ES2340405T3 - Metodo para producir l-arginina, l-ornitina o l-citrulina. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que tiene: (i) una secuencia de aminoácidos en la que están sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 20 a 38 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1; o (ii) una secuencia de aminoácidos en la que están sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 20 a 38 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 y se han suprimido, sustituido o añadido de 1 a 20 radicales de aminoácido en la región en las posiciones 1 a 19 o de 39 a 294 y que tiene actividad N-acetil glutamato quinasa.
Description
Método para producir L-arginina,
L-ornitina o L-citrulina.
La presente invención se refiere a un proceso
para producir L-arginina, L-ornitina
o L-citrulina.
En los microorganismos, se biosintetiza la
L-arginina a partir de ácido
L-glutámico a través de ocho etapas de reacción.
L-ornitina y L-citrulina son
productos intermedios de la ruta de biosíntesis de
L-arginina. La biosíntesis de
L-arginina, L-ornitina y
L-citrulina está regulada de manera similar a la de
otros aminoácidos.
En las bacterias corineformes, por ejemplo, la
transcripción de un operón compuesto de genes que codifican las
enzimas responsables de la biosíntesis de L-arginina
(en adelante, abreviado operón de arginina) es reprimida por el
represor de arginina (en adelante denominado ArgR) (ver publicación
de patente Nº1). Se sabe que en la bacteria corineforme
N-acetilglutamato quinasa, que es la segunda enzima
en la ruta de biosíntesis a partir de ácido
L-glutámico de L-arginina (EC:
2.7.2.8, en adelante a veces abreviado ArgB), está sujeta a la
inhibición por retroalimentación a través de
L-arginina (ver la publicación no patente Nº 2).
L-arginina,
L-ornitina y L-citrulina se producen
utilizando microorganismos así como otros aminoácidos, y se han
llevado a cabo estudios, como en el caso de otros aminoácidos, para
favorecer la productividad de estos aminoácidos a través del uso de
medios como mutación y técnicas de ADN recombinante.
Por ejemplo, existe un informe de la obtención
de Corynebacterium glutamicum K65 (FERM
BP-1115) que tiene una mejor productividad de
arginina por transformación de Corynebacterium glutamicum con
un fragmento de ADN que contiene un gen responsable de la
biosíntesis de arginina y la realización después de mutagénesis (ver
publicación de patente Nº 2).
Se han obtenido también por mutagénesis
Corynebacterium glutamicum en la que se cancela la represión
de las enzimas de la biosíntesis de arginina (ver la publicación no
patente Nº 1) y Corynebacterium glutamicum en la que se
cancela la represión de las enzimas de la biosíntesis de arginina,
se desensibiliza la inhibición por retroalimentación a través de
L-arginina y se potencia la permeabilidad de
membrana de L-argina (ver la publicación no patente
Nº 3).
Se ha obtenido la bacteria corineforme en la que
se destruye ADN que codifica ArgR (ver publicación de patente Nº1) a
través de técnicas de ADN recombinante.
No obstante, no existe ningún informe hasta la
fecha a cerca de qué mutación debería introducirse en el ADN que
codifica ArgB o ArgR para obtener una cepa en la que se introduzcan
las mutaciones en los dos ADNs que codifican respectivamente ArgB y
ArgR y que suponga una mejor productividad de
L-arginina.
Publicación de patente Nº1:
Solicitud de patente sin examinar publicada
japonesa Nº 51790/02
\vskip1.000000\baselineskip
Publicación de patente Nº 2:
Solicitud de patente sin examinar publicada
japonesa Nº 79597/88
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Publicación no patente Nº 1:
Agricultural & Biológical Chemistry, vol.
43, p. 105-111 (1979)
\vskip1.000000\baselineskip
Publicación no patente Nº 2:
Journal of Bacteriology, vol. 91, p. 617
(1966)
\vskip1.000000\baselineskip
Publicación no patente Nº 3:
Agricultural & Biological Chemistry, vol.
36, p. 1675-1684 (1972).
Uno de los objetos de la presente invención
consiste en proporcionar un proceso eficiente para producir
L-arginina, L-ornitina, o
L-citrulina.
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La presente invención se refiere a los
siguientes puntos (1) a (18):
(1) Un polipéptido que tiene:
- (i)
- una secuencia de aminoácidos en la que uno o más de los radicales de aminoácido está sustituido en la región en las posiciones 20 a 38 desde el término N de la secuencia de aminoácidos que se presenta en SEQ ID NO: 1; o
- (ii)
- una secuencia de aminoácidos en la que está sustituido uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 20 a 38 desde el término N de la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 1 y están suprimidos, sustituidos a añadidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 1 a 19 o 39 a 294; y que tiene actividad N-acetilglutamato quinasa.
(2) Un polipéptido que tiene:
- (i)
- una secuencia de aminoácidos en la que uno o más de los radicales de aminoácido está sustituido en la región en las posiciones 26 a 31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos que se presenta en SEQ ID NO: 1; o
- (ii)
- una secuencia de aminoácidos en la que está sustituido uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 26 a 31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 1 y están suprimidos, sustituidos a añadidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 1 a 25 o 32 a 294; y que tiene actividad N-acetilglutamato quinasa.
(3) Un polipéptido que tiene:
- (i)
- una secuencia de aminoácidos en la que está sustituido el radical de aminoácido en la posición 26 a 31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos que se presenta en SEQ ID NO:1;
- (ii)
- una secuencia de aminoácidos en la que están sustituidos los radicales de aminoácido en las posiciones 26 a 31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO:1; o
- (iii)
- una secuencia de aminoácidos en la que están suprimidos, sustituidos o añadidos uno o más de los radicales de aminoácido que no son los que están en las posiciones sustituidas en la secuencia de aminoácidos de los puntos (i) y (ii) anteriores, y que tiene actividad N-acetilglutamato quinasa.
(4) Un polipéptido que tiene:
- (i)
- una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos presentadas en las SEQ ID NOS:3, 5, 7, 9, y 11;
- (ii)
- una secuencia de aminoácidos en las que están suprimidos, sustituidos o añadidos uno o más radicales de aminoácido distintos al radical 26 en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos presentadas en las SEQ ID NOS: 3, 5 y 7;
- (iii)
- una secuencia de aminoácidos en la que están suprimidos, sustituidos o añadidos uno o más radicales de aminoácido distintos al radical 31 en la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 9; o
- (iv)
- una secuencia de aminoácidos en las que están suprimidos, sustituidos o añadidos uno o más radicales de aminoácido distintos a los radicales 26 y 31 en la secuencia de aminoácidos que se presenta en la SEQ ID NO: 11, y que tiene actividad N-acetilglutamato quinasa.
(5) Un ADN que codifica el polipéptido con
arreglo a uno de los puntos (1) a (4) anteriores.
(6) Un ADN que tiene una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de
nucleótido que se presentan en las SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 y 12.
(7) Un ADN que se híbrida con ADN que consiste
en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de
nucleótidos de ADN que codifica un polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos que se presenta en SEQ ID NO:1 en
condiciones estrictas, que se selecciona del grupo que consiste en
los siguientes puntos (i) a (iii):
- (i)
- ADN que codifica un polipéptido en el que el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 26 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 es un radical de aminoácido distinto a L-arginina;
- (ii)
- ADN que codifica un polipéptido en el que el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:1 es un radical de aminoácido distinto a L-metionina; y
- (iii)
- ADN que codifica un polipéptido en el que el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 26 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO:1 es un radical de aminoácido distinto a L-alanina y el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 31 es un radical de aminoácido distinto a L-metionina, y que codifica un polipéptido que tiene actividad N-acetilglutamato quinasa.
(8) El ADN según el punto (7) anterior en el que
el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición
26 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 1 es L-valina, L-leucina,
o L-isoleucina y el radical de aminoácido que
corresponde al radical en la posición 31 es
L-valina.
(9) Un ADN que se híbrida con ADN que consiste
en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de
nucleótidos de ADN que codifica un polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 en condiciones
estrictas, que se selecciona del grupo que consiste en los
siguientes puntos (i) a (iii)
- (i)
- ADN que tiene una secuencia de nucleótidos en la que la región que corresponde a la región en las posiciones 76 a 78 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 1 es guanina-timidaina-timidina, citosina-timidina-guanina o adenina-timidina-citosina.
- (ii)
- ADN que tiene una secuencia de nucleótidos en la que la región que corresponde a la región en las posiciones 91 a 93 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:2 es guanina-timidina-guanina; y
- (iii)
- ADN que tiene una secuencia de nucleótidos en la que la región que corresponde a la región en las posiciones 76 a 78 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:2 es guanina-timidina-timidina, citosina-timidina-guanina o adenina-timidina-citosina y la región que corresponde a la región en las posiciones 91 a 93 es guanina-timidina-guanina y
que codifica un polipéptido que tiene actividad
N-acetilglutamato quinasa.
(10) Un ADN recombinante que se obtiene
incorporando el ADN según cualquiera de los puntos (5) a (9)
anteriores en un vector;
(11) Un microorganismo que se obtiene
introduciendo el ADN recombinante según el punto (10) anterior.
(12) Un microorganismo que tiene el ADN según
cualquiera de los puntos (5) a (9) anteriores.
(13) El microorganismo según los puntos
anteriores (11) o (12), en el que la actividad de represión de la
transcripción del represor de arginina en el operón de arginina está
reducida o perdida.
(14) El microorganismo según cualquiera de los
puntos anteriores (11) a (13) en el que la actividad de ornitina
carbamoil transferasa está reducida o perdida.
(15) El microorganismo según cualquiera de los
puntos anteriores (11) a (14) en el que se reduce o se pierde la
actividad de argininosuccinato sintasa.
(16) El microorganismo según cualquiera de los
puntos (11) a (15), siendo dicho microorganismo un microorganismo
que pertenece al género Corynebacterium.
(17) El microorganismo según cualquiera de los
puntos anteriores (11) a (16) siendo el microorganismo un
microorganismo que pertenece a Corynebacterium
glutamicum.
(18) Un proceso para producir
L-arginina, L-ornitina o
L-citrulina que comprende el cultivo del
microorganismo con arreglo a cualquiera de los puntos anteriores
(11) a (17) en un medio, que permite la formación y acumulación de
L-arginina, L-ornitina o
L-citrulina en el cultivo, y la recuperación de
L-arginina, L-ornitina o
L-citrulina desde el cultivo.
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La presente invención proporciona un proceso
eficiente para producir L-arginina,
L-orinitina o L-citrulina.
Los polipéptidos de la presente invención
incluyen un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en
la que están sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la
región en las posiciones 20 a 38 desde el término N de la secuencia
de aminoácidos que se presenta en la SEQ ID NO: 1 y que tiene
actividad N-acetilglutamato quinasa (en adelante
denominada actividad ArgB).
