ES2382207T3

ES2382207T3 - Procedimiento para la producción de L-glutamina

Info

Publication number: ES2382207T3
Application number: ES06843405T
Authority: ES
Inventors: Mikiro Hayashi; Masaki Maeda; Yoshiyuki Yonetani
Original assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Current assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 2005-12-27
Filing date: 2006-12-27
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2026-12-27
Also published as: JPWO2007074857A1; EP1978094A1; EP1978094A4; US20100184163A1; WO2007074857A1; US8067211B2; EP1978094B1; CN101336292A; CN101336292B; JP5592059B2

Abstract

Polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, o un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, y además, uno a 20 aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos, en el que la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 es derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, y en el que el polipéptido confiere una cantidad de producción mayor de L-glutamina en una bacteria corineforme de tipo salvaje cuando el polipéptido es expresado en la bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

Description

Procedimiento para la producción de L-glutamina.

Campo técnico

La presente exposición se refiere a un procedimiento para producir L-glutamina.

Antecedentes de la técnica

Como procedimientos para producir L-glutamina mediante fermentación, se conocen uno que implica una bacteria corineforme dotada de resistencia a la azaserina (cf Patente Referencia 1), otro que implica una bacteria corineforme dotada de resistencia a la 6-diazo-5-oxo-norleucina (cf Patente Referencia 2) y similares. Además, como procedimientos para producir L-glutamina mediante refuerzo de la actividad glutamina sintetasa, se conocen los que implican una bacteria corineforme con una actividad glutamino-sintetasa adenilil-transferasa reducida que es controlada mediante adenililación (cf No patente Referencia 1, Patente Referencia 3), y una bacteria corineforme en la que es sustituido un aminoácido en posición 405 de la glutamina sintetasa que se somete a adenililación, y una bacteria corineforme que posee una actividad disminuida de la proteína PH (No-patente Referencia 2, Patente Referencia 3).

Es conocido que, además de la glnA que codifica una glutamina-sintetasa, en el genoma de las bacterias corineformes se encuentra glnA2, que codifica una glutamina sintetasa 2 que presenta homología con glutamina sintetasa. Se informó de que el polipéptido codificado por glnA2 de una bacteria corineforme, presenta una alta homología con una glutamina sintetasa de Bacillus subtilis que no está controlada por adenililación, pero la bacteria corineforme muestra fenotipo glutamin-auxotrófico cuando glnA que codifica una glutamina sintetasa que es controlada mediante adenililación, es desactivada (No patente Referencia 1). En las bacterias corineformes, el polipéptido codificado por glnA2 no tiene actividad glutamín sintetasa, no existiendo casos en los que la L-glutamina fuera obtenida mediante modificación de glnA2.

Además, se informó de que en Corynebacterium glutamicum, el ácido glutámico se produce mediante reducción de la actividad de un polipéptido que es codificado por ItsA y que está implicado en la sensibilidad a la lisozima, (no patente, Referencia 3, no-patente Referencia 4, Patente Referencia 4).

Patente Referencia 1: solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 148094/80 Patente Referencia 2: solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 232497/91 Patente Referencia 3: solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 3008887/02 Patente Referencia 4: documento WO 00/14241 No-patente Referencia 1: FEMS Microbiology Letters, 201, 91 (2001) No-patente Referencia 2: FEMS Microbiology Letters, 173, 303 (1999) No-patente Referencia 3: BMC Biotechnol., 1, 9 (2001) No-patente Referencia 4: Journal of Bacteriology, 182,2696 (2000)

Exposición de la invención

Problemas que deben ser resueltos por la invención

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una glutamina sintetasa 2 modificada, un ADN que codifique la glutamina sintetasa 2 modificada, un ADN recombinante que incluya el ADN, un transformante que traslade el ADN recombinante, un microorganismo que comprende el ADN en su cromosoma, y un procedimiento para producir L-glutamina que utilice el transformante o el microorganismo.

Medios para resolver los problemas

La presente invención se refiere a las formas de realización que se caracterizan en las reivindicaciones. Así, se refiere a lo siguiente:

1.: Un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en la posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, se sustituye con un aminoácido distinto al ácido glutámico en la que la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, se deriva de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, y en la que el polipéptido confiere una cantidad producida más copiosa de L-glutamina en una bacteria corineforme de tipo salvaje, cuando el polipéptido se expresa en la bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

2.: El polipéptido según el apartado 1, que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en

posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, eliminándose, sustituyéndose o añadiéndose, además, uno o más aminoácidos.

3.: El polipéptido según el apartado 1, en el que la secuencia aminoácida es una secuencia aminoácida en la que un

5 aminoácido en posición 64 a partir del terminal N, en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico.

4. El polipéptido según el apartado 2, en el que la secuencia aminoácida es una secuencia aminoácida en la que un aminoácido en una posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con

10 un aminoácido distinto al ácido glutámico, eliminándose, sustituyéndose o añadiéndose, además, uno o más aminoácidos.

5. Un ADN seleccionado de los (a) y (b) siguientes:

15 (a) un ADN que codifica el polipéptido según cualquiera de los apartados 1 a 4;

(b) un ADN que hibrida un ADN formado por una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, bajo condiciones estrictas, y que comprende una secuencia nucleotídica en la que una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5 en la secuencia

20 nucleotídica de SEC ID nº 2, es un cordón que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico, en el que una cantidad producida de L-glutamina, en un transformante obtenido introduciendo el ADN en una bacteria corineforme de tipo salvaje, es más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

6. El ADN según el apartado 5, que codifica el polipéptido según cualquiera de los apartados 1 a 4, y comprende; 25

(a) una secuencia nucleotídica en la que, en la secuencia nucleotídica de un ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, o

(b) una secuencia nucleotídica en la que la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico.

35 7. El polipéptido o ADN según cualquiera de los apartados 1 a 6, en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico, es un aminoácido básico.

8. El polipéptido o el ADN según cualquiera de los apartados 1 a 6, en el que el aminoácido distinto al ácido

glutámico es la lisina. 40

9.: Un ADN recombinante que incluye el ADN según cualquiera de los apartados 5 a 8.

10.: Un microorganismo seleccionado a partir de (a) y (b):

45 (a) un microorganismo transformado con el ADN recombinante según el apartado 9;

(b) un microorganismo que comprende, en su ADN cromosómico, el ADN según cualquiera de los apartados 5 a 8.

11. El microorganismo según el apartado 10, que posee capacidad para producir un polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia

50 aminoácida de LtsA derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme y que posee sensibilidad a la lisozima.

12. El microorganismo según el apartado 11, en el que polipéptido comprende una secuencia aminoácida en la que

un aminoácido en la posición que corresponde al aminoácido en posición 80 a partir del extremo N en la secuencia 55 aminoácida de SEC ID nº 10, es un aminoácido distinto a la glicina.

13. El microorganismo según el apartado 11, en el que;

(a): la secuencia aminoácida de LtsA es la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10; o 60

(b) la secuencia aminoácida de LtsA es la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, y el polipéptido comprende una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en posición 80 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, es un aminoácido distinto a la glicina.

15. El polipéptido, ADN, ADN recombinante o microorganismo según cualquiera de los apartados 1 a 14, donde el microorganismo es uno que pertenece al género Corynebacterium, al género Brevibacterium o al género Mycobacterium.

: 5 16. El polipéptido, ADN, ADN recombinante o microorganismo según el apartado 15, en el que el microorganismo que pertenece al género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.

65 14. El microorganismo según el apartado 12 o 13, en el que el aminoácido distinto de la glicina, es el ácido aspártico.

17. Un procedimiento para producir L-glutamina, que comprende el cultivo del microorganismo según cualquiera de

los apartados 10 a 16 en un medio, para formar y acumular L-glutamina en un cultivo, y recuperar ésta a partir del 10 cultivo.

Además, también se dan a conocer los apartados siguientes (1) a (34):

(1) Un polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos se eliminan, sustituyen o

15 añaden en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, en la que el polipéptido confiere una cantidad producida más copiosa de L-glutamina en una bacteria corineforme de tipo salvaje, cuando el polipéptido se expresa en la bacteria corineforme de tipo salvaje como una célula huésped, que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

20 (2) El polipéptido según el apartado anterior (1), que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico.

25 (3) El polipéptido según el apartado anterior (1), que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, y, además, uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos.

(4) El polipéptido según los apartados anteriores (2) o (3), en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico es un aminoácido básico.

(5) El polipéptido según los apartados anteriores (2) o (3), en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico, es la 35 lisina.

(6) El polipéptido según cualquiera de los apartados anteriores (1) a (5), en el que el microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, es uno que pertenece al género Corynebacterium, al género Brevibacterium o al género Mycobacterium.

(7): El polipéptido según el apartado (1) anterior, en el que la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, es la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1.

(8): El polipéptido según el apartado (7) anterior, que comprende una secuencia aminoácida en la que el aminoácido

45 en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico.

(9) El polipéptido según el apartado anterior (7), que comprende una secuencia aminoácida en la que el ácido glutámico en la posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituida con un

50 aminoácido distinto al ácido glutámico, eliminándose, sustituyéndose o añadiéndose, además, uno o varios aminoácidos.

(10) El polipéptido según los apartados (8) o (9) anteriores, en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico es un

aminoácido básico. 55

(11) El polipéptido según los apartados (8) o (9) anteriores, en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico es la lisina.

(12) Un ADN que codifica el polipéptido según cualquiera de los apartados (1) a (11) anteriores. 60

(13) El ADN según el apartado (12) anterior, que comprende una secuencia nucleotídica en la que, en la secuencia nucleotídica de un ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido

65 glutámico.

(14): El ADN según el apartado (13) anterior, en el que el codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, es un codón que codifica un aminoácido básico.

(15): El ADN según el apartado (13) anterior, en el que el codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, es un codón que codifica la lisina.

(16): El ADN según cualquiera de los apartados anteriores (13) a (15) en el que el microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, es un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium, al género Brevibacterium o al género Mycobacterium.

(17): El ADN según el apartado anterior (12), que comprende una secuencia nucleotídica en la que la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico.

(18): El ADN según el apartado (17) anterior, en el que el codón que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico, es un codón que codifica un aminoácido básico.

(19): El ADN según el apartado (17) anterior, en el que el codón que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico, es un codón que codifica la lisina.

(20): Un ADN que se hibrida con un ADN formado por una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, bajo condiciones estrictas, y que incluye una secuencia nucleotídica en la que una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, en la que una cantidad producida de L-glutamina en un transformante obtenido introduciendo el ADN en una bacteria corineforme de tipo salvaje, es mayor que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

(21): El ADN que codifica el apartado (20) anterior, en el que el codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, es un codón que codifica un aminoácido básico.

(22): El ADN según el apartado (20) anterior, en el que el codón que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico, es un codón que codifica lisina.

(23): Un ADN recombinante que comprende el ADN según cualquiera de los apartados (12) a (22) anteriores.

(24): Un microorganismo transformado con el ADN recombinante según el apartado (23) anterior.

(25): Un microorganismo que incluye, en su ADN cromosómico, el ADN según cualquiera de los apartados anteriores (12) a (22).

(26): El microorganismo según el apartado (24) o (25) anterior, que puede producir un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de LtsA derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, presentando sensibilidad a la lisozima.

(27): El microorganismo según el apartado (26) anterior, en el que el polipéptido comprende una secuencia aminoácida en la que un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en la posición 80 a partir del Nterminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, es un aminoácido distinto a la glicina.

(28): El microorganismo según el apartado (27) anterior, en el que el aminoácido distinto a la glicina, es el ácido aspártico.

(29): El microorganismo según el apartado anterior (26), en el que la secuencia aminoácida de LtsA es la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10.

(30): El microorganismo según el apartado (29) anterior, en el que el polipéptido comprende una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en posición 80 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, es un aminoácido distinto a la glicina.

(31): El microorganismo según el apartado (30) anterior, en el que el aminoácido distinto a la glicina, es el ácido aspártico.

(32): El microorganismo según cualquiera de los apartados anteriores (24) a (31), en el que el microorganismo es uno que pertenece al género Corynebacterium, al género Brevibacterium o al género Mycobacterium.

(33): El microorganismo según el apartado (32) anterior, en el que el microorganismo que pertenece al género

Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.

(34) Un procedimiento para obtener L-glutamina, que comprende el cultivo del microorganismo según cualquiera de

los apartados (24) a (33) anteriores, en un medio para formar y acumular L-glutamina en un cultivo, y recuperar 5 L-glutamina a partir del cultivo.

Efecto de la invención

Según lo anterior, se obtiene una glutamina sintetasa 2 modificada tal como se define en las reivindicaciones, y un

10 ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 modificada, pudiéndose obtener la L-glutamina mediante un microorganismo que incluye el ADN. Además, la L-glutamina puede obtenerse posteriormente de forma eficiente, introduciendo una mutación en el gen del microorganismo que codifica LtsA.

