JPH044881A - シチジンアナログ耐性化遺伝子ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生化学試薬あるいは、医薬品の合成原料とし
て有用な物質であるシチジンの製造法に関する。

従来の技術 醗酵法によりシチジンを製造しようとする場合、野生株
はほとんど菌体外にシチジンを生産しないので、野生株
に人工的突然変異を生起せしめてソチジン生成能を付与
する方法が取られている。従来、シチジンの醗酵生産法
としては、バチルス・ズブチリスあるいは、プロテウス
・レトゲリ−の変異株を用いる方法（特開昭３６−２１
４９９号）、ブレビバクテリウム属細菌から誘導された
プリンアナログ耐性株、ピリミジンアナログ耐性株お−
よび／またはヒスチノンアナログ耐性昧を用いる方法（
特開昭５７−’１８８７１号）、ミクロバクテリウム属
細菌から誘導されたプリンアナログ耐性株を用いる方法
（特開昭５７−１８８７２号）、バチルス属細菌から誘
導されたノチジンデアミナーゼ活性を欠損し、かつ、ピ
リミジンアナログ耐性をもつ株を用いる方法（特開昭６
１−１３５５９７号）などが知られている。

発明が解決しようとする課題 シチジン生産菌の改良については上記のような技術が知
られているが、従来の変異処理方法では、特定の遺伝子
を選択的に増幅させることによって収量の増大をはかる
ことができない。

課題を解決するための手段 本発明者らは、遺伝子組換え技術をシチジン生産菌の育
種に利用する研究を重ねた結果、シチジンアナログ耐性
を示すバチルス属細菌からシチジン５°−トリフォスフ
ェート合成酵素をコードする遺伝領域（以下、ＣＴＰ合
成酵素遺伝子と称する）を分離することに成功し、これ
がシチジンアナログ耐性をらたらすこと、さらにこれが
組み込まれたプラスミドを用いて形質転換せしめた菌株
が、培地中に著量のシチジンを蓄積することを見いだし
、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、（１）シチジンアナログ耐性を示
すバチルス属細菌の染色体ＤＮＡから得られたＣＴＰ合
成酵素遺伝子を含むＤＮＡ、特に、シチジンアナログ耐
性をもたらすＣＴＰ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ、（２
）該ＤＮＡが組み込まれたプラスミド、（３）該プラス
ミドで形質転換された細菌、特に、シチジン生産能を有
するバチルス属細菌、（４）シチジンアナログ耐性をも
ｆ二らすＣＴＰ合成酵素遺伝子が組み込まれたプラスミ
ドで形質転換されたシチジン生産能を有するバチルス属
細菌を培養し、培養物中にシチジンを生成蓄積させこれ
を採取することを特徴とするシチジンの製造法を提供す
るものである。

本発明に用いられるＤＮＡは、シチジンアナログ耐性を
示しシチジン生産能を有するバチルス属細菌より分離す
ることができる。また、このようなりＮＡは、野生型の
バチルス属細菌よりＣＴＰ合成酵素遺伝子を分離した後
、ＣＴＰ合成酵素遺伝子をプラスミドベクターに挿入し
て得られる組換えＤＮＡに変異処理を施したり、あるい
は上記組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入して得られる
形質転換株に変異処理を施すことによって造成すること
ができる。ＤＮＡ供与菌の具体例としては、バチルス・
ズブチリスＮｏ、　ｌ　２２（Ｉ　ＦＯ＋４３８６．Ｆ
ＥＲＭ　　Ｐ−７９０８）から誘導されたシチジンアナ
ログ耐性変異株であるバチルス・ズブチリスＤＦＣＲ−
１００株（ＩＦＯ１５０２６、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８
６０）があげられる。ここでいうシチジンアナログ耐性
株とはバチルス属細菌を親株として誘導される変異株で
あり、親株の生育できない濃度のシチジンアナログを含
む培地において生育できる菌株をいう。また、ここでい
うシチジンアナログとは、その生育阻害効果がシチジン
によって回復される物質を意味し、例えば、５−フルオ
ロシチジン、２−チオシチジン、６−アザシチジン、３
−デアザウラシル、３−デアザウリジンなどをいう。