La secuencia de aminoácidos que se presenta en
SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de ArgB de
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 y es codificada por
ADN que tiene la secuencia de nucleótidos que se presenta en SEQ ID
NO: 2. El ADN que tiene la secuencia de nucleótidos que se presenta
en SEQ ID NO: 2 está registrada como NCg11342 en
DDBJ/GenBank/EMBL.
Se supone que la región que consiste en la
secuencia de aminoácidos en las posiciones 20 a 38 desde el término
N de la secuencia de aminoácidos que se presenta en SEQ ID NO: 1 es
una región que forma una a-hélice, a juzgar por la
reacción entre la secuencia de aminoácidos de ArgB de Escherichia
coli y su estructura tridimensional [Estructura 10,
329-342 (2002)] y por la homología de dicha
secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de ArgB de
Corynebacterium glutamatum.
La sustitución de aminoácidos puede darse en
cualquier sitio en la región en las posiciones 20 a 38 desde el
término N de la secuencia de aminoácidos que se presenta en SEQ ID
NO: 1, pero el sitio de sustitución está preferiblemente en la
región en las posiciones 26 a 31.
El número de radicales de aminoácido que están
sustituidos no está limitado específicamente siempre y cuando tenga
actividad ArgB un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos
sustituida, preferiblemente actividad ArgB en la que se reduce o se
elimina la inhibición por retroalimentación a través de
L-arginina. El número adecuado es preferiblemente de
1 a 10, más preferiblemente de 1 a 5, siendo sobre todo preferible 1
ó 2.
Puede confirmarse que el polipéptido tiene
actividad ArgB en la que se reduce o se cancela la inhibición por
retroalimentación a través de L-arginina comprobando
que su actividad ArgB en presencia de L-arginina es
mayor que la del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos
que se presenta en la SEQ ID NO: 1 en presencia de
L-arginina. La concentración de
L-arginina es preferiblemente 5 mmoles/l o más,
siendo aún más preferible 10 mmoles/l o más.
La actividad ArgB del polipéptido se puede medir
por ejemplo a través de métodos como es el método en el que se
determina colorimétricamente el ácido pirúvico formado por reacción
del sistema ácido fosfoenolpirúvico-piruvato
quinasa como 2,4-dinitrofenilhidrazona utilizando
ATP y ácido
N-acetil-L-glutámico
como sustrato [Meth. Enzymol., 17, 251-255 (1970)];
y un método en el que se determina acetilglutamato
5-fosfato que se forma por reacción de ATP y ácido
N-acetil-L-glutámico
con hidroxilamina, como un ácido hidroxámico [Meth. Enzymol.,
17, 269-272 (1970)].
Los aminoácidos que se sustituyan no están
específicamente limitados siempre y cuando el polipéptido que tiene
la secuencia de aminoácidos sustituida tenga actividad ArgB,
preferiblemente actividad ArgB en la que la inhibición por
retroalimentación a través de L-arginina está
reducida o cancelada, y pueden ser naturales o no.
Entre los ejemplos de aminoácidos naturales se
incluyen L-alanina, L-asparagina,
ácido L-aspártico, L-glutamina,
ácido L-glutámico, glicina,
L-histidina, L-isoleucina,
L-leucina, L-lisina,
L-arginina, L-metionina,
L-fenilalanina, L-prolina,
L-serina, L-treonina,
L-triptofano, L-tirosina,
L-valina y L-cisteína.
A continuación, se indican ejemplos de
aminoácidos que tienen la capacidad de sustitución mutua. Los
aminoácidos en el mismo grupo pueden sustituirse mutuamente.
- Grupo A:
- leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2-aminobutanoico, metionina, O-metil serina, t-butil glicina, t-butilalanina, ciclohexil alanina
- Grupo B:
- Ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico, ácido 2-aminosubérico.
- Grupo C:
- asparagina, glutamina
- Grupo D:
- lisina, arginina, ornitiina, ácido 2,4-diaminobutanoico, ácido 2,3-diaminopropiónico
- Grupo E:
- prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina
- Grupo F:
- serina, treonina, homoserina
- Grupo G:
- fenilalanina, tirosina.
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Los polipéptidos de la presente invención
incluyen también un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos en la que el radical de aminoácido en la posición 25 o
31, o los dos radicales aminoácido en las posiciones 26 y 31 desde
el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO:
1 están sustituidos y tienen actividad ArgB.
En el polipéptido de la presente invención, uno
o más de los radicales aminoácido puede estar suprimido, sustituido
o añadido en otros sitios distintos a los sitios que han sido
sustituidos en la secuencia de aminoácidos siempre y cuando el
polipéptido tenga actividad ArgB.
El número de radicales de aminoácido que están
suprimidos, sustituidos o añadidos no está limitado específicamente,
siendo el número adecuado de 1 a docenas, preferiblemente de 1 a 20,
más preferible de 1 a 10, siendo sobre todo preferible de 1 a 5.
Los radicales de aminoácido que se sustituyen
son los mismos que los radicales de aminoácido mencionados que
tienen la capacidad de ser sustituidos en la región en la posición
20 a 38 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada
en SEQ ID NO: 1.
La "supresión, sustitución o adición" se
refiere a la supresión, sustitución o adición de uno solo o de
varios radicales de aminoácido en la misma secuencia, y pueden tener
lugar simultáneamente.
Para que el polipéptido de la presente invención
pueda tener actividad ArgB, es deseable que el polipéptido tenga al
menos un 60% de homología, normalmente 80% o más de homología,
específicamente un 95% o más de homología con el polipéptido que
tiene la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1.
En la presente invención, la homología entre las
secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos se puede
determinar utilizando el algoritmo BLAST de Karlin and Alschul
[Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90, 5873 (1993)] y FASTA [Methods
Enzymol., 183, 63 (1990)]. Sobre la base del algoritmo BLAST, se han
desarrollado programas como BLASTIN y BLASTX [J. Mol. Biol., 215,
403 (1990)]. Cuando se analiza una secuencia de nucleótidos a
través de BLASTN sobre la base de BLAST, los parámetros, por
ejemplo, son los siguientes: puntuación = 100 y tamaño de palabra =
12. Cuando se analiza una secuencia de aminoácidos según BLASTX
sobre la base de BLAST, los parámetros, por ejemplo, son los
siguientes: puntuación = 50 y tamaño de palabra = 3. Cuando se
utilizan los programas BLAST y gapped BLAST, se utilizan los
parámetros por defecto de cada uno de los programas. Las técnicas
específicas para estos análisis son conocidas
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Entre los ejemplos más específicos de secuencias
de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención se
incluyen: las secuencias de aminoácidos que se presentan en SEQ ID
NO: 3, en las que la posición de alanina 26 desde el término N de
la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 está
sustituida por valina; la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 5, en la que alanina en la posición 26 desde el término
N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 está
sustituida con leucina; la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 7, en la que la alanina en la posición 26 del término N
de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 está
sustituida por isoleucina; la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 9, en la que la metionina en la posición 31 desde el
término N de la secuencias de aminoácidos presentada en SEQ ID NO:
1 está sustituida por valina; y la secuencia de aminoácidos
presentada en SEQ ID NO: 11, en la que alanina en la posición 26 y
metionina en la posición 31 desde el término N de la secuencia de
aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 están sustituidas
respectivamente por valina.
Entre los ejemplos de los ADNs de la presente
invención se incluyen ADNs que codifican los polipéptidos de la
presente invención, específicamente, los ADNs que tienen las
secuencias de nucleótido que se presentan en las SEQ ID NO: 4, 6,
8, 10 y 12, que codifican los polipéptidos que tienen las secuencias
de aminoácidos que se presentan en las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 y 11,
respectivamente.
Los ADNs de la presente invención incluyen ADN
que se hibridan con ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos
complementaria con la secuencia de nucleótidos de ADN que codifica
un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se
presenta en la SEQ ID NO: 1 en condiciones estrictas, que se
seleccionan del grupo que consiste en los siguientes puntos (i) a
(ix):
(i) ADN que codifica un polipéptido en el que el
radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 26
desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ
ID NO: 1 es un radical de aminoácidos distinto a
L-alanina.
(ii) ADN que codifica un polipéptido en el que
el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición
31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 1 es un radical de aminoácido distinto a
L-metionina.
(iii) ADN que codifica un polipéptido en el que
el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición
26 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 1 es un radical de aminoácido distinto a
L-alanina y el radical aminoácido que corresponde al
radical en la posición 31 es un radical aminoácido distinto a
L-metionina.
(iv) ADN que codifica un polipéptido en el que
el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición
26 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 1 es L-valina, L-leucina
o L-isoleucina;
(v) ADN que codifica un polipéptido en el que el
radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 31
desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ
ID NO: 1 es L-valina;
(vi) ADN que codifica un polipéptido en el que
el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición
26 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 1 es L-valina, L-leucina,
o L-isoleucina, y el radical aminoácido
correspondiente al radical en la posición 31 es
L-valina.
(vii) ADN que tiene una secuencia de aminoácidos
en la que la región que corresponde a la región en las posiciones 76
y 78 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 2 es
guanina-timidina-timidina-citosina-timidina-guanina
o adenina-timidina-citosina;
(viii) ADN que tiene una secuencia de
nucleótidos en la que la región que corresponde a la región en las
posiciones 91 a 93 desde el extremo 5' de la secuencia de
nucleótidos que se presenta en SEQ ID NO: 2 es
guanina-timidina-guanina; y
(ix) ADN que tiene una secuencia de nucleótidos
en la que la región que corresponde a la región en las posiciones 76
a 78 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se
presenta en SEQ ID NO: 2 es
guanina-timidina-timidina,
citosina-timidina-guanina o
adenina-timidina-citosina, y la
región que corresponde a la región en las posiciones 91 a 93 es
guanina-timidina-guanina y que
codifica un polipéptido que tiene actividad
N-acetilglutamato quinasa.
El ADN capaz de hibridarse en condiciones
estrictas se refiere a un ADN que se obtiene por hibridación de
colonia, hibridación de placa, hibridación de mancha de Southern, o
similar, utilizando parte o todo el ADN que consiste en una
secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de
nucleótidos de ADN que codifica un polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 ó
11, preferiblemente, la secuencia de nucleótidos presentada en la
SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, ó 12, como sonda. Un ejemplo específico
de dicho ADN es ADN que puede ser identificado llevando a cabo la
hibridación a 65ºC en presencia de 0,7 a 1,0 moles/l de cloruro
sódico utilizando un filtro con ADN derivado de colonia o de placa
inmovilizado en él, y a continuación, lavado del filtro a 65ºC con
una solución SSC concentrada 0,1 a 2 veces (solución SSC concentrada
1 vez: 150 mmoles/l cloruro sódico y 15 mmoles/l de citrato
sódico).
