JPH0739382A - プラスミドベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 （ａ）プラスミドｐＢＹ５０３由来のコリネ
型細菌内でプラスミドの自律複製を司る機能に関与する
遺伝子を含むＤＮＡ断片であって、プラスミドのコピー
数を増加し得る変異点が該遺伝子内の少なくとも１カ所
に存在するＤＮＡ断片、（ｂ）プラスミドｐＢＹ５０３
由来のコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドを該
細菌内において安定に保持させる機能に関与する遺伝子
を含むＤＮＡ断片および（ｃ）プラスミドマーカーとな
りうる薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を保有すること
を特徴とするプラスミドベクター。 【効果】 本発明のプラスミドベクターは、コリネ型細
菌内に多コピー数で存在し、且つ宿主内に安定に維持さ
れるベクターであり、該ベクターに工業的に有用な遺伝
子を連結し、これにより形質転換されたコリネ型細菌を
用いることで、従来よりも高効率に有用微生物産物を生
産することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コリネ型細菌細胞内で
複製増殖し同細胞内において、多コピー数で存在し且つ
安定に保持されるプラスミドベクターに関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え技術において、プラスミド
ベクターは、有用な遺伝情報をコードする遺伝子ＤＮＡ
断片を宿主細胞内に導入し、それを宿主細胞内で安定に
複製させ、且つ有用遺伝子がコードする遺伝情報を発現
させるための有用遺伝子の運び手として極めて重要なも
のである。

【０００３】コリネ型細菌は、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
ｍ）等のアスパラギン酸等のアミノ酸を大量に生産する
ものを含み、工業的に極めて重要な微生物群である。こ
のようなコリネ型細菌を宿主とし、遺伝子組換え技術に
よりこれらのコリネ型細菌の有用物質の生産性を高める
ため、既にいくつかのプラスミドベクターが開発されて
いる（特開平３−２１０１８４号公報参照）。

【０００４】これらのプラスミドベクターはいずれもコ
リネ型細菌内で複製増殖するが、プラスミドのコピー数
が低く、有用遺伝子をさらに高発現させる場合には不適
合である。またプラスミドベクター自身のサイズが大き
いため、挿入される遺伝子のサイズが限定される。従っ
て、コリネ型細菌内に多コピー数で存在し、且つ宿主内
で安定に保持される小型のプラスミドベクターの開発が
望まれている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、コリネ型細菌細胞内で複製増殖しうるものであっ
て、宿主細胞内で多コピー数存在し且つ安定に保持さ
れ、以上に述べた特徴が損なわれないような有用遺伝子
の挿入部位が複数以上存在する、しかも小型のプラスミ
ドベクターを創製することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】叙上の課題を解決するた
め本発明者らは鋭意研究の結果、コリネ型細菌内で複製
増殖しうるブレビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ
１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）が保持するプ
ラスミドｐＢＹ５０３（特開平１−９５７８５号公報参
照）に由来するプラスミドの自律複製を司る機能に関与
するＤＮＡ領域を改変することにより、コリネ型細菌内
でプラスミドのコピー数の増加をもたらしうるＤＮＡ断
片を取得することができ、さらに該ＤＮＡ断片と本願発
明者らが先に提案したプラスミドｐＢＹ５０３由来のコ
リネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドを該細菌内に
おいて安定に保持させる機能に関与する遺伝子を含むる
ＤＮＡ断片（特開平２−２７６５７９号公報参照）と、
プラスミドマーカーとなりうる薬剤耐性遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片とを組合せることにより、コリネ型細菌内で多
コピー数で存在し、且つ宿主内で安定に保持されるプラ
スミドベクターが造成可能なことを見い出し、本発明を
完成するに至った。

【０００７】かくして本発明によれば、（ａ）プラスミ
ドｐＢＹ５０３由来のコリネ型細菌内でプラスミドの自
律複製を司る機能に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片で
あって、プラスミドのコピー数を増加し得る変異点が該
遺伝子内の少なくとも１カ所に存在するＤＮＡ断片、
（ｂ）プラスミドｐＢＹ５０３由来のコリネ型細菌内で
複製増殖可能なプラスミドを該細菌内において安定に保
持させる機能に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片および
（ｃ）プラスミドマーカーとなりうる薬剤耐性遺伝子を
含むＤＮＡ断片を保有することを特徴とするプラスミド
ベクターが提供される。

【０００８】本発明の上記プラスミドベクターは、複数
のクローニングサイトを有し、コリネ型細菌内で多コピ
ー数存在し、且つ該細菌内で安定に複製増殖する。この
プラスミドベクターに有用遺伝子を導入してコリネ型細
菌を形質転換することにより、工業的に有用なコリネ型
細菌の育種改良が可能である。以下、本発明のプラスミ
ドベクターについてさらに詳細に説明する。

【０００９】本発明のプラスミドベクターの造成に用い
る、（ａ）コリネ型細菌内でプラスミドの自律複製を司
る機能に関与する遺伝子（以下これを「自律複製遺伝
子」ということがある。）を含むＤＮＡ断片であって、
プラスミドのコピー数を増加し得る変異点が該遺伝子内
の少なくとも１カ所に存在するＤＮＡ断片（以下これを
「多コピー数自律複製ＤＮＡ断片」ということがあ
る。）とは、該ＤＮＡ断片を用いて造成されたプラスミ
ドベクターのコピー数を、変異点を有しない自律複製遺
伝子を含むＤＮＡ断片を用いて造成されたプラスミドベ
クターのコピー数と比較して、増加し得る作用を有する
ＤＮＡ断片を意味するものである。

【００１０】ここで、本明細書においては、コピー数と
いう術語は１細胞当たりのプラスミド分子数（プラスミ
ドの存在数）を意味し、多コピー数という術語はプラス
ミドｐＢＹ５０３またはｐＣＲＹ３のコピー数よりも多
いコピー数を意味する。上記の多コピー数自律複製ＤＮ
Ａ断片は、その塩基配列が決定された後においては合成
することも可能であるが、通常は、ブレビバクテリウム
・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔ
ａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２５１５）が保持する大きさ約１５ｋｂのプラスミドｐ
ＢＹ５０３（特開平１−９５７８５号公報参照）上に存
在するコリネ型細菌内で自律複製を司る機能に関与する
遺伝子を変異誘起処理して改変した後、コピー数の増加
がもたらされたプラスミドを適当な制限酵素で切断して
得られる切断断片の中から、分離および取得することが
できる。

【００１１】即ち、自律複製遺伝子を含むプラスミドｐ
ＢＹ５０３を適当な制限酵素で切断し、得られるＤＮＡ
断片を、マーカーとなり得る薬剤耐性遺伝子を有するベ
クタープラスミド、例えば、クロラムフェニコール耐性
遺伝子を有するｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）、カナマイ
シン耐性遺伝子を有するｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）ま
たはテトラサイクリン耐性遺伝子を有するｐＢＲ３２２
（宝酒造製）に、それ自体既知の常法により挿入し、こ
のベクタープラスミドを電気パルス法による形質転換に
より宿主コリネ型細菌に導入し（なお、宿主コリネ型細
菌および形質転換法等は後述のものと同様である）、得
られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡを、それ自体既
知の常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法等により抽出し、
適当な制限酵素で切断して解析することにより、挿入さ
れたｐＢＹ５０３由来の自律複製遺伝子を含むＤＮＡ断
片を確認することができる。

【００１２】このプラスミド保持株を、Ｘ線、γ線、ま
たは紫外線等で照射するか、あるいはＮ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異誘起剤に曝
した後に、各種濃度のマーカー薬剤による選択圧下で培
養して薬剤耐性濃度の上昇した菌株をプラスミドコピー
数の増加による遺伝子増幅効果が現れたものと見なして
選抜し、選抜株が保持するプラスミドのコピー数を解析
する。かくして得られる薬剤耐性およびプラスミドコピ
ー数が親株より上昇した菌株から組換えプラスミドを抽
出し、該プラスミドを適当な制限酵素で切断することに
より、多コピー数自律複製ＤＮＡ断片を得ることができ
る。

【００１３】ここで、コピー数の解析は、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５２，ｐ７２
２（１９８２）に記載の方法に従い、細胞より染色体Ｄ
ＮＡおよびプラスミドＤＮＡを抽出し、双方の分子数の
比を求めることにより行うことができる。

