表示的碱基序列的5’末端起第76-78位区域的区域为鸟嘌呤-胸腺嘧啶-胸腺嘧啶、胞嘧啶-胸腺嘧啶-鸟嘌呤、或者腺嘌呤-胸腺嘧啶-胞嘧啶的碱基序列的DNA，
(ii)具有相应于序列号2表示的碱基序列的5’末端起第91-93位区域的区域为鸟嘌呤-胸腺嘧啶-鸟嘌呤的碱基序列的DNA，或者
(iii)具有相应于序列号2表示的碱基序列的5’末端起第76-78位区域的区域为鸟嘌呤-胸腺嘧啶-胸腺嘧啶，胞嘧啶-胸腺嘧啶-鸟嘌呤或腺嘌呤-胸腺嘧啶-胞嘧啶的、且对应于第91-93位区域的区域为鸟嘌呤-胸腺嘧啶-鸟嘌呤的碱基序列的DNA，
并且编码具有N-乙酰谷氨酸激酶活性的多肽的DNA。
(10)通过在载体中整合上述(5)-(9)中任一项的DNA获得的重组体DNA。
(11)通过导入上述(10)的重组体DNA获得的微生物。
(12)具有上述(5)-(9)中任一项的DNA的微生物。
(13)上述(11)或(12)的微生物，其特征在于精氨酸抑制子对精氨酸操纵子的转录抑制活性降低或丧失。
(14)上述(11)-(13)任一项的微生物，其特征在于鸟氨酸氨甲酰转移酶活性降低或丧失。
(15)上述(11)-(14)任一项的微生物，其特征在于精氨基琥珀酸合酶(argininosuccinate synthase)活性降低或丧失。
(16)上述(11)-(15)任一项的微生物，其中所述微生物是属于棒杆菌(Corynebacterium)属的微生物。
(17)上述(11)-(16)任一项的微生物，其中所述微生物是属于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的微生物。
(18)L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸的制备方法，其特征在于在培养基中培养上述(11)-(17)任一项的微生物，使培养基中生成L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸，并累积，从该培养物中获得L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸。
发明的效果
根据本发明，可以提供一种高效的L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸的制备方法。
具体实施方式
作为本发明的多肽，可以例举有具有序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第20-38位的氨基酸序列中1个以上的氨基酸被取代的氨基酸序列，并且具有N-乙酰谷氨酸激酶活性(以下，称为ArgB活性)的多肽。
序列号1表示的氨基酸序列是谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的ArgB的氨基酸序列，其由具有序列号2表示的碱基序列的DNA编码。并且，具有序列号2表示的碱基序列的DNA在DDBJ/GenBank/EMBL上以NCg11342登录。
由序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第20-38的氨基酸序列构成的区域，是根据大肠杆菌(Escherichia coli)的ArgB的氨基酸序列和立体结构[Structure，10，329-342，(2002)]之间的关系以及该氨基酸序列与谷氨酸棒杆菌的ArgB的氨基酸序列的同源性，推测为形成α-螺旋的区域。
氨基酸被取代的部位如果是在序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第20-38位的氨基酸序列中，可以是任意一个部位，优选是第26-31位的部位。
被取代的氨基酸的数目，如果具有取代后的氨基酸序列的多肽具有ArgB活性，或者具有L-精氨酸产生的反馈抑制被降低或被解除的ArgB活性，就没有特别的限制，优选是1-10个，更优选1-5个，更为优选是1或2个。
多肽具有L-精氨酸产生的反馈抑制被降低或被解除的ArgB活性，可以根据L-精氨酸存在下的ArgB活性比具有序列号1表示的氨基酸序列的多肽在L-精氨酸存在下的ArgB活性更高来确定。L-精氨酸的浓度优选为5mmol/l以上，更优选10mmol/l以上。
多肽的ArgB活性，可以通过例如，将以ATP和N-乙酰-L-谷氨酸作为底物的磷酸烯醇丙酮酸-丙酮酸激酶系的反应中生成的丙酮酸作为二硝基苯基腺的比色定量方法[Meth.Enzymol.，17，251-255(1970)]，使ATP和N-乙酰-L-谷氨酸与羟胺一起反应生成的乙酰谷氨酸5-磷酸作为氧肟酸的定量方法[Meth.Enzymol.，17，269-272(1970)]等方法来测定。
取代的氨基酸，具有取代后的氨基酸序列的多肽具有ArgB活性，优选如果具有L-精氨酸产生的反馈抑制被降低或被解除的ArgB活性，就没有特别的限制，无论是天然型还是非天然型均可。
作为天然型氨基酸，可以例举有L-丙氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酰胺，L-谷氨酸，甘氨酸，L-组胺酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-精氨酸，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-缬氨酸，L-半胱氨酸等。
以下显示了可以相互取代的氨基酸的例子。包含于同一组中的氨基酸可以互相取代。
A组：亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，缬氨酸，正缬氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，蛋氨酸，O-甲基丝氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，环己基丙氨酸
B组：天冬氨酸，谷氨酸，异天冬氨酸，异谷氨酸，2-氨基脂肪酸，2-氨基辛二酸
C组：天冬氨酸，谷氨酰胺
D组：赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸，2，4-二氨基丁酸，2，3-二氨基丙酸
E组：脯氨酸，3-羟脯氨酸，4-羟脯氨酸
F组：丝氨酸，苏氨酸，高丝氨酸
G组：苯丙氨酸，酪氨酸
作为本发明的多肽，可以例举有，例如具有序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第26或31位的任一个位置或者两个位置的氨基酸被取代的氨基酸序列，并且具有ArgB活性的多肽。
本发明的多肽中，取代部位之外的氨基酸序列中，只要具有ArgB活性，可以缺失、取代或添加1个以上的氨基酸。
缺失、取代或添加的氨基酸的数目没有特别的限定，但是优选1个-数十个，优选1-20个，更优选1-10个，更为优选1-5个。
取代的氨基酸与可以在上述的序列号1表示的氨基酸序列的N末端起的第20-38位的氨基酸序列中取代的氨基酸相同。
缺失、取代或添加是指同一序列中的1或多个氨基酸的缺失、取代或添加，也可以同时发生缺失、取代或添加。
为了本发明的多肽具有ArgB活性，优选与具有序列号1表示的氨基酸序列的多肽具有至少60％以上，通常80％以上，尤其是95％以上的同源性。
在本发明中，氨基酸序列和碱基序列的同源性可以采用由Karlin和Altschul提出BLAST算法[Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)]和FASTA[Methods Enzymol.，183，63(1990)]来确定。基于这种BLAST算法，开发了称为BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]。在通过基于BLAST的BLASTN分析碱基序列时，参数设为例如Score＝100，wordlength＝12。此外，在通过基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列时，参数设为例如score＝50，wordlenth＝3。在使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法是公知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
作为本发明的多肽的氨基酸序列的更具体的实例，可以例举有序列号1表示的氨基酸序列的N末端起的第26位的丙氨酸被取代为缬氨酸的序列号3表示的氨基酸序列，序列号1表示的氨基酸序列的N末端起的第26位的丙氨酸被取代为亮氨酸的序列号5表示的氨基酸序列，序列号1表示的氨基酸序列的N末端起的第26位的丙氨酸被取代为异亮氨酸的序列号7表示的氨基酸序列，序列号1表示的氨基酸序列的N末端起的第31位的蛋氨酸被取代为缬氨酸的序列号9表示的氨基酸序列，序列号1表示的氨基酸序列的N末端起的第26位的丙氨酸和第31位的蛋氨酸均被取代为缬氨酸的序列号11表示的氨基酸序列等。
作为本发明的DNA，可以例举有编码本发明的多肽的DNA，作为具体的例子，可以例举有分别编码具有序列号3，5，7，9和11表示的氨基酸序列的多肽的具有序列号4，6，8，10和12表示的碱基序列的DNA。
此外，作为本发明的DNA，可以例举有与由编码具有序列号1表示的氨基酸序列的多肽的DNA的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交，并且是
(i)编码相应于序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第26位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-丙氨酸之外的氨基酸的多肽的DNA，
(ii)编码相应于序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第31位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-蛋氨酸之外的氨基酸的多肽的DNA，或
(iii)编码相应于序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第26位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-丙氨酸之外的氨基酸，并且对应于第31位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-蛋氨酸之外的氨基酸的多肽的DNA，
(iv)编码相应于序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第26位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-缬氨酸，L-亮氨酸或L-异亮氨酸的多肽的DNA，
(v)编码相应于序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第31位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-缬氨酸的多肽的DNA，
(vi)编码相应于序列号1表示的氨基酸序列的N末端起第26位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-缬氨酸，L-亮氨酸或L-异亮氨酸并且对应于第31位的氨基酸残基的氨基酸残基为L-缬氨酸的多肽的DNA，
(vii)具有相应于序列号2表示的碱基序列的5’末端起第76-78位区域的区域是鸟嘌呤-胸腺嘧啶-胸腺嘧啶，胞嘧啶-胸腺嘧啶-鸟嘌呤或腺嘌呤-胸腺嘧啶-胞嘧啶的碱基序列的DNA，
(viii)具有相应于序列号2表示的碱基序列的5’末端起第91-93位区域的区域为鸟嘌呤-胸腺嘧啶-鸟嘌呤的碱基序列的DNA，或
(ix)具有相应于序列号2表示的碱基序列的5’末端起第76-78位区域的区域为鸟嘌呤-胸腺嘧啶-胸腺嘧啶，胞嘧啶-胸腺嘧啶-鸟嘌呤或腺嘌呤-胸腺嘧啶-胞嘧啶的碱基序列的DNA，且对应于第91-93位区域的区域为鸟嘌呤-胸腺嘧啶-鸟嘌呤的碱基序列的DNA，
并且编码具有N-乙酰谷氨酸激酶活性的多肽的DNA。
