BR112019019376A2

BR112019019376A2 - micro-organismo do gênero corynebacterium que produz l-aminoácidos e método para produzir l-aminoácidos com o uso do mesmo

Info

Publication number: BR112019019376A2
Application number: BR112019019376-6A
Authority: BR
Inventors: Seung-ju SON; Byoung Hoon Yoon; Kwang woo Lee; Seon Hye Kim; Hyo Jeong BYUN; Jin Sook CHANG; Hyung Joon Kim; Yong Uk Shin
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2020-09-01
Also published as: CN110325642A; CL2020001740A1; TW201942129A; US20200362374A1; PH12020551045A1; EP3567110A4; TWI771557B; AU2019212400B8; MX2020007037A; AR114088A1; PE20210105A1; CN113046288B; CA3086227A1; RU2754781C1; JP2021511009A; AU2019212400A1; CN113046288A; US11180784B2; KR101947945B1; WO2019147059A1

Abstract

  Trata-se de um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-aminoácidos e um método para produzir L-aminoácidos com o uso do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “MICRO- ORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM QUE PRODUZ L-AMINOÁCIDOS E MÉTODO PARA PRODUZIR L-AMINOÁCIDOS COM O USO DO MESMO”

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente revelação refere-se a um micro- organismo do gênero Corynebacterium que produz L-aminoácidos e a um método de produção de L-aminoácidos com o uso do mesmo.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[0002] Os L-aminoácidos são básicos, as unidades estruturais de proteínas, e usados como materiais importantes para fármacos, aditivos alimentares, alimentos para animais, nutrientes, pesticidas, bactericidas, etc.

Entre os aminoácidos L, a L-lisina é um aminoácido essencial que não é biossintetizado no corpo vivo e é conhecido por ser necessário para a promoção do crescimento, metabolismo do cálcio, promoção da secreção do suco gástrico e resistência a doenças. L-lisina é amplamente usado em alimentos, produtos médicos, alimentos, etc. Além disso, a L-valina também é um dos aminoácidos essenciais e é conhecido por ter um efeito antioxidante e um efeito de promover diretamente a síntese proteica das células musculares. L- valina é usado em suplementos de saúde, produtos médicos, alimentos, rações, fragrâncias, cabelo e pele condicionadores, etc.

[0003] Enquanto isso, uma cepa do gênero Corynebacterium, especialmente Corynebacterium glutamicum, é um micro-organismo gram-positivo frequentemente usado na produção de L-aminoácidos e outras substâncias úteis. Muitos estudos foram realizados para desenvolver um micro-organismo com alta eficiência de produção e uma tecnologia de fermentação para produzir os aminoácidos. Por exemplo, abordagens específicas do material alvo para aumentar a expressão de um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de aminoácidos ou remover genes desnecessários na biossíntese de aminoácidos em uma cepa do gênero Corynebacterium são usadas principalmente (Patentes no KN 10-0924065 e 1208480). Além desses métodos, também é usado um método para excluir genes que não estão envolvidos na produção de aminoácidos e um método para excluir genes cujas funções específicas na produção de aminoácidos não são conhecidas. No entanto, ainda há uma demanda por pesquisas sobre um método com capacidade de produzir eficientemente L- aminoácidos com alto rendimento.

[0004] Sob esse pano de fundo, os presentes inventores realizaram estudos intensivos para desenvolver um micro-organismo com capacidade de produzir L-aminoácidos com alto rendimento e, como resultado, constataram que, quando um gene específico é inativado, os rendimentos de produção de L-aminoácidos são aumentados, completando assim a presente revelação.

REVELAÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[0005] Um objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium produtores de L-aminoácidos, em que a atividade de uma proteína composta por uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é inativada.

[0006] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um método de produção de L-aminoácidos usando o micro-organismo.

[0007] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um uso do micro-organismo para aumentar a produtividade de L-aminoácidos.

[0008] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para aumentar a produtividade dos aminoácidos L, que compreende: inativar a atividade de uma proteína composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 da presente revelação em um micro-organismo do gênero Corynebacterium.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[0009] A presente revelação será descrita em detalhes a seguir. Enquanto isso, descrições e modalidades reveladas neste documento também podem ser aplicadas a outras descrições e modalidades. Em outras palavras, todas as combinações de vários elementos aqui revelados se enquadram no escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não é limitado por descrições específicas descritas abaixo.

[0010] A fim de alcançar os objetos acima, um aspecto da presente revelação fornece um micro-organismo do gênero Corynebacterium produtores de L-aminoácidos, em que a atividade de uma proteína composta por uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é inativada.

[0011] Como usado aqui, o termo “L-aminoácido” pode incluir todos os L-aminoácidos que podem ser produzidos por um micro-organismo a partir de muitos tipos diferentes de fontes de carbono por meio de processos metabólicos.

Especificamente, o L-aminoácido pode incluir aminoácidos básicos como L-lisina, L-arginina, L-histidina, etc., aminoácidos não polares como L-valina, L-leucina, L-glicina, L- isoleucina, L-alanina, L-prolina, L-metionina, etc., aminoácidos polares como L-serina, L-treonina, L-cisteína, L-asparagina, L-glutamina, etc., aminoácidos aromáticos, como L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano, etc., aminoácidos ácidos, como ácido L-glutâmico, L-ácido aspártico, aminoácidos alifáticos, como L-alanina, L-valina, L-isoleucina, L-serina, etc., e aminoácidos de cadeia ramificada, como L-valina, L-leucina, L-isoleucina, etc. Na presente revelação, o L-aminoácido pode ser mais especificamente aminoácidos básicos, aminoácidos alifáticos,

aminoácidos de cadeia ramificada e muito mais especificamente, L-lisina ou L-valina, mas não está limitado a isso. O aminoácido L pode incluir qualquer aminoácido sem limitação, desde que sua produtividade seja aumentada quando a atividade da proteína composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 da presente revelação é inativada.

[0012] Como usado aqui, o termo “proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1” se refere a uma proteína que é, codificada pelo gene NCgl0275, intrinsecamente presente em um micro-organismo do gênero Corynebacterium e, especificamente, uma proteína reguladora composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 que está intrinsecamente presente em um micro-organismo do gênero Corynebacterium. A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e uma sequência polinucleotídica de um gene que codifica a proteína pode ser obtida de um banco de dados conhecido, por exemplo, GenBank de NCBI, etc., mas não estão limitados a isso. Além disso, a proteína pode ser uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma proteína que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou uma proteína composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, mas não está limitado a isso.