【００１４】上記手法により得られる多コピー数自律複
製ＤＮＡ断片としては、前記プラスミドｐＣＲＹ３を保
持するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ＧＥ
１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１３）をＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで処理すること
により得られる、クロラムフェニコール耐性濃度が上昇
し、かつプラスミドコピー数が約２倍に増加した菌株で
あるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ｃｏｐ
１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６１９）および同ＭＪ２３３
ｃｏｐ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６２０）からそれぞれ得
られるプラスミドｐＣＯＰ１およびｐＣＯＰ２を制限酵
素ＫｐｎＩで切断して得られる、大きさ約６．０ｋｂの
ＤＮＡ断片が挙げられる。

【００１５】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」という術語は、ＤＮＡ断片またはプラス
ミドを過剰の制限酵素の存在下に完全分解して得られる
分解物を、それ自体既知の方法に従い１％アガロースゲ
ル電気泳動および４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供したときに分離可能な断片の数から決定した値を意
味する。

【００１６】また、「切断断片の大きさ」という術語
は、１％アガロースゲル電気泳動を用いる場合にはエシ
エリヒア・コリのλファージのＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄIIIで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片を試
料と同時に泳動して得られる標準線に基づき、また、４
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合にはエ
シエリヒア・コリのφｘ１７４ファージのＤＮＡを制限
酵素ＨａｅIII で切断して得られる分子量既知のＤＮＡ
断片を試料と同時に泳動して得られる標準線に基づき、
切断ＤＮＡ断片の大きさをそれぞれ算出して決定するこ
とができる。また、「プラスミドの大きさ」は、前記
「切断断片の大きさ」を決定する手法によりプラスミド
の各ＤＮＡ断片の大きさを決定し、それを加算すること
で求めることができる。なお、各ＤＮＡ断片の大きさの
決定においては、１ｋｂ以上の断片の大きさついては１
％アガロースゲル電気泳動の結果を採用し、１ｋｂ未満
の断片の大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動の結果を採用した。

【００１７】このようにして大きさが決定されたＤＮＡ
断片を上記泳動ゲルより抽出することにより、特定の大
きさを有するＤＮＡ断片を取得することができる。上記
プラスミドｐＣＯＰ１およびｐＣＯＰ２を制限酵素Ｋｐ
ｎＩで切断して得られる大きさ約６．０ｋｂの多コピー
数自律複製ＤＮＡ断片を各種の制限酵素で切断して得ら
れる認識部位数および切断断片の大きさは、両プラスミ
ドにおいて同一であり、その値を下記表１に示す。

【００１８】

【表１】 表 １ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＳｍａＩ １ １．３，４．７ ＸｈｏＩ ２ １．６，４．０，０．４ ＳｐｈＩ ２ ３．６，１．７，０．７

【００１９】上記表１に示した、前記大きさ約６．０ｋ
ｂのＫｐｎＩ切断断片をＸｈｏＩで切断して得られる大
きさ約４．０ｋｂのＤＮＡ断片、およびＨｈａＩで切断
して得られる大きさ約１．８ｋｂのＤＮＡ断片は、双方
共に多コピー数自律複製機能を有していることが確認さ
れており、従って、これらのＤＮＡ断片も多コピー数自
律複製ＤＮＡ断片として用いることができる。

【００２０】以上の如く、自律複製遺伝子または多コピ
ー数自律複製遺伝子は、プラスミドｐＢＹ５０３、ｐＣ
ＲＹ３、ｐＣＯＰ１またはｐＣＯＰ２を制限酵素Ｘｈｏ
Ｉで切断することにより得られる大きさ約４．０ｋｂの
ＤＮＡ断片、および同プラスミドを制限酵素ＨｈａＩで
切断して得られる大きさ約１．８ｋｂのＤＮＡ断片中に
含まれているものと考えられる。

【００２１】上記プラスミドｐＣＯＰ１およびｐＣＯＰ
２を制限酵素ＸｈｏＩで切断して得られる大きさ約４．
０ｋｂのＤＮＡ断片をさらに各種制限酵素で切断したと
きの認識部位数および切断断片の大きさは、両プラスミ
ドにおいて同一であり、その値を下記表２に示す。

【００２２】

【表２】 表 ２ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＰｓｔＩ ２ ０．９，０．８，２．３ ＳｐｈＩ ２ ２．０，１．７，０．３

【００２３】また、上記ｐＣＯＰ１およびｐＣＯＰ２を
制限酵素ＨｈａＩで切断して得られる大きさ約１．８ｋ
ｂのＤＮＡ断片をさらに各種制限酵素で切断したときの
認識部位数および切断断片の大きさも、両プラスミドに
おいて同一であり、その値を下記表３に示す。また、こ
れら多コピー数自律複製ＤＮＡ断片の制限酵素切断点地
図を図１に示す。

【００２４】

【表３】 表 ３ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＰｓｔＩ １ ０．４，１．４ ＳｐｈＩ １ ０．７，１．１ ＳｐｅＩ １ １．３，０．５

【００２５】一方、プラスミドｐＣＯＰ１およびｐＣＯ
Ｐ２を制限酵素ＨｈａＩで切断して得られる大きさ約
１．８ｋｂの多コピー数自律複製遺伝子を含むＤＮＡ断
片、ならびにプラスミドｐＢＹ５０３およびｐＣＲＹ３
を制限酵素ＨｈａＩで切断して得られる大きさ約１．８
ｋｂの自律複製遺伝子を含むＤＮＡ断片については、そ
の塩基配列をプラスミドｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９を
用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ
ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏ
ｄ，Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３，１９７７）に
より決定することができる。

【００２６】このようにして得られる、プラスミドｐＢ
Ｙ５０３およびｐＣＲＹ３から得られる自律複製遺伝子
またはプラスミドｐＣＯＰ１およびｐＣＯＰ２から得ら
れる多コピー数自律複製遺伝子を含む１．８ｋｂのＤＮ
Ａ断片の塩基配列は、１８９７塩基対より構成されてお
り、その中に２６１個のアミノ酸をコードする７８３塩
基対よりなるオープン・リーディング・フレーム（ＯＲ
Ｆ）が存在していた。またプラスミドｐＢＹ５０３およ
びｐＣＲＹ３からそれぞれ得られる大きさ約１．８ｋｂ
の自律複製ＤＮＡ断片は同一の塩基配列を有していた
（以下これを「野生型の配列」と言うことがある）。

【００２７】一方、プラスミドｐＣＯＰ１から得られた
ＤＮＡ断片の配列では野生型の配列の１３０７番目のグ
アニン（Ｇ）がアラニン（Ａ）に変異することによりコ
ードするアミノ酸がアルギニン（Ａｒｇ）からヒスチジ
ン（Ｈｉｓ）に変換され、またプラスミドｐＣＯＰ２か
ら得られたＤＮＡ断片の配列では野生型の配列の１５７
７番目のＧがＡに変異することによりコードするアミノ
酸がグリシン（Ｇｌｙ）からアスパラギン酸（Ａｓｐ）
に変換されていることが明らかとなった。

【００２８】かくして、後記配列表の配列番号：１に示
す塩基配列もまた本願発明でもちいる多コピー数自律複
製ＤＮＡ断片として使用することができる。なお、配列
番号：１に示した配列においてｐＣＯＰ１から得られる
配列は、塩基配列１３０７番目のＲがＡ、１５７７番目
のＲがＧであり、アミノ酸配列１２９番目のＸｘｘがＨ
ｉｓ、２１９番目のＺｚｚがＧｌｙである。またｐＣＯ
Ｐ２から得られる配列は、塩基配列１３０７番目のＲが
Ｇ、１５７７番目のＲがＡであり、アミノ酸配列１２９
番目のＸｘｘがＡｒｇ、２１９番目のＺｚｚがＡｓｐで
ある。さらに野生型の配列は、塩基配列１３０７番目お
よび１５７７番目のＲがともにＧであり、アミノ酸配列
２１９番目のＸｘｘがＡｒｇ、２１９番目のＺｚｚがＧ
ｌｙである。

【００２９】上記した後記配列表の配列番号：１に示し
た多コピー数自律複製ＤＮＡ断片は、プラスミドｐＣＯ
Ｐ１およびｐＣＯＰ２から単離されたもののみならず、
通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライドバイ
オシステムズ社製Ｍｏｄｅｌ３７３Ａを用いて合成され
たものであってもよい。また、配列番号：１に示した配
列を有する多コピー数自律複製ＤＮＡ断片は、多コピー
数自律複製機能を実質的に損なうことがない限り、塩基
配列の一部の塩基が他の塩基で置換されていてもよく、
あるいは新たに塩基が挿入されていてもよく、また一部
の塩基が欠損していてもよく、これら誘導体のいずれも
が、多コピー数自律複製ＤＮＡ断片として使用可能であ
る。

