JPS59192088A - 遺伝子組換えで造成されるプラスミド - Google Patents
遺伝子組換えで造成されるプラスミドInfo
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- JPS59192088A JPS59192088A JP17072782A JP17072782A JPS59192088A JP S59192088 A JPS59192088 A JP S59192088A JP 17072782 A JP17072782 A JP 17072782A JP 17072782 A JP17072782 A JP 17072782A JP S59192088 A JPS59192088 A JP S59192088A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
- C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ゲルタデオン生合成酵素の遺伝子をエツシエ
リヒア・コリー（Ｂ、 Ｃｏ Ｉ ＋ ） ｙ（ｚ
ヘクターに組込んだ組換えプラスミドおよび該プラスミ
ドによるグルタチオンの改良された製造法に関する。グ
ルタチオンは、グルタミン酸、シスディン。
リヒア・コリー（Ｂ、 Ｃｏ Ｉ ＋ ） ｙ（ｚ
ヘクターに組込んだ組換えプラスミドおよび該プラスミ
ドによるグルタチオンの改良された製造法に関する。グ
ルタチオンは、グルタミン酸、シスディン。
クリシンよりなるトリペプチドであり人混な肝疾、肋の
治療薬としてまた試薬として頻用される重要な仕合物で
ある。従来、かがるグルタチオンは、有機合成あるいは
微生物（特に酵母）菌体から抽出する方法で製造されて
いるが、前者は反応工程の長さとその仮雑さにおいて、
また後者は煩雑な操作と菌体内低含鍛のために必ずしも
有利な方法とは言えず、より効率の優れた生産方法の開
発が望まれている。かかる現状に鑓み、本発明者らは、
生化学的手法と遺広子組換え技術を糾み合せることによ
り、大腸菌を形質転換してグルタチオン合成活性を与え
、この大腸菌を培養することにより、グルタチオンを高
い生産性で製造することに成功した。グルタチオン（以
下ＧＳＨと略称する）は、アデノシン−５′−三リン酸
（以下ＡＴＰと略称する）を反応に要する２種の酵素γ
−グルタミルーＬ−システィン合成酵素（以下Ｇ８Ｈ−
Ｉと略称する）とグルタチオン合成酵素（以下Ｇ ８
）１．− Ｉ［と略称する）によって触媒され、グルタ
ミン酸。
治療薬としてまた試薬として頻用される重要な仕合物で
ある。従来、かがるグルタチオンは、有機合成あるいは
微生物（特に酵母）菌体から抽出する方法で製造されて
いるが、前者は反応工程の長さとその仮雑さにおいて、
また後者は煩雑な操作と菌体内低含鍛のために必ずしも
有利な方法とは言えず、より効率の優れた生産方法の開
発が望まれている。かかる現状に鑓み、本発明者らは、
生化学的手法と遺広子組換え技術を糾み合せることによ
り、大腸菌を形質転換してグルタチオン合成活性を与え
、この大腸菌を培養することにより、グルタチオンを高