[0013] Além disso, a proteína da presente revelação pode ser composta de uma sequência de aminoácidos possuindo 80% ou mais de homologia com a SEQ ID NO: 1, bem como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. A proteína composta pela sequência de aminoácidos com 80% ou mais de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 pode incluir uma proteína composta por uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais, especificamente 83% ou mais, 84% ou mais, 88% ou mais, 90% ou mais, 93% ou mais, 95% ou mais ou 97% ou mais homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. É aparente que qualquer sequência de aminoácidos possuindo deleção, modificação, substituição, substituição conservativa ou adição em parte da sequência também é incluída como a sequência de aminoácidos possuindo homologia ou identidade com a sequência no escopo da presente revelação, desde que como é uma sequência de aminoácidos que tem uma atividade biológica substancialmente idêntica ou correspondente à da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

1.

[0014] Na presente revelação, embora descrita como “uma proteína ou polipeptídeo composto de uma SEQ ID NO específica”, isso obviamente pertence ao escopo da presente revelação que a mesma pode compreender uma proteína tem uma sequência de aminoácidos com exclusão, modificação, substituição, substituição ou inserção conservadora de uma parte da sequência, desde que a proteína possua uma atividade igual ou correspondente à de um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente.

Mesmo quando um polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO. Específica, obviamente pertence ao escopo da presente revelação.

[0015] Além disso, uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência genética conhecida, por exemplo, uma sequência que codifica uma proteína que tem a atividade da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 por hibridização sob condições rigorosas com uma sequência complementar a toda ou parte da sequência polinucleotídica, pode ser incluída sem limitação.

[0016] Por exemplo, a proteína composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 pode ser codificada por um gene incluindo uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2. Além disso, a proteína composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 pode ser codificada por um gene que inclui a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, um gene que consiste essencialmente na sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 ou gene composto pela sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, mas não está limitado a isso.

[0017] Além disso, a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 pode incluir uma sequência polinucleotídica com pelo menos 80% de homologia com a SEQ ID NO: 2, bem como a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2.

[0018] Especificamente, qualquer sequência polinucleotídica é incluída no escopo da presente revelação, desde que possa codificar uma proteína incluindo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia com a SEQ ID NO: 1. A proteína pode ser codificada por um gene incluindo uma sequência polinucleotídica com 80% ou mais, especificamente 83% ou mais, 84% ou mais, 88% ou mais, 90% ou mais, 90% ou mais homologia, 93% ou mais, 95% ou mais, ou 97% ou mais de homologia ou identidade com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2.

[0019] É também aparente que na sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, também são incluídos polinucleotídeos traduzidos na proteína composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou uma proteína com homologia devido à degeneração do códon. Uma sonda preparada a partir de uma sequência nucleotídica conhecida, por exemplo, qualquer sequência que hibridiza com uma sequência complementar a toda ou parte da sequência polinucleotídica sob condições rigorosas para codificar uma proteína com a atividade da proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 também pode ser incluído sem limitação. As “condições rigorosas” significam condições sob as quais é permitida a hibridização específica entre polinucleotídeos.

Tais condições são descritas especificamente em uma literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989; FM Ausubel et al., Current Protocols on Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova York).

As condições rigorosas podem incluir, por exemplo, condições sob as quais os genes com alta homologia, homologia de 40% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, muito mais especificamente 97% ou mais, ainda muito mais especificamente 99% ou mais de homologia são hibridizados entre si e genes com homologia menor que a homologia acima não são hibridizados entre si, ou condições de lavagem comuns da hibridização Southern, isto é, lavagem uma vez, especificamente, duas ou três vezes a uma concentração de sal e a uma temperatura correspondente a 60 °C, 1×SSC, SDS a 0,1%, especificamente, 60 °C, 0,1×SSC, SDS a 0,1%, e mais especificamente 68 °C, 0,1×SSC, SDS a 0,1%.

A hibridização requer que dois polinucleotídeos contenham sequências complementares, embora, dependendo do rigor da hibridização, sejam possíveis incompatibilidades entre as bases. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases nucleotídicas que são hibridizáveis entre si. Por exemplo, em relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina.

Portanto, a presente revelação também pode incluir um fragmento de polinucleotídeo isolado complementar à sequência inteira, bem como uma sequência de polinucleotídeo substancialmente semelhante a isso.

[0020] Especificamente, o polinucleotídeo com homologia pode ser detectado usando condições de hibridização, incluindo uma etapa de hibridização a um valor de Tm de 55 °C nas condições descritas acima. Além disso, o valor de Tm pode ser 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não está limitado a isso, e adequadamente controlado pelos versados na técnica, dependendo da finalidade do mesmo.

[0021] Como usado aqui, o termo “homologia” ou “identidade” se refere a um grau de correspondência com uma determinada sequência de aminoácidos ou sequência polinucleotídica, e a homologia pode ser expressa como uma porcentagem. Os termos “homologia” e “identidade” são frequentemente usados de forma intercambiável. Na presente revelação, uma sequência de homologia com uma atividade idêntica ou semelhante à sequência de aminoácidos ou sequência polinucleotídica especificada é expressa como “percentual (%) de homologia”.

[0022] A homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos ou polinucleotídeo pode ser determinada por, por exemplo, o algoritmo BLAST [consulte Karlin e Altschul, Pro.

Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] ou FASTA de Pearson [consulte Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]. Com base nesse algoritmo BLAST, um programa chamado BLASTN ou BLASTX foi desenvolvido [consulte http://www.ncbi.nlm.nih.gov].

[0023] Além disso, a homologia, semelhança ou identidade entre as sequências de aminoácidos ou polinucleotídeos pode ser determinada por comparação de sequências usando hibridização Southern sob condições rigorosas. As condições rigorosas estão dentro do escopo da tecnologia correspondente e podem ser determinadas por um método entendido pelos versados na técnica (por exemplo, J.

Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989; FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova York).

[0024] Como aqui usado, a expressão “atividade de uma proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 está inativada” significa que a proteína não é expressa de todo, ou a proteína é expressa, mas não exibe atividade ou redução na atividade, em comparação com a da cepa nativa do tipo selvagem, cepa parental ou de uma cepa sem modificação na proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Nesse sentido, a redução se refere a um conceito que inclui um caso em que a atividade de uma proteína em si é menor do que a de uma proteína originalmente possuída em um micro-organismo devido à modificação ou exclusão de um gene que codifica a proteína,

um caso em que o nível de a atividade geral da proteína nas células é menor que a da cepa nativa ou a da cepa antes da modificação devido à inibição da expressão ou tradução do gene que codifica a proteína, ou um caso combinado da mesma.

[0025] Na presente revelação, a inativação pode ser alcançada por vários métodos bem conhecidos na técnica.