所谓可以在严格条件下杂交的DNA是指通过以编码具有序列号1，3，5，7，9或11表示的氨基酸序列的多肽的DNA的碱基序列，更优选由与序列号2，4，6，8，10或12表示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA的一部分，或者全部作为探针，使用菌落杂交法，噬斑杂交法或southern杂交法等获得的DNA，具体是，可例举有，可通过使用固定了菌落或噬斑来源的DNA的滤膜，在0.7-1.0mol/l的氯化钠存在下，进行65℃杂交后，使用0.1-2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为150mmol/l氯化钠，15mmol/l柠檬酸钠)，在65℃条件下清洗滤膜来鉴定的DNA。
杂交可以按照《分子克隆，实验室手册》第3版，冷泉港实验室出版(2001)(以下，简称为分子克隆第3版)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons(1987-1997)(以下简称Current Protocols in Molecular Biology)，DNA Cloning 1：CoreTechniques，A Practical Approach，第二版，牛津大学(1995)(以下简称DNA克隆)等中记载的方法进行。作为可以杂交的DNA，在使用上述BLAST和FASTA等计算时，可以例举有与序列号2，4，6，8，10或12表示的碱基序列至少有75％以上的同源性的DNA，优选具有80％以上的同源性的DNA，更为优选具有95％以上的同源性的DNA。
作为本发明的微生物，如果是具有本发明的DNA的微生物，可以是任意一种，但是优选精氨酸抑制子(ArgR)对精氨酸操纵子的转录抑制活性降低或丧失的微生物。
本发明的微生物的种类没有特别的限定，但是可以列举有例如棒状细菌。
作为棒状细菌，可以列举有属于棒状杆菌(Corynbacterium)属，短杆菌(Brevibacterium)属，微杆菌(Microbacterium)属的微生物。
作为属于棒状杆菌属的微生物，可以例举有谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)，醋谷棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)，美棒状杆菌(Corynebacteriumcallunae)，力士棒状杆菌(Corynebacterium herculls)，百合花棒状杆菌(Corynebacterium lilium)，栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacterium melassecola)，嗜热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)等，具体可以例举有谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，谷氨酸棒状杆菌ATCC13060，谷氨酸棒状杆菌ATCC13826(旧属种Brevibacterium flavum)，谷氨酸棒状杆菌ATCC14020(旧属种Brevibacterium divaricatum)，谷氨酸棒状杆菌ATCC13869(旧属种Brevibacterium lactofermentum)，嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870，醋谷棒状杆菌ATCC15806，美棒状杆菌ATCC15991，力士棒状杆菌ATCC13868，百合花棒状杆菌ATCC15990，栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965，嗜热产氨棒状杆菌ATCC9244等。
作为属于短杆菌属的微生物，可以例举有解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)，未成熟短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)，玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)，生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)等，具体可以例举有解糖短杆菌ATCC14066，未成熟短杆菌ATCC14068，玫瑰色短杆菌ATCC13825，生硫短杆菌ATCC19240等。
作为属于微杆菌属的微生物，可以例举有嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)等，具体可以例举有嗜氨微杆菌ATCC15354等。
本发明的微生物的ArgR的精氨酸操纵子转录抑制活性可以比亲本株的活性低，优选50％以下，更优选10％以下，更优选5％以下，最优选活性为0，即丧失。
亲本株如果是具有生产L-精氨酸，L-乌氨酸或L-瓜氨酸能力，ArgB受到L-精氨酸产生的反馈抑制，并且精氨酸操纵子的转录受到ArgR抑制的微生物，可以是野生株，也可以是由该野生株人工育种的育种株。此外，如果具有这些性质，可以使用以下所述的导入本发明的DNA时使用的宿主微生物作为亲本株。
在本发明中，所谓野生株是指与本发明的微生物在分类学上属于同一种的微生物，并且具有在自然界中最高频度出现的表型的微生物。
例如，本发明的微生物是属于谷氨酸棒杆菌的微生物时，作为野生株，可以例举有谷氨酸棒杆菌ATCC13032株。
本发明的微生物，可以通过以下方式获得：用N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍等诱变物质处理亲本株，使用含有精氨酸类似物-精氨酸氧肟酸盐(hydroxamate)的培养基培养获得的菌株时，选择生长速度比亲本株快的株，再从使用常规的微生物的培养基时，L-精氨酸的产率比亲本株提高的微生物中选择，但是更简便的是，可以使用导入本发明的DNA的方法获得。
下面，作为本发明的微生物的获得方法对导入本发明的DNA获得的方法进行说明。
本发明的DNA可以通过以下方式获得：由具有序列号2表示的碱基序列的DNA，或者与序列号2表示的碱基序列具有高同源性的碱基序列并且编码具有ArgB活性的多肽的DNA来制备。
所谓与序列号2表示的碱基序列具有高同源性是具有至少75％以上，优选80％以上，更优选95％以上的同源性。
具有序列号2表示的碱基序列的DNA、或者与序列号2表示的碱基序列具有高同源性的碱基序列、并且编码具有ArgB活性的多肽的DNA可以通过从具有这些DNA的微生物中制备来获得，但是也可以使用Perceptive Biosystems公司制的8905型DNA合成装置等化学合成来获得。
作为具有这些DNA的微生物，可以例举有例如属于棒杆菌属的微生物。
作为属于棒杆菌属的微生物，可以例举有Corynebacteriumefficiens，钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)等，例如，可以例举有谷氨酸棒杆菌ATCC13032，谷氨酸棒杆菌K65(FERMBP-1115)，嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870，Corynebacterium efficiens JCM44549等，但是优选使用带有具有序列号2表示的碱基序列的DNA的谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
通过公知的方法培养带有具有序列号2表示的碱基序列的DNA或者与序列号2表示的碱基序列具有高同源性的碱基序列并且编码具有ArgB活性的多肽的DNA的微生物[例如，Mol.Microbiol.，20，833(1996)]。
培养后，按照例如齐藤等人的方法[Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)]分离纯化该微生物的染色体DNA。
基于DDBJ/GenBank/EMBL中以NCg11342登录的编码谷氨酸棒杆菌的ArgB的DNA的碱基序列(序列号2表示的碱基序列)或者含有该碱基序列的区域的碱基序列(例如，序列号30表示的碱基序列)制备引物，以分离纯化的染色体DNA作为模板，进行PCR[PCR Protocols，Academic Press(1990)]，制备含有编码ArgB的DNA的DNA片段。
作为引物，可以例举有例如基于序列号30表示的碱基序列设计的序列号13-18表示的碱基序列构成的DNA。
此外，使用分离纯化的染色体DNA，按照分子克隆第3版，CurrentProtocols in Molecular Biology等中记载的方法制备DNA文库，从通过分子克隆第3版，Current Protocols in Molecular Biology，DNA克隆等实验书中记载的菌落杂交法等获得的文库中获得含有编码ArgB的DNA的克隆。
作为杂交中使用的探针，可以例举有编码公知的谷氨酸棒杆菌的ArgB的DNA或其一部分，以该DNA的碱基序列为基础合成的DNA等，以及以编码公知的ArgB的DNA的碱基序列为基础合成的DNA引物通过PCR等获得的DNA片段等。
例如，可以例举有以具有序列号2表示的碱基序列的DNA或者由序列号13-18表示的碱基序列构成的DNA作为引物，以属于谷氨酸棒杆菌的微生物的染色体DNA作为模板，进行PCR扩增的DNA片段等。
将具有通过菌落杂交法，噬斑杂交法，southern杂交法等获得的文库中获得的含有编码ArgB的DNA的DNA片段照原样或用适当的限制性酶等切断后，通过常规方法整合到载体中，通过通常使用的碱基序列分析方法，例如采用ABI377DNA测序仪(Parkin Elmer公司制)等的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74，5463(1977)]测定该DNA片段的碱基序列。
进而，基于测定的碱基序列制备引物，以染色体DNA为模板，通过PCR法[PCR Protocols，Academic Press(1990)]，可以获得具有编码ArgB的DNA的DNA片段。
此外，也可以基于测定的DNA片段的碱基序列，用PerceptiveBiosystems公司制造的8905型DNA合成装置通过化学合成制备目的DNA片段。
作为上述获得的编码ArgB的DNA，可以例举有例如具有序列号2表示的碱基序列的DNA。
在具有序列号2表示的碱基序列的DNA，或者与序列号2表示的碱基序列具有高同源性的碱基序列、并且编码具有ArgB活性的多肽的DNA中，根据需要，通过分子克隆第3版，Current Protocols inMolecular Biology，Nucleic Acids Research，10，6487(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.79，6409(1982)，Gene，34，315(1985)，Nucleic Acids Research，13，4431(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488(1985)中记载的定位诱变法，例如通过采用PCR的方法等导入位点特异的变异，可以获得本发明的DNA。
采用常规的方法在质粒载体等载体中整合如此获得的本发明的DNA，制备本发明的重组DNA。
作为载体，如果是可以在导入本发明的DNA的微生物(以下称为宿主微生物)中导入的载体，没有特别的限制，可以例举有例如pHSG299[Gene，61，63-74(1987)]，pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均由Boehringer Mannheim公司制)、pHelix1(Roch Diagnostics公司制)、pKK233-2(Amersham Pharmacia Biotech公司制)，pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(Qiagen公司制)、pET-3(Novagene公司制)、pKYP10(特开昭58-110600)，pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]，pLSA1[Agric.Biol.Chem，53，277(1989)]，pGEL1[Proc.Nail.AcadSci.USA，82，4306(1985)]，pBluescriptIISK(+)，pBluescriptIIKS(-)(Stratagene公司制)，pTrS30[从大肠杆菌JM109/pTrS30(FBRMBP-5407)制备]，pTrS32[从大肠杆菌JM109/pTrS32(FBRM BP-5408)制备]，pPAC31(国际公开98/12343小册子)，pUC19[Gene，33，103(1985)]，pSTV28(宝酒造公司制)，pUC118(宝酒造公司制)和pPA1(特开昭63-233798)，pCG116，pCG1(特开平6-277082号)，pCS299P(国际公开00/63388小册子)等，但是如果使用在宿主微生物中无法自我复制的载体，本发明的重组DNA能够整合到宿主微生物的染色体中，则优选。