【００３０】次に、本発明のプラスミドベクターの造成
に用いる、（ｂ）プラスミドｐＢＹ５０３由来のコリネ
型細菌内で複製増殖可能なプラスミドを該細菌内におい
て安定に保持させる機能に関与する遺伝子を含むＤＮＡ
断片（以下これを「安定化ＤＮＡ断片」ということがあ
る。）は、その塩基配列が決定されており（特開平２−
２７６５７９号公報参照）合成することも可能である
が、通常は、前記したブレビバクテリウム・スタチオニ
スＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）が保
持するプラスミドｐＢＹ５０３上に存在し、このプラス
ミドｐＢＹ５０３を、例えば制限酵素ＫｐｎＩで分解
し、分解物を０．８％アガロースゲル電気泳動により分
離して、大きさ約７．４ｋｂのＫｐｎＩ断片をゲルより
抽出する。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩおよ
びＨｉｎｄIII で切断し、０．８％アガロースゲル電気
泳動により分離して大きさ約１．１ｋｂのＤＮＡ断片
（ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII 切断）をゲルより抽出し、こ
れを安定化ＤＮＡ断片として用いることができる。

【００３１】さらに、本発明のプラスミドベクターの造
成に用いる、（ｃ）プラスミドマーカーとなりうる薬剤
耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下これを「薬剤耐性遺
伝子ＤＮＡ断片」と言うことがある。）としては、宿主
コリネ型細菌内で発現し、宿主に薬剤耐性能を付与する
ことができ、その薬剤耐性能によりプラスミドの存在が
検出可能なものであれば特に制限はなく、プラスミドベ
クター内に１種類でも複数存在していても良い。上記薬
剤耐性遺伝子ＤＮＡ断片の具体例としては、例えば、ク
ロラムフェニコール耐性遺伝子を有するｐＨＳＧ３９８
（宝酒造製）、カナマイシン耐性遺伝子を有するｐＨＳ
Ｇ２９８（宝酒造製）、テトラサイクリン耐性遺伝子を
有するｐＢＲ３２２（宝酒造製）等を適当な制限酵素で
切断することによって得られるＤＮＡ断片を挙げること
ができる。

【００３２】本発明において新規に提供されるプラスミ
ドベクターは、以上に詳述した、（ａ）多コピー数自律
複製ＤＮＡ断片、（ｂ）安定化ＤＮＡ断片、（ｃ）薬剤
耐性遺伝子ＤＮＡ断片の３つの必須ＤＮＡ断片を保有す
るものである。本発明のプラスミドベクターの造成は、
上記した３つの必須ＤＮＡ断片を前記で詳述した方法に
より調製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用させて順次ＤＮ
Ａ断片を結合することにより容易に行うことができる。

【００３３】本発明により提供されるプラスミドベクタ
ーの好適具体例としては、前記した３つのＤＮＡ断片か
ら実質的になり、大きさ約４．１ｋｂのプラスミドで、
本発明者らがそれぞれｐＫＰＲ−１およびｐＫＰＲ−２
と命名したプラスミドを挙げることができる。プラスミ
ドｐＫＰＲ−１およびｐＫＰＲ−２を各種の制限酵素で
切断したときの認識部位数および切断断片の大きさは、
両プラスミドにおいて同一であり、その値を表４に、制
限酵素切断点地図を図２に示す。

【００３４】

【表４】 表 ４ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＫｐｎＩ １ ４．１ ＢａｍＨＩ １ ４．１ ＥｃｏＲＩ １ ４．１ ＥｃｏＲＶ １ ４．１ ＸｈｏＩ ２ ２．９，１．２

【００３５】以上に述べた本発明のプラスミドベクター
ｐＫＰＲ−１およびｐＫＰＲ−２は、例えば以下に示す
方法で調製することができる。

【００３６】前記したプラスミドｐＣＯＰ１及びｐＣＯ
Ｐ２上の大きさ約１．８ｋｂの多コピー数自律複製ＤＮ
Ａ断片をそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩの切断部位を有する
プライマーと制限酵素ＸｈｏＩの切断部位を有するプラ
イマーを用いてＰＣＲ法〔Ｎａｔｕｒｅ，３２４，１６
３（１９８６）〕により増幅させて、ＫｐｎＩ−Ｘｈｏ
Ｉの断片として調製する。一方、前記の様に調製した大
きさ約１．１ｋｂの安定化ＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ−Ｈｉ
ｎｄIII 断片）とをＴ４ＤＮＡリガーゼによって結合
し、適当なクローニングサイトを持つベクター、例えば
大腸菌プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ストラタ
ジーン社製）のＫｐｎＩ，ＨｉｎｄIII サイトに導入す
る。作製したプラスミドのＳｍａＩサイトにカナマイシ
ン耐性遺伝子（ファルマシア製）を平滑末端化処理して
導入する。構築したプラスミドより、コピー数自律複製
ＤＮＡ断片、安定化ＤＮＡ断片およびカナマイシン耐性
遺伝子ＤＮＡ断片を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ
で切断し、取得する。次に、ＤＮＡ合成装置（アプライ
ドバイオシステムズ社製３７３Ａ）により作製したＫｐ
ｎＩ−ＢａｍＨＩリンカー〔ｄ（ＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴ
ＣＣ）〕をＴ₄ リガーゼにより、上記のＫｐｎＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片に結合させ、ｐＣＯＰ１及びｐＣＯＰ２にそ
れぞれ由来する多コピー数自律複製ＤＮＡ断片を有する
プラスミドベクターｐＫＰＲ−１及びｐＫＰＲ−２を調
製することができる。

【００３７】かくして造製されるプラスミドベクターｐ
ＫＰＲ−１およびｐＫＰＲ−２は、有用遺伝子のクロー
ニングサイトとしてＥｃｏＲＩサイト、ＥｃｏＲＶサイ
ト、ＫｐｎＩサイト、ＢａｍＨＩサイト等を有してお
り、諸種の目的遺伝子のクローニングが可能である。本
発明の多コピー数自律複製ＤＮＡ断片および安定化ＤＮ
Ａ断片を保有するコリネ型細菌で安定に多コピー数で自
律複製可能なプラスミドベクターには、種々の産業上有
用な物質をコードする構造遺伝子等を含むＤＮＡ断片を
組み込むことができる。従って、本発明のプラスミドベ
クターを有用遺伝子等で組換えたプラスミドを宿主微生
物に導入して培養することにより、該有用遺伝子でコー
ドされた有用物質を効率よく工業的に生産することが可
能となる。

【００３８】本発明のプラスミドベクターに組み込みう
る有用な構造遺伝子等を含むＤＮＡとしては、例えば、
アスパルターゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．１）をコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片；少なくともトリプトファン
シンターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２０）遺伝子をコー
ドする遺伝子（ｔｒｐＡとｔｒｐＢ）と該遺伝子の発現
を制御するプロモーターおよびオペレーターとを含むＤ
ＮＡ断片；スレオニン生合成遺伝子またはイソロイシン
生合成遺伝子等のアミノ酸生合成遺伝子を含むＤＮＡ断
片等が挙げられる。

【００３９】本発明の前記プラスミドベクターに上記有
用遺伝子を組み込んだプラスミドベクターで形質転換し
得る宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えば、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３
３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＡＢＴ−１１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９９）等が挙げられる。

【００４０】なお、上記ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８の菌
株はＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株としてＤＬ
−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノール
資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公報参
照）。また、ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００の菌株はＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９７の菌株を親株としたＬ−α−アミノ
酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株である（特開昭６
２−５１９９８号公報参照）。さらに、ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９９の菌株はＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を
親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異
株である（特開昭６１−１７７９９３号公報参照）。

【００４１】上記微生物の他に、ブレビバクテリウム・
アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａ
ｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣ
Ｃ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリ
ウム・デバリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄ
ｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ４０２０、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ
１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）
ＡＴＣＣ３１８３０等を宿主微生物として用いることも
できる。

【００４２】なお、宿主としてブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が保
持するプラスミドｐＢＹ５０２のために形質転換が困難
となる場合があるので、そのような場合には、本菌株よ
りプラスミドｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。
プラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠落させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
〔Ｂａｃｔ．Ｒｅｖ．３６，ｐ．３６１−４０５（１９
７２）参照〕。

【００４３】上記宿主微生物の前記組換えプラスミドベ
クターによる形質転換は、それ自体既知の方法、例え
ば、Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，ｐ
１５９（１９９０）（宿主微生物にパルス波を通電する
方法）；Ｃａｌｖｉｎ，Ｎ．Ｍ．およびＨａｎａｗａｌ
ｔ，Ｐ．Ｃ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ，１７０，２７９６（１９８８）；Ｉｏｏ，
Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｔ．およびＩｚａｋｉ，Ｋ．，
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２，２９３（１９８８）
等の文献に記載の方法により行うことができる。

