KR20010032426A - 아미노산 생산균의 작제 방법 및 작제된 아미노산생산균을 사용하는 발효법에 의한 아미노산의 제조 방법 - Google Patents

아미노산 생산균의 작제 방법 및 작제된 아미노산생산균을 사용하는 발효법에 의한 아미노산의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코리네형 세균의 염색체상의 아미노산 또는 핵산 생합성계 유전자의 프로모터 서열에 컨센서스 서열에 근접하는 돌연변이를 일으키게 하거나 유전자 재조합에 의해 변화를 도입하여 코리네형 세균의 변이체를 작제하고 이의 변이체를 배양하여 목적하는 아미노산 또는 핵산의 생성량이 많은 변이체를 채취하는 것을 포함하는 아미노산 또는 핵산 생성능이 향상된 코리네형 세균의 작제 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에 따르면 플라스미드를 사용하지 않고 목적하는 유전자의 발현량이 적절하게 강화 및 조절될 수 있으며 아미노산을 고수율로 생산하는 능력을 갖는 변이주를 유전자 재조합 또는 돌연변이에 의해 작제할 수 있다.

Description

아미노산 생산균의 작제 방법 및 작제된 아미노산 생산균을 사용하는 발효법 에 의한 아미노산의 제조 방법 {Process for constructing amino acid-producing bacterium and process for producing amino acid by fermentation method with the use of the thus constructed amino acid-producing bacterium}
본 발명은 아미노산을 고수율로 생산하는 능력을 갖는 변이주를 작제하는 방법 및 당해 변이주를 사용하는 발효법에 의한 L-아미노산의 제조 방법에 관한 것이다.
발효법에 의한 아미노산의 생산에 사용되는 변이주의 작제 방법은 대별하면 두 가지이며 하나는 화학변이제를 이용하여 DNA에 랜덤하게 돌연변이를 도입하는 방법이며 또 하나는 유전자 재조합을 사용하는 방법이다. 유전자 재조합을 사용하는 방법으로서는 목적 물질의 생합성에 관여하는 대사 경로상의 유전자를 강화하거나 분해에 관여하는 효소의 유전자를 약화시킴으로써 목적 물질의 생산성이 향상된 균주를 개발할 수 있다. 또한, 이때에 목적 유전자를 강화하는 방법으로서 세포내에서 염색체와는 관계없이 독립 복제할 수 있는 플라스미드가 주로 사용되고 있다.
그러나 플라스미드를 사용하는 목적 유전자의 강화 방법에는 문제점이 있다. 구체적으로는 목적 유전자의 강화 정도는 플라스미드 자체의 카피수에 의해서 결정되므로 목적 유전자의 종류에 따라서는 카피수가 너무 높아서 발현량이 너무 높아짐으로써 생육이 현저하게 억제되거나 반대로 목적 물질의 생산능이 저하되는 예가 많이 있다. 이러한 경우, 카피수가 낮은 종류의 플라스미드를 사용함으로써 목적 유전자의 강화 정도를 낮출 수 있지만 많은 경우에 있어서 플라스미드의 종류는 한정적이며 목적 유전자의 발현 수준을 자유롭게 조절할 수 없다.
또 하나의 문제점은 플라스미드의 복제가 불안정한 경우가 자주 있으며 플라스미드가 제거되는 것이다.
예를 들면, 일본 공개특허공보 제(소)61-268185호에는 글루탐산 생산성 코리네형 세균 유래의 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH) 생성 유전자(글루탐산 탈수소 효소 유전자)를 함유하는 DNA 단편과 세포내에서 독립 복제에 필요한 유전자를 함유하는 DNA 단편(플라스미드)을 함유하는 재조합체 DNA가 개시되어 있으며 이러한 재조합체 DNA를 세포에 도입함으로써 GDH 강화주를 육종할 수 있으며 미생물에 의한 물질(아미노산, 단백질 등)의 생산을 개선할 수 있는 것이 개시되어 있다.
이에 대하여 일본 특허공보 제2520895호에는 상기한 재조합체 DNA를 코리네박테리움에 도입하여 효소활성이 강화된 균주를 수득하고 이러한 균주를 사용하여 발효법에 의해 L-글루탐산을 제조하지만 이의 생산량이나 수율은 아직 만족할 만한 것은 아니며 또한 L-글루탐산의 생산성을 향상시키는 것이 요망되는 것으로 되어 있다. 그리고 이러한 요망은 글루타메이트 생산성 코리네형 세균 유래의 글루타메이트 데하이드로게나제 생성 유전자와 이소시트레이트 데하이드로게나제(ICDH) 유전자의 2 종류의 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 글루타메이트 생산성 코리네형 세균에 도입함으로써 달성할 수 있다고 한다.
한편, 일본 국제공개특허공보 제(평)6-502548호에는 코리네박테리움 균주 및 당해 균주중의 발현을 위한 제1 기능성 DNA 서열, 아미노산, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 암호화하는 제2 DNA 서열과 상기 제1 및 제2 DNA 서열 사이에 삽입된 제3 DNA 서열을 함유하는 분비 카세트를 함유하여 이루어지고 당해 제3 DNA 서열이 코리네박테리움 균주에 의한 아미노산, 폴리펩타이드 및/또는 단백질의 분비를 보장하는 PS1 및 PS2로부터 선택되는 단백질의 요소를 암호화하는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움의 발현 및 분비계가 개시되어 있다. 구체적으로는 폴리펩타이드의 분비가 개시되어 있으며 코리네박테리움 균주에 NTG 돌연변이 유발을 실시하고 글루타메이트 유사체인 4-플루오로글루타메이트(4-f1uoroglutamate, 4FG)에 대하여 내성을 부여하는 변이주를 선택하고 이것을 pCGL141로 형질전환시키며 상기 유사체 내성균 중에서 GDH의 발현이 강화된 세포주를 취득할 수 있는 것이 개시되어 있다. 여기서는 GDH 프로모터의 251번 내지 266번째 뉴클레오타이드 서열에 변이가 발생하는 것이 기재되어 있다.
도 1은 변이 프로모터를 갖는 GDH 유전자의 작제 흐름도를 도시한 것이다.
도 2는 변이 프로모터를 갖는 CS 유전자의 작제 흐름도를 도시한 것이다.
도 3은 리포터 유전자로서 lacZ를 갖는 셔틀(shuttle) 벡터의 작제 흐름도를 도시한 것이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에서 말하는 코리네형 글루탐산 생산균이란 종래부터 브레비박테리움속으로 분류되고 있지만 현재 코리네박테리움속 세균으로서 통합된 세균을 포함하며[참조: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)] 또한 코리네박테리움속과 대단히 근연(近緣)된 브레비박테리움속 세균을 포함한다. 따라서, 본 발명에서 사용하는 변이주는 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속에 속하는 하기와 같은 코리네형 글루탐산 생산균으로부터 유도할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 글루탐산 생산성을 언급하지 않는 경우에는 코리네박테리움속 세균 및 브레비박테리움속 세균을 단순히 코리네형 세균이라고 하는 경우가 있다.
코리네박테리움·아세토액시도필룸 ATCC13870
코리네박테리움·아세토글루타미쿰 ATCC15806
코리네박테리움·칼루네 ATCC15991
코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13032
브레비박테리움·디바리카툼 ATCC14020
브레비박테리움·락토퍼멘툼 ATCC13869
코리네박테리움·리리움 ATCC15990
브레비박테리움·플라붐 ATCC14067
코리네박테리움·멜라세콜라 ATCC17965
브레비박테리움·사카로리티쿰 ATCC14066
브레비박테리움·임마리오필룸 ATCC14068
브레비박테리움·로제움 ATCC13825
브레비박테리움·티오게니탈리스 ATCC19240
미크로박테리움·암모니아필룸 ATCC15354
코리네박테리움·써모아미노게네스 AJ12310(FERM 9246)
목적 물질로서의 아미노산으로서는 생합성에 관여하는 유전자 및 이의 프로모터가 분명하게 되어 있는 것이면 모두 바람직하다. 생합성에 관여하는 효소의 예로서 구체적으로는 글루탐산 발효의 경우에는 GDH, 시트레이트 신타제(CS), 이소시트레이트 신타제(ICDH), 피루베이트 데하이드로게나제(PDH) 및 아코니타제(AC0) 등이 효과적이다.
라이신 발효에서는 아스파르테이트 키나제(AK), 디하이드로디피코리네이트 신타제, 디하이드로디피코리네이트 리덕타제, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카복실라제 등의 생합성계 효소에 추가하여 라이신의 막 배출에 관여하는 라이신 배출 단백질(lysE 유전자)도 동일하게 효과적이다.
아르기닌 발효에서는 N-아세틸글루타메이트 신타제, N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀인산 리덕타제, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 카바밀트랜스퍼라제, 아르기니노석시네이트 신타제 및 아르기니노석시나제에 의해 촉매되는 반응으로 생성된다. 그리고 이들 효소가 효과적이다. 또한, 이들 효소는 순차적으로 argA, argB, argC, argD, argE, argF, argG 및 argH의 각 유전자에 의해 암호화되어 있다.
세린 발효에서는 3-포스포글리세린산 데하이드로게나제, 포스포세린 트랜스아밀라제, 포스포세린 포스파타제 등의 효소가 효과적이다.
페닐알라닌 발효에서는 데옥시아라비노헵트론산인산 합성효소, 3-데하이드로키네이트 합성효소, 3-데하이드로키나산 데하이드라타제, 시키미산(shikimic acid) 데하이드로게나제, 시키미산 키나제, 5-에놀 피루빌시키미산-3-포스페이트 합성효소, 코리스미산 합성효소, 코리스미산 뮤타제, 프레페네이트 데하이드라타제 등의 생합성 효소가 효과적이다. 또한, 트랜스케토라제, 트랜스알돌라제, 포스포에놀피루브산 합성효소 등의 당대사계 효소도 효과적이다.
트립토판 발효에서는 페닐알라닌 발효에서 효과적이라고 생각되는 여러가지 효소, 세린 발효에서 효과적이라고 생각되는 여러가지 효소에 추가하여 트립토판 오페론에 속하는 효소가 효과적이다.
프롤린 발효에서는 글루탐산 발효에서 효과적이라고 생각되는 여러가지 효소에 추가하여 γ-글루타밀키나제, γ-글루타밀세미알데히드 데하이드로게나제, 피롤린-5-카복실레이트 리덕타제 등이 효과적이다.
글루타민 발효에서는 글루탐산 발효에서 효과적이라고 생각되는 여러가지 효소에 추가하여 글루타민 합성효소가 효과적이다.
이노신 생산에서는 5-포스포리보실 1-디포스페이트 합성효소, 5-포스포리보실 1-디포스페이트 아미노트랜스퍼라제, 포스포리보실아미노이미다졸카복스아미드 포르밀트랜스퍼라제 등의 효소의 발현 강화가 효과적이라고 생각된다.
구아노신 생산에서는 5-포스포리보실 1-디포스페이트 합성효소, 5-포스포리보실 1-디포스페이트 아미노트랜스퍼라제, 포스포리보실아미노이미다졸카복스아미드 포르밀트랜스퍼라제에 추가하여 5'-이노신산 데하이드로게나제, 5'-크산틸산 아미나제의 발현 강화가 효과적이라고 생각된다.
아데노신 생산에서는 5-포스포리보실 1-디포스페이트 합성효소, 5-포스포리보실 1-디포스페이트아미노트랜스퍼라제, 포스포리보실아미노이미다졸카복스아미드 포르밀트랜스퍼라제에 추가하여 아데닐로석시네이트 합성 효소의 발현 강화가 효과적이라고 생각된다.
뉴클레오타이드 생산에서는 포스포리보실 트랜스퍼라제나 이노신 키나제, 구아노신 키나제, 아데노신 키나제의 발현 강화가 효과적이라고 생각된다.
본 발명에서는 코리네형 아미노산 생산균의 염색체 위의 원하는 아미노산 생합성계 유전자의 프로모터 서열, 예를 들면, GDH용 프로모터 등의 프로모터 서열에 컨센서스 서열에 가까운 변이를 화학약품 등을 사용하는 돌연변이에 의해 일으키게 하거나 유전자 재조합에 의해 변이를 도입하여 코리네형 아미노산 생산균의 변이체를 작제한다.
여기서, 컨센서스 서열은 많은 프로모터 서열과 비교하여 가장 높은 빈도로 출현하는 염기를 한줄로 배열한 서열이다. 이러한 컨센서스 서열로서는 대장균, 바실러스 서브틸리스 등의 컨센서스 서열을 들 수 있다. 대장균의 컨센서스 서열은 문헌[Diane K. Haw1ey and William R. McClure Nuc. Acid. Res. 11: 2237­2255(1983)]에 기재되어 있으며 바실러스 서브틸리스의 컨센서스 서열은 문헌[Charles et al. Mol. Gen. Genet 186: 339­346(1982)]에 기재되어 있다.
상기한 변이는 1개의 프로모터 서열, 예를 들면, GDH용 프로모터에만 일으킬 수 있지만 2개 이상의 프로모터 서열, 예를 들면, GDH용 프로모터, 시트레이트 신타제(CS)나 이소시트레이트 신타제(ICDH)에서도 일으킬 수 있다.
본 발명에서는 이와 같이 수득되는 변이체를 배양하여 목적하는 아미노산의 생성량이 많은 변이체를 채취한다.
글루탐산 발효의 경우에 코리네형 글루탐산 생산균의 GDH는 그 자신의 프로모터 서열을 이의 상류 영역에 가지는 것이 명백해졌다[참조: Sahm et al. Molecular Microbiology(1992), 6, 317­326].
예를 들면, 본 발명의 GDH용 프로모터, 당해 GDH용 프로모터 서열을 가지는 GDH 유전자 및 당해 유전자를 갖는 L-글루탐산 생산성 코리네박테리아 균주는 예를 들면, 다음과 같이 하여 수득할 수 있다.
요컨대, 상기와 같은 균주에 자외선 조사, X선 조사, 방사선 조사, 변이 유발제 처리 등의 변이처리를 실시하고 4-플루오로글루탐산을 함유하는 한천 평판배지 위에서 4-플루오로글루탐산에 대하여 내성을 갖는 균주를 수득한다. 즉, 친주(親株)의 생육을 억제하는 농도의 4-플루오로글루탐산을 함유하는 한천 평판배지 위에 변이처리를 실시한 균주를 도포하여 생육시킨 변이주를 분리하면 양호한다.