Exemplos dos métodos podem incluir 1) um método para excluir a totalidade ou parte do gene que codifica a proteína; 2) um método para modificar uma sequência de controle de expressão de modo que a expressão do gene que codifica a proteína seja reduzida; 3) um método para modificar a sequência do gene que codifica a proteína, de modo que a atividade da proteína seja removida ou atenuada; 4) um método de introdução de um oligonucleotídeo antissenso (por exemplo, RNA antissenso) que se liga complementarmente a uma transcrição do gene que codifica a proteína; 5) um método para tornar impossível a ligação de um ribossomo, formando uma estrutura secundária adicionando uma sequência Shine-Dalgarno e sua sequência complementar na extremidade frontal da sequência Shine- Dalgarno do gene que codifica a proteína; 6) um método de engenharia de transcrição reversa (RTE), que adiciona um promotor a ser transcrito reversamente no terminal 3 ‘da estrutura de leitura aberta (ORF) da sequência polinucleotídica do gene que codifica a proteína, etc., e também pode incluem uma combinação dos mesmos, mas não estão particularmente limitados a isso.

[0026] Especificamente, o método de excluir parte ou a totalidade do gene que codifica a proteína pode ser realizado substituindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo endógena dentro do cromossomo por um polinucleotídeo ou um gene marcador em que parte da sequência nucleotídica é excluída, via um vetor para inserção cromossômica no micro-organismo. Em uma modalidade exemplar do método de exclusão de parte ou da totalidade do polinucleotídeo, um método de exclusão do polinucleotídeo por recombinação homóloga pode ser usado, mas não está limitado a isso. Em outra modalidade exemplar do método de excluir parte ou a totalidade do polinucleotídeo, uma mutação pode ser induzida usando luz como UV, ou produtos químicos, e uma cepa com o gene alvo deletado é selecionada a partir dos mutantes obtidos.

[0027] O método de exclusão do gene pode incluir um método de utilização de uma técnica de recombinação genética.

Por exemplo, uma sequência polinucleotídica ou um vetor incluindo uma sequência polinucleotídica com homologia com um gene alvo é introduzida em um micro-organismo para causar recombinação homóloga. Além disso, a sequência polinucleotídica ou o vetor a ser introduzido pode incluir um marcador de seleção dominante, mas não está limitado a isso.

[0028] Além disso, o método de modificar a sequência de controle de expressão pode ser alcançado aplicando uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o método pode ser realizado induzindo uma modificação da sequência de controle de expressão na sequência polinucleotídica via exclusão, inserção, substituição não conservadora ou conservadora ou uma combinação dos mesmos para atenuar ainda mais a atividade da sequência de controle de expressão ou por substituir a sequência de controle de expressão por uma sequência polinucleotídica com uma atividade mais fraca. A sequência de controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica uma região de ligação ao ribossomo e sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução, mas não estão limitadas a isso.

[0029] Além disso, o método de modificar a sequência nucleotídica pode ser realizado induzindo uma modificação na sequência via deleção, inserção, substituição não conservadora ou conservadora, ou uma combinação dos mesmos na sequência nucleotídica para atenuar ainda mais a atividade enzimática ou substituindo a sequência nucleotídica com uma sequência nucleotídica que foi melhorada para ter atividade mais fraca ou uma sequência nucleotídica que foi melhorada para não ter atividade, mas não está limitada a ela.

[0030] Como usado aqui, o termo “micro-organismo que produz L-aminoácidos” pode se referir a um micro- organismo que tem naturalmente uma capacidade de produzir L- aminoácidos ou um micro-organismo que é preparado ao transmitir a capacidade de produzir L-aminoácidos a uma cepa parental que tem nenhuma capacidade de produzir L- aminoácidos. Por exemplo, o micro-organismo que produz L- aminoácidos pode ser um micro-organismo no qual a atividade da proteína composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 é inativada. Além disso, o micro-organismo que produz L-aminoácidos pode ser um micro-organismo no qual a expressão de um gene que codifica uma enzima envolvida na via biossintética dos L-aminoácidos é aprimorada ou uma enzima envolvida na via de degradação é inativada.

Alternativamente, o micro-organismo que produz L-aminoácidos pode ser um micro-organismo obtido pela inativação da atividade da proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 na cepa parental na qual a expressão do gene que codifica a enzima envolvida na via biossintética dos aminoácidos L é aumentada ou a enzima envolvida na via de degradação é inativada. O L-aminoácido produtor de micro- organismos pode ser preparado aplicando vários métodos conhecidos.

[0031] Na presente descrição, um “micro-organismo da Corynebacterium género” pode incluir todos os micro- organismos do género Corynebacterium, especificamente,

Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium Deserti, efficiens Corynebacterium, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, halotolerans Corynebacterium, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris ou Corynebacterium flavescens e, mais especificamente, pode ser Corynebacterium glutamicum.

[0032] O micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-aminoácidos, no qual a atividade de uma proteína composta na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 da presente revelação é inativada, pode ser um micro-organismo no qual a produtividade do L-aminoácido é melhorada.

Especificamente, o micro-organismo pode ser um micro- organismo com a produtividade aprimorada de aminoácidos L em comparação com uma cepa não modificada. A cepa não modificada pode ser uma cepa nativa do tipo selvagem, uma cepa parental ou uma cepa não modificada na qual uma proteína composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 não está inativada.

[0033] Outro aspecto da presente revelação fornece um método de produção de L-aminoácidos, o método incluindo as etapas de cultura do micro-organismo de acordo com a presente revelação em um meio; e recuperar L-aminoácidos do micro-organismo ou do meio.

[0034] O micro-organismo de acordo com a presente revelação é o mesmo que descrito acima.

[0035] No método da presente revelação, a cultura do micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser realizada utilizando quaisquer condições e métodos de cultura conhecidos na técnica.

[0036] Conforme usado aqui, o termo “cultura” significa que um micro-organismo pode crescer sob condições ambientais artificialmente controladas. Na presente revelação, o método de produção de aminoácidos L usando o L- aminoácidos produtores de micro-organismos pode ser realizado usando um método amplamente conhecido na técnica.

Especificamente, a cultura pode ser realizada por um processo descontínuo, um lote alimentado ou um processo descontínuo alimentado repetido de maneira contínua, mas não está limitado a isso. Qualquer meio para cultura pode ser usado sem limitação, por exemplo, o meio de cultura para as cepas de Corynebacterium é conhecido na técnica (por exemplo, Manual de Métodos para Bacteriologia Geral pela Sociedade Americana de Bacteriologia, Washington DC, EUA, 1981).

[0037] As fontes de carbono aplicáveis no meio podem incluir açúcares e carboidratos, como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; óleos e gorduras como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de mamona e óleo de coco; ácidos gordos como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico; álcoois como etanol e glicerol; e ácidos orgânicos como ácido acético. Essas substâncias podem ser usadas sozinhas ou em uma mistura, mas não estão limitadas a isso.

