JPS61104790A - Ｌ−トリプトフアンの生合成に関与する遺伝情報を有する新規組換え体ｄｎａ - Google Patents
Ｌ−トリプトフアンの生合成に関与する遺伝情報を有する新規組換え体ｄｎａInfo
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- JPS61104790A JPS61104790A JP59225915A JP22591584A JPS61104790A JP S61104790 A JPS61104790 A JP S61104790A JP 59225915 A JP59225915 A JP 59225915A JP 22591584 A JP22591584 A JP 22591584A JP S61104790 A JPS61104790 A JP S61104790A
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- tryptophan
- fragment
- recombinant dna
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明はバチルス属から選ばれた菌を宿主細胞として形
質転換を行なわせしめる組換え体ＤＮＡとして有用な新
規大腸菌組換えプラスミドに関し、更に詳しくは、バチ
ルス属に属する宿主菌に、トリプトファンの生合成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組
換え体ＤＮＡを用い該宿主菌内で自己複製させることな
く、つまシ宿主菌の染色体内に該組換え体ＤＮＡを安定
に挿入せしめて、Ｌ−トリプト７ア／の高生産性形質転
換菌を創製出来る新規組換え体ＤＮＡに関する。
質転換を行なわせしめる組換え体ＤＮＡとして有用な新
規大腸菌組換えプラスミドに関し、更に詳しくは、バチ
ルス属に属する宿主菌に、トリプトファンの生合成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組
換え体ＤＮＡを用い該宿主菌内で自己複製させることな
く、つまシ宿主菌の染色体内に該組換え体ＤＮＡを安定
に挿入せしめて、Ｌ−トリプト７ア／の高生産性形質転
換菌を創製出来る新規組換え体ＤＮＡに関する。
（従来技術）
発酵法によるＬ−）！Ｊグト７アンの製造はその経済性
の観点から注目を集め、その際特に、その基礎となるＬ
−） リグドアアン生産菌の改良は重要な課題となっ
ている。
の観点から注目を集め、その際特に、その基礎となるＬ
−） リグドアアン生産菌の改良は重要な課題となっ
ている。
従来、菌の改良には公知の方法、例えば特開昭５９−１
３０１８１号公報に見られるように、主に人工突然変異
法が用いられ、取得した突然変異株によってＬ−）！ｊ
プトファ／の製造が行なわれて来た。
３０１８１号公報に見られるように、主に人工突然変異
法が用いられ、取得した突然変異株によってＬ−）！ｊ
プトファ／の製造が行なわれて来た。
しかし、Ｌ−）！Ｊブト７アンの収量は商業的に必ずし
も充分なものとは言い難く、”その経済的製法の追求が
望まれている。そこで、最近開発された遺伝子組換え技
術を利用してアミノ酸を高度に生産するように微生物を
処理することが出来るように種々の研究が行われている
。
も充分なものとは言い難く、”その経済的製法の追求が
望まれている。そこで、最近開発された遺伝子組換え技
術を利用してアミノ酸を高度に生産するように微生物を
処理することが出来るように種々の研究が行われている
。
ところで、遺伝子組換え技術による菌の改良は、先ず遺
伝子をその供与細胞から取出し、試験管内でベクターＤ
ＮＡと結合させ、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に
取り込ませる。そして、目的とする組換え体ＤＮＡを有
する宿主細胞を増殖せしめ、次いで導入遺伝子を発現せ
しめることによって目的の産物を得る。しかし、これら
従来の一般的な方法によって用いられて来た組換え体Ｄ
ＮＡは宿主細胞内で一般に不安定で培養中に消失したシ
、あるいは、組換え体の一部が欠失を生ずることがある
。それゆえ、宿主細胞内における組換え体ＤＮＡの安定
化手法が確立されない限り実用性に制約を受ける。そこ
で、本発明者等は宿主菌内で自己複製能力を有さない組
換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体に挿入（インテグレー
ション）することが出来れば、安定に組換え体ＤＮＡが
宿主細胞に保持され、上記制約から逃れられることが期
待されると考えた。しかしながら、宿主菌内で自己複製
能力を有さない組換え体ＤＮＡを宿主菌の染色体に挿入
せしめ、得られる形質転換菌を用いて、Ｌ−トリプトフ
ァンなどの製造のために供したという例はない。
伝子をその供与細胞から取出し、試験管内でベクターＤ
ＮＡと結合させ、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に
取り込ませる。そして、目的とする組換え体ＤＮＡを有
する宿主細胞を増殖せしめ、次いで導入遺伝子を発現せ
しめることによって目的の産物を得る。しかし、これら
従来の一般的な方法によって用いられて来た組換え体Ｄ
ＮＡは宿主細胞内で一般に不安定で培養中に消失したシ
、あるいは、組換え体の一部が欠失を生ずることがある
。それゆえ、宿主細胞内における組換え体ＤＮＡの安定
化手法が確立されない限り実用性に制約を受ける。そこ
で、本発明者等は宿主菌内で自己複製能力を有さない組
