JPH0231690A - 遺伝子組換えで造成されるプラスミドによるグルタチオンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グルタチオン生合成酵素の遺伝子をエツシエ
リヒア・コリー（Ｅ、　Ｃｏ１１　）系ベクターに組込
んだ組換えプラスミドによるグルタチオンの改良された
製造法に関する。グルタチオンは、グルタミン酸、シス
ティン、グリシンよりなるトリペプチドであり広汎な肝
疾患の治療薬として、また試薬として頻用される重要な
化合物である。

従来、かかるグルタチオンは、有機合成あるいは微生物
（特に酵母）菌体から抽出する方法で製造されているが
、前者は、反応工程の長さとその複雑さにおいて、また
後者は煩雑な操作と菌体内低含量のために必ずしも有利
な方法とは言えず、より効率の優れた生産方法の開発が
望まれている。

かかる現状に鑑み、本発明者らは、生化学的手法と遺伝
子組換え技術を組み合せることにより、大腸菌を形質転
換してグルタチオン合成活性を与え、この大腸菌を培養
することにより、グルタチオンを高い生産性で製造する
ことに成功した。グルタチオン（以下ＧＳＨと略称する
）は、アデノシン−５′−三リン酸（以下ＡＴＰと略称
する）を反応に要する２種の酵素γ−グルタミル−し一
システィン合成酵素（以下ＧＳＨ−１と略称する）とグ
ルタチオン合成酵素（以下ＧＳＨ−■と略称する）によ
って触媒され、グルタミン酸、システィンおよびグリシ
ンより生合成される。すでに、本発明者らは遺伝子組み
換えによって、第一の酵素ＧＳＨ−１活性か増強された
大腸菌を育種し、この菌株がＧ　Ｓ　Ｈ生産菌株として
優れていることを明らかにした（特願昭５６−１２０’
５４６）。本発明者らは、更に本菌株の改良について鋭
意研究の結果、ＧＳＨ生合成に関与する第二の酵素ＧＳ
Ｈ■の遺伝子（以下ｇｓｈ−ＩＩと略称する）のクロー
ニングに成功し、ＧＳＨ−■活性の増強された大腸菌株
を取得した。本発明は、このＧＳＨ■活性の増強された
組換えプラスミド又はＧ　Ｓ　Ｈ−Ｉ、ＧＳＨ−ＩＩの
両酵素活性が増強された組換えプラスミドを用いるグル
タチオンの酵素的生産法に関する。

以下、本発明をＧ　Ｓ　Ｈ−ｎ遺伝子のクローニングお
よびＧＳＨ−１，■両酵素活性を増強する遺伝子のクロ
ーニング、更にそれ等によるグルタチオンの製造法の順
に説明する。なお本発明で使用するベクターは、Ｅ、Ｃ
ｏ１１系のコピー数が比較的多いベクタープラスミド、
あるいはファージ等であれば特に限定されるものでない
が、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２５のプラスミドを使
用した場合について説明する。

ＧＳＨ−ＩＩｎ遺伝子クローニング 本発明において、ＧＳＨ−ＩＩ遺伝転子ｓｈＩＩをクロ
ーニングするために適用される方法は、まず宿主大腸菌
としてエツシエリヒア・コリーＢ　（Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｂ　（ＡＴＣＣ２３２２６）　）株を使用し
、これよリアグリカルチュラル　アンド　バイオロジカ
ル　ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、）。

４５　（ｇ）２１３１　　（１９８１）の方法に従い変
異誘導したＧＨ３−１欠損株Ｃ９１２の復帰変異株ＲＣ
９１２を得た後、通常の方法、例えばフェノール法〔バ
イオケミ力　エト　バイオフイジクアクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　）　、７２＋６
１９６２９（１９６３）　）によって染色体ＤＮＡを抽
出し、適当な制限酵素、例えばＨｉｎｄｌｌ＋で染色体
ＤＮＡを断片化する。他方、染色体ＤＮＡの断片化に用
いたのと同じ制限酵素で、ベクターｐＢＲ３２２を切断
し、更にサイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）　。

１９６．１３１３−１３１９　（１９７７）の方法に準
じてアルカリフォスファターゼで処理する。

こうして得られるｐＢＲ３２２処理物を先に調整した染
色体ＤＮＡ処理物と混合した後、７５℃、５分間の処理
でアニーリングし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで組み換え体Ｄ
ＮＡを調製する。この過程において、使用すに制限酵素
の種類に制限はない。