[0038] As fontes de nitrogênio aplicáveis podem incluir peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, aguardente de milho, bolo de soja e ureia ou compostos inorgânicos, como sulfato de amônio, cloreto de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. Essas fontes de nitrogênio também podem ser usadas sozinhas ou em uma mistura, mas não estão limitadas a isso.

[0039] As fontes de fósforo aplicáveis podem incluir di-hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou sais contendo sódio correspondentes. Além disso, o meio de cultura pode incluir um sal metálico, como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, necessário para o crescimento. Além disso, além das substâncias descritas acima, podem ser usados fatores essenciais de crescimento, como aminoácidos e vitaminas, mas não estão limitados a eles.

Além disso, podem ser usados precursores adequados para o meio de cultura. Essas substâncias podem ser adicionadas adequadamente à cultura durante a cultura de maneira descontínua ou contínua, mas não estão limitadas a ela.

[0040] Compostos básicos como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia ou compostos ácidos como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico podem ser adicionados durante a cultura do micro-organismo de maneira adequada, ajustando assim o pH da cultura. Além disso, um agente antiespumante, como éster de poliglicol de ácidos graxos, pode ser usado para suprimir a formação de bolhas. A fim de manter condições aeróbicas, oxigênio ou gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) pode ser injetado na cultura, mas não está limitado a isso. A temperatura da cultura pode ser geralmente de 20 °C a 45 °C, especificamente de 25 °C a 40 °C. A cultura pode continuar até que seja produzida uma quantidade desejada de L-aminoácido, e geralmente pode ser alcançada dentro de 10 horas a 160 horas, mas não está limitada a isso.

[0041] Os aminoácidos L podem ser recuperados da cultura por um método comum conhecido na técnica. Os métodos de recuperação podem incluir a centrifugação, filtração, cromatografia, cristalização, etc. Por exemplo, um sobrenadante, obtido por centrifugação do meio de cultura a baixa velocidade e remoção de biomassa, pode ser separado por cromatografia de troca iônica, mas não está limitado a isso.

[0042] A etapa de recuperação pode ainda incluir um processo de purificação. Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um uso de um micro-organismo do gênero Corynebacterium para aumentar a produtividade de aminoácidos L, em que a atividade de uma proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é inativada.

[0043] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para aumentar a produtividade de aminoácidos L, compreendendo: inativação da atividade de uma proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 em um micro-organismo do gênero Corynebacterium.

EFEITOS VANTAJOSOS

[0044] O micro-organismo da presente revelação que produz L-aminoácidos pode produzir L-aminoácidos com um alto rendimento. Além disso, os L-aminoácidos preparados podem ser aplicados a uma variedade de produtos, como alimentos ou aditivos alimentares para humanos ou produtos médicos, bem como alimentos para animais ou aditivos alimentares para animais.

MODO PARA INVENÇÃO

[0045] A seguir, a presente revelação será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, esses exemplos são apenas para fins ilustrativos, e o escopo da presente revelação não se destina a ser limitado por esses exemplos.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DA BIBLIOTECA MUTANTE ALEATÓRIA

COM O USO DE TRANSPÓSON

[0046] Para obter uma cepa com produtividade de lisina aprimorada, foi preparada uma biblioteca de vetores por meio do método a seguir.

[0047] Primeiro, um plasmídeo obtido usando o kit EZ-Tn5™ <R6Kγori/KAN-2> Tnp Transposome™ (Epicenter) foi transformado em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (patente no KN 10-0159812; esse micro-organismo foi revelado como KFCC10881 e depositado em uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste com o no de Acesso KCCM11016P) como uma cepa parental por meio de um método de pulso elétrico (Appl. Microbiol. Biothcenol. 52: 541 a 545, 1999), e manchados em uma placa média complexa contendo canamicina (25 mg/l) para obter cerca de 20.000 colônias.

PLACA DE MEIO COMPLEXO (PH 7,0)

[0048] 10 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de carne bovina, 5 g de extrato de levedura, 18,5 g de infusão de coração, 2,5 g de NaCl, 2 g de ureia, 91 g de sorbitol, 20 g de ágar (à base de em 1 l de água destilada) EXEMPLO 2: TRIAGEM DE BIBLIOTECA MUTANTE ALEATÓRIA

[0049] Cada uma das cerca de 20. 000 colônias obtidas no Exemplo 1 foi inoculada em 300 µl do meio de seleção a seguir e cultivada em uma placa de 96 poços a 32 °C a 1000 rpm por cerca de 24 horas.

MEIO DE SELEÇÃO (PH 8. 0)

[0050] 10 g de glicose, 5,5 g de sulfato de amônio,

1,2 g de MgSO47H2O, 0,8 g de KH2PO4, 16,4 g de K2HPO4, 100 µg de biotina, 1 mg de HCl de tiamina, 2 mg de pantotenato de cálcio, 2 mg de nicotinamida (à base de 1 l de água destilada)

[0051] Um método de ninidrina foi usado para analisar a quantidade de L-lisina produzida no meio de cultura (Moore, S., Stein, WH, método fotométrico de ninidrina para uso na cromatografia de aminoácidos. J. Biol.

Chem. 1948, 176, 367-388).

[0052] Após a conclusão do cultivo, 10 µl do sobrenadante da cultura e 190 µl de uma solução de reação com ninidrina reagiram a 65 °C por 30 minutos.

Posteriormente, a absorbância foi medida no comprimento de onda de 570 nm, utilizando um espectrofotômetro, e foram selecionados cerca de 60 tipos de colônias com alta absorvância, em comparação com uma cepa de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, que é um grupo de controle. Confirmou- se que outras colônias mostraram absorvância semelhante ou diminuída, em comparação com a cepa de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P usada como grupo de controle.

[0053] Cultivaram-se 60 tipos das cepas selecionadas da mesma maneira que acima, e a reação ninidrina foi realizada repetidamente. Como resultado, foram selecionadas as 10 principais cepas mutantes com melhor produtividade da L-lisina, em comparação com a cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P como cepa parental.

EXEMPLO 3: ANÁLISE DA PRODUTIVIDADE DA L-LISINA DE CEPAS

MUTANTES SELECIONADAS

[0054] Para finalmente selecionar as cepas com aumento da produtividade de L-lisina, a cultura foi realizada pelo método a seguir para 10 tipos de cepas mutantes selecionadas no Exemplo 2. Cada uma das cepas foi inoculada em um balão defletor de 250 ml contendo 25 ml do meio de semente e cultivada sob agitação a 30 °C e 200 rpm por 20 horas. Posteriormente, 1 ml da cultura de sementes foi inoculado em um balão defletor de 250 ml contendo 24 ml do meio de produção e cultivado sob agitação a 32 °C e 200 rpm por 72 horas. Cada meio de semente e meio de produção tem as seguintes composições. Após a conclusão do cultivo, as concentrações de L-lisina no meio de cultura foram analisadas por HPLC (Waters, 2478), e a concentração de L-lisina de cada cepa mutante é mostrada na Tabela 1 abaixo.