換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体に挿入（インテグレー
ション）することが出来れば、安定に組換え体ＤＮＡが
宿主細胞に保持され、上記制約から逃れられることが期
待されると考えた。しかしながら、宿主菌内で自己複製
能力を有さない組換え体ＤＮＡを宿主菌の染色体に挿入
せしめ、得られる形質転換菌を用いて、Ｌ−トリプトフ
ァンなどの製造のために供したという例はない。
従来、宿主菌内で自己複製能力を有さない組換え体ＤＮ
Ａの研究としては、わずかに、バチルスズプチルス菌に
おいて遺伝子地図作成や遺伝子解析のために、染色体Ｄ
ＮＡ断片を有する組換え体プラスミドを用いてバチルス
ズプチルス菌の染色体に組換え体プラスミドを挿入せし
め、胞子形成に関与する遺伝子座の同定を行ったシ、組
換え体プラスミドの染色体への挿入の機構研究などの基
礎研究があるにとどまっている〔参考、Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ。
Ａの研究としては、わずかに、バチルスズプチルス菌に
おいて遺伝子地図作成や遺伝子解析のために、染色体Ｄ
ＮＡ断片を有する組換え体プラスミドを用いてバチルス
ズプチルス菌の染色体に組換え体プラスミドを挿入せし
め、胞子形成に関与する遺伝子座の同定を行ったシ、組
換え体プラスミドの染色体への挿入の機構研究などの基
礎研究があるにとどまっている〔参考、Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ。
■、９０−９８ （１９８０）及びＰｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ ＃ Ａｃａｄ 。
ｌ ＃ Ａｃａｄ 。
Ｓｃｉ 、 ＵＳＡ 、 ７５．３６６４−３６６８
（１９７８） ）。
（１９７８） ）。
（発明の目的及び構成）
そこで、Ｌ −） ’）シトファンの発酵法による製造
のために、Ｌ−）リプトフフンの生合成に関与する遺伝
子を新たに宿主菌の染色体に挿入させるべく鋭意研究を
行った所、Ｌ −） リプトファンの生合成に関与する
遺伝子を有する染色体断片と、ベクターＤＮＡを試験管
内で結合せしめ、宿主菌内で自己複製能力を有さないが
染色体に挿入できる組換え体ＤＮＡを取得することに成
功した。該組換え体ＤＮＡを用いてトリブトファンアナ
ログ耐性を有する宿主菌を形質転換させた所、親株と比
較して、例えばトリプト７アン生合成に関係する酵素活
性が高くなった菌株を選択することが出来る。
のために、Ｌ−）リプトフフンの生合成に関与する遺伝
子を新たに宿主菌の染色体に挿入させるべく鋭意研究を
行った所、Ｌ −） リプトファンの生合成に関与する
遺伝子を有する染色体断片と、ベクターＤＮＡを試験管
内で結合せしめ、宿主菌内で自己複製能力を有さないが
染色体に挿入できる組換え体ＤＮＡを取得することに成
功した。該組換え体ＤＮＡを用いてトリブトファンアナ
ログ耐性を有する宿主菌を形質転換させた所、親株と比
較して、例えばトリプト７アン生合成に関係する酵素活
性が高くなった菌株を選択することが出来る。
このように選択された形質転換菌は、Ｌ−ト’Ｊブト７
アンの生産性が高く、更に、例えば一般に知られている
自己複製能のある組換え体ＤＮＡ 、例えば、プラスミ
ドや７アージを用いた場合のような特別な配慮やその不
安定さに伴う障害を克服するための対策を講することな
しに培養が可能であるなど、工業的に有利にＬ−）！ｊ
ブト７アノの製造に供することができる。
アンの生産性が高く、更に、例えば一般に知られている
自己複製能のある組換え体ＤＮＡ 、例えば、プラスミ
ドや７アージを用いた場合のような特別な配慮やその不
安定さに伴う障害を克服するための対策を講することな
しに培養が可能であるなど、工業的に有利にＬ−）！ｊ
ブト７アノの製造に供することができる。
本発明によれば、Ｌ−１デトフアンの生合成に関与する
遺伝子（望ましくは、トリブトファンあるいはトリブト
ファンアナログなどによる阻害が解除されているものが
望ましい。）を有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの
、宿主菌内で自己複製能力ガないが染色体に安定に挿入
される組換え６ず 体ＤＮＡが取得出来、これを用いることによってバチル
ス属に属する微生物から選ばれる宿主菌株（好’ｔＬ＜
ａ、）リプドア７ノアナログ耐性を有する宿主菌）を形
質転換出来る。形質転換菌にはその染色体に該組換え体
ＤＮＡが新たに挿入されており、コラして、Ｌ−トリブ
トファンの生合成を調整する遺伝子が新たに付加された
染色体ＤＮＡを有するＬ−）！Ｊブトファン高生産性菌
が提供でき、さらに該形質転換菌を用いたＬ −） Ｉ
Ｊグトファンの経済的な発酵法による製造法が提供され
る。
遺伝子（望ましくは、トリブトファンあるいはトリブト
ファンアナログなどによる阻害が解除されているものが
望ましい。）を有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの
、宿主菌内で自己複製能力ガないが染色体に安定に挿入
される組換え６ず 体ＤＮＡが取得出来、これを用いることによってバチル
ス属に属する微生物から選ばれる宿主菌株（好’ｔＬ＜
ａ、）リプドア７ノアナログ耐性を有する宿主菌）を形
質転換出来る。形質転換菌にはその染色体に該組換え体
ＤＮＡが新たに挿入されており、コラして、Ｌ−トリブ
トファンの生合成を調整する遺伝子が新たに付加された
染色体ＤＮＡを有するＬ−）！Ｊブトファン高生産性菌
が提供でき、さらに該形質転換菌を用いたＬ −） Ｉ
Ｊグトファンの経済的な発酵法による製造法が提供され
