CN114480467A - 一种在棒状杆菌中辅助sacB基因编辑系统的CRISPR-cpf1筛选工具 - Google Patents

一种在棒状杆菌中辅助sacB基因编辑系统的CRISPR-cpf1筛选工具 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在棒状杆菌中辅助sacB基因编辑系统的CRISPR‑cpf1筛选工具，属于基因工程领域。本发明通过对现有基因编辑技术的改进及组合，提供了一种提高基于自杀质粒介导的同源重组及sacB系统二轮交换时的筛选效率的筛选工具，基于CRISPR/Cpf1机理及谷氨酸棒杆菌不存在非同源修复机制给予的致死性，创造性地开发了一种反向筛选工具，并无需再做改造或更换sgRNA就能直接用于筛选二轮交换菌株，解决了sacB系统二轮交换低效的问题，并具有普适性。同时降低了假阳性的概率、显著提升了筛选效果。在棒状杆菌的基因编辑及进一步利用中有广阔的应用前景。

Description

一种在棒状杆菌中辅助sacB基因编辑系统的CRISPR-cpf1筛 选工具
技术领域
本发明涉及一种在棒状杆菌中辅助sacB基因编辑系统的CRISPR-cpf1筛选工具，属于基因工程领域。
背景技术
棒状杆菌是目前白色生物技术的产业支柱，是公认的安全发酵菌株，它被广泛应用于有机酸、氨基酸及其衍生物的生产。随着分子生物学技术的发展，一些分子遗传工具被开发出来并应用到棒状杆菌的代谢工程改造中，以更有效地生产或者生产更多有价值的化学品。目前，已经对多株棒状杆菌进行了基因组测序，为深入了解棒状杆菌的代谢机制、发掘其更多生产功能提供了依据。基因编辑技术对棒状杆菌的研究至关重要，而现有的基因编辑技术都存在一定缺陷。
传统基因编辑技术主要依赖于同源重组，将含有目的基因两侧同源序列的外源DNA片段导入宿主菌，然后通过核酸链间等位替换的方式对目的基因进行突变、缺失或插入。在棒状杆菌中常用的传统基因编辑技术包括基于自杀质粒介导的同源重组系统(如pK18mobsacB)以及基于位点特异性重组的Cre/loxP系统。
以sacB为基础的自杀质粒介导的同源重组系统可通过两轮交换实现无痕编辑。通过自杀质粒无法在棒状杆菌中复制的特性，用相应抗性平板筛选出整个敲除质粒通过单交换整合在基因组的菌株。sacB基因编码的果聚糖蔗糖酶，可水解蔗糖以聚合形成对细胞有毒的果聚糖，当有蔗糖存在时，sacB基因对棒状杆菌就具有致死效应。因此，可通过蔗糖平板筛选出已发生第二轮交换从而去除载体骨架以进行无疤痕遗传修饰的重组菌株。然而，假阳性克隆的频繁发生以及低概率的双交换事件限制了基于sacB的自杀质粒介导的同源重组系统的编辑效率。
Cre/loxP重组系统是由Cre重组酶和其所识别的两个loxP位点共同组成，当两个loxP位点方向相同且位于同一条DNA链上，Cre酶介导两个loxP位点完成分子内重组，使loxP位点间的序列被剪切，并留下1个loxP位点。根据两个loxP位点之间序列及位置的不同，Cre酶能够实现两个loxP位点间的序列倒位或者丢失。通过自杀质粒在基因组中导入loxP位点，再利用Cre切除loxP位点间序列的方式实现目的基因的敲除。Cre/loxP系统的主要缺点在于完成一次敲除后，会在基因组上残留一个loxP位点，因此无法用于密码子替换、RBS工程等小片段的精确编辑。
CRISPR系统是一种新型的基因编辑系统，其包括一个Cas蛋白如Cas9、Cpf1和sgRNA。sgRNA引导Cas9/Cpf1蛋白与靶序列结合，并对双链DNA进行剪切，形成双链断裂，再通过非同源修复与同源修复两种机制来实现基因编辑。在棒状杆菌中不存在非同源修复机制，若不提供同源修复模板，则Cas9/Cpf1蛋白对棒状杆菌就具有致死性。基于CRISPR的系统看起来非常有吸引力的，因为它能保证高效、快速、普适和多重基因组编辑，而且从理论上讲只产生阳性转化子。然而，高表达的Cas9可能会因为致死性而导致转化子的缺乏；低表达的Cas9可能会导致假阳性菌的存活。此外，Cas9的表达在复制过程中具有相当高的突变率，导致无义突变、插入、缺失等，甚至从质粒中完全删除基因，从而导致编辑系统失败。另外，针对不同编辑位点，都需要重新构建含有不同sgRNA和同源修复模板的基因编辑系统。因此开发一个普遍适用的、高效率的基因编辑系统对棒状杆菌的代谢工程研究和改造至关重要。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明构建了一种适用于棒杆菌的基因编辑系统，具体为先用自杀质粒pK18mobsacB携带目的基因的上下游同源臂，通过两轮交换进行目的基因的无痕编辑。由于第二轮发生双交换的概率太低，且sacB筛选的假阳性率过高，设计并开发一个靶向pK18mobsacB的标记基因kan或sacB的CRISPR反筛工具pCS，用于在双交换后通过双链断裂杀死所有未发生双交换的菌株，提高阳性菌的筛选概率。由于CRISPR反筛工具pCS靶向的是kan或sacB中的序列而非被编辑的目的基因中的专用序列，因此对任何基因编辑后的筛选都具有普适性，而无需同目前的CRISPR基因编辑工具一样待编辑的靶基因或靶位点改变时要更换同源修复模板和sgRNA。
本发明的第一个目的是提供一种基因编辑系统，所述编辑系统由带有目标基因同源修复模板的pK18mobsacB质粒及反向筛选工具组成；所述反向筛选工具含有靶向pK18mobsacB质粒的sgRNA的表达模块。
在一种实施方式中，所述反向筛选工具还含有Cpf1表达框、温敏型复制子pBL1ts。
在一种实施方式中，所述sgRNA的表达模块上的靶向位点为pK18mobsacB质粒上的任一位点。
在一种实施方式中，所述反向筛选工具以氯霉素抗性基因为筛选标记，但不限于氯霉素抗性基因。
在一种实施方式中，当靶向位点为pK18mobsacB质粒上的卡那霉素抗性基因时，所述反向筛选工具的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种编辑菌株的方法，所述方法是利用所述基因编辑系统对菌株进行两轮交换实现基因编辑。
在一种实施方式中，利用pK18mobsacB质粒转入宿主细胞中，培养、并验证获得第一轮交换菌株；向第一轮交换菌株中转入所述反向筛选工具，培养、并验证获得第二轮交换菌株，即为基因编辑后的菌株。
在一种实施方式中，具体方法为：
(1)在pK18mobsacB中插入基因编辑所用的同源修复模板，构建pK18mobsacB-编辑质粒；
(2)将pK18mobsacB-编辑质粒转入目标菌株的感受态细胞，在卡那霉素固体培养基中筛选发生整合的一轮交换菌株；
(3)在蔗糖液体培养基中培养并富集二轮交换菌株；
(4)将反向筛选工具pCS质粒转入富集的二轮交换菌株的感受态细胞，在氯霉素和蔗糖固体培养基中筛选二轮交换菌株；
(5)在37℃下培养，去除二轮交换菌株中的反向筛选工具pCS质粒。
在一种实施方式中，将步骤(2)中转入了pK18mobsacB质粒的宿主细胞在LBBK培养基中培养，筛选获得第一轮交换菌株；所述LBBK培养基中含有1～5g/L酵母提取物，4～8g/L氯化钠，4～8g/L蛋白胨，15～20g/L脑心浸液和10～100mg/L卡那霉素。
优选地，所述LBBK固体培养基含有2.5g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，5g/L蛋白胨，18.5g/L脑心浸液和30mg/L卡那霉素。
在一种实施方式中，将步骤(4)中转入了反向筛选工具的菌株在LBBSC培养基中培养，筛选获得基因编辑后的菌株；所述LBBSC培养基中含有1～5g/L酵母提取物，4～8g/L氯化钠，4～8g/L蛋白胨，15～20g/L脑心浸液，80～150g/L蔗糖和5～15mg/L氯霉素。
优选地，所述LBBSC培养基中含有2.5g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，5g/L蛋白胨，18.5g/L脑心浸液，100g/L蔗糖和10mg/L氯霉素。
本发明的第三个目的是提供所述基因编辑系统在棒状杆菌基因编辑中的应用。
在一种实施方式中，所述棒状杆菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌。
本发明还提供所述基因编辑系统在棒状杆菌的代谢调控和代谢工程改造中的应用。
本发明还提供所述基因编辑系统在棒状杆菌代谢产物或含有棒状杆菌代谢产物的产品的生产中的应用。
有益效果：本发明通过对现有基因编辑技术的改进及组合，提供了一种提高基于自杀质粒介导的同源重组及sacB系统二轮交换时的筛选效率的筛选工具，基于CRISPR/Cpf1机理及谷氨酸棒杆菌不存在非同源修复机制给予的致死性，创造性地开发了一种反向筛选工具，并无需再做改造或更换sgRNA就能直接用于筛选二轮交换菌株，解决了sacB系统二轮交换低效的问题，具有普适性。同时降低了假阳性的概率、显著提升了筛选效果。