【００４４】次に実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。当然ながら、下記実施例は本発明について具
体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、本
発明の範囲を何ら限定するものではない。

【００４５】

【実施例】

参考例１プラスミドｐＢＹ５０３とプラスミドｐＨＳＧ３９８と
からなる複合プラスミドｐＣＲＹ３の造成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉ
ｏｎｉｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトン（約１５
ｋｂ）のプラスミドであり、その詳細は特開平１−９５
７８５号公報に記載されている。プラスミドｐＢＹ５０
３は以下の方法にて調製した。

【００４６】半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、硫酸
アンモニウム７ｇ、リン酸−カリウム０．５ｇ、リン酸
二カリウム０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＭｎＳＯ₄
・４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ６ｍ
ｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２
００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ
を蒸留水に溶解して１リットルとする（ｐＨ７．４）〕
１リットルにてブレビバクテリウム・スタチオニスを対
数増殖期後期まで培養して菌体を集めた。得られた菌体
をリゾチーム１０ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する緩衝液〔組
成：２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース〕２０ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反応液にアル
カリーＳＤＳ液〔組成：０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％（Ｗ
／Ｖ）ＳＤＳ〕４０ｍｌを添加し、緩やかに混和して室
温にて１５分間静置した。

【００４７】次に、この反応液に酢酸カリウム水溶液
〔組成：５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１．５
ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌの混合液〕３０ｍｌを添加
し、充分混和してから、氷水中に１５分間静置した。溶
菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分間、１５，００
０×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た。

【００４８】これに等量のフェノール／クロロホルム
（１：１、ｖ／ｖ）混和液を添加して懸濁した後、全量
を遠心管に移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇの
遠心分離にかけ、水層を得た。該水層に２倍量のエタノ
ールを添加し、−２０℃で１時間静置した後、４℃で１
０分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、その沈殿
を回収した。

【００４９】得られた沈殿を減圧乾燥した後、ＴＥ緩衝
液〔１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ；塩酸にてｐＨ
８．０に調整〕２ｍｌに溶解した。この溶解液に塩化セ
シウム溶液〔組成：５倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに
塩化セシウム１７０ｇを溶解させた液〕１５ｍｌと１０
ｍｇ／ｍｌエチジウム・ブロマイド溶液１ｍｌを添加し
て該液の密度を１．３９２ｇ／ｍｌに調節した。この溶
液を１２℃で４２時間、１１６，０００×ｇの遠心分離
にかけた。遠心後、プラスミドｐＢＹ５０３は、紫外線
照射により遠心管内の下方に存在するバンドとして見い
だされる。このバンドを、滅菌済みプラスチック製注射
器で遠心管の側面から抜き出すことにより、プラスミド
ＤＮＡを含む分画液を得た。

【００５０】次いでこの分画液を等量のイソアミルアル
コールで４回処理してエチジウム・ブロマイドを抽出除
去し、その後ＴＥ緩衝液に対して透析を行った。このよ
うにして得られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む透析液
に、最終濃度が３０ｍＭとなるように３Ｍ酢酸ナトリウ
ム溶液を添加した後、２倍量のエタノールを添加して−
２０℃で１時間静置した。この溶液を１５，０００×ｇ
の遠心分離にかけてＤＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢ
Ｙ５０３のＤＮＡ約５０μｇを回収した。

【００５１】（Ｂ）プラスミドｐＨＳＧ３９８の準備 プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）はコリネ型細菌
内で複製せず、大腸菌内で複製してクロラムフェニコー
ル耐性を発現する、大きさ約２．２ｋｂのプラスミドで
あり、市販品として宝酒造より購入可能である。

【００５２】（Ｃ）複合プラスミドｐＣＲＹ３の造成 前記プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）０．５μｇ
を、制限酵素ＫｐｎＩ５ｕｎｉｔｓと３７℃で１時間反
応させて該プラスミドＤＮＡを完全分解した。前記
（Ａ）で調製したプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡ ２μ
ｇを制限酵素ＫｐｎＩ １ｕｎｉｔと３７℃で３０分間
反応させて該プラスミドＤＮＡを部分分解した。両者の
プラスミドＤＮＡ分解物を混合し、６５℃で１０分間加
熱処理して制限酵素を不活性化させた後、該混合液にそ
れぞれの最終濃度が５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ ＡＴＰ、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕ
ｎｉｔとなるように各成分を添加して強化し、１６℃で
約１５時間インキュベートした。この溶液を用いて、大
腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社製）を製造
者のマニュアルに従い形質転換した。

【００５３】得られた形質転換株は、３０μｇ／ｍｌ
（最終濃度）クロラムフェニコール、１００μｇ／ｍｌ
（最終濃度）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を含むＬ培地〔組成：ト
リプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
を蒸留水に溶解して１リットルとした液（ｐＨ７．
２）〕で３７℃にて２４時間培養し、培地上に白いコロ
ニーとして生育した株をそれぞれ独立に選抜し、各々の
プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”，ｐ９０−９
１（１９８２）参照〕により抽出した。

【００５４】（Ｄ）複合プラスミドのコリネ型細菌への
形質転換 形質転換には電気パルス法を用いた。ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）
プラスミド除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖
期初期まで培養した後、ペニシリンＧを１ｕｎｉｔ／ｍ
ｌとなるように添加してさらに２時間浸透培養した。培
養菌体を遠心分離にて集め、２０ｍｌのパルス用溶液
〔組成：２７２ｍＭシュークロース、７ｍＭ ＫＨ₂ Ｐ
Ｏ₄ 、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ；ｐＨ７．４〕にて洗浄し
た。再度、遠心分離にて菌体を集め、５ｍｌのパルス用
溶液に懸濁し、０．７５ｍｌの細胞と前記（Ｃ）で得ら
れたＤＮＡ溶液５０ｍｌとを混合し、氷中にて２０分間
静置した。ジーンパルサー（バイオラド社製）を用い
て、２５００ボルト２５μＦＤに設定し、パルスを印加
後中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に
移し、３０℃にて１時間培養後、クロラムフェニコール
３μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌
して３０℃で２〜３日間培養し、出現したクロラムフェ
ニコール耐性株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３ ＧＥ１０２と命名し、この形質転換株より上記
（Ａ）に記載の方法を用いてプラスミドを得た。このプ
ラスミドを各種制限酵素で切断し、得られた切断断片の
大きさを測定した。その結果を下記表５に示す。

【００５５】

【表５】 表 ５ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＫｐｎＩ ２ ６．０，２．２ ＳａｕＩ １ ８．２ ＢａｍＨＩ １ ８．２ ＰｓｔＩ ２ ５．７，２．５

【００５６】上記制限酵素の切断断片により特徴付けら
れるプラスミドを“ｐＣＲＹ３”と命名した。上記表５
から明らかな如く、前記プラスミドｐＣＲＹ３を制限酵
素ＫｐｎＩで切断することにより、プラスミドｐＨＳＧ
３９８に由来する大きさ２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え
て、プラスミドｐＢＹ５０３に由来する大きさ６．０ｋ
ｂの自律複製遺伝子を含むＤＮＡ断片が確認された。な
お、複合プラスミドｐＣＲＹ３により形質転換されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ＧＥ１０２
は、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２
５１３としてブタペスト条約に基いて国際寄託されてい
る。

【００５７】実施例１プラスミドｐＣＲＹ３からの変異型多コピー数プラスミ
ドの取得 （Ａ）クロラムフェニコール高濃度耐性株の取得 プラスミドｐＣＲＹ３で形質転換されたブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ２３３ ＧＥ１０２（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２５１３）株を３００μｇ／ｍｌのＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンに３０℃で３０
分間曝す変異誘発処理を行った。次に半合成Ａ培地〔組
成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄
０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５
ｇ、ＦｅＳＯ ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ・４〜
６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５
ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グ
ルコース２０ｇを蒸留水に溶解して１リットルとする〕
にクロラムフェニコールを６μｇ／ｍｌ添加した培地を
用い、３３℃で５時間培養した。得られた培養菌体を、
クロラムフェニコールを３６μｇ／ｍｌ、寒天を１５ｇ
／ｌ含有する半合成Ａ培地に塗抹して培養し、クロラム
フェニコール高濃度耐性株を選抜して２株のクロラムフ
ェニコール高濃度耐性株を得た。

【００５８】前記クロラムフェニコール高濃度含有培地
上で生育可能な変異株を、それぞれブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ２３３ ｃｏｐ１、同ＭＪ２３３ ｃｏ
ｐ２と命名した。