MEIO DE SEMENTES (PH 7,0)

[0055] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO47H2O, 100 µg de biotina, 1 mg de HCl de tiamina, 2 mg de pantotenato de cálcio, 2 mg de nicotinamida (com base em 1 l de água destilada) MEIO DE PRODUÇÃO (PH 7,0)

[0056] 100 g de glicose, 40 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de milho sólido íngreme, 3 g de ureia,

1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO47H2O, 100 µg de biotina, 1 mg de HCl de tiamina, 2 mg de pantotenato de cálcio, 3 mg de nicotinamida, 30 g de CaCO3 (à base de 1 l de água destilada) [TABELA 1] CONCENTRAÇÕES DE L-LISINA PRODUZIDAS POR 10 TIPOS DE

CEPAS MUTANTES ALEATÓRIAS SELECIONADAS L-lisina (g/l)

CEPA Lote 1 Lote 2 Lote 3 Média Grupo de KCCM11016P 41. 1 40,9 41,5 41,2 controle 1 KCCM11016P/mt-1 40,2 39,9 40,5 40,2 2 KCCM11016P/mt-2 41,8 41,5 41,7 41,7 3 KCCM11016P/mt-3 47,1 46,8 47 47,0 4 KCCM11016P/mt-4 42,3 42,1 42,6 42,3 5 KCCM11016P/mt-5 42,7 42,7 42,9 42,8 6 KCCM11016P/mt-6 41,0 40,7 41,2 41,0 7 KCCM11016P/mt-7 41,7 41,2 41,8 41,6 8 KCCM11016P/mt-8 42,5 42,9 42,9 42,8 9 KCCM11016P/mt-9 43,3 43,5 43,8 43,5 10 KCCM11016P/mt-10 42,0 42,3 42,5 42,3

[0057] Entre os 10 tipos dos mutantes selecionados acima, o KCCM11016P/mt-3 foi finalmente selecionado como uma cepa tendo uma produtividade significativamente melhorada de L-lisina.

EXEMPLO 4: IDENTIFICAÇÃO DA CAUSA DA PRODUTIVIDADE AUMENTADA DE L-LISINA EM CEPAS FINALMENTE SELECIONADAS

[0058] Nesse exemplo, os genes que são deletados devido à inserção aleatória de um transpóson foram identificados nas cepas mutantes finalmente selecionadas no exemplo 3.

[0059] O DNA genômico de KCCM11016P/mt-3 mostrando a mais excelente produtividade de L-lisina foi extraído e depois digerido. Depois disso, o resultante foi ligado, transformado em E. coli DH5α e depois plaqueado em um meio sólido LB contendo canamicina (25 mg/l). Após a seleção de 20 tipos de colônias transformadas, foram obtidos plasmídeos contendo partes dos genes desconhecidos e as sequências de nucleotídeos foram analisadas usando o primer 1 (SEQ ID NO: 3) e o primer 2 (SEQ ID NO: 4) no EZ-Tn5™ Kit <R6Kγori/KAN- 2> Tnp Transposome™.

[0060] Como resultado, foi confirmado que uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 foi excluída. Foi confirmado que a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e que a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 era uma proteína reguladora, cujas funções não são claramente reveladas, com base na sequência nucleotídica relatada no Genbank do NIH,

EUA.

Primer 1 (SEQ ID NO: 3): ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC Primer 2 (SEQ ID NO: 4): CTACCCTGTGGAACACCTACATCT

[0061] Por conseguinte, a fim de examinar se a inativação da atividade da proteína afetaria a produtividade da L-lisina, o gene foi selecionado como um gene candidato à exclusão.

EXEMPLO 5: CONSTRUÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE PARA

DELEÇÃO GÊNICA

[0062] Nesse exemplo, para confirmar se a inativação da proteína composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 afetaria a produção de L-lisina, um plasmídeo recombinante para exclusão do gene selecionado no Exemplo 4 no cromossomo da L micro-organismo produtor de lisina do gênero Corynebacterium foi construído. Para este fim, os Primers 3 a 6, como mostrado na Tabela 2 a seguir, foram sintetizados.

[TABELA 2] PRIMERS 3 A 6 PARA A PREPARAÇÃO DE FRAGMENTOS PARA

EXCLUSÃO DE GENES Primer Sequência de nucleotídeos Primer 3 (SEQ ID NO: 5) GAATTCGCGCCCCACTGGCCCTTC Primer 4 (SEQ ID NO: 6) ACCCCGGCGGCGCTGCTCTGGAATCAC Primer 5 (SEQ ID NO: 7) GAGCAGCGCCGCCGGGGTTTAATTAAT

Primer 6 (SEQ ID NO: 8) GCAGGTCGACCTGGTTACCGGTCTGAATC

[0063] Em detalhes, para excluir ORF (SEQ ID NO: 2) do gene NCgl0275, primer 3 (SEQ ID NO: 5), primer 4 (SEQ ID NO: 6), primer 5 (SEQ ID NO: 7) e primer 6 (SEQ ID NO: 8) (Tabela 2) foram sintetizados para ter locais de restrição EcoRI e SalI nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente, e o DNA genômico do Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 de tipo selvagem foi usado como modelo para realizar PCR (Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1989).

[0064] Como resultado, os fragmentos de DNA de 500 pb correspondentes às regiões a montante e a jusante do gene foram amplificados. A este respeito, as condições de PCR são as seguintes: 30 ciclos, em que cada um consiste em desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 50 °C por 30 segundos; e alongamento a 72 °C por 1 minuto, seguido de alongamento a 72 °C por 7 minutos. Um vetor pDZ (Patente Coreana No. 10-0924065), que não é replicável em Corynebacterium glutamicum, e os fragmentos de DNA amplificados por PCR foram tratados com enzimas de restrição EcoRI e SalI para inserção cromossômica, ligadas entre si usando uma ligase de DNA transformada em E. coli DH5α, e depois plaqueadas em um meio sólido LB contendo canamicina (25 mg/l).

[0065] Depois de selecionar colónias transformadas com o plasmídeo em que o gene desejado foi inserido através de PCR, o plasmídeo foi obtido utilizando um método de extração de plasmídeo e designado como pDZ-△NCgl0275.

EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO DA CEPA DELETADA NCGL0275 DO CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM KCCM11016P E AVALIAÇÃO DA PRODUTIVIDADE DA L-LISINA

[0066] Com base na cepa KCCM11016P, que é uma cepa produtora de L-lisina representativa do gênero Corynebacterium, a cepa deletada NCgl0275 selecionada a partir do acima foi preparada e a avaliação da produtividade da L-lisina foi tentada.