ＣＴＰ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離する方法
は、供与菌よりまず染色体ＤＮＡを抽出し［例えば、バ
イオシミ力・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　　７２゜６１
９（＋９６３）の方法が使用できる］、これを適当な制
限酵素で切断する方法があげられる。

ＣＴＰ合成酵素遺伝子はシチジンアナログ耐性をもたら
すことができ、それを含むＤＮＡの代表的な例として、
約７５キロベース離れた二つのＰｓ［切断点を有し、か
つ、該ＰｓｔＩ断片中に２カ所のＥｃｏＲＩ切断点と、
１カ所のＰｖｕｌｌ切断点を有するものがあげられる。

ついで、このようにして得られたＣＴＰ合成酵素遺伝子
を含む染色体ＤＮＡ断片は、ベクターＤＮＡに挿入され
る。

本発明で使用されるベクターＤＮＡは、バチルス属細菌
で増殖しうるしの、または、エシェリヒア属細菌および
バチルス属細菌で増殖できるもの（いわゆるシャトルベ
クター）、めろいはバチルス属に属する宿主中で自己複
製する能力を欠くベクターＤＮＡとバチルス属細菌の染
色体ＤＩ’ＪＡの組換え体であり、該宿主菌内で自己複
製することなく宿主菌の染色体内に該組換え体Ｄ　Ｎ　
Ａを安定に挿入せしめることのできるもの（いわゆるイ
ンテグレーンヨンヘクター）の中から適宜選択すること
ができる。バチルス属細菌で増殖可能なプラスミドとし
ては、ｐＵＢＩＩＯ［ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジ−（Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　　Ｉ　３４
３１８（１９７８）コ、ｐｃ１９４［プロシーデインゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｌＡｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）、　７４　、Ｉ　６８０（
１９７７）］、ｐＬＳ２８［ツヤ−ナル・オブ・バクテ
リオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　　ｌ　
３１６９９（＋９７７）］などがあげられる。また、エ
エシェリヒア属細およびバチルス属細菌の双方で増殖で
きるいわゆるシャトルベクターとしては、例えば、ｐＨ
Ｖ１４［ブロン−デインゲス・オブ・ナンヨナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　５ｃｉＵ、Ｓ、Ａ、
）、７５．１４３３（１９７８）］、ｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋ［ジャパニーズ・ジャーナル・才ブ・ジェネティック
ス（Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｇｅｎｅｔ、）、　　６１５１５
（＋９８６）］などがあげられる。また、インテグレー
ションベクターとしては、ｐＪＨｌｏｌ［ジャーナル・
オブ・バタテリオロノー（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　　　！　　５４．　　　ｌ
　　５　１　３（１９８３）コ、ｐＧＸ３４５［ジャー
ナル・オブ・バクテリオロノ−（Ｊ　　、　　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、）、　　　ｌ　　５　７，７　１　８（＋
　　９　８　４）コなどがあげられる。また、これら既
知のものの他に、新たに分離されたり合成されｆニリし
たベクタ−ＤＮＡであっても、本発明の目的を達成しう
るしのであれば、用いることができる。

これらのプラスミドベクターにＣＴＰ合成酵素遺伝子を
含むＤＮＡ断片を挿入するには、ティ・マニアナイスら
の「モレキュラークローニング」（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ
　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
東大出版会、１９８２年）などに記載された公知の方法
が用いられる。