い生産性で製造することに成功した。グルタチオン（以
下ＧＳＨと略称する）は、アデノシン−５′−三リン酸
（以下ＡＴＰと略称する）を反応に要する２種の酵素γ
−グルタミルーＬ−システィン合成酵素（以下Ｇ８Ｈ−
Ｉと略称する）とグルタチオン合成酵素（以下Ｇ ８
）１．− Ｉ［と略称する）によって触媒され、グルタ
ミン酸。
システィンおよびグリシンより生合成されろ。すでに、
本発明者らは遺伝子組み換えによって第一の酵素ＧＳＨ
−１活性が増強された大腸菌を育種しこの菌株がＧ８Ｈ
生産菌株として優れていることを明らかにした（％願昭
５６−１２０５４６ ）。本発明者らは更に本菌株の改
良（めついて鋭意研究の結果、Ｇ５１１生合成に関与す
る第二の酵ｇ Ｇ Ｓ Ｈ−Ｈの遺伝子（以下ｆｓｈ−
ＩＩと略称する）のクローニングに成功し、ＧＳＨ−ｍ
活性の増分された大腸菌株な取得した。本発明は、この
Ｇ Ｓ Ｉ：４−ＩＩ活性の増強された組換えグラ７ミ
ド、ＧＳＨ−Ｉ。
本発明者らは遺伝子組み換えによって第一の酵素ＧＳＨ
−１活性が増強された大腸菌を育種しこの菌株がＧ８Ｈ
生産菌株として優れていることを明らかにした（％願昭
５６−１２０５４６ ）。本発明者らは更に本菌株の改
良（めついて鋭意研究の結果、Ｇ５１１生合成に関与す
る第二の酵ｇ Ｇ Ｓ Ｈ−Ｈの遺伝子（以下ｆｓｈ−
ＩＩと略称する）のクローニングに成功し、ＧＳＨ−ｍ
活性の増分された大腸菌株な取得した。本発明は、この
Ｇ Ｓ Ｉ：４−ＩＩ活性の増強された組換えグラ７ミ
ド、ＧＳＨ−Ｉ。
Ｇ ８ Ｈ−ＩＩの両酵素活性が増強された絹換えプラ
スミド、およびそれ等を用いるクルタチオンの酵素的生
産法に関する。
スミド、およびそれ等を用いるクルタチオンの酵素的生
産法に関する。
以下、本発明をＧ Ｓ Ｉ−Ｌ −ＩＩ 遺伝子のクロ
ーニングおよびＧＳＨ−Ｉ 、１両酵素活性を増強する
遺伝子のクローニング、更にそれ等によるグルタチオン
の製造法の順に説明する。なお本発明で使用するベクタ
ーは、Ｂ、ｃ０１ｉ系のコピー数が比較的多いベクター
プラスミド、あるいは７アージ等であれは特に限定され
るものでないが、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２５のプ
ラスミドを使用した場合について説明する。
ーニングおよびＧＳＨ−Ｉ 、１両酵素活性を増強する
遺伝子のクローニング、更にそれ等によるグルタチオン
の製造法の順に説明する。なお本発明で使用するベクタ
ーは、Ｂ、ｃ０１ｉ系のコピー数が比較的多いベクター
プラスミド、あるいは７アージ等であれは特に限定され
るものでないが、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２５のプ
ラスミドを使用した場合について説明する。
Ｇ Ｓ Ｈ−ＩＩ遺伝子のクローニング本発明においで
、ＧＳＨ−ＩＴ遺伝子９ ｓ １１ ＴＩをクローニン
グするために適用される方法は、まず宿主大腸菌として
エツシエリヒア・コリーＢ（Ｅ。
、ＧＳＨ−ＩＴ遺伝子９ ｓ １１ ＴＩをクローニン
グするために適用される方法は、まず宿主大腸菌として
エツシエリヒア・コリーＢ（Ｅ。