Mejor modo de poner en práctica la invención

15 La presente invención se describe a continuación detalladamente:

(1) Polipéptido de la presente invención

20 Los ejemplos del polipéptido tal como se dan a conocer en la presente memoria, incluyen:

(i) un polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, en el que el polipéptido confiere una cantidad

25 producida más copiosa de L-glutamina en una bacteria corineforme de tipo salvaje, cuando el polipéptido se expresa en la bacteria corineforme de tipo salvaje como una célula huésped, que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje,

(ii) el polipéptido según el apartado (i) anterior, que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la

30 secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida del SEC ID nº 1, se sustituye con un aminoácido distinto al ácido glutámico,

(iii) el polipéptido según el apartado (i) anterior, que incluye una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia

35 aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico y posteriormente uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos,

(iv) el polipéptido según los apartados anteriores (ii) o (iii), en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico es un 40 aminoácido básico,

(v) el polipéptido según los apartados anteriores (ii) o (iii), en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico es la lisina,

45 (vi) el polipéptido según cualquiera de los apartados anteriores (i) a (v), en el que el microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme es uno que pertenece al género Corynebacterium, al Brevibacterium o Mycobacterium,

(vii) el polipéptido según el apartado anterior (i), en el que la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 es 50 la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1,

(viii) el polipéptido según el apartado (vii) anterior, que comprende una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, se sustituye con un aminoácido distinto al ácido glutámico,

(ix) El polipéptido según el apartado (vii) anterior que comprende una secuencia aminoácida en la que el ácido glutámico en la posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, y uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos,

(x) El polipéptido según los apartados (viii) o (ix) anteriores, en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico es un aminoácido básico,

(xi) el polipéptido según los apartados anteriores (viii) o (ix) en el que el aminoácido distinto del ácido glutámico es 65 la lisina y similares.

El microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme según la presente invención se refiere a un microorganismo que se define en el Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8 599 (1974), incluyendo los ejemplos del microorganismo uno que pertenece al género Corynebacterium, al género Brevibacterium o al género Mycobacterium.

Los ejemplos específicos tal como se dan a conocer en la presente memoria son Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium melassecola, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficient, Corynebacterium diphtheriae, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium thiogenitalis, Microbacterium ammoniaphilum

y similares.

Más ejemplos específicos, tal como se dan a conocer en la presente memoria, son Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium callunae ATCC 15991, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13060, Corynebacterium glutamicum ATCC 13826 (género principal y especies: Brevibacterium flavum o Corynebacterium lactofermentum) Corynebacterium glutamicum ATCC 14020 (género principal y especies: Brevibacterium divaricatum), Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (género principal y especies: Brevibacterium lactofermentum), Corynebacterium herculis ATCC 13868, Corynebacterium lilium ATCC 15990, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes ATCC 9244, Corynebacterium efficiens YS-314, Corynebacterium diphtheriae NCTC 13129, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 y similares.

La glutamina sintetasa 2 anteriormente mencionada, derivada a partir de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, puede ser cualquier glutamina sintetasa 2, siempre que sea la glutamina sintetasa 2 anteriormente citada, derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, incluyendo los ejemplos una glutamina sintetasa 2 derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, descrita en EP 1108790 y que posee la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, una glutamina sintetasa 2 derivada de Corynebacterium efficient YS-314, que posee la secuencia aminoácida que se describe en GenBank, con número de registro NP_738737, una glutamina sintetasa 2 derivada de Corynebacterium diphtheriae NCTC 13129, que posee la secuencia aminoácida que se describe en GenBank, número de registro NP_940011, y similares.

El número de aminoácidos que es eliminado, sustituido o añadido según el polipéptido, tal como se da a conocer anteriormente (i) no está particularmente limitado, pero es un número tal que la eliminación, sustitución o adición pueden llevarse a cabo mediante un procedimiento conocido tal como la mutagénesis puntual que se describe más adelante, principalmente, a partir de una a varias decenas de veces, preferentemente de 1 a 20, más preferentemente de 1 a 10 y muy preferentemente de 1 a 5 decenas de veces.

Además, “uno o más aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos”, significa que existe eliminación, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos en posiciones opcionales en la misma secuencia, en las que la eliminación, sustitución o adición puede tener lugar al mismo tiempo, y el aminoácido que es sustituido o añadido puede ser de un tipo natural o de uno no natural. El aminoácido de tipo natural incluye L-alanina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-arginina, L-glutamina, ácido L-glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, L-cisteína y similares.

Los ejemplos de aminoácidos capaces de sustituirse mutuamente se muestran a continuación. Los aminoácidos en el mismo grupo son capaces de sustituirse mutuamente.

Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido-2-amino butanoico, metionina, O-metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina, ciclohexil-alanina.

Grupo B: ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico, ácido 2aminosubérico.

Grupo C: asparagina, glutamina.

Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanoico, ácido 2,3-diaminopropiónico.

Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina.

Grupo F: serina, treonina, homoserina.

Grupo G: fenilalanina, tirosina.

El polipéptido, tal como se da a conocer anteriormente (i) en la presente memoria, presenta preferentemente una

homología de por lo menos el 70% o más, más preferentemente del 90% o más, más preferentemente, aún, del 95%

o más, preferentemente de modo particular, del 98% o más, y muy preferentemente del 99% o más, con la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1.

La homología de las secuencias aminoácidas y las secuencias nucleotídicas puede determinarse utilizando, por ejemplo, el algoritmo BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA 90,5873 (1993)] o FASTA [Methods in Enzymol., 183, 63 (1990)] por Karlin y Altschul. Basándose en este algoritmo BLAST, se desarrollaron los programas denominados BLASTN y BLASTX [J. Mol. Biol., 215. 403 (1990)]. Cuando una secuencia nucleotídica se analiza mediante BLASTN basado en BLAST, los parámetros se fijan en, por ejemplo, índice = 100, longitud de la palabra = 12. Asimismo, cuando una secuencia aminoácida se analiza mediante BLASTX basado en BLAST, los parámetros se fijan en, por ejemplo, índice = 50, longitud de la palabra = 3. Cuando los programas BLAST y Capped BLAST se utilizan, se utilizan los parámetros por defecto de cada programa. Se conocen convencionalmente técnicas específicas de estos procedimientos analíticos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

Al expresar un polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, la bacteria corineforme de tipo salvaje que va a utilizarse como huésped, se refiere a un tipo de microorganismo en una población salvaje, que se encuentra muy frecuentemente en las especies a las que el microorganismo pertenece, y ejemplos incluyen Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium callunae ATCC 15991, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13060, Corynebacterium glutamicum ATCC 13826 (género principal y especies: Brevibacterium flavum o Corynebacterium lactofermentum), Corynebacterium glutamicum ATCC 14020 (género principal y especies: Brevibacterium divaricatum), Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (género principal y especies: Brevibacterium lactofermentum), Corynebacterium herculis ATCC 13868, Corynebacterium lilium ATCC 15990, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes ATCC 9244, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240, Mycobacterium ammoniaphilum ATCC 15354 y similares.

El procedimiento para expresar una polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la cual uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, incluye un procedimiento en el que el polipéptido se expresa introduciendo un ADN que codifica el polipéptido en una bacteria corineforme de tipo salvaje, y sustituyendo el ADN y un ADN que codifica una glutamina sintetasa 2 de tipo salvaje, en el ADN cromosómico de una bacteria corineforme de tipo salvaje, mediante una técnica de recombinación homóloga, un procedimiento en el que el polipéptido se expresa transformando una bacteria corineforme de tipo salvaje con un ADN recombinante que incluye un ADN que codifica el polipéptido, y similares.

El polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen

o se añaden en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, en la que una cantidad producida de L-glutamina cuando el polipéptido se expresa utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, es más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje, puede confirmarse midiendo que la cantidad de L-glutamina producida por un transformante en el que el polipéptido se expresó introduciendo un ADN que codificaba el polipéptido en una bacteria corineforme de tipo salvaje, y sustituyendo el ADN por un ADN que codificaba una glutamina sintetasa 2 de tipo salvaje en el ADN cromosómico de una bacteria corineforme de tipo salvaje mediante una técnica de recombinación homóloga, o mediante un transformante en el que el polipéptido se expresó transformando una bacteria corineforme de tipo salvaje con un ADN recombinante que incluía un ADN que codifica el polipéptido, es más copiosa que el de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

Específicamente, se construyó un transformante en el cual el polipéptido se expresó introduciendo un ADN que codifica el polipéptido en una cepa salvaje de Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 y sustituyendo el ADN por un ADN en el ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, que codifica una glutamina sintetasa 2 de tipo salvaje, mediante una técnica de recombinación homóloga, o un transformante en el cual Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 se transformó con un ADN recombinante que incluye un ADN que codifica el polipéptido, y construyéndose un vector tal como pCS299P (WO 00/63388). El transformante y Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 se cultivaron a 30°C durante 24 horas en un medio agar BYG [un medio que contenía 10 g de glucosa, 7 g de extracto de carne, 10 g de peptona, 3 g de cloruro sódico, 5 g de extracto de levadura, (preparado por Difco) y 18 g de Bacto-Agar (preparado por Difco), en 1 litro de agua, ajustándose el pH 7,2], inoculándose cada cepa en un tubo de ensayo que contenía 6 ml de un medio de cultivo de siembra (un medio que contenía 50 g de glucosa, 20 g de caldo de cultivo, 5 g de sulfato amónico, 5 g de urea, 2 g de fosfato dihidrógeno de potasio, 0,5 g de heptahidrato sulfato magnésico, 1 mg de heptahidrato sulfato de hierro, 0,4 mg de pentahidrato de sulfato de cobre, 0,9 mg de heptahidrato sulfato de cinc, 0,07 mg de tetrahidrato cloruro de manganeso, 001 mg de tetraborato disódico, 0,04 mg de heptamolibdato de hexaamonio, 0,5 mg de clorhidrato de tiamina y 0,1 mg de biotina en 1 litro de agua, ajustándose a pH 7,2, seguido por la adición de 10 g de carbonato

cálcico), y se cultivó a 30°C durante 12 a 16 horas. Cada uno de los cultivos de siembra así obtenidos, se inoculó, con una concentración del inóculo del 10%, en un matraz cónico de 300 ml de capacidad, con desviadores que contenían 30 ml de un medio de cultivo principal (un medio que contenía 50 g de glucosa, 2 g de urea, 20 g de sulfato amónico, 0,5 g de fosfato dihidrógeno de potasio, 0,5 g de fosfato hidrógeno dipotásico, 0,5 g de heptahidrato sulfato magnésico, 2 mg de heptahidrato sulfato de hierro, 2,5 mg de tetrahidrato cloruro de manganeso, 0,5 mg de clorhidrato de tiamina y 0,1 mg o 0,001 mg de biotina en 1 litro de agua, ajustándose a pH 7,2, seguido por la adición de 20 g de carbonato cálcico) y cultivándose entre 16 y 18 horas antes de que el azúcar no esté completamente consumido bajo condiciones de 30°C y 220 rpm. Eliminando las células del cultivo así obtenido mediante centrifugación, se determina, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) la cantidad acumulada de L-glutamina en el sobrenadante. Puede confirmarse, mediante la medición de la cantidad acumulada de L-glutamina en el sobrenadante, obtenido cultivando el transformante, que es más copiosa que la cantidad acumulada de L-glutamina en el sobrenadante, obtenido cultivando Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.

En los polipéptidos de la presente invención, en los apartados (ii) a (vi) mencionados anteriormente, el aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, en la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, se refiere a un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1 en la secuencia aminoácida de la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, cuando la homología de la secuencia aminoácida de la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme con la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, se calcula utilizando un programa analizador de homología, tal como los mencionados anteriormente BLAST y FASTA, y sus parámetros, alineándose las dos secuencias aminoácidas.

El aminoácido distinto al ácido glutámico puede ser cualquier aminoácido distinto al ácido glutámico, pero resulta preferido un aminoácido seleccionado a partir de alanina glicina, valina, leucina, isoleucina, cisteína, metionina, triptófano fenilalanina, prolina, lisina, histidina, arginina, ácido aspártico, asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina, más preferentemente un aminoácido básico, más preferentemente todavía, un aminoácido seleccionado a partir de lisina, histidina y arginina, y más preferentemente, lisina.

Mediante el procedimiento mencionado anteriormente puede confirmarse que la cantidad que se produce de L-glutamina, expresando el polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de la glutamina sintetasa 2, el aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, se sustituye con otro aminoácido distinto al ácido glutámico, utilizando como huésped una bacteria corineforme de tipo salvaje, es más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

Cada uno de los polipéptidos tal como se dan a conocer en la presente memoria en los apartados (iii) a (vi) mencionados anteriormente, es un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida codificada por un ADN, que puede obtenerse eliminando, sustituyendo o añadiendo un nucleótido en el ADN que codifica el polipéptido de la presente invención en los apartados (i) o (ii) mencionados anteriormente, utilizando la mutagénesis puntual que se describe después. La mutación puntual que va a introducirse puede ser cualquier mutación, siempre que uno o varios aminoácidos distintos que un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, sean eliminados, sustituidos o añadidos.

El aminoácido que es eliminado, sustituido o añadido, no está particularmente limitado, siempre que sea un aminoácido distinto al aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1.

Además, “uno o más aminoácidos que son eliminados, sustituidos o añadidos”, hace referencia a que existen una o varias eliminaciones, sustituciones o adiciones en posiciones opcionales distintas que el aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, en las que la eliminación, sustitución o adición pueden tener lugar al mismo tiempo, pudiendo el aminoácido que es sustituido o añadido, de tipo natural o no, siendo los aminoácidos capaces de sustituirse, similares a los mencionados anteriormente.