附图说明
图1为CRISPR筛选质粒pCS的构建图谱。
图2为CRISPR/Cpf1辅助的sacB基因编辑操作流程图。
具体实施方式
谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01已公布于文献4-Hydroxyisoleucine production of recombinant Corynebacterium glutamicumssp.lactofermentum under optimal corn steep liquor limitation中，公开于2015年。
LBB培养基：酵母提取物2.5g/L，氯化钠5g/L，蛋白胨5g/L，脑心浸液18.5g/L。
LBBK固体培养基：酵母提取物2.5g/L，氯化钠5g/L，蛋白胨5g/L，脑心浸液18.5g/L，卡那霉素30mg/L，琼脂糖15g/L。
LBBS培养基：酵母提取物2.5g/L，氯化钠5g/L，蛋白胨5g/L，脑心浸液18.5g/L，蔗糖100g/L。
LBBSC固体培养基：酵母提取物2.5g/L，氯化钠5g/L，蛋白胨5g/L，脑心浸液18.5g/L，蔗糖100g/L，氯霉素10mg/L，琼脂糖15g/L。
实施例1：质粒pCS的构建
以pJYS3_ΔcrtYf(已公布于CRISPR-Cpf1 assisted genome editing ofCorynebacterium glutamicum,Nature Communications.2017,8:15179)质粒为模板，
利用引物为CE1-Cpf1-F和CE2-gRNA-R，扩增Cpf1表达框；利用引物为CE2-ori-F和CE3-ori-R，扩增sgRNA表达框及pBL1ts温敏复制子；用化学合成法合成氯霉素抗性基因cat。通过重叠PCR将Cpf1表达框和sgRNA表达框及pBL1ts连接；再通过一步克隆将cat基因和Cpf1表达框、sgRNA表达框及pBL1ts连接成环状质粒pCS，质粒pCS的序列如SEQ ID NO.1所示(其中，氯霉素抗性基因cat为3495-4154bp，靶向卡那霉素抗性基因kan的sgRNA为8845-8865bp)。
CE1-Cpf1-F：TCTAAATACATTCAAATATCGGAATCATGACCTGAGCTGTTT，
CE2-gRNA-R：TGTCAAGACCGACCTGTCCGGATTTAAATAAAACGAAAGGCT；
CE2-ori-F：CCGGACAGGTCGGTCTTGACAATCTACAACAGTAGAAATTCG，
CE3-ori-R：TGCCAGAACCGTTATGATGTGGTGACCGCCTCGATGATCGCC。
实施例2：编辑质粒pK18mobsacB-odhA::PilvBNC-odhA的构建
以谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01的基因组DNA为模板，利用引物odhA-U-F和odhA-U-R，扩增odhA-U上游同源臂；利用引物为odhA-D-F和odhA-D-R，扩增odhA-D下游同源臂；利用引物为PilvBNC-F和PilvBNC-R，扩增PilvBNC片段。利用引物odhA-U-F和odhA-D-R，将片段odhA-U、PilvBNC和odhA-D经过重叠PCR得到odhA-U-PilvBNC-odhA-D片段。
odhA-U-F：TACCCGGGGATCCTCTAGAAGTCTTTGACAATTATGCGG，
odhA-U-R：CTTTTCAGCGCTAATCTTGGTCAGGCCATTAAATGCCAC；
odhA-D-F：GTAAAGGAGCCAGAAAGTCATGCTACAACTGGGGCTTAG，
odhA-D-R：AAGCTTGCATGCCTGCAGGTGTAAGGAACGTTCATTGCG；
PilvBNC-F：CCAAGATTAGCGCTGAAAAG，
PilvBNC-R：GACTTTCTGGCTCCTTTAC。
在质粒pK18mobsacB的SalI位点处插入odhA-U-PilvBNC-odhA-D片段，得到对谷氨酸棒杆菌odhA起始密码子前整合PilvBNC启动子的整合质粒pK18mobsacB-odhA::PilvBNC-odhA。
实施例3：谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种SN01 odhA::PilvBNC-odhA菌株的构建
一轮交换：将pK18mobsacB-odhA::PilvBNC-odhA电转入谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01感受态细胞中，涂布于LBBK平板，在28℃下培养至长出单菌落，挑取单菌落进行PCR验证，验证获得一轮交换菌株SN01 pK18mobsacB-odhA::PilvBNC-odhA。
二轮交换(本发明创建的二轮交换方法)：将一轮交换菌株SN01 pK18mobsacB-odhA::PilvBNC-odhA在LBBS培养基内培养24h后，将菌液再转接到新鲜的LBBS培养基，培养过夜后制备成感受态细胞，然后将pCS质粒转入感受态细胞中，涂布于LBBSC平板，28℃培养72h后，挑取平板上的15个单菌落进行PCR验证，PCR结果显示，15个单菌落中有2个是正确的双交换，4个是回复的双交换，9个是假阳性。得到验证正确的二轮交换菌株SN01odhA::PilvBNC-odhA/pCS，最后将二轮交换菌株SN01 odhA::PilvBNC-odhA/pCS在37℃培养24h后去除pCS质粒，得到无痕编辑的SN01 odhA::PilvBNC-odhA。
对照二轮交换(采用传统的二轮交换方法)：将一轮交换菌株SN01 pK18mobsacB-odhA::PilvBNC-odhA在LBBS培养基内培养24h后，涂布于LBBS平板，在28℃或30℃培养72h后，挑取平板上的20个单菌落进行PCR验证，PCR结果显示，此20个单菌落均为假阳性。
因此，在二轮交换时采用本发明的CRISPR基因编辑工具pCS来辅助sacB进行筛选能大幅提高阳性菌的筛选率。
实施例4：编辑质粒pK18mobsacB-kgd::PilvBNC-kgd的构建
以谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种C.glutamicum ssp.Lactofermentum SN01的基因组DNA为模板，利用引物odhA-U-F和kgd-U-R，扩增kgd-U上游同源臂；利用引物kgd-D-F和odhA-D-R，扩增kgd-D下游同源臂；利用引物PilvBNC-F和PilvBNC-R，扩增PilvBNC片段。利用引物odhA-U-F和odhA-D-R将kgd-U、PilvBNC和kgd-D片段经过重叠PCR得到kgd-U-PilvBNC-kgd-D片段。
kgd-U-R：CTTTTCAGCGCTAATCTTGGTTTTATCCACTGTAACGTTGGTCG，
kgd-D-F：GTAAAGGAGCCAGAAAGTCGTGAGCAGCGCTAGTACTT。
在质粒pK18mobsacB的SalI位点处插入kgd-U-PilvBNC-kgd-D片段，得到对谷氨酸棒杆菌kgd起始密码子前整合PilvBNC启动子的整合质粒pK18mobsacB-kgd::PilvBNC-kgd。
实施例5：谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种SN01kgd::PilvBNC-kgd菌株的构建
一轮交换：将pK18mobsacB-kgd::PilvBNC-kgd电转入谷氨酸棒状杆菌SN01感受态细胞中，涂布于LBBK平板，在28℃下培养至长出单菌落，挑取单菌落进行PCR验证，验证获得一轮交换菌株SN01 pK18mobsacB-kgd::PilvBNC-kgd。
二轮交换：将一轮交换菌株SN01 pK18mobsacB-kgd::PilvBNC-kgd在LBBS培养基内培养24h后，将菌液再转接到新鲜的LBBS培养基，培养过夜后制备成感受态细胞，然后将pCS质粒转入感受态细胞中，涂布于LBBSC平板，28℃培养72h后，从平板上挑取20个单菌落，进行PCR验证，PCR结果显示，20个单菌落中有12个是正确的双交换，8个是假阳性，验证获得二轮交换菌株SN01 kgd::PilvBNC-kgd/pCS，最后将二轮交换菌株SN01 kgd::PilvBNC-kgd/pCS在37℃培养24h后去除pCS质粒，得到无痕编辑的SN01 kgd::PilvBNC-kgd。
对照二轮交换(采用传统的二轮交换方法)：将一轮交换菌株SN01 pK18mobsacB-kgd::PilvBNC-kgd在LBBS培养基内培养24h后，涂布于LBBS平板，在28℃或30℃下培养72h后，从平板上挑取20个单菌落，进行PCR验证，PCR结果显示，20个单菌落均为假阳性。