こうして得られたＣＴＰ合成酵素遺伝子を組み込まれた
ベクターＤＮＡはエシェリヒア属細菌およびバチルス属
細菌に属する細菌の形質転換に用いられる。エシェリヒ
ア属細菌を形質転換する場合には、塩化カルシウムで受
容菌細胞を処理してＤＮＡを導入する方法「ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．
　Ｂｉｏｌ、）５３、＋５９（１９７９）］、すなわち
コンピテントセル法が用いられる。また、バチルス属細
菌を形質転換する場合には、受容菌をプロトプラストに
してＤＮＡを導入する方法［モレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジェネティックス（ＭｏｌＧｅｎ、　Ｇｅｎ
ｅｔ、）、　　ｌ　６８．　　Ｉ　ｌ　ｌ（１９７９）
］あるいは、コンピテントセルを用いる方法［ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、）ｓ＋、７１４（＋９６１）］などの形質転換法か
用いられる。ＣＴＰ合成酵素遺伝子を単離する方法とし
ては、バチルス属細菌やエシェリヒア属細菌のＣＴＰ合
成酵素欠損変異株を形質転換し、ＣＴＰ合成酵素活性を
保有するようになった菌株を単離し、これよりＣＴＰ合
成酵素遺伝子を単離することができる。この手法は、Ｃ
ＴＰ合成酵素欠損変異株がシチジンを含有しない培地に
生育しないのに対し、ＣＴ’Ｐ合成酵素遺伝子が組み込
まれたベクターＤＮＡを保有する形質転換株は、ノチジ
ンを含有しない培地に生育することに基づいている。こ
の受容菌の例としてはエシェリヒア・コリＧ−１４４５
株かあげられる。また、供試するベクターＤＮＡか抗生
物質耐性などの選択マーカーを有する場合には、上記の
選択用培地に当該抗生物質を添加するなどの方法を用い
れば、目的とする形質転換株の選択がより一層容易とな
る。

このようにして得られたＣＴＰ合成酵素遺伝子が組み込
まれたベクターＤＮＡは、その保有株から抽出して他の
受容菌に導入したり、あるいは、抽出された組換えＤＮ
ＡからＣＴＰ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製し
、これを他のベクタープラスミドに連結して用いること
ができる。また、プラスミドを導入する宿主はＣＴＰ合
成酵素欠損株であってもよく、あるいは野生株であって
もよい。また、より高いシチジン生産能をもつ形質転換
株を得るために、シチジンデアミナーゼが欠損していた
り、あるいはピリミジンアナログ耐性などの性質を付与
することによりシチジンまたは、その前駆体の生合成活
性が高まったような変異株や組換え体を受容菌として用
いることもできる。

ここにいう前駆体とは、カルバミルリン酸、カルバミル
アスパラギン酸、アスパラギン酸、ノヒドロオロチン酸
、オロチン酸、５−フォスフオーＤリボシルシリン酸、
オロチン酸、オロチジン、オロチジン５°−モノフォス
フェート、ウラシル、ウリジン、ウリジン５°−モノフ
ォスフェート、ウリジン５−シフオスフェート、ウリジ
ン５トリフオスフエートなどをいう。

このようにして得られた形質転換株の例として、バチル
ス・ズブチリスＣＤＣ−１株の形質転換株であるバチル
ス・ズブチリスＰＩＮＶＩ２８株（ＩＦＯ１５０２８，
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８６１）およびバチルス・ズブチ
リスＤＦＣＲ−１００株（ＩＦＯ１５０２６，ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−２８６０）の形質転換株であるバチルス・ズ
ブチリスＰＩＮＶ２２Ｂ株（ＩＦＯ１５０２９，ＦＥＲ
ＭＢＰ−２８５９）がある。

上記のエシェリヒア・コリＧ−１４４５株は、エシェリ
ヒア・コリＣ６００株［バクテリオロジカル・レビュー
ズ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　Ｒｅｖ、）、　　３６５２
５（１９７２）］を親株として誘導されたもので、ＣＴ
Ｐ合成酵素を欠損しているが、その他の菌学的性質は、
親株と同じである。また、バチルス・ズブチリスＤＦＣ
Ｒ−１００には、バチルス・ズブチリスＮｏ、１２２株
（ＩＦ’０　１４３８６ＦＥＲＭ　　Ｐ−７９０８）を
親株として誘導されたものであり、シチジンデアミナー
ゼを欠損しシチジンアナログに耐性で、シチジン生産能
を有しているが、その他の性質は、親株と同じである。