Los polipéptidos, tal como se dan a conocer anteriormente, (iii) a (vi), muestran preferentemente una homología de, por lo menos, un 70% o más, más preferentemente del 90% o más, más preferentemente, todavía, del 95% o más, particularmente preferible del 98% o más, y muy preferentemente, del 99% o más, con la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1.

El polipéptido (vii) mencionado anteriormente, tal como se da a conocer en la presente memoria, es un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la cual uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, en la que una cantidad producida de L-glutamina, cuando el polipéptido se expresa utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, es más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

El número de aminoácidos que son eliminados, sustituidos o añadidos, tal como se da a conocer en la presente memoria, no está particularmente limitado, pero consiste en un número tal que la eliminación, sustitución o adición pueden llevarse a cabo mediante un procedimiento conocido tal como la mutagénesis puntual anteriormente mencionada, principalmente, entre una y varias decenas de veces, preferentemente entre 1 a 20 decenas de veces, más preferentemente, de 1 a 10 decenas de veces, y muy preferentemente de 1 a 5 decenas de veces.

Además, tal como se da a conocer en la presente memoria, “uno o más, aminoácidos que son eliminados, sustituidos o añadidos”, significa que existen una o varias eliminaciones, sustituciones o adiciones en posiciones opcionales, en la misma secuencia, en la que la eliminación, sustitución o adición pueden tener lugar al mismo tiempo, pudiendo el aminoácido que es sustituido o añadido, de tipo natural o no, siendo los aminoácidos capaces de sustituirse, similares a los mencionados anteriormente.

El polipéptido tal como se da a conocer en la presente memoria, en el apartado (vii) descrito anteriormente, muestra preferentemente una homología de por lo menos un 70% o más, más preferentemente del 90%, más preferentemente, todavía, del 95%, o más particularmente preferible del 98% o más, y muy preferentemente del 99%

o más, con la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1.

Los polipéptidos (viii) a (xi) descritos anteriormente de la presente invención, pueden prepararse utilizando un ADN en el cual un codón que codifica ácido glutámico en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, utilizando un ADN que codifica la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, mediante la mutagénesis puntual que se describe después. El aminoácido distinto del ácido glutámico incluye los aminoácidos mencionados anteriormente.

Cada uno de los polipéptidos de la presente invención en los apartados (ix) a (xi) mencionados anteriormente, es un polipéptido que incluye una secuencia aminoácida codificada por un ADN que puede obtenerse eliminando, sustituyendo o añadiendo un nucleótido en el ADN que codifica el polipéptido de la presente invención en los apartados (vi) o (vii) anteriormente citados, utilizando la mutagénesis puntual que se describe después. La mutación puntual que va a introducirse puede ser cualquier mutación, siempre que uno o varios aminoácidos distintos que el aminoácido que está en una posición que corresponde al ácido glutámico en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1 en el polipéptido de la presente invención en los mencionados anteriormente

(vi) o (vii), sean eliminados, sustituidos o añadidos.

El aminoácido que es eliminado, sustituido o añadido, no está particularmente limitado, de siempre que sea un aminoácido distinto al ácido glutámico en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1.

Además, “uno o más aminoácidos que son eliminados, sustituidos o añadidos”, significa que existen una o varias eliminaciones, sustituciones o adiciones en posiciones opcionales distintas que el ácido glutámico en una posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, en la que la eliminación, sustitución o adición pueden tener lugar al mismo tiempo, pudiendo el aminoácido que es sustituido o añadido, de tipo natural o no, siendo los aminoácidos capaces de sustituirse, similares a los mencionados anteriormente. Los polipéptidos, tal como se dan a conocer en la presente memoria en los apartados (ix) a (xi) descritos anteriormente, muestran preferentemente una homología de por lo menos, un 70% o más, más preferentemente del 90% o más, más preferentemente, todavía, del 95% o más, preferible particularmente del 98% o más, y muy preferentemente, del 99% o más, con la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1.

(2): ADN de la presente invención.

El ADN de la presente invención incluye:

(i): un ADN que codifica cualquier polipéptido de los polipéptidos anteriores de la presente invención,

(ii): el ADN según el anterior apartado (i), que comprende una secuencia nucleotídica en la que, en la secuencia nucleotídica de un ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico,

(iii) el ADN según el apartado (ii) anterior, en el que el codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, es un codón que codifica un aminoácido básico,

(iv): el ADN según el apartado anterior (ii), en el que el codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, es uno que codifica lisina,

(v): el ADN que codifica cualquiera de los apartados mencionados anteriormente (ii) a (iv), en el que el microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme es un microorganismo que pertenece al género

Corynebacterium, al género Brevibacterium, o al género Mycobacterium,

(vi) el ADN según el apartado (i) mencionado anteriormente en esta memoria, en el que la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, comprende un codón que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico,

(vii) el ADN según el apartado (vi) anterior, en el que el codón que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico, es un codón que codifica un aminoácido básico,

(viii) el ADN que codifica el apartado (vi) anterior, en el que el codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico es un codón que codifica lisina,

(ix): un ADN que se hibrida con un ADN formado por una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, bajo condiciones estrictas, y que comprende una secuencia nucleotídica en la que una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 desde el extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico y en el que una cantidad producida de L-glutamina mediante un transformante obtenido introduciendo el ADN en una bacteria corineforme de tipo salvaje, es más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje,

(x): el ADN según el apartado (ix) mencionado anteriormente, en el que el codón que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico, es un codón que codifica un aminoácido básico,

(xi): el ADN según el apartado (ix) anterior, en el que el codón que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico, es un codón que codifica lisina,

(xii) un ADN recombinante que comprende el ADN según cualquiera de los apartados (i) a (xi) mencionados anteriormente, y los similares,

El ADN mencionado anteriormente (i), tal como se da a conocer en la presente memoria, es un ADN que codifica el polipéptido de la presente invención en el apartado (1) mencionado anteriormente, incluyendo sus ejemplos un ADN que codifica un polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, en la que una cantidad producida de L-glutamina cuando el polipéptido se expresa utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, es más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

El ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, entre los ADN mencionados anteriormente (ii) a (v) de la presente invención, incluye el ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme según el apartado (1) mencionado anteriormente.

El ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme puede ser cualquier ADN, siempre que sea el ADN que codifique la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme según el apartado 1 mencionado anteriormente (1), y el ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, incluye por ejemplo, un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 que se describe en EP 1108790, un ADN que comprende una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica en las posiciones 2258903 a 2260453 en el ADN cromosómico Corynebacterium efficiens YS-314 que se describe en GenBank con el número de registro BA000035, un ADN que comprende una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica en las posiciones 320981 a 322321 en el ADN cromosómico derivado de Corynebacterium diphtheriae NCTC 13129, que se describe en GenBank con el nº de registro BX248358, y similares.

En la secuencia nucleotídica del ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, la región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, se refiere a una región que comprende a las posiciones 190 a 192 en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, en la secuencia nucleotídica que posee el ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, cuando la homología de la secuencia nucleotídica que posee el ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme con la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, se calcule utilizando los programas de análisis de la homología, tales como los BLAST y FASTA mencionados anteriormente, así como sus parámetros, alineándose las 2 secuencias nucleotídicas.

El codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, en la región que corresponde a las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, puede ser cualquier codón que codifique un aminoácido distinto al ácido glutámico, pero es preferible un codón que codifique un aminoácido seleccionado a

partir de la alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, cisteína, metionina, triptófano, fenilalanina, prolina, lisina, histidina, arginina, ácido aspártico, asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina, más preferentemente un aminoácido básico, todavía más preferentemente un aminoácido seleccionado a partir de lisina, histidina y arginina, y muy preferentemente, lisina.

Que la cantidad producida de L-glutamina cuando los polipéptidos codificados por el ADN de los apartados (ii) a (v) mencionados anteriormente se expresan utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, sea mayor que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje, puede confirmarse mediante un procedimiento similar al mencionado anteriormente. Es decir, puede confirmarse obteniendo un transformante en el que el polipéptido se exprese introduciendo el ADN en una bacteria corineforme de tipo salvaje y sustituyendo el ADN por un ADN que codifique una glutamina sintetasa 2 de tipo salvaje en el ADN cromosómico de una bacteria corineforme de tipo salvaje, mediante una técnica de recombinación homóloga, o un transformante en el que el polipéptido se exprese transformando una bacteria corineforme de tipo salvaje con un ADN recombinante que comprende el ADN, y evaluando que la cantidad producida de L-glutamina en un sobrenadante del cultivo, cuando el transformante se cultiva en un medio, sea más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje cuando actúa como célula huésped, y se cultiva en un medio.

El ADN de la presente invención en los apartados (vi) a (viii) mencionados anteriormente, es un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, en la que una secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 es sustituida con un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico. El codón incluye el codón mencionado anteriormente que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico.

Que la cantidad producida de L-glutamina cuando los polipéptidos codificados por el ADN de (vi) a (vii) mencionado anteriormente se expresan utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, sea más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje, puede confirmarse obteniendo un transformante en el que el polipéptido se expresa introduciendo el ADN en una bacteria corineforme de tipo salvaje, y sustituyendo el ADN por un ADN que codifica una glutamina sintetasa 2 de tipo salvaje en el ADN cromosómico de una bacteria corineforme de tipo salvaje mediante una técnica de recombinación homóloga, o un transformante en el que un polipéptido que posee un aminoácido codificado por el ADN, se expresa transformando una bacteria corineforme de tipo salvaje, con un ADN recombinante que incluye el ADN, y evaluando que la cantidad producida de L-glutinina en el sobrenadante de un cultivo cuando el transformante se cultiva en un medio, sea más copiosa que la de cuando la bacteria corineforme de tipo salvaje se cultiva como célula huésped. Un procedimiento específico es tal como el que se describe anteriormente.

En el ADN de los apartados (ix) a (xi) mencionados anteriormente, el ADN que se hibrida con un ADN que comprende una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 bajo condiciones estrictas, significa que un ADN que se obtiene utilizando una parte o porción entera de una cadena complementaria del ADN que comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, actúa como una sonda según el procedimiento que utiliza la hibridación colonial, la hibridación en placa, la hibridación de transferencia Southern, o similares, siendo ejemplos específicos un ADN que puede identificarse llevando a cabo la hidridación a 65°C utilizando un filtro en el cual se inmoviliza un ADN derivado de una colonia -o placa-, en presencia de 0,7 a 1,0 ml/l de cloruro sódico, lavando entonces el filtro a una temperatura de 65°C, utilizando una concentración de 0,1 a 2 de una solución de SSC (la composición de concentración 1 de la solución SSC contiene 150 mml/l de solución de cloruro sódico y 15 mml/litro de citrato sódico). La hibridación puede llevarse a cabo según los procedimientos que se describen en Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3ª edición”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (al que se hará referencia en adelante como Molecular Cloning, 3ª edición). Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons (1987-199) (al que se hará referencia como Current Protocols in Molecular Biology), DNA Cloning 1: Core Tecniques, A Practical Approach. 2ª edición, Oxford University (1995) y similares. Específicamente, el ADN que puede hibridarse es un ADN que presenta una homología de por lo menos un 70% o más, preferentemente del 90%

o más, más preferentemente, del 95% o más, particularmente, con preferencia, del 98% o más, y muy preferentemente del 99% o más, con la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, cuando se calcula utilizando BLAST, FASTA o similares.

En el ADN que puede hibridarse mencionado anteriormente, el codón en el ADN que comprende una secuencia nucleotídica en la que una región que corresponde a una secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 desde el extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, e incluye el codón mencionado anteriormente que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico.

Que la cantidad producida de L-glutamina cuando el polipéptido codificado por el ADN se expresa utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, sea mayor que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje, puede confirmarse mediante el procedimiento mencionado anteriormente.

El ADN de la presente invención incluye, por ejemplo un ADN en el que la guanina en posición 190 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es sustituida con adenina, y similares. El ADN es un ADN que codifica un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en posición 64 a

partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, se sustituye con lisina.

El ADN recombinante mencionado anteriormente (xii) de la presente invención, es un ADN recombinante que comprende el ADN de la presente invención en los apartados (i) a (xi) mencionados anteriormente y un vector. El vector incluye un plásmido, un cósmido, un bacteriófago y similares, y puede ser cualquier vector, siempre que pueda estar unido con el ADN de la presente invención, en los (i) a (xi) mencionados anteriormente. El plásmido incluye pUC19 (preparado por Takara Bio), pHSG299 (preparado por Takara Bio), pBR322 (preparado por Takara Bio, pCG1 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 134500/82, pCG2 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 35197/83), pCG4 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 183799/81), YEp13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) y similares. El cósmido incluye pAxCAwtit (preparado por Nippon Gene) y similares, y el bacteriófago incluye M13mp18RF (preparado por Nippon Gene) y similares.

(3): Preparación del ADN de la presente invención.

(i): Preparación de un ADN que codifique una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme.

Como procedimiento para preparar un ADN que codifique una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, el ADN puede obtenerse a partir de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme mediante PCR o similares, utilizando un ADN cromosómico como matriz, que puede prepararse según el procedimiento de Saito et al [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)], y utilizando un ADN cebador que puede diseñarse y sintetizarse basándose en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2.