因此，在二轮交换时采用本发明的CRISPR基因编辑工具pCS来辅助sacB进行筛选能大幅提高阳性菌的筛选率。
pCS序列(SEQ ID NO.1)
单划线处为氯霉素抗性基因cat；双划线处为靶向卡那霉素抗性基因kan的sgRNA：CTAGTCCTTTTCCTTTGAGTTGTGGGTATCTGTAAATTCTGCTAGACCTTTGCTGGAAAACTTGTAAATTCTGCTAGACCCTCTGTAAATTCCGCTAGACCTTTGTGTGTTTTTTTTGTTTATATTCAAGTGGTTATAATTTATAGAATAAAGAAAGAATAAAAAAAGATAAAAAGAATAGATCCCAGCCCTGTGTATAACTCACTACTTTAGTCAGTTCCGCAGTATTACAAAAGGATGTCGCAAACGCTGTTTGCTCCTCTACAAAACAGACCTTAAAACCCTAAAGGCTTAAGTAGCACCCTCGCAAGCTCGGGCAAATCGCTGAATATTCCTTTTGTCTCCGACCATCAGGCACCTGAGTCGCTGTCTTTTTCGTGACATTCAGTTCGCTGCGCTCACGGCTCTGGCAGTGAATGGGGGTAAATGGCACTACAGGCGCCTTTTATGGATTCATGCAAGGAAACTACCCATAATACAAGAAAAGCCCGTCACGGGCTTCTCAGGGCGTTTTATGGCGGGTCTGCTATGTGGTGCTATCTGACTTTTTGCTGTTCAGCAGTTCCTGCCCTCTGATTTTCCAGTCTGACCACTTCGGATTATCCCGTGACAGGTCATTCAGACTGGCTAATGCACCCAGTAAGGCAGCGGTATCATCAAGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTACGCTCCGGGACGCCAACAACAAGACCCATCATAGTTTGCCCCCGCGACATTGACCATAAATTCATCGCACAAAATATCGAACGGGGTTTATGCCGCTTTTAGTGGGTGCGAAGAATAGTCTGCTCATTACCCGCGAACACCGCCGCATTCAGATCACGCTTAGTAGCGTCCCCATGAGTAGGCAGAACCGCGTCCAAGTCCACATCATCCATAACGATCATGCACGGGGTGGAATCCACACCCAGACTTGCCAGCACCTCATTAGCGACACGTTGCGCAGCGGCCACGTCCTTAGCCTTATCCACGCAATCGAGAACGTACTGCCTAACCGCGAAATCAGACTGAATCAGTTTCCAATCATCGGGCTTCACCAAAGCAACAGCAACGCGGGTTGATTCGACCCGTTCCGGTGCTTCCAGACCGGCGAGCTTGTACAGTTCTTCTTCCATTTCACGACGTACATCAGCGTCTATGTAATCAATGCCCAAAGCACGCTTAGCCCCACGTGACCAGGACGAACGCAGGTTTTTAGAACCAACCTCATACTCACGCCACCGAGCCACCAAAACAGCGTCCATATCCTCGCCGGCGTCGCTTTGATCGGCCAACATATCCAACATCTGAAACGGCGTGTACGACCCCTTAGACGCGGTTTTAGTAGCGGAGCCAGTCAGTTCCTGAGACATGCCCTTAGCGAGGTAGGTTGCCATTTTCGCAGCGTCTCCACCCCAGGTAGACACCTGATCAAGTTTGACCCCGTGCTCACGCAGTGGCGCGTCCATACCGGCCTTAACCACACCAGCAGACCAGCGGGAAAACATGGAATCCTCAAACGCCTTGAGTTCATCGTCAGACAGTGGACGATCCAAGAACAACAGCATGTTGCGGTGCAAGTGCCAACCGTTCGCCCAAGAGTCTGTGACCTCATAGTCACTATAGGTGTGCTCCACCCCGTACCGTGCACGTTCTTTCTTCCACTGAGATGTTTTCACCATCGAAGAGTACGCAGTCTTAATACCCGCTTCAACCTGCGCAAATGACTGTGAGCGGTTGTGTCGAACAGTGCCCACAAACATCATGAGCGCGCCACCCGCCGCCAAGTGATTCTTAGTAGCAATAGCCAGCTCAATGCGGCGTTCGCCCATGACTTCCAATTCAGCCAGAGATGACCCCCAGCGAGAGTGAGAGTTTTGCAGACCCTCAAACTGCGAAGCACCGTTAGACGACCAGGACACCGCAACAGCTTCGTCCCTGCGCCACCTATGGCACCCCGCCAGAGCCTTACTATTGGTGATCTTGTACATGACGTTTTGCCTACGCCACGCCCTAGCGCGAGTGACCTTAGAACCCTCATTGACCTGCGGTTCCTTAGAGGTGTTCACTTCTATTTCAGTGTTACCTAGACCCGATGTTGTGCGGGGTTGCGCAGTGCGAGTTTGTGCGGGTGTTGTGCCCGTTGTCTTAGCTAGTGCTATGGTTGTCAATTGAAACCCCTTCGGGTTATGTGGCCCCCGTGCATATGAGTTGGTAGCTCGCACGGGGGTTTGTCTTGTCTAGGGACTATTAATTTTTAGTGGTGTTTGGTGGCCGCCTAGCTTGGCTATGCGTGCCAGCTTACCCGTACTCAATGTTAAAGATTTGCATCGACATGGGAGGGTTACGTGTCCGATACCTAGGGGGGGTATCCGCGACTAGGTGCCCCGGTGCTCACTGTCTGTACCGGCGGGGCAAGCCCCACACCCCGCATGGACAGGGTGGCTCCGCCCCCTGCACCCCCAGCAATCTGCATGTACATGTTTTACACATTAGCACGACATGACTGCATGTGCATGCACTGCATGCAGACTAGGTAAATATGAGTATGTACGACTAGTAACAGGAGCACTGCACATAATGAATGAGTTGCAGGACAATGTTTGCTACGCATGCGCATGACATATCGCAGGAAAGCTACTAGAGTCTTAAAGCATGGCAACCAAGGCACAGCTAGAACAGCAACTACAAGAAGCTCAACAGGCACTACAGGCGCAGCAAGCGCAGGCACAAGCCACCATCGAAGCACTAGAAGCGCAGGCAAAGGCTAAGCCCGTCGTGGTCACCGCACGCGTTCCTTTGGCACTACGTGAGGACATGAAGCGCGCAGGCATGCAGAACGGTGAAAACCTCCAAGAGTTCATGATCGCCGCGTTTACCGAGCGGCTAGAAAAGCTCACCACCACCGACAACGAGGAAAACAATGTCTAACCCACTAGTTCTCTTTGCCCACCGTGACCCGGTAAATGACGTGACGTTCGAGTGCATTGAGCACGCCACCTACGACACACTTTCACACGCTAAAGACCAGATCACCGCCCAAATGCAAGCCCTAGACGAAGAAGCCGCCCTACTGCCCTAATGGGTGTTTCATGGGTGTTTCCCTAGTGTTTCATGGTGTTTTCACCTAAGCTAGGGAATTGCGCGAGAAGTCTCGCAAAAATCAGCAACCCCCGGAACCACACAGTTCACGGGGGTTCTTCTATGCCAGAAATCAGAAAGGGGAACCAGTGAACGACCCCGAATGGCTGGATGATCCTCCTTGGGCCACGCCCACCCGGCGATCATCGAGGCGGTCACCACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGTGTGGTACCATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGCTAGCGAAAGGACATCAACGATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGG CATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTAC GGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGA ATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACC GTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACAT ATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCG TCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTT TTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTG TGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAAAAGCTTCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGGAATCATGACCTGAGCTGTTTACAATTAATCATCGTGTGGTACCATGTGTGGAATTGGAAAGGACTTGAACGATGTCCATCTACCAAGAGTTTGTGAATAAATACTCCCTGTCCAAGACCCTCCGTTTTGAGCTGATCCCCCAAGGCAAGACCCTCGAAAACATCAAGGCACGCGGCCTCATCCTGGATGACGAAAAGCGCGCTAAGGATTACAAGAAGGCAAAGCAGATCATCGACAAGTACCACCAGTTCTTCATCGAAGAGATCCTGTCCTCCGTGTGCATCTCCGAGGACCTGCTCCAGAACTACTCCGATGTCTACTTCAAGCTCAAGAAGTCCGATGACGATAACCTGCAGAAGGACTTCAAGTCCGCTAAGGATACCATCAAGAAGCAGATCTCCGAATACATCAAGGATTCCGAGAAGTTCAAGAACCTCTTCAACCAGAACCTGATCGACGCAAAGAAGGGCCAGGAATCCGATCTCATCCTGTGGCTCAAGCAGTCCAAGGATAACGGCATCGAGCTCTTCAAGGCCAACTCCGACATCACCGACATCGATGAAGCTCTGGAGATCATCAAGTCCTTCAAGGGCTGGACCACCTACTTCAAGGGCTTCCACGAAAACCGCAAGAACGTGTACTCCTCCAACGATATCCCAACCTCTATCATCTACCGCATCGTCGACGATAACCTGCCAAAGTTCCTCGAAAACAAGGCAAAGTACGAGTCCCTGAAGGATAAGGCCCCAGAAGCTATCAACTACGAGCAGATCAAGAAGGACCTGGCCGAAGAGCTCACCTTCGACATCGATTACAAGACCTCTGAAGTGAACCAGCGCGTCTTCTCCCTCGATGAAGTGTTCGAGATCGCCAACTTCAACAACTACCTGAACCAGTCCGGCATCACCAAGTTCAACACCATCATCGGCGGCAAGTTCGTCAACGGCGAAAACACCAAGCGCAAGGGCATCAACGAGTACATCAACCTCTACTCCCAGCAGATCAACGATAAGACCCTGAAGAAGTACAAGATGTCCGTGCTCTTCAAGCAGATCCTGTCCGACACCGAATCCAAGTCCTTCGTCATCGACAAGCTGGAGGACGATTCCGATGTGGTCACCACCATGCAGTCCTTCTACGAACAGATCGCAGCCTTCAAGACCGTGGAAGAGAAGTCCATCAAGGAGACCCTCTCCCTGCTCTTCGACGATCTGAAGGCTCAGAAGCTGGATCTCTCCAAGATCTACTTCAAGAACGACAAGTCCCTGACCGATCTCTCCCAGCAGGTCTTCGACGATTACTCCGTGATCGGCACCGCAGTCCTGGAATACATCACCCAGCAGATCGCCCCAAAGAACCTCGATAACCCATCCAAGAAGGAACAGGAGCTGATCGCCAAGAAGACCGAAAAGGCTAAGTACCTGTCCCTCGAGACCATCAAGCTGGCTCTCGAAGAGTTCAACAAGCACCGCGACATCGATAAGCAGTGCCGCTTCGAAGAGATCCTCGCAAACTTCGCTGCAATCCCAATGATCTTCGACGAAATCGCACAGAACAAGGATAACCTGGCCCAGATCTCCATCAAGTACCAGAACCAGGGCAAGAAGGATCTGCTCCAGGCCTCCGCTGAGGACGATGTGAAGGCAATCAAGGACCTGCTCGATCAGACCAACAACCTGCTCCACAAGCTGAAGATCTTCCACATCTCCCAGTCCGAAGACAAGGCCAACATCCTCGACAAGGATGAGCACTTCTACCTGGTGTTCGAAGAGTGCTACTTCGAACTCGCTAACATCGTCCCACTGTACAACAAGATCCGCAACTACATCACCCAGAAGCCATACTCCGATGAAAAGTTCAAGCTCAACTTCGAGAACTCCACCCTGGCAAACGGCTGGGACAAGAACAAGGAACCAGATAACACCGCCATCCTCTTCATCAAGGACGATAAGTACTACCTGGGCGTGATGAACAAGAAGAACAACAAGATCTTCGACGATAAGGCCATCAAGGAAAACAAGGGCGAGGGCTACAAGAAGATCGTGTACAAGCTGCTCCCAGGCGCTAACAAGATGCTCCCAAAGGTCTTCTTCTCCGCAAAGTCCATCAAGTTCTACAACCCATCCGAAGATATCCTGCGCATCCGCAACCACTCCACCCACACCAAGAACGGCTCCCCACAGAAGGGCTACGAAAAGTTCGAGTTCAACATCGAAGACTGCCGCAAGTTCATCGATTTCTACAAGCAGTCCATCTCCAAGCACCCAGAGTGGAAGGACTTCGGCTTCCGCTTCTCCGATACCCAGCGCTACAACTCCATCGATGAATTCTACCGCGAAGTGGAGAACCAGGGCTACAAGCTGACCTTCGAAAACATCTCCGAGTCCTACATCGATTCCGTGGTCAACCAGGGCAAGCTGTACCTCTTCCAGATCTACAACAAGGACTTCTCCGCTTACTCCAAGGGCCGCCCAAACCTGCACACCCTCTACTGGAAGGCACTCTTCGACGAACGCAACCTGCAGGATGTGGTCTACAAGCTCAACGGCGAAGCAGAGCTGTTCTACCGCAAGCAGTCCATCCCAAAGAAGATCACCCACCCAGCCAAGGAAGCAATCGCCAACAAGAACAAGGATAACCCAAAGAAGGAATCCGTGTTCGAGTACGACCTGATCAAGGATAAGCGCTTCACCGAGGACAAGTTCTTCTTCCACTGCCCAATCACCATCAACTTCAAGTCCTCCGGCGCCAACAAGTTCAACGATGAAATCAACCTGCTCCTGAAGGAGAAGGCTAACGACGTGCACATCCTGTCCATCGATCGCGGCGAACGCCACCTCGCCTACTACACCCTGGTCGACGGCAAGGGCAACATCATCAAGCAGGACACCTTCAACATCATCGGCAACGATCGCATGAAGACCAACTACCACGACAAGCTGGCCGCTATCGAGAAGGACCGCGATTCCGCTCGCAAGGATTGGAAGAAGATCAACAACATCAAGGAAATGAAGGAAGGCTACCTCTCCCAGGTGGTCCACGAAATCGCTAAGCTGGTGATCGAGTACAACGCAATCGTGGTCTTCGAAGACCTGAACTTCGGCTTCAAGCGCGGCCGCTTCAAGGTGGAGAAGCAGGTCTACCAGAAGCTGGAAAAGATGCTCATCGAGAAGCTGAACTACCTCGTGTTCAAGGACAACGAATTCGATAAGACCGGCGGCGTCCTCCGTGCATACCAGCTGACCGCCCCATTCGAGACCTTCAAGAAGATGGGCAAGCAGACCGGCATCATCTACTACGTGCCAGCTGGCTTCACCTCTAAGATCTGCCCAGTGACCGGCTTCGTCAACCAGCTCTACCCAAAGTACGAATCCGTCTCCAAGTCCCAGGAGTTCTTCTCCAAGTTCGACAAGATCTGCTACAACCTGGATAAGGGCTACTTCGAATTCTCCTTCGACTACAAGAACTTCGGCGATAAGGCAGCCAAGGGCAAGTGGACCATCGCATCCTTCGGCTCCCGCCTCATCAACTTCCGCAACTCCGACAAGAACCACAACTGGGATACCCGCGAAGTGTACCCAACCAAGGAACTGGAGAAGCTCCTGAAGGATTACTCCATCGAATACGGCCACGGCGAGTGCATCAAGGCTGCAATCTGCGGCGAATCCGACAAGAAGTTCTTCGCAAAGCTGACCTCTGTGCTCAACACCATCCTGCAGATGCGCAACTCCAAGACCGGCACCGAGCTGGATTACCTCATCTCCCCAGTGGCCGACGTCAACGGCAACTTCTTCGATTCCCGCCAGGCTCCAAAGAACATGCCACAGGACGCTGATGCAAACGGCGCCTACCACATCGGTCTGAAGGGTCTCATGCTCCTGGGTCGCATCAAGAACAACCAGGAAGGCAAGAAGCTGAATCTCGTCATTAAGAACGAAGAATACTTTGAATTTGTCCAGAACCGCAATAACTAAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGATGGCCTTCTGCTTAATTTGATGCCTGGCAGTTTATGGCGGGCGTCCTGCCCGCCACCCTCCGGGCCGTTGCTTCGCAACGTTCAAATCCGCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTAAATCCGGACAGGTC GGTCTTGACAATCTACAACAGTAGAAATTCGGATCCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGTATACATAGGGCCCGGTGAACAGTTGTTCTACTTTTGTTTGTTAGTCTTGATGCTTCACTGATAGATACAAGAGCCATAAGAACCTCAGATCCTTCCGTATTTAGCCAGTATGTTCTCTAGTGTGGTTCGTTGTTTTTGCGTGAGCCATGAGAACGAACCATTGAGATCATGCTTACTTTGCATGTCACTCAAAAATTTTGCCTCAAAACTGGTGAGCTGAATTTTTGCAGTTAAAGCATCGTGTAGTGTTTTTCTTAGTCCGTTATGTAGGTAGGAATCTGATGTAATGGTTGTTGGTATTTTGTCACCATTCATTTTTATCTGGTTGTTCTCAAGTTCGGTTACGAGATCCATTTGTCTATCTAGTTCAACTTGGAAAATCAACGTATCAGTCGGGCGGCCTCGCTTATCAACCACCAATTTCATATTGCTGTAAGTGTTTAAATCTTTACTTATTGGTTTCAAAACCCATTGGTTAAGCCTTTTAAACTCATGGTAGTTATTTTCAAGCATTAACATGAACTTAAATTCATCAAGGCTAATCTCTATATTTGCCTTGTGAGTTTTCTTTTGTGTTAGTTCTTTTAATAACCACTCATAAATCCTCATAGAGTATTTGTTTTCAAAAGACTTAACATGTTCCAGATTATATTTTATGAATTTTTTTAACTGGAAAAGATAAGGCAATATCTCTTCACTAAAAACTAATTCTAATTTTTCGCTTGAGAACTTGGCATAGTTTGTCCACTGGAAAATCTCAAAGCCTTTAACCAAAGGATTCCTGATTTCCACAGTTCTCGTCATCAGCTCTCTGGTTGCTTTAGCTAATACACCATAAGCATTTTCCCTACTGATGTTCATCATCTGAGCGTATTGGTTATAAGTGAACGATACCGTCCGTTCTTTCCTTGTAGGGTTTTCAATCGTGGGGTTGAGTAGTGCCACACAGCATAAAATTAGCTTGGTTTCATGCTCCGTTAAGTCATAGCGACTAATCGCTAGTTCATTTGCTTTGAAAACAACTAATTCAGACATACATCTCAATTGGTCTAGGTGATTTTAATCACTATACCAATTGAGATGGGCTAGTCAATGATAATTA
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> BAA220096A
<130> 一种在棒状杆菌中辅助sacB基因编辑系统的CRISPR-cpf1筛选工具
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10024
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctagtccttt tcctttgagt tgtgggtatc tgtaaattct gctagacctt tgctggaaaa 60
cttgtaaatt ctgctagacc ctctgtaaat tccgctagac ctttgtgtgt tttttttgtt 120
tatattcaag tggttataat ttatagaata aagaaagaat aaaaaaagat aaaaagaata 180
gatcccagcc ctgtgtataa ctcactactt tagtcagttc cgcagtatta caaaaggatg 240
tcgcaaacgc tgtttgctcc tctacaaaac agaccttaaa accctaaagg cttaagtagc 300
accctcgcaa gctcgggcaa atcgctgaat attccttttg tctccgacca tcaggcacct 360
gagtcgctgt ctttttcgtg acattcagtt cgctgcgctc acggctctgg cagtgaatgg 420
gggtaaatgg cactacaggc gccttttatg gattcatgca aggaaactac ccataataca 480
agaaaagccc gtcacgggct tctcagggcg ttttatggcg ggtctgctat gtggtgctat 540
ctgacttttt gctgttcagc agttcctgcc ctctgatttt ccagtctgac cacttcggat 600
tatcccgtga caggtcattc agactggcta atgcacccag taaggcagcg gtatcatcaa 660
ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 720
aaaggatctt cacctagatc ctttacgctc cgggacgcca acaacaagac ccatcatagt 780
ttgcccccgc gacattgacc ataaattcat cgcacaaaat atcgaacggg gtttatgccg 840
cttttagtgg gtgcgaagaa tagtctgctc attacccgcg aacaccgccg cattcagatc 900
acgcttagta gcgtccccat gagtaggcag aaccgcgtcc aagtccacat catccataac 960
gatcatgcac ggggtggaat ccacacccag acttgccagc acctcattag cgacacgttg 1020
cgcagcggcc acgtccttag ccttatccac gcaatcgaga acgtactgcc taaccgcgaa 1080
atcagactga atcagtttcc aatcatcggg cttcaccaaa gcaacagcaa cgcgggttga 1140
ttcgacccgt tccggtgctt ccagaccggc gagcttgtac agttcttctt ccatttcacg 1200
acgtacatca gcgtctatgt aatcaatgcc caaagcacgc ttagccccac gtgaccagga 1260
cgaacgcagg tttttagaac caacctcata ctcacgccac cgagccacca aaacagcgtc 1320
catatcctcg ccggcgtcgc tttgatcggc caacatatcc aacatctgaa acggcgtgta 1380