る。
以下、本発明について更に説明する。
組換え体ＤＮＡの作製
従来、宿主菌を形質転換せしめる場合には、もりばら宿
主菌内で自己複製能力を有する組換え体ＤＮＡ 、例え
ば、プラスミドやファーゾが用いられて来た。しかし、
本発明では、染色体に安定に組換え体ＤＮＡを挿入せし
めるために、自己複製能力を有さない組換え体ＤＮＡを
使用した。
主菌内で自己複製能力を有する組換え体ＤＮＡ 、例え
ば、プラスミドやファーゾが用いられて来た。しかし、
本発明では、染色体に安定に組換え体ＤＮＡを挿入せし
めるために、自己複製能力を有さない組換え体ＤＮＡを
使用した。
本発明に於けるＬ −） ＩＪグトファンの生合成に関
与する遺伝情報を有するＤＮＡ断片は、通常Ｌ−トリプ
トファン生産能を有する微生物の染色体ＤＮＡより適当
な制限酵素によりて切出されたものが用いられるが、宿
主菌の染色体ＤＮＡとの相同性が高いものであれば原則
としてその由来については特別な制限はなく、例えば、
土壌や他の天然物から分離されるＬ−）リグト７ア／生
産能を有する野生株は勿論のこと、それらを紫外線照射
や化学物質による処理をして得られる人工的突然変異法
式いは遺伝子組換え技術を用いて得られるＬ−トリプト
ファンの生合成に関与する遺伝情報を含む組換えＤＮＡ
等いずれでも良い。尚、この場合、該ＤＮＡ断片はＩ、
−トＩＪブトファンの生合成に関与する遺伝情報を有
する部分のみからなり、他に余分な部分を含まないもの
であることが望ましいが、用いる制限酵素の種類によっ
てはその前後に若干他の部分を含むことがあり、そのよ
うなものであっても宿主菌との相同性や目的とするＬ
−） リプトファンの生合成に悪影響を及ぼさない限り
用いることができる。また、該ＤＮＡ断片はＬ−トリプ
トファンの生合成に関与する遺伝情報のすべてを有する
必要はなく、その一部分のみを含んでいるＤＮＡでも用
いることができる。
与する遺伝情報を有するＤＮＡ断片は、通常Ｌ−トリプ
トファン生産能を有する微生物の染色体ＤＮＡより適当
な制限酵素によりて切出されたものが用いられるが、宿
主菌の染色体ＤＮＡとの相同性が高いものであれば原則
としてその由来については特別な制限はなく、例えば、
土壌や他の天然物から分離されるＬ−）リグト７ア／生
産能を有する野生株は勿論のこと、それらを紫外線照射
や化学物質による処理をして得られる人工的突然変異法
式いは遺伝子組換え技術を用いて得られるＬ−トリプト
ファンの生合成に関与する遺伝情報を含む組換えＤＮＡ
等いずれでも良い。尚、この場合、該ＤＮＡ断片はＩ、
−トＩＪブトファンの生合成に関与する遺伝情報を有
する部分のみからなり、他に余分な部分を含まないもの
であることが望ましいが、用いる制限酵素の種類によっ
てはその前後に若干他の部分を含むことがあり、そのよ
うなものであっても宿主菌との相同性や目的とするＬ
−） リプトファンの生合成に悪影響を及ぼさない限り
用いることができる。また、該ＤＮＡ断片はＬ−トリプ
トファンの生合成に関与する遺伝情報のすべてを有する
必要はなく、その一部分のみを含んでいるＤＮＡでも用
いることができる。
このようなし−トリプトファンの生合成に関与する遺伝
情報を有する染色体ＤＮＡを有する微生物としては、例
えば、バチルス・アミロリクイファシェンス、バチルス
・アミロリティカス、バチルス・アルカロフィラス、バ
チルス・コアギユランス、バチルス・ライケニホルミス
、バチルス・ナラトウ、バチルス・ズプチルス、バチル
ス・ステアロサーモクイ２ス等のバチルス属に属する微
生物や、それらの変異株など、およびそれらを親株とし
て遺伝子組み換えによって育種した株等が掲げられる。
情報を有する染色体ＤＮＡを有する微生物としては、例
えば、バチルス・アミロリクイファシェンス、バチルス
・アミロリティカス、バチルス・アルカロフィラス、バ
チルス・コアギユランス、バチルス・ライケニホルミス
、バチルス・ナラトウ、バチルス・ズプチルス、バチル
ス・ステアロサーモクイ２ス等のバチルス属に属する微
生物や、それらの変異株など、およびそれらを親株とし
て遺伝子組み換えによって育種した株等が掲げられる。
また、これらＤＮＡよりトリプトファン生合成に関与す
る遺伝子を切出すのに用いられる制限酵素゛としては特
に制限はないが、トリプトファンの生合成忙関与する遺
伝子中にも切断部位が少ないほうが望ましく、例えば、
ＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨＩ ％ Ｓａｌ Ｉ、５ａｅｌｓ
Ｐｖｕ■、Ｘｈｏ Ｉ 、 Ｘｂａ １、Ｍｂｏ［、Ｍ
ｌｕｌ等がらげられる。
る遺伝子を切出すのに用いられる制限酵素゛としては特
に制限はないが、トリプトファンの生合成忙関与する遺
伝子中にも切断部位が少ないほうが望ましく、例えば、
ＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨＩ ％ Ｓａｌ Ｉ、５ａｅｌｓ
Ｐｖｕ■、Ｘｈｏ Ｉ 、 Ｘｂａ １、Ｍｂｏ［、Ｍ
ｌｕｌ等がらげられる。
本発明において、宿主菌内で自己複製しないベクターと
しては、例えば、Ｃｏ１Ｅ１ 、 ｐｓｃｌｏｌ 、
ｐＪＢ８ 。
しては、例えば、Ｃｏ１Ｅ１ 、 ｐｓｃｌｏｌ 、
ｐＪＢ８ 。
ｐＡｃＹｃ１８４ 、 ｐＢＲ３２２、ｐＡＴ１５３．
、 ＭＵＡ−３、ｐｃＲｌ 。
、 ＭＵＡ−３、ｐｃＲｌ 。
ｐＫＴ２８７ 、ｐＫＮ４０２ 、ｐＢＲ３２５、ｐＢ
Ｒ３２８、ｐＢＲ３２７。
Ｒ３２８、ｐＢＲ３２７。
ｐＮＯ１５２３、ｐＫＢｌｌｌ 、 ｐＫＫ２２３−３
、 ｐＫｃ３０などの大腸菌由来のプラスミド及びそ
の誘導体があげられるが、所謂宿主−ベクター系として