Como procedimiento para preparar un ADN que codifica una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, en el que se ha encontrado una secuencia nucleotídica completa del ADN cromosómico, el ADN puede obtenerse mediante PCR o similar tal como se describe anteriormente, utilizando el ADN cromosómico como matriz y utilizando un ADN cebador que puede diseñarse y sintetizarse basándose en la secuencia nucleotídica de un ADN que codifica un polipéptido que presenta una homología del 70% o más, con un polipéptido que incluye la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1.

Específicamente, un ADN que codifica una glutamina sintetasa 2, puede obtenerse preparando un ADN cromosómico a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, sintetizando químicamente, utilizando el ADN como una matriz, fragmentos de ADN que tienen secuencias, respectivamente de las regiones 5’ y 3’ terminales de la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, y llevando a cabo PCR utilizando los fragmentos del ADN como un conjunto de cebadores. El ADN que puede obtenerse mediante el procedimiento mencionado anteriormente, incluye un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 y similares.

El ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, puede también obtenerse mediante un procedimiento de hibridación que utiliza una parte o la totalidad del ADN que incluye la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 como una sonda.

Además, el ADN que codifica una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme puede obtenerse asimismo, basándose en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, sintetizando químicamente un ADN que incluye la secuencia nucleotídica mediante un procedimiento conocido.

(ii) Preparación del ADN de la presente invención

El ADN de la presente invención puede obtenerse mediante un procedimiento habitual utilizando el ADN que codifica una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme obtenida mediante el (i) mencionado anteriormente.

Un ADN que codifica un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, puede obtenerse fácilmente, por ejemplo introduciendo una mutación puntual en un ADN que codifica un polipéptido que incluye la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, utilizando la mutagénesis puntual que se describe en “Molecular Cloning”, 3ª edición. Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487/1982), Proc. Natl. Acad Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) y similares.

Una bacteria corineforme que produce un polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos son eliminados sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, puede obtenerse transformando una bacteria corineforme que produce una glutamina sintetasa 2 con un ADN que codifica el polipéptido, y sustituyendo el ADN que codifica el polipéptido que puede obtenerse mediante el procedimiento antes mencionado, por el ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 de tipo salvaje, utilizando una técnica de recombinación homóloga. Además,

también puede obtenerse transformando una bacteria corineforme con un ADN recombinante que comprende el ADN que codifica el polipéptido que puede obtenerse mediante el procedimiento antes mencionado.

El hecho de que la cantidad producida de L-glutamina, cuando el polipéptido codificado por el ADN que puede obtenerse mediante el procedimiento mencionado anteriormente, se expresa utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje, como célula huésped, sea más copiosa que el de la bacteria corineforme de tipo salvaje, puede confirmarse mediante el procedimiento mencionado anteriormente.

El procedimiento siguiente puede también mencionarse como un procedimiento para obtener un ADN que codifica una glutamina sintetasa 2 de tipo mutación que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, en la que una cantidad producida de L-glutamina cuando el polipéptido se expresa utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje como una célula huésped, es más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

Introduciendo aleatoriamente mutaciones en el ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, mediante un procedimiento para contactar con un agente mutágeno químico tal como hidroxilamina, o un procedimiento PCR proclive al error, se construye una biblioteca de genes mutados de glutamina sintetasa 2. Se construye un ADN recombinante uniendo la biblioteca con un ADN plasmídico que puede replicarse autónomamente en una bacteria corineforme, y que contiene un gen resistente a los medicamentos que puede proporcionar resistencia a un medicamento que inhibe el crecimiento de la bacteria corineforme, transformándose entonces una bacteria corineforme de tipo salvaje con el ADN recombinante. El transformante se extiende con una densidad de 1 a 10 células/cm2 en un medio agar mínimo [glucosa 1%, NH4Cl 0,4%, urea 0,2%, KH2PO4 0,1%, K2HPO4 0,3%, MgSO4 0,04%, FeSO4 10 mg/l, MnSO4 1 mg/l, ácido nicotínico 5 mg/l, biotina 100 Ig/l, clorhidrato de tiamina 5 mg/l, Bacto Agar (Difco) 1,6% (pH 7,2)] que contienen aproximadamente 1 x 106 células/cm3 de una cepa MJ4-26 glnA deficiente derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, que muestra un requerimiento de glutamina [FEMS Microbiology Letters, 154, 81 (1997)]. Después de dejar que el medio mínimo de agar permaneciera a 30°C durante 2 a 3 días, los halos que pueden confirmar el crecimiento de la cepa MJ 4-26 que requiere glutamina en el medio de agar, se rascan y se aplican sobre el medio mínimo de agar que contiene dicho medicamento sobre sólo aquellos transformantes, que incluyen el ADN recombinante, pueden crecer y formar colonias cínicas. El medio mínimo de agar que contiene el medicamento, se deja permanecer a 30°C durante 1 a 2 días, seleccionándose entonces los transformantes que formaron colonias. Además, cada uno de los transformantes se cultiva en un medio, midiéndose la concentración de glutamina en el medio cuando finaliza el cultivo. Se selecciona un transformante que muestra un aumento en la concentración de glutamina, en el medio, al finalizar el cultivo, en comparación con la concentración de glutamina detectada cuando una bacteria corineforme de tipo salvaje, se cultiva de la misma forma. Ya que el ADN que codifica una glutamina sintetasa 2 mutada que posee el ADN recombinante mantenido por el transformante, proporciona al huésped una producción más copiosa de L-glutamina que la bacteria corineforme de tipo salvaje, el ADN de la presente invención puede obtenerse mediante dicho procedimiento.

Un ADN que codifica un polipéptido en el cual un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, puede obtenerse llevando a cabo una sustitución nucleótida mediante la mutagénesis puntual anteriormente mencionada, de tal forma que el codón que codifica un aminoácido en una posición correspondiente al aminoácido en posición 64 a partir del Nterminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, en el ADN que codifica un polipéptido que comprende la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, se convierte en un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico. El codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico puede ser cualquier codón que codifique un aminoácido distinto al ácido glutámico, pero resulta preferido un codón que codifique un aminoácido seleccionado a partir de alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, cisteína, metionina, triptófano, fenol alanina, prolina, lisina histidina, arginina, ácido aspártico, asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina, más preferentemente un aminoácido básico, más preferentemente todavía un aminoácido seleccionado a partir de lisina, histidina y arginina, y muy preferentemente, lisina.

Que la cantidad producida de glutamina cuando un polipéptido codificado por un ADN que puede obtenerse mediante el procedimiento mencionado anteriormente, se expresa utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje como una célula huésped, sea más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje, puede confirmarse mediante el procedimiento antes mencionado.

Utilizando un ADN que codifica un polipéptido que comprende la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, la mutagénesis puntual anteriormente mencionada, un procedimiento para contactar con un mutágeno químico, un procedimiento para introducir una mutación mediante un procedimiento PCR predispuesto al error, y similares, pueden utilizarse para obtener un ADN que codifique un polipéptido que incluya una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, donde una cantidad producida de L-glutamina cuando el polipéptido se expresa utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, es más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje. La existencia del

ADN de la presente invención puede confirmarse comparando la producción de glutamina mediante el procedimiento mencionado anteriormente.

Un ADN que codifica un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal, en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, puede obtenerse llevando a cabo una sustitución nucleótida mediante la mutagénesis puntual antes mencionada, de tal forma, que el codón que codifica ácido glutámico en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, en el ADN que codifica un polipéptido que incluye la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, se convierte en un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico. El codón incluye el codón mencionado anteriormente, que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico.

Que la cantidad producida de glutamina cuando un polipéptido codificado por un ADN que puede obtenerse mediante el procedimiento antes mencionado se expresa utilizando una bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, sea más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje, puede confirmarse mediante el procedimiento mencionado anteriormente.

Para la preparación de un ADN que codifique un polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos distintos que un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, son eliminados, es preferible eliminar un codón distinto al que codifica el aminoácido en una unidad de codón, principalmente 3 nucleótidos. Asimismo, para la preparación de un ADN que codifica un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos distintos que el aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, son sustituidos, es preferible llevar a cabo la sustitución nucleótida de tal forma que, en un nucleótido distinto al contenido en el codón que codifica el aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, el aminoácido codificado por el codón que contiene el nucleótido, sea sustituido por otro aminoácido. Además, para la preparación de un ADN que codifique un polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos se añaden a la secuencia aminoácida del polipéptido de la presente invención, resulta preferido añadir un codón que codifique un aminoácido principalmente 3 nucleótidos, entre cada codón que codifique el aminoácido, anterior o posteriormente.

El ADN de la presente invención puede también obtenerse utilizando una parte o una porción completa de una cadena complementaria del ADN que comprende la secuencia de SEC ID nº 2, como una sonda bajo condiciones estrictas, utilizando la hibridación colonial, hidridación en placa, la hibridación por transferencia Southern o similares. Específicamente, puede obtenerse un ADN, que puede identificarse llevando a cabo la hibridación a 65°C, utilizando un filtro en el cual se inmoviliza un ADN derivado de una placa o de una colonia, en presencia de 0,7 a 1,0 ml/l de cloruro sódico, y lavando el filtro entonces bajo una temperatura de 65°C, utilizando una concentración de entre 0,1 y 2 veces de una solución SSC (compuesta por una concentración de una solución de SSC, conteniendo 150 mmol/l de cloruro sódico y 15 mmol/l de citrato sódico). La hibridación puede llevarse a cabo según los procedimientos que se describen en Molecular Cloning, 3ª edición, Current Protocols in Molecular Biology, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, 2ª edición, Oxford University (1995) y similares. Las condiciones estrictas pueden ajustarse según la longitud de la cadena y el contenido de GC del ADN sonda, y pueden fijarse mediante el procedimiento que se describe en Molecular Cloning, 3ª edición o similares.

El ADN de la presente invención puede obtenerse confirmando que el ADN mencionado anteriormente obtenido mediante la hibridación colonial o similar, es un ADN que comprende una secuencia nucleotídica en la que una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, y preparando un transformante en el que el polipéptido se expresa introduciendo el ADN en una bacteria corineforme de tipo salvaje, y sustituyendo el ADN por un ADN que codifica una glutamina sintetasa 2 de tipo salvaje en el ADN cromosómico de una bacteria corineforme de tipo salvaje, mediante una técnica de recombinación homóloga, o un transformante en el cual el polipéptido se expresa transformando una bacteria corineforme de tipo salvaje con un ADN recombinante que comprende el ADN, y confirmando que la cantidad producida de L-glutamina en el sobrenadante de un cultivo, cuando el transformante y la bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped se cultivan en un medio, utilizando el procedimiento mencionado anteriormente, es más cuantiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

El ADN recombinante que comprende el ADN de la presente invención, puede obtenerse uniendo el ADN de la presente invención con un vector. El vector incluye un plásmido, un cósmido, un bacteriófago y similares, y puede ser cualquier vector suyo, siempre que pueda unirse con el ADN de la presente invención. El procedimiento para unir el ADN de la presente invención con un vector, incluye un procedimiento en el que el ADN de la presente invención se une enzimáticamente al vector, utilizando la T4 ADN ligasa (preparada por Takara Bio) o similares, y así sucesivamente.

(4) Producción del polipéptido de la presente invención.

El polipéptido de la presente invención del apartado (1) descrito anteriormente, puede obtenerse expresando el ADN

de la presente invención del apartado (2) mencionado anteriormente en una célula huésped, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento según los procedimientos descritos en Molecular Cloning, 3ª edición, Current Protocols in Molecular Biology, y similares.

Es decir, un fragmento de ADN que posee una longitud apropiada y que contiene una región que codifica el polipéptido, si es necesario, se prepara basándose en el ADN que se ha obtenido anteriormente, y un ADN recombinante en el que el fragmento de ADN se une a la parte inferior del promotor de un vector de expresión apropiado. Introduciendo el ADN recombinante en una célula huésped apropiada para el vector de expresión, puede prepararse un transformante.

Además, el polipéptido de la presente invención puede producirse eficientemente preparando un ADN en el que un nucleótido en la secuencia nucleotídica del fragmento de ADN, se sustituye para obtener un codón que sea muy apropiado para la expresión de la célula huésped.

Como célula huésped, puede utilizarse cualquiera de las bacterias o levaduras capaces de expresar el gen de interés. Como vector de expresión, los que puedan replicarse autónomamente en la célula huésped anteriormente mencionada, pueden integrarse en un cromosoma, y contienen un promotor en tal posición que el ADN que codifica el polipéptido de la presente invención, puede transcribirse.

Cuando un procariota tal como una bacteria, se utiliza como célula huésped, resulta preferido que el vector recombinante que comprende un ADN que codifica el polipéptido de la presente invención, pueda realizar la replicación autónoma en los procariotas y, al mismo tiempo, sea un vector que incluya un promotor, una secuencia de unión ribosómica, el ADN de la presente invención y una secuencia de finalización de la trascripción. Puede contenerse un gen que controle el promotor.