なお、本明細書において、ＩＦＯ番号は財団法人発酵研
究所（Ｉ　ＰＯ１大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１
７番８５号）への寄託番号、また、ＦＥＲＭ　　Ｐ一番
号は工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ、茨城具
つくば市東１丁目１番３号）への寄託番号であり、ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ一番号はＦＲＴへのブタペスト条約に基づ
く寄託番号である。

上記のようにして得られたシチジン生産菌の培養には、
通常の微生物の培養と同様の方法が用いられる。すなわ
ち、培地としては炭素源、窒素源、無機物、金属塩など
のほかに、必要に応じてアミノ酸、核酸、ビタミン類な
どの栄養源を含有する培地が用いられる。例えば、炭素
源としては、グルコース、シュークロース、マルトース
、ソルビトール、でんぷん、でんぷん糖化液、糖蜜など
が用いられる。窒素源としては、ペプトン、コーン・ス
チープ・リカー、大豆粉、尿素などの有機窒素源のほか
に、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウム塩や、
アンモニアガス、アンモニア水などの無機窒素源が、そ
４＝、ぞれ単独もしくは混合して用いられる。その他の
栄養源としては菌の生育に必要な、各種の無機塩類、ア
ミノ酸類、核酸類、ビタミン類などが適宜選択の上、そ
れぞれ単独らしくは混合して用いられる。さらに、培地
には、必要に応じてシリコンオイル、ポリアルキレング
リコールエーテルなどの消泡剤や界面活性剤などを添加
することができる。培養は、通常、振盪あるいは通気撹
拌深部培養等の好気的条件下に行われる。培地のｐＨは
通常４〜９の範囲が好ましい。培養中にｐＨの変動が観
察される場合には、これを好ましい範囲に修正するため
に、硫酸、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモ
ニアガス、アンモニア水等を適宜添加してもよい。培養
温度は、通常、２０℃〜４５℃の範囲から使用される微
生物の生育およびシチジンの蓄積に好適な温度が選択さ
れる。培養は実質的にンチジン蓄積量が最大になるまで
行われるが、通常、２日間〜６日間の培養で目的を達す
ることができる。

培養物からシチジンを分離、採取するにはすでに公知に
されている通常の精製手段、例えば、沈澱法、イオン交
換樹脂や活性炭などによるクロマトグラフィー法などの
分離精製法が用いられる。

に乳剋 以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明す
る。

実施例 ）シチジン生産菌の育種 バチルス・ズブチリスＮｏ、　Ｉ　２２株（ＩＦＯ１４
３８６、ＦＥＲＭ　　Ｐ−７９０８）を５０μ９／ｊ！
（のＮ−メチル−Ｎｏ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン（ＮＴＧ）で３７℃、２０分間処理した後（以下、Ｎ
ＴＧ処理は同様の条件で行った）、下記の基本培地（Ｍ
Ｔ−９）に０．０１％のウラシルを加えた培地に塗抹し
て３７℃で２日間培養した。

出現したコロニーの中からレプリカ法によってウラシル
要求性変異株を選択した。つぎに、このウラシル要求性
変異株をＮＴＧ処理し、０．０Ｉ％のウラシルを含むＭ
Ｔ−９培地に塗抹して３７℃で２日間培養した。