またアルカリフォスファターゼ処理は必須としない。こ
うして調製した組み換え体ＤＮＡの中より目的とするＧ
ＳＨ−ＩＩの遺伝子ｇｓｈ１１選択するため、全組み換
え体ＤＮＡを、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　Ｂより変異誘導した
ＧＳＨ−ｎ活性欠）員株Ｃ１００Ｉのカルシウムイオン
処理によって（モレキュラージエネラルジエネテイクス
（Ｍｏｌｅｃ、　　ｇ　ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）、１２
４．１−１０　（１９７３））コンピテント化した菌体
に導入する。かくして得られるＤＮＡ１人株中より、目
的の遺伝子ｇｓｈ−ｎを持つ株を選択するため、テトラ
メチルチウラムダイサルファイド（以下Ｔ’　Ｍ　Ｔ　
Ｄと略称する）８０／’ｇ／ｍｊ！およびアンピシリン
（以下Ａｍと略称する）５μｇ／ｍβ又はテトラサイク
リン（以下Ｔｃと略す）５μｇ／ｍｌ！を含む最小寒天
培地ＣＫＨ２ＰＯ４０，３％、ＫｚＨＰＯ４０，７％、
　　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　　・７Ｈ２００，０１％、（
Ｎ　Ｈａ）ｔ　Ｓ　Ｏ４０，１％、グルコース０．５％
、寒天１．５％〕　（以下ＤＭ培地と略称する。）に塗
布し、３７°Ｃで１０〜４０時間培養する。かくして生
じる大きなコロニーを選択することによって、目的の遺
伝子ｇｓｈｒｌを持つ株を容易に取得できる。この株の
持つ組み換え体ＤＮＡをｐＢＲ３２２−ｇｓｈｌｌと称
する。この組み換え体ＤＮＡを保持する菌株を、Ｌ−培
地〔酵母エキス０．５％、グルコース０．１％、ＮａＣ
，１０，５％、ペプトン１．０％（ｐＨ７，２））にて
対数増殖期後期まで生育させた後、１５０μｇ　／　ｍ
　１となるようにクロラムフェニコール（以下Ｃｍと略
称する）を添加して、１６時間培養を続は菌体内の組み
換え体ＤＮＡの量を増大させる。この菌体を集菌後、常
法通りにュークレイツク　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、）、　　７　。

１５１３−１５１７　（１９７９）　）密度勾配遠心に
よってｐＢＲ３２２−ｇｓｈＩ［を大量に調製する。か
くして得られた、組み喚え体ＤＮＡ：ｐＢＲ３２２−ｇ
ｓｈｌＩの分子量は４．２メガダルトン（Ｍｄ）であり
、その構造はｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ■部位に１．６　
Ｍ　ｄのＰＯ９１２株由来の染色体ＤＮＡ断片が導入さ
れたものである（第１図（イ））。

またｐｓｔＩでＰＯ９１２の染色体ＤＮＡを処理するこ
とによって、第１図（ロ）のような組み換え体も得られ
る。この組換え体ＤＮＡ：ｐＢＲ３２２−ｇｓｈＩＩを
Ｅ、ｃｏｌｔ由来の種々の変異株、例えばＰＯ９１２、
Ｃ６００に導入することによって、ＧＳＨ−Ｕ活性が特
異性に増強された菌株を得ることができる。

ＧＳＨ−１，Ｉｆ両酵素活　　強゛伝　のクローニング 次の、ＧＳＨ−■およびＧＳＨ−ｒの画情性を同時に増
強した菌株の造成は一以下の２通りの方法で行なうこと
ができる。第一の方法は、Ｅ。

ｃｏｌｉ由来の変異株にｐＢＲ３２２−ｇｓｈＵとｐＢ
Ｒ３２２−ｇｓｈＩを共存させる方法である。ここで用
いられるｐＢＲ３２２−ｇ５　ｈ　Ｉは、特願昭５６−
１２０５４６に記載したとおり、ＰＯ９１２由来の染色
体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで処理して取得される組み
換え体ＤＮＡ　：ρＢＲ３２２−ｇｓｈｌ　　（分子ｆ
ｆ１４．７Ｍｄで２．　Ｉ　Ｍ　ｄに相当するＰＯ９１
２染色体ＤＮＡ断片を、ｐＢＲ３２２のＰｓｔｌの部位
に挿入した構造を有する（第２図参照））が用いられる
。

２種の組み換え体ＤＮＡは、先述した方法でコンピテン
ト化したＥ、ｃｏｌｉ由来の変異株に導入されるが、そ
の導入の順序は問わず、場合によっては、ｐＢＲ３２２
−ｇｓｈｌとｐＢＲ３２２−ｇｓｈＵを混合して同時に
導入してもよい。これらバイブリドプラスミド導入株の
選択は前述したＴＭＴＤに対する耐性、あるいはアンピ
シリン（以下Ａｍと略称する）およびテトラサイクリン
（以下Ｔｃと略称する）に対する感受性を指標にして行
なうことができる。例えばＥ、ｃｏｌｉＢより変異誘導
された株Ｃ９１２（ＧＳＨ−１活性欠損株）にｐＢＲ３
２２−ｇｓｈｌの導入された株の選択は、Ｔｃを２０μ
ｍ　／　ｍ　１含むし一培地に生育する菌として容易に
行なえる。またＣ９１２株にｐＢＲ３２２−ｇｓｈ［［
（第１図（イ）のプラスミド）を導入した株は、Ａｍを
２０μｇａｍｅを含むし一培地に生育する菌として選択
できる。