El vector de expresión incluye, por ejemplo, pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (todos disponibles en Boehringer Mannheim), pKK233-2 (preparado por Pharmacia), pSE280 (preparado por Invitrogen), pGEMEX-1 (preparado por Promega), pQE-8 (preparado por QIAGEN), pKYP10 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 110600/83), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48,669 (1984), pLSA 1(Agric. Biol. Chem. 53, 277 (1989), pGEL1/Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985), pBluescript II SK(-)] (preparado por Stratagene), pTrs30 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5403)], pTrs32 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP5408)], pGHA2 [preparado a partir de Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400), solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 221091/85], pTerm2 (patente US nº 4686191, patente US nº 4939094, patente US nº 5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX (fabricada por Pharmacia), sistema pET (preparado por Novagen) y similares.

El promotor puede ser cualquier sustancia, siempre que pueda funcionar en la célula huésped. Los ejemplos incluyen promotores derivados de Escherichia coli fagos y similares, tales como el promotor trp (Ptrp), promotor lac, promotor PL, promotor PR y promotor T7. Además, promotores diseñados artificialmente y modificados, tales como un promotor preparado uniendo dos Ptrp en series (Ptrp x 2), promotor tac, promotor lacT7 y promotor letl, y similares. Es preferible la utilización de un plásmido en el que el espacio entre una secuencia de unión ribosómica, una secuencia Shine-Dalgarno, y un codón de iniciación se ajuste a una distancia apropiada (por ejemplo, entre 6 y 18 nucleótidos). Según el ADN recombinante de la presente invención, una secuencia de finalización de la trascripción no siempre es necesaria para la expresión del ADN de la presente invención, pero es preferible considerar una secuencia de finalización de la trascripción inmediatamente por debajo del gen estructural.

La célula huésped incluye microorganismos que pertenecen al género Escherichia, al género Serratia, al género Bacillus, al género Brevibacterium al género Corynebacterium, al género Microbacterium, al género Pseudomonas y similares. Ejemplos específicos incluyen Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli Xl2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli Nº 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli G1698, Escherichia coli TB1, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 1869, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium Acetoacidophilum ATCC 13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. D-0110 y similares.

Particularmente, cuando la célula huésped es un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium, al género Brevibacterium, o al género Microbacterium, es preferible utilizar Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium lactofermentum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium melassecola, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium thiogenitalis, Microbacterium ammoniaphilum y similares.

Más específicamente, resulta preferido utilizar Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium callunae ATCC 15991, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,

Corynebacterium glutamicum ATCC 13060, Corynebacterium glutamicum ATCC 13826 (géneros originales y especies: Brevibacterium flavum), Corynebacterium glutamicumn ATCC 14020 (géneros originales y especies: Brevibacterium divaricatum), Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (géneros originales y especies: Brevibacterium lactofermentum), Corynebacterium herculis ATCC 13868, Corynebacterium lilium ATCC 15990, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes ATCC 9244, ATCC 9245, ATCC 9246 y ATCC 9277, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 y Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354.

Cuando la célula huésped es el microorganismo mencionado anteriormente que pertenece al género Corynebacterium, al género Brevibacterium, o al género Microbacterium, es preferible utilizar pCG1 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada Nº 134500/82), pCG2 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada Nº 35197/83), pCG4 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada Nº 183799/82), pCG11 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada Nº 134500/82), pCG116, pCE54, pCB101 (todos en la solicitud de patente japonesa publicada no examinada Nº 105999/83), pCE51, pCE52, pCE53 [todos en Molecular y General Genetics, 196, 175 (1984)] pCS299O (WO 00/63388) y los similares como un vector para utilizarse en la preparación de un ADN recombinante que comprende el ADN de la presente invención.

Como procedimiento para introducir el vector de ADN recombinante, cualquier procedimiento que pueda introducir el ADN en la célula huésped anteriormente citada, puede utilizarse, y ejemplos incluyen un procedimiento que utiliza iones cálcicos [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110, (1972)]. Un procedimiento protoplástico (ejemplo, solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 1864492/82 y solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 18649/82), o los procedimientos descritos en Gene 17, 107 (1982) y Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979), electroporación [ejemplo, J. Bacteriology, 175, 4096 (1993) y similares.

Cuando se utilizan las levaduras como célula huésped, el vector de expresión incluye, por ejemplo, Yep13 (ATCC 37115), Yep24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419), pHS19, pHS15 y similares.

Como promotor, cualquier sustancia que pueda funcionar en las cepas de levadura puede utilizarse, incluyendo, por ejemplo, el promotor de un gen de hexoquinasa o similar en la vía glicolítica, el promotor PHO5, promotor PGK, promotor GAP, promotor ADH, promotor gall, promotor gal10, promotor del polipéptido de choque térmico, promotor MFa1, promotor CUP l y similares.

La célula huésped incluye microorganismos que pertenecen al género Saccharomyces, al género Schizosaccharomyces, al género Kluyveromyces, al género Schwanniomyces, al género Pichia, al género Candida y similares, tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius y Candida utilis.

Como procedimiento para introducir el vector de ADN recombinante, puede utilizarse cualquier procedimiento para introducir el ADN en las levaduras, que incluye, por ejemplo, la electroporación [Methods Enzymol, 194, 182 (1990)], un procedimiento esferoplástico [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)], un procedimiento de acetato de litio

[J. Bacteriology, 153, 163 (1983)], el procedimiento que se describe en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) y similares.

Cuando se expresa en las levaduras, puede obtenerse un polipéptido al cual se añade un azúcar o una cadena de azúcares.

Como procedimiento de expresión génica, además de la expresión como tal, puede expresarse como una proteína de fusión según el procedimiento descrito en Molecular Cloning, 3ª edición, o similar.

El polipéptido de la presente invención puede obtenerse cultivando el transformante obtenido mediante el procedimiento mencionado anteriormente en un medio, para formar de este modo y acumular el polipéptido de la presente invención en el cultivo, y recuperar el polipéptido de la presente invención a partir del cultivo.

El cultivo del transformante puede llevarse a cabo mediante un procedimiento de cultivo habitual. El medio, como medio para cultivar el transformante, puede ser, bien un medio natural, o uno sintético, siempre que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y similares, que puedan ser asimiladas por el transformante y puedan realizar eficientemente el cultivo del transformante.

Como fuente de carbono, pueden utilizarse, por ejemplo, azúcares tales como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa y un hidrolizado de almidón, alcoholes tales como etanol, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido láctico y ácido succínico.

Como fuente de nitrógeno, pueden utilizarse varias sales orgánicas e inorgánicas de amonio, tales como amoníaco, cloruro amónico, sulfato amónico, carbonato amónico y acetato amónico, urea,, otros compuestos que contienen nitrógeno y sustancias orgánicas que contienen nitrógeno tales como extracto de carne, extracto de levadura, licor

de maíz fermentado y un hidrolizado de habas de soja.

Como sales inorgánicas, pueden utilizarse fosfato de hidrógeno dipotásico, fosfato dihidrógeno de potasio, sulfato amónico, cloruro sódico, sulfato magnésico, carbonato de calcio y similares.

Además de estos, si es necesario, se añaden trazas de fuentes nutritivas, tales como biotina y tiamina. Estas fuentes de nutrientes traza, pueden sustituirse con aditivos del medio tales como extracto de carne, extracto de levadura, licor de maíz fermentado y casaminoácidos.

El cultivo se lleva a cabo bajo condiciones aeróbicas, tales como cultivo en agitación o de agitación-aireación. Habitualmente, la temperatura del cultivo es preferentemente de entre 20°C a 42°C, y más preferentemente de entre 25 a 40°C. Resulta preferido que el pH en el medio se mantenga entre 5 y 9. El pH se ajusta utilizando ácidos inorgánicos u orgánicos, una solución alcalina, urea, carbonato cálcico, amoníaco o similares. El período de tiempo del cultivo está habitualmente entre 12 horas y 6 días. Además, antibióticos tales como ampicilina y tetraciclina pueden añadirse al medio durante el cultivo, si es necesario.

Cuando un microorganismo transformado con un vector recombinante utilizando un promotor inducible como su promotor, se cultiva, puede añadirse al medio, si es necesario, un inductor. Por ejemplo, pueden añadirse al medio, isopropol-�-D-tiogalactopiranósido o similar, cuando un microorganismo transformado con un vector recombinante que utiliza el promotor lac, se cultiva, o indol acrilato o similar, cuando un microorganismo transformado con un vector recombinante, que utiliza el promotor trp, se cultiva.

El proceso de producción del polipéptido de la presente invención, incluye un procedimiento en el que el polipéptido se produce en el interior de la célula huésped, un procedimiento en el que el polipéptido se secreta a la porción extracelular del huésped, o un procedimiento en el que el polipéptido se produce en la membrana externa de la célula huésped, pudiéndose cambiar la estructura del polipéptido que va a expresarse seleccionando la célula huésped en respuesta al procedimiento que vaya a utilizarse.

Cuando el polipéptido de la presente invención se produce en el interior de la célula huésped o en la membrana externa de la célula huésped, el polipéptido puede secretarse positivamente a la parte extracelular de la célula huésped, según el procedimiento de Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989), el procedimiento de Low et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], o los procedimientos que se describen en la solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 336963/93, documento WO 94/23021 y similares.

Además, la cantidad producida puede también aumentar según un sistema de amplificación génica, utilizando un gen de la dihidrofolato reductasa, de acuerdo con el procedimiento descrito en la solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 227075/90.

Para aislar y purificar el polipéptido producido por el transformante de la presente invención, pueden utilizarse procedimientos generales de purificación y aislamiento enzimático.

Por ejemplo, cuando el polipéptido de la presente invención se expresa en el interior de las células en una forma soluble, las células se recuperan mediante centrifugación, después de la finalización del cultivo, suspendiéndose en un tampón acuoso, obteniéndose entonces un extracto libre de células mediante el rompimiento de las células con ultrasonidos, utilizando también un homogeneizador French press, Manton Gaulin, un triturador Dyno y similares. Puede prepararse una mezcla purificada a partir del sobrenadante obtenido centrifugando el extracto libre de células, utilizando procedimientos de purificación y aislamiento enzimático, procedimientos, principalmente, que incluyen la extracción con disolventes, el saldo mediante sulfato amónico, desalado, precipitación con disolventes orgánicos, cromatografía de intercambio aniónico utilizando una resina tal como dietilaminoetil (DEAE)-Sepharosa, DIAION HPA-75 (fabricada por Mitsubishi Chemical), cromatografía de intercambio catiónico utilizando una resina tal como S-Sepharosa FF (fabricada por Pharmacia), cromatografía hidrofóbica utilizando una resina tal como Fenil-Sepharosa, filtración en gel utilizando un filtro molecular, cromatografía de afinidad, cromatoenfoque y electroforesis, tal como enfoque isoeléctrico, solo o en combinación.

Además, cuando el polipéptido se expresa en el interior de las células formando un cuerpo insoluble, éste se recupera de la misma forma que después de recuperar las células, seguido por rotura y centrifugación. El cuerpo insoluble recuperado del polipéptido, se solubiliza con un agente desnaturalizante proteico. Mediante dilución o diálisis del líquido solubilizado hasta conseguir una concentración menor del agente desnaturalizante proteico en el líquido solubilizado, el polipéptido vuelve a la estructura tridimensional normal. Después de esta operación, puede obtenerse una muestra purificada del polipéptido mediante idéntico procedimiento de purificación aislamiento que el descrito anteriormente.

Cuando el polipéptido de la presente invención o un derivado suyo tal como uno en el que se añade una cadena de azúcares al polipéptido, se secreta a la porción extracelular, el polipéptido o su derivado pueden recuperarse en un sobrenadante del cultivo. Es decir, una muestra purificada puede obtenerse a partir del sobrenadante del cultivo consiguiendo el sobrenadante del cultivo mediante el tratamiento de éste con un procedimiento tal como la centrifugación similar a la anterior, y utilizando idéntico procedimiento de purificación aislamiento que el que se ha descrito anteriormente.

5 El polipéptido obtenido de esta forma incluye el polipéptido del apartado (1) antes mencionado, incluyendo ejemplos más específicos un polipéptido en el que un residuo de ácido glutámico en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un residuo de lisina.

(5) Microorganismo de la presente invención

10 El microorganismo de la presente invención incluye un microorganismo que produce el polipéptido de la presente invención, pudiendo ser cualquier microorganismo, siempre que sea un microorganismo que pueda producir el polipéptido de la presente invención, y es preferible que sea un microorganismo que pertenezca a una bacteria corineforme, más preferentemente uno que pertenezca al género Corynebacterium, al género Brevibacterium o al

15 género Microbacterium, y muy preferentemente al Corynebacterium glutamicum, o similar.

El microorganismo de la presente invención puede obtenerse transformando una célula huésped con el ADN de la presente invención, según un procedimiento general, e incluye, por ejemplo, el transformante que se obtiene en el apartado (4) antes mencionado.

20 Además, el microorganismo de la presente invención incluye un microorganismo que comprende el ADN de la presente invención en el ADN cromosómico. El microorganismo puede obtenerse introduciendo una mutación puntual en la glutamina sintetasa 2 en el ADN cromosómico de un microorganismo que vaya a utilizarse como un huésped, utilizando un tratamiento mutante general, remplazamiento génico mediante técnicas de ADN

25 recombinante, fusión celular, transducción o similares. La introducción de la mutación puntual puede llevarse a cabo según los procedimientos descritos en Molecular Cloning, 3ª edición. Protocolos habituales en Biología Molecular, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 316 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad Sci. USA, 82, 488 (1985) y similares.