ｃｏｌｌＢ （ＡＴＣＣ２３２２６））株を使用し、
これよりアグリカルチュラル アンド バイオロジカル
ケミストリー （Ａ５ｉ’ｒｉｃ、 旧０１．Ｃｈ
ｅｍ、）。
これよりアグリカルチュラル アンド バイオロジカル
ケミストリー （Ａ５ｉ’ｒｉｃ、 旧０１．Ｃｈ
ｅｍ、）。
ｊ−ｊ（ＩＩＪ ２１３Ｌ （１９８１）の方法に従
い変異誘導したＧ Ｓ Ｈ−Ｉ欠損株Ｃ９１２の復帰変
異株几Ｃ９１２を得た後、通常の方法、例えばフェノー
ル法〔ノクイオケミ力 エト バイオフイジク アクタ
（Ｂｉ□ｃｈｉｍ、Ｂｔｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、７２
．６１９−６２９ （１９６３））によって染色体ＤＮ
Ａを抽出し、適当な制限酵素、例えばＨｉｎｄＩ［Ｉ
で染色体１） Ｎ Ａを断ハ化する。他方、染色体ＤＮ
Ａの断片化に用いたのと同じ制限酵素で、ベクターｐＢ
Ｒ３２２を切断し、更にサイエンス（Ｓｃｉ６ｎｃ６）
。
い変異誘導したＧ Ｓ Ｈ−Ｉ欠損株Ｃ９１２の復帰変
異株几Ｃ９１２を得た後、通常の方法、例えばフェノー
ル法〔ノクイオケミ力 エト バイオフイジク アクタ
（Ｂｉ□ｃｈｉｍ、Ｂｔｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、７２
．６１９−６２９ （１９６３））によって染色体ＤＮ
Ａを抽出し、適当な制限酵素、例えばＨｉｎｄＩ［Ｉ
で染色体１） Ｎ Ａを断ハ化する。他方、染色体ＤＮ
Ａの断片化に用いたのと同じ制限酵素で、ベクターｐＢ
Ｒ３２２を切断し、更にサイエンス（Ｓｃｉ６ｎｃ６）
。
、Ｌ旦６．１３１３−１３１９ （１９７７）
の方法に準じてアルカリ７オス７アターゼで処理す
る。
の方法に準じてアルカリ７オス７アターゼで処理す
る。
こうして得られるｐＢＲ３２２処理物を先に調製した染
色体ＤＮＡ処理物と混合した後、７５℃、５分間の処理
でアニーリングし、Ｔ、ＤＮＡリガーゼで組み換え体Ｄ
ＮＡを調製する。この過程において、使用する制限酵素
の種類に制限Ｇゴない。またアルカリ７オス７アターゼ
処理は必須としない。こうして調製した組み換え体ＤＮ
Ａの中より目的とするＧＳＨ−πの遺伝子？ｓｈ［を選
択するため、全組み換え体ＤＮＡを、Ｅ、 ｃｏｌｉ
Ｂより変異誘導したＧＳＨ−Ｉｒ活性欠損株Ｃ１００
１のカルシウムイオン処理によって（モレキュラージエ
ネラルジエネティクス（Ｍｏｌ ｅｃ、 ｆｅｎ、Ｇｅ
ｎｅｔ、） −，１２４゜１−１０ （１９７３）
） コンピテント化した菌体に導入する。かくして得
られるＤＮＡ導入導入土中、目的の遺伝子ｆｓｈ−１［
を持つ株を選択するため、テトラメチルチウラムダイサ
ルファイド（以下ＴＭＴＤと略称する）８ｏｐ’ｉ？／
ｒｓｌおよびアンビシリン（以下Ａｍと略称する）５μ
ｆ ／ ｖｌｌ又はテトＨ２００，０１％ｅ （ＮＨ４
） ２ ”０４ ０．Ｌ’＋グルコース０．５％、寒天
１５％ 〕（以下ＤＭ培地と略称する。）に塗布し、３
７℃で１０〜４０時間培養する。かくして生じる大きな
コロニーを選択することによって、目的の遺伝子７ｓｈ
ＩＩを持つ株を容易に取得できる。この株の持つ組み換