또한, GDH 유전자의 프로모터 서열을 부위 특이적 변이법을 사용하여 각종 변이를 도입한 서열로 치환하는 것을 다수 제조하여 각각의 서열과 GDH 활성의 관계를 조사하여 L-글루탐산 생산성이 높은 것을 선택할 수 있다.
본 발명에서는 특히, GDH 유전자의 프로모터의 -35 영역의 DNA 서열이 CGGTCA, TTGTCA, TTGACA 및 TTGCCA로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 DNA 서열로 이루어져 있고/있거나 당해 프로모터의 -10 영역의 DNA 서열이 TATAAT로 이루어져 있거나 -10 영역에 TATAAT 서열의 ATAAT 염기가 별도의 염기로 치환되어 있으며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. -10 서열의 TATAAT 서열의 ATAAT의 염기가 별도의 염기로 치환되어 있으며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열로 이루어져 있는 것을 선택할 수 있는 것은 야생형의 ­10 서열인 CATAAT의 최초의「C」를「T」로 대신할 뿐으로 극적으로 GDH 비활성의 상승이 관찰되므로(참조: 표 1, p6-4) 다른 염기로 변경해도 상관없다고 생각되기 때문이다.
GDH 유전자의 프로모터 서열은 예를 들면, 상기한 문헌[Sahm et al., Molecu1ar Microbiology(1992), 6, 317-326]에 기재되어 있으며 또한, 서열 1에 기재되어 있다. 또한, GDH 유전자 자체의 서열은 예를 들면, 동일하게 문헌[Sahm et al., Molecu1ar Microbiology(1992), 6, 317­326]에 기재되어 있으며 또한, 서열 1에 기재되어 있다.
동일하게 하여 시트레이트 신타제(CS)나 이소시트레이트 신타제(ICDH)의 프로모터에 관해서도 돌연변이를 일으킬 수 있다.
이와 같이 GDH용 프로모터로서는 -35 영역에 CGGTCA, TTGTCA, TTGACA 및 TTGCCA로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 DNA 서열 및/또는 -10 영역에 TATAAT 서열 또는 당해 서열의 ATAAT 염기가 별도의 염기로 치환되어 있으며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 또한, 상기한 프로모터를 갖는 글루타메이트 데하이드로게나제 생성 유전자를 제공한다.
CS용 프로모터로서는 -35 영역에 TTGACA 서열 및/또는 -10 영역에 TATAAT 서열을 가지며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 또한, 상기한 프로모터를 갖는 CS 유전자를 제공한다.
ICDH용 프로모터로서는 -35 영역의 제1 또는 제2의 프로모터에 TTGCCA 서열 및 TTGACA 서열중의 하나이고/이거나 -10 영역의 제1 또는 제2의 프로모터에 TATAAT 서열을 가지며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 또한, 상기한 프로모터를 갖는 icd 유전자를 제공한다.
PDH용 프로모터로서는 -35 영역에 TTGCCA 서열 및/또는 -10 영역에 TATAAT 서열을 가지며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열을 들 수 있다. 또한, 상기한 프로모터를 갖는 PDH 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기한 유전자를 갖는 코리네형 L-글루탐산 생산균을 제공한다.
아르기니노석시네이트 신타제용 프로모터로서는 -35 영역에 TTGCCA, TTGCTA 및 TTGTCA로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 DNA 서열 및/또는 -10 영역에 TATAAT 서열 또는 당해 서열의 ATAAT 염기가 별도의 염기로 치환되어 있으며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 또한, 상기한 프로모터를 갖는 아르기니노석시네이트 신타제 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기한 유전자를 갖는 코리네형 아르기닌 생산균을 제공한다.
본 발명의 코리네형 아미노산, 바람직하게는 L-글루탐산 생산균을 액체 배지에 배양하여 배지중에 원하는 아미노산, 바람직하게는 L-글루탐산을 생성 축적시켜 이것을 당해 배지로부터 채취함으로써 아미노산을 수득할 수 있다.
본 발명에서 상기 균주의 배양에 사용되는 액체 배지로서는 탄소원, 질소원, 무기염류, 생육 인자 등을 함유하는 통상적인 영양 배지가 사용된다.
탄소원으로서는 글루코오스, 프럭토오스, 슈크로오스, 폐당밀, 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 에탄올, 글리세롤 등의 알콜류, 아세트산 등의 유기산류가 사용된다. 질소원으로서는 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 아세트산암모늄, 암모니아, 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액 등이 사용된다. 영양 요구성을 갖는 변이주를 사용하는 경우에는 이들 요구물질을 표준품 또는 이를 함유하는 천연물로서 첨가하는 것이 양호한다.
코리네형 세균은 일반적으로 바이오틴 제한하에 L-글루탐산을 생산한다. 따라서 배지중의 바이오틴량을 제한하거나 계면활성제나 페니실린 등의 바이오틴 작용 억제물질을 첨가한다.
발효는 진탕 배양이나 통기 교반 배양 등에 따른 호기 조건하에서 배양액의 pH를 5 내지 9 사이로 유지하면서 2 내지 7일 동안 실시하는 것이 바람직하다. pH 조절에는 요소, 탄산칼슘, 암모니아 가스, 암모니아수를 사용하는 것이 바람직하다. 배양 온도는 24 내지 37℃인 것이 바람직하다.
배양액 중에 생성 축적된 L-글루탐산의 채취는 통상적인 방법에 따라 실시하면 바람직하며 예를 들면, 이온교환 수지법, 결정 석출법 등에 따를 수 있다. 구체적으로는 L-글루탐산을 음이온 교환수지에 의해 흡착, 분리시키거나 중화 결정 석출시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면 코리네형 아미노산 생산균의 아미노산 생합성 유전자의 프로모터 영역에 변이를 도입하여 목적 유전자의 발현량을 조절함으로써 목적하는 아미노산을 고수율로 수득할 수 있으며 또한 플라스미드와 같이 탈락이 없으며 안정적으로 목적하는 아미노산을 고수율로 수득할 수 있으므로 공업적으로 큰 이점이 있다.
또한, 본 발명에 따르면 부산물로서의 아스파라긴산 및 알라닌의 증가를 일으키지 않고 코리네박테리아 균주에 아미노산, 특히 글루탐산을 고수율로 생산하는 능력을 부여할 수 있는 각종 프로모터 특히 GDH용 프로모터를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 코리네형 L-글루탐산 생산균에 변이처리를 실시하고 변이가 GDH 유전자의 프로모터 영역에 일어나 4-플루오로글루탐산에 대하여 내성을 갖는 균주를 채취하고 이러한 균주를 배양함으로써 글루탐산을 고수율로 수득할 수 있으므로 공업적으로 큰 이점이 있다.
본 발명은 플라스미드를 사용하지 않고 목적 유전자의 발현량의 적절한 강화
및 조절을 할 수 있으며 아미노산을 고수율로 생산하는 능력을 갖는 변이주를 유전자 재조합 또는 변이에 의해 작제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 부산물로서의 아스파라긴산 및 알라닌의 현저한 증가를 일으키지 않고 코리네박테리아 균주에 글루탐산을 고수율로 생산하는 능력을 부여할 수 있는 GDH용 프로모터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, GDH용 프로모터 서열을 가지는 GDH 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기한 유전자를 갖는 L-글루탐산 생산성 코리네박테리아 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 작제된 아미노산 생산균을 사용하는 발효법에 의한 아미노산의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 코리네형 글루탐산 생산균을 사용하는 글루탐산의 수율를 향상시켜 보다 저렴한 가격에 글루탐산을 제조하는 글루탐산 발효법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 염색체 위의 아미노산 생합성계 유전자의 프로모터를 다양하게 개변하여 목적하는 유전자의 발현량을 조절함으로써 상기한 과제를 효율적으로 해결할 수 있다는 발견에 기초하여 이루어진 것이다. 특히, 프로모터의 특이적 영역인 -35 영역 및/또는 -10 영역에 특정한 변이를 도입함으로써 상기한 과제를 효율적으로 해결할 수 있다는 발견에 기초하여 이루어진 것이다.
즉, 본 발명은 코리네형 세균의 염색체상의 아미노산 또는 핵산 생합성계 유전자의 프로모터 서열에 컨센서스(consensus) 서열에 근접하는 변이를 일으키게 하거나 유전자 재조합에 의해 변화를 도입하여 코리네형 세균의 변이체를 작제하고 이의 변이체를 배양하여 목적하는 아미노산 또는 핵산의 생성량이 많은 변이체를 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노산 또는 핵산 생성능이 향상된 코리네형 세균의 작제 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, -35 영역에 CGGTCA, TTGTCA, TTGACA 및 TTGCCA로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 DNA 서열 및/또는 -10 영역에 TATAAT 서열 또는 당해 서열의 ATAAT 염기가 별도의 염기로 치환되어 있으며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH) 생성 유전자용 프로모터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프로모터를 갖는 글루타메이트 데하이드로게나제 생성 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자를 갖는 코리네형 L-글루탐산 생산균을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기한 방법으로 작제한 아미노산 또는 핵산 생성능이 향상된 코리네형 세균을 배지에서 배양하여 배지중에 목적하는 아미노산 또는 핵산을 생성 축적시키고 이것을 당해 배지로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 발효법에 의한 당해 아미노산 또는 핵산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 4-플루오로글루타메이트에 대하여 내성을 갖는 코리네형 L-글루탐산 생산균을 액체 배지에서 배양하여 배지중에 L-글루탐산을 생성 축적시켜 이것을 당해 배지로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 발효법에 의한 L-글루탐산의 제조 방법을 제공한다.
다음 실시예에 따라 본 발명을 설명한다.
실시예 1: 변이형 GDH 프로모터의 제조
부위 특이 변이법을 사용하여 다음 방법으로 변이형 GDH 프로모터를 작제한다.
(1) 각종 변이형의 프로모터를 가지는 GDH 유전자의 제조
코리네형 세균의 GDH 유전자의 프로모터의 -35 영역 및 -10 영역의 야생형 서열을 서열 1에 기재한다. 단, 야생형의 프로모터 서열은 이미 보고되어 있다[참조: Molecu1ar Microbio1gy(1992), 6, 317­326].
변이형 프로모터를 가지는 GDH 유전자를 운반하는 플라스미드의 제조 방법은 하기와 같다. 도 1에 도시된 바와 같이 문헌[″Bacterial Genome DNA purification kit″ (Advanced Genetic Technologies Corp.)]에 기초하여 작제한 코리네형 세균 야생주 ATCC 13869주의 염색체 유전자를 주형으로 하고 GDH 유전자의 상류와 하류에서 PCR에 의해 유전자를 증폭하여 양쪽 말단을 평활 말단화한 후에 이것을 플라스미드 pHSG399(제조원: 다카라슈조)의 SmaI 부위에 삽입한다. 다음에 이러한 플라스미드의 Sa1I 부위에 코리네형 세균으로 복제할 수 있는 복제 오리진을 갖는 플라스미드 pSAK4로부터 취득한 복제 오리진을 도입함으로써 플라스미드 pGDH를 제조한다. 이러한 방법에서 GDH 유전자의 상류측의 프라이머로서 서열 1 내지 6에 기재된 서열을 가지는 프라이머를 사용함으로써 상기한 각각의 프로모터 서열을 가지는 GDH 유전자를 제조할 수 있다. 또한, 여기서 사용하는 PCR 증폭 단편 중에는 도입되는 프로모터 서열내의 변이 이외에는 변이는 도입되어 있지 않은 것을 염기 서열의 결정에 의해 확인한다. pSAK4를 작제하기 위해서는 이미 취득된 코리네박테리움속 세균으로 독립 복제할 수 있는 플라스미드 pH㎖519[참조: Agric. Bio1. Chem., 48, 2901-2903(1984)] 유래의 복제 오리진을 가지는 플라스미드 pHK4[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5­7491호]를 제한효소 BamHI 및 KpnI로 절단하여 복제 오리진을 함유하는 DNA 단편을 취득하고 수득된 단편을 DNA 평활 말단화 키트(Bluntingkit, 제조원: 다카라슈조)를 사용하여 평활 말단화한 다음, SalI 링커(제조원: 다카라슈조)를 결합하여 이것을 pHSG299의 SalI 사이트에 삽입한다. 수득된 플라스미드가 pSAK4이다.
(2) 각 프로모터 서열을 갖는 GDH 발현량의 비교
상기와 같이 하여 제조한 플라스미드를 코리네형 세균 야생주 ATCC13869주에 각각 도입한다. 도입 방법은 전기천공법을 사용한다[참조; 일본 공개특허공보 제(평)2-207791호]. 제조한 이들 균주의 GDH 발현량을 비교하기 위해서 GDH의 비활성을 조사한다. 활성 측정 방법은 상기한 Sahm 등의 방법에 따른다. 그 결과를 표 1에 기재한다.
균주 프로모터 배열-35 -10 GDH 비활성 상대치
ATCC 13869 TGGTCA CATAAT 7.7 0.1
/pGDH TGGTCA CATAAT 82.7 1.0
/p6-2 CGGTCA CATAAT 33.1 0.4
/p6-4 TGGTCA TATAAT 225.9 2.7
/p6-3 TTGACA TATAAT 327.2 4.0
/p6-7 TTGCCA TATAAT 407.0 4.9
/p6-8 TTGTCA TATAAT 401.3 4.9
상기한 ATCC13869/p6­2 내지 ATCC13869/p6­8은 서열 2 내지 6에 대응하는 것이며 이들 서열은 서열 1에 기재된 서열(야생형)을 기초로 하선(下線)부를 하기와 같이 변경한 것이다.
서열 1 5'-TTAATTCTTTGTGGTCATATCTGCGACACTGC CATAATTTGAACGT-3'
서열 2 CGGTCA CATAAT
서열 3 TGGTCA TATAAT
서열 4 TTGACA TATAAT
서열 5 TTGCCA TATAAT
서열 6 TTGTCA TATAAT
또한, 이들 서열은 직쇄상, 2본쇄의 합성 DNA이다.