Ｌ−培地の代りに先述した０Ｍ培地を用いる場合には、
１０〜２０　ｔｔ　ｇ／ｍＡ’のＴＭＴＤに耐性の菌と
して選択することが可能である。またｐＢＲ３２２ｇｓ
ｈｌ、ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ［Ｉの両方を導入した株は
、Ａｍを２０μｇ　／　ｍ　１およびＴｃを２０μｇ　
／　ｍ　Ｉ！含むし一培地に生育する菌として容易に選
択できる。

かく七で同一菌体内に２種の組換え体ＤＮＡ　：ｐＢＲ
３２２−ｇｓｈｌとｐＢＲ３２２−ｇｓｈＵと合わせ持
ち、ＧＳＨ−１およびＧＳＨ−１１活性が同時に増強さ
れた菌株を得ることができる。

ＧＳＨ−１とＧＳＨ−ＩＩの両舌性を高める第２の方法
は、Ｇ　Ｓ　Ｈ−１ととＧＳＨ−４の両道転子を同一の
ベクターに連結して、Ｅ、ｃｏｌｉ由来の株に導入する
方法である。その方法としては、先ずｐＢＲ３２２−ｇ
　ｓ　ｈ　ＩをＰｓｔｌで処理して遊離するＲＣ９１２
由来のＤＮＡ断片を争乱する。この断片の単離には、ｐ
ＢＲ３２２−ｇｓｈｌのＰｓｔＩ処理物をアガロースゲ
ル電気泳動にかけて分離後、ゲルより抽出することによ
って容易に行なえるメソド　イン　エンティモロジー（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　、
　　６８．　１７６１８２　　（１９７９）参照」。単
離されたＤＮＡ断片をＰｓｔｌで処理したｐＢＲ３２２
−ｇｓｈＩ［（第１図（イ）のプラスミド）と混合する
。この混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで処理後カルシウム
処理でコンピテント化したＥ、ｃｏｌｉＢ由来の株、例
えば０９１２株に導入する。目的とするｇｓｈｌとｇｓ
ｈＩＩの遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡ、（これをｐＢ
Ｒ３２２ｇｓｈｌ・ＩＩと称する）を保持する菌株の選
択は、形質転換走査後のＣ９１２株をＴＭＴＤ　１０　
ｐ　ｇ／ｍ　ｌを含むＤＭ−寒天培地に生育可能な菌体
として容易に行なえる（第３図参照）。かくしてベクタ
ーｐＢＲ３２２上に、ＧＳＨ−１，ＧＳＨ−ＩＩの両道
転子ｇｓｈｌとｇｓｈｌｌを持つ組み換え体ＤＮＡ　：
ｐＢＲ３２２−ｇｓｈｌ　・ｎが得られ、コノ組み換え
体ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｔ由来の株に導入することにより
、ＧＳＨ−１，ＧＳＨ−ｎ活性を同時に増強せしめた菌
株を取得できる。ＧＳＨ−１とＧＳＨ−ｎ活性を同時に
増強するもう一つの方法としては、ベクターｐＢＲ３２
２の代りにｐＢＲ３２５を使うこともできる。ｐＢＲ３
２５上にＧＳＨ−１，ＧＳＨ−ｎの２つの遺伝子ｇｓｈ
ｌとｇｓｈＵを組み込む方法は、基本低には上述したｐ
ＢＲ３２２の場合とは同じである。その手ｊ頃は第４図
に示すように、ｐＢＲ３２２−ｇｓｈｌよりＰｓｔｌ処
理でｇｓｈｌを含むＤＮＡ断片を取り出す。また同様に
ｐＢＲ３２２−ｇ　ｓ　ｈＩＩを）１　ｉ　ｎｄ［［処
理してｇｓｈＩ［を含むＤＮＡ断片をとり出す。この２
種のＤＮＡ断片を、ｐＢＲ３２５のＰｓｔ１部位および
ＨｉｍｄＩ［［部位に挿入し、ｐＩ３Ｒ３２５上にｇｓ
ｈｌとｇｓｈＩｌをもつ組み換え体ＤＮＡ：ｐＢＲ３２
５−ｇｓｈｌ・■を調製する。この場合ｐＢＲ３２５は
Ｃｍ耐性の遺伝子を持っているので、形質転換株の選択
が非常に容易となる。ｐＢＲ３２５−ｇ　ｓ　ｈ　Ｉ・
■をＥ。