作为宿主微生物，可以使用上述例举的微生物。
在宿主微生物中无法自我复制的载体没有特别的限定，但是如果是具有与对抗生物质的抗性相关的基因的载体，优选可以容易选择本发明的重组DNA通过重组整合到宿主微生物的染色体上的微生物的载体，进而，如果是具有编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的果聚糖-蔗糖酶(EC：2.4.1.10)的DNA(sacB)的载体，优选可以容易选择编码宿主微生物的染色体上原来存在的ArgB的DNA被取代为本发明的DNA的微生物的载体。作为这种载体，可以例举有，例如实施例1所示的质粒pESB30等。
将本发明的重组DNA导入宿主微生物。
使本发明的微生物的ArgR的活性降低或丧失的变异的导入，可以在向该宿主微生物导入本发明的DNA的操作前进行，还可以在宿主微生物中导入本发明的DNA后进行。
为了使ArgR的活性降低或丧失，可以用N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍等诱变物质处理使ArgR的活性降低或丧失的微生物，从L-精氨酸的产率比诱变处理前提高的微生物中选择，也可以通过使用与在编码ArgB的DNA中导入部位特异的变异的方法相同的方法在DNA中进行碱基的取代，缺失或添加等。
进行碱基的取代，缺失或添加等的部位如果是可以使ArgR的活性降低或丧失的部位，没有限定，如果是与ArgR的L-精氨酸的结合区域中或含有该结合区域，优选能够使该活性有效降低或丧失的区域。
作为L-精氨酸的结合区域，可以例举有，例如在编码谷氨酸棒杆菌ATCC13032的ArgR的DNA的碱基序列-序列号19表示的碱基序列中第45-240位的区域。在编码其它的微生物的ArgR的DNA中，对应于该区域的区域中或其附近是L-精氨酸的结合区域。
进行取代，缺失或添加等的碱基数如果是能够使ArgR的活性降低或丧失的数目，没有限定。
本发明的DNA向宿主微生物的导入，可以使用能够在宿主微生物中导入本发明的重组DNA的方法的任意一种方法。
例如，可以例举有电穿孔法[Appl.Microbiol.Biotech.，52，541(1999)]和原生质体法[J.Bacteriol.，159，306(1984)]等。
由于野生型ArgB受L-精氨酸反馈抑制，因此没有降低或解除该反馈抑制的微生物在含有精氨酸类似物-精氨酸氧肟酸盐的培养基中，生长速度比ArgR的活性降低或解除了的微生物慢。此外，ArgR的活性没有降低或丧失的微生物，精氨酸操纵子由于L-精氨酸的积累而被抑制，ArgB表达量降低，在含有精氨酸氧肟酸盐的培养基中，生长速度更慢。
因此，根据含有精氨酸氧肟酸盐的培养基中的生长速度，该微生物与宿主微生物相比，该微生物的生长速度比宿主微生物有所提高，可以确认通过上述方法，在宿主微生物中导入本发明的DNA获得的微生物中导入了本发明的DNA。此外，也可以通过从该微生物中通过常规方法制备质粒或染色体，研究碱基序列来确定。
可以通过采用Northern杂交法(分子克隆第3版)比较该微生物和宿主微生物中精氨酸操纵子的表达来确定该微生物的ArgR的活性降低或丧失。Northern杂交法中使用的探针，可以例举有具有构成精氨酸操纵子的基因序列的一部分或全部的DNA。例如，可以例举有用于从DNA文库中选择编码上述ArgB的DNA的DNA。
此外，也可以使用在精氨酸操纵子中整合了报告基因的微生物作为宿主微生物，与宿主微生物比较该报告基因的表达量来确认。
本发明的微生物如果是是具有本发明的DNA，ArgR的活性降低或丧失的微生物，可以是任一种微生物，但是在制备L-鸟氨酸中使用本发明的微生物时，优选L-精氨酸的生物合成途径上的酶-鸟氨酸氨甲酰转移酶(EC：2.1.3.3，以下称为ArgF)的活性比亲本株降低或丧失的微生物。ArgF活性比亲本株降低或丧失的株，与向ArgB和ArgR导入变异时相同，可以通过突变处理获得，也可以使用与在ArgB和ArgR导入定点突变的方法相同的方法在编码ArgF的DNA中进行碱基的取代，缺失或添加等。并且，编码ArgF的DNA是公知的，例如可以使用DDBJ/GenBank/EMBL中记载的碱基序列信息。作为ArgF的DNA，可以例举有具有序列号31表示的碱基序列的DNA。
此外，在使用本发明的微生物制备瓜氨酸时，优选L-精氨酸的生物合成途径上的酶-精氨琥珀酸合酶(EC：6.3.4.5，以下称为ArgG)的活性比亲本株降低或丧失的微生物。ArgG活性比亲本株降低或丧失的株，与向ArgB和ArgR导入变异时相同，可以通过突变处理获得，也可以使用与在ArgB和ArgR导入定点突变的方法相同的方法在编码ArgG的DNA中进行碱基的取代，缺失或添加等。并且，编码ArgG的DNA是公知的，例如可以使用DDBJ/GenBank/EMBL中记载的碱基序列信息。作为编码ArgG的DNA，可以例举有具有序列号32表示的碱基序列的DNA。
可以在培养基中培养本发明的微生物，使培养物中生成，累积L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸，通过收集L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸，可以制备L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸。
在培养基中培养本发明的微生物的方法，如果是可以在微生物的培养中使用的通常的方法，可以是任意一种方法。
作为培养基，如果是含有可以同化本发明的微生物的碳源，氮源，无机盐类等，有效进行微生物的培养的培养基，可以使用天然培养基或合成培养基的任一种。
作为碳源，如果是可以同化本发明的微生物的碳源，没有限制，可以使用葡萄糖，果糖，蔗糖，麦芽糖，含有这些物质的糖蜜，淀粉或淀粉水解产物等碳水化合物，醋酸，乳酸，琥珀酸等有机酸，乙醇，正丙醇等醇类。
作为氮源，可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和碳酸铵等无机酸或有机酸的铵盐，其它含氮化合物，蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解产物、豆饼、豆饼水解产物和各种发酵菌体和其消化的产物。
作为无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙等。
此外，根据需要，还可以加入生物素，维生素B，烟酰胺，烟酸等微量营养源。这些微量营养源也可以用肉膏，酵母提取物，玉米浆，酪蛋白氨基酸等代用。
通常在振荡培养或在深度通气搅拌培养等需氧条件下进行培养。培养温度优选地为20-42℃，更优选30-40℃。培养的pH在5-9的范围内，优选维持在中性附近。培养基pH的调整用有机酸或无机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨，pH缓冲液等进行。
在本发明的微生物的制备中使用的本发明的重组DNA具有诱导性的启动子时，根据需要可以在培养基中添加与该启动子适应的诱导剂。例如，作为重组DNA，使用具有1ac启动子的重组DNA时，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等；在使用具有trp启动子的重组DNA时，可以向培养基中加入吲哚丙烯酸等。
培养时间通常为1-6天，培养物中生成，积累L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸。
培养结束后，从培养物中除去菌体等沉淀物，通过合用活性炭处理，离子交换树脂处理等公知的方法，可以回收培养物中积累的L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸。
以下表示实施例，但是本发明不受这些实施例的限定。
实施例1
ArgB氨基酸取代用质粒的制备
(1)同源重组用载体的制备
用PstI处理具有赋予对卡那霉素的抗性的基因的质粒pHSG299[Gene，61，63-74(1987)]，在切割部位连结含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的果聚糖蔗糖酶基因sacB的千碱基对(以下，简称为kb)的DNA片段[Mol.Microbiol.，6，1195(1992)]，获得了质粒pESB30。
用BamHI(宝酒造公司制)处理pESB30，进行琼脂糖凝胶电泳，用GENECLEAN试剂盒(BIO 101公司制)提取，纯化。使用DNA Blunting试剂盒(宝酒造公司制)，按照附加的手册将所得DNA片段的两端平滑化。用苯酚·氯仿处理平滑了的DNA片段，将其提供给乙醇沉淀浓缩后，在Taq聚合酶(Roche Diagnosis公司制)和dTTP存在下，使之在70℃反应2小时，在3’末端添加一个碱基胸腺嘧啶，制备出质粒pESB30-T。
(2)编码第26位的丙氨酸被取代为缬氨酸的ArgB的DNA的制备
用DNA合成仪合成具有序列号30表示的碱基序列的第19-38位的碱基序列的DNA(序列号13表示的碱基序列构成的DNA)和具有与序列号30的第1027～1047位的碱基序列互补的序列的DNA(序列号14表示的碱基序列构成的DNA)。
并且，序列号30表示的碱基序列的第451-1332位的碱基序列是编码具有谷氨酸棒杆菌的ArgB-序列号1表示的氨基酸序列的多肽的区域，该区域的碱基序列表示为序列号2。
此外，用DNA合成仪合成与序列号2表示的碱基序列的第77位的胞嘧啶被取代为胸腺嘧啶的序列号4表示的碱基序列(编码序列号1表示的氨基酸序列的第26位的丙氨酸被取代为缬氨酸的序列号3表示的氨基酸序列)的第68-89位的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA(序列号15表示的碱基序列构成的DNA)，和序列号4表示的碱基序列的第65-87位的碱基序列构成的DNA(序列号16表示的碱基序列构成的DNA)。
按照齐藤等人的方法[Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)]制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的染色体DNA，以该染色体DNA作为模板，分别以序列号13表示的碱基序列构成的DNA和序列号15表示的碱基序列构成的DNA的组合，以及序列号14表示的碱基序列构成的DNA和序列号16表示的碱基序列构成的DNA的组合作为引物对，使用Pfu turbo DNA聚合酶(Stragene公司制)以及附加的缓冲液进行两种PCR。对由该PCR获得的两个约0.5kb的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，用GENECLEAN试剂盒(BIO 101公司制)提取，纯化。
进而，以两纯化物作为模板，以序列号13表示的碱基序列构成的DNA和序列号14表示的碱基序列构成的DNA作为引物对，进行PCR。将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，用GENECLEAN试剂盒(BIO101公司制)提取，纯化，获得了约1.0kb的DNA片段。用测序仪测定该DNA片段的碱基序列，确认该DNA片段具有序列号4表示的碱基序列。
(3)编码第31位的蛋氨酸被取代为缬氨酸的ArgB的DNA的制备
用DNA合成仪合成与序列号2表示的碱基序列的第91位的腺嘌呤被取代为鸟嘌呤的序列号10表示的碱基序列(编码序列号1表示的氨基酸序列的第31位的蛋氨酸被取代为缬氨酸的序列)的第83-102位的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA(序列号17表示的碱基序列构成的DNA)和序列号10表示的碱基序列的第79-99位的碱基序列构成的DNA(序列号18表示的碱基序列构成的DNA)。