실시예 2: 변이주의 취득
(1) 4-플루오로글루탐산에 대한 내성을 갖는 변이주의 유도
AJ13029주는 W0 제96/06180호에 기재된 글루탐산 생산주이며 배양 온도가 31.5℃에서는 글루탐산을 생산하지 않지만 배양 온도를 37℃로 전환시키면서 바이오틴 작용 억제물질의 비존재하에서도 글루탐산을 생산하는 변이주이다. 본 실시예에서는 브레비박테리움·락토퍼멘툼 AJ13029주를 변이주 유도의 친주로서 사용한다. 물론, AJ13029주 이외의 글루탐산 생산주라도 4-플루오로글루탐산에 대한 내성을 갖는 변이주 유도의 친주로 될 수 있다.
AJ13029주를 CM2B 한천 배지(표 2)위에서 31.5℃에서 24시간 동안 배양하여 균체를 수득한다. 수득된 균체를 250㎍/㎖의 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘의 수용액으로 3O℃에서 30분 동안 처리한 다음, 생존율 1%의 당해 균체의 현탁액을 4-플루오로글루탐산(4FG)을 함유하는 한천 평판배지(표 3)에 파종하고 31.5℃에서 20 내지 30시간 동안 배양하여 콜로니를 형성시킨다. 이때에 처음으로 1mg/㎖의 4FG를 함유하는 배지를 경사를 주어 제조하고 그 위에 4FG를 함유하지 않는 동일한 배지를 수평으로 중층한다. 이에 따라 한천 배지 표면은 4FG의 농도 구배로 제조된다. 이러한 플레이트 위에 상기 변이 처리균체를 파종하면 균주의 생육한계의 영역을 경계로 경계선이 된다. 이러한 경계보다도 고농도의 4FG가 존재하는 영역에서 콜로니를 형성하는 주를 채종한다. 이와 같이 하여 약 10,000개의 변이 처리균주로부터 약 50주의 4FG 내성주를 취득한다.
CM2B 한천 배지
성분 농도
폴리펩톤(제조원: 리혼세이야쿠사) 1.0%
효모 추출물(제조원: 디프코사) 1.0%
NaCl 0.5%
d-바이오틴 10㎍/ℓ
한천 1.5%
(pH 7.2 KOH로 조절)
한천 배지
성분 물 1ℓ중 첨가량
글루코오스 10g
MgSO4·7H2O 1g
FeSO4·7H2O 0.01g
MnSO4·4-6H2O 0.01g
티아민 하이드로클로라이드 0.2㎎
d-바이오틴 0.05㎎
(NH4)2SO4 5g
Na2HPO4·12H2O 7.1g
KH2PO4 1.36g
한천 15g
(2) 4FG에 대하여 내성을 나타내는 변이주에 따른 L-글루탐산의 생산능의 확인
상기 (1)에서 수득된 약 50주의 변이주및 이의 친주인 AJ13029주에 대해서 글루탐산의 생산능력을 아래와 같이 하여 확인한다.
AJ13029 및 각 변이주를 각각CM2B 한천 배지 위에서 31.5℃에서 20 내지 30시간 동안 배양하여 수득한 균체를 표 4의 A배지에 기재된 조성의 액체 배지에 접종하고 31.5℃에서 진탕 배양을 개시한다. 약 22시간 후에 최종 농도가 표 4의 B배지에 기재된 농도로 되도록 새롭게 배지를 첨가하고 37℃로 전환시킨 다음, 약 24시간 동안 배양을 실시한다. 배양 종료후에 아사히가세이사가 제조한 바이오텍 분석기를 사용하여 L-글루탐산의 생성 유무를 조사한다. 그 결과, 이의 약 50주를 배양하여 글루탐산 수율이 친주보다 높으며 GDH 활성도 높은 주를 2주 분리한다(A주 및 B주). 각각의 GDH 활성을 측정한 바, 양쪽 주 모두 GDH의 비활성이 상승하고 있다(표 5). GDH 활성의 측정은 E. R. Bormann 등의 방법[Molecu1ar Microbio1., 6, 317­326(1996)]에 따른다. 그래서 GDH 유전자의 염기서열을 해석한 바, GDH의 프로모터 영역내에만 변이점이 존재한다(표 6).
성분 A 배지 B 배지
글루코오스 3g/㎗ 5g/㎗
KH2PO4 0.14g/㎗ 0.14g/㎗
MgSO4·7H2O 0.04g/㎗ 0.04g/㎗
FeSO4·7H2O 0.001g/㎗ 0.001g/㎗
MnSO4·4H2O 0.001g/㎗ 0.001g/㎗
(NH$)2SO4 1.5g/㎗ 2.5g/㎗
대두단백질 가수분해액 1.5㎖/㎗ 0.38㎖/㎗
티아민하이드로클로라이드 0.2㎎/㎗ 0.2㎎/ℓ
바이오틴 0.3㎎/㎗ 0.3㎎/ℓ
소포제 0.05㎖/㎗ 0.05㎖/ℓ
CaCO3 5g/㎗ 5g//㎗
pH 7.0 KOH로 조절
변이주의 글루탐산 생성과 GDH 활성
균주 Glu(g/㎗) GDH 비활성 상대치
AJ13029 2.6 7.7 1.0
FGR1 2.9 23.1 3.0
FGR2 3.0 25.9 3.4
변이주의 GDH 프로모터 영역의 염기서열
균주 GDH 프로모터 영역의 염기 서열-35 -10
AJ13029 TGGTCA TTCTGTGCGACACTGC CATAAT
FGR1 TGGTCA TTCTGTGCGACACTGC TATAAT
FGR2 TTGTCA T-CTGTGCGACACTGC TATAAT
실시예 3: 코리네형 글루탐산 생산균의 CS 유전자 프로모터 영역으로의 변이 도입
본 실시예에서는 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH) 및 시트레이트 신타제(CS)를 암호화하는 유전자의 프로모터 강화주를 작성한 예를 기재한다.
(1) gltA 유전자의 클로닝
코리네형 세균의 시트레이트 신타제를 암호화하는 유전자 gltA의 염기서열은 이미 명백해지고 있다[참조: Microbio1. 140 1817-1828(1994)]. 이러한 서열을 기초하여 서열 7 및 서열 8에 기재된 프라이머를 합성한다. 한편, Bacterial Genome DNA Purification Kit(제조원: Advanced Genetic Technologies Corp.)를 사용하여 브레비박테리움·락토퍼멘툼 ATCC13869의 염색체 DNA를 작제한다. 이러한 염색체 DNA를 0.5㎍, 상기한 올리고뉴클레오타이드를 각각 10pmol, dNTP 혼합물(각 2.5mM) 8㎕, 10 × LA Taq Buffer(제조원: 다카라슈조) 5㎕, LA Taq(제조원: 다카라슈조) 2U에 멸균수를 가하여 전량 50㎕의 PCR 반응액을 작제한다. 이러한 반응액을 써멀 사이클러 TP240(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 15초, 신장 반응 72℃ 3분의 조건으로 30 사이클의 PCR을 실시하고 gltA 유전자 및 이의 프로모터를 함유하는 약 3Kbp의 DNA 단편을 증폭한다. 수득된 증폭 단편은 SUPREC02(제조원: 다카라슈조)로써 정제한 다음, 평활 말단화한다. 평활 말단화는 Blunting Kit(제조원: 다카라슈조)에 의해 실시한다. 이것과 pHSG399(다카라슈조)를 SmaI로 완전 절단한 것을 혼합하여 연결한다. 연결 반응은 DNA ligation kit ver2(제조원: 다카라슈조)로 실시한다. 연결한 후에 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하고 IPTG(이소프로필­β-D­티오갈락토피라노시드) 10㎍/㎖, X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 -β-D-갈락토시드) 40㎍/㎖ 및 클로람페니콜 40㎍/㎖을 함유하는 L배지(박토트립톤 10g/ℓ, 박토이스트 추출물 5g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, 한천 15g/ℓ, pH 7.2)로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 백색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다.
형질전환주로부터 알칼리법(참조: 세이부쓰고가쿠짓켄쇼, 일본생물공학회편, 105페이지, 하이프칸, 1992년)을 사용하여 플라스미드를 작제하여 제한효소 지도를 작성하여 도 2에 기재된 제한효소 지도와 동등한 것을 pHSG399CS라고 명명한다.
(2) gltA 프로모터로의 변이 도입
gltA 프로모터 영역으로의 변이 도입에는 Mutan-Super Express Km(제조원: 다카라슈조)을 사용한다. 구체적인 방법을 하기에 기재한다. pHSG399CS를 EcoRI, SalI로 완전 절단하여 gltA 유전자를 함유하는 EcoRI-SalI 단편을 작제하고 이것과 pKF19kM(제조원: 다카라슈조)를 EcoRI과 SalI로 완전 절단한 단편을 연결한다. 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(다카라슈조)을 사용하여 형질전환을 실시하고 IPTG 10㎍/㎖, X-Gal 40㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 백색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질전환주로부터 플라스미드를 작제하여 gltA 유전자를 함유하는 것을 pKF19CS로 명명한다.
pKF19CS를 주형으로 하고 서열 9, 서열 10, 서열 11에 기재된 5' 말단 인산화 합성 DNA와 Mutan-super Express Km 부속의 선택 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한다. 이러한 PCR 산물을 사용하여 에스케리치아 콜라이 MV1184의 컴피턴트 세포(제조원: 다카라슈조)의 형질전환을 실시하고 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질 전환체로부터 플라스미드 DNA를 작제하고 서열 12에 기재된 합성 DNA를 사용하여 Sanger의 방법[참조: J. Mol. Biol., 143, 161,(1980)]으로 gltA 프로모터 부분의 염기서열을 결정한다. 구체적으로는 염기서열의 결정에는 Dye terminator sequencing Kit(제조원: Applied Biosystems)를 사용하여 Genetic Analyzer ABI310(제조원: Applied Biosystems)으로 해석한다. gltA 프로모터 영역이 표 7에 기재된 서열로 치환된 것을 각각 pKF19CS1, pKF19CS2, pKF19CS4로 명명한다.
-35 영역 -10 영역
pKF19CS ATGGCT TATAGC
pKF19CS1 ATGGCT TATAAC
pKF19CS2 ATGCCT TATAAT
pKF19CS4 TTGACA TATAAT
(3) 변이형 gltA 플라스미드의 작제
(2)에서 작제한 pKF19CS, pKF19CS1, pKF19CS2, pKF19CS4를 각각 SalI, EcoRI(제조원: 다카라슈조)로 완전 절단한다. 한편, 코리네형 세균으로 독립 복제할 수 있는 플라스미드 pAM330[참조: 일본 공개특허공보 제(소)58­67699호] 유래의 복제 오리진을 가지는 플라스미드 pSFK6[참조: 일본 특허원 제(평)11­69896호]를 EcoRI, SalI로 완전 절단하여 이것과 gltA를 함유하는 약 2.5kb의 단편을 연결한다. 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포를 사용하여 형질전환을 실시하고 IPTG 10㎍/㎖, X­Gal 40㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 백색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질전환주로부터 플라스미드를 작제하여 gltA 유전자를 함유하는 플라스미드를 각각 pSFKC, pSFKC1, pSFKC2, pSFKC4로 한다.
(4) 변이형 gltA 플라스미드의 코리네형 세균에서의 CS 발현량의 측정
상기(3)에서 작제한 플라스미드를 브레비박테리움·락토퍼멘툼 ATCC13869에 도입한다. 구체적으로는 전기 펄스법을 사용하며[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2­07791호] 형질 전환체의 선택은 25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 CM2B
성분 농도
글루코오스 50g/ℓ
KH2PO4 1g/ℓ
MnSO4·7H2O 0.4㎎/ℓ
FeSO4·7H2O 10㎎/ℓ
대두 단백질 가수분해액 20㎖/ℓ
바이오틴 0.5㎎/ℓ
티아민 하이드로클로라이드 2㎎/ℓ
균주 dABS/분/㎎ 상대활성 상대활성
야생주 6.8 1.0
BLCS00 38.8 5.7 1.0
BLCS01 57.1 8.4 1.2
BLCS02 92.5 13.6 1.9
BLCS04 239.4 35.2 4.8
(5) 변이형 gltA 유전자의 온도 감수성 플라스미드로의 도입
변이형 gltA 프로모터 서열의 염색체로의 유전자 도입 방법으로서는 코리네형 세균내에서 복제가 온도 감수성인 플라스미드를 사용하는 방법이 공지되어 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5­7491호]. 여기서는 코리네형 세균내에서 이의 복제가 온도 감수성인 플라스미드 벡터로서 pSFKT2[참조: 일본 특허원 제(평)11-81693호]를 사용한다. 변이형 gltA 프로모터 서열로서 pKFCS1, pKFCS2, pKFCS4를 SalI 및 BstPI로 완전 절단하여 평활 말단화한 것을 사용하고 이것과 pSFKT2를 SmaI로 완전 절단한 것을 연결한다. 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하여 IPTG 10㎍/㎖, X-Gal 40㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 백색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질전환주로부터 플라스미드를 작제하여 gltA 유전자를 함유하는 온도 감수성 셔틀 벡터를 각각 pSFKTC1, pSFKTC2, pSFKTC4라고 명명한다.
(6) 변이형 gltA 프로모터의 염색체로의 도입
pSFKTC1, pSFKTC2, pSFKTC4를 각각 브레비박테리움, 락토퍼멘툼 FGR2주에 전기 펄스법으로 도입한다. 형질전환체의 선택은 25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 CM2B 플레이트 배지에서 25℃에서 실시한다. 도입후에 수득된 주를 CM2B 액체 배지에서 배양한 다음, 25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 CM2B 플레이트에 플레이트당 103내지 105cfu가 되도록 희석한 후에 도포하여 34℃에서 배양한다. 온도 감수성 플라스미드를 유지하는 주는 당해 온도에서는 플라스미드의 복제가 억제되므로 카나마이신 감수성으로 되며 콜로니를 형성할 수 없지만 염색체에 플라스미드 DNA를 편입한 주는 콜로니를 형성하므로 선택할 수 있다. 출현된 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리한다. 이러한 주로부터 염색체 DNA를 추출하고 이것을 주형으로 하여 서열 8과 서열 13에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하고 대략 3kb의 증폭 단편이 확인된다. 따라서 이러한 주는 상동적인 재조합에 의해 숙주 염색체의 gltA 유전자의 근방에 온도 감수성 플라스미드 유래의 변이형 gltA 유전자가 편입되어 있는 것으로 나타난다. pSFKTC1, 2, 4로부터 유도된 주를 각각 BLCS11, BLCS12, BLCS14로 명명한다.