ｃｏｌｉ由来の種々の菌株に導入することによってＧ　
Ｓ　Ｈ−１とＧＳＨ−■の活性が同時に増強された、菌
体を得ることができる。

グルタチオンＣＤ　’１８　ｉＩ かくして得られるＧＳＨ−１１，ＧＳＨ−１およびＧＳ
Ｈ−■の活性が増強された大腸菌を用いるＧＳＨの生産
は、以下のように行なうことができる。ＧＳＨ−１ある
いはＧ　Ｓ　Ｈ−１とＧ　Ｓ　Ｈ−ＩＩの両・活性が増
強された菌株を、炭素源、窒素源無機塩などを含む栄養
培地、あるいは最少培地（ＤＭ培地など）に接種し振盪
培養する。酸素源としては、クルコース、フラクトース
、グリセロール、シュークロースなど、また窒素源とし
ては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム、　（尿素）などの無機態窒素の他、酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキスなどの有機体窒素を使用できる
。また微量金属元素として、塩化マグネシウム、塩化マ
ンガンなどの添加も効果的である。用いる炭素源の濃度
は０．１〜５％、好適には０．５％、窒素源の濃度は０
．０５〜５％、好適には０、５％、また微量金属元素は
、０．００５％程度添加するのが好ましい。培養温度は
２０〜４０℃、好適には３７℃、また培養ｐＨは６〜８
、好適には７が好ましい。かくして培養終了液より菌体
を集めて、−度０．８５％の生理的食塩水で洗浄液、水
懸濁液として、これを１００℃の沸とう水中で１〜１０
分、好適には１分処理することにより大腸菌菌体内のＧ
ＳＨを抽出できる。また、上記培養後の菌体を集菌した
後、該菌体を以下に述べるような処理をし、これをグル
タミン酸、システィン。

グリシン、マグネシウムイオン、ＡＴＰ、そして好まし
くは適当なＡＴＰ再生系存在下に反応せしめることによ
り、ＧＳＨを製造することができる。

このような菌体処理物としては、菌体の有機溶媒処理物
、界面活性剤処理物、菌体の音波破砕物、音波処理後に
遠心で得られる無細胞抽出液、あるいは適当な担体に固
定した菌体、あるいは酵素が挙げられる。この場合、利
用できる有機溶媒としては、アセトン、トルエン、エー
テルなど、界面活性剤としては、トリトンＸ１００．　
　ドデシル硫酸、セチニトリメチルアンモニウムブロミ
ドなどが利用される。また、菌体あるいは酵素の固定化
にはポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル、アル
ギン酸ゲル、光硬化樹脂などの他ＤＥＡＥ−セルロース
、ＤＥ八へ−セファデックス等も担体として用いること
ができる。またかかる反応に利用されるＡＴＰ再生系と
しては、大腸菌のもつアセテートキナーゼ反応、カルバ
メートキナーゼ反応あるいは微生物の解糖系が好適であ
る。Ｇ　Ｓ　Ｈ生成反応は酵素含有物を１０〜１００ｍ
Ｍのグルタミン酸（好適には８０ｍＭ）　、５〜４０ｍ
Ｍのシスティン（好適には２０ｍＭ）、５〜５０ｍＭの
グリシン（好適には２０ｍ）、１〜３０ｍＭのマグネシ
ウムイオン（好適には１０ｍＭ）、１〜２０ｍＭのＡＴ
Ｐ　（好適には１０ｍＭ）を含む反応液で、２０℃〜４
０℃（好適には３７℃）また反応ｐＨは６〜９（好適に
は７．５）で数時間接触させることによって行える０不
反応系において、アセテートキナーゼ反応をＡＴＰ再生
系として用いる場合には、アセチルリン酸５〜４０ｍＭ
（好適には２０ｍＭ）を添加すればよい。大腸菌は強い
アセテートキナーゼ活性をもっているので、アセテート
キナーゼ源を添加する必要はない。

上記に様にして、抽出あるいは反応液中に生成したＧＳ
Ｈは、通常のイオン交換樹脂のカラムで容易に単離され
る。まず抽出液あるいは反応液のｐＨを硫酸で３．０に
合わせた後、これをカチオン交換樹脂、例えばダイアイ
オンＰＫ−２２８Ｈ’に導通し、０．５　Ｍの水酸化ア
ンモニウムで）容出する、溶出液のＩ）　Ｈを硫酸で４
．５に合わせた後、アニオン交換樹脂、例えばデオライ
トＡ２　（ＣＨ，ＩＣ０Ｏ−型）に導通する。吸着した
ＧＳＨを０．５Ｍ硫酸で溶出後、エタノールを５０％に
なるように添加することによって結晶ＧＳＨを単離取得
できる。

以下実施例をあげて本発明を具体的に説明する。

なお、ｐＢＲ３２２−ｇｓｈｌｌ、ｐＢＲ３２２−ｇｓ
ｈｌおよびｐ　Ｉ３　Ｒ３２２−ｇ　ｓ　ｈ　ＩＩの両
方、ｐＢＲ３２２ｇｓｈｒ、ＩｒおよびｐＩ３Ｒ３２５
−ｇｓｈｌ、Ｉ［の各々をＲＣ９１２に移入した株は、
工業技術院微生物工業技術研究所に各々受託番号　微工
研条寄第３３６号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３３６、微工研
菌寄第６７３１号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−６７３１）より移
管）、微工研菌寄第６７３２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−６７
３２）同第６７３３号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−６７３３）お
よび徽工研条寄第３３７号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３３７
，微工研菌寄第６７３４号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−６７３４
）より移りとして寄託された。