30 Además, un microorganismo que comprende el ADN de la presente invención, en el cromosoma, puede también prepararse sustituyendo un ADN que codifica la glutamina sintetasa en el ADN cromosómico, con el ADN de la presente invención, obtenido mediante el procedimiento del apartado (3) mencionado anteriormente, utilizando un procedimiento de recombinación homóloga.

35 Específicamente, el ADN de la presente invención obtenido mediante el procedimiento del apartado (3) mencionado anteriormente, se introduce en un microorganismo según el procedimiento de acuerdo con el apartado (4) mencionado anteriormente, introduciéndolo en un plásmido que no puede realizar la replicación autónoma en células huésped y que posee un gen marcador resistente a los antibióticos y el gen sac B sacarosa levan de Bacillus subtilis [Mol. Microbiol., 6, 1195 (1992)].

40 Ya que el plásmido recombinante no puede replicarse autónomamente en las células huésped, puede obtenerse un transformante en el que el plásmido recombinante se integra en el cromosoma mediante una recombinación homóloga de tipo Campbell, y seleccionándolo basándose en la resistencia a los antibióticos que tiene lugar en el plásmido recombinante.

45 A continuación, puede obtenerse una cepa en la que la glutamina sintetasa 2 en el ADN cromosómico del huésped es sustituida con el ADN de la presente invención, mediante selección basada en el hecho de que el gen sac B de la sacarosa levan de Bacillus subtilis, que va a integrarse en el cromosoma, junto con el ADN de la presente invención, convierte la sacarosa en un sustrato suicida [J. Bacteriol., 174, 5462 (1992)].

50 El remplazamiento génico en el cromosoma puede llevarse a cabo mediante el procedimiento anterior, pero también puede utilizarse otro procedimiento de remplazo génico sin limitación para el procedimiento mencionado anteriormente, siempre que sea uno que pueda sustituir genes en el cromosoma.

55 Otros procedimientos para preparar un microorganismo que incluye el ADN de la presente invención en el cromosoma, incluyen un procedimiento de fusión celular y un procedimiento de transducción. Los ejemplos incluyen procedimientos que se describen en Amino San Hakko (Fermentación de aminoácidos), editado por Hiroshi Aida et al., 1986, Gakkai Shuppan Center.

60 Además, el microorganismo de la presente invención incluye:

(i) un microorganismo que posee capacidad para producir un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de LtsA derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, y posee

65 sensibilidad a la lisozima,

(ii) el microorganismo según el apartado (i) anterior, en el que el polipéptido comprende una secuencia aminoácida en la que un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 80 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, es un aminoácido distinto a la glicina,

(iii) el microorganismo según el apartado (ii) anterior, en el que el aminoácido distinto a la glicina, es acido aspártico,

(iv): el microorganismo según el apartado (i) anterior, en el que la secuencia aminoácida de LtsA es la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10,

(v): el microorganismo según el apartado anterior, (iv) en el que el polipéptido incluye una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en posición 80 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, es un aminoácido distinto a la glicina, y

(vi): el microorganismo según el apartado (v) anterior, en el que el aminoácido distinto a la glicina, es el ácido aspártico,

y que también comprende el ADN de la presente invención, y los similares.

El LtsA derivado de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, puede obtenerse en el procedimiento habitual, utilizando un ADN que codifica LtsA, el cual puede obtenerse mediante la hibridación anteriormente mencionada, utilizando una cadena complementaria de un ADN que presente la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 11, o una cadena complementaria de un ADN que incluye una parte del ADN, como una sonda, o mediante PCR, utilizando un ADN cebador, que puede diseñarse a partir de la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 11, y utilizando el ADN cromosómico de Corynebacterium mencionado anteriormente como, matriz.

El LtsA derivado de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, puede ser cualquier LtsA, siempre que sea un LtsA derivado del microorganismo mencionado anteriormente que pertenece a una bacteria corineforme e incluye, por ejemplo, el LtsA descrito en EP 1 108 790, que comprende la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10.

El polipéptido tal como se da a conocer en la presente memoria, incluyendo una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, se sustituyen o se añaden en la secuencia aminoácida del LtsA derivado de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, puede construirse mediante un procedimiento similar al procedimiento mencionado anteriormente para construir un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de la glutamina sintetasa 2, derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme. El número, posición y tipo de los aminoácidos eliminados, sustituidos o añadidos son los mismos que en el caso del polipéptido mencionado, que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme.

Una bacteria corineforme tal como se describe en la presente memoria, que produce el polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos en la secuencia aminoácida de LtsA derivado de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, son eliminados, sustituidos o añadidos, puede obtenerse transformando una bacteria corineforme que produce un LtsA de tipo salvaje, y que comprende el ADN de la presente invención, con un ADN que codifica el péptido que puede obtenerse mediante el procedimiento antes mencionado, y sustituyendo el ADN que codifica el péptido que puede obtenerse mediante el procedimiento mencionado anteriormente, por un ADN que codifica el LtsA de tipo salvaje, según una técnica de recombinación homóloga. Detectando que el microorganismo corineforme muestre sensibilidad a la lisozima y que una cantidad producida de glutamina mediante el microorganismo corineforme es superior que una cantidad producida mediante la bacteria corineforme antes de la introducción de la mutación de LtsA, puede confirmarse que la bacteria corineforme es el microorganismo de la presente invención.

Que la bacteria corineforme tal como se da a conocer en la presente memoria, que produce el polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos en la secuencia aminoácida del LtsA derivado de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, son eliminados sustituidos o añadidos, muestre sensibilidad a la lisozima, significa que, cuando la bacteria corineforme se cultiva utilizando un medio que contiene una concentración máxima de lisozima mediante la cual la bacteria corineforme produce LtsA de tipo salvaje antes de la sustitución de éste, su velocidad de crecimiento es más lenta que la velocidad de crecimiento cuando la bacteria corineforme que produce el tipo salvaje se cultiva utilizando el medio.

En el microorganismo de la presente invención en los apartados (ii) o (iii) antes mencionados, el aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en la posición 80 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10 en el LtsA derivado de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, significa un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 80 a partir del N-terminal en la secuencia

aminoácida de SEC ID nº 10 en la secuencia aminoácida del LysA derivado de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, cuando la homología de la secuencia aminoácida del LtsA derivado de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, con la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, se calcula utilizando un programa analítico, tal como los BLAST y FASTA antes mencionados y los parámetros, alineándose entonces las secuencias.

El aminoácido distinto a la glicina puede ser cualquier aminoácido, siempre que sea un aminoácido distinto a la glicina, pero es preferentemente un aminoácido seleccionado a partir de la alanina, valina, leucina, isoleucina, cisteína, metionina, triptófano, fenilalanina, prolina, lisina, histidina, arginina, ácido aspártico, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y ácido glutámico, y más preferiblemente, ácido aspártico.

El microorganismo de la presente invención en los apartados (ii) o (iii) antes mencionados, puede obtenerse construyendo un ADN en el cual un codón que codifica un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 80 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10 en el LtsA derivado de una microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, es sustituido con un codón que codifica un aminoácido distinto a la glicina, utilizando la mutagénesis puntual anteriormente mencionada, utilizando este ADN para transformar una bacteria corineforme que produce un LtsA de tipo salvaje y comprende el ADN de la presente invención, y sustituyendo el ADN que puede obtenerse mediante el procedimiento anteriormente obtenido, por un ADN que codifica el LtsA de tipo salvaje según una técnica de recombinación homóloga. Detectando que el microorganismo corineforme muestra sensibilidad a la lisozima y que la cantidad producida de glutamina mediante el microorganismo corineforme, es superior a la cantidad producida mediante la bacteria corineforme antes de la introducción de LtsA, puede confirmarse que la bacteria corineforme es el microorganismo de la presente invención.

El polipéptido tal como se da a conocer en la presente memoria, que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10 en el apartado (iv) antes mencionado, puede construirse utilizando un ADN que codifica la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, de la misma forma que el procedimiento mencionado anteriormente para construir un polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme. El número, posición y tipo de los aminoácidos que van a ser eliminados, sustituidos o añadidos, se describen anteriormente.

La bacteria corineforme tal como se da a conocer en la presente memoria, que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, y que también produce el polipéptido que incluye la secuencia aminoácida, pues sólo un LtsA producido dentro de las células puede obtenerse transformando una bacteria corineforme que produce el LtsA de tipo salvaje, y que comprende asimismo el ADN de la presente invención, con un ADN que codifica el polipéptido que puede obtenerse mediante el procedimiento antes mencionado, y sustituyendo el ADN que codifica el polipéptido que puede obtenerse mediante el procedimiento antes mencionado, y el ADN que codifica el LtsA de tipo salvaje según una técnica de recombinación homóloga. Determinando mediante medición que el microorganismo corineforme muestra sensibilidad a la lisozima y que la cantidad producida de glutamina mediante el microorganismo corineforme es mayor que la cantidad producida mediante la bacteria corineforme antes de introducir LtsA, puede confirmarse que la bacteria corineforme es el microorganismo de la presente invención.

El microorganismo de la presente invención en los apartados (v) o (vi) antes mencionados, puede obtenerse utilizando un ADN que codifica la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10 y utilizando un ADN en el que el codón que codifica un residuo de glicina en posición 80 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un codón que codifica un aminoácido distinto que un residuo de glicina según la mutagénesis puntual antes mencionada. El aminoácido incluye el aminoácido distinto de la glicina antes mencionado.

El microorganismo de la presente invención en los apartados (v) o (vi) antes mencionados puede obtenerse construyendo un ADN en el que el codón que codifica la glicina en posición 80 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, es sustituido con un codón que codifica un aminoácido distinto de la glicina, utilizando la mutagénesis puntual anteriormente mencionada, transformando una bacteria corineforme que produce un LtsA de tipo salvaje y que también comprende el ADN de la presente invención con el ADN mutado, y sustituyendo el ADN que puede obtenerse mediante el procedimiento antes mencionado por un ADN que codifica el LtsA de tipo salvaje según una técnica de recombinación homóloga. Determinando, mediante detección, que el microorganismo corineforme muestras sensibilidad a la lisozima, y que la cantidad producida de glutamina por el microorganismo corineforme es superior a la cantidad producida por la bacteria corineforme antes de introducir LtsA, puede confirmarse que la bacteria corineforme es el microorganismo de la presente invención.

Asimismo, en los microorganismos de los apartados (i) a (vi) mencionados anteriormente, el microorganismo de la presente invención puede construirse también introduciendo una mutación del LtsA en una bacteria corineforme, tal como se ha descrito anteriormente, proporcionando entonces la capacidad para producir el polipéptido de la presente invención.

(6) Producción de L-glutamina

La L-glutamina puede obtenerse cultivando el transformante obtenido en el apartado (4) anterior o el microorganismo de la presente invención obtenido en el apartado (5) anterior en un medio, para formar y acumular L-glutamina en el cultivo, y recuperarla a partir de éste.

El cultivo del microorganismo puede llevarse a cabo mediante un procedimiento habitual de cultivo de un microorganismo que posea capacidad para producir L-glutamina.

Como medio, puede utilizarse cada uno de un medio natural o sintético, siempre que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y similares, en cantidades apropiadas.

La fuente de carbono puede ser cualquier sustancia que pueda ser asimilada por el microorganismo de la presente invención, pudiéndose utilizar azúcares como glucosa, fructosa, maltosa y un hidrolizado de algodón, alcoholes como etanol, y ácidos orgánicos como ácido acético, ácido láctico y ácido succínico y similares.

Como fuente de nitrógeno, pueden utilizarse varias sales amónicas orgánicas e inorgánicas, tales como amoníaco, cloruro amónico, sulfato amónico, carbonato amónico y acetato amónico, urea, otros compuestos que contengan nitrógeno y sustancias orgánicas que contengan nitrógeno, tales como extracto de carne, extracto de levadura, licor de maíz fermentado y un hidrolizado de habas de soja y similares.

Como sales inorgánicas pueden utilizarse fosfato, hidrógeno dipotásico, fosfato dihidrógeno potásico, sulfato amónico, cloruro sódico, sulfato magnésico, carbonato cálcico y similares.

Además de éstas, pueden añadirse, si es necesario, fuentes de nutrientes traza tales como biotina, tiamina, nicotinamida y ácido nicótico. Estas fuentes de nutrientes traza pueden sustituirse con aditivos para el medio, tales como extracto de carne, extracto de levadura, licor de maíz fermentado y casaminoácidos.

El cultivo se lleva a cabo bajo condiciones aeróbicas, tales como cultivo con agitación, o cultivo con agitaciónaireación sumergida. Habitualmente, la temperatura del cultivo es preferentemente de entre 20°C y 42°C, y más preferentemente de entre 30°C y 40°C. Es preferible que el pH en el medio se mantenga en una región neutra de 5 a

9. El pH se ajusta utilizando ácidos inorgánicos u orgánicos, una solución alcalina, urea, carbonato cálcico, amoníaco, un tampón pH o similares.

El período de cultivo es generalmente de entre 12 horas y 6 días, formándose y acumulándose la L-glutamina en el cultivo.