成シ立つものであれば大腸菌糸にこだわる必要はない。
、 ｐＫｃ３０などの大腸菌由来のプラスミド及びそ
の誘導体があげられるが、所謂宿主−ベクター系として
成シ立つものであれば大腸菌糸にこだわる必要はない。
特に、本発明のすぐれた点は、例えばバチルス属に属さ
ない宿主細胞、例えば大腸菌などでクローニング出来れ
ば、その系で用いた組換え体ＤＮＡそのものを直接本発
明に使用出来る点にある。その際、従来技術でおれば、
宿主菌以外でクロー二／グした時、ベクターとして宿主
菌内でも自己複製可能なベクター（例えば宿主菌内で複
製可能なシャトルベクターとか広量主領域ベクターなど
）を使用しておくか、あるいはクロー二／グしたＤＮＡ
を宿主菌内で安定に存在し得るベクターと連結させ直す
操作などの配慮を必要とした。
ない宿主細胞、例えば大腸菌などでクローニング出来れ
ば、その系で用いた組換え体ＤＮＡそのものを直接本発
明に使用出来る点にある。その際、従来技術でおれば、
宿主菌以外でクロー二／グした時、ベクターとして宿主
菌内でも自己複製可能なベクター（例えば宿主菌内で複
製可能なシャトルベクターとか広量主領域ベクターなど
）を使用しておくか、あるいはクロー二／グしたＤＮＡ
を宿主菌内で安定に存在し得るベクターと連結させ直す
操作などの配慮を必要とした。
以下に代表的な例として大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ
３２２及びｐＢＲ３２５を使用した例を示し、更に具体
的に詳述するが、前述の如く他の例くついても同様に行
い得ることは言うまでもない。
３２２及びｐＢＲ３２５を使用した例を示し、更に具体
的に詳述するが、前述の如く他の例くついても同様に行
い得ることは言うまでもない。
プラスミドｐＴＰ４の有するクロラムフェニコール耐性
遺伝子を常法によりファージｐＨのＤＮＡにクローニン
グし、次いで該ファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで
切断して、予めＫｃｏＲｌで切断しておいたプラスミド
ｐＢＲ３２２ＤＮＡと、それら生じたＤＮＡ断片の末端
の数が同じくなるような濃度で混合し、Ｔ４ファーシリ
ｆ−ゼを用いて結合反応を起こさせる。このＤＮＡを用
い、塩化カルシウム処理した大腸菌Ｃ６００ｔｒｐ ５
ｌｓｕ ％ｔｈｒ Ｓｒｋ”’ ｍｋ″″株を常法によ
り形質転換し、クロラムフェニコール、アン−シリ／、
テトラサイクリンのいずれにも耐性を有する株を取得し
た。これら形質転換株からプラスミドを分離精製し、制
限酵素地図をりくりた所、第１図のような制限酵素地図
を有するプラスミドを含む形質転換菌大腸菌５Ｄ−１０
０７（微工研菌寄第７８６０号）が得られた。
遺伝子を常法によりファージｐＨのＤＮＡにクローニン
グし、次いで該ファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで
切断して、予めＫｃｏＲｌで切断しておいたプラスミド
ｐＢＲ３２２ＤＮＡと、それら生じたＤＮＡ断片の末端
の数が同じくなるような濃度で混合し、Ｔ４ファーシリ
ｆ−ゼを用いて結合反応を起こさせる。このＤＮＡを用
い、塩化カルシウム処理した大腸菌Ｃ６００ｔｒｐ ５
ｌｓｕ ％ｔｈｒ Ｓｒｋ”’ ｍｋ″″株を常法によ
り形質転換し、クロラムフェニコール、アン−シリ／、
テトラサイクリンのいずれにも耐性を有する株を取得し
た。これら形質転換株からプラスミドを分離精製し、制
限酵素地図をりくりた所、第１図のような制限酵素地図
を有するプラスミドを含む形質転換菌大腸菌５Ｄ−１０
０７（微工研菌寄第７８６０号）が得られた。
該形質転換菌のプラスミド（ｐＳＤ３１６５と称する）
にはｐＢＲ３２２のＥｅｏＲＩの切断点に約２．５メガ
ダルトンのクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され
ていた。尚、ｐＴＰ４由来のクロラムフェニコール耐性
遺伝子はバチルス・ズプチルス、バチルス・アミロリク
イファシェンスなどで発現可能であシ、さらに上記の如
くクローニングした該クロラムフェニコール耐性遺伝子
に関してもバチルス・ズプチルス及ヒノクチルス・アミ
ロリクイファシェンスなどのバチルス属に属する菌内で
発現することは後に記述するように明らかである。
にはｐＢＲ３２２のＥｅｏＲＩの切断点に約２．５メガ
ダルトンのクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され
ていた。尚、ｐＴＰ４由来のクロラムフェニコール耐性
遺伝子はバチルス・ズプチルス、バチルス・アミロリク
イファシェンスなどで発現可能であシ、さらに上記の如
くクローニングした該クロラムフェニコール耐性遺伝子
に関してもバチルス・ズプチルス及ヒノクチルス・アミ
ロリクイファシェンスなどのバチルス属に属する菌内で
発現することは後に記述するように明らかである。
次にｐＳＤ３１６５を制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で部分的
に切断し−またクローンしたトリプトファンアナログ耐
性枯草菌由来のトリプトファンオペロンを含むファージ
φ１０５ＤＮＡ（特開昭５９−１２５８９２号参照）も
制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で切断し、両者ＤＮＡを混合し
、Ｔ４ファージリガーゼを用いて結合させる。
に切断し−またクローンしたトリプトファンアナログ耐
性枯草菌由来のトリプトファンオペロンを含むファージ
φ１０５ＤＮＡ（特開昭５９−１２５８９２号参照）も