(7) gltA 프로모터 치환주의 취득
상동 재조합에 의해 변이형 gltA 유전자를 편입한 BLCS11, BLCS12, BLCS14주로부터 우선, 카나마이신 감수성주를 취득한다. 플라스미드 편입 주를 CM2B 플레이트에 희석, 도포하고 34℃에서 배양한다. 콜로니 형성후에 25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 CM2B 플레이트에 도포하고 34℃에서 배양한다. 이때에 카나마이신 감수성으로 된 주를 취득한다.
카나마이신 감수성으로 된 주로부터 염색체를 추출하여 서열 7 및 서열 8에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하고 gltA 유전자 단편을 작제한다. 수득된 증폭 단편은 SUPREC02(제조원: 다카라슈조)로 정제한 다음, 서열 13에 기재된 프라이머를 사용하여 서열 분석 반응을 실시하고 이의 프로모터 영역의 서열을 결정한다. 그 결과, 표 7내의 pKF19CS1과 동일한 프로모터 서열을 갖는 주를 GBO1, pKF19CS2와 동일한 프로모터 서열을 갖는 주를 GBO2, pKF19CS4와 동일한 프로모터 서열을 갖는 주를 GB03라고 명명한다. 이들 주에서는 염색체로부터 플라스미드 및 중복하는 gltA 유전자가 탈락할 때에 플라스미드에 의해 도입되는 변이형의 gltA 유전자는 염색체 위에 잔류하며 원래 염색체 위에 있던 야생형의 gltA 유전자가 벡터 플라스미드와 함께 탈락하여 유전자 치환이 일어나는 것을 의미한다.
(8) gltA 프로모터 변이주의 시트레이트 신타제 활성 측정
(7)에서 수득한 FGR2, GBO1, GBO2, GBO3주 및 FGR2/pSFKC주를 (4)에 기재한 방법과 동일하게 하여 시트레이트 신타제의 활성을 측정한다. 측정 결과를 표 10에 기재한다. gltA 프로모터 치환주는 이의 친주와 비교하여 시트레이트 신타제 활성이 상승하고 있는 것으로 확인된다.
균주 dABS/분/㎎ 상대활성
FGR2 7.9 1.0
GB01 9.5 1.2
GB02 15.0 1.9
GB03 31.6 4.0
FGR2/pSFKC 61.6 7.8
(9) gltA 프로모터 치환주의 배양 성적
상기 (7)에서 취득한 각 주를 표 11에 기재된 조성의 씨드(種) 배양 배지에 접종하고 31.5℃에서 24시간 동안 진탕 배양하여 씨드 배양을 수득한다. 표 11에 기재된 조성의 본 배양배지를 500㎖ 용적 유리제 쟈 퍼멘터에 300㎖씩 분주(分注)하여 가열 살균한 다음, 상기 씨드 배양을 40㎖ 접종한다. 교반 속도를 800 내지 1300rpm, 통기량을 1/2 내지 1/1vvm으로 하고 배양온도 31.5℃에서 배양을 개시한다. 배양액의 pH는 암모니아 가스로 7.5로 유지한다. 배양을 개시하여 8시간 후에 37℃로 전환한다. 어느 것이나 20 내지 40시간으로 글루코오스가 완전히 소비된 시점에서 배양을 종료하여 배양액 중에 생성 축적된 L-글루탐산의 양을 측정한다.
그 결과, 표 12에 기재된 바와 같이 GB01이나 FGR2/pSFKC주보다는 오히려 GB02나 GB02주에서 L­글루탐산의 대폭적인 수율 향상이 확인된다. 상기한 점으로부터 이들 주의 글루탐산 수율 향상에서 프로모터에 변이를 도입하여 CS 활성을 2 내지 4배로 강화하는 것으로 좋은 성적으로 될 수 있는 것이 나타난다.
성분 농도씨드 배양 본 배양
글루코오스 50g/ℓ 150g/ℓ
KH2PO4 1g/ℓ 2g/ℓ
MgSO4·7H2O 0.4g/ℓ 1.5g/ℓ
FeSO4·7H2O 10㎎/ℓ 15㎎/ℓ
MnSO4·4H2O 10㎎/ℓ 15㎎/ℓ
대두 단백질 가수분해물 20㎖/ℓ 50㎖/ℓ
바이오틴 0.5㎎/ℓ 2㎎/ℓ
티아민 하이드로클로라이드 2㎎/ℓ 3㎎/ℓ
균주 L-글루탐산(g/ℓ)
FGR2 8.9
GB01 9.1
GB02 9.4
GB03 9.4
FGR2/pSFKC 9.1
실시예 4: 코리네형 글루탐산 생산균의 ICDH 유전자 프로모터 영역으로의 변이의 도입
본 실시예에서는 글루타메이트 데하이드로게나제, 시트레이트 신타제 및 이소시트레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 프로모터 강화주를 작성한 예를 기재한다.
(1) icd 유전자의 클로닝
코리네형 세균의 시트레이트 신타제를 암호화하는 유전자 icd의 염기서열은 이미 명백하게 되어 있다[참조: J. Bacterio1. 177 774-782(1995)]. 이러한 서열을 기초하여 서열 14 및 15에 기재된 프라이머를 합성하여 브레비박테리움·락토퍼멘툼 ATCC13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하고 icd 유전자 및 이의 프로모터를 함유하는 약 3Kbp의 DNA 단편을 증폭한다. 수득된 증폭 단편은 EcoRI로 완전 절단하여 이것과 pHSG399(제조원: 다카라슈조)를 EcoRI로 완전 절단한 것을 혼합하여 연결한다. 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포를 사용하여 형질전환을 실시하고 IPTG 10㎍/㎖, X­Gal 4O㎍/㎖ 및 클로람페니콜 40㎍/㎖을 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 백색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다.
icd 유전자를 갖는 플라스미드를 pHSG399icd라고 명명한다.
(2) icd 프로모터로의 변이 도입
icd 유전자의 정확한 프로모터의 위치는 결정되어 있지 않다. 그래서 ICDH를 암호화하는 유전자의 상류 서열을 프로모터와 같은 서열에 인위적으로 개변함으로써 icd 유전자의 mRNA 전사량을 증대시킬 수 있을 가능성을 검토한다. 구체적으로는 ICDH 단백질의 제1 ATG에서 상류 약 190bp(제1의 프로모터) 및 약 70bp(제2의 프로모터)의 DNA 서열중에 존재하는 -10 형태 영역에 변이를 도입한다.
icd 유전자 상류 영역으로의 변이 도입에는 Mutan­Super Express Km(제조원: 다카라슈조)을 사용한다. 구체적인 방법을 하기에 기재한다. pHSG399icd를 PstI로 완전 절단하여 icd 유전자의 프로모터를 함유하는 PstI 단편을 작제하고 이것과 pKF18kM(제조원: 다카라슈조)를 PstI로 완전 절단한 단편을 연결한다. 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하고 IPTG 10㎍/㎖, X-Gal 40㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 백색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질전환주로부터 플라스미드를 작제하여 icd 유전자의 프로모터를 함유하는 것을 pKF18icd로 명명한다.
pKF18icd를 주형으로 하여 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21에 기재된 5' 말단 인산화 합성 DNA와 se1ection 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한다. 이러한 PCR 산물을 사용하여 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포의 형질전환을 실시하고 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질 전환체로부터 플라스미드 DNA를 작제하여 서열 22에 기재된 합성 DNA를 사용하여 Sanger의 방법[참조: J.Mol. Biol., 143, 161, (1980)]으로 icd 프로모터 부분의 염기서열을 결정한다. 구체적으로는 염기서열의 결정에는 Dye terminator sequencing Kit(제조원: Applied Biosystems)를 사용하여 Genetic Ana1yzer ABI310(제조원: App1ied Biosystems)로 해석한다. icd 프로모터 영역이 표7에 기재된 서열로 치환된 것을 각각 pKF18ICD1, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6으로 명명한다. 이중에서 pKF18ICD2를 PstI로 완전 절단하여 icd 유전자의 프로모터를 함유하는 PstI 단편을 작제하고 이것과 pKF18kM(제조원: 다카라슈조)를 PstI로 완전 절단한 단편을 연결한다. 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하고 IPTG 10㎍/㎖, X-Gal 40㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 백색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질전환주로부터 플라스미드를 작제하여 icd 유전자의 프로모터를 함유하는 것을 pKF18ICDM2라고 명명한다. pKF18ICDM2를 주형으로 하여 서열 20, 서열 21에 기재된 5' 말단 인산화 합성 DNA와 se1ection 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한다. 이러한 PCR 산물을 사용하여 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포의 형질전환을 실시하고 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 콜로니를 채취하여 콜로니 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질전환체에서 플라스미드 DNA를 작제하여 서열 22에 기재된 합성 DNA를 사용하여 icd 프로모터 부분의 염기서열을 결정한다. icd 프로모터 영역이 표 13에 기재된 서열로 치환된 것을 각각 pKF18ICD25, pKF18ICD26이라고 명명한다.
플라스미드 프로모터 1-35 -10 프로모터 2-35 -10
pKF18ICD GCGACT GAAAGT TTTCCA CACCAT
pKF18ICD01 GCGACT TATAAT TTTCCA CACCAT
pKF18ICD02 TTGACA TATAAT TTTCCA CACCAT
pKF18ICD03 TTGACT TAAAGT TTTCCA CACCAT
pKF18ICD04 GCGACT GAAAGT TTTCCA TATAAT
pKF18ICD05 GCGACT GAAAGT TTGCCA TATAAT
pKF18ICD06 GCGACT GAAAGT TTGACA TATAAT
pKF18ICD25 TTGACA TATAAT TTGCCA TATAAT
pKF18ICD26 TTGACA TATAAT TTGACA TATAAT
(3) 프로모터 활성 측정용 플라스미드의 작제
프로모터 활성을 간편하게 측정하기 위해서는 리포터 유전자를 사용하여 간접적으로 프로모터 활성을 측정하는 방법을 생각할 수 있다. 리포터 유전자로서 요망되는 성질로서 활성측정이 간단한 것, N 말단측에 아미노산이 가능하지 않아도 활성이 현저하게 저하되지 않는 것, 백그라운드의 반응이 없는 것, 유전자 조작을 하는 데에 적당한 제한효소 절단부위가 있는 것을 들 수 있다. 에스케리치아·콜라이의 β-갈락토시다제(LacZ)는 광범위하게 리포터 유전자로서 사용되고 있으며 또한 코리네박테리움속 세균에는 락토스 자화(資化)능이 없는 점으로부터[참조: J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 399­416(1972)] 리포터 유전자로서 LacZ를 사용하는 것이 최적이라고 판단된다. 그래서 LacZ를 리포터 유전자로서 탑재하는 플라스미드 pNEOL의 작제를 실시한다(도 3). 하기에 그 과정을 상세하게 기재한다. 서열 23, 서열 24에 기재된 합성 DNA를 프라이머로 하여 E.co1iME8459(ME 8459는 일본의 국립유전학연구소에 기탁되어 있다)로부터 수득된 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 한다. PCR 산물은 SmaI, bamHI로 완전 절단한 다음, pKF3(제조원: 다카라슈조)를 HindIII로 절단하여 평활 말단화한 것을 연결한다. 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하고 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질전환주로부터 플라스미드를 작제하여 pKF3nptII로 한다. 다음에 이것을 SalI로 절단하는 한편, pSAK4를 실시예 1의 (1)과 동일하게 하여 SmaI, SalI로 완전 절단하여 평활 말단화한 것을 연결하여 코리네형 세균내에서 복제할 수 있는 셔틀 벡터 pNE0를 작제한다. 이러한 플라스미드는 숙주에 클로람페니콜 내성 및 카나마이신 내성을 부여한다. 또한 pNE0를 SmaI, Sse8387I로 완전 절단하여 이것과 pMC1871(제조원: 파르마시아바이오테크)를 PstI, SmaI로 완전 절단한 것을 연결하여 리포터 유전자로서 N 말단측의 8아미노산을 결실한 LacZ를 갖는 코리네형 세균내에서 복제할 수 있는 셔틀 벡터 pNEOL을 작제한다(도 3).
(4) 변이형 icd 프로모터 활성의 측정
(2)에서 작제한 변이형 icd 프로모터를 갖는 플라스미드 pKF18ICD1, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKF18ICD25, pKF18ICD26 및 pKF18ICD를 SacII, PstI으로 완전 절단한 다음, 평활 말단화하여 pNEOL을 SmaI로 절단한 것과 연결한다. 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포를 사용하여 형질전환을 실시하고 IPTG, X­Gal, 클로람페니콜 40㎍/㎖을 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 청색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다.
형질전환주로부터 플라스미드를 작제하여 ICDH와 LacZ의 융합 단백질이 생성될 수 있는 구조의 것을 pNE0ICD1, pNE0ICD2, pNE0ICD3, pNE0ICD4, pNE0ICD5, pNE0ICD6, pNE0ICD25, pNE0ICD26, pNEOLICD로 한다. 이들 플라스미드 및 pNEOL을 전기 펄스법으로 브레비박테리움·락토퍼멘툼 ATCC13869에 도입한다. 형질전환체의 선택은 25㎍/㎖의 카나마이신 및 X­Gal 40㎍/㎖를 함유하는 CM2B 플레이트 배지(박토트립톤 10g/ℓ, 박토이스트 추출물 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, 바이오틴 10㎍/ℓ, 한천 15g/ℓ, pH 7.0)에서 31℃에서 실시한다. 2일 밤 배양한 다음, 출현하는 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 pNE0ICD1, pNE0ICD2, pNE0ICD3, pNE0ICD4, pNE0ICD5, pNE0ICD6, pNE0ICD25, pNE0ICD26, pNEOLICD를 유지하는 형질전환체를 각각 BLAC1, BLAC2, BLAC3, BLAC4, BLAC5, BLAC6, BLAC25, BLAC26, BLAC, BNEOL이라고 명명한다. BNE0 이외의 형질전환체는 전부 청색의 콜로니를 형성하고 있다. 이들 형질전환체에서 실시예3 (4)에 기재된 방법으로 조효소액을 작제한다. 단, 균체의 세정 및 현탁에는 완충액으로서 Z­buffer[KCl 10mM, MgS041mM, 2-ME 270㎕/100mM NaPi(pH 7.5)]를 사용한다. LacZ의 활성 측정은 하기의 순서에 따라서 실시한다. Z­buffer와 조효소액을 혼합하고 종료 농도 0.8mg/㎖로 되도록 Z­buffer에 용해한 0NPG를 첨가하고 30℃에서 420nm의 흡광도의 증대를 히타치 분광광도계 U­3210으로 측정한 값을 LacZ의 활성으로 한다. 또한, 조효소액의 단백질 농도의 측정에는 Protein Assay(제조원: BI0-RAD)를 사용한다. 표준 단백질에는 소혈청 알부민을 사용한다. 측정 결과를 표 14에 기재한다. icd 프로모터에 변이를 갖는 ICDH-LacZ 융합 단백질을 발현하는 주는 야생형의 ICDH LacZ 융합 단백질을 발현하는 주와 비교하여 LacZ 기본 활성이 상승하고 있는 것으로 확인된다.
