JPH03210184A - 新規プラスミドベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は遺伝子組換え技術によって創製された新規なプ
ラスミドベクターに関し、更に詳しくは、コリネ型細菌
内で複製増殖機能を有し、かつ安定保持性に優れたプラ
スミドベクターに関する。

従来の技術 遺伝子組換え技術において、プラスミドベクターは、有
用な遺伝情報をコードした外来遺伝子断片を宿主細菌内
に導入し、それを宿主細菌内で安定に複製させ、且つ外
来遺伝子がコードする遺伝情報を発現させるための外来
遺伝子の運び手として極めて重要なものである。

ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ型細菌は、アミ
ノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を生産する工業的
に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ技術の導入によ
る菌株の育種改良は、エシェリヒア・コリ等に比べてま
だ遅れており、特に、コリネ型細菌を宿主とする工業的
に有用なプラスミドベクターの開発が強く望まれている
。

工業的に有用なブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ
型細菌から得られる天然型プラスミドは本菌属を遺伝的
に改良するにたる可能性は秘めているもののほとんどが
プラスミドのマーカーとなりえるような薬剤耐性遺伝子
をもっておらず、また有用な遺伝子を結合させることが
可能なりローニングサイトがないプラスミドであり、天
然型のプラスミドのままではコリネ型細菌の育種改良に
は不適合である。

菌株の育種改良に用いるプラスミドベクターの宿主内で
の安定性に関しては、従来より、培養時に宿主からのプ
ラスミドの脱落や挿入遺伝子の欠落等種々の遺伝子的不
安定性が報告されている。

その対応策が諸種検討されてはいる（特開昭５５−１５
６５９１号明細書参照）が、かかる方法を工業的に応用
するにはかなりの問題がある。また、プラスミドベクタ
ーの不安定性の原因には、組換えプラスミドのサイズも
関わっている。挿入される有用遺伝子も合わせた組換え
プラスミド全体のサイズが巨大化することにより不安定
となることが知られている［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇ
ｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１１８　、　
Ｐ２５３（１９８０）参照］。

一方、有用遺伝子をベクターへクローニングする際に、
用いるクローニングサイトが有用遺伝子内に存在する場
合は、有用遺伝子のプラスミドベクターへのクローニン
グが困難となることがある。

従って、小型で適当なりローニングサイトを少なくとも
２ケ所以上持ち、コリネ型細菌内で安定に保持されるプ
ラスミドベクターの開発が望まれている。

発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための
手段 本発明者等は先に、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　ＭＪ　
２３３　（ＦＢＲＭＯＦ−１４９７）が保持するプラス
ミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７８７号明細書参
照）又はブレビバクテリウム０スタチオニス（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ１
２１４４（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２５１５）が保持するプ
ラスミドｐＢＹ５０３（特開平１−９５７８５号明細書
参照）に由来するコリネ型細菌内でプラスミドの複製増
殖機能を担うＤＮＡ領域に、プラスミドマーカーとなり
つる薬剤耐性遺伝子、クローニングサイト及びエシェリ
ヒア・コリ内で複製するのに必要な遺伝子領域を導入す
ることにより、工業的に有用なプラスミドベクター、例
えばｐＣＲＹ２、ｐＣＲＹ３を創成し、提案した（特開
平１−１９１６８６号明細書参照）。

しかし、該プラスミドベクターは、菌体内での安定性に
おいて必ずしも満足できるものではなく、遺伝子産物を
著量産生させる場合には、菌体内における目的遺伝子発
現の効率をさらに高める必要がる。

そこで、本発明者らは鋭意研究の結果、コリネ型細菌内
で複製増殖しろるブレビバクテリウム・スタチオニスＩ
ＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２５１５）由来の
プラスミドｐＢＹ５０３上に、コリネ型細菌内で複製増
殖可能なプラスミドを該細菌内において安定に保持させ
る機能（以下、これを「安定化機能」という）に関与す
る遺伝子（以下、これを便宜上「安定化遺伝子」という
ことがある）が存在することを見い出した。そして、上
記ｐＢＹ５０３からこの安定化遺伝子を含むＤＮＡ断片
を分離することに成功し、該安定化遺伝子をプラスミド
ベクター内に導入することにより、該プラスベクターが
、形質転換された微生物菌体内で安定に親細胞から娘細
胞へと継代的に確実に分配されるプラスミドの安定化法
を開発し提案した（特願平１−１８３７０６号明細書参
照）。

本発明者らはさらに、より小型で、適当なりロニングサ
イトを複数箇有し、コリネ型細菌内で安定に保持される
プラスミドベクターを開発すべく研究を重ねた。その結
果、上記した、プラスミドｐＢＹ５０２又はｐＢＹ５０
３に由来するプラスミドの複製増殖機能を担うＤＮＡ領
域をさらに小型化したＤＮＡ領域と、プラスミドｐＢＹ
５０３に由来する安定化遺伝子を含むＤＮＡ領域と、プ
ラスミドのマーカーとなり得る薬剤耐性遺伝子とを導入
して新規なプラスミドベクターを造成することにより上
記の目的が達成されることを見い出し本発明を完成する
に到った。

かくして、本発明によれば、コリネ型細菌内で複製増殖
可能なプラスミドを該細菌内において安定に保持させる
機能に関与する遺伝子を含有するＤＮＡ領域（ａ）と、
コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を担うＤＮ
Ａ領域ら）と、プラスミドマーカーとなりうる薬剤耐性
遺伝子を含むＤＮＡ領域（ｃ）とを保有するプラスミド
ベクターが提供される。