制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で切断し、両者ＤＮＡを混合し
、Ｔ４ファージリガーゼを用いて結合させる。
このＤＮＡを用い、塩化カルシウム処理した大腸菌Ｃ６
００ｔｒｐ ｓ ｌｅｕ ５ｔｈｒ 、 ｒｋ−１
ｍｋ″″ 株を常法によシ形質転換し、クロラムフェニ
コール耐性、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐
性でかつＴｒｐ非要求性を示す形質転換菌を取得する。
００ｔｒｐ ｓ ｌｅｕ ５ｔｈｒ 、 ｒｋ−１
ｍｋ″″ 株を常法によシ形質転換し、クロラムフェニ
コール耐性、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐
性でかつＴｒｐ非要求性を示す形質転換菌を取得する。
該形質転換菌から組換えプラスミドを常法により分離精
製し、制限酵素地図を作製した所、第２図のように制限
酵素地図を持つプラスミドを有する形質転換菌大腸菌５
Ｄ−１００８（微工研菌寄第７８６１号）が得られた。
製し、制限酵素地図を作製した所、第２図のように制限
酵素地図を持つプラスミドを有する形質転換菌大腸菌５
Ｄ−１００８（微工研菌寄第７８６１号）が得られた。
この形質転換菌のプラスミド（ｐＳＤＴｌｌｌｌと称す
る）にはｐＳＤ３１６５のＥｃｏＲＩ切断点の１つに約
５メガダルトンのＤＮＡが挿入されていた。この挿入Ｄ
ＮＡは、各種トリシトファン要求株（ｔｒｐ Ａ ｓ
ｔｒｐ Ｂ ％ ｔｒｐ Ｃ、ｔｒｐ Ｄまたはｔｒｐ
Ｅ等の突然変異株）を受容菌としてｐＳＤＴｌｌｌｌを
供与体ＤＮＡとした時、全てにＴｒｐ非要求性の形質転
換菌が高頻度に出現せしめることから、トリプトファン
の生合成を調整する遺伝情報を有すると考えられる・ 次いでｐＢＲ３２５を用いた例を示す。
る）にはｐＳＤ３１６５のＥｃｏＲＩ切断点の１つに約
５メガダルトンのＤＮＡが挿入されていた。この挿入Ｄ
ＮＡは、各種トリシトファン要求株（ｔｒｐ Ａ ｓ
ｔｒｐ Ｂ ％ ｔｒｐ Ｃ、ｔｒｐ Ｄまたはｔｒｐ
Ｅ等の突然変異株）を受容菌としてｐＳＤＴｌｌｌｌを
供与体ＤＮＡとした時、全てにＴｒｐ非要求性の形質転
換菌が高頻度に出現せしめることから、トリプトファン
の生合成を調整する遺伝情報を有すると考えられる・ 次いでｐＢＲ３２５を用いた例を示す。
プラスミドｐＢＲ３２５を制限酵素（例えば、ＥｃｏＲ
ｌ ）で切断し、また例えば、特開昭５９−１２５８９
２号で示された方法でクローンしたバチルス・アミロリ
クイファシェンスＩＡＭ１５２１ （東京大学応用微生
物研究所よシ入手）の５−フルオロトリプトファン耐性
株のトリプトファンの生合成を調整する遺伝情報を含む
ファージφ１０５ ＤＮＡもＥｃｏＲＩにて切断し、両
者のＤＮＡを適当な濃度で混合し、両ＤＮＡ断片をＴ４
ファーシリが−ゼで結合させる。次に、このＤＮＡを用
い、大腸菌Ｃ６００ｔｒｐ ｓ ｌｅｕ １ｔｈｒ
％ｒｋ−１ｍｋ−株を上述の方法で形質転罠せしめた。
ｌ ）で切断し、また例えば、特開昭５９−１２５８９
２号で示された方法でクローンしたバチルス・アミロリ
クイファシェンスＩＡＭ１５２１ （東京大学応用微生
物研究所よシ入手）の５−フルオロトリプトファン耐性
株のトリプトファンの生合成を調整する遺伝情報を含む
ファージφ１０５ ＤＮＡもＥｃｏＲＩにて切断し、両
者のＤＮＡを適当な濃度で混合し、両ＤＮＡ断片をＴ４
ファーシリが−ゼで結合させる。次に、このＤＮＡを用
い、大腸菌Ｃ６００ｔｒｐ ｓ ｌｅｕ １ｔｈｒ
％ｒｋ−１ｍｋ−株を上述の方法で形質転罠せしめた。
そして、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性かつ
クロラムフェニコール耐性でなおかつＴｒｐ非要求性の
形質転換菌大腸菌５Ｄ−１００９（微工研菌寄第７８６
２号）を選択した。該菌よシブラスミドを常法により分
離精製した所、第３図に示すようなプラスミド（ｐＳＤ
２９６１ ）が得られた。
クロラムフェニコール耐性でなおかつＴｒｐ非要求性の
形質転換菌大腸菌５Ｄ−１００９（微工研菌寄第７８６
２号）を選択した。該菌よシブラスミドを常法により分
離精製した所、第３図に示すようなプラスミド（ｐＳＤ
２９６１ ）が得られた。
尚、該プラスミドを用いて、バチルス・ズプチルスｈｉ
ｓ Ｂ株を形質転換した所、Ｈｉｍ非要求性株が得られ
ることから、該組換え体ＤＮＡはトリプトファンオペロ
ン以外にｈｉｓ Ｂ遺伝子も含むことが判る。
ｓ Ｂ株を形質転換した所、Ｈｉｍ非要求性株が得られ
ることから、該組換え体ＤＮＡはトリプトファンオペロ
ン以外にｈｉｓ Ｂ遺伝子も含むことが判る。
′以下に本発明によって得られた組換え体ＤＮＡを用い
て、Ｌ−トリプトファンの高生産性を示す形質転換菌取
得の代表的な実施例を示すが、本発明の範囲をこれら実
施例に限定するものでないことはいうまでもない。
て、Ｌ−トリプトファンの高生産性を示す形質転換菌取
得の代表的な実施例を示すが、本発明の範囲をこれら実
施例に限定するものでないことはいうまでもない。
宿主菌としては前述したような組換え体ＤＮＡをその染
色体内に挿入し得るものならばいずれでもよい。どこで
は、代表的な例としてバチルス・ズプチルスＩＭＡ１０
２６株（東京大学応用微生物研究所より入手）ならびに
バチルス・アミロリクイファシェンスＩＭＡ１５２１株
とそのトリプトファンアナログ耐性株、バチルス５Ｄ−
３０（特開昭５９−１３０１８１号を宿主菌として例示
する。
色体内に挿入し得るものならばいずれでもよい。どこで
は、代表的な例としてバチルス・ズプチルスＩＭＡ１０
２６株（東京大学応用微生物研究所より入手）ならびに