균주 dABS/분/㎎ 상대활성
BNEOL 검출 안됨 0.0
BNEOLI 42 1.0
BNEOLI-1 84 2.0
BNEOLI-2 168 4.0
BNEOLI-3 80 1.9
BNEOLI-4 126 3.0
BNEOLI-5 139 3.3
BNEOLI-6 84 2.0
BNEOLI-25 168 4.0
BNEOLI-26 170 4.0
(5) 변이형 icd 유전자의 온도 감수성 플라스미드로의 도입
코리네형 세균내에서 당해 복제는 온도 감수성인 플라스미드 벡터 pSFKT2[참조: 일본 특허원 제(평)11-81693호]를 사용한다. 변이형 icd 프로모터 서열로서(pKF18ICD1, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKFICD25, pKFICD26를 PstI로 완전 절단하여 이것과 pSFKT2를 PstI로 완전 절단한 것을 연결한다. 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하고 IPTG 10㎍/㎖, X­Gal 40㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖를 함유하는 L 배지로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 백색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질전환주로부터 플라스미드를 작제하여 icd 프로모터를 함유하는 온도 감수성 셔틀 벡터를 각각 pSFKTI1, pSFKTI2, pSFKTI3, pSFKTI4, pSFKTI5, pSFKTI6, pSFKTI25, pSFKTI26으로 명명한다.
(6) 변이형 icd 프로모터의 염색체로의 도입
(5)에서 작제한 플라스미드를 각각 브레비박테리움·락토퍼멘툼 GB02주에 전기 펄스법으로 도입한다. 형질전환체의 선택은 25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 CM2B 플레이트 배지(박토트립톤 10g/ℓ, 박토이스트 추출물 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, 바이오틴 10㎍/ℓ, 한천 15g/ℓ, pH 7.0)에서 25℃에서 실시한다. 도입후에 수득된 주를 CM2B 액체 배지에서 배양한 다음, 25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 CM2B 플레이트에 플레이트당 103내지 105cfu로 되도록 희석한 후에 도포 하고 34℃에서 배양한다. 온도 감수성 플라스미드를 보유하는 주는 이러한 온도에서는 플라스미드의 복제가 억제되므로 카나마이신 감수성으로 되어 콜로니를 형성할 수 없지만 염색체에 플라스미드 DNA를 편입한 주는 콜로니를 형성하므로 선택할 수 있다. 출현하는 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리한다. 이러한 주에서 염색체 DNA를 추출하고 이것을 주형으로 하여 서열 13과 서열 15에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하고 대략 3Kb의 증폭 단편을 확인한다. 따라서 이러한 주는 상동적인 재조합에 의해 숙주 염색체의 icd 유전자의 근방에 온도 감수성 플라스미드 유래의 변이형 icd 유전자가 편입되는 것으로 나타난다.
(7) icd 프로모터 치환주의 취득
상동 재조합에 의해 변이형 icd 유전자를 편입한 (6)기재의 주에서 우선, 카나마이신 감수성주를 취득한다. 플라스미드 편입 주를 CM2B 플레이트에 희석, 도포하여 34℃에서 배양한다. 콜로니 형성후에 25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 CM2B 플레이트에 리플리커하고 34℃에서 배양한다. 이때에 카나마이신 감수성으로 된 주를 취득한다.
카나마이신 감수성으로 된 주로부터 염색체를 추출하여 서열 14, 서열 15에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하고 icd 유전자 단편을 작제한다. 수득된 증폭 단편은 SUPREC02(제조원: 다카라슈조)로 정제한 다음, 서열 22에 기재된 프라이머를 사용하여 서열 분석 반응을 실시하고 이의 프로모터 영역의 서열을 결정한다. 그 결과, pSFKTI1, pSFKTI2, pSFKTI3, pSFKTI4, pSFKTI5, pSFKTI6, pSFKTI25, pSFKTI26 유래의 icd 프로모터 서열을 갖는 주를 각각 GC01, GC02, GC03, GC04, GC05, GC06, GC25 및 GC26이라고 명명한다. 이들 주에서는 염색체로부터 플라스미드 및 중복하는 icd 유전자가 탈락할 때에 플라스미드에 의해 도입한 변이형의 icd 유전자가 염색체 위에 잔류하며 원래 염색체 위에 있던 야생형의 icd 유전자가 벡터 플라스미드와 함께 탈락된다.
(8) icd 프로모터 변이주의 이소시트레이트 데하이드로게나제 활성 측정
(7)에서 수득한 8개 주 및 GB02주를 실시예 3 (7)에 기재된 방법과 동일하게 하여 ICDH 조효소액을 작제한다. ICDH의 활성 측정은 하기의 순서에 따라서 한다. TisHCl 35mM(pH 7.5), MnS041.5mM, NADP 0.1mM, 이소시트르산 1.3mM을 함유하는 반응액에 조효소액을 첨가하고 30℃에서 340nm의 흡광도 증대를 히타치 분광광도계 U­3210으로 측정한 값을 ICDH의 활성으로 한다. 또한, 조효소액의 단백질 농도의 측정에는 Protein Assay(제조원: BI0­RAD)를 사용한다. 표준 단백질에는 소혈청 알부민을 사용한다. 측정 결과를 표 15에 기재한다. icd 프로모터 치환주는 이의 친주와 비교하여 이소시트레이트 데하이드로게나제 활성이 상승되는 것으로 확인된다.
균주 dABS/분/㎎ 상대활성
GB02 3.9 1.0
GC01 8.2 2.1
GC02 19.1 4.9
GC03 7.0 1.8
GC04 12.5 3.2
GC05 19.1 4.9
GC06 10.5 2.7
GC25 30.4 7.8
GC26 24.2 6.2
(9) icd 프로모터 치환주의 배양 성적
(7)에서 취득한 8주를 실시예 3 (9)에 기재된 방법과 동일하게 하여 배양한다. 그 결과, 표 16에 기재된 바와 같이 GC02, GC04, GC05, GC25 및 GC26주에서는 L­글루탐산의 수율 향상이 확인된다. icd 프로모터에 변이를 도입하여 ICDH 활성을 3배 이상으로 강화하는 것으로 좋은 성적으로 될 수 있는 것이 나타난다.
균주 L-글루탐산(g/ℓ)
GB02 9.2
GC01 9.0
GC02 9.5
GC03 9.1
GC04 9.4
GC05 9.6
GC06 9.2
GC25 9.9
GC26 9.8
실시예 5: 코리네형 글루탐산 생산균의 PDH 유전자 프로모터 영역으로의 변이의 도입
(1) 코리네형 세균으로부터의 pdhA 유전자의 클로닝
대장균, 녹농균 및 결핵균의 피루베이트 데하이드로게나제(PDH)의 E1 서브유니트 간에 상동성이 높은 영역을 선택하고 서열 25 및 서열 26에 기재된 프라이머를 합성하고 Bacterial Genomic DNA Purification Kit(제조원: Advanced Genetic Technologies Corp.)에 의해서 조정된 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체를 주형으로 하고 PCR 테크놀로지(헨리 에리히편, 스톡튼프레스, 1989년) 8페이지에 기재되어 있는 표준 반응조건으로 PCR을 실시하고 반응액을 아갈로스겔 전기영동한 바, 약 1.3킬로베이스(kb)의 DNA 단편이 증폭되어 있는 것으르 판명됐다. 수득된 DNA는 서열 25 및 서열 26의 합성 DNA를 사용하여 양쪽 말단의 염기서열의 결정을 실시한다. 염기서열의 결정은 DNA Sequencing Kit(제조원: Applied biosystems사제)를 사용하여 Sanger의 방법[참조: J.Mol. Biol., 143, 161(1980)]에 따라서 실시한다. 결정된 염기서열을 아미노산으로 번역하여 대장균, 녹농균 및 결핵균의 피루베이트 데하이드로게나제의 E1 서브유니트과 비교한 바, 상동성이 높으므로 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편은 브레비박테리움·락토퍼멘툼브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 피루베이트 데하이드로게나제의 E1 서브유니트를 암호화하는 pdhA 유전자의 일부라고 판단하여 당해 유전자의 상류 및 하류 부분의 클로닝을 실시한다. 클로닝 방법은 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869 염색체를 제한효소 EcoRI, BamHI, HindIII, PstI, SalI, XbaI(제조원: 다카라슈조)로 절단한 DNA 단편으로부터 상류 부분을 클로닝하기 위해 서열목록의 서열 27 및 서열 28에 기재한 프라이머를 사용하고 하류 부분을 클로닝하기 위해 서열 29 및 서열 30에 기재한 프라이머를 사용하며 LA PCR in vitro cloning Kit(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 클로닝을 실시한다. 이러한 키트로 PCR을 실시한 결과, 상류 부분은 EcoRI HindIII, PstI, SalI, XbaI으로 절단한 단편에서 각각 약 0.5, 2.5, 3.0, 1.5, 1.8킬로베이스의 DNA 단편이 증폭되며 또한 하류 부분은 BamHI, HindIII, PstI으로 절단한 단편에서 각각 약 1.5, 3.5, 1.0킬로베이스의 DNA 단편이 증폭되므로 이러한 DNA 단편을 상기와 동일한 방법으로 염기서열의 결정을 실시한다. 그 결과, 증폭된 DNA 단편에는 추가로 약 920개 아미노산의 개방 판독 프레임이 함유되어 있으며 또한 이의 상류에는 프로모터 영역으로 추정되는 영역이 존재하는 것도 명백해졌다. 이러한 개방 판독 프레임의 염기서열로부터 추정되는 산물의 아미노산 서열은 공지된 대장균 등의 피루베이트 데하이드로게나제의 E1 서브유니트과 상동성이 높은 점으로부터 이러한 개방 판독 프레임이 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 피루베이트 데하이드로게나제의 E1 서브유니트를 암호화하는 pdhA 유전자인 것이 명백해졌다. 이러한 개방 판독 프레임의 염기서열은 서열목록의 서열 31에 기재된 바와 같다. 서열목록의 서열 31의 서열에는 이의 염기서열로부터 추정되는 산물의 아미노산 서열도 나타난다. 또한 단백질의 N 말단에 있는 메티오닌 잔기는 개시코돈인 ATG에 유래하므로 단백질 본래의 기능과 무관계한 경우가 많으며 번역후에 펩티다제의 작용에 의해 제거되는 것이 잘 알려져 있으며 상기한 단백질의 경우에도 N 말단측의 메티오닌 잔기의 제거가 발생될 가능성이 있다. 단, 서열목록의 서열 31에 기재한 ATG의 6베이스 상류에 GTG의 서열이 있으며 여기로부터 아미노산이 번역되어 있을 가능성도 있다. 또한, 대장균 등의 다른 미생물의 피루베이트 데하이드로게나제는 E1, E2 및 E3의 3개의 서브유니트으로 구성되어 있으며 이들을 암호화하는 유전자는 오페론인 경우가 많지만 여기서 명백해진 pdhA 유전자의 하류 약 3킬로베이스 중에는 피루베이트 데하이드로게나제의 E2 및 E3 서브유니트라고 생각되는 개방 판독 프레임은 존재하지 않는다. 그 대신에 이러한 개방 판독 프레임의 하류에는 터미네이터로 추정되는 서열이 존재하고 있는 것이 명백해지고 있으므로 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 피루베이트 데하이드로게나제의 E2 및 E3 서브유니트는 염색체 위의 다른 부분에 존재하고 있다고 생각된다.
(2) pdhA 증폭을 위한 플라스미드의 작제
브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869에 E.coli의 PDH를 구성하는 3개의 서브유니트를 암호화하는 유전자를 도입한 주는 글루탐산 수율이 향상되는 것이 이미 명백해지고 있다[참조: 일본 특허원 제(평)10­360619호]. 그러나 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 PDH는 E1 서브유니트를 암호화하는 pdhA 유전자밖에 클로닝되지 않으며 이러한 유전자 단독에서의 증폭이 글루탐산 수율에 효과가 있을까는 아직 조사되고 있지 않으므로 여기서 pdhA 유전자 단독 증폭이 글루탐산 수율에 효과가 있을까를 조사하는 것으로 한다.
이미 클로닝되어 있는 염기서열에 기초하여 서열 33 및 34에 기재된 프라이머를 합성하고 Bacterial Genomic DNA Purification Kit(제조원: Advanced Genetic Technologies Corp.)에 의해 조정된 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체를 주형으로 하여 PCR 테크놀로지(헨리에리히편, 스톡튼프레스, 1989년) 8페이지에 기재되어 있는 표준 반응조건으로 PCR을 실시하고 pdhA 유전자를 증폭한다. 합성한 프라이머 내에서 서열 33은 서열목록의 서열 32에 기재되어 있는 pdhA 유전자의 염기서열의 1397번째로부터 1416번째의 염기에 이르는 서열에 상당하며 서열 34는 서열목록의 서열 32의 5355번째로부터 5374번째의 염기에 이르는 서열에 상당하는 염기서열의 역 쇄를 5'측으로부터 기재한 것이다.
생성된 PCR 산물을 통상적인 방법에 의해 정제한 다음, 제한효소 SalI와 EcoT221을 반응시켜 제한효소 SalI과 PstI으로 절단한 pSFK[참조: 일본 특허원 제(평)11-69896호]와 라이게이션 키트(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하고 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드) 10㎍/㎖, X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드) 40㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖를 함유하는 L 배지(박토트립톤 10g/ℓ, 박토이스트 추출물 5g/ℓ, NaCl 15g/ℓ, 한천 15g/ℓ, pH 7.2)로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 백색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다.