【００５９】（Ｂ）プラスミドコピー数の確認 上記（Ａ）にて得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３ ｃｏｐ１および同ＭＪ２３３ ｃｏｐ２、なら
びにプラスミドｐＣＲＹ３を保有する同ＭＪ２３３ Ｇ
Ｅ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１３）を、前記半合成
Ａ培地で対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得
られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む
緩衝液〔組成：２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコー
ス〕２０ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反
応液にアルカリ−ＳＤＳ液〔組成：０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ〕を４０ｍｌ添加し、緩やか
に混和して室温にて１５分間静置した。次に、この反応
液に酢酸カリウム水溶液〔組成：５Ｍ酢酸カリウム溶液
６０ｍｌ、酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌの混
合液〕３０ｍｌを添加し、充分混和してから、氷水中に
１５分間静置した。

【００６０】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール／クロロホルム（１：１、
ｖ／ｖ）混和液を添加して懸濁した後、全量を遠心管に
移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇの遠心分離に
かけ、水層を得た。該水層に２倍量のエタノールを添加
し、−２０℃で１時間静置した後、４℃で１０分間、１
５，０００×ｇの遠心分離にかけ、ＤＮＡの沈殿を回収
した。

【００６１】得られた沈殿を減圧乾燥した後、ＴＥ緩衝
液〔組成：１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ；塩酸にて
ｐＨ８．０に調整〕２ｍｌに溶解した。以上のようにし
て抽出したプラスミドおよび染色体ＤＮＡをそれぞれ
０．８％アガロースゲル電気泳動により分離した。次
に、泳動ネガフィルムをデンシトメーターにかけ、染色
体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡの割合を測定し、染色体Ｄ
ＮＡの分子量を３．０×１０⁹ ダルトン、プラスミドの
分子量を５．４×１０³ ダルトン（８．２ｋｂ）とし
て、プラスミドコピー数を算出した。

【００６２】その結果、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ２３３ｃｏｐ１および同ＭＪ２３３ｃｏｐ２には１
０〜１２コピーのプラスミドが存在し、同ＭＪ２３３Ｇ
Ｅ１０２には５〜６コピーのプラスミド（ｐＣＲＹ３）
が存在することが判明した。

【００６３】（Ｃ）大きさ約６．０ｋｂの多コピー数自
律複製ＤＮＡ断片の取得 参考例１（Ａ）と同様の方法により、前記（Ａ）で得た
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ｃｏｐ１お
よび同ＭＪ２３３ ｃｏｐ２からプラスミドを抽出し、
これを各種制限酵素で切断してその切断断片の大きさを
測定した。その結果、両株から得られたプラスミドの制
限酵素による認識部位数および切断断片の大きさは同一
であり、前記表５に示したプラスミドｐＣＲＹ３の値と
一致した。

【００６４】上記の如く、菌体当たり１０〜１２のコピ
ー数で存在し、かつ表５に示した制限酵素による認識部
位数および切断断片の大きさを有することで特徴付けら
れ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ｃｏｐ
１より得られるプラスミドを“ｐＣＯＰ−１”、また同
ＭＪ２３３ ｃｏｐ２より得られるプラスミドを“ｐＣ
ＯＰ−２”と、それぞれ命名した。

【００６５】次に、プラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣ
ＯＰ−２から制限酵素ＫｐｎＩで大きさが約６．０ｋｂ
の多コピー数自律複製ＤＮＡ断片を切り出し、このＤＮ
Ａ断片を各種の制限酵素で切断し、切断断片の大きさを
求めた。その結果、両プラスミドから得られたＤＮＡ断
片の制限酵素認識部位数および切断断片の大きさは同一
であり、前記表１に示したとおりであった。

【００６６】なお、プラスミドｐＣＯＰ−１を保有する
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ｃｏｐ１、お
よびプラスミドｐＣＯＰ−２を保有する同ＭＪ２３３ｃ
ｏｐ２は、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術
院生命工学工業技術研究所に、平成５年４月２７日付
で、それぞれ受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３６１９およ
び受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３６２０として寄託され
ている。

【００６７】実施例２大きさ約４．０ｋｂの多コピー数自律複製ＤＮＡ断片の
クローニング 実施例１で調製したプラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣ
ＯＰ−２のコリネ型細菌内で多コピー数で自律複製し得
る機能を担う遺伝子領域を特定化するために、両プラス
ミドが有する約６．０ｋｂの自律複製ＤＮＡ断片を更に
縮小化した。以下の操作は全て、両プラスミドについて
各々独立に行った。

【００６８】プラスミド１μｇを制限酵素ＸｈｏＩ １
ｕｎｉｔと３７℃で１時間反応させてプラスミドＤＮＡ
を完全分解した。得られた分解物を０．８％アガロース
ゲル電気泳動で分離して、大きさ約４．０ｋｂのＤＮＡ
断片画分をゲルから切り出した。この画分よりＤＮＡを
抽出精製して、約０．５μｇのＤＮＡを得た。次に、参
考例１に既述の大腸菌プラスミドｐＨＳＧ３９８ １μ
ｇを制限酵素ＳａｌＩ１ｕｎｉｔと３７℃で１時間反応
させた後、該反応液を７０℃で１０分間加熱して酵素を
失活させた。この失活溶液と上記で得た大きさ約４．０
ｋｂのＤＮＡとを混合し、この混合液にそれぞれの最終
濃度が５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔとなるよう
に各成分を添加し、これを１２℃で１５時間反応させて
ＤＮＡ断片を結合させた。

【００６９】結合させたＤＮＡを参考例１（Ｄ）と同様
にしてブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３に導入
して該細菌を形質転換した。形質転換株は、クロラムフ
ェニコール３６μｇ／ｍｌを含む半合成Ａ培地に寒天を
１５ｇ／ｌ添加した固体培地上に２〜３日間培養し、ク
ロラムフェニコール高濃度耐性株を取得した。上記操作
により得られた、プラスミドｐＣＯＰ−１に由来する大
きさ約４．０ｋｂのＤＮＡ断片が導入されたプラスミド
を保有する菌株を“ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３ｃｏｐ１−４．０”、およびプラスミドｐＣＯＰ
−２に由来する大きさ約４．０ｋｂのＤＮＡ断片が導入
されたプラスミドを保有する菌株を“ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ２３３ｃｏｐ−４．０”と、それぞれ
命名した。

【００７０】上記菌株のプラスミドコピー数を、実施例
１（Ｂ）と同様の方法を用い、プラスミドの分子量を
４．０×１０³ ダルトン（６．２ｋｂ）として、算出し
た。その結果、それぞれの形質転換株の保持するプラス
ミドコピー数は１０〜１２であることが判明した。得ら
れた２種の形質転換株から、参考例１（Ａ）と同様の方
法でプラスミドを抽出し、そのプラスミドをそれぞれ各
種制限酵素で切断して切断断片の大きさを求めた。その
結果、両プラスミドから得られたＤＮＡ断片の制限酵素
認識部位数および切断断片の大きさは同一であった。そ
の値を表６に示す。

【００７１】

【表６】 表 ６ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ １ ６．２ ＢａｍＨＩ １ ６．２ ＫｐｎＩ １ ６．２ ＳｐｈＩ ３ ４．２，１．７，０．３

【００７２】上記の如く、菌体当たり１０〜１２のコピ
ー数で存在し、かつ表６に示した制限酵素による認識部
位数および切断断片の大きさを有することで特徴付けら
れ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ｃｏｐ１
−４．０が保持するプラスミドを“ｐＣＯＰ１−４．
０”、また同ＭＪ２３３ｃｏｐ２−４．０が保持するプ
ラスミドを“ｐＣＯＰ２−４．０”と、それぞれ命名し
た。

【００７３】次に、プラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣ
ＯＰ−２から得られた上記大きさ約４．０ｋｂの多コピ
ー数自律複製ＤＮＡ断片を各種の制限酵素で切断して切
断断片の大きさを求めた。その結果、両プラスミドから
得られたＤＮＡ断片の制限酵素認識部位数および切断断
片の大きさは同一であり、前記表２に示したとおりであ
った。

【００７４】実施例３大きさ約１．８ｋｂの多コピー数自律複製ＤＮＡ断片の
クローニング 参考例１で得たプラスミドｐＣＲＹ３、ならびに実施例
１で得たプラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣＯＰ−２を
各々１μｇとり、それぞれを制限酵素ＫｐｎＩ１ｕｎｉ
ｔと１時間反応させて完全分解した。次いで、該分解物
を０．８％アガロースゲル電気泳動により分離したが、
その際に、大腸菌λファージの制限酵素ＨｉｎｄIII に
よる分解物（λＨｉｎｄIII 分解物）をサイズマーカと
して試料と同時に泳動した。泳動に用いたゲルからプラ
スミドの自律複製を司る機能に関与する大きさ約６．０
ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロース画分を切り出し、該
画分より大きさ約６．０ｋｂのＤＮＡ断片を抽出した。