本発明の上記プラスミドベクターは、複数箇所のクロー
ニングサイトを有し、コリネ型細菌内で安定に複製増殖
する。このプラスミドベクターに有用構造遺伝子等を導
入してコリネ型細菌を形質転換することにより、工業的
に有用なコリネ型細菌の育種改良が可能となる。

以下、本発明のベクタープラスミドの造成に用いるＤＮ
Ａ領域、該プラスミドベクターの造成法についてさらに
詳細に説明する。

本発明の安定化遺伝子を含むＤＮＡ領域（ａ）（以下、
これを「安定化ＤＮＡ断片」という）は、ブレビバクテ
リウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖ　１ｂａｃｔｅｒ　ｉ
ｕｍｓｔａｔｉｏｎｉｓ）　Ｉ　ＦＯ１２１４４（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ　−２５１５）が保有するプラスミドｐＢ
Ｙ５０３（大きさ約１５ｋｂ）上に存在し、このｐＢＹ
５０３を適当な制限酵素で切断することにより生ずる切
断断片の中から以下に述べる方法で分離、取得すること
ができる。

すなわち、安定化ＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＢＹ５
０３を、適当な制限酵素で切断し、得られるＤＮＡ断片
を、コリネ型細菌内で不安定で薬剤耐性マーカーを保持
するベクタープラスミドに挿入し、このベクタープラス
ミドを電気パルス法による形質転換によりコリネ型細菌
に導入する。

得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制
限酵素で解析することにより挿入されたｐＢＹ５０３由
来のＤＮＡ断片を調べる。各組換えプラスミド保持株を
非選択圧下で数十世代培養し、培養後のプラスミド保持
率が元のベクタープラスミドより上昇しているものを安
定化ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドとして分離する
。

このようにして得られる安定化ＤＮＡ断片の１つは、前
記プラスミドｐＢＹ５０３を制限酵素にｐｎｌ及びＥｃ
ｏＲＩで切り出すことによって得られる大きさが約２．
１　ｋｂのＤＮＡ断片が挙げられる。

この約２．１　ｋｂの安定化ＤＮＡ断片を各種の制限酵
素で切断したときの認識部位数及び切断断片の大きさを
下記表１に示す。

なお、本明細書において、制限酵素による［認識部位数
」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、過剰の制限酵素の
存在下で完全分解し、これらの分解物をそれ自体既知の
方法に従い１％アガロースゲル電気泳動およびポリアク
リルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数か
ら決定することができる。

また、「切断断片の大きさ」及びプラスミドの大きさは
、アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリ
ヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡ
を制限酵素器ｎｄＩＩＩで切断して得られる分子量既知
のＤＮＡ断片の同−丁ガロースゲル上での泳動距離で描
かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのファ
イ・エックス１７４フアージ（φｘ　１７４　ｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素１ａｅＩ［［で切断して得られ
る分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲ
ル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮ
Ａ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算出す
る。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれの大きさ
を加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大きさの決定
において、１ｋｂ以上の断片の大きさについては、１％
アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用し
、約０．１　ｋｂからｌｋｂ未満の断片の大きさについ
ては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得ら
れる結果を採用した。

表 制限酵素　　認識部位数 Ｓａｃ　Ｉ　　　　　　Ｉ Ｘｂａ　Ｉ　　　　　　Ｉ Ｈｉｎｄ　ｍ　　　　　Ｉ Ｋｐｎ　Ｉ　　　　　　０ 切断断片の大きさ（ｋｂ） １．４　　　０．７ １．８　　　０．３ １．６　　　０．５ ２．１ また、制限酵素Ｋｐｎ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで切り出すこ
とにより得られる大きさが約１．７　ｋｂのＤＮＡ断片
も安定化機能を有している。この約１．７　ｋｂの安定
化ＤＮＡ断片については、その塩基配列を、プラスミド
ｐＵｃ１８又はｐ　ＵＣ１９［Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ。

ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、、　Ｇｅｎｅ　１９　、
２６９（１９８２）参照〕を用いるジデオキシヌクレオ
チド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ法）　［Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ、　ａ
ｔｌＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＩＪＳ＾７４　、５４
６３　（１９７７）参照〕により決定することができる
。このようにして決定した上記的１．７　ｋｂのＤＮＡ
断片の塩基配列は次のとおりであり、１７６３個の塩基
から構成される装 安定化遺伝子は、上記塩基配列のどの部分に担われてい
るかまだ正確には判明されていないが、該塩基配列の後
半部分に含まれているものと推定される。

上記塩基配列を有する本発明のプラスミドベクターの造
成に用いる安定化ＤＮＡ断片は、天然のプラスミドから
分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成
装置、例えばベックマン社製Ｓｙｓｔｅｍ−Ｉ　Ｐｌｕ
ｓを用いて合成されたものであってもよい。

また、前記の如くプラスミドｐＢＹ５０３から取得され
る安定化ＤＮＡ断片は、安定化機能を実質的に損なうこ
とがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換
されていてもよく又は削除されていてもよく、或いは新
たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一
部が転位されているものであってもよく、これらの誘導
体のいずれもが、本発明の安定化ＤＮＡ断片に包含され
るものである。

次に、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を担
う遺伝子を含むＤＮＡ領域う）（以下これを「複製増殖
ＤＮＡ断片」ということがある）は、前記したブレビバ
クテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−２５１５）が保有するプラスミドｐＢＹ５０
３（大きさ約１５ｋｂ）上に存在し、このｐＢＹ５０３
を制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで切断することにより生ずる切断
断片の中から以下の方法で分離取得することができる。