除分别使用序列号13表示的碱基序列构成的DNA和序列号17表示的碱基序列构成的DNA的组合，以及具有序列号14表示的碱基序列的DNA和序列号18表示的碱基序列构成的DNA的组合作为引物对之外，其与进行与(2)相同的操作，获得了约1.0kb的DNA片段。
用测序仪测定获得的片段的碱基序列，结果确认了该DNA片段具有序列号10表示的碱基序列。
(4)ArgB的氨基酸取代用质粒的制备
在Taq聚合酶(Boehringer-Mannheim)和dATP存在下，于72℃分别处理上述(2)和(3)获得的具有序列号4和10表示的碱基序列的DNA片段10分钟，在各DNA片段的3’末端添加1个碱基-腺嘌呤。
分别混合质粒pESB30-T和在具有序列号4或10表示的碱基序列的DNA的DNA片段上添加了腺嘌呤的DNA片段，使用连接试剂盒Ver.1(宝酒造公司制)，进行了连接酶反应。使用反应产物，按照常规方法转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺社制)。在含有20μg/ml的卡那霉素的LB琼脂培养基[1L水中含有10g的Bacto胰蛋白胨(Difco公司制)，5g酵母提取物(Difco公司制)，10g的氯化钠，16g的Bacto琼脂(Difco公司制)，调整成pH7.0的培养基]中培养该菌株，选择转化株。使用含有20μg/ml的卡那霉素的LB培养基过夜培养该转化株，从获得的培养液中根据碱SDS法(分子克隆第3版)，制备质粒。用测序仪测定该质粒的碱基序列，确认了在质粒中，pESB30-T中分别插入了具有序列号4或10表示的碱基序列的DNA。
这些质粒中，将带有具有序列号4表示的碱基序列的DNA的质粒命名为pEargB26，将带有具有序列号10表示的碱基序列的DNA的质粒命名为pEargB31。
(5)ArgB的二氨基酸取代用质粒的制备
分别使用序列号13表示的碱基序列构成的DNA和序列号15表示的碱基序列构成的DNA的组合，以及序列号14表示的碱基序列构成的DNA和序列号16表示的碱基序列构成的DNA的组合作为引物对，以pEargB31作为模板，进行与(2)相同的操作，获得了约1.0kb的DNA片段。用测序仪测定获得的DNA片段的碱基序列，结果确认了该DNA片段具有序列号12表示的碱基序列。
除了使用具有序列号12表示的碱基序列的DNA片段之外，其余使用与上述(4)相同的方法，获得了pESB30-T中整合了具有序列号12表示的碱基序列的DNA的质粒pEargB2631。
并且，序列号12表示的DNA是编码序列号11表示的氨基酸序列的DNA，是编码序列号1表示的氨基酸序列的第26位的丙氨酸和第31位的蛋氨酸分别被取代为缬氨酸的氨基酸序列的DNA。
实施例2
向染色体ArgB导入氨基酸取代
(1)向野生株的染色体上的ArgB导入氨基酸取代
分别使用实施例1中制备的质粒pEargB26，pEargB31和pEargB2631，按照Rest等人[Appl.Microbiol.Biotech.，52，541(1999)]的方法通过电穿孔法转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032株，选择出卡那霉素抗性株。从卡那霉素抗性株的其中1株制备染色体，通过Southern杂交法(分子克隆第3版)进行研究的结果，确认了pEargB26，pEargB31和pEargB2631通过Cambell型的同源重组整合到各株的染色体中。这种菌株中，编码原来存在于染色体上的ArgB的DNA与本发明的DNA在染色体上相邻并存，它们之间容易发生第二次同源重组。
由于sacB编码的果聚糖蔗糖酶将蔗糖转换成自杀基质，因此具有sacB的微生物在含有蔗糖的培养基中不能生长。但是，编码原来染色体上存在的ArgB的DNA与本发明的DNA之间发生第二次同源重组的菌株中，由于任意DNA与sacB同时缺失，因此即使在含有蔗糖的培养基中也可以生长。当缺失编码原来染色体上存在的ArgB的DNA时，可以获得本发明的DNA被取代为编码原来存在于宿主微生物的染色体上的ArgB的DNA的微生物。
利用该微生物，将上述转化株涂布于Suc琼脂培养基[1L水中含有100g蔗糖，7g肉提取物，10g胰蛋白胨，3g的氯化钠，5g酵母提取物(Difco公司制)，和15g的Bacto琼脂(Difco公司制)，调整成pH7.2的培养基]上，于30℃培养1天，选择生长的菌落。
从这样获得菌落制备染色体DNA，以该染色体DNA作为模板，以序列号13表示的碱基序列构成的DNA和序列号14表示的碱基序列构成的DNA作为引物对，使用Pfu turbo DNA聚合酶(Stragene公司制)以及附加的缓冲液进行PCR，用测序仪测定PCR产物的碱基序列。
由此，从导入了pEargB26的菌株中获得了编码染色体上的ArgB的DNA被具有序列号4表示的碱基序列的DNA取代的菌株，将该菌株命名为B26株。
同样，从导入了pEargB31的菌株中获得了编码染色体上的ArgB的DNA被具有序列号10表示的碱基序列的DNA取代的菌株，将该菌株命名为B31株。
此外，从导入了pEargB2631的菌株中获得了编码染色体上的ArgB的DNA被具有序列号12表示的碱基序列的DNA取代的菌株，将该菌株命名为2631株。
(2)ArgB内部序列缺失用质粒的制备
按照齐藤等人的方法[Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)]制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的染色体DNA。
用DNA合成仪合成序列号19表示的碱基序列(编码谷氨酸棒杆菌的ArgR的DNA的碱基序列)的第43-62位的碱基序列构成的DNA(序列号20表示的碱基序列构成的DNA)，序列号19表示的碱基序列的第1421-1440位的碱基序列互补序列构成的DNA(序列号21表示的碱基序列构成的DNA)，序列号19表示的碱基序列的第539-559位的碱基序列添加了标记序列而构成碱基序列互补序列构成的DNA(序列号22表示的碱基序列构成的DNA)和序列号19表示的碱基序列的第941-961位的碱基序列上添加了标记序列的碱基序列构成的DNA(序列号23表示的碱基序列构成的DNA)。
并且，序列号19表示的碱基序列是含有编码谷氨酸棒杆菌ArgR的DNA的碱基序列的碱基序列。以制备的染色体DNA作为模板，分别以序列号20表示的碱基序列构成的DNA和序列号22表示的碱基序列构成的DNA的组合，以及序列号21表示的碱基序列构成的DNA和序列号23表示的碱基序列构成的DNA的组合作为引物对，使用Pfu turboDNA聚合酶(Stragene公司制)以及附加的缓冲液进行两种PCR。对由该PCR获得的两个约0.5kb的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，用GENECLEAN试剂盒(BIO 101公司制)提取，纯化。
进而，以两纯化物作为模板，以序列号20表示的碱基序列构成的DNA和序列号21表示的碱基序列构成的DNA作为引物对，使用Pfuturbo DNA聚合酶(Stragene公司制)以及附加的缓冲液进行PCR。将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，用GENECLEAN试剂盒(BIO101公司制)提取，纯化，获得了在编码ArgR的序列号19表示的碱基序列的第560-940位的区域缺失了约1.0kb的DNA片段。
按照实施例1记载的方法将该片段整合到质粒pESB30-T中，获得了pEdel-argR。
(3)ArgR内部序列缺失株的制备
除了使用质粒pEdel-argR以外，其余与上述(1)同样的方法，获得了编码谷氨酸棒杆菌株ATCC13032株的染色体上的ArgR的DNA被取代为序列号19表示的碱基序列的第560-940位的区域缺失了的DNA的菌株，将该菌株命名为R株。
(4)向ArgR内部序列缺失株的染色体上的ArgB导入氨基酸取代
除了使用R株作为宿主菌，使用pEargB26，pEargB31和pEargB2631作为质粒以外，其余与上述(1)相同的方法，获得了编码染色体上的ArgB的DNA被具有序列号4，10或12表示的碱基序列的DNA取代，并且编码染色体上的ArgR的DNA被序列号19表示的碱基序列的第560-940位的区域缺失了的DNA所取代的菌株。将这些菌株分别命名为RB26株，RB31株，RB2631株。
实施例3
由ArgB氨基酸取代株生产L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的试验
在BY琼脂培养基(1L水中含有7g肉提取物，10g胰蛋白胨，3g氯化钠，5g酵母提取物，和15g的Bacto琼脂，调整成pH7.2的培养基)中，于30℃培养实施例2获得的B26株，B31株，B2631株，R株，RB26株，RB31株和RB2631株24小时。
将在BY琼脂培养基生长的菌体分别接种于含有6ml种子培养基(1L水中含有25g蔗糖，20g玉米浆，20g胰蛋白胨，10g酵母提取物，0.5g硫酸镁七水化合物，2g磷酸二氢钾，3g尿素，8g硫酸铵，1g氯化钠，20mg烟酸，10mg硫酸铁七水化合物，10mg泛酸钙，1mg硫酸锌七水化合物，1mg硫酸铜五水化合物，1mg盐酸硫胺，100μg生物素，用氢氧化钠水溶液调整成pH7.2后，加入10g碳酸钙的培养基)的试管中，于32℃一边振荡一边培养24小时。
将获得的2mL种子培养液分别接种于含有20mL主体培养培养基(1L水中含有60g葡萄糖，5g玉米浆，30g硫酸铵，8g氯化钾，2g尿素，0.5g磷酸二氢钾，0.5g磷酸氢二钾，1g硫酸镁七水化合物，1g氯化钠，20mg硫酸铁七水化合物，20mg烟酸，20mgβ-丙氨酸，10mg硫酸锰五水化合物，10mg盐酸硫胺，200μg生物素，用氢氧化钠水溶液调整成pH7.7后，加入30g碳酸钙的培养基)的带有挡板的瓶中，于32℃一边振荡一边培养48小时。
使用谷氨酸棒杆菌株ATCC13032株，进行同样的操作，以其作为对照。
通过离心分离从培养物中除去菌体，用高效液相色谱(HPLC)定量上清中L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的累积量。结果示于表1。
表1
| 菌株 | OD660nm | L-精氨酸(g/l) | L-鸟氨酸(g/l) | L-瓜氨酸(g/l) |
| ATCC13032 | 48 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| B26 | 44 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| B31 | 46 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| B2631 | 45 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| R | 45 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| R26 | 43 | 3.0 | 0.2 | 1.0 |
| RB31 | 46 | 2.0 | 0.1 | 0.8 |
| R2631 | 38 | 4.5 | 0.3 | 2.0 |
如表1所示，在ATCC13032株(对照)，B26株，B31株，B2631株，R株中没有发现L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的生产。与之相对，在RB26株，R31株和R2631株中发现有L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的生产。
实施例4
ArgB中具有氨基酸取代的L-鸟氨酸生产株的制备
(1)用于ArgF内部序列缺失用质粒的制备的DNA的制备
用DNA合成仪合成序列号31表示的碱基序列的第21-43位的碱基序列上添加了标记序列的碱基序列构成的DNA(序列号24表示的碱基序列构成的DNA)和序列号31表示的碱基序列的第1366-1385位的碱基序列上添加了标记序列的碱基序列互补序列构成的DNA(序列号25表示的碱基序列构成的DNA)。