【００７５】得られた大きさ約６．０ｋｂのＤＮＡ断片
０．８μｇを制限酵素ＨｈａＩ ０．１ｕｎｉｔと３７
℃で３０分間反応させて不完全に分解し、種々の大きさ
の分解物を得た後、反応液を７０℃で１０分間加熱処理
して酵素を失活させた。次に、前述の大腸菌プラスミド
ｐＨＳＧ３９８ ０．５μｇを制限酵素ＡｃｃＩ ０．
５ｕｎｉｔと３７℃で１時間反応させて完全分解した
後、この反応液も７０℃で１０分間加熱処理して酵素を
失活させた。

【００７６】得られた双方の分解物を混合し、この混合
液にそれぞれの最終濃度が５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１
ｕｎｉｔとなるように各成分を添加し、これを１２℃で
１５時間反応させてＤＮＡ断片を結合させた。結合して
得られたプラスミドＤＮＡを参考例１（Ｄ）と同様にし
て電気パルス法によりコリネ型細菌に導入して該細菌を
形質転換し、前記半合成Ａ培地にて培養した。さらに、
プラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣＯＰ−２由来のＤＮ
Ａで形質転換させた菌体は３０μｇ／ｍｌ（最終濃
度）、ｐＣＲＹ３由来のＤＮＡで形質転換させた菌体は
５μｇ／ｍｌ（最終濃度）のクロラムフェニルコールを
それぞれ含有する前記Ａ培地の寒天培地上に植菌し、３
０℃で２〜３日間培養して、それぞれのクロラムフェニ
コール耐性株を得た。

【００７７】出現したクロラムフェニコール耐性株をそ
れぞれ独立に上記半合成Ａ培地１リットルを用いて対数
増殖期後期まで培養した後、菌体を回収した。得られた
菌体をリゾチームを１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する緩
衝液〔組成：２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース〕
２０ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。この反
応液にアルカリ−ＳＤＳ液〔組成：０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ〕４０ｍｌを添加し、緩やか
に混和して室温にて１５分間静置した。次に、該反応液
に酢酸カリウム溶液〔組成：５Ｍ酢酸カリウム溶液６０
ｍｌ、酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌの混合
液〕３０ｍｌを添加し、これを充分に混和してから氷水
中に１５分間静置した。

【００７８】リゾチームによる溶菌物を全量遠心管に移
し、４℃で１０分間、１５，０００×ｇの遠心分離にか
けて上澄液を得た。該上澄液に等量のフェノール／クロ
ロホルム液（１：１、ｖ／ｖ）を加えて懸濁してから遠
心管に移し、室温下で５分間１５，０００×ｇの遠心分
離にかけて、その水層を回収した。該水層に２倍量のエ
タノールを添加して−２０℃で１時間静置した後、４℃
で１０分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈殿
を回収した。得られた沈殿には染色体ＤＮＡとプラスミ
ドＤＮＡが含まれている。この沈殿を減圧乾燥した後、
ＴＥ緩衝液〔組成：１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ；塩酸にてｐＨを８．０に調整〕２ｍｌに溶解して試
料とした。

【００７９】上記手順により得た、抽出プラスミドＤＮ
Ａを含む試料をそれぞれ０．８％アガロースゲルを用い
た電気泳動にかけてその分子量を測定したところ、３．
０×１０⁹ ダルトンの染色体ＤＮＡと２．６×１０³ ダ
ルトン（４．０ｋｂ）のプラスミドＤＮＡのバンドが確
認された。従って、得られたプラスミドにおいては、プ
ラスミドｐＨＳＧ３９８の大きさ２．２ｋｂのＤＮＡ断
片に、プラスミドｐＣＲＹ３、ｐＣＯＰ−１およびｐＣ
ＯＰ−２を制限酵素ＨｈａＩでそれぞれ切断して得られ
る大きさ約１．８ｋｂのＤＮＡ断片（多コピー数自律複
製ＤＮＡ断片）が挿入されていることが確認された。

【００８０】上記で得られた、３種の大きさ約１．８ｋ
ｂの制限酵素ＨｈａＩ切断ＤＮＡ断片がそれぞれ導入さ
れたプラスミドを各種の制限酵素で切断して切断断片の
大きさを求めた。その結果、３種のプラスミドの制限酵
素認識部位数および切断断片の大きさは同一であり、そ
の値を下記表７に示す。

【００８１】

【表７】 表 ７ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ １ ４．０ ＫｐｎＩ １ ４．０ ＢａｍＨＩ １ ４．０ ＳｐｈＩ ２ ０．７，３．３ ＰｓｔＩ ２ ０．４，３．６

【００８２】上記の如くして取得された、プラスミドｐ
ＣＯＰ−１に由来する大きさ約１．８ｋｂの制限酵素Ｈ
ｈａＩ切断ＤＮＡ断片を有し、かつ上記表７に示す切断
断片により特徴付けられるプラスミドを“ｐＣＯＰ１−
１．８”、プラスミドｐＣＯＰ−２に由来する大きさ約
１．８ｋｂの制限酵素ＨｈａＩ切断ＤＮＡ断片を有し、
かつ上記表７に示す切断断片により特徴付けられるプラ
スミドを“ｐＣＯＰ２−１．８”、プラスミドｐＣＲＹ
３に由来する大きさ約１．８ｋｂの制限酵素ＨｈａＩ切
断ＤＮＡ断片を有し、かつ上記表７に示す切断断片によ
り特徴付けられるプラスミドを“ｐＳ−１”と、それぞ
れ命名した。

【００８３】また、実施例１（Ｂ）と同様の手順により
取得した上記プラスミドおよび染色体ＤＮＡをアガロー
スゲル電気泳動にかけ、染色体ＤＮＡの分子量を３．０
×１０⁹ ダルトン、プラスミドの分子量を２．６×１０
³ ダルトン（４．０ｋｂ）としてプラスミドのコピー数
を算出した。その結果、プラスミドコピー数はｐＳ−１
で５〜６、ｐＣＯＰ１−１．８およびｐＣＯＰ２−１．
８では１０〜１２であることが判明した。

【００８４】さらに、プラスミドｐＣＯＰ−１およびｐ
ＣＯＰ−２を制限酵素ＨｈａＩで切断して得られる大き
さ約１．８ｋｂの多コピー数自律複製ＤＮＡ断片を各種
の制限酵素で切断し、切断断片の大きさを求めた。その
結果、両プラスミドから得られたＤＮＡ断片の制限酵素
認識部位数および切断断片の大きさは同一であり、前記
表３に示したとおりであった。

【００８５】なお、プラスミドｐＣＯＰ１−１．８を保
持するブレビバクテリウム・フラバムＣＯＰ１−１．８
およびｐＣＯＰ２−１．８を保持するブレビバクテリウ
ム・フラバムＣＯＰ２−１．８は、茨城県つくば市東１
丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に、
平成５年３月４日付で受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３５
０６およびＦＥＲＭ Ｐ−１３５０７として寄託されて
いる。

【００８６】実施例４多コピー数変異プラスミドにおける変異位置の決定 実施例３で得た、制限酵素ＨｈａＩで切断して得られる
大きさ約１．８ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を、プラス
ミドｐＵＣ１８またはプラスミドｐＵＣ１９を用いてジ
デオキシヌクレオチド酵素法〔ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａ
ｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，Ｓａｎ
ｇｅｒ，Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）参照〕により
決定した。

【００８７】各ＤＮＡ断片の配列は１８９７塩基対から
なるが、その中に２６１個のアミノ酸をコードするオー
プン・リーディング・フレームが存在し、これがプラス
ミドの複製に不可欠な複製蛋白質をコードしているもの
と推察される。プラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣＯＰ
−２から得られる配列をｐＳ−１から得られる配列と比
較したところ、配列中のオープン・リーディング領域に
おいて、ｐＣＯＰ−１から得られる配列では１３０７番
目の塩基ＧがＡに変異することにより該部位がコードす
るアミノ酸がＡｒｇからＨｉｓに変換し、ｐＣＯＰ−２
から得られる配列では１５７７番目のＧがＡに変異する
ことにより該部位がコードするアミノ酸がＧｌｙからＡ
ｓｐに変換していることが判明した。