ｐＢＹ５０３を制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで切断したＤＮＡ断
片の混合液を０．８％アガロースゲル電気泳動により分
離する。ＤＮＡの大きさとして４．Ｏｋｂの両分をゲル
から切り出し、ヨウ化ナトリウム液にてゲルを溶解し、
水冷下でＤＮＡをシリカマ）　ＩＪフックス吸着させる
。エタノール−水の混合液で洗浄した後、ＴＥ緩衝液［
１０ｍＭ）リス−塩酸、１　ｍＭ　ＢＤＴＡ　　ｐＨ＝
８．０１に抽出する。遠心分離にて、シリカマトリック
スを沈殿させ、ＤＮＡを含む上清液を得た［Ｖｏｇｅｌ
ｓｔｅｉｎ、　Ｂ、、　Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ、口：　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、
Ａ、：　７６　、６１５（１９７９）の方法による］。

この約４．０ｋｂの複製増殖ＤＮＡ断片を各種の制限酵
素で切断したときの認識部位数及び切断断片の大きさを
表２に示す。

表　　　２ 制限酵素　　認識部位数　　切断断片の大きさ（ｋｂ）
ＰｓｔＩ　　　　２　　　　２．３．０．９．０．８Ｓ
ｐｈＩ　　　　２　　　　２．０．１，７．０．３Ｘｂ
ａＩ　　　　３　　　　２．５．０．８．０．５．０゜
２Ｍ］ｕＩ　　　　１　　　　２．１．１．９また、複
製増殖機能を担う遺伝子を含むＤＮＡ領域は、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭ　Ｊ　２３３（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−１４９７）が保有するプラスミドｐＢＹ５０２（大
きさ約４５ｋｂ）上に存在し、このｐＢＹ５０２を制限
酵素旧ｎｄＩＩ［及びＳｍａ　Ｉで切断することにより
生ずる切断断片の中から上記した方法で分離取得するこ
とができる大きさ約３．６ｋｂ　　ＤＮＡ断片中に存在
する。該ＤＮＡ断片を、本発明プラスミドベクターを構
成する複製増殖ＤＮＡ断片として好適に使用することが
できる。

この約３．６　ｋｂの複製増殖ＤＮＡ断片を各種の制限
酵素で切断したときの認識部位数及び切断断片の大きさ
を下記表３に示す。

表 制限酵素　　認識部位数 ＨｉｎｄＩＩＩ　　　　　Ｏ Ｓｍａ　Ｉ　　　　　０ ３ａｃ　Ｉ　　　　　Ｉ Ｂａｍ）Ｉ　Ｉ　　　　　１ 切断断片の大きさ（ｋｂ） ３．６ ３．６ ２．９、０．７ ３．１、０．５ さらにプラスミドマーカーとなる薬剤耐性遺伝子を含む
ＤＮＡ領域（ｃ）は、例えばクロラムフェニコール耐性
遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などが好適に用いられ
るが、宿主とするコリネ型細菌内で発現し、宿主に薬剤
耐性能を与えることができ、その薬剤耐性能によりプラ
スミドの存在が示唆される限り、遺伝子の種類は限られ
るものではなく、また一種類でも複数存在してもよい。

コリネ型細菌内で発現する薬剤耐性遺伝子としては、ク
ロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝
子、テトラサイクリン耐性遺伝子、スベクチノマイシン
耐性遺伝子、トリメトプリム耐性遺伝子などが挙げられ
る。

例えばエシェリヒア・コリ由来のクロラムフェニコール
耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子は、コリネ型細
菌内で発現することが知られている。そして両遺伝子を
コードするプラスミドとしては、ｐＨ５Ｇ３９８及びｐ
Ｈ３Ｇ２９８が市販されており容易に入手することが可
能である。

本発明において新規に提供されるプラスミドベクターは
、以上に詳述した、安定化遺伝子を含むＤＮＡ領域、複
製増殖機能を担うＤＮＡ領域、薬剤耐性遺伝子を含むＤ
ＮＡ領域の３つの必須のＤＮＡ領域を保有するものであ
る。本発明のプラスミドベクターは、有用遺伝子のクロ
ーニングサイトとして、ＥｃｏＲＩサイト、ＢａｍＨＩ
サイト、　ＫｐｎＩサイト、Ｐｓｔ　Ｉサイト等を有し
ており、様々な目的遺伝子のクローニングが可能である
。

本発明プラスミドベクターの造成は、上記した３つの必
須ＤＮＡ領域（ＤＮＡ断片）を前記で詳述した方法によ
り調製し、Ｔ、ＤＮＡ！Ｉガーゼを作用させて順次ＤＮ
Ａ断片を結合することにより容易にできる。

本発明により提供されるプラスミドベクターの好適具体
例としては、前記した３つのＤＮＡ断片から実質的にな
り、大きさが約８．６　ｋｂ及び約７．５ｋｂのプラス
ミドで、本発明者らがそれぞれｐ　ＣＲＹ３０及びｐＣ
ＲＹ２０と命名したプラスミドを挙げることができる。

プラスミドｐＣＲＹ３０を各種の制限酵素で切断したと
きの認識部位数及び切断断片の大きさを表４に、該プラ
スミドの構成及び切断点地図を第１図に示す。また、プ
ラスミドｐＣＲＹ２０を各種の制限酵素で切断したとき
の認識部位数及び切断断片の大きさを表５に、該プラス
ミドの構成及び切断点地図を第２図に示す。