형질전환주로부터 알칼리법(참조: 세이부쓰고가쿠짓켄쇼, 일본생물공학회편, 105페이지, 하이프칸, 1992년)을 사용하여 플라스미드를 작제한 다음, 벡터에 삽입된 DNA 단편의 제한효소 지도를 작성하여 서열목록의 서열 32에 보고되어 있는 pdhA 유전자의 제한효소 지도와 비교하여 동일한 제한효소 지도를 갖는 DNA 단편이 삽입되어 있는 플라스미드를 pSFKBPDHA라고 명명한다.
(3) 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869 및 CG25로의 pASFKBPDHA의 도입과 발효 배양 평가
브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869 및 GC25를 전기 펄스법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-207791호]에 의해 플라스미드 pSFKBPDHA로 형질전환하여 형질전환주를 수득한다. 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869 및 GC25에 플라스미드 pSFKBPDHA를 도입하여 수득하는 형질전환주 ATCC13869/pSFKBPDHA 및 GC25/pSFKBPDHA를 사용하여 L-글루탐산 생산을 위한 배양을 아래와 같이 실시한다. 25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 CM2B 플레이트 배지로써 배양하여 수득한 ATCC13869/pSFKBPDHA 및 GC25/pSFKBPDHA주의 균체를 글루코오스 80g, KH2P041g, Mg SO4·7H2O 0.4g, (NH4)2SO430g, FeSO4·7H2O 0.01g, MnS04·7H2O 0.01g, 대두 가수절단액 15㎖, 티아민 하이드로클로라이드 200㎍, 바이오틴 60㎍, 카나마이신 25mg 및 CaCO350g을 순수 1L 중에 함유하는 배지에 K0H를 사용하여 pH 8.0으로 조정되어 있다)에 접종하고 31.5℃에서 배지중의 당이 소비될 때까지 진탕 배양한다. 수득된 배양물을 GC25/pSFK6 및 GC25/pSFKBPDHA에 관해서는 상기와 동일한 조성의 배지에 또한 ATCC13869/pSFK6 및 ATCC13869/pSFKBPDHA에 관해서는 상기와 동일하도록 바이오틴을 제거한 배지에 5%의 양으로 접종하고 37℃에서 배지중의 당이 소비될 때까지 진탕 배양한다. 대조군으로서 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869 및 GC25에 이미 취득된 코리네박테리움속 세균으로 독립 복제할 수 있는 플라스미드 pSFK6을 전기 펄스법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-207791호]에 의해 형질전환된 균주를 상기와 동일하게 하여 배양한다. 배양 종료후에 배양액 중의 L-글루탐산 축적량을 바이오텍 분석기 AS-210(제조원: 아사히가세이고교사)에 의해 측정한다. 이때의 결과를 표 17에 기재한다.
균주 L-글루탐산 수율(%)
ATCC13869/pSFK 3.6
ATCC13869/pSFKBPDHA 3.8
GC25/pSFK6 5.1
GC25/pSFKBPDHA 5.3
이들 결과로부터 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869 및 GC25에서 pdhA 유전자의 단독 증폭에서도 Glu 수율 향상에 효과가 있는 것이 명백해졌다.
(4) 변이된 pdhA 프로모터 활성 측정용의 플라스미드의 작제
피루베이트 데하이드로게나제(PDH)의 프로모터 변이주의 제조를 수행하기 위해 이미 클로닝이 된 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 pdhA 유전자의 프로모터 영역의 결정 및 프로모터 영역의 개변에 따른 발현량의 차이를 β­갈락토시다제의 활성을 측정함으로써 실시한다.
클로닝을 실시하고 이미 명백해진 염기서열로부터 pdhA 유전자의 프로모터 부위를 추정한 바, 서열목록의 서열 32의 2252번째로부터 2257번째와 2279번째로부터 2284번째가 각각 ­35 영역 및 -10 영역일 가능성이 높은 것으로 추정된다. 그래서 서열목록의 서열 35 및 36에 기재된 프라이머를 합성하여 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR법에 의해 pdhA 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편을 증폭한다. 합성한 프라이머 내에서 서열 35는 서열목록의 서열 32의 염기서열의 2194번째로부터 2221번째의 염기에 이르는 서열에 상당하지만 2198번째의 염기를 C, 2200번째와 2202번째의 염기를 G로 변경하여 제한효소 SmaI의 인식서열을 삽입하고 있다. 서열 36는 서열목록의 서열 32의 염기서열의 2372번째로부터 2398번째의 염기에 이르는 서열에 상당하지만 2393번째와 2394번째의 염기를 G로 변경하여 제한효소 SmaI의 인식서열을 삽입한 염기서열의 역 쇄를 5' 측으로부터 표기한 것이다. Bacterial Genomic DNA Purification Kit(제조원: Advanced Genetic Technologies Corp.)에 의해 조정된 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체를 주형으로 하여 PCR 테크놀로지(헨리에리히편, 스톡튼프레스, 1989년) 8페이지에 기재되어 있는 표준 반응조건으로 PCR을 실시하고 pdhA 유전자의 프로모터 영역을 증폭한다. 생성한 PCR 산물을 통상적인 방법에 의해 정제한 다음, 제한효소 SmaI를 반응시켜 lacZ 유전자의 프로모터 영역을 결여시킨 코리네형 세균으로 복제할 수 있는 pNEOL을 제한효소 SmaI로[실시예 4의 (3)] 절단한 것과 라이게이션 키트(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하고 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드) 40㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지(박토트립톤 10g/ℓ, 박토이스트 추출물 5g/ℓ, NaCl 15g/ℓ, 한천 15g/ℓ, pH 7.2)로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 청색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질전환주에서 알칼리법(참조: 세이부쓰고가쿠짓켄쇼, 일본생물공학회편, 105페이지, 하이프칸, 1992년)을 사용하여 플라스미드를 작제한 다음, 정해진 방법에 따라 벡터에 삽입된 DNA 단편의 서열 분석을 실시하고 DNA 단편이 삽입되어 있는 플라스미드를 pNEOLBPDHApro1이라고 명명한다.
또한 프로모터 부위로 추정되는 영역을 코리네형 세균의 프로모터의 공통 서열로 변경한 플라스미드를 작제하기 위해 서열목록의 서열 37, 38, 39에 기재된 프라이머를 합성하고 이들 각각의 프라이머와 서열목록의 서열 36에 기재된 프라이머를 사용하여 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR법에 의해 pdhA 유전자의 프로모터 영역을 공통 서열로 변경한 DNA 단편을 증폭한다. 합성한 프라이머 중에서 서열 37은 서열목록의 서열 32의 염기서열의 2244번째로부터 2273번째의 염기에 이르는 서열에 상당하며 2255번째의 염기를 C, 2257번째의 염기를 A로 변경하여 ­35 영역만을 코리네형 세균의 공통 서열로 변경하는 것에 상당하고 있다. 또한, 서열 38은 서열목록의 서열 32의 염기서열의 2249번째로부터 2288번째의 염기에 이르는 서열에 상당하며 2279번째와 2281번째의 염기를 T로 변경하여 -10 영역만을 코리네형 세균의 공통 서열로 변경하는 것에 상당하고 있다. 또한, 서열 39는 서열목록의 서열 32의 염기서열의 2249번째로부터 2288번째의 염기에 이르는 서열에 상당하며 2255번째의 염기를 C, 2257번째의 염기를 A, 2279번째와 2281번째의 염기를 T로 변경하여 -35 영역 및 -10 영역의 양쪽을 코리네형 세균의 공통 서열로 변경하는 것에 상당하고 있다. Bacterial Genomic DNA Purification Kit(제조원: Advanced Genetic Technologies Corp.)에 의해 조정된 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체를 주형으로 하여 PCR 테크놀로지(참조: 헨리에리히편, 스톡튼프레스, 1989년) 8페이지에 기재되어 있는 표준 반응조건으로 PCR을 실시하고 이들 프라이머를 사용하여 프로모터 영역을 공통 서열로 변경한 pdhA 유전자의 프로모터 영역을 증폭한다. 생성된 PCR 산물을 통상적인 방법에 의해 정제한 다음, 제한효소 SmaI를 반응시켜 lacZ 유전자의 프로모터 영역을 결실시킨 코리네형 세균으로 복제할 수 있는 pNEOL을 제한효소 SmaI로 절단한 것과 라이게이션 키트(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하고 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드) 40㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지(박토트립톤 10g/ℓ, 박토이스트 추출물 5g/ℓ, NaCl 15g/ℓ, 한천 15g/ℓ, pH 7.2)로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 청색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질전환주로부터 알칼리법(참조: 세이부쓰고가쿠짓켄쇼, 일본생물공학회편, 1O5페이지, 하이프칸, 1992년)을 사용하여 플라스미드를 작제한 다음, 정해진 방법에 따라 벡터에 삽입된 DNA 단편의 서열 분석을 실시하고 -35 영역만을 공통 서열로 변경하는 DNA 단편이 삽입되어 있는 플라스미드를 pNEOLBPDHApro35라고 명명하고 -10 영역만을 공통 서열로 변경하는 DNA 단편이 삽입되어 있는 플라스미드를 pNEOLBPDHApro35라고 명명하고 -35 영역 및 -10 영역을 공통 서열로 변경한 DNA 단편이 삽입되어 있는 플라스미드를 pNEOLBPDHApro3510이라고 명명한다.
(5) 변이된 pdhA 프로모터 활성의 평가
여기서 작제한 pNEOLBPDHApro1, pNEOLBPDHApro10, pNEOLBPDHApro3510이라고 명명한 플라스미드에 의해 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869를 전기 펄스법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-207791호]으로 형질전환하여 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환체의 β­갈락토시다제 활성을 실시예4 (4)에 기재된 방법에 따라 측정한다. 프로모터 영역을 공통 서열로 변경할 때의 β­갈락토시다제 활성은 pdhA 유전자의 프로모터 영역을 가지는 β-갈락토시다제의 효소활성을 1로 하여 표 18과 같은 결과이다.
균주 β-갈락토시다제 활성(상대치)
ATCC13869/pNEOLBPDHApro1 1
ATCC13869/pNEOLBPDHApro10 6
ATCC13869/pNEOLBPDHApro3510 7.5
이러한 결과는 추정된 프로모터 부위가 pdhA 유전자의 프로모터인 것을 의미하며 이러한 영역을 공통 서열로 변경하는 것으로 pdhA의 발현량을 변경할(증폭하는 것) 수 있는 것을 나타낸다. 이것은 pdhA 유전자의 프로모터 영역을 변경하는 것으로 플라스미드를 사용하지 않고 발현량을 변경할 수 있는 것을 나타낸다.
(6) 프로모터 변이주 제조용 플라스미드의 작제
프로모터에 변이를 일으키게 함으로써 pdhA의 발현량을 변경하는 것이 명백해졌으므로 pdhA 유전자의 프로모터 변이주를 제조하기 위한 플라스미드의 작제를 실시한다. 프로모터 변이주 작제용의 플라스미드는 -35 영역 및 -10 영역을 각각 공통 서열로 변경하는 것과 그 양쪽을 공통 서열로 변경하는 3종류의 작제를 실시한다.
4-1) 프로모터 변이주 제조용 플라스미드의 작제
이미 클로닝되어 있는 염기서열에 근거하여 서열 40, 41에 기재된 프라이머를 새롭게 합성한다. 합성한 프라이머 중에서 서열 40은 서열목록의 서열 32의 2491번째로부터 2521번째의 염기에 이르는 서열에 상당하는 염기서열의 역 쇄를 5' 측으로부터 표기하지만 5' 말단에 A가 3개 연속된 다음에 T가 4개 연속된 서열을 부여한 것이다. 또한, 서열 33은 서열목록의 서열 32에 기재되어 있는 pdhA 유전자의 염기서열도의 5020번째로부터 5039번째의 염기에 이르는 염기서열의 역 쇄를 5' 측으로부터 표기한 것이다. Bacterial Genomic DNA Purification Kit(제조원: Advanced Genetic Technologies Corp.)에 의해서 조정한 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체를 주형으로 하여 프라이머로서 서열목록의 서열 33 및 40을 사용하여 PCR 테크놀로지(헨리에리히편, 스톡튼프레스, 1989년) 8페이지에 기재되어 있는 표준 반응조건으로 PCR을 실시한다. 또한, 브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체를 주형으로 하여 서열목록의 서열 15 및 17을 사용하여 PCR을 실시한다. 생성한 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 정제한 다음, 프라이머로서 서열목록의 서열 9 및 16을 사용할 때의 PCR 산물과 서열목록의 서열 39 및 41을 사용할 때의 PCR 산물 및 서열목록의 서열 33과 41을 사용하여 PCR을 실시한다. 이때의 조건은 이들 4개의 DNA 농도가 10μM으로 되도록 반응액 중에 가하여 주형을 넣지 않고 LA taq(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 PCR을 실시한다. 생성된 PCR 산물은 통상적인 방법에 따라 정제한 다음, 제한효소 SalI와 XhoI를 반응시켜 코리네형 세균으로 복제할 수 있는 온도 감수성 플라스미드 pSFKT2를 제한효소 SalI로 절단한 것과 라이게이션 키트(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 연결한 다음, 에스케리치아·콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하고 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드) 10㎍/㎖, X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드) 40㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖을 함유하는 L 배지(박토트립톤 10g/ℓ, 박토이스트 추출물 5g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, 한천 15g/ℓ, pH 7.2)로 도포하여 밤새 배양한 다음, 출현하는 백색의 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리하여 형질전환주를 수득한다. 형질전환주로부터 알칼리법(참조: 세이부쓰고가쿠짓켄쇼, 일본생물공학회편, 105페이지, 하이프칸, 1992년)을 사용하여 플라스미드를 작제한 다음, 벡터에 삽입된 DNA 단편의 서열 분석을 실시하고 서열목록의 서열 32에 보고되어 있는 pdhA 유전자의 염기서열과 비교하여 프로모터의 -35 영역과 ­10 영역만이 코리네형 세균의 공통 서열로 변경되는 DNA 단편이 삽입되어 있는 플라스미드를 pSFKTPDHApro3510이라고 명명한다.