【００８８】また、これらの配列から、大きさ１．８ｋ
ｂの多コピー数自律複製ＤＮＡ断片は、後記配列表の配
列番号：１で表される配列を有することが確認できた。
なお、配列番号：１に示した配列においてｐＣＯＰ１か
ら得られる配列は、塩基配列１３０７番目のＲがＡ、１
５７７番目のＲがＧであり、アミノ酸配列１２９番目の
ＸｘｘがＨｉｓ、２１９番目のＺｚｚがＧｌｙである。
またｐＣＯＰ２から得られる配列は、塩基配列１３０７
番目のＲがＧ、１５７７番目のＲがＡであり、アミノ酸
配列１２９番目のＸｘｘがＡｒｇ、２１９番目のＺｚｚ
がＡｓｐである。さらに野生型の配列は、塩基配列１３
０７番目および１５７７番目のＲがともにＧであり、ア
ミノ酸配列２１９番目のＸｘｘがＡｒｇ、２１９番目の
ＺｚｚがＧｌｙである。

【００８９】実施例５プラスミドベクターｐＫＰＲ−１及びｐＫＰＲ−２の作
製 （Ａ）多コピー数自律複製ＤＮＡ断片の調製 実施例３で取得したプラスミドｐＣＯＰ１−１．８及び
ｐＣＯＰ２−１．８より、以下のプライマー鋳型とし、
ＤＮＡサーマルサイクラー４８０型（宝酒造社製）を用
いて、ＰＣＲ法により大きさ約１．８ｋｂの多コピー数
自律複製ＤＮＡ断片を増幅させた。ＤＮＡ断片の増幅
は、それぞれＸｈｏＩ及びＫｐｎＩの制限酵素サイトを
付加した下記プライマーを用いて行った。

【００９０】プライマー１（アンダーライン部分はＸｈ
ｏＩサイト）： ＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧ
（配列番号:2） プライマー２（アンダーライン部分はＫｐｎＩサイ
ト）： ＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＣＧ
（配列番号:3） 増幅ＤＮＡ断片０．５μｇを、制限酵素ＸｈｏＩ（０．
５ｖ）及びＫｐｎＩ（０．５ｖ）で消化し、ＸｈｏＩ−
ＫｐｎＩの断片として調製した。これらの断片を以下そ
れぞれｃｏｐ１断片及びｃｏｐ２断片と称する。

【００９１】（Ｂ）安定化ＤＮＡ断片の調製 コリネ型細菌内でプラスミドを安定に保持させる機能に
関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片（安定化ＤＮＡ断片）
としては、特開平２−２７６５７９号公報に記載されて
いるプラスミドｐＢＹ５０３由来ＤＮＡ断片をあげるこ
とができる。安定化ＤＮＡ断片は、次の様にして調製で
きる。

【００９２】参考例１で得られたｐＢＹ５０３（５μ
ｇ）を制限酵素ＫｐｎＩ（５ｕｎｉｔ）で３７℃１時
間、完全分解した。分解液を０．８％アガロースゲル電
気泳動により分離して、大きさ約７．４ｋｂのＫｐｎＩ
断片をゲルより抽出し精製した。得られたＤＮＡ １μ
ｇを制限酵素ＸｈｏＩ（１ｕｎｉｔ）及びＨｉｎｄIII
（１ｕｎｉｔ）で切断し、０．８％アガロースゲル電気
泳動により分離し、大きさ約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を
ゲルより抽出し、安定化ＤＮＡ断片を得た。

【００９３】（Ｃ）プラスミドベクターｐＫＰＲ−１及
びｐＫＰＲ−２の作製 プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ⁺ （ストラ
タジーン社製）０．５μｇを制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉ
ｎｄIII で３７℃１時間、完全分解した。次に上記
（Ａ）及び（Ｂ）で調製した多コピー数自律複製ＤＮＡ
断片と安定化ＤＮＡ断片を混合し、７０℃で１０分間加
熱して制限酵素を失活させた後、５０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ およびＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終
濃度である）、１２℃で１５時間反応させ結合させた。
結合させたプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９
コンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、アンピ
シリン耐性株として取得した。形質転換株よりプラスミ
ドＤＮＡを前記と同様の方法で抽出し、その１μｇを制
限酵素ＳｍａＩで切断した。この切断ＤＮＡ断片に、カ
ナマイシン耐性遺伝子（ファルマシア社製）を制限酵素
ＰｓｔＩで切断し平滑末端化処理したＤＮＡ断片を加え
て結合させた。このプラスミド用いて大腸菌ＪＭ１０９
コンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、カナマ
イシンを含む前記Ｌ培地で３７℃にて２４時間培養し、
生育株を得た。これらの生育株より前記と同様にして、
プラスミドを抽出した。

【００９４】このように構築されたプラスミドを制限酵
素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電
気泳動にて切断ＤＮＡを分離し、ゲルよりＤＮＡを抽出
回収して、多コピー数自律複製ＤＮＡ断片、安定化ＤＮ
Ａ断片、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡ断片の３種のＤ
ＮＡ断片を得た。次にＤＮＡ合成装置アプライドバイオ
システム社製３７３Ａにより作製したＫｐｎＩ−Ｂａｍ
ＨＩリンカー〔ｄ（ＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣ）〕（配
列番号：４）を上記の断片と混合し、前述の条件にて結
合させた。結合させたプラスミドの溶液を用い、ブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３の形質転換を電気パ
ルス法により次のとおり行った。

【００９５】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２
除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで培
養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌになるように添
加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌体
を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭＳ
ｕｃｒｏｓｅ、７ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ ：ｐＨ７．４）にて洗浄した。さらに菌体を遠心分
離して集め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０．７５
ｍｌの細胞と、前記で得られたプラスミドＤＮＡ溶液５
０μｌとを混合し、水中にて２０分間静置した。ジーン
パルサー（バイオラド社製）を用いて、２５００ボル
ト、２５μＦＤに設定し、パルスを印加後氷中に２０分
間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃に
て１時間培養後、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ（最終濃
度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日間
培養した。出現したカナマイシン耐性株より、参考例１
に記載の方法によりプラスミドを得た。このプラスミド
を各種制限酵素で切断して、切断断片の大きさを測定し
た。その結果は、両プラスミドにおいて同一であり、前
記表４に示したとおりであった。

【００９６】プラスミドｐＣＯＰ１−１．８から得られ
たＤＮＡ断片を有し且つ前記表４に示す切断断片により
特徴づけられるプラスミドを“ｐＫＰＲ−１”、プラス
ミドｐＣＯＰ２−１．８から得られたＤＮＡ断片を有し
且つ前記表４に示す切断断片により特徴づけられるプラ
スミドを“ｐＫＰＲ−２”と命名した。これらプラスミ
ドの制限酵素切断点地図を図２に示す。

【００９７】実施例６プラスミドベクターｐＫＰＲ−１及びｐＫＰＲ−２のコ
ピー数と安定性 実施例４で得られたプラスミドベクターｐＫＰＲ−１、
ｐＫＰＲ−２ならびに実施例３で得られたｐＳ−１をそ
れぞれ含有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３
３より、実施例１（Ｂ）と同様の手順により染色体ＤＮ
Ａ及びプラスミドを取得し、アガロースゲル電気泳動に
かけ、染色体ＤＮＡの分子量を３．０×１０⁹ ダルト
ン、ｐＫＰＲ−１及びｐＫＰＲ−２の分子量を２．７×
１０³ ダルトン（４．１ｋｂ）ｐＳ−１の分子量を２．
６×１０³ ダルトン（４．０ｋｂ）としてプラスミドの
コピー数を算出した。その結果、プラスミドのコピー数
はｐＳ−１で５〜６、ｐＫＰＲ−１及びｐＫＰＲ−２で
は１０〜１２であることが判明した。

【００９８】プラスミドの安定性は、次のようにして確
認した。上述のｐＫＰＲ−１、ｐＫＰＲ−２及びｐＳ−
１をそれぞれ含有するブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３由来株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌ（最終濃
度）を含む前記Ａ培地に植菌し、３０℃で１５時間前培
養した。次にＡ培地に１ｍｌ当たり１０⁴ ｃｅｌｌｓの
割合になるように植え継ぎを行い約２００世代培養し
た。培養液中のカナマイシン耐性株、すなわちプラスミ
ド保持株数の全菌数に対する割合を百分率で示した結果
を下記表８に示す。