序列号31表示的碱基序列是含有编码谷氨酸棒杆菌的ArgF的DNA的碱基序列的碱基序列。
(2)ArgF内部序列缺失用质粒的制备1
按照齐藤等人的方法[Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)]制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的染色体DNA。
以该染色体DNA作为模板，以序列号24表示的碱基序列构成的DNA和序列号25表示的碱基序列构成的DNA的组合作为引物对，使用Pfu turbo DNA聚合酶(Stragene公司制)以及附加的缓冲液进行PCR。用BamHI(宝酒造社制)处理由PCR获得的约1.4kb的DNA片段产物，进行琼脂糖凝胶电泳，用GENECLEAN试剂盒(BIO 101公司制)提取，纯化。混合获得的DNA片段和预先由BamHI切断的pUC119(宝酒造社制)，使用连接试剂盒Ver.1(宝酒造公司制)，进行了连接酶反应。
使用该反应产物，按照分子克隆第3版记载的方法转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺社制)。在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养该菌株，挑选转化株。用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基过夜培养该转化株，从获得的培养液中根据碱SDS法(分子克隆第3版)，制备质粒。用NcoI切断该质粒后，用连接试剂盒Ver.1(宝酒造公司制)，进行了连接酶反应使之自我环化，转化大肠杆菌DH5α株，从获得的转化体中制备质粒。用限制性酶研究该质粒的结构，结果确认了该质粒含有在编码ArgF的DNA中缺失了369个碱基对的DNA片段。
(3)ArgF内部序列缺失用质粒的制备2
以该质粒作为模板，以序列号24表示的碱基序列构成的DNA和序列号25表示的碱基序列构成的DNA作为引物对，使用Pfu turbo DNA聚合酶(Stragene公司制)以及附加的缓冲液进行PCR，获得了约1.0kb的DNA片段。在Taq聚合酶(Boehringer Mannhein GmbH.)和dATP存在下，于72℃，使该DNA片段反应10分钟，在3’末端添加1个碱基-腺嘌呤。使用实施例1中制备的pESB30-T和添加了腺嘌呤的DNA片段和连接试剂盒Ver.1(宝酒造公司制)，进行连接酶反应。将获得的质粒命名为pEargF。
(4)在ArgB中具有氨基酸取代的ArgF内部序列缺失株的制备
除了使用B26株，B31株，R株，RB26株，RB31株和ATCC13032株作为宿主菌，使用pEargF作为质粒以外，其余进行与实施例2(1)相同的操作，获得了对于各菌株中，编码染色体上的ArgF的DNA内被该DNA的369个碱基对缺失了的DNA取代的菌株。将这些菌株分别命名为FB26株，FB31株，FR株，FRB26株，FRB31株和F株。
实施例5
由ArgB中具有氨基酸取代的ArgF内部序列缺失株生产L-鸟氨酸的试验
在BY琼脂培养基中，于30℃培养实施例4制备的FB26株，FB31株，FR株，FRB26株，FRB31株，F株和ATCC13032株24小时。将各菌株分别接种于含有6ml种子培养基(1L水中含有25g蔗糖，0.5g磷酸二氢钾，1.5g磷酸氢二钾，0.5g硫酸镁，20g胰蛋白胨，3g尿素，50μg生物素，0.3gL-精氨酸，加入了10g碳酸钙的培养基)的试管中，于32℃一边振荡一边培养24小时。将获得的2mL种子培养液分别接种于含有20mL主体培养培养基(930mL水中含有100g葡萄糖，30g硫酸铵，0.6g硫酸镁，0.5g磷酸二氢钾，0.25gL-精氨酸，16mg硫酸铁七水化合物，16mg硫酸锰五水化合物，4.9mg硫酸锌七水化合物，4.9mg硫酸铜七水化合物，16mg氯化钙，16mgβ-丙氨酸，8mg盐酸硫胺，180μg生物素，16g玉米浆，用氢氧化钠水溶液调整成pH7.2后，加入了30g碳酸钙的培养基)的带有挡板的瓶中，于32℃一边振荡一边培养48小时。
通过离心分离从培养物中除去菌体，用高效液相色谱(HPLC)定量上清中的L-鸟氨酸的累积量。结果示于表2。
表2
| 菌株 | OD660nm | L-鸟氨酸(g/l) |
| ATCC13032 | 49 | 0.0 |
| F | 22 | 5.0 |
| FB26 | 22 | 5.3 |
| FB31 | 21 | 5.2 |
| FR | 22 | 5.3 |
| FRB26 | 21 | 6.2 |
| FRB31 | 20 | 6.0 |
如表2表明，带有具有序列号4表示的碱基序列的DNA的、并且ArgF和ArgF内有缺失的FRB26株和带有具有序列号10表示的碱基序列的DNA并且在ArgF和ArgF内有缺失的FRB31株的L-鸟氨酸的产量比其它株的L-鸟氨酸的产量明显要高。
实施例6
ArgB的第26位的丙氨酸被取代为亮氨酸或异亮氨酸的ArgR内部序列缺失株的制备
(1)ArgB的1个氨基酸取代用质粒的制备
用DNA合成仪合成由与序列号2表示的碱基序列的第76-78位的区域被取代为ctg的、序列号6表示的碱基序列(编码序列号1表示的氨基酸序列的第26位的丙氨酸被取代为亮氨酸的、序列号5表示的氨基酸序列)的第68-89位的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA(序列号26表示的碱基序列构成的DNA)，和序列号6表示的碱基序列的第65-87位的碱基序列构成的DNA(序列号27表示的碱基序列构成的DNA)。
用DNA合成仪合成由与序列号2表示的碱基序列的第76-78位的区域被取代为atc的、序列号8表示的碱基序列(编码序列号1表示的氨基酸序列的第26位的丙氨酸被取代为异亮氨酸的、序列号7表示的氨基酸序列)的第68-89位的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA(序列号28表示的碱基序列构成的DNA)，和序列号8表示的碱基序列的第65-87位的碱基序列构成的DNA(序列号29表示的碱基序列构成的DNA)。
在实施例1的(2)中，除了使用序列号26和27表示的碱基序列构成的DNA代替序列号15和16表示的碱基序列构成的DNA之外，其余进行与之同样的操作，获得了具有序列号6表示的碱基序列的约1.0kb的DNA片段。此外，在实施例1的(2)中，除了使用序列号28和29表示的碱基序列构成的DNA代替序列号15和16表示的碱基序列构成的DNA之外，其余进行与之同样的操作，获得了具有序列号8表示的碱基序列的约1.0kb的DNA片段。
在实施例1的(4)中，除了使用具有序列号6或8表示的碱基序列的DNA的DNA片段代替具有序列号4或10表示的碱基序列的DNA的DNA片段之外，其余进行与之同样的操作，获得了在质粒pESB30-T中整合有具有序列号6或8表示的碱基序列的DNA的质粒。将这些质粒分别命名为pEargB26L和pEargB26I。
(2)向ArgR内部序列缺失株导入ArgB1个氨基酸取代
除了使用R株作为宿主，使用pEargB26L和pEargB26I作为质粒以外，其余进行与实施例2(1)相同的操作，获得了R株中编码染色体上的ArgB的DNA被具有序列号6的碱基序列的DNA取代的菌株，和编码染色体上的ArgB的DNA被具有序列号8表示的碱基序列的DNA取代的菌株。将这些菌株分别命名为RB26L株，RB26I株。
(3)由ArgB氨基酸取代和ArgR内部序列缺失株生产L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的试验
除了使用RB26株，RB26L株和RB26I株之外，其余用与实施例3相同的操作研究这些菌株的L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的产率。
结果示于表3。
表3
| 菌株 | OD660nm | L-精氨酸(g/l) | L-鸟氨酸(g/l) | L-瓜氨酸(g/l) |
| ATCC13032 | 48 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| RB26 | 43 | 3.0 | 0.2 | 1.0 |
| RB26L | 41 | 3.3 | 0.3 | 1.2 |
| RB26I | 41 | 4.1 | 0.4 | 1.8 |
如表3表明，带有具有序列号6表示的碱基序列的DNA的RB26L株和带有具有序列号8表示的碱基序列的DNA的RB26I株，与带有具有序列号4表示的碱基序列的DNA的RB26一样地生产L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸。并且，RB26L株和RB26I株的这些氨基酸的产量比RB26株的产量高。
实施例7
由ArgB氨基酸取代和ArgG内部序列缺失株生产L-瓜氨酸
以与含有编码谷氨酸棒杆菌的ArgG的DNA的碱基序列的序列号32表示的碱基序列为基础合成引物，构建含有在编码ArgG的DNA中缺失了约400个碱基对的DNA片段的质粒。
根据该质粒制备在编码ArgG的DNA中缺失了约400个碱基对的DNA片段，在该DNA片段的3’末端添加1个碱基-腺嘌呤。以通过使用实施例1中制备的pESB30-T，添加了腺嘌呤的DNA片段和连接试剂盒Ver.1(宝酒造公司制)进行连接酶反应获得的质粒作为pEargG。
以上方法可以按照实施例4记载的方法进行。
除了使用B26株，B31株，R株，RB26株，RB31株和ATCC13032株作为宿主菌，使用pEargG作为质粒以外，其余进行与实施例2(1)相同的操作，制备对于各菌株中，编码染色体上的ArgG的DNA内被该DNA的约400个碱基对缺失了的DNA取代的菌株，分别命名为GB26株，GB31株，GR株，GRB26株，GRB31株和G株。
在BY琼脂培养基中，于30℃培养GB26株，GB31株，GR株，GRB26株，GRB31株和G株和ATCC13032株24小时。将各菌株分别接种于含有6ml种培养基(1L水中含有25g蔗糖，0.5g磷酸二氢钾，1.5g磷酸氢二钾，0.5g硫酸镁，20g胰蛋白胨，3g尿素，50μg生物素，0.3gL-精氨酸，加入了10g碳酸钙的培养基)的试管中，于32℃一边振荡一边培养24小时。将获得的2mL种子培养液分别接种于含有20mL主体培养培养基(930mL水中含有100g葡萄糖，30g硫酸铵，0.6g硫酸镁，0.5g磷酸二氢钾，0.25gL-精氨酸，16mg硫酸铁七水化合物，16mg硫酸锰五水化合物，4.9mg硫酸锌七水化合物，4.9mg硫酸铜七水化合物，16mg氯化钙，16mgβ-丙氨酸，8mg盐酸硫胺，180μg生物素，16g玉米浆，用氢氧化钠水溶液调整成pH7.2后，加入了30g碳酸钙的培养基)的带有挡板的瓶中，于32℃一边振荡一边培养48小时。
通过离心分离从培养物中除去菌体，用高效液相色谱(HPLC)定量上清中的L-瓜氨酸的累积量。
工业上的可利用性
如果根据本发明，可以获得改良的N-乙酰谷氨酸激酶及编码它的DNA，通过使用带有该DNA的微生物，可以有效生产L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸。
序列表free-text
序列号13-人工序列的说明：合成DNA
序列号14-人工序列的说明：合成DNA
序列号15-人工序列的说明：合成DNA
序列号16-人工序列的说明：合成DNA
序列号17-人工序列的说明：合成DNA
序列号18-人工序列的说明：合成DNA
序列号20-人工序列的说明：合成DNA
序列号21-人工序列的说明：合成DNA
序列号22-人工序列的说明：合成DNA
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序列号24-人工序列的说明：合成DNA
序列号25-人工序列的说明：合成DNA
序列号26-人工序列的说明：合成DNA
序列号27-人工序列的说明：合成DNA
序列号28-人工序列的说明：合成DNA
序列号29-人工序列的说明：合成DNA
序列表
<110>协和发酵工业株式会社
<120>L-精氨酸，L-鸟氨酸或L-瓜氨酸的制备方法
<130>1000P11719
<150>JP2004-280855
<151>2004-09-28
<160>32
<170>PatentIn Ver.3.1
<210>1