実施例１　　（ｐＢＲ３２２−ｇｓｈｎの調製およびそ
れを保持する菌株） エツジエリビア・コリーＢ（Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｂ（ＡＴ
ＣＣ２３２２６））より変異誘導された変異株ＲＣ９１
２をＬ−培地で対数増殖期まで生育させた後集菌し、生
理的食塩水（０，８５％）で１回洗浄する。かくして得
られる菌体１ｇ（湿重量）よりフェノール法（Ｂｉｏｃ
ｈｅ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ａｃｔａ、７２゜６１９
−６２９　（１９６３））で染色体ＤＮＡを抽出し、約
１．６　ｍ　ｇのＤＮＡを得た。この染色体ＤＮＡ　１
　／Ｊ　ｇをＨｉｎｄＩ［［で３７℃、３０分間処理し
て断片化し、別に）ｉｉｎｄｌ［［で２時間処理後、Ｕ
ｌｌｒｉｃｈらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅｌ　９６．　１
３１３−１３１９　（１９７７）でアルカリフォスファ
ターゼ処理した１、ｕｇのベクタープラスミドｐＢＲ３
２２と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで１０℃１６時間処
理し、組み換え体ＤＮＡを３ＩＲ製する。

目的の組み換え体ＤＮＡ：ｐＢＲ３２２：ｇｓｈ■を選
択するため得られた全組み換え体をＥ。

ｃｏｌｉ　　Ｂより変異誘導されたＧＳＨ−ＩＩ欠…株
Ｃ１００Ｉのコンピテントな菌体に導入し、ｐＢＲ３２
２ｇｓｈＩＩをもつ菌株を選択するため、ＴＭＴＤ８０
．ｃｚｇ／ｍｌを含むＤＭ培地に塗布する。３７℃で４
０時間培養後、生じた大きなコロニーを釣国することに
よってＧＳＨ−ＩＩの遺伝子ｇｓｈＩＩを持つ組み換え
体ＤＮＡ：ｐＢＲ３２２−ＧｓｈＩ［を含む菌株を得た
。該菌体よりｐＢＲ３２２−ｇＳｈｎを密度勾配遠心に
より大量調製した。得られた組み換え体ＤＮＡの制限構
造は第１図（イ）の通りであった。

分子量は４．２　Ｍ　ｄでヘクターｐＢＲ３２２のＨｉ
ｎｄＩ［１部位に１．６　Ｍ　ｄのＲＣ９１２由来のＤ
ＮＡ断片が組み込まれている。本実施例においてＨｉ　
ｎ　ｄ　ｍの代りにＰｓｔｌを用いることによって同様
な組み換え体ＤＮＡを得ることができる「第１図（ロ）
」。この場合の組み換え体ＤＮＡの分子量は８．０　Ｍ
　ｄでｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位にＲＣ９１２由来の
５．４　Ｍ　ｄに相当するＤＮＡ断片が組み込まれてい
る。かくして得られたｐＢＲ３２２−ｇｓｈＩＩ（第１
図（イ））をＥ、ｃｏ目　Ｂ由来の種々の変異株に導入
した。異変株への導入は、先術のカルシウム処理法（Ｍ
ｏｌｅｃ、ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　＋１２４．１−１０
　（１９７３）］　によって菌体をコンピテント化して
行ない、形質転換株の選択は２０μｇ　／　ｍ　ｌのア
ンピシリンを含むし一培地、又は１０　／ｊ　ｇ／ｍ１
〜８０．１７　ｇ／ｍｊ２のＴＭＴ　Ｄを含むＤＭ培地
で、各薬剤の耐性株として行なうことが出来る。かくし
て得られる形質転換株のもつＧＳＨ−１およびＧＳＨ−
ＩＩ活性を表１に示した。なお、各酵素活性は、ＤＭ培
地で対数増殖期の菌体より調製した菌体抽出液を用いて
行なった。

また酵素活性はジャーナル　オブ　ジェネラルマイクロ
バイオロジー（Ｊ、　Ｇ　ｅ　ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ）１２８．１０４７〜１０５２　（１９８２）に記載
の測定法に従った。

表１　組み換えＤＮＡ　：　ｐＢＲ３２２ｇＳｈｎを保
持する菌株のＧＳＨ−１およびＧＳ）！−■酵素活性 菌　株　　　　　　　（μｍｏｌｅ／’／ｍｇ−蛋白）
ＧＳＨ−Ｉ　　ＧＳＨ−■ ｃ９１２　　　　０　　（−）　　０．６０　（１，０
）Ｃ９１２／ＢＲ３２２−ｓｈＩＩ　Ｏ（）　２２．０
　（３６，７）Ｃ１００Ｉ　　　　’０．０６　（１，
０）　０　　（−）Ｃ１００Ｉ／　ＢＲ３２２−５ｈｌ
ｒ　０．０５　（１，０）　２０．２　（−）ＲＣ９１
２０，０６（１，０）　Ｏ，’５７　（１，０）中のグ
ルタチオンを抽出する。かくして得られたグルタチオン
量は表２に示す通りであった。