[0067] Em detalhe, o plasmídeo recombinante pDZ- △NCgl0275 construído no Exemplo 5 foi transformado em Corynebacterium glutamicum que produz L-lisina KCCM11016P por recombinação homóloga no cromossoma (van der Resto et al, Appl Microbiol Biotechnol. 52: 541 a 545, 1999).

[0068] Depois disso, a recombinação secundária foi realizada em uma placa de meio sólido contendo 4% de sacarose. A deleção cromossômica do gene da SEQ ID NO: 2 no transformante Corynebacterium glutamicum no qual a recombinação secundária foi concluída foi confirmada por PCR usando o primer 3 e o primer 6. A cepa recombinante foi designada como Corynebacterium glutamicum KCCM11016P- NCgl0275.

[0069] Para analisar a produtividade de L-lisina da cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-NCgl0275 preparada, a cepa parental (isto é, cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P) também foi cultivada pelo método a seguir.

[0070] Cada um de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P como cepa parental e Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-NCgl0275 preparado no Exemplo 6 foi inoculado em um balão de 250 ml com defletores de canto contendo 25 ml do meio de semente a seguir e cultivado sob agitação a 30 °C e 200 rpm por 20 horas. Posteriormente, 1 ml da cultura de sementes foi inoculado em um balão defletor de 250 ml contendo 24 ml de um meio de produção e cultivado sob agitação a 30 °C e 200 rpm por 72 horas. As composições do meio de semente e do meio de produção são as seguintes, respectivamente.

MEIO DE SEMENTES (PH 7,0)

[0071] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO47H2O, 100 µg de biotina, 1 mg de HCl de tiamina, 2 mg de pantotenato de cálcio, 2 mg de nicotinamida (com base em 1 l de água destilada) MEIO DE PRODUÇÃO (PH 7,0)

[0072] 100 g de glicose, 40 g de (NH 4)2SO4, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de milho sólido íngreme, 3 g de ureia, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO47H 2O, 100 µg de biotina, 1 mg de HCl de tiamina, 2 mg de pantotenato de cálcio, 3 mg de nicotinamida, 30 g de CaCO3 (à base de 1 l de água destilada)

[0073] Após a conclusão do cultivo, a produção de L-lisina foi medida usando HPLC, e as concentrações de L- lisina assim analisadas são mostradas na Tabela 3 abaixo.

[TABELA 3] ANÁLISE DA PRODUTIVIDADE DA L-LISINA DE KCCM11016P E KCCM11016P-NCGL0275 L-lisina (g/l) Cepa Lote 1 Lote 2 Lote 3 Média Grupo de KCCM1106P 40,3 40,0 40,4 40,2 controle Grupo KCCM1106P- 46,8 47,3 47,1 47,1 experimental NCgl0275

[0074] Como mostrado nos resultados acima, quando NCgl0275 foi deletado no Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, produtor de L-lisina, a produtividade de L- lisina aumentou para 17,2% em média, em comparação com a da cepa parental.

[0075] Consequentemente, confirmou-se que a produtividade da L-lisina foi melhorada pela inativação da proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 no micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[0076] Além disso, a cepa KCCM11016P-NCgl0275 foi designada como CA01-7512 e depositada no Centro Coreano de Cultura de Micro-organismos (KCCM), uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste, com o número de acesso KCCM12153P em 7 de novembro de 2017.

EXEMPLO 7: PREPARAÇÃO DA CEPA DELETADA NCGL0275 DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM KCCM11347P E AVALIAÇÃO DA PRODUTIVIDADE DE L-LISINA

[0077] Para examinar se os efeitos acima também são mostrados em outras cepas de Corynebacterium glutamicum produtoras de L-lisina, uma cepa deletada por NCgl0275 foi preparada a partir de uma Corynebacterium glutamicum produtora de L-lisina KCCM11347P (Patente no KN 10-0073610; esse micro-organismo foi revelado como KFCC10750 e depositado novamente em uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste com o Nº de Acesso KCCM11347P) da mesma maneira que no Exemplo 6 e designado como KCCM11347P-NCgl0275.

[0078] Depois disso, a cepa foi cultivada da mesma maneira que no Exemplo 6. Após a conclusão do cultivo, a produção de L-lisina foi medida usando HPLC, e as concentrações de L-lisina assim analisadas são mostradas na Tabela 4 abaixo.

[TABELA 4] ANÁLISE DA PRODUTIVIDADE DA L-LISINA DE KCCM11347P E KCCM11347P-NCGL0275 L-lisina (g/l) Cepa Lote 1 Lote 2 Lote 3 Média Grupo de KCCM11347P 38,8 39. 1 38,7 38,9 controle Grupo KCCM11347P- 44,1 44,4 44,2 44,2 experimental NCgl0275

[0079] Como mostrado nos resultados acima, foi confirmado que quando o gene NCgl0275 foi deletado no Corynebacterium glutamicum KCCM11347P, produtor de L-lisina, a produtividade da L-lisina aumentou em média para 13,6%.

[0080] Consequentemente, como no resultado do Exemplo 6, confirmou-se que a produtividade da L-lisina foi melhorada pela inativação da proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 no micro-organismo do gênero Corynebacterium, em comparação com os não- micro- organismo modificado.

EXEMPLO 8: PREPARAÇÃO DA CEPA DELETADA NCGL0275 DO CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM KCCM10770P E AVALIAÇÃO DA PRODUTIVIDADE DA L-LISINA

[0081] Para examinar se os efeitos acima também são mostrados em outras cepas de Corynebacterium glutamicum produtoras de L-lisina, uma cepa deletada por NCgl0275 foi preparada a partir de uma Corynebacterium glutamicum produtora de L-lisina KCCM10770P (Patente Coreana No. 10- 0924065) da mesma maneira que no Exemplo 6 e designado como KCCM10770P-NCgl0275.

[0082] Depois disso, a cepa foi cultivada da mesma maneira que no Exemplo 6. Após a conclusão do cultivo, a produção de L-lisina foi medida usando HPLC, e as concentrações de L-lisina assim analisadas são mostradas na Tabela 5 abaixo.

[TABELA 5] ANÁLISE DA PRODUTIVIDADE DA L-LISINA DE KCCM10770P E KCCM10770P-NCGL0275 L-lisina (g/l) Cepa Lote 1 Lote 2 Lote 3 Média Grupo de KCCM10770P 45,1 44,9 45,5 45,2 controle Grupo KCCM10770P- 51,5 52,0 51,9 51,8 experimental NCgl0275

[0083] Conforme mostrado nos resultados acima, foi confirmado que, quando o gene NCgl0275 foi deletado no Corynebacterium glutamicum KCCM10770P, produtor de L-lisina,

a produtividade da L-lisina aumentou em média para 14,6%.