Después de finalizar éste, la L-glutamina puede recuperarse a partir del líquido del cultivo obtenido eliminando los precipitados tales como células, según los procedimientos convencionalmente conocidos en combinación, tales como un tratamiento con carbón activado y uno con resina de intercambio iónico.

Los ejemplos de la presente invención se muestran a continuación, proporcionados de manera no limitativa de la presente invención.

Ejemplo 1

Preparación del plásmido pCglnA2 para remplazamiento génico

Un ADN que codifica un polipéptido que posee una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, se sustituyó con lisina (Glu64Lys), se obtuvo según una mutagénesis puntual, utilizando PCR (Molecular Cloning, 3ª edición) de la forma siguiente.

En primer lugar, se preparó un ADN cromosómico de la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, que es una cepa de tipo salvaje según el procedimiento de Saito et al. [Biochim. Biophys. Acta. 72, 619 (1963)].

A continuación, utilizando el AND cromosómico como matriz, se llevó a cabo la PCR utilizando Pyrobest ADN polimerasa (preparada por Takara Bio), uniéndose a ésta el tampón y los cebadores que se describen seguidamente. Como cebadores que se utilizaron en PCR, se sintetizaron según un procedimiento general, un fragmento de ADN formado por una secuencia nucleotídica en la que, en una región que codifica la glutamina sintetasa 2 de SEC ID nº 2, una región formada por 21 nucleótidos (una secuencia nucleotídica en las posiciones 180 a 200 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, y una secuencia nucleotídica en las posiciones 680 a 700 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 3) que contiene una región que codifica ácido glutámico en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1 (una región de posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, gaa), se sustituyó con un codón (aaa) que codifica la lisina, basado en la información de la secuencia nucleotídica de un ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de Corynebacterium glutamicum, que se describe en EP1108790, y un

fragmento de ADN formado por una secuencia nucleotídica de 21 nucleótidos de SEC ID nº 6 como su secuencia complementaria.

Además, se sintetizó un fragmento de ADN en el que una secuencia señalizadora que contenía una secuencia de reconocimiento BamHl, se añadió a la secuencia nucleotídica en posiciones 167 a 186 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 3, mostrándose en SEC ID nº 4 la secuencia nucleotídica.

Se sintetizó un fragmento de ADN en el que una secuencia señalizadora que contenía una secuencia de reconocimiento BamHl, se añadió a una secuencia complementaria de la secuencia nucleotídica en posiciones 1.185 a 1.204 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 3, mostrándose la secuencia nucleotídica en SEC ID nº 7.

Utilizando el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 4 y un fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 6 como cebadores, o utilizando un fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 5 y el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 7 como cebadores, se llevaron a cabo, respectivamente, dos tipos de PCR, utilizando Pyrobest ADN polimerasa (preparado por Takara Bio) y el tampón unido a ésta, utilizando el ADN cromosómico así obtenido como una matriz.

Los productos amplificados de aproximadamente 0,5 kb, obtenidos mediante las PCR respectivas (un fragmento de ADN que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 167 a 700 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 3, y un fragmento de ADN que corresponde al de las posiciones 167 a 700), se sometieron a electroforesis en gel de agarosa, extrayéndose entonces y purificándose utilizando el equipo GENECLEAN (preparado por BIO 101).

Además, se llevó a cabo PCR utilizando los dos productos purificados como matriz, y utilizando el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 4 y el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 7, como cebadores. Mediante esta PCR se obtuvo alrededor de 1,0 kb de un fragmento de ADN en el que un codón (gaa) que codifica el ácido glutámico en posición 64 a partir del extremo N de la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, se sustituyó con un codón (aaa) que codifica la lisina. El fragmento así obtenido de ADN de alrededor de 1,0 kb, se trató con BamHl, se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se extrajo entonces y purificó utilizando GENECLEAN (preparado por BIO 101).

El fragmento de ADN se insertó en un plásmido pESB30. El pESB30 es un plásmido en el que un fragmento Pstl ADN de 2,6 kb [Mol. Microbiol., 6, 1195 (1992)] que contiene un gen sacB de sacarosa levan derivado de Bacillus subtilis se unió al sitio de fragmentación Pstl de un vector pHSG299 [Gene, 61, 63 (1987)], que contiene un gen de resistencia a la kanamicina. Específicamente, el pESB30 fue cometido a digestión con BamHl (preparado por Takara Bio), tratándose con fosfatasa alcalina (preparada por Takara Bio) y sometiéndose entonces a electroforesis en gel de agarosa, extrayéndose el fragmento de tratado con BamHl, pESB30 y purificándose utilizando el equipo GENECLEAN (preparado por BIO 101). Mezclando este fragmento pESB30 con el fragmento de ADN tratado con BamHl de alrededor de 1,0 kb obtenido anteriormente, se llevó a cabo su unión utilizando un equipo de Unión ver 1 (preparado por Takara Bio). Utilizando el producto de reacción así obtenido, Escherichia coli DH5a (preparado por TOYOBO) se transformó según el procedimiento convencional (Molecular Cloning, 3ª edición).

Se seleccionó un transformante cultivando la cepa en un medio LB agar [un medio que contiene 10 g de bacto triptona (preparado por Difco), 5 g de extracto de levadura (preparado por Difco), 10 g de cloruro sódico y 16 g de bacto agar (preparado por Difco) en 1 litro de agua, ajustándose a pH 7,0], que contenía 20 Ig/ml de kanamicina. El transformante se cultivó durante la noche en un medio LB que contenía 20 Ig/ml de kanamicina, y se preparó un plásmido a partir del cultivo así obtenido mediante un procedimiento SDS alcalino (Molecular Cloning, 3ª edición).

Mediante un análisis de digestión enzimática de restricción, se confirmó que el plásmido es uno que poseía una estructura en la que el fragmento de ADN de alrededor de 1,0 kb obtenido anteriormente, se había insertado en pESB30. Este plásmido se denominó pCglnA2.

Ejemplo 2

Construcción de pGlnA2 para expresión génica

Un ADN que codifica un polipéptido que posee una secuencia aminoácida en la que el ácido glutámico en posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, fue sustituido con lisina (Glu64Lys), se obtuvo de la misma forma que en el Ejemplo 1.

A partir de un ADN cromosómico de la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, que es una cepa de tipo salvaje, se sintetizaron un fragmento de ADN en el que una secuencia de señalización que contenía una secuencia de reconocimiento BamHl, se añadió a una secuencia nucleotídica posicionada por encima del lado del extremo 5’ en una secuencia nucleotídica que codifica una glutamina sintetasa 2 (la secuencia nucleotídica en posiciones 1 a 20 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 3) y un fragmento de ADN en el que una

secuencia de señalización que contiene una secuencia de reconocimiento BamHl se añadió a una secuencia complementaria de una secuencia nucleotídica posicionada en el lado suyo del extremo 3’ (la secuencia nucleotídica en posiciones 1.825 a 1.844 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 3), mostrándose sus secuencias nucleotídicas en SEC ID nº 8 y SEC ID nº 9, respectivamente.

Utilizando el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 8 y el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 6 como cebadores, o utilizando el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 5 y el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 9 como cebadores, se llevaron a cabo, respectivamente, dos tipos de PCR, utilizando el Pyrobest ADN polimerasa (preparado por Takara Bio) y el tampón unido a ella utilizando el ADN cromosómico de ATCC 13032 como matriz.

El producto amplificado de aproximadamente 0,7 kb (un fragmento de ADN que corresponde a la secuencia nucleotídica en posición 1 a 700 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 3) y el producto amplificado de aproximadamente 1,1 kb (un fragmento de ADN que corresponde a la secuencia nucleotídica en posiciones 680 a 1.844 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 3), obtenidos mediante la PCR respectiva, se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se extrajeron y purificaron utilizando el equipo GENECLEAN (preparado por BIO 101).

Además, se llevó a cabo una PCR utilizando ambos productos purificados como una matriz y utilizando el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 8 y el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 9 como cebadores. Mediante esta PCR, se obtuvieron aproximadamente 1,9 kb de un fragmento de ADN que posee la secuencia promotora que existe por encima del lado del extremo 5’ de la glutamina sintetasa 2 y, en SEC ID nº 2, una secuencia en la que un codón (gaa) que codifica el ácido glutámico en posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, fue sustituido por un codón (aaa) que codifica lisina. Este fragmento de ADN de alrededor de 1,9 kb, se trató con BamHl (preparado por Takara Bio), se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se extrajo entonces y se purificó utilizando el equipo GENECLEAN (preparado por BIO 101). El pCS299P (WO 00/63388) se sometió a digestión con BamHl (preparado por Takara Bio), se trató con fosfatasa alcalina (preparada por Takara Bio) y se sometió entonces a electroforesis en gel de agarosa, extrayéndose y purificándose el fragmento pCS299P utilizando el equipo GENECLEAN (preparado por Takara Bio 101).

El fragmento de ADN tratado con BamHl de aproximadamente 1,9 kb obtenido anteriormente, se clonó en este fragmento pCS299P de la misma forma que en el Ejemplo 1.

Llevando a cabo un análisis de digestión enzimática de restricción, se confirmó que el plásmido es uno que posee una estructura en la que el fragmento de ADN de alrededor de 1,9 kb obtenido anteriormente, se insertó en pCS299P. Este plásmido se denominó pGlnA2.

Ejemplo 3

Preparación del plásmido pCltsA para el remplazo génico

Un ADN que codifica un polipéptido que posee una secuencia aminoácida en la que la glicina (en posición 80 a partir del extremo N de la secuencia aminoácida del polipéptido de SEC ID nº 10 relacionado con la sensibilidad a la lisozima) se sustituyó con asparagina (Gly80Asp), se obtuvo de la misma forma que en el Ejemplo 1. Se informó que la sensibilidad a la lisozima se produjo por la introducción de la misma mutación [BMC Biotechnol., 9, 1 (2001)].

Se sintetizaron un fragmento de ADN en el que, una secuencia de señalización que contiene una secuencia de reconocimiento BamHl, se añadió a la secuencia nucleotídica en posiciones 1 a 20 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 12, y un fragmento de ADN en el que una secuencia señalizadora que contiene una secuencia de reconocimiento BamHl, se añadió a una secuencia complementaria de la secuencia nucleotídica en posiciones 981 a 1.000 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 12, que es una región periférica del ADN que codifica LtsA, en un ADN cromosómico de la cepa salvaje de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, mostrándose sus secuencias nucleotídicas en SEC ID nº 13 y SEC ID nº 16, respectivamente. Se sintetizaron de acuerdo con un procedimiento general, un fragmento de ADN formado por la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 15 en la que, en una región formada por 21 nucleótidos (la secuencia nucleotídica en las posiciones 229 a 249 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 11, y la secuencia nucleotídica en las posiciones 491 a 511 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 12), entre la región que codifica el LtsA de SEC ID 11, que contiene un codón que codifica la glicina en la posición 80 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida del LtsA de SEC ID nº 10 (la secuencia nucleotídica en las posiciones 238 a 240 desde el extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 11, ggt), se sustituyó la glicina con un codón (gat) que codifica el ácido aspártico, y un fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de 21 nucleótidos de SEC ID nº 14.

Utilizando el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 13 y el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 14 como cebadores, o utilizando el fragmento de ADN que posee la

secuencia nucleotídica de SEC ID nº 15, y el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 16 como cebadores, se llevaron a cabo, respectivamente, dos tipos de PCR utilizando el ADN cromosómico de la cepa de ATCC 13032 como una matriz, y utilizando Pyrobest ADN polimerasa (preparado por Takara Bio), y el tampón adjunto.

Los productos amplificados de alrededor de 0,5 kb obtenidos mediante las PCR respectivas (un fragmento de ADN correspondiente a la secuencia nucleotídica en las posiciones 1 a 511 desde el extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 12, y un fragmento de ADN correspondiente a la secuencia nucleotídica en posiciones 491 a 1.000, desde el extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 12), se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se extrajeron y purificaron utilizando el equipo GENECLEAN y se (prepararon por BIO 101).

Además, se llevó a cabo la PCR utilizando ambos productos purificados como matriz y se utilizó el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 13, y el fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 16 como cebadores. Mediante esta PCR, alrededor de 1,0 kb de un fragmento de ADN en el que una región que codifica el codón (ggt) que codifica la glicina en posición 80 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, se sustituyó con el codón (gat) que codifica el ácido aspártico, obteniéndose éste. Este fragmento de ADN de alrededor de 1,0 kb, se trató con BamHl (preparado por Takara Bio) y se clonó en pESB30 de la misma forma que en el Ejemplo 1, denominándose al plásmido pCltsA.

Ejemplo 4

Construcción de la cepa que produce L-glutamina que posee el ADN de la presente invención

Utilizando el plásmido pCglnA2 preparado en el Ejemplo 1 mencionado anteriormente, una mutación en la que el ácido glutámico en la posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, se sustituyó con lisina (Glu64Lys), se introdujo en un gen que codifica una glutamina sintetasa 2 en un ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 mediante un procedimiento de remplazo génico.

La introducción de la mutación mediante un procedimiento de remplazamiento génico en el gen que codifica una glutamina sintetasa 2 en un ADN cromosómico de ATCC 13032, se llevó a cabo mediante el siguiente procedimiento de recombinación en dos etapas. En primer lugar, basándose en el hecho de que el plásmido pCglnA2 preparado anteriormente, no puede replicarse autónomamente en las células de bacterias corineformes, una cepa en la que este plásmido se integró mediante recombinación homóloga en el Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, se seleccionó mediante el procedimiento siguiente.