表２＆ｌみ換え体ＤＮＡ　：　ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　
ｎを保持Ｃ９１２／　　ＢＲ３２２−５ｈＩＩ １００Ｉ Ｃ１００Ｉ／　ＢＲ３２２−ｇｓｔＩｌｌ、２ Ｃ９１２ ０，７ ＲＣ９１２／　　ＢＲ３２２−ｓｈＩ［１，４ 実施例２ 実施例１の表１記載の菌株を５００ｍｌのＤＭ培地に接
種し、３７℃で３時間振盪培養する。かくして得られる
対数増殖期の菌体を集め、０．８５％の生理的食塩水で
１回洗浄する。この菌体を再度水に懸濁し５０ｍβ／ｍ
ｌの溶液とする。この懸濁液０．５　ｍ　ｌを１００℃
で１分間加熱し、菌体定量法：アナリテイカル　バイオ
ケミストリー（ＡｎａＩｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　２
７．５０２−５２２（１９６９）実施例３　（ｐ　ＢＲ
３２２−ｇ　ｓ　ｈ　Ｉおよびｐ　Ｂ　Ｒ３２２ｇ５ｈ
ｎを合せ持つ菌株） 実施例１の表１記載の菌株Ｃ９１２／　ｐ　Ｂ　Ｒ３２
２ｇ５ｈ１１．Ｃ１００Ｉ／ｐＢＲ３２２−ｇＳｈｎお
よびＲＣ９１２／ｐＢＲ３２２−ｇＳｈｎを各々カルシ
ウムイオン処理でコンピテント化した後、組み換え体Ｄ
ＮＡ：ｐＢＲ３２２−ｇｓｈｌを導入、同−菌株中にｐ
ＢＲ３２２−ｇｓｈｌとｐＢＲ３２２−ｇｓｈＩ［の両
者を保持する形質転換株を造成した。これら形質転換株
のＧＳＨ−Ｉ、ＧＳＨ−ｎ活性および菌体内のグルタチ
オン含量は表３に示す通りであった。

実施例４　（ｐＢＲ３２２−１，Ｈの調製およびそれを
保持する菌株） ｐＢＲ３２２ｇｓｈｌ　　５０　８ｇを、Ｐ　ｓ　ｔ　
Ｉで処理した後、アガロースゲル電気泳動によって生じ
たＤＮＡ断片を分離する。小断片を含むゲルを切り出し
、これを透析チューブに入れて再び電気泳動にかけ、ゲ
ル中に存在するＤＮＡ断片をゲル外へ出す。かくして約
５μｇのｇｓｈｌを含むＤＮＡ断片を得た。

次に、ｐＢＲ３２２−ｇｓｈＴＩ　　１ｇｇをＰｓｔｌ
で処理した後、上記調製したｇｓｈｌを含むＤＮＡ断片
１ｇｇを加え、Ｔ、ＤＮＡリガーゼで処理する。

かくしてｐＢＲ３２２上に、ｇｓｈｌとｇｓｈｌｌの両
道転子を合せ持つ組み換え体ＤＮＡ：ｐＢＲ３２２−ｇ
ｓｈｌ　・■が得られる。このｐＢＲ３２２−ｇｓｈｌ
・■をＥ、ｃｏｌｉＢ由来の菌株にカルシウム処理で導
入する。形質転換株は２０μｇ／ｍｊ＋のＴＭＴＤを含
む０Ｍ培地上に生育する大コロニーを釣菌することによ
って容易に選択できる。かくして得られる性質転換株の
もつＧＳＨ−Ｉ、ＧＳＨ−ｎ活性およびＧＳＨ含量は下
表の通りであった。