制限酵素 Ｂａｍ）Ｉ　Ｉ ｆ！ｃｏＲＩ にｐｎ　Ｉ ｍａ　Ｉ ａｌ　　Ｉ 表　　　４ 認識部位数　　切断断片の大きさ（ｋｂ）１８．６ １８．６ １８．６ ２　　　　４．８．３．８ ２　　　　８．３．０．３ 制限酵素 Ｋｐｎ　Ｉ ｓｔ　Ｉ Ｘｂａ　Ｉ ｃｏＲＩ ａｃ　Ｉ 表　　　５ 認識部位数　　切断断片の大きさ（ｋｂ）１７．５ １７．５ １７．５ １７．５ ３　　　　　３．９．２．９．０．７ 以上に述べた本発明のプラスミドベクターｐＣＲＹ３０
及びｐＣＲＹ２０は、例えば以下に示す方法で調製する
ことができる。

プラスミドベクターｐＣＲＹ３０は、例えば次の様に作
製できる。先ず、カナマイシン耐性遺伝子をコードし、
大腸菌内での複製増殖機能を有するプラスミドｐＨ３０
２９８（宝酒造製）を制限酵素５ａｌＩで切断し、前記
の様にして調製したｐＢＹ５０３由来の複製増殖機能を
担うＤＮＡ断片とＴ、ＤＮＡリガーゼにより結合させる
。次に、複製増殖機能を担うＤＮＡ断片が挿入された上
記プラスミドを制限酵素Ｋｐｎ　Ｉ及び３ｃｏＲＩによ
り切断し、前記の方法により調製したｐＢＹ５０３由来
の安定化遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｅｃ
ｏＲＩ　　２．１ｋｂ断片）と混合し、Ｔ、ＤＮＡリガ
ーゼにより結合させる。以上の様にして複製増幅機能と
、安定化機能を有し、カナマイシン耐性遺伝子を発現す
るプラスミドベクターｐＣＲＹ３０を作製することがで
きる。

またｐＣＲＹ２０は、例えば次の様に作製できる。先ず
、クロラムフェニコール耐性遺伝子をコードし、大腸菌
内での複製増殖機能を有するプラスミドｐＨ３Ｇ３９８
　（宝酒造製）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａ　Ｉで切
断し、前記の様に取得したｐＢＹ５０３由来の安定化遺
伝子を含むＤＮＡ断片（Ｋｐｎｌ　−ＸｂａＩ　　１７
６３塩基対より成る断片）と混合し、Ｔ、ＤＮＡリガー
ゼにより結合させる。

次に、前記の様に調製したｐＢＹ５０２由来の複製増殖
機能を担うＤＮＡ断片及び安定化遺伝子が挿入された上
記プラスミドを制限酵素器ｎｄｎＩで切断したＤＮＡ断
片の各々を、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼにより末端平滑化
した後、両ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼに
より結合させる。以上の様にして複製増殖機能と、安定
化機能を有し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を発現
するプラスミドベクターｐＣＲＹ２０を作製することが
できる。

かくして創製される本発明のプラスミドベクターで形質
転換しつる宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えば
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３　（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−１４９７）、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ　２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９
８）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ　２３３−Ａ
ＢＴ−１１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１５００）、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ　２３３−ＡＢＤ−２１（Ｆ
ＢＲＭＢＰ−１４９９）等が挙げられる。

なお、上記のＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９８の菌株は、Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７号の菌株を親株としてＤＬ−
α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノール資
化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公報第３
〜４欄参照）。また、ＦＥＲＭＢＰ−１５００号の菌株
は、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７の菌株を親株としたし
一α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株であ
る（特開昭６２−５１９９８号公報参照）。さらに、Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭ　　ＢＰ−
１４９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７７９９３
号公報参照）。

これらの微生物の他に、ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍａ＋ｏ
ｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３
７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリウム・
デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｖ
ａｒｉｃａｔｕｍ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ４０２０、ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　１ａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕａ＋）＾Ｔ
ＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（
ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕ
＋＋＋）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３１８３０等を宿主微生物とし
て用いることもできる。

宿主としてブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３を
用いる場合には、本菌株が保有するプラスミドｐＢＹ５
０２（特開昭６３−３６７８７号明細書参照）により形
質転換が困難になる場合があるので、そのような場合に
は、本菌株より予めプラスミドｐＢＹ５０２を除去する
ことが望ましい。そのようなプラスミドは、例えば、継
代培養を繰り返すことにより自然に脱落させることも可
能であるし、人為的に例えばＢａｃｔ、Ｒｅｖ、、３６
．３６１〜４０５　（１９７２）に記載の方法により除
去することも可能である。

プラスミドを人為的に除去する方法の一例を具体的に示
せば以下のとありである。

宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ　２３３の生育
を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレンジ（濃度：
０．２〜５０μｇ／、ｍ１）もしくはエチジウムプロミ
ド（濃度＝０．２〜５０μｇ／ｍｊり等を含む培地に、
１ｍ１当り約１０細胞になるように植菌し、生育を不完
全に阻害しながら、約２４時間３５℃で培養する。培養
液を希釈後寒天培地に塗布し、３５℃に約２日培養する
。出現したコロニーから各々独立にプラスミド抽出操作
を行ない、プラスミドが除去されている株を選択する。

この操作によりｐＢＹ５０２が除去されたブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ　２３３由来株が得られる。

上記宿主微生物の前記組換えプラスミドベクターによる
形質転換は、それ自体既知の方法、例えば、Ｃａ１ｖｉ
ｎ、　Ｎ０Ｍ、ａｎｄ　Ｈａｎａｗａｌｔ、　Ｐ、Ｃ，
、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　
１７０．２７９６（１９８８）；　Ｉｏｏ、に、、Ｎ１
５ｈｉｄａ、Ｔ、ａｎｄ　Ｔｚａｋｉ、　Ｋ、、　Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉ。

ｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｒｙ、　５２．２９３　
（１９８８）等の文献に記載の方法により、例えば宿主
微生物にパルス波を通電することにより行なうことがで
きる。

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。し
かしながら、下記の実施例は本発明について具体的な認
識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによっ
て本発明の範囲は何ら限定されるものではない。

実施例１ Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム１スタ
チオニス（ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕＬＩｌｓｔａｔ
ｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２
５１５）から新たに分離された大きさ約１５ｋｂのプラ
スミドである（特開平１−９５７８５号明細書参照）。

プラスミドｐＢＹ５０３は次のようにして調製した。

半合成培地Ａ培地〔尿素２　ｇ、　（ＮＨ４）ｚｓＯ４
７ｇｌに２ＨＰＯ４０，５ｇＳＫＨａＰ０４０．５　ｇ
ＳＭｇＳＯ４０，５ｇ。

Ｆｅ５Ｏｎ　　・７Ｈ２０６ｍｇ、Ｍｎ５Ｏａ　４〜６
　ＬＯ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ１
ビチオン２００μｇ１塩酸チアミン２００μｇ１グルコ
ース２０ｇ１純水１１〕１１に、ブレビバクテリウム・
スタチオニスＩＦＯ１２１４４を対数増殖期後期まで培
養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０■／ｍｌの濃
度にリゾチームを含む緩衝液〔２５ｍＭ）リス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン、１０　ｍＭ　　ＥＤＴＡ、
５０　ｍＭグルコース〕２０！１１１に懸濁し、３７℃
で１時間反応させた。反応液にアルカリ−３ＤＳ液［０
，２Ｎ　　Ｎａ叶、１％（ｗ／ｖ）　５ＤＳＩ　４０　
ｒｎｌを添加し、緩やかに混和して室温にて１５分間静
置した。

次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸カリウ
ム溶液６０ｍｊ！、酢酸１１．５　ｍｌ、純水２８．５
ｍｌの混合液］３０［１１１を添加し、充分混和してか
ら氷水中に１５分間静置した。

溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分間、１５、Ｏ
ＯＯＸｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た。

これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノール
／クロロホルム１／１混和液）を加え懸濁後、遠心管に
移し、室温下で５分間、１５．０００　Ｘｇの遠心分離
にかけ、水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを
加え、−２０℃で１時間静置後、４℃で１０分間、１５
．０００　Ｘ　ｇの遠心分離にかけ、沈殿を回収した。

沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液〔トリス１０ｍＭ、ＥＤ
ＴＡ、１　　ｍＭ：ＨＣｌにてｐ）１８．０に調整〕２
　ｍｌ２に溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液〔５倍
濃度のＴＥ緩衝液１００ｍ１に塩化セシウム１７０ｇを
溶解させた液〕１５ｆｆ＋１と１０ｍｇ／ｌ１１１エチ
ジウムブロマイド溶液１　ｍｌを加えて、密度を１．３
９２　ｇ／　ｍｌに合わせた。この溶液を１２０℃で４
２時間、１１６，０００　Ｘｇの遠心分離を行なった。

プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射により遠心管内で
下方のバンドとして見い出される。このバンドを注射器
で遠心管の側面から抜きとることにより、プラスミドｐ
ＢＹ５０３を含む分画液を得た。

次いでこの分画液を当量のイソアミルアルコールで４回
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後Ｔ
Ｅ！ｌ衝液に対して透析を行なった。

このようにして得られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む
透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに
添加した後、２倍量のエタノールを加え、−２０℃１時
間静置した。この溶液を１５．０００×ｇの遠心分離に
かけてＤＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０３を約
５０μｇ得た。

Ｂ）プラスミドｐＢＹ５０３上の複製増殖機能を担うＤ
ＮＡ領域（複製増殖ＤＮＡ断片）の調製 上記Ａ）項で得たプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡ２０μ
ｇに制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ　　（２０ｕｎｉｔｓ）を３７
℃２時間反応させプラスミドＤＮＡを完全に分解した。

該分解物を０．８％のアガロースゲル電気泳動にて分離
し約４．ＯｋｂのＤＮＡ画分をゲルから切り出した。該
両分からＤＮＡを抽出、精製し約５μｇのＤＮＡを得た
。

Ｃ）プラスミドｐＢＹ５０３上の安定化機能に関与する
遺伝子を含むＤＮＡ領域（安定化ＤＮＡ断片）の調製 前記Ａ）項で得たプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡ２０μ
ｇに制限酵素Ｋｐｎ　Ｉ及びＥｃｏＲＩ　　（各々２０
ｕｎｉｔｓ）を３７℃２時間反応させ、プラスミドＤＮ
Ａを完全に分解した。該分解物を０．８％のアガロース
ゲル電気泳動にて分離し、約２．１　ｋｂのＤＮＡ断片
画分をゲルから切り出した。該両分からＤＮＡを抽出、
精製し約５μｇのＤＮＡを得た。

Ｄ）プラスミドｐＨ３０２９Ｂの準備 プラスミドｐＨ３Ｇ２９８は、エシェリヒア・コリ内で
複製し、カナマイシン耐性を発現する大きさ２６７６ｂ
ｐのプラスミドであり、市販品として宝酒造より購入可
能である。

Ｅ）プラスミドベクターｐＣＲＹ３０の造成プラスミド
ｐＨ３０２９８（宝酒造製）０．５μｇに制限酵素Ｓａ
ｌ　　Ｉ　　（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃１時間反応させ
、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。