[0084] Por conseguinte, como no resultado do Exemplo 7, foi confirmado que a produtividade da L-lisina pode ser melhorada pela inativação da proteína composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 em vários micro- organismos produtores de L-lisina do gênero Corynebacterium, em comparação com a cepa parental.

EXEMPLO 9: PREPARAÇÃO DA CEPA DELETADA NCGL0275 A PARTIR DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM CJ3P E AVALIAÇÃO DA PRODUTIVIDADE DA L-LISINA

[0085] Para examinar se os efeitos acima também são mostrados em outras cepas de Corynebacterium glutamicum produtoras de L-lisina, uma cepa deletada por NCgl0275 foi preparada a partir de uma Corynebacterium glutamicum CJ3P produtora de L-lisina (Binder et al. Genome Biology 2012, 13: R40) da mesma maneira que no Exemplo 6 e designado como CJ3P-NCgl0275.

[0086] Depois disso, a cepa foi cultivada da mesma maneira que no Exemplo 6. Após a conclusão do cultivo, a produção de L-lisina foi medida usando HPLC, e as concentrações de L-lisina assim analisadas são mostradas na Tabela 6 abaixo.

[TABELA 6] ANÁLISE DA PRODUTIVIDADE DA L-LISINA DE CJ3P E CJ3P- NCGL0275

L-lisina (g/l) Cepa Lote 1 Lote 2 Lote 3 Média Grupo de CJ3P 7. 6 7. 4 7,9 7. 6 controle Grupo CJ3P- 8,7 8,9 8,7 8,8 experimental NCgl0275

[0087] Como mostrado nos resultados acima, foi confirmado que quando o gene NCgl0275 foi deletado em Corynebacterium glutamicum CJ3P produtor de L-lisina, a produtividade da L-lisina aumentou em média para 15,8%.

[0088] Por conseguinte, como nos resultados dos Exemplos 6 a 8, foi confirmado que a produtividade da L- lisina pode ser melhorada pela inativação da proteína composta pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 em vários micro-organismos produtores de L-lisina do gênero Corynebacterium.

EXEMPLO 10: PREPARAÇÃO DA CEPA DELETADA NCGL0275 DO CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM KCCM11201P E AVALIAÇÃO DA PRODUTIVIDADE DA L-VALINA

[0089] Foi examinado se a produtividade da valina também é melhorada pela exclusão do gene NCgl0275 no Corynebacterium glutamicum, que tem uma produtividade da L- valina diferente da produtividade da L-lisina.

[0090] O plasmídeo recombinante pDZ- △ NCgl0275 construído no Exemplo 5 foi transformado em L-valina produzindo-Corynebacterium glutamicum KCCM11201P (Patente Coreana N ° 10-1117022) por recombinação homóloga no cromossoma (van der Resto et al, Appl Microbiol Biotechnol.

52: 541 a 545, 1999). Depois disso, a recombinação secundária foi realizada em uma placa de meio sólido contendo 4% de sacarose. Uma cepa na qual o gene NCgl0275 foi deletado no cromossomo foi preparada a partir do transformante Corynebacterium glutamicum no qual a recombinação secundária foi concluída, por PCR usando o primer 3 e o primer 6. A cepa recombinante foi designada como Corynebacterium glutamicum KCCM11201P-NCgl0275.

[0091] Para analisar a produtividade de L-valina da cepa preparada, a cepa foi cultivada pelo método a seguir e os componentes do meio de cultura foram analisados. A cepa foi inoculada em um balão de 250 ml com defletor de canto contendo 25 ml de um meio de produção e cultivada sob agitação a 30 °C e 200 rpm por 72 horas. Posteriormente, as concentrações de L-valina foram medidas usando HPLC, e as concentrações de L-valina assim analisadas são mostradas na Tabela 7 abaixo.

[0092] <Meio de produção (pH 7,0)>

[0093] 100 g de glicose, 40 g de sulfato de amônio, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de sólido íngreme de milho,

3 g de ureia, 1 g de fosfato dibásico de potássio, 0,5 g de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 100 µg de biotina, 1 mg de HCl de tiamina, 2 mg de pantotenato de cálcio, 3 mg de nicotinamida, 30 g de carbonato de cálcio (com base em 1 l de água destilada) [TABELA 7] PRODUTIVIDADE DE L-VALINA DE KCCM11201P E KCCM11201P- NCGL0275 L-valina (g/l) Cepa Lote 1 Lote 2 Lote 3 Média Grupo de KCCM11201P 2,8 2,7 2,9 2,8 controle Grupo KCCM11201P- 3,3, 3,8 3,4, 3,5 experimental NCgl0275

[0094] Como mostrado nos resultados acima, foi confirmado que quando a produtividade de L-valina da cepa KCCM11201P-NCgl0275 aumentou para 25,0%, em comparação com a do grupo de controle. Ou seja, foi confirmado que a produtividade da L-valina pode ser melhorada com a exclusão do gene NCgl0275 nos micro-organismos do gênero Corynebacterium.

[0095] Também foi confirmado que a produtividade de vários aminoácidos L pode ser melhorada através da inativação da proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 nos micro-organismos do gênero Corynebacterium.

EXEMPLO 11: PREPARAÇÃO DA CEPA DELETADA NCGL0275 A PARTIR DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM CJ7V E AVALIAÇÃO DA PRODUTIVIDADE DA L-VALINA

[0096] Para examinar se os efeitos acima também são mostrados em outras cepas de Corynebacterium glutamicum produtoras de L-valina, um tipo de mutação [ilvN (A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, junho de 2014, volume 19, edição 3, páginas 456 a 467] foi introduzida em um Corynebacterium glutamicum ATCC14067 de tipo selvagem para preparar uma cepa com produtividade melhorada de L- valina.

[0097] Em detalhe, o DNA genômico da cepa de Corynebacterium glutamicum de tipo selvagem ATCC14067 foi extraído utilizando um mini-kit de extração de DNA Total G- spin (Intron, Cat. No 17045) de acordo com o protocolo fornecido no kit. O DNA genômico foi usado como modelo para a realização da PCR. Para construir um vetor para a introdução da mutação A42V no gene ilvN, um conjunto primers do primer 7 (SEQ ID NO: 9) e primer 8 (SEQ ID NO: 10) e um conjunto de primers do primer 9 (SEQ ID NO: 11) e o primer 10 (SEQ ID NO: 12) foi usado para obter fragmentos de DNA (A, B). As condições de PCR são as seguintes: desnaturação a 94 °C por 5 minutos, 25 ciclos, em que cada um consiste em desnaturação a 94 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e alongamento a 72 °C por 60 segundos, seguido de alongamento a 72 °C por 7 minutos.