バチルス・アミロリクイファシェンスＩＭＡ１５２１株
とそのトリプトファンアナログ耐性株、バチルス５Ｄ−
３０（特開昭５９−１３０１８１号を宿主菌として例示
する。
但し、バチルス５Ｄ−３０以外はトリプトファン・アナ
ログである５−フルオロトリプトファン（以下、５−Ｆ
Ｔと略す）感受性でありたので、例えば、Ｎ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ７等を用いて常法
により人工突然変異処理をして、５−ＦＴ耐性菌を取得
して、以下の実験に供した。また、ＩＭＡ１５２１株に
関しては、同様の突然変異処理で５−ＦＴ耐性を有すヒ
スチジン要求株を取得し、実験に供した。
ログである５−フルオロトリプトファン（以下、５−Ｆ
Ｔと略す）感受性でありたので、例えば、Ｎ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ７等を用いて常法
により人工突然変異処理をして、５−ＦＴ耐性菌を取得
して、以下の実験に供した。また、ＩＭＡ１５２１株に
関しては、同様の突然変異処理で５−ＦＴ耐性を有すヒ
スチジン要求株を取得し、実験に供した。
実施例１
ｐＳＤＴｌｌｌｌ ０．１〜１μｇを上記宿主菌に公知
の方法（例えばＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、影１．７４
１（１９６１） 又はｐｌｏｌｅＣ−ｇｅｎ−Ｇｅｎ
ｔ−，１６８，１１１（１９７９）など）によって取シ
込ませ、形質転換を行ったところ、ｐｏラムフェニコー
ル（１０μσ算）を含む寒天培地で成育する、いわゆる
クロラムフェニコール耐性を有する形質転換菌バチルス
５Ｄ−１００２（微工研菌寄第７８５５号）が取得でき
た。この菌の菌学的性質は原株バチルス・アミロリクイ
ファシェンスＩＭＡ１５２１株とクロラムフェニコール
耐性、アントラニル酸によるＬ−トリプトファンの合成
阻害、トリプトファンアナログ耐性及びトリジ６フフフ
合成系酵素の活性の点で相違する以外は原株と実質的に
同じである。
の方法（例えばＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、影１．７４
１（１９６１） 又はｐｌｏｌｅＣ−ｇｅｎ−Ｇｅｎ
ｔ−，１６８，１１１（１９７９）など）によって取シ
込ませ、形質転換を行ったところ、ｐｏラムフェニコー
ル（１０μσ算）を含む寒天培地で成育する、いわゆる
クロラムフェニコール耐性を有する形質転換菌バチルス
５Ｄ−１００２（微工研菌寄第７８５５号）が取得でき
た。この菌の菌学的性質は原株バチルス・アミロリクイ
ファシェンスＩＭＡ１５２１株とクロラムフェニコール
耐性、アントラニル酸によるＬ−トリプトファンの合成
阻害、トリプトファンアナログ耐性及びトリジ６フフフ
合成系酵素の活性の点で相違する以外は原株と実質的に
同じである。
ところで、トリプトファン合成を調整する遺伝子を含ま
ない、つまシ染色体ＤＮＡと相同性があるＤＮＡ ｔ−
含まないｐＳＤ３１６５そのものを用いた時には、クロ
ラムフェニコール耐性菌の出現は認められなく主菌内で
自己複製能力はないと考えられた。さらに、上記形質転
換菌からは閉環状ＤＮＡ （プラスミド）の存在は認め
られなかりた。このことから、ｐＳＤＴｌｌｌｌが宿主
菌染色体に挿入されたと考えられる（参照Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳＡ１．７５．３
６６４（１９７８））。
ない、つまシ染色体ＤＮＡと相同性があるＤＮＡ ｔ−
含まないｐＳＤ３１６５そのものを用いた時には、クロ
ラムフェニコール耐性菌の出現は認められなく主菌内で
自己複製能力はないと考えられた。さらに、上記形質転
換菌からは閉環状ＤＮＡ （プラスミド）の存在は認め
られなかりた。このことから、ｐＳＤＴｌｌｌｌが宿主
菌染色体に挿入されたと考えられる（参照Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳＡ１．７５．３
６６４（１９７８））。
次に、バチルス５Ｄ−３０株を宿主菌に用いて選抜した
該形質転換菌のＬ−）リグトファンシ／セターゼの活性
の測定〔文献Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ ｓ旦、７９４（１９６２） ］結果を示す。
該形質転換菌のＬ−）リグトファンシ／セターゼの活性
の測定〔文献Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ ｓ旦、７９４（１９６２） ］結果を示す。
バチルス５Ｄ−３０１００
バチルス５Ｄ−１００２２０３
また、該形質転換株のアントラニル酸（８０ｐｐｍ）存
在下におけるスピデイゼン最少培地 Ｃ（ＮＨ４）２Ｓｏ４０．２チ、Ｋ２ＨＰＯ４１，４チ
、ＫＨ２ＰＯ４０，６％、クエン酸ナトリダム・２Ｈ２
００，１チ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２％、グルコ
ース ０．５チ 〕で３７℃、１．５時間培養した時の
Ｌ −） ＩＪグトファンの蓄積結果を示す。
在下におけるスピデイゼン最少培地 Ｃ（ＮＨ４）２Ｓｏ４０．２チ、Ｋ２ＨＰＯ４１，４チ
、ＫＨ２ＰＯ４０，６％、クエン酸ナトリダム・２Ｈ２
００，１チ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２％、グルコ
ース ０．５チ 〕で３７℃、１．５時間培養した時の
Ｌ −） ＩＪグトファンの蓄積結果を示す。
菌 株 Ｌ−）リグトファン蓄積（μｇ／ｍｌ