La hibridación puede llevarse a cabo con arreglo
a los métodos descritos en Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (en
adelante abreviado Molecular Cloning, 3^{a} ed): Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley % Sons
(1987-1997) (en adelante abreviado Current
Protocols in Molecular Biology); DNA Cloning 1: Core Techniques, A
Practical Approach, segunda edición, Oxford University (1995) (en
adelante abreviado ADN Cloning), etc. El ADN hibridable incluye ADN
que tiene al menos un 75% de homología, preferiblemente un 80% o
más de homología, siendo más preferible un 95% o más de homología
con la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8,
10 o 12 tal como se calcula con el uso de BLAST o FASTA antes
descritos.
Los microorganismos de la presente invención
incluyen los microorganismos que tienen el ADN de la presente
invención. Los preferibles son microorganismos en los que la
actividad de represión transcripcional del represor de arginina
(ArgR) en el operón arginina se ha reducido o perdido.
El tipo de microorganismo de la presente
invención no está específicamente limitado, y los ejemplos de los
microorganismos incluyen bacterias corineformes.
Las bacterias corineformes incluyen
microorganismos que pertenecen a los géneros, Corynebacterium,
Brevibacterium y Microbacterium.
Entre los ejemplos de microorganismos que
pertenecen al género Corynebacterium se incluyen
Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum,
Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae,
Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium
melassecola y Corynebacterium thermoaminogenes,
específicamente, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,
Corynebacterium glutamicum ATCC 136060, Corynebacterium
glutamicum ATCC 13826 (anteriormente Brevibacterium
flavum), Corynebacterium glutamicum ATCC 14020
(anteriormente Brevibacterium divaricatum), Corynebacterium
glutamicum ATCC 13869 (anteriormente Brevibacterium
lactofermentum), Corynebacterium acetoacidophilum ATCC
13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,
Corynebacterium callunae ATCC 15991, Corynebacterium
herculis ATCC 13868, Corynebacterium lilium ATCC 15990,
Corynebacterium melassecola ATCC 17965 y Corynebacterium
thermoaminogenes ATCC 9244.
Entre los ejemplos de microorganismos que
pertenecen al género Brevibacterium se incluyen
Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariophilum,
Brevibacterium roseum, y Brevibacterium thiogenitalis,
específicamente, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14 0
66, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068,
Brevibacterium roseum ATCC 13825 y Brevibacterium
thiogenitalis ATCC 19240.
Un ejemplo de los microorganismos que pertenecen
al género Microbacterium es Microbacterium
ammoniaphilum, específicamente, Microbacterium
ammoniaphilum ATCC 15354.
La actividad de represión transcripcional de
ArgR en el operón de arginina en el microorganismo de la presente
invención deberá reducirse en comparación con su cepa de origen,
preferiblemente a un 50% o menos, más preferiblemente a un 10% o
menos, siendo más preferible aún a un 5% o menos, y siendo sobre
todo preferible a un 0% o pérdida.
La cepa de origen puede consistir en cualquier
microorganismo que tenga la capacidad de formar
L-arginina, L-ornitina o
L-citrulina en la que ArgB está sujeto a inhibición
por retroalimentación a través de L-arginina y se
reprime la transcripción del operón de la arginina a través de ArgR,
que puede ser o bien una cepa de tipo silvestre o bien una cepa
desarrollada de forma artificial a partir de una cepa de tipo
silvestre. El microorganismo huésped para introducir el ADN de la
presente invención que se describe más adelante puede utilizarse
también como cepa de origen siempre y cuando tenga las propiedades
mencionadas.
En la presente invención, el término cepa de
tipo silvestre se refiere a un microorganismo que pertenece
taxonómicamente a la misma especie que el microorganismo de la
presente invención y que tiene el fenotipo que aparece en la
naturaleza con mayor frecuencia.
Cuando el microorganismo de la presente
invención es un microorganismo que pertenece a Corynebacterium
glutamicum, un ejemplo de la cepa de tipo silvestre es
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.
El microorganismo de la presente invención se
puede obtener tratando una cepa de origen con un mutágeno, como por
ejemplo
N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina,
cultivando la cepa obtenida utilizando un medio que comprende
hidroxamato de arginina (análogo de arginina), seleccionando las
cepas que crecen más rápido que la cepa de origen y seleccionando
además las cepas de los microorganismos que tienen una mejor
productividad de L-arginina en comparación con la
de la cepa de origen cuando se cultivan utilizando un medio
ordinario. El microorganismo de la presente invención se puede
obtener de manera más conveniente introduciendo el ADN de la
presente invención.
A continuación, se describe el método para
obtener el microorganismo de la presente invención introduciendo el
ADN de la presente invención.
El ADN de la presente invención se puede
preparar a partir de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos que
se presenta en SEQ ID NO: 2 o ADN que tiene una secuencia de
nucleótidos que tiene una alta homología con la secuencia de
nucleótidos que se presenta en SEQ ID NO: 2 y que codifica un
polipéptido que tiene actividad ArgB.
"Una alta homología con una secuencia de
nucleótidos presentada en SEQ ID NO. 2" se refiere a al menos un
75% de homología, preferiblemente un 80% ó más de homología, siendo
más preferible un 95% o más de homología.
El ADN que tiene la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 2 o el ADN que tiene una secuencia de
nucleótidos que tiene una alta homología con la secuencia de
nucleótidos que se presenta en SEQ ID NO: 2 y que codifica un
polipéptido que tiene actividad ArgB se puede preparar a partir de
microorganismos que tienen estos ADNs, y también se puede obtener
por síntesis química utilizando un sintetizador de ADN (Modelo 8905,
PerSeptive Biosystems, Inc.).
Entre los ejemplos de microorganismos que tienen
estos ADNs se incluyen los que pertenecen al género
Corynebacterium.
Entre los ejemplos de microorganismos que
pertenecen al género Corynebacterium se incluyen
Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum,
Corynebacterium efficiens, y Corynebacterium crenatum,
específicamente, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,
Corynebacterium glutamicum k65 (FERM
BP-1115), Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC 1387 0 y Corynebacterium efficiens JCM 44549. Se
prefiere Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 que tiene un
ADN que tiene una secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO:
2.
Se cultiva un microorganismo que tiene ADN que
tiene la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 2 o ADN
que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una alta homología
con la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 2 y que
codifica un polipéptido que tiene actividad ArgB a través de un
método conocido (por ejemplo Mol. Microbial. 20.833 (1996)].
Después del cultivo, se aísla el ADN cromosómico
del microorganismo y se purifica por ejemplo, con arreglo al método
de Saito y cols. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)].
Se lleva a cabo la PCR [PCR Protocols Academic
Press (1990)] utilizando cebadores preparados en función de la
secuencia de nucleótidos del ADN que codifica ArgB de
Corynebacterium glutamicum, que está registrado como NCg
11342 en DDBJ/GenBank/EMBL (la secuencia de nucleótidos que se
presenta en SEQ ID NO: 2) o la secuencia de nucleótidos de una
región que contiene dicha secuencia de nucleótidos (por ejemplo la
secuencia de nucleótidos que se presenta en SEQ ID NO: 30) y como
una plantilla, el ADN cromosómico aislado y purificado para preparar
un fragmento de ADN que contiene ADN que codifica ArgB.
Entre los ejemplos de cebadores se incluyen ADNs
que consisten en las secuencias de nucleótido presentadas en SEQ ID
NO: 13 a 18 designadas en función de la secuencia de nucleótidos que
se presenta en la SEQ ID NO: 30.
Asimismo, se puede obtener un ADN clonado que
contiene ADN que codifica ArgB a partir de la biblioteca de ADN que
se prepara utilizando el ADN cromosómico aislado y purificado con
arreglo a los métodos descritos en Molecular Cloning, 3^{a} ed.
Current Protocols in Molecular Biology, etc. y obteniendo después el
clon deseado a partir de la biblioteca de ADN a través de métodos
como hibridación de colonia, hibridación de placa e hibridación de
Southern, tal como se describe en manuales de laboratorio, como por
ejemplo en Molecular Cloning, 3ª ed. Current Protocols in Molecular
Biology and DNA Cloning.
Las sondas utilizadas para la hibridación
incluyen un ADN conocido que codifica el ArgB de Corynebacterium
glutamicum o una parte del ADN, ADN que ha sido sintetizado en
función de la secuencia de nucleótidos de dicho ADN conocido y un
fragmento de ADN que se obtiene por PCR utilizando cebadores de ADN
sintetizados en función de la secuencia de nucleótidos de un ADN
conocido que codifica ArgB.
Entre los ejemplos de las sondas se incluyen ADN
que tiene la secuencia de nucleótidos que se presenta en la SEQ ID
NO: 2 y un fragmento de ADN amplificado por PCR utilizando ADNs que
consiste en las secuencias de nucleótidos que se presentan en las
SEQ ID NOS: 13 a 18 como cebadores y el ADN cromosómico de un
microorganismo que pertenece a Corynebacterium glutamicum
como plantilla.
Se inserta el fragmento de ADN que comprende ADN
que codifica ArgB obtenido por hibridación de colonia, hibridación
de placa, hibridación de Southern o similares, como tal o después de
la segmentación con enzimas de restricción apropiadas, en un vector
a través de un método convencional. A continuación, se determina la
secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN a través de un método
de secuenciado convencional como por ejemplo el método didesoxi
[Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 74, 5463 (1977)] utilizando ABI377
DNA Sequencer (Perkin-Elmer Corpo.) o similares.
Asimismo, se puede obtener un fragmento de ADN
que tiene ADN que codifica ArgB llevando a cabo la PCR [PCR
Protocols, Academic Press (1930)] utilizando cebadores preparados en
función de la secuencia de nucleótidos determinada y el ADN
cromosómico como plantilla.
También es posible preparar el fragmento de ADN
deseado por síntesis química utilizando un sintetizador de ADN
(v.g., Modelo 8905, PerSeptive Biosystems) en función de la
secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN determinada.
Un ejemplo del ADN que codifica ArgB que se
puede obtener a través del método que se ha descrito es ADN que
tiene la secuencia de nucleótidos que se presenta en la SEQ ID NO:
2.