상기한 방법의 서열목록의 서열 39를 서열목록의 서열 37 및 38로 각각 변경하여 완전히 동일한 방법으로 pdhA 유전자의 프로모터의 -35 영역을 코리네형 세균의 공통 서열로 변경한 플라스미드 및 pdhA 유전자의 프로모터의 -10 영역을 코리네형 세균의 공통 서열로 변경한 플라스미드를 작제한다. 이들 플라스미드는 각각 pSFKTPDHApro35 및 pSFKTPDHApro10이라고 명명한다.
(7) 프로모터 변이주의 제조
(6)에서 작제한 프로모터 변이주 제조용의 플라스미드를 사용하여 상동 재조합에 의해 pdhA 유전자의 프로모터 변이주의 제조을 실시한다.
우선, 프로모터 변이주 제조용 플라스미드 pSFKTPDHApro3510을 사용하여 GC25를 전기 펄스법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-2O7791호]으로 형질전환을 실시하고 CM2B 플레이트 배지(폴리펩톤 10g/ℓ, 박토이스트 추출물 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, 바이오틴 10 ㎍/㎖, 한천 15g/ℓ, pH 7.2)로 습포하고 배양온도 25℃에서 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주는 CM2B 액체 배지에서 밤새 시험관 배양한 후에 카나마이신 25㎍/㎖를 함유하는 CM2B 플레이트 배지로 습포하고 배양온도 34℃에서 배양하여 상동 재조합으로 염색체 위에 플라스미드 pSFKTPDHpro3510이 삽입된 1회 재조합 주를 수득한다. 수득된 1회 재조합 주를 단일 콜로니 분리한 후에 CM2B 액체 배지로 습포하여 배양온도 31.5℃에서 배양하고 콜로니가 출현하면 카나마이신 25㎍/㎖를 함유하는 CM2B 플레이트 배지에 리플리커하는 것으로 카나마이신 감수성 주를 취득한다. 취득된 주의 pdhA 유전자의 프로모터 부위는 야생주 서열의 주와 변이가 도입된 주의 2 종류가 수득되므로 이 부분의 서열 분석를 실시하는 것으로 pdhA 유전자의 프로모터 부위에 변이가 도입된 프로모터 변이주를 취득한다. 이러한 주는 pdhA 유전자의 프로모터의 -35 영역 및 -10 영역이 코리네형 세균의 공통 서열로 변경된 주이며 이러한 주를 GD3510이라고 명명한다.
또한, 상기한 프로모터 변이주 제조용 플라스미드 pSFKTPDHApro3510을 프로모터 변이주 제조용 플라스미드 pSFKTPDHApro35 및 pSFKTPDHApro10을 대신하여 상기와 완전하게 동일한 방법에 따라 pdhA 유전자 프로모터의 -35 영역 및 -10 영역이 코리네형 세균의 공통 서열로 변경한 주를 취득하여 각각 GD35 및 GD10이라고 명명한다.
(8) pdhA 유전자 프로모터 변이주의 플라스크 배양 평가
취득한 3 종류의 pdhA 유전자 프로모터 변이주 GD3510, GD35, GD10 및 GC25를 사용하여 L-글루탐산 생산을 위한 플라스크 배양을 아래와 같이 실시한다. CM2B 플레이트 배지에서 배양하여 수득한 프로모터 변이주 GD3510, GD35, GD10 및 GC25의 균체를 글루코오스 30g, KH2P041g, MgSO4·7H20 0.4g, (NH4)2S0430g, FeS04·7H20 0.0lg, MnSO4·7H20 0.01g, 대두 가수절단액 15㎖, 티아민 하이드로클로라이드 200㎍, 바이오틴 60㎍ 및 CaCO350g을 증류수 1L 중에 함유하는 배지에 K0H를 사용하여 pH 8.0으로 조정되어 있다)에 접종하고 31.5℃에서 배지중의 당이 소비될 때까지 진탕 배양한다. 수득된 생성물을 상기와 동일한 조성의 배지에 5%의 농도로 접종하여 배지중의 당이 소비될 때까지 37℃에서 진탕 배양한다. 배양 종료후에 배양액 중의 L-글루탐산 축적량을 바이오텍 분석기 AS 1210(제조원: 아사히가세이고교사)에 의해 측정한다. 이때의 결과를 표 19에 기재한다.
균주 L-글루탐산 (g/ℓ)
GC25 1.9
GD35 2.0
GD10 2.0
GD3510 2.1
이들 결과로부터 취득한 프로모터 변이주는 Glu 수율이 향상되는 것이 명백해졌다.
실시예 6: 코리네형 아르기닌 생산균으로의 아르기니노석시네이트 신타제 유전자의 프로모터 영역으로의 변이 도입
1) argG 유전자의 상류 영역의 염기서열 결정
브레비박테리움·플라붐의 argG 유전자를 PCR에 의해 증폭하기 위해서 상기한 0RF의 상류 및 하류 영역의 염기서열을 결정한다. 염기서열의 결정은 공지된 코리네박테리움·글루타미쿰의 argG 유전자의 0RF의 염기서열(GenBank accession AF030520)에 근거하여 프라이머를 합성하고 In vitro LA PCR cloning kit(제조원: 다카라슈조)를 사용하여 키트에 첨부된 설명서에 따라 실시한다. 상기한 프라이머로서 구체적으로는 ORF의 상류 영역용에는 서열 42 및 43에 기재된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(프라이머1, 2), 하류 영역용에는 서열 44 및 45에 기재된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(프라이머3, 4)를 각각 사용한다. 브레비박테리움·플라붐의 야생주인 2247주(ATCC14067)의 염색체 DNA를 제한효소 EcoRI로 완전 절단하여 1차 PCR을 프라이머 2 또는 3으로 실시하고 2차 PCR을 프라이머 1 또는 4를 사용하여 실시함으로써 argG의 상류, 하류의 염기서열을 결정한다.
2) 프로모터 부위의 예측
상기한 서열에서 시판하는 소프트웨어(GENETYX)를 사용하여 argG 유전자의 ORF의 상류에 있는 프로모터 모양 서열을 검색한다. 가장 스코어가 높은 부위(최초의 ATG로부터 약 120bp 상류)에 변이를 도입한 다음, 프로모터의 활성을 평가한다.
3) 프로모터 서열로의 변이 도입과 변이형 프로모터의 활성 측정
가장 스코어가 높은 부위에 변이 도입용 프라이머 9 또는 프라이머 10 또는 프라이머 11 또는 프라이머 12 또는 프라이머 13과 프라이머 7(각각 서열 50, 51, 52, 53, 54, 48)을 사용하여 AJ12092주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 1회째의 PCR을 실시하고 이러한 PCR 산물을 3' 측의 프라이머로 하고 프라이머 8(서열 49)를 5' 측의 프라이머로 하여 다시 상기한 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시함으로써 목적하는 프로모터 부분에 변이가 도입된 DNA 단편을 수득한다. 다음에 이러한 변이형 프로모터의 활성을 측정하기 위하여 이들 DNA 단편을 프로모터 프로브 벡터 pNEOL의 SmaI 부위에 리포터 유전자의 lacZ와 순차적인 방향으로 되도록 삽입한 플라스미드 pNEOL­1, pNEOL­2, pNEOL­3, pNEOL­4, pNEOL­7을 수득한다. 또한 활성의 대조군으로서 프라이머 7과 프라이머 8을 사용하여 AJ 12092주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하여 수득한 DNA 단편을 동일하게 pNEOL의 lacZ 유전자의 상류에 삽입한 플라스미드 pNEOL­0을 작제한다.
pNEOL­0, pNEOL­1, PNEOL­2, pNEOL­3, pNEOL­4, pNEOL­7을 AJ12092주에 도입한다. 플라스미드의 도입은 전기 펄스법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-207791호]을 사용한다. 형질전환체는 4㎍/㎖의 클로람페니콜를 함유하는 CM2G 플레이트 배지(폴리펩톤 10g, 효모 추출물 10g, 글루코오스 5g, NaCl 15g, 한천 15g을 증류수 1ℓ에 함유시킨다. pH7.2)에서 클로람페니콜 내성주로서 선택한다.
이들 균주를 글루코오스 0.5g/㎗, 폴리펩톤 1g/㎗, 효모 추출물 1g/㎗, NaCl 0.5g/㎗, 클로람페니콜 5㎍/ℓ를 함유하는 한천 배지로 도포하고 31.5℃에서 20시간 동안 배양하여 수득한 균체 1에제(エ－ゼ)를 글루코오스 3g/㎗, 황산암모늄 1.5g/㎗, KH2PO40.1g/㎗, MgS040.04g/㎗, FeSO40.001g/㎗, MnSO40.01g/㎗, VB15㎍/㎗, 바이오틴 5㎍/㎗, 대두 단백질 가수분해물 N량으로서 45mg/㎗을 함유하는 배지에 식균(植菌)하고 31.5℃에서 18시간 동안 배양하여 수득한 균체를 사용하여 β­갈락토시다제 활성을 측정한다.
표 20에 기재된 바와 같이 AJ12092/pNEOL­0에서 β-갈락토시다제 활성이 검출되는 점으로부터 lacZ 구조 유전자의 상류에 삽입하는 DNA 단편이 프로모터로서 기능하고 있는 것을 알았다. 또한, AJ12092/pNEOL­0과 비교하여 각 플라스미드 도입주에서는 β-갈락토시다제 활성이 높아지며 이러한 프로모터 모양 서열로의 변이 도입에 의해 전사 활성이 표 20과 같이 상승하는 것을 알았다.
상대활성(AJ12092/pNEOL-0=1)
AJ12092 검출 안됨(nd)
AJ12092/pNEOL-0 1.0
AJ12092/pNEOL-1 2.8
AJ12092/pNEOL-2 2.7
AJ12092/pNEOL-3 1.8
AJ12092/pNEOL-4 0.8
AJ12092/pNEOL-7 3.0
4) 변이 도입용 플라스미드의 작제
프라이머 14, 15(서열 55와 56)를 사용하여 AJ12092주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하여 수득한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pHSG398(제조원: 다카라슈조)의 멀티클로닝 사이트(MCS)의 SmalI 부위에 삽입하여 플라스미드 p0를 작제한다. 다음에 p0를 제한효소 EcoRV 및 BspHI로 절단하고 동일하게 pNEOL-3 및 pNEOL-7을 제한효소 EcoRV 및 BspHI로 절단함으로써 수득되는 DNA 단편을 라이게이션함으로써 변이 도입용 플라스미드 p3(변이 도입용 프라이머 11 유래의 변이) 및 p7(변이 도입용 프라이머 13 유래의 변이)을 수득한다.
5) 변이 도입용 플라스미드의 Arg 생산균으로의 도입
상기한 플라스미드를 Arg 생산균 브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ12092주에 도입한다. 플라스미드의 도입은 전기 펄스법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-207791gh]을 사용한다. 브레비박테리움 속에서 이들 플라스미드의 독립 복제를 할 수 없으므로 본 플라스미드가 상동 재조합에 의해 염색체에 편입된 주만이 Cm 내성주로서 선택할 수 있다. 변이 도입용 플라스미드가 염색체에 편입된 주는 5㎍/㎖의 클로람페니콜를 함유하는 CM2G 플레이트 배지(폴리펩톤 10g, 효모 추출물 10g, 글루코오스 5g, NaCl 15g, 한천 15g을 증류수 1ℓ에 함유시킨다. pH 7.2)에서 클로람페니콜 내성주로서 선택한다. 다음에 다시 상동 재조합을 일으켜 Cm 감수성으로 된 주 중에서 argG 유전자의 프로모터 부분이 목적하는 변이 서열로 치환된 주를 선택한다.
그 결과, P3의 서열로 치환된 것(AJ12092-P3) 및 P7의 서열로 치환된 것(AJ12092-P7)을 수득한다.
6) argG 유전자의 클로닝
1)과 같이 결정한 염기서열을 기초하여 서열 46 및 47에 기재된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(프라이머5, 6)를 합성하여 브레비박테리움·플라붐 2247의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시한다. PCR 반응은 94℃: 30초, 55℃: 1초, 72℃: 2분 30초로 이루어진 사이클을 25회 실시한다. 수득된 DNA 단편을 클로닝 벡터 pSTV29(제조원: 다카라슈조)의 멀티클로닝 사이트 내의 SmaI 부위에 클로닝하여 pSTVargG를 제조한다. 또한, pSTVargG의 SalI 부위에 실시예 1 (1)에 기재된 pSAK4를 SalI 처리하여 수득된 복제 오리진을 함유하는 단편을 삽입한 pargG를 제조한다.
7) pargG의 브레비박테리움으로의 도입
pargG를 브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ12092주에 도입한다. 플라스미드의 도입은 전기 펄스법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-207791호]을 사용한다. 형질전환체는 4㎍/㎖의 클로람페니콜를 함유하는 CM2G 플레이트 배지(폴리펩톤 10g, 효모 추출물 10g, 글루코오스 5g, NaCl 15g, 한천 15g을 증류수 1ℓ에 함유시킨다. pH 7.2)에서 클로람페니콜 내성주로서 선택한다.
8) 프로모터 변이주의 ArgG 활성
상기한 2종류의 ArgG 프로모터 변이주 및 플라스미드에서 argG를 증폭한 주(AJ12092/pargG)의 ArgG 활성을 측정한다. 이들 균주를 글루코오스 0.5g/㎗, 폴리펩톤 1g/㎗, 효모 추출물 1g/㎗, NaCl 0.5g/㎗, 클로람페니콜 5㎍/ℓ를 함유하는 한천 배지로 도포하고 31.5℃에서 20시간 동안 배양하여 수득한 균체 1에제를 글루코오스 3g/㎗, 황산암모늄 1.5g/㎗, KH2PO40.1g/㎗, MgSO40.04g/㎗, FeSO40.001g/㎗, MnSO40.01g/㎗, VB15㎍/㎗, 바이오틴 5㎍/㎗, 대두 단백질 가수분해물 N량으로서 45mg/㎗를 함유하는 배지에 식균(植菌)하고 31.5℃에서 18시간 동안 배양하여 수득한 균체를 사용하고 이미 보고된[참조: Journal of General Microbiology (1990),136, 1177-1183] 것에 따라서 ArgG 활성의 측정을 한다. 상기한 2 종류의 ArgG 프로모터 변이주 및 플라스미드에서 argG를 증폭한 주(AJ12092/pargG)의 ArgG 활성을 표21에 기재한다. 표 21에 기재된 바와 같이 프로모터에 변이를 도입함으로써 AJ12092-P3에서는 친주의 약 2배, AJ12092-P7에서는 약 3배에서 ArgG 활성이 상승한다. 또한, AJ12092/pargG에서는 ArgG 활성은 친주의 약 4.5배이다.