<211>294
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)
<400>1
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<221>CDS
<222>(548)..(1060)
<400>19
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cgacagcctc gacgaggttg ccggcgccga tgttgtcatc accgatacct gggtatccat 300
gggtatggaa aacgacggca tcgatcgcac cacacctttc gttccttacc aggtcaacga 360
tgaggtcatg gcgaaagcta acgacggcgc catcttcctg cactgccttc ctgcctaccg 420
tggcaaagaa gtggcagcct ccgtgattga tggaccagcg tccaaagttt tcgatgaagc 480
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gtaagac atg tcc ctt ggc tca acc ccg tca aca ccg gaa aac tta aat 589
Met Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ser Thr Pro Glu Asn Leu Asn
1 5 10
ccc gtg act cgc act gca cgc caa gct ctc att ttg cag att ttg gac 637
Pro Val Thr Arg Thr Ala Arg Gln Ala Leu Ile Leu Gln Ile Leu Asp
15 20 25 30
aaa caa aaa gtc acc agc cag gta caa ctg tct gaa ttg ctg ctg gat 685
Lys Gln Lys Val Thr Ser Gln Val Gln Leu Ser Glu Leu Leu Leu Asp
35 40 45
gaa ggc atc gat atc acc cag gcc acc ttg tcc cga gat ctc gat gaa 733
Glu Gly Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Leu Ser Arg Asp Leu Asp Glu
50 55 60
ctc ggt gca cgc aag gtt cgc ccc gat ggg gga cgc gcc tac tac gcg 781
Leu Gly Ala Arg Lys Val Arg Pro Asp Gly Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala
65 70 75
gtc ggc cca gta gat agc atc gcc cgc gaa gat ctc cgg ggt ccg tcg 829
Val Gly Pro Val Asp Ser Ile Ala Arg Glu Asp Leu Arg Gly Pro Ser
80 85 90
gag aag ctg cgc cgc atg ctt gat gaa ctg ctg gtt tct aca gat cat 877
Glu Lys Leu Arg Arg Met Leu Asp Glu Leu Leu Val Ser Thr Asp His
95 100 105 110
tcc ggc aac atc gcg atg ctg cgc acc ccg ccg gga gct gcc cag tac 925
Ser Gly Asn Ile Ala Met Leu Arg Thr Pro Pro Gly Ala Ala Gln Tyr
115 120 125
ctg gca agt ttc atc gat agg gtg ggg ctg aaa gaa gtc gtt ggc acc 973
Leu Ala Ser Phe Ile Asp Arg Val Gly Leu Lys Glu Val Val Gly Thr
130 135 140
atc gct ggt gat gac acc gtt ttc gtt ctc gcc cgt gat ccg ctc aca 1021
Ile Ala Gly Asp Asp Thr Val Phe Val Leu Ala Arg Asp Pro Leu Thr
145 150 155
ggt aaa gaa cta ggt gaa tta ctc agc ggg cgc acc act taaagcgccc 1070
Gly Lys Glu Leu Gly Glu Leu Leu Ser Gly Arg Thr Thr
160 165 170
ctagttcaag gcttgttaat cgcttgttaa tgcaggcagg taaggtataa cccgagtgtt 1130
ttttcgagaa ataccaaccc tttcaacaca ataattttct ttaaacatcc ttgctgtcca 1190
ccacggctgg caaggaactt aaaatgaagg agcacacctc atgactaacc gcatcgttct 1250
tgcatactcc ggcggtctgg acaccactgt ggcaattcca tacctgaaga agatgattga 1310
tggtgaagtc atcgcagttt ccctcgacct gggccagggt ggagagaaca tggacaacgt 1370
tcgccagcgt gcattggatg ccggtgcagc tgagtccatc gttgttgatg caaaggatga 1430
gttcgctgag 1440
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>20
cccagcaggc cttaagggta 20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>21
ctcagcgaac tcatcctttg 20
<210>22
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>22
cccatccact aaacttaaac agccaaggga catgtcttac ct 42
<210>23
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>23
tgtttaagtt tagtggatgg ggatagggtg gggctgaaag aa 42
<210>24
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>24
atatatggat cctgttcttg atggttttaa gcacg 35
<210>25
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>25
atatatggat cctgctatct actgggccga cc 32
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>26
tcggcagcaa acagagcctt ga 22
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>27
atctcaaggc tctgtttgct gcc 23
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>28
tcggcagcaa agatagcctt ga 22
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>29
atctcaaggc tatctttgct gcc 23
<210>30
<211>1332
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<221>CDS
<222>(451)..(1332)
<400>30
aacaacgagc aggcgattaa tgcggctcgc actgttgctc gtgacaattt gttcaagtgc 60
gcaatgtttg gatctgatcc aaactggggt cgcgtgttgg ctgcagtcgg catggctgat 120
gctgatatgg aaccagagaa gatttctgtg ttcttcaatg gtcaagcagt atgccttgat 180
tccactggcg ctcctggtgc tcgtgaggtg gatctttccg gcgctgacat tgatgtccga 240
attgatttgg gcaccagtgg ggaaggccag gcaacagttc gaaccactga cctgagcttc 300
tcctacgtgg agatcaactc cgcgtacagc tcttaaaaag aaacagcact ccaactaaca 360
agcagggaaa agggcacagg catgaatgac ttgatcaaag atttaggctc tgaggtgcgc 420
gcaaatgtcc tcgctgaggc gttgccatgg ttg cag cac ttc cgc gac aag att 474
Leu Gln His Phe Arg Asp Lys Ile
1 5
gtt gtc gtg aaa tat ggc gga aac gcc atg gtg gat gat gat ctc aag 522
Val Val Val Lys Tyr Gly Gly Asn Ala Met Val Asp Asp Asp Leu Lys
10 15 20
gct gct ttt gct gcc gac atg gtc ttc ttg cgc acc gtg ggc gca aaa 570
Ala Ala Phe Ala Ala Asp Met Val Phe Leu Arg Thr Val Gly Ala Lys
25 30 35 40
cca gtg gtg gtg cac ggt ggt gga cct cag att tct gag atg cta aac 618
Pro Val Val Val His Gly Gly Gly Pro Gln Ile Ser Glu Met Leu Asn
45 50 55
cgt gtg ggt ctc cag ggc gag ttc aag ggt ggt ttc cgt gtg acc act 666
Arg Val Gly Leu Gln Gly Glu Phe Lys Gly Gly Phe Arg Val Thr Thr
60 65 70
cct gag gtc atg gac att gtg cgc atg gtg ctc ttt ggt cag gtc ggt 714
Pro Glu Val Met Asp Ile Val Arg Met Val Leu Phe Gly Gln Val Gly
75 80 85
cgc gat tta gtt ggt ttg atc aac tct cat ggc cct tac gct gtg gga 762
Arg Asp Leu Val Gly Leu Ile Asn Ser His Gly Pro Tyr Ala Val Gly
90 95 100
acc tcc ggt gag gat gcc ggc ctg ttt acc gcg cag aag cgc atg gtc 810
Thr Ser Gly Glu Asp Ala Gly Leu Phe Thr Ala Gln Lys Arg Met Val
105 110 115 120
aac atc gat ggc gta ccc act gat att ggt ttg gtc gga gac atc att 858
Asn Ile Asp Gly Val Pro Thr Asp Ile Gly Leu Val Gly Asp Ile Ile