実施例５　　（ｐＢＲ３２５−ｇｓｈｌ・Ｉ［の調製お
よびそれを保持する菌株） ｐＢＲ３２２−ｇｓｈｌ　　５０８ｇをＰｓｔｌで処理
し、実施例４と同様にｇｓｈｌを含むＤＮＡ断片４μｇ
を取得した。他方ベクターｐＢＲ３２５をＰｓｔｌで処
理し、この１μｇにｇｓｈｌを含むＤＮＡ断片ｌμｇを
加えてＴ、ＤＮＡリガーゼで処理する。目的とする組み
換えＤＮＡ：ｐＢＲ３２５−ｇｓｈｌを取得するためリ
ガーゼ処理物で０９１２株を形質転換し、ｐＢＲ３２５
−ｇｓｈｌを保持する菌株を２０μｇ　／　ｍ　１のＴ
ＭＴＩ）と５μｇ　／　ｍ　１のテトラサイクリンを含
むＤＭ培地上に生育するコロニーとして取得した。次い
でこの菌株より密度勾配遠心でｐＢＲ３２５−ｇ　ｓ　
ｈ　ｒを大ｔｉｌｌ製する。この組み換え体ＤＮＡ：ｐ
ｎＲ３２５−ｇｓｈｌにｇｓｈｌｌに組み込ませるため
、まずｐＢＲ３２２−ｇｓｈｌｌ（５０μｇ）をＨ４ｎ
ｄｄｌＩＩで処理し、実施例４同様に、その断片を電気
泳動で分離し、ｇｓｈＩＩを含むＤＮＡ断片約７μｇを
得た。このＤＮＡ断片ｌμｇをＨｉｎｄｌｌｒで処理し
たｐＢＲ３２５−ｇｓｈｌ　１μｇと混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼで処理する。かくして、ｐＢＲ３２５上にｇ
ｓｈＩとｇｓｈＵの両道転子を合せ持つ組み換え体ＤＮ
Ａ：ｐＢＲ３２５ｇｓｈｌ・■をｉｎ　　ｖｉｔｒｏで
合成できる。これをＥ。

ｃｏｌｉ　　Ｂ　由来の種々の株にカルシウム処理法で
導入する。形質転換株の選択は、８０μｇ　／　ｍ　１
のＴＭＴＤと２μｇ　／　ｍ　１のクロランフェニコー
ルを含むＤＭ培地上で大コロニーを釣菌することによっ
て行なうことができる。かくして造成したｐＢＲ３２５
−ｇ　Ｓ　ｈ　Ｉ・■を含む菌株のもつＧＳＨ−１，Ｇ
ＳＨ−ＩＩ活性およびＧＳＨ含量は下表の通りであった
。

実施例６ 実施例２表２記載の株ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２２−ｇｓ
ｈＩＩ、実施例３表３記載の株ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２
２−１；　ｓ　ｈ　Ｉ、−ｇ　ｓ　ｈ　［１，実施例４
表４記載の株ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２２−ｇ　ｓ　ｈ　
Ｉ・■、および実施例５表５記載の株ＲＣ９１２／ｐＢ
Ｒ３２５−ｇｓｈＴ・ｎを実施例２と同様に、０Ｍ培地
にて培養する。対数増殖期の菌体を集菌後、０．８５％
の生理的食塩水で１回洗浄後、５ｍＭトリス塩酸緩衝液
ｐＨ７，５）に懸濁し、９０ＫＨｚで５分間破砕し、破
砕物を１５．０００　ｒ、ｐ、個、３０分遠心する。か
くして得られる菌体抽出液を２０ｍＭＬ−グルタミン酸
、２０ｍＭＬ−ンステイン、２０ｍＭグリシン、１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１０ｍＭ　　ＡＴＰ、１０ｍＭア
セチルリン酸、５０ｍＭトリス−塩酸援極液（ｐＨ７，
０）を含む反応液中で３７℃　２時間インキュベートす
る。かくして反応液中に生成したグルタチオンは下表の
通りであった。

表６　各種紐み換え体ＤＮＡを保持するＲＣ９１２株の
グルタチオン生成活性 菌株 グルタチオン生成活性 （ＬＬｌ／１ｌｊｌ！７２時　） ′Ｆ？ｃｃ＋ｘ２ ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２２ ＲＣ９１２／’１ｌｌＢＲ３２２ ＲＣ９１２，／ｐＢｐ３２２ ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２５ ０，４ ｇｓｈ　ＩＩ　ｌ：ＦＥＲＭ　ＢＰ−３３６）　　　　
　　０．８ｇｒ、ｈ　Ｉ　、　−ｇｓｈ　ＩＩ　（ＦＢ
Ｉ？Ｍ　Ｐ−６７３２）２．１ｇ５ｈ　Ｉ　　・　ＩＩ
　（ＦＥＲＭ　Ｐ−６７３３＞　　　２．３ｇ５ｈ　Ｉ
　　・ＩＩ　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３３７）　　　２．８
実施例　　７ 実施例５の表５に記載の株ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２５−
ｇｓｈｌ・■をペプトン１．０％、酵母エキス１．０％
、肉エキス０．５　！ｌ（＋　、グリコース１．０％。

硫酸マグネシウム、７水和物０．０１％、リン酸１カリ
ウム０．５％、クロラムフェニコール２０／Ｊｇ／ｍ７
！を含む培地（ｐＨ７，０）１０００ｍ／に接種し、３
０℃で２０時間通気振とう培養する。菌体を集菌後、生
理食塩水で一度洗浄した後、生菌体２８ｇ　（湿重Ｉ）
を３０％塩化カリウム溶液１５ｍ１！に懸濁し、これに
３３．５％アクリルアミドモノマー１３ｍＡ’、２０％
Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド２ｍ／、５．０
％β−ジメチルアミノプロピオニトリル５　ｍ　ｅおよ
び６．５％過硫酸カリウム５ｍｌを加え、２０℃でゲル
が生成されるまで放置する。ついでこの固定化した菌を
１辺２ｍｍの立方体に成型し、生理食塩水にて洗浄する
ことにより固定化エツシエリヒア・コリーＲＣ９１２／
ｐＢＲ３２５−ｇ　ｓ　ｈ　Ｉ・ｌｌ８０ｇを得る。プ
ラスミドを含有しないＲＣ９１２株についても同様の方
法で固定化菌体を調整した。