え体ＤＮＡをｐＢＲ棒 ３２２−ｆｌｉｈＩＩと称する。この組み換え許体Ｄ
Ｎ Ａを保持する菌株を、Ｌ−培地〔酵母エキス０．５
％。
色体ＤＮＡ処理物と混合した後、７５℃、５分間の処理
でアニーリングし、Ｔ、ＤＮＡリガーゼで組み換え体Ｄ
ＮＡを調製する。この過程において、使用する制限酵素
の種類に制限Ｇゴない。またアルカリ７オス７アターゼ
処理は必須としない。こうして調製した組み換え体ＤＮ
Ａの中より目的とするＧＳＨ−πの遺伝子？ｓｈ［を選
択するため、全組み換え体ＤＮＡを、Ｅ、 ｃｏｌｉ
Ｂより変異誘導したＧＳＨ−Ｉｒ活性欠損株Ｃ１００
１のカルシウムイオン処理によって（モレキュラージエ
ネラルジエネティクス（Ｍｏｌ ｅｃ、 ｆｅｎ、Ｇｅ
ｎｅｔ、） −，１２４゜１−１０ （１９７３）
） コンピテント化した菌体に導入する。かくして得
られるＤＮＡ導入導入土中、目的の遺伝子ｆｓｈ−１［
を持つ株を選択するため、テトラメチルチウラムダイサ
ルファイド（以下ＴＭＴＤと略称する）８ｏｐ’ｉ？／
ｒｓｌおよびアンビシリン（以下Ａｍと略称する）５μ
ｆ ／ ｖｌｌ又はテトＨ２００，０１％ｅ （ＮＨ４
） ２ ”０４ ０．Ｌ’＋グルコース０．５％、寒天
１５％ 〕（以下ＤＭ培地と略称する。）に塗布し、３
７℃で１０〜４０時間培養する。かくして生じる大きな
コロニーを選択することによって、目的の遺伝子７ｓｈ
ＩＩを持つ株を容易に取得できる。この株の持つ組み換
え体ＤＮＡをｐＢＲ棒 ３２２−ｆｌｉｈＩＩと称する。この組み換え許体Ｄ
Ｎ Ａを保持する菌株を、Ｌ−培地〔酵母エキス０．５
％。
グルツース０．１ ％ 、 、、ＮｃＬＣｌ ０．５％
、ペプトン１．０％（ｐＨ７，２） ）にて対数増殖
期後期まで生育させた後、１５０μ９ ／ Ｉｌｌとな
るようりＵラムフェニコール（以下Ｃｍと略称する）を
添加して、１６時間培養を続は菌体内の組み換え体ＤＮ
Ａの坦を増大させる。この菌体を集菌後、常法通り に
ュークレイツク アシッド リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、）、７．１５１３−１５１７ （
１９７９）密度勾配遠心によってｐＢＲ３２２−ｒｓｈ
Ｉ［を大凧に調製する。かくして得られた、組み換え体
ＤＮＡ ：ｐＢＲ３２２−ｆｓｈＩ［の分子量は４，２
メガダルトン（Ｍｄ）であり、その構造はｐＢＲ３２２
の１ａｉｎ ｄ１部位に１．６Ｍｄ ＋７）ＲＣ９１
２株由来＋７’）染色体ＤＮＡ１！１片が導入されたも
のである（５５１図（イ））。またＰｓｔＩでＲＣ９１
２の染色体ＤＮＡを処理することによって、第１図（ロ
）のような組換え体も侮られる。この組換え体ＤＮΔ：
ｐＢＲ３２２−７ｓｈｌｌをＥ。
、ペプトン１．０％（ｐＨ７，２） ）にて対数増殖
期後期まで生育させた後、１５０μ９ ／ Ｉｌｌとな
るようりＵラムフェニコール（以下Ｃｍと略称する）を
添加して、１６時間培養を続は菌体内の組み換え体ＤＮ
Ａの坦を増大させる。この菌体を集菌後、常法通り に
ュークレイツク アシッド リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、）、７．１５１３−１５１７ （