125 130 135
aat gtc gat gcc tct tcc ttg atg gat atc atc gag gcc ggt cgc att 906
Asn Val Asp Ala Ser Ser Leu Met Asp Ile Ile Glu Ala Gly Arg Ile
140 145 150
cct gtg gtc tct acg att gct cca ggc gaa gac ggc cag att tac aac 954
Pro Val Val Ser Thr Ile Ala Pro Gly Glu Asp Gly Gln Ile Tyr Asn
155 160 165
att aac gcc gat acc gca gca ggt gct ttg gct gca gcg att ggt gca 1002
Ile Asn Ala Asp Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ile Gly Ala
170 175 180
gaa cgc ctg ctg gtt ctc acc aat gtg gaa ggt ctg tac acc gat tgg 1050
Glu Arg Leu Leu Val Leu Thr Asn Val Glu Gly Leu Tyr Thr Asp Trp
185 190 195 200
cct gat aag agc tca ctg gtg tcc aag atc aag gcc acc gag ctg gag 1098
Pro Asp Lys Ser Ser Leu Val Ser Lys Ile Lys Ala Thr Glu Leu Glu
205 210 215
gcc att ctt ccg gga ctt gat tcc ggc atg att cca aag atg gag tct 1146
Ala Ile Leu Pro Gly Leu Asp Ser Gly Met Ile Pro Lys Met Glu Ser
220 225 230
tgc ttg aac gcg gtg cgt ggg gga gta agc gct gct cat gtc att gac 1194
Cys Leu Asn Ala Val Arg Gly Gly Val Ser Ala Ala His Val Ile Asp
235 240 245
ggc cgc atc gcg cac tcg gtg ttg ctg gag ctt ttg acc atg ggt gga 1242
Gly Arg Ile Ala His Ser Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Met Gly Gly
250 255 260
att ggc acg atg gtg ctg ccg gat gtt ttt gat cgg gag aat tat cct 1290
Ile Gly Thr Met Val Leu Pro Asp Val Phe Asp Arg Glu Asn Tyr Pro
265 270 275 280
gaa ggc acc gtt ttt aga aaa gac gac aag gat ggg gaa ctg 1332
Glu Gly Thr Val Phe Arg Lys Asp Asp Lys Asp Gly Glu Leu
285 290
<210>31
<211>1440
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<221>CDS
<222>(170)..(1126)
<400>31
cgcgacgtcg caaagcaagc tgttcttgat ggttttaagc acggcgttat tttgaatgca 60
ccggcggaca acattatccg tttgaccccg ccgctggtga tcaccgacga agaaatcgca 120
gacgcagtca aggctattgc cgagacaatc gcataaagga ctcaaactt atg act tca 178
Met Thr Ser
1
caa cca cag gtt cgc cat ttt ctg gct gat gat gat ctc acc cct gca 226
Gln Pro Gln Val Arg His Phe Leu Ala Asp Asp Asp Leu Thr Pro Ala
5 10 15
gag cag gca gag gtt ttg acc cta gcc gca aag ctc aag gca gcg ccg 274
Glu Gln Ala Glu Val Leu Thr Leu Ala Ala Lys Leu Lys Ala Ala Pro
20 25 30 35
ttt tcg gag cgt cca ctc gag gga cca aag tcc gtt gca gtt ctt ttt 322
Phe Ser Glu Arg Pro Leu Glu Gly Pro Lys Ser Val Ala Val Leu Phe
40 45 50
gat aag act tca act cgt act cgc ttc tcc ttc gac gcg ggc atc gct 370
Asp Lys Thr Ser Thr Arg Thr Arg Phe Ser Phe Asp Ala Gly Ile Ala
55 60 65
cat ttg ggt gga cac gcc atc gtc gtg gat tcc ggt agc tca cag atg 418
His Leu Gly Gly His Ala Ile Val Val Asp Ser Gly Ser Ser Gln Met
70 75 80
ggt aag ggc gag tcc ctg cag gac acc gca gct gta ttg tcc cgc tac 466
Gly Lys Gly Glu Ser Leu Gln Asp Thr Ala Ala Val Leu Ser Arg Tyr
85 90 95
gtg gaa gca att gtg tgg cgc acc tac gca cac agc aat ttc cac gcc 514
Val Glu Ala Ile Val Trp Arg Thr Tyr Ala His Ser Asn Phe His Ala
100 105 110 115
atg gcg gag acg tcc act gtg ccg ctg gtg aac tcc ttg tcc gat gat 562
Met Ala Glu Thr Ser Thr Val Pro Leu Val Asn Ser Leu Ser Asp Asp
120 125 130
ctg cac cca tgc cag att ctg gct gat ctg cag act atc gtg gaa aac 610
Leu His Pro Cys Gln Ile Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ile Val Glu Asn
135 140 145
ctc agc cct gaa gaa ggc cca gca ggc ctt aag ggt aag aag gct gtg 658
Leu Ser Pro Glu Glu Gly Pro Ala Gly Leu Lys Gly Lys Lys Ala Val
150 155 160
tac ctg ggc gat ggc gac aac aac atg gcc aac tcc tac atg att ggc 706
Tyr Leu Gly Asp Gly Asp Asn Asn Met Ala Asn Ser Tyr Met Ile Gly
165 170 175
ttt gcc acc gcg ggc atg gat att tcc atc atc gct cct gaa ggg ttc 754
Phe Ala Thr Ala Gly Met Asp Ile Ser Ile Ile Ala Pro Glu Gly Phe
180 185 190 195
cag cct cgt gcg gaa ttc gtg gag cgc gcg gaa aag cgt ggc cag gaa 802
Gln Pro Arg Ala Glu Phe Val Glu Arg Ala Glu Lys Arg Gly Gln Glu
200 205 210
acc ggc gcg aag gtt gtt gtc acc gac agc ctc gac gag gtt gcc ggc 850
Thr Gly Ala Lys Val Val Val Thr Asp Ser Leu Asp Glu Val Ala Gly
215 220 225
gcc gat gtt gtc atc acc gat acc tgg gta tcc atg ggt atg gaa aac 898
Ala Asp Val Val Ile Thr Asp Thr Trp Val Ser Met Gly Met Glu Asn
230 235 240
gac ggc atc gat cgc acc aca cct ttc gtt cct tac cag gtc aac gat 946
Asp Gly Ile Asp Arg Thr Thr Pro Phe Val Pro Tyr Gln Val Asn Asp
245 250 255
gag gtc atg gcg aaa gct aac gac ggc gcc atc ttc ctg cac tgc ctt 994
Glu Val Met Ala Lys Ala Asn Asp Gly Ala Ile Phe Leu His Cys Leu
260 265 270 275
cct gcc tac cgt ggc aaa gaa gtg gca gcc tcc gtg att gat gga cca 1042
Pro Ala Tyr Arg Gly Lys Glu Val Ala Ala Ser Val Ile Asp Gly Pro
280 285 290
gcg tcc aaa gtt ttc gat gaa gca gaa aac cgc ctc cac gct cag aaa 1090
Ala Ser Lys Val Phe Asp Glu Ala Glu Asn Arg Leu His Ala Gln Lys
295 300 305
gca ctg ctg gtg tgg ctg ctg gcc aac cag ccg agg taagacatgt 1136
Ala Leu Leu Val Trp Leu Leu Ala Asn Gln Pro Arg
310 315
cccttggctc aaccccgtca acaccggaaa acttaaatcc cgtgactcgc actgcacgcc 1196
aagctctcat tttgcagatt ttggacaaac aaaaagtcac cagccaggta caactgtctg 1256
aattgctgct ggatgaaggc atcgatatca cccaggccac cttgtcccga gatctcgatg 1316
aactcggtgc acgcaaggtt cgccccgatg ggggacgcgc ctactacgcg gtcggcccag 1376
tagatagcat cgcccgcgaa gatctccggg gtccgtcgga gaagctgcgc cgcatgcttg 1436
atga 1440
<210>32
<211>1806
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<221>CDS
<222>(301)..(1503)
<400>32
aagtttcatc gatagggtgg ggctgaaaga agtcgttggc accatcgctg gtgatgacac 60
cgttttcgtt ctcgcccgtg atccgctcac aggtaaagaa ctaggtgaat tactcagcgg 120
gcgcaccact taaagcgccc ctagttcaag gcttgttaat cgcttgttaa tgcaggcagg 180