El ADN de la presente invención se puede obtener
introduciendo una mutación dirigida a sitio en el ADN que tiene la
secuencia de nucleótidos que se presenta en SEQ ID NO: o ADN que
tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una alta homología con
la secuencia de nucleótidos que se presenta en SEQ ID NO: 2 y que
codifica un polipéptido que tiene actividad ArgB a través del
método de mutagénesis dirigida a sitio descrito en Molecular
Cloning, 3ª ed.; Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic
Acids Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,
6409 (1982); Gene 34, 315 (1985); Nucleic Acids Research, 13, 4431
(1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488 (1985), etc. por ejemplo,
el método en el que se utiliza PCR según las necesidades.
Se incorpora el ADN de la presente invención así
obtenido en un vector, como por ejemplo un vector de plasmidio, a
través del método habitual para preparar el ADN recombinante de la
presente invención.
Como vector, no existe ninguna limitación
específica siempre y cuando sea un vector que se pueda introducir
en un microorganismo en el que se introduzca el ADN de la presente
invención (en adelante denominado un microorganismo huésped). Entre
los ejemplos de vectores adecuados se incluyen pHSG299 [Gene, 61,
63-74 (1987)], pBTrp2, pBTac1 y pBTac2 (productos
de Boehringer Mannheim GmbH), pHelix1 (Roche Diagnostics Corp.),
pKK233-2 (Amersham Pharmacia Biotech), pSE280
(Invitrogen Corp.) pGEMEX-1 (Promega Corp.),
pQE-8 (Quiagen, Inc.), pET-3
(Novagen, Inc.), pKYP10 (Solicitud de patente sin examinar
publicada japonesa Nº 110600/83), pKYP200 [Agric. Biol. Chem. 48,
669 (1984)]. pLSA1 [Agric. Biol. Chem. 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK(+),
pBluescript II KS(-) Stratagene), pTrS30 [preparado a partir de
Escherichia coli JM109/p TrS30 (FERM
BP-5407)], pTrS32 [preparado a partir de
Escherichia coli JM109/p TrS32 (Ferm
BP-5408)], pPAC31 (WO 98/12343 panfleto), pUC19
[Gene, 33, 103 (1985)] pSTV28 (Takara Shuzco Co. Ltd), pUC118
(Takara Shuzco Co., Ltd), pPA1 (solicitud de patente sin examinar
publicada japonesa Nº 233798/88), pCG116, pCG1 (solicitud de
patente sin examinar publicada japonesa Nº 277082/94 y pCS2 99P (WO
00/63388 panfleto). Es preferible usar vectores que no tengan
capacidad de replicación autónoma en un microorganismo huésped, ya
que el ADN recombinante de la presente invención se puede integrar
en el cromosoma del microorganismo huésped utilizando dichos
vectores.
Como microorganismos huéspedes se pueden
utilizar los que se han mencionado anteriormente.
\newpage
No existe ninguna limitación específica en
cuanto a los vectores que no tienen capacidad de replicación
autónoma en un microorganismo huésped. Se prefiere un vector que
tiene un gen que participa en la resistencia a los antibióticos,
que facilita la selección de un microorganismo en el que se ha
integrado el ADN recombinante de la presente invención en el
cromosoma por recombinación homóloga. Es más preferible un vector
que tiene un ADN que codifica levansucrasa (EC: 2,4,1,10) derivada
de Bacilllus subtilis (sacB), que facilita la selección de u
microorganismo en el que se ha reemplazado el ADN que codifica ArgB
que existe originalmente en el cromosoma del microorganismo huésped
por el ADN de la presente invención. Un ejemplo de dicho vector es
el plasmidio pESB30 descrito en el ejemplo 1.
Se introduce el ADN recombinante de la presente
invención en un microorganismo huésped.
La introducción de una mutación que reduce o
destruye la actividad de ArgR del microorganismo de la presente
invención se puede llevar a cabo o bien antes o bien después de la
introducción del ADN de la presente invención en el microorganismo
huésped.
La reducción o pérdida de la actividad ArgR
puede conseguirse tratando un microorganismo cuya actividad ArgR ha
de reducirse o perderse con un mutágeno (v.g.,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina)
y seleccionando cepas cuya productividad de
L-arginina se potencia en comparación con la que
tenían antes de la mutagénesis, o alternativamente, introduciendo
una sustitución, supresión o adición de nucleótido en el ADN que
codifica ArgR a través de un método similar al utilizado para la
introducción de una mutación dirigida a sitio en el ADN que codifica
ArgB.
Se puede introducir una sustitución, supresión o
adición de nucleótido en cualquier sitio siempre y cuando se pueda
reducir o perder la actividad de ArgR, pero preferiblemente, se
introduce en un sitio en la región de unión a
L-arginina del ADN que codifica ArgR o una región
que contienen la región de unión para que la actividad pueda
reducirse o perderse eficientemente.
Un ejemplo de la región de unión a
L-arginina es la región en las posiciones 45 a 240
de la secuencia de nucleótidos que se presenta en SEQ ID NO: 19,
que es la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica ArgR de
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. En los ADN que
codifican ArgR de otros microorganismos, la región de unión a
L-arginina es la región que corresponde a la región
mencionada o su vecindad.
El número de nucleótidos que se sustituyen,
suprimen o añaden no está limitado específicamente siempre y cuando
sea un número adecuado para la reducción o pérdida de la actividad
de ArgR.
La introducción del ADN de la presente invención
en un microorganismo huésped puede llevarse a cabo a través de
cualquiera de los métodos con los que se pueda introducir el ADN
recombinante de la presente invención en un microorganismo
huésped.
Por ejemplo, se pueden utilizar métodos como
electroporación [Appl. Microbiol. Biotech. 52, 541 (1999)] y el
método de protoplasto (J. Bacteriol. 159, 306 (1984)].
Dado que se somete a inhibición por
retroalimentación ArgB de tipo silvestre a través de
L-arginina, los microorganismos en los que no se
reduce o cancela la inhibición por retroalimentación presentan una
velocidad de crecimiento más lenta que los microorganismos en los
que se reduce o cancela la inhibición por retroalimentación en un
medio que comprende hidroxamato de arginina (análogo de arginina).
Los microorganismos en lo que se no se reduce o pierde la actividad
de ArgR tienen un nivel de expresión de ArgB inferior debido a la
represión de la transcripción del operón de arginina por
acumulación de L-arginina y presentan una velocidad
de crecimiento más lenta aún en un medio que comprende hidroxamato
de arginina.
Por consiguiente, es posible confirmar que el
ADN de la presente invención se ha introducido en un microorganismo
obtenido por introducción del ADN de la presente invención en un
microorganismo huésped a través del método mencionado comprobando
que la velocidad de crecimiento del microorganismo se potencia en
comparación con la del microorganismo huésped cuando se comparan la
velocidad de crecimiento del microorganismo y la del microorganismo
huésped en un medio que comprende hidroxamato de arginina. La
confirmación se puede también realizar preparando un plasmidio o un
cromosoma a partir del microorganismo a través de un método
convencional y examinando después la secuencia de nucleótidos.
La reducción o pérdida de la actividad de ArgR
del microorganismo se puede confirmar comparando la expresión del
operón de arginina en el microorganismo y el microorganismo huésped
por hibridación de Northern (Molecular Cloning, 3ª ed.) o similar.
Las sondas utilizadas para la hibridación de Norther incluyen ADN
que tiene una parte o toda la secuencia de nucleótidos de los genes
que constituyen el operón de arginina, por ejemplo, el ADN antes
descrito utilizado para seleccionar el ADN que codifica ArgB de la
biblioteca de ADN.
La confirmación también se puede realizar
utilizando un microorganismo que lleva un gen informador incorporado
en el operón de arginina como un microorganismo huésped, y
comparando la cantidad de expresión del gen informador con la del
microorganismo huésped.
\newpage
El microorganismo de la presente invención puede
ser cualquier microorganismo que tenga el ADN de la presente
invención en el que esté reducida o perdida la actividad ArgR.
Cuando se utiliza el microorganismo de la presente invención para
la producción de L-ornitina, es deseable que se
pierda o se reduzca la actividad de ornitina carbamoil transferasa,
que es un enzima en la vía de biosíntesis de
L-arginina (E.C.: 2.1.3.3, en adelante denominado
ArgF), en el el microorganismo en comparación con la de la cepa de
origen. Se puede obtener una cepa, en la que la actividad ArgF está
perdida o reducida en comparación con la de la cepa de origen, por
mutagénesis del mismo modo que en el método para introducir una
mutación en ArgB y ArgR, o introduciendo una sustitución, supresión
o adición de nucleótido en el ADN que codifica ArgF utilizando el
mismo método que el método utilizado para introducir una mutación
dirigida a sitio en ArgB y ArgR. Se conoce el ADN que codifica ArgF
y se puede utilizar la información de la secuencia de nucleótidos
descrita por ejemplo en DDBJ/GenBank/EMBL. Un ejemplo del ADN que
codifica ArgF es ADN que tiene la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 31.
Cuando se utiliza el microorganismo de la
presente invención para producir L-citrulina, es
deseable que se pierda o se reduzca la actividad de
arginonsuccinato sintasa, que es una enzima en la vía de biosíntesis
de L-arginina (EC: 6.3.4.5, en adelante denominado
ArgG), en el microorganismo en comparación con la de la cepa de
origen. Se puede obtener una cepa en la que se ha perdido o reducido
la actividad de ArgG en comparación con la de la cepa de origen por
mutagénesis, de la misma forma que la del método para introducir una
mutación en ArgB y ArgR, o introduciendo una sustitución, supresión
o adición de nucleótido en el ADN que codifica ArgG utilizando el
mismo método que el método utilizado para la introducción de una
mutación dirigida a sitio de ArgB y ArgR. Se conoce el ADN que
codifica ArgG y se puede utilizar la información de la secuencia de
nucleótidos descrita por ejemplo en DDBJ/GenBank/EMBL. Un ejemplo
del ADN que codifica ArgG es ADN que tiene la secuencia de
nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 32.
Se puede producir L-arginina,
L-ornitina o L-citruina por cultivo
del microorganismo de la presente invención en un medio que permite
la formación y acumulación de L-arginina,
L-ornitina o L-citruilina en el
cultivo, y recuperando L-arginina,
L-ornitina o L-citrulina.
Como método para el cultivo del microorganismo
de la presente invención en un medio, se puede utilizar cualquiera
de los métodos ordinarios utilizados para el cultivo de un
microorganismo.
Como medio, se puede utilizar cualquiera de los
medios naturales y medios sintéticos siempre y cuando se trate de
un medio adecuado para un cultivo eficiente del microorganismo de la
presente invención que contenga fuentes de carbono, fuentes de
nitrógeno, sales inorgánicas, etc, que pueda ser asimilado por el
microorganismo.