【００９９】

【表８】 表 ８ 菌株（保持プラスミド名） プラスミド保持率（％） ｐＳ−１ １８ ｐＫＰＲ−１ ９８ ｐＫＰＲ−２ ９８

【０１００】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1897 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プラスミド DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：MJ233 cop1 又は MJ233 cop2 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：922-1704 特徴を決定した方法：E 他の情報 下記塩基配列中１３０７番目および１５７７番目のＲは
Ｇ又はＡを示すが、双方が同時にＧであることはなく、
また、下記アミノ酸配列中１２９番目のＸｘｘはＡｒｇ
又はＨｉｓを、２１９番目のＺｚｚはＧｌｙ又はＡｓｐ
をそれぞれ示すが、１２９番目のＸｘｘがＡｒｇである
ときには２１９番目のＺｚｚがＧｌｙであることはな
い。

【０１０１】 配列 GCGCAGCCTG ACCATGGACA TGCTTCTACG TTCTTCCACA CTGGTATCTT TTGGTTGCAA 60 TATATATTGC AACCATGCTG GTAAAACAAC TTTTTAGCGT GTCTTGCCCA AAATTACAGT 120 CATGTGATTT ACAGTTGAAA GATACTGAAA ATCAAAGAAG GCCACTCGGC GGCAACCGAA 180 TGACCTTCGC TTATCACCCA GTCCTACCTG GGAGAAAGCA TGTACATGAT TATACCCAAT 240 AGTACGCCCG CGTACCCCAT TTCCGGTTCG CGTGTTAACA CGCCATCACG TTTGCGCCCT 300 GACTGCGCAG GCCTTGATGA CACCCCAGCG AGCACCGTTG ACCGGGACAA GCTGCTCGCA 360 CATCTTGGCC GTACAGCACT GCACGGGTCT ATAAGTCGAA ACTTCAAAGG CGCTTATCGC 420 CTCGTTGTGG ATAAGGAAAC GGGGGAAAAG CGAAGCGTTC CGAACCTTTA CCGCATTGAT 480 TCCGAAAAAC TCGGTCGCTG CGAATACGTC ATGCTGACTA GTAAGCAATA TGCTTCGGTC 540 ATGGTCATAG ACGTTGACCA GATAGGAGAG GCTGGAGGAC ATCCAGAAAA CCTCAACTCC 600 TATGTCAAAG GCGTTATCTG GGTACTTGTG CAGCACGGAA TTGGACCAGC ATGGGCAGGC 660 ATTAATCCGA TTAGTGGTAA AGCGCAGTTT ATTTGGCTTA TTGACCCAGT TTATGCAGGA 720 AAGAATCGTG CGTCCCGGAA TATGGAGCTA CTCAAAGCCA CAAGTCACGA GTTGGGTGAG 780 TTACTGGATC ATGATCCACA TTTTGCGCAT CGGTTTAGCC GGAGTCCTTT TTATACTGGA 840 AAGTCACCGG AGGCTTATCG CTGGTATTGC CAGCATGACC GGGTTATACG CCTCCAAGAC 900 TTTCTAAGGC AGGTGCGCGA G ATG GCG GGA CAA TCC CAG CAC ATT AAA AAC 951 Met Ala Gly Gln Ser Gln His Ile Lys Asn 1 5 10 AAG CGC CAG CAA TTT AAC AGT GGC CGT GAG CTT ATT AAT GCG GTC AAA 999 Lys Arg Gln Gln Phe Asn Ser Gly Arg Glu Leu Ile Asn Ala Val Lys 15 20 25 ACT CGC CGT GAA GAA GCC CAA GCC TTT AAA GCA CTT GCT GAG GAT GTC 1047 Thr Arg Arg Glu Glu Ala Gln Ala Phe Lys Ala Leu Ala Glu Asp Val 30 35 40 GAA AAC GAG ATA AGT GAA GAA ATC GAT CAA TAC GAC CCG GAA CTA ATC 1095 Glu Asn Glu Ile Ser Glu Glu Ile Asp Gln Tyr Asp Pro Glu Leu Ile 45 50 55 GAC GGG GTG CGC GTG CGC TGG ATT AGC CAA GGG GTC GCA GCA CGC GAC 1143 Asp Gly Val Arg Val Arg Trp Ile Ser Gln Gly Val Ala Ala Arg Asp 60 65 70 GAA ACA GCG TTT AGC CAC GCA CTA AAA ATT GGT CAC CGC CTA CGC AAA 1191 Glu Thr Ala Phe Ser His Ala Leu Lys Ile Gly His Arg Leu Arg Lys 75 80 85 90 GCA GGA CAA CGA CTC ACA GAC GCC GCC GTT ATC GAT GCC TAC GAG CAT 1239 Ala Gly Gln Arg Leu Thr Asp Ala Ala Val Ile Asp Ala Tyr Glu His 95 100 105 GCC TAT AAC GTT GCA CAA CAA CAA GGC TCA GCA GGC CGA GAC AGC GAA 1287 Ala Tyr Asn Val Ala Gln Gln Gln Gly Ser Ala Gly Arg Asp Ser Glu 110 115 120 ATG CCA CCC ATG CGT GAC CRC CAG ACC ATG GCA CGA CGC GTA CGC GGC 1335 Met Pro Pro Met Arg Asp Xxx Gln Thr Met Ala Arg Arg Val Arg Gly 125 130 135 TAT GTC ACC CAA TCC AAA ACC AAC ACA AGT CTA GGA GCT AGC GCT CCC 1383 Tyr Val Thr Gln Ser Lys Thr Asn Thr Ser Leu Gly Ala Ser Ala Pro 140 145 150 GGA CGC GTT ACC AGC AGC GAA CGC AAA GCA CTG GCC ACC ATG GGG CGA 1431 Gly Arg Val Thr Ser Ser Glu Arg Lys Ala Leu Ala Thr Met Gly Arg 155 160 165 170 AAA GGC GGA CAG AAA GCA GCA CAA CGC TGG AAA ACC GAT CCA GAA GGT 1479 Lys Gly Gly Gln Lys Ala Ala Gln Arg Trp Lys Thr Asp Pro Glu Gly 175 180 185 CAA TAC GCA CAA AAT CAG CTG CAG AAA CTA AAG AAA ACG CAC CGG AAG 1527 Gln Tyr Ala Gln Asn Gln Leu Gln Lys Leu Lys Lys Thr His Arg Lys 190 195 200 AAG CGG GTG GAA GGA CAG ACC ACG CGT GCG AAG ATT CAA GCC TTA ATT 1575 Lys Arg Val Glu Gly Gln Thr Thr Arg Ala Lys Ile Gln Ala Leu Ile 205 210 215 GRT GAA GCT TAC GTG CAA ACA GGC GAG GTA CTT ACC CGC AAA CAG ATT 1623 Zzz Glu Ala Tyr Val Gln Thr Gly Glu Val Leu Thr Arg Lys Gln Ile 220 225 230 GTG GAT GAG ACA GGA CTA TCT AGA GCT ACA GTG ACA CGG CAT TTG GCG 1671 Val Asp Glu Thr Gly Leu Ser Arg Ala Thr Val Thr Arg His Leu Ala 235 240 245 250 GCA CTT CGA GAA CAG GGA GCA CTT CCG GAA ACG TAGGGGCTCATACCGTAAGCA 1725 Ala Leu Arg Glu Gln Gly Ala Leu Pro Glu Thr 255 260 ATATACGGTT CCCCTGCCGG TAGGAATGTA GTAATAACCT CTCTTGAAGA AAACCTTGTA 1785 GGGCAAGGCT ACTTATGCTT CCGGGGTTAG TCGTTCTTCT ATTGCGGTGA TGAGTTCTAG 1845 ACCTTTATCT AAGTCCTGGG GGCTGCTGTT GCCGTGCGAG GCTTTGCTGC GC 1897

【０１０２】配列番号：2 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TCCTCGAGGC GCAGCCTGAC CATG 24

【０１０３】配列番号：3 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TCGGTACCGC GCAGCAAAGC CTCG 24

【０１０４】配列番号：4 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGTACCGGAT CC 12

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のプラスミドベクターの造成に用いる多
コピー数自律複製ＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図。

【図２】本発明のプラスミドベクターｐＫＰＲ−１およ
びｐＫＰＲ−２の制限酵素切断点地図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）プラスミドｐＢＹ５０３由来のコ
   リネ型細菌内でプラスミドの自律複製を司る機能に関与
   する遺伝子を含むＤＮＡ断片であって、プラスミドのコ
   ピー数を増加し得る変異点が該遺伝子内の少なくとも１
   カ所に存在するＤＮＡ断片、（ｂ）プラスミドｐＢＹ５
   ０３由来のコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミド
   を該細菌内において安定に保持させる機能に関与する遺
   伝子を含むＤＮＡ断片および（ｃ）プラスミドマーカー
   となりうる薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を保有する
   ことを特徴とするプラスミドベクター。