制限酵素を不活化するために６５℃で１０分間加熱処理
した後、前記Ｂ）項で調製した複製増殖ＤＮＡ断片と混
合し、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍ
Ｍ）リス緩衝液（ｐｆ１７．６　）、１０　　ｍＭ　Ｍ
ｇＣ１ｗ　、１０　　ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ及びＴ４リガーゼ１　ｕｎｉｔになるように各成
分を強化し、１６℃で１５時間保温した。

この溶液を用いてエシェリヒア・コ！Ｊ　ＪＭＩ　０９
コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は３０μｇ／＋ｙ＋ｊ！（最終濃度）のクロ
ラムフェニコール、１００μｇ　／　ｍｌ　（最終１１
度）ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド）、１００μｇ／ｍ１（最終濃度）Ｘ−ｇａｊ！（
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド）を含むし培地（トリプトン１０ｇ１
酵母エキス５ｇ５ＮａＣｊ！５ｇ、純水１１；ｐ８７．
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これら生育株のうち、白いコロニーで生育して来た
ものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−３ＤＳ法［
Ｔ、Ｍａｎｉａｔｌｓ、　Ｂ、　Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈＳ
Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　　”　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
　ｃｌｏｎｉｎｇ″（１９Ｂ２）　９０〜９１参照〕に
より抽出した。

抽出したＤＮＡ１　μｇに制限酵素Ｋｐｎ　Ｉ　、　Ｅ
！ｃｏＲＩ　　（５ｕｎｉｔｓ）を、３７℃、２時間反
応させ、プラスミドＤＮＡを完全に分解し、前記Ｃ）項
で調製した安定化ＤＮＡ断片２μｓと混合し、制限酵素
を不活化するために６５℃で１０分間加熱処理した後、
該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０［１１Ｍ
）リス緩衝液ｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣｆ！　２．
１０ｍＭジチオスレイトール、１＋ｎＭＡＴＰ及びＴａ
　リガーゼｌ　ｕｎｉｔになるように各成分を強化し、
１６℃で１５時間インキュベートした。この溶液を用い
てエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩコンピテントセル（宝
酒造製）を形質転換した。

形質転換株は５０Ｍｇ／＋＋＋１（最終濃度）のカナマ
イシンを含むし培地〔トリプトン１０ｇ１酵母エキス５
ｇ、　　ＮａＣ１５ｇ、純水１１、ｐＨ７，２１で３７
℃にて２４時間培養し、生育株として得られた。得られ
た生育株から各々プラスミドをアルカリ−３ＤＳ法［Ｔ
、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｂ、　Ｐ、Ｐｒ１ｔｓｃｈ　。

Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　　”　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　　ｃｌｏｎｉｎｇ　”　（１９Ｂ２）９０〜９１参照
〕により抽出した。

Ｆ）プラスミドベクターのコリネ型細菌への形質転換 形質転換には電気パルス法に用いた。ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ　２３３　（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７
）プラスミド除去株を１００ｍｊ！の前記Ａ培地で対数
増殖期初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍ
１になるように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心
分離により菌体を集め、菌体を２０ｍ１のパルス用溶液
［１ｍＭＨｅｐｅｓ　、　１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ　　
；　　ｐＨ７，２Ｅにて洗浄する。さらに菌体を遠心分
離にて集め、１　ｍｌのパルス用溶液に懸濁し０．１８
ｍＪの細胞と前記Ｄ）項で得られたＤＮＡ溶液２０ｍ１
を混合し、水中にて５分間静置する。シーンパルサー（
バイオラド社製）を用いて１２．５キロボルト、２５μ
ＦＤに認定し、パルスを印加後、全量を３０℃にて１時
間培養後、カナマイシン２５μｇ／＋ｎβ（最終濃度）
を含む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日培養す
る。出現したカナマイシン耐性株より、前記Ａ）項に記
載の方法を用いてプラスミドを得た。このプラスミドを
各種制限酵素で切断し、切断断片の大きさを測定した。

その結果は前記表４に示した。また切断点地図を第２図
に示した。

上記のプラスミドベクターを本発明者らはｐＣＲＹ３０
”と命名した。尚、本プラスミドベクターのクローニン
グサイトとして、Ｂａｍ１（Ｉサイト、ＥｃｏＲＩサイ
ト、Ｋｐｎ　Ｉサイト等が使用可能である。

実施例２ Ａ）プラスミドｐＢＹ５０２の調製 プラスミドｐＢＹ５０２は、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ２３３　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）から
新たに分離された大きさ約４５ｋｂのプラスミドである
（特開昭６３−３６７８７号明細書参照）。

プラスミドｐＢＹ５０２は次のようにして調製した。

半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２　ｇ、　（Ｎ）１４）
２ＳＯ４７ｇ、に２１１ＰＯ４０，５ｇ　、　ＫＩＩｚ
ＰＯ４０，５ｇ　５Ｍｇ５Ｌ０、５　ｇ、　Ｆｅ５Ｏｓ
　　・７Ｈ２０６ｍｇ５Ｍｎ５０，４〜６Ｌ０６■、酵
母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ１ビチオン２００μ
ｇ１塩酸チアミン２００μｇ１グルコース２０ｇ１純水
１ｊ）１１に、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３
３　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期
まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０■／ｃ
ｎｌの濃度にリゾチームを含む緩衝液［：２５ｍＭ）リ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１０　＋ｎＭ　
　ＢＤＴ＾、５０　［１１Ｍグルコース）２０ｍｊ！に
懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反応液にアルカＩ
Ｊ　−Ｓ　Ｄ　Ｓ液［０，２Ｎ　ＮａＯＨ、１％（ｗ／
ｖ）　５ＤＳＩ　４０　ｔｎｌを添加し、緩やかに混和
して室温にて１５分間静置した。