cgacccctta gacgcggttt tagtagcgga gccagtcagt tcctgagaca tgcccttagc 1440
gaggtaggtt gccattttcg cagcgtctcc accccaggta gacacctgat caagtttgac 1500
cccgtgctca cgcagtggcg cgtccatacc ggccttaacc acaccagcag accagcggga 1560
aaacatggaa tcctcaaacg ccttgagttc atcgtcagac agtggacgat ccaagaacaa 1620
cagcatgttg cggtgcaagt gccaaccgtt cgcccaagag tctgtgacct catagtcact 1680
ataggtgtgc tccaccccgt accgtgcacg ttctttcttc cactgagatg ttttcaccat 1740
cgaagagtac gcagtcttaa tacccgcttc aacctgcgca aatgactgtg agcggttgtg 1800
tcgaacagtg cccacaaaca tcatgagcgc gccacccgcc gccaagtgat tcttagtagc 1860
aatagccagc tcaatgcggc gttcgcccat gacttccaat tcagccagag atgaccccca 1920
gcgagagtga gagttttgca gaccctcaaa ctgcgaagca ccgttagacg accaggacac 1980
cgcaacagct tcgtccctgc gccacctatg gcaccccgcc agagccttac tattggtgat 2040
cttgtacatg acgttttgcc tacgccacgc cctagcgcga gtgaccttag aaccctcatt 2100
gacctgcggt tccttagagg tgttcacttc tatttcagtg ttacctagac ccgatgttgt 2160
gcggggttgc gcagtgcgag tttgtgcggg tgttgtgccc gttgtcttag ctagtgctat 2220
ggttgtcaat tgaaacccct tcgggttatg tggcccccgt gcatatgagt tggtagctcg 2280
cacgggggtt tgtcttgtct agggactatt aatttttagt ggtgtttggt ggccgcctag 2340
cttggctatg cgtgccagct tacccgtact caatgttaaa gatttgcatc gacatgggag 2400
ggttacgtgt ccgataccta gggggggtat ccgcgactag gtgccccggt gctcactgtc 2460
tgtaccggcg gggcaagccc cacaccccgc atggacaggg tggctccgcc ccctgcaccc 2520
ccagcaatct gcatgtacat gttttacaca ttagcacgac atgactgcat gtgcatgcac 2580
tgcatgcaga ctaggtaaat atgagtatgt acgactagta acaggagcac tgcacataat 2640
gaatgagttg caggacaatg tttgctacgc atgcgcatga catatcgcag gaaagctact 2700
agagtcttaa agcatggcaa ccaaggcaca gctagaacag caactacaag aagctcaaca 2760
ggcactacag gcgcagcaag cgcaggcaca agccaccatc gaagcactag aagcgcaggc 2820
aaaggctaag cccgtcgtgg tcaccgcacg cgttcctttg gcactacgtg aggacatgaa 2880
gcgcgcaggc atgcagaacg gtgaaaacct ccaagagttc atgatcgccg cgtttaccga 2940
gcggctagaa aagctcacca ccaccgacaa cgaggaaaac aatgtctaac ccactagttc 3000
tctttgccca ccgtgacccg gtaaatgacg tgacgttcga gtgcattgag cacgccacct 3060
acgacacact ttcacacgct aaagaccaga tcaccgccca aatgcaagcc ctagacgaag 3120
aagccgccct actgccctaa tgggtgtttc atgggtgttt ccctagtgtt tcatggtgtt 3180
ttcacctaag ctagggaatt gcgcgagaag tctcgcaaaa atcagcaacc cccggaacca 3240
cacagttcac gggggttctt ctatgccaga aatcagaaag gggaaccagt gaacgacccc 3300
gaatggctgg atgatcctcc ttgggccacg cccacccggc gatcatcgag gcggtcacca 3360
catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt gacaattaat catcgtgtgg 3420
taccatgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagaa ttcgctagcg 3480
aaaggacatc aacgatggag aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat 3540
ggcatcgtaa agaacatttt gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga 3600
ccgttcagct ggatattacg gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt 3660
atccggcctt tattcacatt cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg 3720
caatgaaaga cggtgagctg gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc 3780
atgagcaaac tgaaacgttt tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt 3840
ttctacacat atattcgcaa gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta 3900
aagggtttat tgagaatatg tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt 3960
ttgatttaaa cgtggccaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat 4020
attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgtct 4080
gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc 4140
agggcggggc gtaaaagctt ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag 4200
attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg 4260
gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt 4320
gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca 4380
gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag 4440
gacaaatccg ccgggagcgg atttgaacgt tgcgaagcaa cggcccggag ggtggcgggc 4500