Entre las fuentes de carbono, se puede utilizar
cualquier fuente de carbono que pueda ser asimilada por el
microorganismo de la presente invención. Entre los ejemplos de
fuentes de carbono adecuadas se incluyen hidratos de carbono como
glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, melazas que las contienen,
almidón e hidrolizado de almidón, ácidos orgánicos como ácido
acético, ácido láctico y ácido succínico, y alcoholes como etanol y
propanol.
Entre los ejemplos de fuentes de nitrógeno se
incluyen amoniaco, sales de amonio de ácidos orgánicos e inorgánicos
como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio y
carbonato de amonio, otros compuestos con contenido en nitrógeno,
peptona extracto de carne, extracto de levadura, licor de maceración
de maíz, hidrolizado de caseína, torta de soja, hidrolizado de
torta de soja y diversas células microbianas fermentadas y productos
digeridos de los mismos.
Entre los ejemplos de sales inorgánicas se
incluyen dihidrogen fosfato potásico, hidrogen fosfato dipotásico,
fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato de
hierro, sulfato de manganeso, sulfato de cobre y carbonato de
calcio.
Asimismo, se pueden añadir micronutrientes como
biotina, tiamina, nicotinamida y ácido nicotínico según las
necesidades. Estos micronutrientes pueden ser suministrados a través
de un extracto de carne, un extracto de levadura, licor de
maceración de maíz, ácido de Casamino, etc.
El cultivo se lleva a cabo en condiciones
aeróbicas, por ejemplo por cultivo en agitación o cultivo
centrifugado sumergido con ventilación. La temperatura de cultivo
es preferiblemente de 20 a 42ºC, más preferiblemente de 30 a 40ºC.
El pH del medio se encuentra en el intervalo de 5 a 9, y
preferiblemente se mantiene en torno al neutro. El ajuste del pH se
lleva a cabo utilizando un ácido orgánico o inorgánico, una solución
de álcali, urea, carbonato cálcico, amoniaco, tampón de pH, etc.
Cuando el ADN recombinante de la presente
invención utilizado en la preparación del microorganismo de la
presente invención tiene un promotor inducible, se puede añadir al
medio un inductor adecuado para el promotor, si es necesario. Por
ejemplo cuando se utiliza ADN recombinante que tiene promotor
lac, se puede añadir
isopropil-B-D-tiogalactopiranosida
o similar al medio, y cuando se utiliza ADN recombinante que tiene
promotor trp, se pueden añadir ácido indolacrílico o
similares.
El cultivo se lleva a cabo normalmente durante 1
a 6 días y se forma y se acumula L-arginina,
L-ornitina o L-citrulina en el
cultivo.
Una vez completado el cultivo, se extraen del
cultivo los precipitados como por ejemplo células y se puede
recuperar L-arginia, L-ornitina o
L-citrulina acumulado en el cultivo combinando los
métodos conocidos, como por ejemplo tratamiento con carbono activo
y tratamiento con resina de intercambio de iones.
En los ejemplos que se exponen a continuación,
se ilustran determinados modos de realización de la presente
invención. Dichos ejemplos no deben interpretarse como limitativos
del marco de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
e trató plasmidio pHSG299 que transportaba un
gen que confiere resistencia a kanamicina [Gen, 61, 63
(1987)] con PstI y se ligó un fragmento de ADN de 2,6 pares
de kilobases (en adelante abreviado kb) que contenía gen de
levansucrasa sacB derivado de Bacillus subtilis [Mol.
Microbiol., 6, 1195 (1992)] con el sitio de segmentación del
plasmidio pHSG299 para obtener el plasmidio pESB30.
Se trató pESB30 con BamHI (Takara Shuzo
Co., Ltd) y se sometió a electroforesis con gel de agarosa seguido
de la extracción y purificación utilizando un equipo GENECLEAN (BIO
101). Se despuntaron ambos extremos del fragmento de ADN obtenido
utilizando un equipo despuntamiento de ADN (DNA Blunting Kit, Takara
Shuzo Co., Ltd.) con arreglo al protocolo adjunto. Se trató el
fragmento de ADN despuntado con fenol/cloroformo, se concentró por
precipitación con etanol y después se sometió a reacción en
presencia de Taq polimerasa (Roche Diagnosis) y dTTP a 70ºC durante
2 horas por adición de una base de timina al extremo 3' para
preparar el plasmidio pESB3 0-T.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron ADN que tenía la secuencia de
nucleótidos en las posiciones 19 a 38 de la secuencia de nucleótidos
que se presenta en SEQ ID NO: 30 (ADN que consiste en la secuencia
de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 13) y ADN que tiene una
secuencia complementaria con la secuencia de nucleótidos en las
posiciones 1027 a 1047 de la secuencia de nucleótidos presentada en
SEQ ID NO: 30 (ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 14) utilizando un sintetizador de ADN.
La secuencia de nucleótidos en las posiciones
451 a 1332 de la secuencia de nucleótidos que se presenta en SEQ ID
NO: 30 es una región que codifica en polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1, que es ArgB de
Corynebacterium glutamicum. La secuencia de nucleótidos de la
región se presenta en SEQ ID NO: 2.
Se sintetizaron ADN que consistía en una
secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de
nucleótidos en las posiciones 68 a 89 de la secuencia de
nucleótidos que se presenta en SEQ ID NO: 4 (la secuencia de SEQ ID
NO: 4 es una secuencia en la que se sustituyó la citosina en la
posición 77 de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:
2 por timidina y que codifica la secuencia de aminoácidos presentada
en SEQ ID NO: 3, en la que está sustituida por valina la alanina en
la posición 26 de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID
NO: 1) (ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos presentada
en SEQ ID NO: 5) y ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos
en las posiciones 65 a 87 de la secuencia de nucleótidos presentada
en SEQ ID NO: 4 (ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 16) utilizando un sintetizador de ADN.
Se preparó el ADN cromosómico de
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 con arreglo al método
de Saito, y cols., [Biochim, Biophys. Acta, 72, 619 (1663)] y se
llevaron a cabo dos tipos de PCR utilizando el ADN cromosómico como
plantilla, una combinación de ADN que consistía en la secuencia de
nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 13 y el ADN que consistía en
la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 15 y una
combinación del ADN que consistía en la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 14 y el ADN que consistía en la secuencia
de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 16, respectivamente, como un
conjunto de cebadores, ADN polimerasa de Pfu turbo (Stratagene) y
el tampón unido. Se sometieron dos productos de PCR de 0,5 kb ca.
obtenidos por PCR respectivamente a electroforesis con gel de
agarosa y se extrajeron y purificaron utilizando un equipo GENECLEAN
(BIO 101).
Se llevó a cabo la PCR además utilizando los dos
productos purificados como plantillas y el ADN que consistía en la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 13 y el ADN que
consistía en la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:
14 como un conjunto de cebadores. Se sometió el producto de PCR
obtenido a electroforesis con gel de agarosa y se extrajo y
purificó utilizando un equipo GENECLEAN para obtener un fragmento de
ADN de 1,0 kb ca. Se determinó la secuencia de nucleótidos del
fragmento de ADN utilizando un secuenciador y se confirmó que el
fragmento de ADN tenía una secuencia de nucleótidos presentada en
SEQ ID NO: 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron ADN que consistía en una
secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de
nucleótidos en las posiciones 83 a 102 de la secuencia de
nucleótidos presentada en la SEQ ID NO: 10 (la secuencia de SEQ ID
NO: 10 es una secuencia en la que está sustituida la adenina en la
posición 91 de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:
2 por guanina y que codifica una secuencia en la que está sustituida
metionina en la posición 31 de la secuencia de aminoácidos
presentada en SEQ ID NO: 1 por valina) (ADN que consiste en la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 17) y ADN que
consistía en la secuencia de nucleótidos en las posiciones 79 a 99
de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 10 (ADN que
consiste en la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:
18) utilizando un sintetizador de ADN.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento que en
(2) con la excepción de que se utilizaron respectivamente una
combinación del ADN que consistía en ADN de la secuencia de
nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 13 y el ADN que tenía la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 17 y una
combinación del ADN que tenía la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 14 y el ADN que consistía en la secuencia
de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 18 como conjunto de
cebadores para obtener un fragmento de ADN de 1,0 kb. ca.
Se determinó la secuencia de nucleótidos del
fragmento de ADN obtenido utilizando un secuenciador y se confirmó
que el fragmento de ADN tenía la secuencia de nucleótidos presentada
en SEQ ID NO: 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trató cada uno de los fragmentos de ADN que
tenían respectivamente las secuencias de nucleótido presentadas en
SEQ ID NO: 4 y 10 obtenidas en los puntos (2) y (3) anteriores en
presencia de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim GmbH) y dATP a
72ºC durante 10 minutos para la adición de una base de adenina al
extremo 3' del fragmento de ADN.
Se mezcló el plasmidio pESB30-T
con cada uno de los fragmentos de ADN preparados por adición de un
radical de adenina a los fragmentos de ADN que tenían ADNs que
tenían las secuencias de nucleótidos presentadas en SEQ ID NO: 4 y
10, respectivamente y se llevó a cabo la reacción de ligasa
utilizando un equipo de ligadura Ver. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd).
Utilizando cada uno de los productos de reacción obtenidos, se
transformó Escherichia coli DH5 \alpha (Toyobo Co., Ltd)
con arreglo al método convencional. Se cultivó la cepa en un medio
LB agar (que contenía 10 g de Bacto-triptona
(Difco), 5 g de extracto de levadura (Difco), 10 g de cloruro
sódico y 16 g de Bacto-agar (Difco) en un litro de
agua, pH 7,0] que contenía 20 \mug/ml de kanamicina para
seleccionar un transformante. Se cultivó el transformante durante
toda la noche utilizando un medio LB que contenía 20 \mug/ml de
kanamicina y se preparó un plasmidio a partir del cultivo obtenido a
través del método SDS con álcali (Molecular Cloning, 3a ed). Se
determinaron las secuencias de nucleótidos de los plasmidios
obtenidos utilizando un secuenciador y se confirmó que los ADNs que
tenían las secuencias de nucleótidos presentadas en SEQ ID NO: 4 y
10, respectivamente habían sido insertadas en
pESB30-T en los correspondientes plasmidios.
Se designó el plasmidio que tenía el ADN que
tenía la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 4 como
pEargB26 y se designó el plasmidio que tenía el ADN que tenía la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 10 como
pEargB31.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el mismo procedimiento que el
del punto (2) anterior a excepción de que se utilizaron
respectivamente la combinación del ADN que consistía en la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 13 y la secuencia
de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 15 y una combinación del ADN
que consistía en la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID
NO: 14 y el ADN que consistía en la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 16 como un conjunto de cebadores y se
utilizó pEargB31 como plantilla para obtener un fragmento de ADN de
1,0 kb. ca. Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento
de ADN utilizando un secuenciador y se confirmó que el fragmento de
ADN tenía la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:
12.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento que en el
punto (4) anterior con la excepción de que se utilizó el ADN que
tenía la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 12 para
obtener el plasmidio pEargB2631 incorporándose el ADN que tenía la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 12 en
pESB30-T.