調整した固定化菌体２．５ｇを８０ｍＭＬ−グルタミン
酸、２０ｍＭＬ−システィン、２０ｍＭグリシン、２５
ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ　　ＡＴＰ、２０ｍＭ
アセチルリン酸、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７，０）を含む反応液５ｍρ中で３７℃で振とう反応さ
せ、経時的に生成したグルタチオンを定量した結果、下
表の通りであった（転換率はＬ−システィンからの転換
率を示す）。

表　　　７ 実施例　８ 実施例５の表５に記載の株ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２５−
ｇｓｈＩ・ＩＩ及びＲＣ９１２株を実施例７と同じ培地
で培養する。菌体を集菌後（湿重量１０ｇ）、生理食塩
水で一度洗浄した後、生理食塩水１０ｍ１に懸濁し、３
７℃に加温する。これに３．１％のカラギーナン水溶液
（３７℃）２０ｍｌを加えて混合し、この混合液を２％
塩化カリウム水溶液中にノズルから滴下させ直径約３ｍ
ｍの球状ゲルを調整する。この固定化菌体２．５ｇを実
施例７と同じ反応液５ｍＪ中で３７℃にて振とう反応さ
せ、経時的に生成したグルタチオンを定量した結果、表
８の如（であった（転換率はＬシスティンからの転換率
を示す。）。又４時間反応後固定化菌体を濾別し、同じ
反応液で繰返し反応した場合の反応４時間目のグルタチ
オン生成量を定量した結果を表９に示す。なお反応液中
のＡＴＰおよびアセチルリン酸の濃度を種々変化させて
もほぼ同様の結果が得られた。

第３図−組み換え体ＤＮＡ ｐＢＲ３２２− ｓｈｌ ■の調製と環状制限地図 （記号は第１図に同じ） 第４図 組み換え体ＤＮＡｐＢＲ３２５− ■ ■の調製と環状制限地図 （記号は第１図に同じ） ４、

【図面の簡単な説明】

組み換え体ＤＮＡ ｐＢＲ３２２− ｓ ｈ■の環状制限地図 （図中の数値はメガダルトン） Ｐ　：Ｐｓｔ　Ｉ Ｅ：ＥｃｏＲＩ Ｂ：Ｂａｍ１ｌｌ Ｓ：Ｓａｌｌ Ｍ：旧１１ Ｈ：）ｆｉｎ ｄＩ［Ｉ Ｐｖ：ＰｖｕＩＩ 第２図−組み換え体ＤＮＡ ＢＲ３２ ■の環状制限地図 （記号は第１図に同じ） 第 図 第２図 第３図 ｐ８Ｒ３２２−ｇｓｈ ｌ−■

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）大腸菌の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄIIIで処理して
   得られる下記（ｉ）で示される制限酵素地図を有する１
   ．６Ｍｄの遺伝子断片に含まれるグルタチオン合成酵素
   の遺伝子（ｇｓｈII） （ｉ）▲数式、化学式、表等があります▼ 及び大腸菌の染色体ＤＮＡをＰｓｔ I で処理して得ら
   れる下記（ｉｉ）で示される制限酵素地図を有する２．
   １Ｍｄの遺伝子断片に含まれるγ−グルタミル−Ｌ−シ
   ステイン合成酵素の遺伝子（ｇｓｔ I ） （ｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼ の両遺伝子またはｇｓｔIIの遺伝子のみを組み込んだ組
   換えプラスミドを有する大腸菌を培養し、培養物からグ
   ルタチオンを採取するか、該大腸菌の菌体処理物をグル
   タミン酸、システイン、グリシン、アデノシン−５′−
   三リン酸およびマグネシウムイオンと接触せしめてグル
   タチオンを生成させることを特徴とするグルタチオンの
   製造法。
2. （２）反応系にアデノシン−５′−三リン酸の再生系を
   共役させることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項
   記載の製造法。
3. （３）アデノシン−５′−三リン酸の再生系がアセテー
   トキナーゼ反応、カルバメートキナーゼ反応あるいはバ
   クテリア、酵母の解糖反応系であることを特徴とする特
   許請求の範囲第（１）または第（２）項記載の製造法。
4. （４）菌体処理物が大腸菌の無細胞抽出液、細胞懸濁液
   又は固定化された菌体、酵素であることを特徴とする特
   許請求の範囲第（１）項記載の製造法。
5. （５）ゲル状体に固定化することを特徴とする特許請求
   の範囲第（４）項記載の製造法。
6. （６）ゲル状担体がポリアクリルアミドゲルである特許
   請求の範囲第（５）項記載の製造法。