aggacgcccg ccataaactg ccaggcatca aattaagcag aaggccatcc tgacggatgg 4560
cctttttgcg tttctacaaa ctcttttgtt tatttttcta aatacattca aatatgggaa 4620
tcatgacctg agctgtttac aattaatcat cgtgtggtac catgtgtgga attggaaagg 4680
acttgaacga tgtccatcta ccaagagttt gtgaataaat actccctgtc caagaccctc 4740
cgttttgagc tgatccccca aggcaagacc ctcgaaaaca tcaaggcacg cggcctcatc 4800
ctggatgacg aaaagcgcgc taaggattac aagaaggcaa agcagatcat cgacaagtac 4860
caccagttct tcatcgaaga gatcctgtcc tccgtgtgca tctccgagga cctgctccag 4920
aactactccg atgtctactt caagctcaag aagtccgatg acgataacct gcagaaggac 4980
ttcaagtccg ctaaggatac catcaagaag cagatctccg aatacatcaa ggattccgag 5040
aagttcaaga acctcttcaa ccagaacctg atcgacgcaa agaagggcca ggaatccgat 5100
ctcatcctgt ggctcaagca gtccaaggat aacggcatcg agctcttcaa ggccaactcc 5160
gacatcaccg acatcgatga agctctggag atcatcaagt ccttcaaggg ctggaccacc 5220
tacttcaagg gcttccacga aaaccgcaag aacgtgtact cctccaacga tatcccaacc 5280
tctatcatct accgcatcgt cgacgataac ctgccaaagt tcctcgaaaa caaggcaaag 5340
tacgagtccc tgaaggataa ggccccagaa gctatcaact acgagcagat caagaaggac 5400
ctggccgaag agctcacctt cgacatcgat tacaagacct ctgaagtgaa ccagcgcgtc 5460
ttctccctcg atgaagtgtt cgagatcgcc aacttcaaca actacctgaa ccagtccggc 5520
atcaccaagt tcaacaccat catcggcggc aagttcgtca acggcgaaaa caccaagcgc 5580
aagggcatca acgagtacat caacctctac tcccagcaga tcaacgataa gaccctgaag 5640
aagtacaaga tgtccgtgct cttcaagcag atcctgtccg acaccgaatc caagtccttc 5700
gtcatcgaca agctggagga cgattccgat gtggtcacca ccatgcagtc cttctacgaa 5760
cagatcgcag ccttcaagac cgtggaagag aagtccatca aggagaccct ctccctgctc 5820
ttcgacgatc tgaaggctca gaagctggat ctctccaaga tctacttcaa gaacgacaag 5880
tccctgaccg atctctccca gcaggtcttc gacgattact ccgtgatcgg caccgcagtc 5940
ctggaataca tcacccagca gatcgcccca aagaacctcg ataacccatc caagaaggaa 6000
caggagctga tcgccaagaa gaccgaaaag gctaagtacc tgtccctcga gaccatcaag 6060
ctggctctcg aagagttcaa caagcaccgc gacatcgata agcagtgccg cttcgaagag 6120
atcctcgcaa acttcgctgc aatcccaatg atcttcgacg aaatcgcaca gaacaaggat 6180
aacctggccc agatctccat caagtaccag aaccagggca agaaggatct gctccaggcc 6240
tccgctgagg acgatgtgaa ggcaatcaag gacctgctcg atcagaccaa caacctgctc 6300
cacaagctga agatcttcca catctcccag tccgaagaca aggccaacat cctcgacaag 6360
gatgagcact tctacctggt gttcgaagag tgctacttcg aactcgctaa catcgtccca 6420
ctgtacaaca agatccgcaa ctacatcacc cagaagccat actccgatga aaagttcaag 6480
ctcaacttcg agaactccac cctggcaaac ggctgggaca agaacaagga accagataac 6540
accgccatcc tcttcatcaa ggacgataag tactacctgg gcgtgatgaa caagaagaac 6600
aacaagatct tcgacgataa ggccatcaag gaaaacaagg gcgagggcta caagaagatc 6660
gtgtacaagc tgctcccagg cgctaacaag atgctcccaa aggtcttctt ctccgcaaag 6720
tccatcaagt tctacaaccc atccgaagat atcctgcgca tccgcaacca ctccacccac 6780
accaagaacg gctccccaca gaagggctac gaaaagttcg agttcaacat cgaagactgc 6840
cgcaagttca tcgatttcta caagcagtcc atctccaagc acccagagtg gaaggacttc 6900
ggcttccgct tctccgatac ccagcgctac aactccatcg atgaattcta ccgcgaagtg 6960
gagaaccagg gctacaagct gaccttcgaa aacatctccg agtcctacat cgattccgtg 7020
gtcaaccagg gcaagctgta cctcttccag atctacaaca aggacttctc cgcttactcc 7080
aagggccgcc caaacctgca caccctctac tggaaggcac tcttcgacga acgcaacctg 7140
caggatgtgg tctacaagct caacggcgaa gcagagctgt tctaccgcaa gcagtccatc 7200
ccaaagaaga tcacccaccc agccaaggaa gcaatcgcca acaagaacaa ggataaccca 7260
aagaaggaat ccgtgttcga gtacgacctg atcaaggata agcgcttcac cgaggacaag 7320
ttcttcttcc actgcccaat caccatcaac ttcaagtcct ccggcgccaa caagttcaac 7380
gatgaaatca acctgctcct gaaggagaag gctaacgacg tgcacatcct gtccatcgat 7440
cgcggcgaac gccacctcgc ctactacacc ctggtcgacg gcaagggcaa catcatcaag 7500
caggacacct tcaacatcat cggcaacgat cgcatgaaga ccaactacca cgacaagctg 7560
gccgctatcg agaaggaccg cgattccgct cgcaaggatt ggaagaagat caacaacatc 7620
aaggaaatga aggaaggcta cctctcccag gtggtccacg aaatcgctaa gctggtgatc 7680
gagtacaacg caatcgtggt cttcgaagac ctgaacttcg gcttcaagcg cggccgcttc 7740