） バチルス５Ｄ−３０３４ バチルス５Ｄ−１００２７２ 以上よ、９、ｐＳＤＴｌｌｌｌが宿主菌染色体に挿入さ
れその結果ｐＳＤＴ１１１１由来のトリプトファン生合
成系遺伝子が新たに染色体上に付加されトリプトファン
生合成系遺伝子が増巾されたと解釈できる。
） バチルス５Ｄ−３０３４ バチルス５Ｄ−１００２７２ 以上よ、９、ｐＳＤＴｌｌｌｌが宿主菌染色体に挿入さ
れその結果ｐＳＤＴ１１１１由来のトリプトファン生合
成系遺伝子が新たに染色体上に付加されトリプトファン
生合成系遺伝子が増巾されたと解釈できる。
実施例２
宿主菌としてＩＭＡ１０２６株の５−ＦＴ耐性株を用い
た場合も、同様にしてｐＳＤＴｌｌｌｌ ＤＮＡによっ
て、クロラム７：１．ニコール耐性を有し、Ｌ−トリグ
ト７アンシ／セターゼ活性ならびにその蓄積が約２倍光
道した形質転換株が取得できた。
た場合も、同様にしてｐＳＤＴｌｌｌｌ ＤＮＡによっ
て、クロラム７：１．ニコール耐性を有し、Ｌ−トリグ
ト７アンシ／セターゼ活性ならびにその蓄積が約２倍光
道した形質転換株が取得できた。
実施例３
ＩＡＭ１５２１の５−ＦＴ耐性を有するヒスチジン要求
株を宿主菌として、ｐＳＤ２９６１を供与体ＤＮＡとし
て上述の方法によシ形質転換し、ヒスチジン非要求性薗
を選択する。
株を宿主菌として、ｐＳＤ２９６１を供与体ＤＮＡとし
て上述の方法によシ形質転換し、ヒスチジン非要求性薗
を選択する。
この場合には宿主菌のヒスチジン遺伝子とｐＳＤ２９６
１が有するヒスチジン遺伝子とが組換えを起こしてヒス
チジン非要求性となった形質転換菌又は上述したように
ｐＳＤ２９６１が染色体に挿入された結果ヒスチジン非
要求性となった形質転換菌あるいは両反応が同時に起り
たヒスチジン非要求性形質転換菌の存在が考えられる。
１が有するヒスチジン遺伝子とが組換えを起こしてヒス
チジン非要求性となった形質転換菌又は上述したように
ｐＳＤ２９６１が染色体に挿入された結果ヒスチジン非
要求性となった形質転換菌あるいは両反応が同時に起り
たヒスチジン非要求性形質転換菌の存在が考えられる。
しかし、もし染色体にｐＳＤ２９６１が挿入された場合
にはトリプトファンの合成を調整する遺伝子は染色体上
に少くとも２個存在することになり、例えばトリグト７
ア／シ／セターゼ活性が宿主菌よシ高い事が期待される
。
にはトリプトファンの合成を調整する遺伝子は染色体上
に少くとも２個存在することになり、例えばトリグト７
ア／シ／セターゼ活性が宿主菌よシ高い事が期待される
。
実際、頻度は少いがＬ−）リプトファンシンセターゼ活
性の高い形質転換菌バチルス５Ｄ−１００５（微工研菌
寄第７８５８号、この菌の菌学的性質はａ 株バチルス
・アミロリクイファシェンスＩＡＭ１５２１株とアント
ラニル酸によるし一トリプトファンの合成阻害、５−Ｆ
Ｔ耐性及びトリプトファン合成系酵素の活性の点で相違
する以外は原株と実質的に同じである。）が以下に示す
ように選抜できた。
性の高い形質転換菌バチルス５Ｄ−１００５（微工研菌
寄第７８５８号、この菌の菌学的性質はａ 株バチルス
・アミロリクイファシェンスＩＡＭ１５２１株とアント
ラニル酸によるし一トリプトファンの合成阻害、５−Ｆ
Ｔ耐性及びトリプトファン合成系酵素の活性の点で相違
する以外は原株と実質的に同じである。）が以下に示す
ように選抜できた。
菌 Ｌ−｝リグトファンシンセター
ゼ比活性 ＩＡＭ１５２１ ５ＦＴ 耐性ヒスチジン要求株 １００パチルス
ＳＤ−１００５ １ ７ ８以上例
示したように、抗生物質耐性遺伝子を有した組換え体Ｄ
ＮＡを用いたり、Ｌ−トリプトファンの生合成に直接関
与する遺伝情報以外に他の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
を用いたり、栄養要求性変異株を宿主菌として用いたが
、これらは染色体Ｋ挿入した組換え体ＤＮＡを含む形質
転換菌の取得を容易Ｋさせるもので、単に例示に過ぎな
い。
ゼ比活性 ＩＡＭ１５２１ ５ＦＴ 耐性ヒスチジン要求株 １００パチルス
ＳＤ−１００５ １ ７ ８以上例
示したように、抗生物質耐性遺伝子を有した組換え体Ｄ
ＮＡを用いたり、Ｌ−トリプトファンの生合成に直接関
与する遺伝情報以外に他の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
を用いたり、栄養要求性変異株を宿主菌として用いたが
、これらは染色体Ｋ挿入した組換え体ＤＮＡを含む形質
転換菌の取得を容易Ｋさせるもので、単に例示に過ぎな
い。
抗生物質耐性遺伝子であれば、上記理由から宿主細胞内
で発現しうるものならいずれでもよく、又、宿主菌の突
然変異も挿入されるＤＮＡと相同性を持つ選択可能な遺
伝子変異ならいずれでもよいことは明白である．
で発現しうるものならいずれでもよく、又、宿主菌の突
然変異も挿入されるＤＮＡと相同性を持つ選択可能な遺
伝子変異ならいずれでもよいことは明白である．
第１図はｐＳＤ３１６５の制限酵素地図、第２図はｐＳ
ＤＴ１１１１の制限酵素地図、第３図はｐＳＤ２９６１
の制限酵素地図、をそれぞれ示す． ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５は大腸菌由来プラスミド、
Ｃｍはクロラム７エニコール耐性形質を示す領域、Ｔｒ
ｐはトリグトファ冫の生成号を調整する領域、Ｓａｌ
１％ ＥｃｏＲＩ， Ｈｉｎｄｌｌ、Ｈｉｎｃ Ｕ ｓ
ＢａｍＨ Ｉｓ Ｐｓｔ １ ，Ｐｖｕ ＩＩ 、Ｘ
ｂａ Ｉ、Ｂｇｌ［Ｉ、Ｘｈｏｌ、は制限酵素名であシ
、各酵素による切断部位を示す。
ＤＴ１１１１の制限酵素地図、第３図はｐＳＤ２９６１
の制限酵素地図、をそれぞれ示す． ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５は大腸菌由来プラスミド、