基本培地（ＭＴ　　９） グルコース　　　　　　　　０．５％ リン酸ｌカリウム　　　　０３％ リン酸２ナトリウム　　　０６６％ 塩化アンモニウ゛ム　　　　０．１％ 塩化ナトリウム　　　　　００５％ 硫酸マグネシウム　　　　１．ＯｍＭ 塩化塩化カルニウム　　　０．ＩｍＭ カザミノ酸　　　　　　　０３％ 寒天　　　　　　　　　　２．０％ （ｐＨ７，２） 出現したコロニーを１００μ９／ＩＩ（ｌのシチジンを
添加したＭＴ−９培地にレプリカして、この培地に生育
できないシチジンデアミナーゼ欠損株を選択した。つぎ
に、上記シチジンデアミナーゼ欠損株をＮＴＧ処理し、
ＭＴ−９培地に塗抹して３７°Ｃで２日間培養した。出
現したコロニー（ウラシル要求性の復帰株）の中から、
シチジンデアミナーゼ欠損株としてバチルス・ズブチリ
スＣＤＤ−１株を選択した。ＣＤＤ−１株をさらにＮＴ
Ｇで処理した後、シチジンアナログの一種である５−フ
ルオロシチノンを５μｇ／ＩＲＩ２含むＭＴ＝９培地に
塗抹して３７℃で３日間培養した。出現したコロニーの
中からシチジン生産能を有する株としてバチルス・ズブ
チリスＦＯＲ−１３株を選択した。ＦＯＲ−１３株をさ
らにＮＴＣで処理した後、シチジンアナログの一種であ
る３−デアザウラシルをｌ　ＯＯＯｕ９／ｘＱ含むＭＴ
−９培地に塗抹して３７℃で３日間培養した。出現した
コロニーの中からシチジン生産能がさらに高まった株と
してバチルス・ズブチリスＤＦＣＲ−１００株（ＩＦＯ
１５０２６，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８６０）を選択した
。

）染色体ＤＮＡの調製 上記１）項で得られたシチジンアナログ耐性を示し、シ
チジンを生産するバチルス・ズブチリスＤＦＣＲ−１０
０株をｌＱの下記に示すし培地に接種し、３７°Ｃで１
２時間培養し、得られた菌体から斉藤らの方法［パイオ
ンミカ・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂ　ｉｏｃｈｉ
ｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）。

７２．６１９（１９６３）コによってＤＮＡを抽出し、
６．０抑の染色体ＤＮＡを得た。

Ｌ培地 バクトドリブトン　１．０％ 酵母エキス　　　　０．５％ 塩化ナトリウム　　０．５％ （ｐＨ７，０） １１１）染色体ＤＮＡベクタープラスミドｐＢＲ３２２
への挿入 以後の実験における実験操作は、特に断わりのないかぎ
り、ティ・マニアティスら、「モレキュラークローニン
グＪ（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、東大出版会、１９８２年）に記載された方法
に従った。

上記ｉ）項で得た染色体ＤＮＡ　Ｉ　ＯＨ２とｐＢＲ３
２２３μ９を制限酵素Ｐｓｔｌにッポンジーン製）を用
いてそれぞれ切断した後、両者を混合しＴ４ファージ由
来のＤＮＡリガーゼにッポンジーン製）によって連結さ
せた。

ｉｖ）ンチジンアナログ耐性をらたらすＣＴＰ合成酵素
遺伝子のクローニング 通常の栄養要求性変異株の取得の際に用いられる方法に
従いエシェリヒア・コリＣ６００株［バクテリオロジカ
ル・レビューズ（Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌＲｅｖ、）、　
　３６．　５２５（１９７２）コよりＮＴＧによる変異
処理とレプリカプレート法の組合せによりＣＴＰ合成酵
素の欠損に基づくシチジン要求株、エシェリヒア・コリ
Ｇ−１４４５株を取得した。

組換えプラスミドの形質転換には、塩化カルシウムで受
容菌細胞を処理してＤＮＡを導入する方法［ジャーナル
・才ブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　　Ｍｏ１
．　　Ｂｉｏｌ、）、　　　５　３．　　１　５　９（
１９７９）コ、すなわち、いわゆるコンピテントセル法
を用いた。