次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸カリウ
ム溶液６０ｍ１、酢酸ＩＬ、５ｍｌ、純水２８．５ｍｊ
！の混合液１３０ｍｊ！を添加し、充分混和してから氷
水中に１５分間静置した。

溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分間、１５．０
００　Ｘ　ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た。

これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノール
／クロロホルム１／１混和液）を加え懸濁液、遠心管に
移し、室温下で５分間、１５．０００　Ｘｇの遠心分離
にかけ、水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを
加え、−２０℃で１時間静置後、４℃で１０分間、１５
．０ＯＯＸ　ｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収した。

沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液〔トリス１０ｍＭ５ＥＤ
ＴＡ、１　ｍＭ、ＨＣｊ！にてｐＨ８，０に調整〕２　
ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液〔５倍濃度
のＴＥ緩衝液１００ｍ１に塩化セシウム１７０ｇを溶解
させた液〕１５ｆｆ１１と１０■／ｍｌｌエチジウムブ
ロマイド溶液１　ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／
ｍｉに合わせた。この溶液を１２０℃で４２時間、１１
６．０００　Ｘｇの遠心分離を行なった。

プラスミドｐＢＹ５０２は紫外線照射により遠心管内で
下方のバンドとして見い出される。このバンドを注射器
で遠心管の側面から抜きとることにより、プラスミドｐ
ＢＹ５０２を含む分画液を得た。

次いでこの分画液を当量のイソアミルアルコールで４回
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後Ｔ
ＥＨ衝液に対して透析を行なった。

このようにして得られたプラスミドｐＢＹ５０２を含む
透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに
添加した後、２倍量のエタノールを加え、−２０℃１時
間静置した。この溶液を１５．０００ｘｇの遠心分離に
かけてＤＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０２を約
２０μｇ得た。

Ｂ）プラスミドｐＢＹ５０２上の複製増殖機能を担うＤ
ＮＡ領域（複製増殖ＤＮＡ断片）の調製 上記Ａ）項で得たプラスミドｐＢＹ５０２　　ＤＮＡ２
０．ｕｇに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩ（各々
２０　ｕｎｉｔｓ）を３７℃２時間反応させ、プラスミ
ドＤＮＡを完全に分解した。該分解物を０．８％のアガ
ロースゲル電気泳動にて分離し約３．６　ｋｂのＤＮＡ
画分をゲルから切り出した。該両分からＤＮＡを抽出、
精製し約５μｇのＤＮＡを得た。

Ｃ）プラスミドｐＢＹ５０３上の安定化機能に関与する
遺伝子を含むＤＮＡ領域（安定化ＤＮＡ断片）の調製 前記実施例１のＡ）項で得たプラスミドｐＢＹ５０３　
　ＤＮＡ２０μｇに制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａｌ（各
々２０　ｕｎｉｔｓ）を３７℃２時間反応させ、プラス
ミドＤＮＡを完全に分解した。該分解物を０．８％のア
ガロースゲル電気泳動にて分離し約１、５　ｋｂのＤＮ
Ａ画分をゲルから切り出した。該両分からＤＮＡを抽出
精製し約５μｇのＤＮＡを得た。

Ｄ）プラスミドｐＨ３０３９８の準備 プラスミドｐＨ３０３９８は、エシェリヒア・コリ内で
複製し、クロラムフェニコール耐性を発現する大きさ２
２２８ｂｐのプラスミドであり、市販品として全酒造よ
り購入可能である。

Ｅ）プラスミドベクターｐＣＲＹ２０の造成プラスミド
ｐＨ３Ｇ３９８　（全酒造製）０．５μｇに制限酵素Ｋ
ｐｎ　Ｉ及びＸｂａＩ（各々５　ｕｎｉｔｓ）を３７℃
１時間反応させプラスミドＤＮＡを完全に分解した。制
限酵素を不活化するために６５℃で１０分間が熱処理し
た後、前記Ｃ）項で調製した安定化ＤＮＡ断片と混合し
、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭ）
！Ｊス緩衝液（ｐ）１７．６）　、１０　ｍＭ　ＭｇＣ
１＊　、１０　ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ
及びＴ、リガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化
し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエシ
ェリヒア・コリＪＭＩ　Ｏ９コンピテントセル（全酒造
製）を形質転換した。

形質転換株は３０μｓ／ｎ＋１（最終濃度）のクロラム
フェニコール、１００μｓ／ｍ１（最終濃度）ＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、１０
０．ＥＪｇ／　ｍｊ！　（最終濃度）Ｘ−ｇａｊ！　（
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド）を含むし培地（トリプトン１０ｇ１
酵母エキス５ｇＳ　ＮａＣ１５ｇ、純水１１、ｐ１１７
．２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得ら
れた。これら生育株のうち、白いコロニーで生育して来
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−３ＤＳ法
［ＴｏＭａｎｉａｔｉｓ。

Ｂ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ＳＪ、　Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋＳ”　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８
２）　９０〜９１参照〕により抽出した。

抽出したＤＮＡ１μ已に制限酵素旧ｎｄＩ［Ｉ（５ｕｎ
ｉｔｓ）を、３７℃２時間反応させ、プラスミドＤＮＡ
を完全に分解し、制限酵素を不活化するために６５℃で
１０分間加熱処理した。次に、前記Ｂ）項で調製した複
製増殖ＤＮＡ断片と混合し、最終濃度として、３３ｍＭ
）リス酢酸ｐＨ７，９，６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍ
Ｍ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭジチオスレイトール、
Ｃｈａｓｅ混合液（ｄ　ＮＴ　Ｐ　２　ｍＭ）　、及び
Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ１　ｕｎｉｔになるように各成
分を強化し、３７℃５分間加温した。攪拌によりＴ４ポ
リメラーゼを不活化した後、溶液中の成分が最終濃度と
して各々５０ｍＭ）リスＥｌ衝液ｐｔ（７，６，１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣｆ　ｘ、１０ｍＭジチオスレイトール、１　
ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ４リガーゼ１　ｕｎｉｔになるよ
うに各成分を強化し、１６℃で１５時間インキュベート
した。この溶液を用いてエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ
コンピテントセル（全酒造製）を形質転換した。