Ｃｍはクロラム７エニコール耐性形質を示す領域、Ｔｒ
ｐはトリグトファ冫の生成号を調整する領域、Ｓａｌ
１％ ＥｃｏＲＩ， Ｈｉｎｄｌｌ、Ｈｉｎｃ Ｕ ｓ
ＢａｍＨ Ｉｓ Ｐｓｔ １ ，Ｐｖｕ ＩＩ 、Ｘ
ｂａ Ｉ、Ｂｇｌ［Ｉ、Ｘｈｏｌ、は制限酵素名であシ
、各酵素による切断部位を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、枯草菌内でも発現し得るクロラムフェニコール耐性
遺伝子を有する大腸菌プラスミドベクターｐＳＤ３１６
５。 ２、Ｌ−トリプトファンの生合成に関与する遺伝情報を
有するＤＮＡ断片と、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２５又
は大腸菌プラスミドｐＳＤ３１６５との組換え体ＤＮＡ
ｐＳＤ２９６１又はｐＳＤＴ１１１１。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59225915A JPS61104790A (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | Ｌ−トリプトフアンの生合成に関与する遺伝情報を有する新規組換え体ｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59225915A JPS61104790A (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | Ｌ−トリプトフアンの生合成に関与する遺伝情報を有する新規組換え体ｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61104790A true JPS61104790A (ja) | 1986-05-23 |
Family
ID=16836876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59225915A Pending JPS61104790A (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | Ｌ−トリプトフアンの生合成に関与する遺伝情報を有する新規組換え体ｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61104790A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6962805B2 (en) | 1998-09-25 | 2005-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of constructing amino acid producing bacterial strains, and method of preparing amino acids by fermentation with the constructed amino acid producing bacterial strains |
| CN104388330A (zh) * | 2014-09-26 | 2015-03-04 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种l-色氨酸发酵菌株及其发酵生产l-色氨酸的方法 |
-
1984
- 1984-10-29 JP JP59225915A patent/JPS61104790A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6962805B2 (en) | 1998-09-25 | 2005-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of constructing amino acid producing bacterial strains, and method of preparing amino acids by fermentation with the constructed amino acid producing bacterial strains |
| US7608437B2 (en) | 1998-09-25 | 2009-10-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of constructing amino acid producing bacterial strains, and method of preparing amino acids by fermentation with the constructed amino acid producing bacterial strains |
| CN104388330A (zh) * | 2014-09-26 | 2015-03-04 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种l-色氨酸发酵菌株及其发酵生产l-色氨酸的方法 |
| CN104388330B (zh) * | 2014-09-26 | 2017-09-22 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种l‑色氨酸发酵菌株及其发酵生产l‑色氨酸的方法 |
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