１９７９）密度勾配遠心によってｐＢＲ３２２−ｒｓｈ
Ｉ［を大凧に調製する。かくして得られた、組み換え体
ＤＮＡ ：ｐＢＲ３２２−ｆｓｈＩ［の分子量は４，２
メガダルトン（Ｍｄ）であり、その構造はｐＢＲ３２２
の１ａｉｎ ｄ１部位に１．６Ｍｄ ＋７）ＲＣ９１
２株由来＋７’）染色体ＤＮＡ１！１片が導入されたも
のである（５５１図（イ））。またＰｓｔＩでＲＣ９１
２の染色体ＤＮＡを処理することによって、第１図（ロ
）のような組換え体も侮られる。この組換え体ＤＮΔ：
ｐＢＲ３２２−７ｓｈｌｌをＥ。
ｃ０１ｉ由来の種々の変異株−例えばＲＣ９１２、Ｃ６
００に導入することによって、ＧＳＨ−ＩＦ活性が特異
的に増強された菌株を得ることができる。
００に導入することによって、ＧＳＨ−ＩＦ活性が特異
的に増強された菌株を得ることができる。
ＧＳＨ−Ｉ 、ＩＩ両”素 −強 Ｌのクローｉとノ
゛ 次に、ＧＳＨ−ＩＩおよびＧ Ｓ Ｈ−Ｉの画情性を同
時に増強した菌株の造成は、以下の２通りの方法で行な
うことができる。第一の方法は、Ｅ 、 ｃｏＩ ｉ由
来の変異株にｆ）ＢＲ３２２−７ｓｈｌｉとｐＢＲ３２
２−ｆｓｈＩを共存させる方法である。ここで用いられ
るｐＢＲ３２２−ｒＳｈＩは、特願昭５６ ＝１２０５
４６に記載したとおり、ＲＣ９１２由来の染色体ＤＮＡ
相当するＲＣ９１２染色体ＤＮＡＷｋ片を、ｐＢＲし ３２２のｐｓｔＩ部位に挿入参れた構造を有する（２種
の組み換え体ＤＮＡは、先述した方法でコンピテント化
したＥ、ｃｏｌｉ 由来の変異株に導入されるが、そ
の導入の順序は問わず、場合によっては、ｐＢＲ３２２
−ｒｓｈＩとｐＢＲ３２２−Ｊ’５ｈｌＩを混合して同
時に導入してもよい。これらへイブリドプラスミド漕大
株の選択は６ｉＪ述したＴＭＴＤＫ対する耐性、あるい
はアンピシリン（以下Ａｍと略称する）およびテトラザ
イクリン（以下Ｔｃと略称する＞ＶＣ対する感受性な指
標にして行なうことができる。例えばＥ、ｃＯｌｉＢよ
り変異誘導された株Ｃ９１２（ＧＳＨ−Ｉ活性欠損→に
ｐ ＢＲ３２２−９５ｂＪの導入された株の選択はＴｃ
を２０μ２／ｍｌ含むＬ−培地に生育する菌として容易
に行なえる。ｔたｃ９ｔｚ株Ｋ ｐ）３Ｒ３２２−ｆＳ
ｈｌＩ（ＩＪ １図（イ）のプラスミド）を導入した株
はＡｍを２０μ２／ｄ含むＬ−培地に生育する菌として
選択できる。
゛ 次に、ＧＳＨ−ＩＩおよびＧ Ｓ Ｈ−Ｉの画情性を同
時に増強した菌株の造成は、以下の２通りの方法で行な
うことができる。第一の方法は、Ｅ 、 ｃｏＩ ｉ由
来の変異株にｆ）ＢＲ３２２−７ｓｈｌｉとｐＢＲ３２
２−ｆｓｈＩを共存させる方法である。ここで用いられ
るｐＢＲ３２２−ｒＳｈＩは、特願昭５６ ＝１２０５
４６に記載したとおり、ＲＣ９１２由来の染色体ＤＮＡ
相当するＲＣ９１２染色体ＤＮＡＷｋ片を、ｐＢＲし ３２２のｐｓｔＩ部位に挿入参れた構造を有する（２種
の組み換え体ＤＮＡは、先述した方法でコンピテント化
したＥ、ｃｏｌｉ 由来の変異株に導入されるが、そ
の導入の順序は問わず、場合によっては、ｐＢＲ３２２
−ｒｓｈＩとｐＢＲ３２２−Ｊ’５ｈｌＩを混合して同