El ADN presentado en SEQ ID NO: 12 es un ADN que
codifica las secuencias de aminoácidos presentadas en SEQ ID NO:
11, que es un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos en la que
la alanina en la posición 26 y la metionina en la posición 31 de la
secuencia de aminoácidos presentadas en SEQ ID NO: 1, están
sustituidas respectivamente con valina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformó Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032 por electroporación con arreglo al método de Rest. y
cols. [Appl. Microbiol Biotech., 52, 541 (1999) utilizando
plasmidios pEargB26, pEargB31 y pEargB2631 preparados en el ejemplo
1, respectivamente, para seleccionar cepas resistentes a kanamicina.
Se preparó un cromosoma a partir de una de las cepas resistentes a
kanamicina y se examinó por hibridación de Southern (Molecular
Cloning, 3ª ed), en virtud de lo cual se confirmó que pEargB26,
pEargB31 y pEargB2631 estaban integradas respectivamente en el
cromosoma de las cepas por recombinación homóloga de tipo Campbell.
En dichas cepas, el ADN que codifica ArgB que está originariamente
presente en el cromosoma y el ADN de la presente invención existen
próximos uno al otro en el cromosoma y la segunda recombinación
homóloga es apta para que tenga lugar entre ellos.
Dado que levansucrasa codificada por sacB
convierte la sacarosa en un sustrato suicida, un microorganismo que
tiene sacB no puede crecer en un medio que contiene sacarosa.
No obstante, cuando tiene lugar la segunda recombinación homóloga
entre el ADN que codifica ArgB que está presente originariamente en
cromosoma y el ADN de la presente invención, se suprime uno de
estos ADNs junto con sacB y, de este modo, la cepa resultante
puede crecer en el medio que contiene sacarosa. Cuando se suprime
el ADN que codifica ArgB que está presente originariamente en el
cromosoma, se puede obtener un microorganismo en el que está
sustituido el ADN que codifica ArgB que está originalmente presente
en el cromosoma del microorganismo huésped por el ADN de la presente
invención.
Al utilizarlo, se extendió el transformante
mencionado en medio agar de Suc [que comprendía 100 g de sacarosa,
7 g de extracto de carne, 10 g de peptona, 3 g de cloruro sódico, 5
g de extracto de levadura (Difco) y 15 g de
Bacto-agar (Difco) en 1 litro de agua, pH 7,2] y se
cultivó a 30ºC durante un día para seleccionar una colonia
desarrollada en él.
Se preparó el ADN cromosómico a partir de la
colonia así obtenida, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ADN
cromosómico como plantilla, y el ADN que consistía en la secuencia
de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 13 y el ADN que consistía
en la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 14 como
conjunto de cebadores, ADN polimerasa de Pfu turbo (Stratagene) y
el tampón adjunto. Se determinó la secuencia de nucleótidos del
producto de PCR utilizando una secuencia.
Asimismo, se obtuvo una cepa en la que el ADN
que codifica ArgB en el cromosoma está sustituido por el ADN que
tiene la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 4 a
partir de las cepas en las que se había introducido pEargB26 y se
designó la cepa como la cepa B26.
De la misma manera, se obtuvo una cepa en la que
el ADN que codifica ArgB en el cromosoma está sustituido por ADN que
tiene la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 10 a
partir de las cepas en las que se había introducido pEargB31 y se
designó la cepa como la cepa B31.
Asimismo, se obtuvo una cepa en la que el ADN
que codifica ArgB en el cromosoma está sustituido por el ADN que
tiene la secuencia de nucleótidos que se presenta en SEQ ID NO: 12 a
partir de las cepas en las que se había introducido pEargB2631 y se
designó la cepa cepa B2631.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el ADN cromosómico de
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 con arreglo al método
de Saito y cols., [Biochim. Biophys Acta, 72, 619 (1963)].
Se sintetizaron los siguientes ADNs utilizando
un sintetizador de ADN: ADN que consiste en la secuencia de
nucleótidos en las posiciones 43 a 62 de la secuencia de nucleótidos
de ADN que codifica ArgR de Corynebacterium glutamicum
presentada en la SEQ ID NO: is (ADN que consiste en la secuencia de
nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 20), ADN que consiste en la
secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos en las
posiciones 1421 a 1440 de la secuencia de nucleótidos presentada en
SEQ ID NO: 19 (ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 21), ADN que consiste en la secuencia
complementaria a la secuencia de nucleótidos preparada por adición
de una secuencia tag a la secuencia de nucleótidos en las posiciones
539 a 559 de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:
19 (ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos presentada en
SEQ ID NO: 22) y ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos
preparada por adición de una secuencia tag a la secuencia de
nucleótidos en las posiciones 941 a 961 de la secuencia de
nucleótidos presentada en la SEQ ID NO: 19 (ADN que consiste en la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 23).
La secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID
NO: 19 es una secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia de
nucleótidos de ADN que codifica ArgR de Corynebacterium
glutamicum. Se llevaron a cabo dos tipos de PCR utilizando el
ADN cromosómico preparado como plantilla, una combinación de ADN que
consiste en la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 20
y el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos presentada en
SEQ ID NO: 22 y una combinación del ADN que consiste en la secuencia
de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 21 y el ADN que consiste en
la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 23,
respectivamente, como un conjunto de cebadores, ADN polimerasa de
Pfu turbo (Stratagene) y el tampón unido. Se sometieron dos
productos de PCR de 0,5 kb ca. obtenidos a través de la PCR
respectivamente a electroforesis de gel de agarosa y se extrajeron y
purificaron utilizando un equipo GENECLEAN (BIO 101).
Se llevó a cabo la PCR además utilizando los dos
productos purificados como plantillas, el ADN que consistía en la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 20 y el ADN que
consistía en la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:
21 como un conjunto de cebadores, ADN polimerasa de Pfu turbo
(Stratagene) y el tampón unido. Se sometió el producto de PCR
obtenido a electroforesis con gel de agarosa y se extrajo y purificó
utilizando un equipo GENECLEAN (BIO 101), en virtud de lo cual se
obtuvo un fragmento de ADN de 1,0 kb ca. en el que estaba suprimida
la región en las posiciones 560 a 940 de la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 19 que codifica ArgR.
Se incorporó este fragmento en el plasmidio
pESB30-T con arreglo al método descrito en el
ejemplo 1 para obtener el plasmidio pEdel-argR.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el mismo procedimiento que en el
punto (1) anterior a excepción de que se utilizó el plasmidio
pEdel-argR. Este procedimiento proporcionó una cepa
en la que el ADN que codifica ArgR en el cromosoma de
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 estaba sustituido por
el ADN en el que estaba suprimida la región en las posiciones 560 a
940 de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 19. La
cepa obtenida se designó cepa R.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el mismo procedimiento que el
del punto (1) a excepción de que se utilizó la cepa R como huésped
y que se utilizaron pEargB26, pEargB31 y pEargB2631 como plasmidios.
Este procedimiento proporcionó cepas en las que estaba sustituido
el ADN que codifica ArgB en el cromosoma por ADN que tiene la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 4, 10 o 12 y se
sustituyó el ADN que codifica ArgR en el cromosoma por ADN en el
que estaba suprimida la región en las posiciones 560 a 940 de la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 19. Se designaron
las cepas como cepa RB26, cepa RB31 y cepa RB2631,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron por separado las cepas B26, B31,
B2631, R, RB26, RB31 y RB2631 obtenidas en el ejemplo 2 en medio
agar BY (un medio que comprendía 7 g de extracto de carne, 10 g de
peptona, 3 g de cloruro sódico, 5 g de extracto de levadura y 15 g
de Bacto-agar en 1 litro de agua, pH 7,2) a 30ºC
durante 24 horas.
Se inocularon células de cada una de las cepas
que crecieron en el medio agar BY en un tubo de ensayo que contenía
6 ml de medio de siembra (un medio que fue preparado añadiendo 10 g
de carbonato cálcico a un medio que contenía 25 g de sacarosa, 20 g
de licor de maceración de maíz, 20 g de peptona, 10 g de extracto de
levadura, 0,5 g de heptahidrato de sulfato de magnesio, 2 g de
dihidrogen fosfato potásico, 3 g de urea, 8 g de sulfato de amonio,
1 g de cloruro sódico, 20 mg de ácido nicotínico, 10 mg de
heptahidrato de sulfato de hierro, 10 mg de pantohenato cálcico, 1
mg de heptahidrato de sulfato de zinc, 1 mg de pentahidrato de
sulfato de cobre, 1 mg de hidrocloruro de tiamina y 100 \mug de
biotina en 1 litro de agua y ajustado a un pH 7,2 con una solución
acuosa de hidróxido sódico), seguido de la agitación de un cultivo a
32ºC durante 24 horas.
Se inoculó cada uno de los cultivos de siembra
obtenidos (2 ml) en un matraz con tabiques que contenía 20 ml del
medio de cultivo principal (un medio que fue preparado por adición
de 30 g de carbonato de calcio a un medio que contenía 60 g de
glucosa, 5 g de licor de maceración de maíz, 30 g de sulfato de
amonio, 8 g de cloruro potásico, 2 g de urea, 0,5 g de dihidrogen
fosfato potásico, 0,5 g de hidrogen fosfato dipotásico, 1 g de
heptahidrato de sulfato de magnesio, 1 g de cloruro sódico, 20 mg,
de heptahidrato de sulfato de hierro, 20 mg de ácido nicotínico, 20
mg de \beta-alanina, 10 mg de pentahidrato de
sulfato de manganeso, 10 mg de hidrocloruro de tiamina y 200 \mug
de biotina en 1 litro de agua y ajustado a un pH 7,7 con una
solución acuosa de hidróxido sódico), seguido de la agitación del
cultivo a 32ºC durante 48 horas.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento
utilizando Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 y se utilizó
el cultivo obtenido como control.
Después de separar las células del cultivo por
centrifugado, se determinaron las cantidades de
L-arginina, L-ornitina y
L-citrulina acumuladas en el sobrenadante por
cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En la tabla 1
se muestran los resultados.