形質転換株は３０μｓ／ｍ１（最終濃度）のクロラムフ
ェニコールを含むし培地〔トリプトン１０ｇ１酵母エキ
ス５ｇ、ＮａＣ１５ｇ、純水ＩＣｐＨ７，２］で３７℃
にて２４時間培養し、生育株として得られた。得られた
生育株から各々プラスミドをアルカリ−３ＤＳ法［Ｔ、
Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ　、　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　　”　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ（１９ｇ２）　
９０〜９１参照〕により抽出した。

Ｆ）プラスミドベクター〇コリネ型細菌への形質転換 上記Ｄ）項で得られたプラスミドＤＮＡを用い、実施例
１のＥ）項の方法で形質転換株を得、プラスミドＤＮＡ
を取得した。このプラスミドを各種制限酵素で切断し分
子量を測定した。その結果を前記表５に示した。また、
切断点地図を第２図に示した。

上記のプラスミドベクターを本発明者らは、ｐＣＲＹ２
０’″と命名した。尚、本プラスミドは、クローニング
サイトとして、ＥｃｏＲＩサイト、Ｐｓｔ　Ｉサイト、
Ｋｐｎ　Ｉサイト等が使用可能である。

実施例３ 造成プラスミドベクターの安定性 実施例１及び２で得られた、プラスミドｐＣＲＹ３０及
びｐＣＲＹ２０を各々保持するブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ　２３３由来株をカナマイシン５０μｇ／ｍ
ｌｌ及びクロラムフェニコール５μｇ／ｆｆ１Ｉｌ含有
する半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２　ｇｌ（Ｎ）１４
）２ＳＯ４７ｇ　、　ＫＪＰＯａ　　０．５　ｇｌＫ）
＋２ＰＯ４０，５ｇＳＭｇＳＯ４０，５ｇＳＦｅＳＯａ
　　７）ＩＪ　　６１１ｇ’Ｍｎ５Ｌ　４〜６）１２０
６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ１ビオチ
ン２００μｇ１塩酸チアミン２００μｇ１グルコース２
０ｇ１純水１β〕１０ｍ１に３０℃にて１５時間培養す
る。上記Ａ培地に、１０　’ｃｅｌｌｓ／　ｍβとなる
様に植え継ぎ、非選択圧条件下で培養する。約１００世
代非選択圧条件下で培養した後、カナマイシン及びクロ
ラムフェニコール耐性を指標として、プラスミド保持株
数の割合を算出した。

なお、対照として、安定化ＤＮＡ断片を有しないプラス
ミドｐＣＲＹ２及びｐＣＲＹ３　（このプラスミドの造
成方法及び性質等については、特開平１−１９１６８６
号明細書参照）を各々保持するブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ　２３３由来株を、上記と同様に植えつぎ、
約１００世代培養し、プラスミド保持株数の割合を算出
した。

その結果を下記表６に示す。

表　　　６ プラスミド　　　　プラスミ ｐＣＲＹ２０　　　　　　１ ＣＲＹ２ ｃＲＹ３０ ＣＲＹ３ ド保持株（％） ０ く５ ００ く５

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＣＲＹ３０の構成及び制限酵素に
よる切断点地図であり、 第２図はプラスミドｐＣＲＹ２０の構成及び制限酵素に
よる切断点地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）コリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドを該細
   菌内において安定に保持させる機能に関与する遺伝子を
   含むＤＮＡ領域（ａ）と、コリネ型細菌内でプラスミド
   の複製増殖機能を担うＤＮＡ領域（ｂ）と、プラスミド
   マーカーとなりうる薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域（
   ｃ）とから成ることを特徴とするプラスミドベクター。 ２）コリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドを該細
   菌内において安定に保持させる機能に関与する遺伝子を
   含むＤＮＡ領域（ａ）が、ブレビバクテリウム・スタチ
   オニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭＢＰ−２５１５）が
   保有するプラスミドｐＢＹ５０３から制限酵素Ｋｐｎ
   I 及びＥｃｏＲ I により切り出される約２．１ｋｂの
   ＤＮＡ断片又は制限酵素Ｋｐｎ I 及びＸｂａ I により
   切り出される約１．７ｋｂのＤＮＡ断片である請求項１
   記載のプラスミドベクター。 ３）コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を担う
   ＤＮＡ領域（ｂ）が、ブレビバクテリウム・スタチオニ
   スＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭＢＰ−２５１５）が保有
   するプラスミドｐＢＹ５０３から制限酵素Ｘｈｏ I に
   より切り出される約４．０ｋｂのＤＮＡ断片又はブレビ
   バクテリウム・フラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１
   ４９７）が保有するプラスミドｐＢＹ５０２から制限酵
   素ＨｉｎｄIII及びＳｍａ I により切り出される約３．
   ６ｋｂのＤＮＡ断片である請求項１記載のプラスミドベ
   クター。 ４）プラスミドベクターがｐＣＲＹ３０及びｐＣＲＹ２
   ０である請求項１〜３記載のプラスミドベクター。