エシェリヒア・コリＧ−１４４５株より調製したコンピ
テントセルの懸濁液に、上記１１１）項で作製したプラ
スミドＤＮＡを加えて形質転換した。つぎに、この形質
転換株を含む懸濁液をテトラサイクリン１２．５μ９／
ｍρを含むＭＴ−９培地に塗抹して３７℃で３日間培養
しｆ：ｏ出現したコロニの中からテトラサイクリン耐性
を有し、かつ、シチジン要求性を消失した形質転換株と
してエシェリヒア・コリＧ−１株（ＩＦ’０　１５０２
７ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８５８）を得た。

■）形質転換株からのプラスミド抽出 形質転換株エシェリヒア・コリＧ−１株を１２．５μ９
／Ｍ（ｌのテトラサイクリンを含むｌρのし培地に接種
して３７℃で１２時間培養した。得られた菌体より最終
的に５００μ９のプラスミドを単離し、これをｐＹＲＧ
ｌｏｏと命名した。

ｖｉ）プラスミドｐＹＲＧ１００の解析ｐＹＲＧ１００
を種々の制限酵素で切断した後、ラムダファージＤＮＡ
にソポンジーン製）のＨｉｎｄＩＩ［分解物を基準にす
るアガロースゲル電気泳動を行い、得られたパターンか
ら、第１図に示すような制限酵素切断地図を作成した。

ｐＹＲＧｌｏｏはｐＢＲ３２２のＰｓｔＩサイトに約７
５キロベースペアのＤＮＡ断片か挿入された組換えプラ
スミドで、図の右側のＰｓｔｌサイトから、３．０．６
．５キロベースペアの位置にＥｃｏＲＩの切断点を有し
、４．８キロベースベアの位置にＰｖｕＩ［の切断点を
有する。

ｖｉｉ　）インテグレーションベクターｐｌＮＶ１００
の作製 プラスミドｐＣＩ　９４の有するクロラムフェニコール
耐性遺伝子［ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ
　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　　１５０　、　８１
５（１９８２）］を制限酵素ＭｓｐｒおよびＰｖｕＩＩ
で切断した。これにプラスミドｐＢＲ３２２のＣＩ’ａ
　ＴおよびＰｖｕＩＩ消化物を混合した後、Ｔ４リガー
ゼを用いて結合反応を行わけた。この反応液をエシェリ
ヒア・コリ０６００株から調製したコンピテントセルの
懸濁液に加えて先のｉｉｉ　）項で示した方法で形質転
換した。つぎに、この形質転換株を含む＠濁液をクロラ
ムフェニコール１０μ９／１Ｎ（ｌヲ含むＭＴ−９培地
上に塗抹し、３７°Ｃで！日間培養した。出現したコロ
ニーをさらにアンピシリン５０μ９／酎含むＭＴ−９培
地上にレプリカし、３７℃で１日間培養した。こうして
クロラムフェニコール耐性を有し、かつ、アンピンリン
耐性を示すエシェリヒア・コリＰＩＮＶ１００？Ｊｅを
得た。

エシェリヒア・コリＰＩＮＶ１００株より先の−）項で
示した方法でプラスミドを抽出し、これをｐ［ＮＶ＋０
０と命名した。ｐｒ　ＮＶ　ｌ　００）作製過程および
制限酵素地図を第２図に示す。

ｐ’ｒＮｖｔｏｏはｐｃ　＋　９４由来のクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子がｐＢＲ３２２のＣ１ａｌおよびＰ
ｖｕｌＩ両サイト両開イト入されている。