Tal como se muestra en la tabla 1, no se
confirmó la producción de L-arginina,
L-ornitina y L-citrulina con las
cepas ATCC 13032 (control), B26, B31, B2631 y R. Por el contrario,
con las cepas RB26, RB31 y RB2631 se confirmó la producción de
L-arginina, L-ornitina y
L-citrulina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron ADN que consistía en la
secuencia de nucleótidos preparada por adición de la secuencia tag
a la secuencia de nucleótidos en las posiciones 21 a 43 de la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 31 (ADN que
consiste en la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 24)
y ADN que consistía en la secuencia complementaria a la secuencia
de nucleótidos preparada por adición de una secuencia tag a la
secuencia de nucleótidos en las posiciones 1366 a 1385 de la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 31 (ADN que
consiste en la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 25)
utilizando un sintetizador de ADN.
La secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID
NO: 31 es una secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia de
nucleótidos de ADN que codifica ArgF de Corynebacterium
glutamicum.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el ADN cromosómico de
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 con arreglo al método
de Saito, y cols., [Biochim. Biophys. Acta 72, 619 (1963)].
Se llevó a cabo la PCR utilizando el ADN
cromosómico como plantilla, el ADN que consistía en la secuencia de
nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 24 y el ADN que consistía la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 25 como un
conjunto de cebadores, ADN polimerasa de Pfu turbo (Stratagene) y el
tampón adjunto. Se trató un fragmento de ADN de 1,4 kb ca. obtenido
por PCR con BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd) a electroforesis
con gel de agarosa, y se extrajo y purificó utilizando un equipo
GENECLEAN (BIO 101). Se mezcló el fragmento de ADN obtenido con
pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.) previamente segmentado con
BamHI y se llevó a cabo la reacción de ligasa utilizando un
equipo de ligadura Ver. 1 (Takara Shuzo Co. Ltd.).
Utilizando el producto de reacción, se
transformó Escherichia coli DH5 \alpha (Toyobo Co., Ltd)
con arreglo al método descrito en Molecular Cloning, 3ª ed. Se
cultivó la cepa en medio agar LB que contenía 50 \mug/ml de
ampicilina para seleccionar un transformante. Se cultivó el
transformante durante toda la noche utilizando medio LB que
contenía 50 \mug/ml de ampicilina, y se preparó un plasmidio a
partir del cultivo obtenido a través del método SDS con álcali
(Molecular Cloning, 3ª ed). Se segmentó el plasmidio con NcoI
y se sometió a reacción de ligasa utilizando un equipo de ligadura
Ver. 1 (Takara Shuzo Co. Ltd) para auto-circulación.
Se transformó Escherichia coli DH5 \alpha utilizando el
producto de reacción y se preparó un plasmidio a partir del
transformante obtenido. Se examinó la estructura del plasmidio
utilizando enzimas de restricción, en virtud de lo cual se confirmó
que el plasmidio contenía un fragmento de ADN en el que estaban
suprimidos 369 pares de base en el ADN que codifica ArgF.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la PCR utilizando el plasmidio
obtenido como plantilla, el ADN que consistía en la secuencia de
nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 24 y el ADN que consistía en la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 25 como conjunto
de cebadores, ADN polimerasa de Pfu turbo (Stratagene) y el tampón
adjunto para obtener un fragmento de ADN de 1,0 kb ca. Se sometió
el fragmento de ADN a reacción en presencia de Tag ADN polimerasa
(Boehringer Mannheim GmBH) y dATP a 72ºC durante 10 minutos para
añadir una base de adenina al extremo 3'. Se llevó a cabo la
reacción de ligasa utilizando pESB30-T preparado en
el ejemplo 1, el fragmento de ADN al que se había añadido adenina y
el equipo de ligadura Ver. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd). Se designó el
plasmidio obtenido como pEargF.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el mismo procedimiento que el
del ejemplo 2 (1) con la excepción de que se utilizaron las cepas
B26, B31, R, RB26, RB31, y ATCC 13032 como huéspedes y que se
utilizó pEargF como plasmidio. El procedimiento proporcionó cepas
en las que el ADN que codifica ArgF en el cromosoma estaba
sustituido por ADN en el que estaban suprimidos 369 pares de base
en el ADN que codifica ArgF y se designaron las cepas obtenidas como
cepas FB26, FB31, FR, FRB26, FRB31 y F, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron por separado las cepas FB26, FB31,
FR, FRB26, FRB31 y F preparadas en el ejemplo 4 y la cepa ATCC
13032 en medio agar BY a 30ºC durante 24 horas. Se inoculó cada una
de las cepas en un tubo de ensayo que contenía 6 ml de medio de
siembra (un medio que fue preparado por adición de 10 g de carbonato
cálcico a un medio que contenía 25 g de glucosa, 0,5 g de
dihidrogen fosfato potásico, 1,5 g de hidrogen fosfato dipotásico,
0,5 g de sulfato de magnesio, 20 g de peptona, 3 g de urea, 50
\mug de biotina y 0,3 g de L-arginina en 1 litro
de agua), seguido de agitación del cultivo a 32ºC durante 24 horas.
Se inoculó cada uno de los cultivos de siembra obtenidos (2 ml) en
un matraz con tabicación que contenía 20 ml del medio de cultivo
principal (un medio que fue preparado por adición de 30 g de
carbonato cálcico a un medio que contenía 100 g de glucosa, 30 g de
sulfato de amonio, 0,6 g de sulfato de magnesio, 0,5 g de dihidrogen
fosfato potásico, 0,25 g de L-arginina, 16 mg de
heptahidrato de sulfato de hierro, 16 mg de pentahidrato de sulfato
de manganeso, 4,9 mg de heptahidrato de sulfato de zinc, 4,9 mg de
pentahidrato de sulfato de cobre, 16 mg de cloruro de calcio, 16 mg
de \beta-alanina, 8 mg de hidrocloruro de
tiamina, 180 \mug de biotina y 16 g de licor de maceración de maíz
en 930 ml de agua y ajustado a pH 7,2 con una solución acuosa de
hidróxido sódico), seguido de agitación del cultivo a 32ºC durante
48 horas.
Después de extraer las células del cultivo por
centrifugado se determinó la cantidad de L-ornitina
acumulada en el sobrenadante por cromatografía de líquidos de alto
rendimiento (HPLC). En la tabla 2 se muestran los resultados.
Se puede deducir claramente de la tabla 2, que
la cantidad de producción de L-ornitina utilizando
la cepa FRB26 que tiene el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 4 y supresiones en ArgF y ArgR y la cepa
FRB31 que tiene el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 10 y supresiones en ArgF y ArgR fue
claramente más alta que la de L-ornitina utilizando
las otras cepas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron ADN que consistía en una
secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de
nucleótidos en las posiciones 68 a 89 de la secuencia de
nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 6 (la secuencia de SEQ ID NO:
6 es una secuencia en la que está sustituida la región en las
posiciones 76 a 78 de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ
ID NO: 2 por ctg y codifica la secuencia de aminoácidos presentada
en SEQ ID NO 5 en la que está sustituida la alanina en la posición
26 de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 por
leucina) (ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos presentada
en SEQ ID NO: 26) y ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos
en las posiciones 65 a 87 de la secuencia de nucleótidos presentada
en SEQ ID NO: 6 (ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 27) utilizando un sintetizador de ADN.
De la misma manera, se sintetizaron ADN que
consistía en una secuencia de nucleótidos complementaria a la
secuencia de nucleótidos en las posiciones 68 a 89 de la secuencia
de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 8 (la secuencia de SEQ ID
NO: 8 es una secuencia en la que está sustituida la región en las
posiciones 76 a 78 de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ
ID NO: 2 por atc y codifica la secuencia de aminoácidos presentada
en SEQ ID NO: 7, en la que está sustituida la alanina en la posición
26 de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 por
isoleucina) (ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 28) y ADN que consiste en la secuencia de
nucleótidos en las posiciones 65 a 87 de la secuencia de
nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 8 (ADN que consiste en la
secuencia de nucleótidos presentada en la SEQ ID NO: 29) utilizando
un sintetizador de ADN.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento que el
del ejemplo 1(2) a excepción de que se utilizaron los ADNS
que consistían en las secuencias de nucleótido presentadas en SEQ ID
NO: 26 y 27 en lugar de los ADNs que consistían en las secuencias de
nucleótido presentadas en SEQ ID NO: 15 y 16 para obtener un
fragmento de ADN de 1,0 kb ca. que tenía el ADN que tenía la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 6. Por separado,
se llevó a cabo el mismo procedimiento que el del ejemplo 1 (2) con
la excepción de que se utilizaron los ADNs que consistían en las
secuencias de nucleótido presentadas en las SEQ ID NO: 28 y 29 en
lugar de los ADN que consistían en las secuencias de nucleótido
presentadas en SEQ ID No: 15 y 16 para obtener un fragmento de ADN
de 1,0 kb ca. que tenía un ADN que tenía la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 8.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento que el
del ejemplo 1 (4) con la excepción de que se utilizaron los
fragmentos de ADN respectivamente que tenían los ADN que tenían las
secuencias de nucleótido presentadas en las SEQ ID NO: 6 y 8 en
lugar de los fragmentos de ADN que tenían respectivamente los ADN
que tenían las secuencias de nucleótido presentadas en las SEQ ID
NO: 4 y 10 para obtener los plasmidios en los que se habían
incorporado respectivamente los ADN que tenían las secuencias de
nucleótido presentadas en SEQ ID NO: 6 y 8 respectivamente en el
plasmidio pESB30-T. Los plásmidos obtenidos se
designaron pEargB26L y pEargB261, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el mismo procedimiento que el
del ejemplo 2(1) con la excepción de que se utilizó la cepa
R como huésped y pEargB26L y pEargB261 como plasmidios. El
procedimiento proporcionó una cepa en la que estaba sustituido el
ADN que codifica ArgB en el cromosoma de la cepa R por el ADN que
tiene la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 6 y una
cepa en la que estaba sustituido el ADN que codifica ArgB en el
cromosoma de la cepa R por el ADN que tiene la secuencia de
nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 8. Se designaron las secuencias
obtenidas como cepa RB26L y cepa RB261, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la productividad de
L-arginina, L-ornitina y
L-citrulina de la misma manera que en el ejemplo 3,
con la excepción de que se utilizaron las cepas RB26, RB26L, y
RB261.
\newpage
En la tabla 3 se muestran los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se puede deducir de la tabla 3, tanto
la cepa RB26L que tiene el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 6 como la cepa RB261 que tiene el ADN que
tiene la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 8
produjeron L-arginina, L-ornitina y
L-citrulina, al igual que la cepa RB26 que tenía el
ADN que tenía la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:
4. Las cantidades de estos aminoácidos producidas al utilizar las
cepas RB26L y RB261 fueron más altas que cuando se utilizó la cepa
RB26.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizan cebadores en función de la
secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 32 que contiene
la secuencia de nucleótidos de ADN que codifica ArgG de
Corynebacterium glutamicum. Se lleva a cabo la PCR
utilizando los cebadores obtenidos y el ADN cromosómico de
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como plantilla para
construir un plasmidio que contiene el fragmento de ADN que tiene
una supresión de aproximadamente 400 pares de base en el ADN que
codifica ArgG.