상대활성(AJ12092=1)_
AJ12092 1.0
AJ12092-P3 2.1
AJ12092-P7 2.9
AJ12092/pargG 4.4
9) 프로모터 변이주에 따른 Arg 생산
ArgG 프로모터 변이주의 플라스크 배양을 실시한다. 대조로서 친주 AJ12092 및 AJ12092/pargG도 동일하게 배양한다. KH2PO40.1g/㎗, MgSO40.04g/㎗, FeSO40.001g/㎗, MnSO40.01g/㎗, VB15㎍/㎗, 바이오틴 5㎍/㎗, 대두 가수분해물 N량으로서 45mg/㎗를 함유하는 배지에 식균(植菌)하고 글루코오스 0.5g/㎗, 폴리펩톤 lg/㎗,효모 추출물 1g/㎗, NaCl 0.5g/㎗, 클로람페니콜 5㎍/ℓ를 함유하는 한천 배지로 도포하고 31.5℃에서 20시간 동안 배양하여 수득한 균체 1에제를 글루코오스 4g/㎗, 황산암모늄 6.5g/㎗, 플라스크에서 31.5℃로 글루코오스를 완전히 소비할 때까지 배양한다. 배양액을 0.2N HC1로 51배 희석한 액의 620nm에서의 흡광도(0D 620), 아르기닌 생성량[농도(g/㎗)] 및 배양시간을 기재한다.
표 22에 기재된 바와 같이 argG 프로모터 변이주에서는 Arg 수율이 향상되며 플라스미드에서 argG 증폭주와 동등한 수율이다. 또한, 플라스미드 증폭주에서는 배양 시간이 지연되는데 대하여 프로모터 변이주에서는 AJ12092-P3, AJ12092-P7 모두 배양 시간은 친주와 동등하며 Arg 생산성이 플라스미드 증폭주보다 향상되는 것을 알았다.
OD Arg(g/㎗) 배양시간(h) 생산성(g/㎗/h)
AJ12092 0.502 1.25 48 0.026
AJ12092-P3 0.510 1.47 48 0.031
AJ12092-P7 0.514 1.43 48 0.030
AJ12092/pargG 0.520 1.47 52 0.028
실시예 7: 코리네형 글루탐산 생산균의 GDH 유전자 프로모터 영역으로의 변이의 도입
(1) 변이형 gdh 플라스미드의 작제
실시예 2에 기재한 FGR1주 및 FGR2주가 갖는 GDH 프로모터 서열을 갖는 플라스미드를 부위 특이적 변이 방법에 따라 작제한다. FGR1주의 GDH 프로모터 서열을 얻기 위해서는 서열 57에 기재된 합성 DNA와 서열 60에 기재된 합성 DNA를 프라이머에 사용하여 ATCC13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하는 한편, 서열 58에 기재된 합성 DNA와 서열 59에 기재된 합성 DNA를 프라이머로서 사용하고 ATCC13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시한다. 또한 이러한 PCR 산물을 혼합한 것을 주형으로 하여 서열 57 및 58에 기재된 합성 DNA를 프라이머에 사용하여 PCR을 실시한다. 이와 같이 수득하는 PCR 산물을 pSFKT2[참조: 일본 특허원 제(평)11-69896호]의 Smal 부위에 삽입한 pSFKTG11을 작제한다. FGR2주의 GDH 프로모터 서열을 얻기 위해서는 서열 57에 기재된 합성 DNA와 서열 62에 기재된 합성 DNA를 프라이머에 사용하고 ATCC13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하는 한편, 서열 58에 기재된 합성 DNA와 서열 61에 기재된 합성 DNA를 프라이머로서 사용하여 ATCC13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시한다. 또한 이러한 PCR 산물을 혼합한 것을 주형으로 하여 서열 57 및 58에 기재된 합성 DNA를 프라이머에 사용하여 PCR을 실시한다. 이와 같이 수득된 PCR 산물을 pSFKT2[참조: 일본 특허원 제(평)11-69896호]의 Smal 부위에 삽입한 pSFKTG07을 작제한다. 또한 pSFKTG11 및 pSFKTG07의 부위에 삽입한 DNA 단편의 염기서열 결정을 실시하고 GDH의 프로모터 영역 이외로 변이가 도입되지 않는 것을 확인하고 있다.
(2) gdh 프로모터 변이주의 작제
다음에 pSFKTG11 및 pSFKTG07을 전기 펄스법에 의해 AJ13029주에 도입하고 25℃에서 25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 CM2B 플레이트 위에 생육하는 형질전환체를 선택한다. 이러한 형질전환체를 34℃에서 배양하고 34℃에서 카나마이신 내성을 나타내는 주를 선택한다. 34℃에서 카나마이신 내성을 나타내는 것은 pSFKTG11 또는 pSFKTG07이 AJ13029주의 염색체 위에 편입되는 것을 의미한다. 이러한 염색체 위에 플라스미드가 편입된 주로부터 카나마이신 감수성 주를 취득한다. 이들 주의 GDH 프로모터 서열을 결정하여 pSFKTG11 및 pSFKTG07과 동일한 gdh 프로모터 서열을 가지는 주를 각각 GA01, GA02로 한다.
(3) gdh 프로모터 변이주의 L-글루탐산 생산능의 확인
GA01주, GA02주 및 이의 친주 AJ13029주에 관해서 글루탐산의 생산능을 실시예2 (2)와 동일한 방법으로 확인한다. 그 결과, GA01 및 GA02에서는 현저한 글루탐산의 축적 향상이 확인된다(표 23).
균주 Glu(g/㎗) GDH 비활성 상대치
AJ13029 2.6 7.7 1.0
GA01 3.0 22.3 2.9
GA02 2.9 27.0 3.5
(4) 자가 클로닝형 gdh 플라스미드의 작제
우선, 자가 클로닝 벡터 pAJ220을 작제한다. pAJ226[참조: 일본 공개특허공보 제(소)61-152289호]를 EcoRV, Pstl로 처리하여 코리네형 세균내에서 독립 복제할 수 있는 영역을 함유하는 단편을 작제하고 이것과 pAJ224[참조: 일본 공개특허공보 제(소)61-152289호]를 EcoRV, Pstl으로 처리하여 생기는 대략 0.7kb의 DNA 단편을 연결한 플라스미드가 pAJ220이다. 본 플라스미드는 코리네형 균류내에서 독립 복제할 수 있으며 숙주에 트리메토프림 내성을 부여한다.
코리네형 세균 야생형의 ATCC13869주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열 63 및 서열 64에 기재된 합성 DNA를 프라이머로 하여 PCR 반응을 실시하고 gdh 유전자 단편을 작제하여 이것을 pAJ220의 BalI 부위에 삽입한 pAJ220G를 작제한다. pAJ220의 BalI 부위 근방에는 프로모터가 존재하고 있으며 BalI 부위에 삽입된 유전자는 이의 삽입된 방향에 따라서는 발현량이 증강되는 것으로 된다. pAJ220G 및 pGDH를 ATCC13869주에 전기 펄스법으로 도입한 주를 작제하여 상기 (1)에 기재된 방법으로 GDH 활성을 측정한다. 그 결과, pAJ220G 도입주에서는 pGDH 도입주와 비교하여 대략 1.5배의 GDH 활성이 확인된다(표 24).
균주 GDH 비활성 상대치
ATCC13869 7.7 1.0
ATCC13869/pGDH 82.7 10.7
ATCC13869/pAJ220G 120.1 15.6
(5) 수율 및 부산물 Asp에 대한 gdh 활성의 영향의 검토
pGDH 및 pAJ220G를 AJ13029에 전기 펄스법으로 도입한다. 이들 주와 상기 (2)에서 취득한 각 주를 표 25에 기재한 조성의 씨드 배양 배지에 접종하고 31.5℃에서 24시간 동안 진탕 배양하여 씨드 배양을 얻는다. 표 25에 기재된 조성의 본 배양 배지를 500㎖ 용적 유리제 쟈 퍼멘터에 300㎖씩 분주하여 가열 살균한 다음, 씨드 배양을 40㎖ 접종한다. 교반 속도를 800 내지 1300rpm, 통기량을 1/2 내지 1/1vvm으로 하고 배양온도 31.5℃에서 배양을 개시한다. 배양액의 pH는 암모니아 가스로 7.5로 유지시킨다. 배양을 개시하여 8시간 후에 37℃로 전환한다. 어느 것이나 20 내지 40시간에서 글루코오스가 완전하게 소비되는 시점에서 배양을 종료하여 배양액 중에 생성 축적된 L­글루탐산의 양을 측정한다(표 26). 수율을 최고로 하는 GDH 활성은 3배 정도이며 이보다도 GDH 활성이 상승하면 수율 향상폭은 감소되며 대략 16배로 강화되는 시점에서는 오히려 수율은 저하되고 있다. 부산물 아미노산을 히타치의 아미노산 분석기 L­8500으로 분석한 바, GDH 활성의 상승에 따라 아스파라긴산 및 알라닌의 축적이 상승되는 것이 분명해졌다. 이들 결과로부터 글루탐산 수율을 향상시키기 위해서는 아스파라긴산 및 알라닌의 현저한 증가를 일으키지 않도록 GDH 활성을 적절하게 강화하는 것이 필요하며 당해 방법의 한가지로 하여 gdh 프로모터에 각종 변이를 도입하는 것으로 GDH 활성을 친주의 3배 전후로 조절하는 것이 효과적인 수단인 것으로 나타난다.
성분 농도씨드 배양 본 배양
글루코오스 50g/ℓ 150g/ℓ
KH2PO4 1g/ℓ 2g/ℓ
MgSO4·7H2O 0.4g/ℓ 1.5g/ℓ
FeSO4·7H2O 10㎎/ℓ 15㎎/ℓ
MnSO4·4H2O 10㎎/ℓ 15㎎/ℓ
대두 단백질 가수분해액 20㎖/ℓ 50㎖/ℓ
바이오틴 0.5㎎/ℓ 2㎎/ℓ
티아민 하이드로클로라이드 2㎎/ℓ 3㎎/ℓ
균주 Glu(g/㎗) Asp(㎎/㎗) Ala(㎎㎗) GDH 비활성 상대치
AJ 13029 8.3 49 60 7.7 1.0
GA01 9.0 145 152 22.3 2.9
GA02 8.9 153 155 27.0 3.5
AJ13029/pGDH 8.6 201 190 82.7 10.7
AJ13029/pAJ220G 7.5 290 590 120.12 15.6

Claims (17)

  1. 코리네형 세균의 염색체상의 아미노산 또는 핵산 생합성계 유전자의 프로모터 서열에 돌연변이를 일으켜 이를 컨센서스 서열에 근접하도록 하거나 유전자 재조합에 의해 도입하여 코리네형 세균의 변이체를 작제하고 이의 변이체를 배양하여 목적하는 아미노산 또는 핵산의 생성량이 많은 변이체를 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노산 또는 핵산 생성능이 향상된 코리네형 세균의 작제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산이 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 세린, 페닐알라닌으로 이루어진 그룹에서 선택되며 핵산이 이노신, 구아노신, 아데노신 및 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 아미노산이 글루탐산이며 이의 프로모터가 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH), 시트레이트 신타제(CS), 이소시트레이트 신타제(ICDH), 피루베이트 데하이드로게나제(PDH) 및 아코니타제(ACO) 생성 유전자용 프로모터로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH) 생성 유전자용 프로모터가 -35 영역에 CGGTCA, TTGTCA, TTGACA 및 TTGCCA로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 DNA 서열 및/또는 -10 영역에 TATAAT 서열 또는 당해 서열의 ATAAT의 염기가 별도의 염기로 치환되어 있으며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열을 갖는 방법.
  5. 제4항에 있어서, GDH의 프로모터가 -35 영역으로서 TGGTCA를 가지며 -10 영역으로서 TATAAT를 갖거나 -35 영역으로서 TTGTCA를 가지며 -10 영역으로서 TATAAT를 갖는 방법.
  6. 제3항에 있어서, CS용 프로모터가 -35 영역에 TTGACA 서열 및/또는 -10 영역에 TATAAT 서열을 가지며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열을 갖는 방법.
  7. 제3항에 있어서, ICDH에 대한 제1 또는 제2의 프로모터 중 하나 이상이 -35 영역에 TTGCCA 서열 또는 TTGACA 서열을 갖고/갖거나 -10 영역에 TATAAT 서열을 가지며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열을 갖는 방법.
  8. 제3항에 있어서, PDH용 프로모터가 -35 영역에 TTGCCA 서열 및/또는 -10 영역에 TATAAT 서열을 가지며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열을 갖는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 아미노산이 아르기닌이며 이의 프로모터가 아르기니노석시네이트 신타제용 프로모터인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제용 프로모터가 -35 영역에 TTGCCA, TTGCTA 및 TTGTCA로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 DNA 서열 및/또는 -10 영역에 TATAAT 서열 또는 당해 서열의 ATAAT의 염기가 별도의 염기로 치환되어 있으며 프로모터 기능을 억제하지 않는 서열을 갖는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제용 프로모터가 -35 영역에 TTGCTA 서열 및/또는 -10 영역에 TATAAT 서열을 갖는 방법.
  12. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 프로모터를 갖는 글루탐산 합성 유전자.
  13. 제10항에 따른 프로모터를 갖는 아르기닌 합성 유전자.
  14. 제12항에 따른 글루탐산 합성 유전자를 갖는 코리네형 글루탐산 생산균.
  15. 제13항에 따른 아르기닌 합성 유전자를 갖는 코리네형 아르기닌 생산균.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 작제한 아미노산 또는 핵산 생성능이 향상된 코리네형 세균, 또는 제14항 또는 제15항의 코리네형 세균을 배지에서 배양하여 배지중에 목적하는 아미노산 또는 핵산을 생성 축적시키고 이것을 당해 배지로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 발효법에 의한 아미노산 또는 핵산의 제조 방법.
  17. 4-플루오로글루탐산에 대하여 내성을 갖는 코리네형 L-글루탐산 생산균을 액체 배지에서 배양하여 배지중에 L-글루탐산을 생성 축적시키고 이것을 당해 배지로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 발효법에 의한 L-글루탐산의 제조 방법.
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