ｖｉｉ）プラスミドｐｒ　ＮＶ　＋　２８の作製光のＶ
）項で得たプラスミドｐＹＲＧ１００　１μ９およびｖ
ｉｉ　）項で得たプラスミドｐｌＮＶ１００１μ９を制
限酵素Ｐｓｔｌで切断した。両者を混合した後、Ｔ４リ
ガーゼを用いて結合さけた。これを用いて、先の実施例
のｉｖ）項と同様にしてエシェリヒア・コリＧ　−１４
４５株を形質転換した。形質転換株を含む懸濁液をクロ
ラムフェニコールｌＯμ９７Ｍ（ｌを含むＭＴ−９培地
上に塗布し、３７℃で２日間培養した。出現したコロニ
ーの中からクロラムフェニコール耐性を有し、かつ、シ
チジン要求性を消失した形質転換株、エシェリヒア・コ
リＰＩＮＶＩ２８味を得た。エシェリヒア・コリＰＩＮ
Ｖｌ’２８株よりλ・）項で示した方法でプラスミドを
抽出し、これをｐｌＮＶ１２８と命名した。ｐｉ　ＮＶ
　１２８の制限酵素地図を第３図に示す。ｐｌＮＶＩ’
２８は、ｐＩＮＶ］ｏＯのＰｓｔＩサイトに、シチジン
アナログ耐性をもたらすＣＴＰ合成酵素遺伝子が挿入さ
れている。

１ｘ）ｐｉ　ＮＶ　１２８によるバチルス・ズブチリス
の形質転換 ｖｉｉ）項で得られたｐｌＮＶ１２８を用いてバチルス
・ズブチリスＣＤＤ−１株およびバチルス・ズブチリス
ＤＦＣＲ−１００株を形質転換した。形質転換はコンピ
テントセル法［ジャーナル・才ブ・バクテリオロジー（
Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　　８１　。

７＋４（１９６１）］を用い、形質転換株の選択にはク
ロラムフェニコール１０μｇ／ｍρを含むＭＴ−９培地
を用いた。バチルス・ズブチリスＣＤＤＩ株の形質転換
株としてバチルス・ズブチリスＰＩＮＶＩ２８株（ＩＦ
Ｏｌ　５０２．８．ＦＥＲＭＢＰ−２８６１）を、また
、バチルス・ズブチリスＰＤＣＲＩ　Ｏ０株の形質転換
株としてバチルス・ズブチリスＰＩＮＶ２２Ｂ株（ＩＦ
Ｏ１５０２９゜ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８５９）を得た。

バチルス・ズブチリスＰＩＮＶ１２８株およびバチルス
・ズブチリスＰＩＮＶ２２８株にはプラスミドの存在は
認められなかった。一方、ＣＴＰ合成酵素遺伝子を含ま
ない、すなわち、染色体ＤＮＡと相同性のあるＤＮＡを
含まないｐｉ　ＮＶ　Ｉ　ＯＯで形質転換した場合クロ
ラムフェニコール耐性株は出現しなかった。このことが
らｐｒＮＶ１２８は宿主染色体に挿入されたと考えられ
る。

ｘ）ｐｌ　ＮＶ　＋　２８による形質転換株の性質表■
）に形質転換株Ｐ■ＮＶＩ２８妹とその親株ｃＤＤ−１
株のクロラムフェニコールおよびンヂジンアナログを含
む培地での生育を示す。

表１ ＭＴ−９ヘノ添加物（μｇ／ｚｃ）　　ＣＤＤ−１株　
ＰＩＮＶ１２８１ｔｉ無添加　　　　　　　　　　＋　
　　＋りａラムフェニコール　　　　　（１０）　　　
　　　　　　−＋５−フルオロシチシ゛ン　　　　（５
）　　　　　　　　　　−＋３−テ゛７す゛ウラシル　
　　　（１０００）　　　　　　　　　　　　　　　　
　＋＊・十生育あり、−生育無し プラスミドｐｉ　ＮＶ　Ｉ　２８をＣＤＤ−１味に導入
して得られたＰＩＮＶ１２８株は５−フルオロンチジン
や３−デアザウラシルなどのシチジンアナログ耐性を示
す。このことは、ｐｒ　ＮＶ　１２８に挿入されている
ｐＹＲＧｌｏｏ由来のＤＮＡ断片がシチジンアナログ耐
性をもたらすＣＴＰ合成酵素遺伝子であることを示して
いる。つぎに、形質転換株Ｐ　ｒＮＶ　ｌ　２８昧およ
びＰ［ＮＶ２２８株とそれらの親株であるＣＤＤ−１株
およびＤＦＣＲ１００株を下記に示す生産培地２０ｍＱ
を含む２００ｉＣ容フラスコに植菌し、３７℃で３日間
培養して、シチジンの生産性を比較し、た。結果を表２
に示す。