Se prepara un fragmento de ADN que tiene una
supresión de aproximadamente 400 pares de base en el ADN que
codifica ArgG a partir del plasmidio y se añade una base de adenina
al extremo 3' del fragmento de ADN. Se lleva a cabo la reacción de
ligasa utilizando pESB30-T preparada en el ejemplo
1, el fragmento de ADN que tiene la adenina añadida y equipo de
ligadura Ver. 1 (Takara Shuzo Co. Ltd), y se designa el plasmidio
obtenido pEargG.
Se puede llevar a cabo el proceso anterior con
arreglo al método descrito en el ejemplo 4.
Se lleva a cabo el mismo procedimiento que el
del ejemplo 2 (1) a excepción de que se utilizan las cepas B26,
B31, R, RB26, RB31 y ATCC 13032 como huéspedes y pEargG como
plasmidio. Este procedimiento proporciona cepas en las que está
sustituido el ADN que codifica ArgG en el cromosoma por el ADN en el
que están suprimidos 400 pares de base en el ADN que codifica ArgG
y las cepas obtenidas se designan cepas GB26, GB31, GR, GRB26, GRB31
y G, respectivamente.
Se cultivan por separado las cepas GB26, GB31,
GR, GRB26, GRB31, G y ATCC 13032 por separado en un medio agar BY a
30ºC durante 24 horas. Se inocula cada una de las cepas en un tubo
de ensayo que contiene 6 ml de un medio de siembra (un medio
preparado por adición de 10 g de carbonato cálcico a un medio que
contiene 25 g de glucosa, 0,5 g de dihidrogen fosfato potásico, 1,5
g de hidrogen fosfato dipotásico, 0,5 g de sulfato de magnesio, 20
g de peptona, 3 g de urea, 50 \mug de biotina y 0,3 g de
L-arginina en 1 litro de agua), seguido de
agitación del cultivo a 32ºC durante 24 horas. Se inocula cada uno
de los cultivos de siembra obtenidos (2 ml) en un matraz con
tabiques que contiene 20 ml de un medio de cultivo principal (un
medio que se prepara por adición de 30 g de carbonato cálcico a un
medio que contenía 100 g de glucosa, 30 g de sulfato de amonio, 0,6
g de sulfato de magnesio, 0,5 g de dihidrogen fosfato potásico, 0,25
g de L-arginina, 16 mg de heptahidrato de sulfato
de hierro, 16 mg de pentahidrato de sulfato de manganeso, 4,9 mg de
heptahidrato de sulfato de zinc, 4,9 mg de pentahidrato de sulfato
de cobre, 16 mg de cloruro de calcio, 16 mg de
\beta-alanina, 8 mg de hidrocloruro de tiamina,
180 \mug de biotina y 16 g de licor de maceración de maíz en 930
ml de agua y se ajusta el pH a 7,2 con una solución acuosa de
hidróxido sódico), seguido de agitación del cultivo a 32ºC durante
48 horas.
Después de extraer las células del cultivo por
centrifugado, se determina la cantidad de
L-citrulina acumulada en el sobrenadante por
cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC).
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención, se
proporcionan N-acetilglutamato quinasa modificada y
ADN que codifica la N-acetil glutamato quinasa
modificada y se puede producir L-arginina,
L-ornitina o L-citrulina eficazmente
utilizando un microorganismo que tiene el ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 13 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 14 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 15 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 16 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 17 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 18 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 20 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 21 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 22 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 23 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 24 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 25 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 26 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 27 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 28 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
SEQ ID NO: 29 Descripción de Secuencia
artificial: ADN sintético
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para producir
L-arginina, L-ornitina o
L-citrulina
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1000P11719
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2004-280855
\vskip0.400000\baselineskip
<151>2004-09-28
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
ATCC13032
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> COS
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatgcggctc gcactgttgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcggtgtac agaccttcca c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcggcagcaa aaacagcctt ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatctcaaggc tgtttttgct gcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagaagacc acgtcggcag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgctgccg acgtggtctt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1440
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (548)..(1060)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagcaggc cttaagggta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcagcgaac tcatcctttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccatccact aaacttaaac agccaaggga catgtcttac ct
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtttaagtt tagtggatgg ggatagggtg gggctgaaag aa
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatatatggat cctgttcttg atggttttaa gcacg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatatatggat cctgctatct actgggccga cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcggcagcaa acagagcctt ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatctcaaggc tctgtttgct gcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcggcagcaa agatagcctt ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatctcaaggc tatctttgct gcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1332
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (451)..(1332)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1440
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (170)..(1126)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1806
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (301)..(1503)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
Claims (17)
1. Un polipéptido que tiene:
(i) una secuencia de aminoácidos en la que están
sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las
posiciones 20 a 38 desde el término N de la secuencia de aminoácidos
presentada en SEQ ID NO: 1; o
(ii) una secuencia de aminoácidos en la que
están sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en
las posiciones 20 a 38 desde el término N de la secuencia de
aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 y se han suprimido,
sustituido o añadido de 1 a 20 radicales de aminoácido en la región
en las posiciones 1 a 19 o de 39 a 294 y
que tiene actividad N-acetil
glutamato quinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un polipéptido que tiene:
(i) una secuencia de aminoácidos en la que están
sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las
posiciones 26 a 31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos
presentada en la SEQ ID NO: 1 ó
(ii) una secuencia de aminoácidos en la que
están sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en
las posiciones 26 a 31 desde el término N de la secuencia de
aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 y están suprimidos,
sustituidos o añadidos de 1 a 20 radicales de aminoácido en la
región en las posiciones 1 a 25 o 32 a 294; y
que tiene actividad N-acetil
glutamato quinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un polipéptido que tiene:
(i) una secuencia de aminoácidos en la que está
sustituido un radical de aminoácido en la posición 26 o 31 desde el
término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO:
1.
(ii) una secuencia de aminoácidos en la que
están sustituidos los radicales de aminoácido en las posiciones 26 a
31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 1; o
(iii) una secuencia de aminoácidos en la que
están suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de
aminoácidos de los puntos (i) o (ii) anteriores de 1 a 20 radicales
de aminoácido distintos a los que están en las posiciones
sustituidas; y
que tiene actividad N-acetil
glutamato quinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un polipéptido que tiene:
(i) una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos presentadas
en las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 y 11;
(ii) una secuencia de aminoácidos en la que
están suprimidos, sustituidos o añadidos de 1 a 20 radicales de
aminoácido distintos al radical 26 en la secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos
presentadas en las SEQ ID NO: 3, 5 y 7;
(iii) una secuencia de aminoácidos en la que
están suprimidos, sustituidos o añadidos de 1 a 20 radicales de
aminoácido distintos al radical 31 en la secuencia de aminoácidos
presentada en SEQ ID NO: 9; o
(vi) una secuencia de aminoácidos en la que
están suprimidos, sustituidos o añadidos de 1 a 20 radicales de
aminoácido distintos a los radicales 26 a 31 en la secuencia de
aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 11; y
que tiene actividad N-acetil
glutamato quinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un ADN que codifica el polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótida
presentadas en las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 y 12.
\newpage
7. Un ADN que tiene un 95% o más de homología
con la secuencia de nucleótidos presentada en la SEQ ID NO: 2, que
se selecciona del grupo que consiste en los siguientes puntos (i) a
(iii):
(i) ADN que codifica un polipéptido en el que el
radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 26
desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en la
SEQ ID NO: 1 es un radical de aminoácido distinto a
L-alanina;
(ii) ADN que codifica un polipéptido en el que
el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición
31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 1 es un radical de aminoácidos distinto a
L-metionina; y
(iii) ADN que codifica un polipéptido en el que
el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición
26 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 1 es un radical de aminoácido distinto a
L-alanina y el radical de aminoácido que corresponde
al radical en la posición 31 es un radical de aminoácido distinto a
L-metionina, y
que codifica un polipéptido que tiene actividad
N-acetil glutamato quinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
8. El ADN según la reivindicación 7, en el que
el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición
26 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en
SEQ ID NO: 1 es L-valina, L-leucina
o L-isoleucina y el radical de aminoácido que
corresponde al radical en la posición 31 es
L-valina.
9. Un ADN que tiene un 95% o más de homología
con la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 2 que está
seleccionado del grupo que consiste en los siguientes puntos (i) a
(iii):
(i) ADN que tiene una secuencia de nucleótidos
en la que la región que corresponde la la región en las posiciones
76 a 78 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos
presentada en SEQ ID NO: 2 es
guanina-timidina-timidina,
citosina-timidina-guanina o
adenina-timidina-citosina;
(ii) ADN que tiene una secuencia de nucleótidos
en la que la región que corresponde a la región en las posiciones 91
a 93 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos presentada
en SEQ ID NO: 2 es
guanina-timidina-guanina; y
(iii) ADN que tiene una secuencia de nucleótidos
en la que la región que corresponde a la región en las posiciones 76
a 78 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos presentada
en la SEQ ID NO: 2 es
guanina-timidina-timidina,
citosina-timidina-guanina o
adenina-timidina-citosina y la
región que corresponde a la región en las posiciones 91 a 93 es
guanina-timidina-guanina; y
que codifica un polipéptido que tiene actividad
N-acetil glutamato quinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un ADN recombinante que se obtiene
incorporando el ADN según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9
en un vector.
11. Un microorganismo que pertenece al género
Corynebacterium que es transformado con el ADN recombinante según la
reivindicación 10.
12. Un microorganismo que pertenece al género
Corynebacterium que tiene el ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9.
13. El microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 11 ó 12, en el que la actividad de represión de la
transcripción del represor arginina en un operón de arginina está
reducida o perdida.
14. El microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, en el que la actividad ornitina carbamoil
transferasa está reducida o perdida.
15. El microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, en el que la actividad arginino succinato
sintasa está reducida o perdida.
16. El microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, siendo dicho microorganismo un
microorganismo que pertenece a Corynebacterium
glutamatum.
17. Un proceso para producir
L-arginina, L-ornitina o
L-citrulina que comprende el cultivo del
microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 en
un medio que permite la formación y acumulación de
L-arginina, L-ornitina o
L-citrulina en el cultivo, y la recuperación de
L-arginina, L-ornitina o
L-citrulina desde el cultivo.
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