Específicamente, ATCC 13032 se transforma con el plásmido mediante electroporación según el procedimiento de Rest, et al. [Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 541 (1999)], seleccionándose cepas resistentes a la kanamicina. Cuando la estructura del cromosoma obtenido a partir de una cepa de las cepas seleccionadas resistentes a la kanamicina, se examinó mediante hibridación Southern (Molecular Cloning, 3ª edición), se confirmó que el plásmido se integró en el cromosoma mediante una recombinación homóloga de tipo Campbell. En dicha cepa, los genes de tipo salvaje y de la glutamina sintetasa 2 mutada están contiguos en el cromosoma, estando favorablemente situados para que tenga lugar entre ellos una segunda recombinación homóloga.

El transformante (primer recombinante) se extendió sobre un medio SUC de agar que contiene 100 g de sacarosa, 7 g de extracto de carne, 10 g de peptona, 3 g de cloruro sódico, 5 g de extracto de levadura (preparado por Difco) y 18 g de Bacto-Agar (preparado por Difco) en 1 litro de agua, ajustándose a pH 7,2) y se cultivó a 30°C durante 1 día para seleccionar colonias de crecimiento. Ya que una cepa que posee el gen sacB se encuentre presente, convierte la sacarosa en un sustrato suicida, no puede crecer en este medio [J. Bacteriol. 174, 5462 (1992)]. Por otra parte, el sustrato suicida no está formado por una cepa en la que el gen sacB se elimina a causa de la segunda recombinación homóloga entre los genes de tipo salvaje y de la glutamina sintetasa 2 mutada que se encuentran juntos en el cromosoma, de forma que puede crecer en este medio. Durante esta segunda recombinación homóloga bien el gen de tipo salvaje o el gen mutado, se elimina junto con sacB. En este caso, puede considerarse que el gen fue que remplazado con el gen mutado tuvo lugar en la cepa en la que el tipo salvaje se eliminó junto con sacB.

El ADN cromosómico del segundo transformante obtenido de esta forma, se preparó mediante el procedimiento de Saito et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)], utilizando el ADN cromosómico como una matriz y utilizando un fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 4 y un fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 7 como cebadores. Se llevó a cabo la PCR utilizando Pyrobest ADN polimerasa (preparado por Takara Bio) unido a su tampón. Determinando las secuencias nucleotídicas de estos productos PCR mediante el procedimiento habitual, se evaluó si el gen de la glutamina sintetasa 2 en el ADN cromosómico del segundo recombinante era de tipo salvaje o de tipo mutado. Como resultado, se obtuvo una cepa GS2, que es un segundo recombinante que posee una mutación de remplazo del ácido glutámico en posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1 con lisina (Glu64Lys), en el gen que codifica la glutamina sintetasa 2 en el ADN cromosómico.

Además de la cepa GS2, se obtuvo una cepa GLA2 introduciendo una mutación en la que la glicina en posición 80 a

partir del extremo N de la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, se sustituyó con ácido aspártico (Gly80Asp) en el gen LtsA en el ADN cromosómico, de la misma forma que se describió anteriormente utilizando pCltsA. Se llevó a cabo idéntica operación, excepto en que la cepa GS2 se usó como un huésped y pCltsA se utilizó como un plásmido para remplazo. El ADN cromosómico del segundo transformante así obtenido, se preparó mediante el procedimiento de Saito et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)], llevándose a cabo la PCR utilizando el AND cromosómico como una matriz y utilizando un fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 13, y un fragmento de ADN que posee la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 16, como cebadores, utilizando Pyrobest ADN polimerasa (preparado por Takara Bio) con su tampón incorporado. Determinando las secuencias nucleotídicas de estos productos PCR mediante el procedimiento habitual, se evaluó si el gen LtsA en el ADN cromosómico del segundo recombinante, era de tipo salvaje o mutado. Como resultado, se obtuvo una cepa GLA2, que era un segundo recombinante con una mutación de remplazo de la glicina en la posición 80 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10 con ácido aspártico (Gly80Asp),en el gen que codifica LtsA en el ADN cromosómico.

Además, se obtuvieron una cepa ATCC 13032/pGlnA2 y una cepa ATCC 13032/pCS299P transformando con el pGlnA2 preparado en el Ejemplo 2 o el pCS299P como control en el ATCC 13032 mediante electroporación.

Ejemplo 5

Ensayo de producción de L-glutamina mediante cepas mutantes de glutamina sintetasa 2.

Cada una de las cepas obtenidas GS2, GLA2, ATCC 13032/pGlnA2, ATCC 13032/pCS299P y la cepa parental ATCC 13032, se cultivó a 30°C durante 24 horas utilizando un medio BYG de agar [un medio que contiene 10 g de glucosa, 7 g de extracto de carne, 10 g de peptona, 3 g de cloruro sódico, 5 g de extracto de levadura (preparado por Difco) y 18 g de Bacto-Agar (preparado por Difco) en 1 litro de agua, ajustándose a pH 7,2], inoculándose cada cepa respectivamente en un tubo de ensayo que contenía 6ml de un medio de cultivo de siembra (un medio de cultivo preparado con 50 g de glucosa, 20 g de caldo, 5 g de sulfato amónico, 5 g de urea, 2 g de fosfato dihidrógeno potásico, 0,5 de heptahidrato sulfato de magnesio, 1 mg de heptahidrato sulfato de hierro, 0,4 mg de pentahidrato sulfato de cobre, 0,9 mg de heptahidrato sulfato de cinc, 0,07 mg de tetrahidrato cloruro de manganeso, 0,01 mg de tetraborato disódico, 0,04 mg de heptamolibdato hexaamónico, 0,5 mg de clorhidrato de tiamina, y 0,1 mg de biotina en 1 litro de agua, ajustándolo a un pH 7,2 y añadiendo entonces 10 g de carbonato cálcico, cultivándolo a 30°C durante 12 a 16 horas.

Cada uno de los cultivos de siembra así obtenidos se inoculó, con un tamaño del inóculo del 10% en un matraz cónico con una capacidad de 300 ml, con desviadores que contenían 30 ml de un medio de cultivo principal (un medio preparado con 50 g de glucosa, 2 g de urea, 20 g de sulfato amónico, 0,5 g de fosfato dihidrógeno potásico, 0,5 g de fosfato hidrógeno dipotásico, 0,5 g de heptahidrato sulfato magnésico, 2 mg de heptahidrato sulfato de hierro, 2,5 mg de pentahidrato sulfato de manganeso, 0,5 mg de clorhidrato de tiamina y 0,1 mg o 0,001 mg de biotina en 1 litro de agua, ajustando el pH a 7,2 y añadiendo entonces 20 g de carbonato cálcico) y cultivándose durante 16 a 18 horas bajo condiciones de 30°C y 220 rpm antes de que el azúcar no se consumiera completamente.

Después de que el cultivo finalizara, las células se eliminaron del cultivo mediante centrifugación y, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), se determinaron las cantidades de L-glutamina y ácido L-glutámico, que respectivamente se habían acumulado en el sobrenadante. Además, después de que el cultivo finalizara, se midieron [como absorbancia a 660 nm (OD660)], las cantidades respectivas de células. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

Cepa: Concentración de biotina (mg/l) Glutamina (g/l) Ácido glutámico (g/l) OD660

ATCC 13032: 0,1 0,0 0,0 45,2

GS2: 0,1 0,2 0,0 49,2

ATCC 13032/pCS299P: 0,1 0,0 0,0 44,3

ATCC 13032/pGlnA2: 0,1 0,3 0,0 45,6

GLA2: 0,1 4,6 0,9 40,2

ATCC 13032: 0,001 0,7 2,5 38,9

GS2: 0,001 2,3 0,0 38,9

ATCC 13032/pCS299P: 0,001 1,1 3,1 32,2

ATCC 13032/pGlnA2: 0,001 6,8 2,4 34,4

Como se aprecia a partir de la Tabla 1, la eficiencia de producción de L-glutamina de la cepa GS2 y de la cepa ATCC 13032/pGlnA2 que posee el ADN de la presente invención, mejoró significativamente en comparación con la cepa parental. Además, la eficiencia de la producción de glutamina, mejoró sin restricción de la biotina, introduciendo una mutación en el gen LtsA.

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, se puede proporcionar un nuevo procedimiento para la producción de L-glutamina.

TEXTO LIBRE DE LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID nº 4 - Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

SEC ID nº 5 - Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

SEC ID nº 6 - Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético 15 SEC ID nº 7 - Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

SEC ID nº 8 - Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

SEC ID nº 9 - Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

SEC ID nº 13 - Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

SEC ID nº 14 - Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético 25 SEC ID nº 15 - Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

SEC ID nº 16 - Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

Listado de secuencias

<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.

5: <120> Procedimiento para producir L-glutamina

<130> 1838

10: <150> JP2005-373873 <151> 2005-12-27

<160> 16

15 20: <170> PatentIn Ver. 3.1 <210> 1 <211> 446 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 1

<210> 2

<211> 1341

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 2

<210> 3

<211> 1844 5 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<220>

<221> CDS 10 <222> (501)..(1838)

<400> 3

5: <210> 4 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético <400> 4

tttggatcca aactcatggc ggagatcgg: 29

15: <210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 5

25: gcgtatctcg aaagcggaca c 21

<210> 6 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético <400> 6

gtgtccgctt tcgagatacg c: 21

10: <210> 7 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 7

20: tttggatccg gcttgggcat aaatgatgc 29

25: <210> 8 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

30: <400> 8

tttggatcct acttagcttc ggtagctcg: 29

35: <210> 9 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

40: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 9

45 50: tttggatcca gtctagtaat caagattgt <210> 10 <211> 640 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 10 29

<210> 11

<211> 1923

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 11

<210> 12 5 <211> 2188

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<220> 10 <221> CDS

<222> (263).. (2182)

<400> 12

<210> 13

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

5: <400> 13 tttggatccc ccacccttac cccctacgt 29

10: <210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético <400> 14

gtagatctca tcgttgaaag t: 24

20: <210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

25: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 15

30: actttcaacg atgagatcta c 21

35: <210> 16 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

40: <400> 16

tttggatccg aggtcctgct ccttaccct: 29

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, o un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, y además, uno a 20 aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos, en el que la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 es derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, y en el que el polipéptido confiere una cantidad de producción mayor de L-glutamina en una bacteria corineforme de tipo salvaje cuando el polipéptido es expresado en la bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.
2.

Polipéptido según la reivindicación 1, en el que la secuencia aminoácida es una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en la posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto del ácido glutámico, o un polipéptido en el que la secuencia aminoácida es una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en la posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto del ácido glutámico, y además uno a 20 aminoácidos pueden eliminarse, sustituirse o añadirse.
3.

ADN seleccionado de los (a) y (b) siguientes:

(a)

un ADN que codifica el polipéptido según la reivindicación 1 o 2;

(b)

un ADN que hibrida con un ADN constituido por una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, bajo condiciones estrictas, y que comprende una secuencia nucleotídica en la que una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico, en el que una cantidad de producción de L-glutamina, en un transformante obtenido introduciendo el ADN en una bacteria corineforme de tipo salvaje es mayor que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.
4. ADN según la reivindicación 3, que codifica el polipéptido según la reivindicación 1 o 2, y comprende;

(a)

una secuencia nucleotídica en la que, en la secuencia nucleotídica de un ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, o

(b)

una secuencia nucleotídica en la que la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5’ en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico.
5.

Polipéptido o ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico, es un aminoácido básico.
6.

Polipéptido o ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico es la lisina.
7.

ADN recombinante que comprende el ADN según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.
8.

Microorganismo seleccionado de entre los (a) y (b) siguientes:

(a)

un microorganismo transformado con el ADN recombinante según la reivindicación 7;

(b)

un microorganismo que comprende, en su ADN cromosómico, el ADN según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.
9.

Microorganismo según la reivindicación 8, que presenta la capacidad de producir un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de LtsA derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme y que presenta sensibilidad a la lisozima.
10.

Microorganismo según la reivindicación 9, en el que polipéptido comprende una secuencia aminoácida en la que un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en la posición 80 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10 es un aminoácido distinto a la glicina.
11.

Microorganismo según la reivindicación 9, en el que;

(a) la secuencia aminoácida de LtsA es la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10; o 5

(b) la secuencia aminoácida de LtsA es la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, y el polipéptido comprende una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en la posición 80 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, es un aminoácido distinto a la glicina.

10 12. Microorganismo según la reivindicación 10 u 11, en el que el aminoácido distinto de la glicina, es el ácido aspártico.
13. Polipéptido, ADN, ADN recombinante o microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el

que el microorganismo es un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium, el género Brevibacterium o 15 el género Mycobacterium.
14. Polipéptido, ADN, ADN recombinante o microorganismo según la reivindicación 13, en el que el microorganismo que pertenece al género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.

20 15. Procedimiento para producir L-glutamina, que comprende cultivar el microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14 en un medio para formar y acumular L-glutamina en un cultivo, y recuperar la L-glutamina a partir del cultivo.