生産培地 グルコース　　　　　　　　　１６．０％コーン・スチ
ープ・リカー　　４．０％尿素　　　　　　　　　　　
　２０％ 炭酸カルシウム　　　　　　　０５ ｐ８７．０ 菌株名 ハ゛チルス・ス゛７゛チリス ハ′チルス・ス′７Ｍリス ハ゛チルス・ス゛）゛チリス へ′チルス・ス゛７゛チリ入 表２ シチジン （Ｈ／ｒｈＱ） ＣＤＤ−Ｉ ＰＩＮＶ１２８ ＤＦＣＲｌｏｏ ＰＩｌｉＶ２２８ ０、！ ３．３ ８．２ 発明の効果 本発明によると、シチジンアナログ耐性をしたらすＣＴ
Ｐ合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入すること
によりシチジン生産株を誘導することができる。

また、シチジン生産株のシチジン生産性を向上させるこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例で得られたプラスミドｐＹＲＧ！００の
制限酵素地図を示す。 第２図は実施例で得られたプラスミドＩ）Ｉ　ＮＶｌｏ
ｏの作製過程および制限酵素地図を示す。第３図は実施
例で得られたプラスミドｐｌ　ＮＶ１２８の制限酵素地
図を示す。Ｐ、Ｅ、Ｐ　Ｉ　Ｉ　、ＭおよびＣは、おの
おの制限酵素Ｐｓｔ、　Ｔ　、　ＥｃｏＲＴ、Ｐｖｕ［
Ｉ、ＭｓｐｌおよびＣ１ａｌの切断点を示す。また、Ｃ
ｍ’、Ａｍ’、Ｔｃｒは、おのおのクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子、アンビンリン耐性遺伝子およびテトラサ
イクリン耐性遺伝子の領域を示す。 口＝＝コはベクターＤＮＡ、−一■Ｉはバチルス・ズブ
チリスＤＦＣＲ１ ００株由来の染色体ＤＮ Ａ断片を示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）シチジンアナログ耐性を示すバチルス属細菌の染
   色体ＤＮＡから得られたシチジン５′−トリフォスフェ
   ート合成酵素をコードする遺伝領域を含むＤＮＡ。
2. （２）該シチジン５′−トリフォスフェート合成酵素が
   シチジンアナログ耐性をもたらす特許請求の範囲第（１
   ）項記載のＤＮＡ。
3. （３）約７．５キロベース離れた二つのＰｓｔ I 切断
   点を有し、かつ、該Ｐｓｔ I 断片中に２ヵ所のＥｃｏ
   Ｒ I 切断点と１ヵ所のＰｖｕII切断点を有する特許請
   求の範囲第（２）項記載のＤＮＡ。
4. （４）特許請求の範囲第（１）項〜第（３）項いずれか
   の１項に記載のＤＮＡが組み込まれたプラスミド。
5. （５）特許請求の範囲第（４）項記載のプラスミドで形
   質転換された細菌。
6. （６）シチジン生産能を有する、バチルス属に属する細
   菌である特許請求の範囲第（５）項記載の細菌。
7. （７）特許請求の範囲第（６）項記載の細菌を培養し、
   培養物中にシチジンを生成蓄積させこれを採取すること
   を特徴とするシチジンの製造法。