[0098] Como resultado, foram obtidos fragmentos A e B, cada um com um polinucleotídeo de 537 pb. Esses dois fragmentos como molde e primer 7 (SEQ ID NO: 9) e primer 10 (SEQ ID NO: 12) foram usados para realizar a sobreposição de PCR. Foi obtido um produto de PCR de 1044 pb (daqui em diante, referido como “fragmento introduzido por mutação”).

[0099] O fragmento introduzido por mutação obtido foi tratado com a enzima de restrição XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA) e depois ligado a um vetor pDZ, que foi tratado com a mesma enzima de restrição, usando ligase T4 (New England Biolabs, Beverly, MA). O gene preparado foi transformado em E. coli DH5α e depois selecionado em um meio LB contendo canamicina. O DNA foi obtido usando um kit de purificação de DNA de plasmídeo spin de DNA (iNtRON). O vetor para a introdução da mutação A42V no gene ilvN foi designado como pDZ-ilvN (A42V).

[TABELA 8] PRIMERS 7 A 10 PARA A PREPARAÇÃO DE FRAGMENTOS PARA INTRODUZIR A MUTAÇÃO A42V NO GENE ILVN Primer Sequência de nucleotídeos Primer 7 (SEQ ID NO: 9) aatttctagaggcagaccctattctatgaagg

Primer 8 (SEQ ID NO: 10) agtgtttcggtctttacagacacgagggac Primer 9 (SEQ ID NO: 11) gtccctcgtgtctgtaaagaccgaaacact Primer 10 (SEQ ID NO: 12) aatttctagacgtgggagtgtcactcgcttgg

[0100] Posteriormente, o plasmídeo recombinante preparado pDZ-ilvN (A42V) foi transformado no Corynebacterium glutamicum ATCC14067 de tipo selvagem por recombinação homóloga no cromossomo (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52: 541 a 545, 1999). Em seguida, a recombinação secundária foi realizada em uma placa de meio sólido contendo 4% de sacarose. O fragmento gênico foi amplificado a partir do transformante Corynebacterium glutamicum no qual a recombinação secundária foi concluída, por PCR, usando o primer 7 e o primer 10. A cepa introduzida por mutação foi confirmada por análise de sequenciação. A cepa recombinante foi designada como Corynebacterium glutamicum CJ7V.

[0101] Por fim, da Corynebacterium glutamicum CJ7V tendo produtividade de L-valina, cepa NCgl0275-deletado foi preparado da mesma maneira que no Exemplo 9, e designada como CJ7V-NCgl0275. Para comparar a produtividade de L- valina da cepa preparada, a cepa foi cultivada da mesma maneira que no Exemplo 9, e então as concentrações de L- valina foram analisadas e as concentrações de L-valina assim analisadas são mostradas na Tabela 9 abaixo.

[TABELA 9] PRODUTIVIDADE DA L-VALINA DE CJ7V E CJ7V-NCGL0275 L-valina (g/l) Cepa Lote 1 Lote 2 Lote 3 Média Grupo de CJ7V 3,2 3,7 3,3 3,4 controle Grupo CJ7V- 3,9 4,2 3,9 4,0 experimental NCgl0275

[0102] Como mostrado nos resultados acima, foi confirmado que quando a produtividade de L-valina da cepa CJ7V-NCgl0275 aumentou para 17,6%, em comparação com a do grupo de controle. Ou seja, foi confirmado que a produtividade da L-valina pode ser melhorada com a exclusão do gene NCgl0275 em vários micro-organismos do gênero Corynebacterium com produtividade da L-valina.

[0103] Como nos Exemplos 6 a 10, foi confirmado que a produtividade de vários L-aminoácidos pode ser melhorada através da inativação da proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 nos micro-organismos do gênero Corynebacterium.

EXEMPLO 12: PREPARAÇÃO DA CEPA DELETADA NCGL0275 A PARTIR DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM CJ8V E AVALIAÇÃO DA

PRODUTIVIDADE DA L-VALINA

[0104] Para examinar se os efeitos acima também são mostrados em outras cepas de Corynebacterium glutamicum produtoras de L-valina, um tipo de mutação [ilvN (A42V)] foi introduzido em um Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo selvagem da mesma maneira que no Exemplo 10 para preparar uma cepa mutante tendo melhorado a produtividade da L-valina. Essa cepa recombinante foi designada como Corynebacterium glutamicum CJ8V.

[0105] A partir de Corynebacterium glutamicum CJ8V que tem produtividade de L-valina, a cepa NCgl0275-deletada foi preparada da mesma maneira que no Exemplo 9, e designada como CJ8V-NCgl0275.

[0106] Para comparar a produtividade de L-valina da cepa preparada, a cepa foi cultivada da mesma maneira que no Exemplo 9, e as concentrações de L-valina foram analisadas, e as concentrações de L-valina assim analisadas são mostradas na Tabela 10 abaixo.

[TABELA 10] PRODUTIVIDADE DA L-VALINA DE CJ8V E CJ8V-NCGL0275 L-valina (g/l) Cepa Lote 1 Lote 2 Lote 3 Média Grupo de controle CJ8V 2,5 2,8 2,8 2,7 Grupo CJ8V- 3,2. 3,6 3,4 3,4 experimental NCgl0275

[0107] Como mostrado nos resultados acima, foi confirmado que quando a produtividade de L-valina da cepa CJ8V-NCgl0275 aumentou para 25,9%, em comparação com a do grupo de controle. Ou seja, como nos Exemplos 10 a 11, foi confirmado que a produtividade da L-valina pode ser melhorada pela exclusão do gene NCgl0275 em vários micro-organismos do gênero Corynebacterium com produtividade da L-valina.

[0108] Por conseguinte, como nos Exemplos 6 a 11, foi confirmado que as produtividades de vários aminoácidos L podem ser melhoradas pela inativação da proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 nos micro- organismos do gênero Corynebacterium.

[0109] Com base na descrição acima, será entendido pelos versados na técnica que a presente revelação pode ser implementada em uma forma específica diferente sem alterar o espírito técnico ou as características essenciais da mesma.

Portanto, deve ser entendido que a modalidade acima não é limitativa, mas ilustrativa em todos os aspectos. O escopo da presente revelação é definido pelas reivindicações anexas, e não pela descrição que as precede, e, portanto, todas as alterações e modificações que se enquadram dentro dos limites e limites das reivindicações, ou equivalentes de tais critérios e limites, devem, portanto, ser adotadas pelas

Claims

reivindicações.

NÚMERO DE ACESSO Instituição Depositária: Centro Coreano de Cultura de Micro-organismos (KCCM) (Autoridade Depositária Internacional) Número de acesso: KCCM12153P Data do Depósito: 7 de novembro de 2017.