aaggtggaga agcaggtcta ccagaagctg gaaaagatgc tcatcgagaa gctgaactac 7800
ctcgtgttca aggacaacga attcgataag accggcggcg tcctccgtgc ataccagctg 7860
accgccccat tcgagacctt caagaagatg ggcaagcaga ccggcatcat ctactacgtg 7920
ccagctggct tcacctctaa gatctgccca gtgaccggct tcgtcaacca gctctaccca 7980
aagtacgaat ccgtctccaa gtcccaggag ttcttctcca agttcgacaa gatctgctac 8040
aacctggata agggctactt cgaattctcc ttcgactaca agaacttcgg cgataaggca 8100
gccaagggca agtggaccat cgcatccttc ggctcccgcc tcatcaactt ccgcaactcc 8160
gacaagaacc acaactggga tacccgcgaa gtgtacccaa ccaaggaact ggagaagctc 8220
ctgaaggatt actccatcga atacggccac ggcgagtgca tcaaggctgc aatctgcggc 8280
gaatccgaca agaagttctt cgcaaagctg acctctgtgc tcaacaccat cctgcagatg 8340
cgcaactcca agaccggcac cgagctggat tacctcatct ccccagtggc cgacgtcaac 8400
ggcaacttct tcgattcccg ccaggctcca aagaacatgc cacaggacgc tgatgcaaac 8460
ggcgcctacc acatcggtct gaagggtctc atgctcctgg gtcgcatcaa gaacaaccag 8520
gaaggcaaga agctgaatct cgtcattaag aacgaagaat actttgaatt tgtccagaac 8580
cgcaataact aagtcgacct gcaggcatgc aagcttaaga gtttgtagaa acgcaaaaag 8640
gccatccgtc aggatggcct tctgcttaat ttgatgcctg gcagtttatg gcgggcgtcc 8700
tgcccgccac cctccgggcc gttgcttcgc aacgttcaaa tccgctcccg gcggatttgt 8760
cctactcagg agagcgttca ccgacaaaca acagataaaa cgaaaggccc agtctttcga 8820
ctgagccttt cgttttattt aaatccggac aggtcggtct tgacaatcta caacagtaga 8880
aattcggatc cattatacct aggactgagc tagctgtcaa gtatacatag ggcccggtga 8940
acagttgttc tacttttgtt tgttagtctt gatgcttcac tgatagatac aagagccata 9000
agaacctcag atccttccgt atttagccag tatgttctct agtgtggttc gttgtttttg 9060
cgtgagccat gagaacgaac cattgagatc atgcttactt tgcatgtcac tcaaaaattt 9120
tgcctcaaaa ctggtgagct gaatttttgc agttaaagca tcgtgtagtg tttttcttag 9180
tccgttatgt aggtaggaat ctgatgtaat ggttgttggt attttgtcac cattcatttt 9240
tatctggttg ttctcaagtt cggttacgag atccatttgt ctatctagtt caacttggaa 9300
aatcaacgta tcagtcgggc ggcctcgctt atcaaccacc aatttcatat tgctgtaagt 9360
gtttaaatct ttacttattg gtttcaaaac ccattggtta agccttttaa actcatggta 9420
gttattttca agcattaaca tgaacttaaa ttcatcaagg ctaatctcta tatttgcctt 9480
gtgagttttc ttttgtgtta gttcttttaa taaccactca taaatcctca tagagtattt 9540
gttttcaaaa gacttaacat gttccagatt atattttatg aattttttta actggaaaag 9600
ataaggcaat atctcttcac taaaaactaa ttctaatttt tcgcttgaga acttggcata 9660
gtttgtccac tggaaaatct caaagccttt aaccaaagga ttcctgattt ccacagttct 9720
cgtcatcagc tctctggttg ctttagctaa tacaccataa gcattttccc tactgatgtt 9780
catcatctga gcgtattggt tataagtgaa cgataccgtc cgttctttcc ttgtagggtt 9840
ttcaatcgtg gggttgagta gtgccacaca gcataaaatt agcttggttt catgctccgt 9900
taagtcatag cgactaatcg ctagttcatt tgctttgaaa acaactaatt cagacataca 9960
tctcaattgg tctaggtgat tttaatcact ataccaattg agatgggcta gtcaatgata 10020
atta 10024

Claims (10)

1.一种基因编辑系统，其特征在于，所述编辑系统由带有目标基因同源修复模板的pK18mobsacB质粒及反向筛选工具组成；所述反向筛选工具含有靶向pK18mobsacB质粒的sgRNA的表达模块。
2.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述反向筛选工具还含有Cpf1表达框、温敏型复制子pBL1ts。
3.根据权利要求1或2所述的基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA的表达模块上的靶向位点为pK18mobsacB质粒上的任一位点。
4.根据权利要求3所述的基因编辑系统，其特征在于，当靶向位点为pK18mobsacB质粒上的卡那霉素抗性基因时，所述反向筛选工具的序列如SEQ ID NO.1所示。
5.一种编辑菌株的方法，其特征在于，利用权利要求1～4任一所述基因编辑系统对菌株进行两轮交换实现基因编辑。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用pK18mobsacB质粒转入宿主细胞中，培养、并验证获得第一轮交换菌株；向第一轮交换菌株中转入所述反向筛选工具，培养、并验证获得第二轮交换菌株，即为基因编辑后的菌株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将转入了pK18mobsacB质粒的宿主细胞在LBBK培养基中培养，筛选获得第一轮交换菌株；所述LBBK培养基中含有1～5g/L酵母提取物，4～8g/L氯化钠，4～8g/L蛋白胨，15～20g/L脑心浸液和10～100mg/L卡那霉素。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，将转入了反向筛选工具的菌株在LBBSC培养基中培养，筛选获得基因编辑后的菌株；所述LBBSC培养基中含有1～5g/L酵母提取物，4～8g/L氯化钠，4～8g/L蛋白胨，15～20g/L脑心浸液，80～150g/L蔗糖，5～15mg/L氯霉素。
9.权利要求1～4任一所述基因编辑系统在棒状杆菌基因编辑中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述棒状杆菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌。
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