taaggtataa cccgagtgtt ttttcgagga ataccaaccc tttcaacaca ataattttct 240
ttaaacatcc ttgctgtcca ccacggctgg caaggaactt aaaatgaagg agcacacctc 300
atg act aac cgc atc gtt ctt gca tac tcc ggc ggt ctg gac acc act 348
Met Thr Asn Arg Ile Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Thr
1 5 10 15
gtg gca att cca tac ctg aag aag atg att gat ggt gaa gtc atc gca 396
Val Ala Ile Pro Tyr Leu Lys Lys Met Ile Asp Gly Glu Val Ile Ala
20 25 30
gtt tcc ctc gac ctg ggc cag ggt gga gag aac atg gac aac gtt cgc 444
Val Ser Leu Asp Leu Gly Gln Gly Gly Glu Asn Met Asp Asn Val Arg
35 40 45
cag cgt gca ttg gat gcc ggt gca gct gag tcc atc gtt gtt gat gca 492
Gln Arg Ala Leu Asp Ala Gly Ala Ala Glu Ser Ile Val Val Asp Ala
50 55 60
aag gat gag ttc gct gag gag tac tgc ctg cca acc atc aag gca aac 540
Lys Asp Glu Phe Ala Glu Glu Tyr Cys Leu Pro Thr Ile Lys Ala Asn
65 70 75 80
ggc atg tac atg aag cag tac cca ctg gtt tct gca atc tcc cgc cca 588
Gly Met Tyr Met Lys Gln Tyr Pro Leu Val Ser Ala Ile Ser Arg Pro
85 90 95
ctg atc gtc aag cac ctc gtt gag gct ggc aag cag ttc aac ggt acc 636
Leu Ile Val Lys His Leu Val Glu Ala Gly Lys Gln Phe Asn Gly Thr
100 105 110
cac gtt gca cac ggc tgc act ggt aag ggc aac gac cag gtt cgt ttc 684
His Val Ala His Gly Cys Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gln Val Arg Phe
115 120 125
gag gtc ggc ttc atg gac acc gat cca aac ctg gag atc att gca cct 732
Glu Val Gly Phe Met Asp Thr Asp Pro Asn Leu Glu Ile Ile Ala Pro
130 135 140
gct cgt gac ttc gca tgg acc cgc gac aag gct atc gcc ttc gcc gag 780
Ala Arg Asp Phe Ala Trp Thr Arg Asp Lys Ala Ile Ala Phe Ala Glu
145 150 155 160
gag aac aac gtt cca atc gag cag tcc gtg aag tcc cca ttc tcc atc 828
Glu Asn Asn Val Pro Ile Glu Gln Ser Val Lys Ser Pro Phe Ser Ile
165 170 175
gac cag aac gtc tgg ggc cgc gct att gag acc ggt tac ctg gaa gat 876
Asp Gln Asn Val Trp Gly Arg Ala Ile Glu Thr Gly Tyr Leu Glu Asp
180 185 190
ctg tgg aat gct cca acc aag gac atc tac gca tac acc gag gat cca 924
Leu Trp Asn Ala Pro Thr Lys Asp Ile Tyr Ala Tyr Thr Glu Asp Pro
195 200 205
gct ctg ggt aac gct cca gat gag gtc atc atc tcc ttc gag ggt ggc 972
Ala Leu Gly Asn Ala Pro Asp Glu Val Ile Ile Ser Phe Glu Gly Gly
210 215 220
aag cca gtc tcc atc gat ggc cgt cca gtc tcc gta ctg cag gct att 1020
Lys Pro Val Ser Ile Asp Gly Arg Pro Val Ser Val Leu Gln Ala Ile
225 230 235 240
gaa gag ctg aac cgt cgt gca ggc gca cag ggc gtt ggc cgc ctt gac 1068
Glu Glu Leu Asn Arg Arg Ala Gly Ala Gln Gly Val Gly Arg Leu Asp
245 250 255
atg gtt gag gac cgt ctc gtg ggc atc aag tcc cgc gaa atc tac gaa 1116
Met Val Glu Asp Arg Leu Val Gly Ile Lys Ser Arg Glu Ile Tyr Glu
260 265 270
gca cca ggc gca atc gca ctg att aag gct cac gag gct ttg gaa gat 1164
Ala Pro Gly Ala Ile Ala Leu Ile Lys Ala His Glu Ala Leu Glu Asp
275 280 285
gtc acc atc gag cgc gaa ctg gct cgc tac aag cgc ggc gtt gac gca 1212
Val Thr Ile Glu Arg Glu Leu Ala Arg Tyr Lys Arg Gly Val Asp Ala
290 295 300
cgt tgg gct gag gaa gta tac gac ggc ctg tgg ttc gga cct ctg aag 1260
Arg Trp Ala Glu Glu Val Tyr Asp Gly Leu Trp Phe Gly Pro Leu Lys
305 310 315 320
cgc tcc ctg gac gcg ttc att gat tcc acc cag gag cac gtc acc ggc 1308
Arg Ser Leu Asp Ala Phe Ile Asp Ser Thr Gln Glu His Val Thr Gly
325 330 335
gat atc cgc atg gtt ctg cac gca ggt tcc atc acc atc aat ggt cgt 1356
Asp Ile Arg Met Val Leu His Ala Gly Ser Ile Thr Ile Asn Gly Arg
340 345 350
cgt tcc agc cac tcc ctg tac gac ttc aac ctg gct acc tac gac acc 1404
Arg Ser Ser His Ser Leu Tyr Asp Phe Asn Leu Ala Thr Tyr Asp Thr
355 360 365
ggc gac acc ttc gac cag acc ctg gct aag ggc ttt gtc cag ctg cac 1452
Gly Asp Thr Phe Asp Gln Thr Leu Ala Lys Gly Phe Val Gln Leu His
370 375 380
ggt ctg tcc tcc aag atc gct aac aag cgc gat cgc gaa gct ggc aac 1500
Gly Leu Ser Ser Lys Ile Ala Asn Lys Arg Asp Arg Glu Ala Gly Asn
385 390 395 400
aac taagccacct tttcaagcat ccagactaga acttcaagta tttagaaagt 1553
Asn
agaagaacac cacatggaac agcacggaac caatgaaggt gcgctgtggg gcggccgctt 1613
ctccggtgga ccctccgagg ccatgttcgc cttgagtgtc tccactcatt tcgactgggt 1673
tttggcccct tatgatgtgt tggcctccaa ggcacacgcc aaggttttgc accaagcaga 1733
tctactttct gatgaagatc tagccaccat gctggctggg cttgatcagc tgggcaagga 1793
tgtcgccgac gga 1806
Claims (12)
1.一种多肽，由选自序列号3、5、7、9和11表示的氨基酸序列的氨基酸序列构成。
2.一种DNA，编码权利要求1所述的多肽。
3.一种DNA，其由从序列号4、6、8、10和12表示的碱基序列中选出的碱基序列构成。
4.通过在载体中整合权利要求2或3所述的DNA获得的重组体DNA。
5.通过导入权利要求4所述的重组体DNA获得的微生物。
6.具有权利要求2或3任一项所述的DNA的微生物。
7.权利要求5或6所述的微生物，其特征在于，精氨酸抑制子对精氨酸操纵子的转录抑制活性降低或丧失。
8.权利要求5-7任一项所述的微生物，其特征在于，鸟氨酸氨甲酰转移酶活性降低或丧失。
9.权利要求5-8任一项所述的微生物，其特征在于，精氨基琥珀酸合酶活性降低或丧失。
10.权利要求5-9任一项所述的微生物，其中，所述微生物是属于棒杆菌(Corynebacterium)属的微生物。
11.权利要求5-10任一项所述的微生物，其中，所述微生物是属于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的微生物。
12.L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸的制备方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求5-11任一项所述的微生物，使培养物中生成L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸，并累积，从该培养物中获得L-精氨酸、L-鸟氨酸或L-瓜氨酸。
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Owner name: XIEHE FERMENTATION BIOCHEMICAL CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. Effective date: 20090508 |
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Effective date of registration: 20090508 Address after: Tokyo, Japan Applicant after: Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Address before: Tokyo, Japan Applicant before: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. |
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