時に導入してもよい。これらへイブリドプラスミド漕大
株の選択は６ｉＪ述したＴＭＴＤＫ対する耐性、あるい
はアンピシリン（以下Ａｍと略称する）およびテトラザ
イクリン（以下Ｔｃと略称する＞ＶＣ対する感受性な指
標にして行なうことができる。例えばＥ、ｃＯｌｉＢよ
り変異誘導された株Ｃ９１２（ＧＳＨ−Ｉ活性欠損→に
ｐ ＢＲ３２２−９５ｂＪの導入された株の選択はＴｃ
を２０μ２／ｍｌ含むＬ−培地に生育する菌として容易
に行なえる。ｔたｃ９ｔｚ株Ｋ ｐ）３Ｒ３２２−ｆＳ
ｈｌＩ（ＩＪ １図（イ）のプラスミド）を導入した株
はＡｍを２０μ２／ｄ含むＬ−培地に生育する菌として
選択できる。
Ｌ−培地の代りに先述したＤＭ培地を用いる場合には、
１０〜２０μｒ／ｍのＴＭＴＤに耐性の菌として選択す
ることが可能である。またｐＢＲ３２２−９ｓｈＩ 、
ｐＢＲ３２２−ｆｓｈｌｌの両方を導入した株は、Ａｍ
を２０μ９／＋ｉ７およびＴｃを２０ ｐ ｆ ／ｍｌ
含むＬ−培地に生育する菌として容易に選択できる。
１０〜２０μｒ／ｍのＴＭＴＤに耐性の菌として選択す
ることが可能である。またｐＢＲ３２２−９ｓｈＩ 、
ｐＢＲ３２２−ｆｓｈｌｌの両方を導入した株は、Ａｍ
を２０μ９／＋ｉ７およびＴｃを２０ ｐ ｆ ／ｍｌ
含むＬ−培地に生育する菌として容易に選択できる。
かくして同一菌体内に２種の組換え体ＤＮＡ：ｐＢＲ３
２２−ｙｓｈＩとｐＢＲ３２２−ｒｓｈＴＩを合わせ持
ち、ＧＳＨ−ＩおよびＱＳＨ−ＩＦ活性が同時に増強さ
れた菌株を得ることができる。
２２−ｙｓｈＩとｐＢＲ３２２−ｒｓｈＴＩを合わせ持
ち、ＧＳＨ−ＩおよびＱＳＨ−ＩＦ活性が同時に増強さ
れた菌株を得ることができる。
ＧＳＨ−ＩとＱＳＨ−ＩＩの画情性を高める第２の方法
は、ＧＳＨ−ＩとＧＳＨ−Ｉ［の両遺伝子を同一のベク
ターに連結して、Ｅ、ｃ □ Ｉ Ｉ 由来の株に導
入する方法である。その方法としては、先ずｐＢＲ３２
２−ｆｓｈＩをＰｓｔ １ で処理して遊離するＲＣ
９１２由来のＤＮＡ断片を単離する。この断片の単離に
は、ｐＢＲ３２２４８ｈＩのＰｓｔ■処理物をアガロー
スゲル電気泳動にかけて分離吸、デルより抽出すること
によって容易に行なえる（メソッドインエンティモロジ
ー（Ｍ６ｔｈ□ｄｓ ｉｎＦｉｎｚｙｍｏｌｏｒｙ）
、６８．．１７６−１８２ （１９７９）参照）。単離
されたＤＮＡ断片をＰｓｔｌで処理したＩ）ＢＲ３２２
−Ｌ？ｓｂｌ［第１図（イ）のプラスぐドと混合する。
は、ＧＳＨ−ＩとＧＳＨ−Ｉ［の両遺伝子を同一のベク
ターに連結して、Ｅ、ｃ □ Ｉ Ｉ 由来の株に導
入する方法である。その方法としては、先ずｐＢＲ３２
２−ｆｓｈＩをＰｓｔ １ で処理して遊離するＲＣ
９１２由来のＤＮＡ断片を単離する。この断片の単離に
は、ｐＢＲ３２２４８ｈＩのＰｓｔ■処理物をアガロー
スゲル電気泳動にかけて分離吸、デルより抽出すること
によって容易に行なえる（メソッドインエンティモロジ
ー（Ｍ６ｔｈ□ｄｓ ｉｎＦｉｎｚｙｍｏｌｏｒｙ）
、６８．．１７６−１８２ （１９７９）参照）。単離
されたＤＮＡ断片をＰｓｔｌで処理したＩ）ＢＲ３２２
−Ｌ？ｓｂｌ［第１図（イ）のプラスぐドと混合する。
この混合物をＴ、 Ｄ Ｎ Ａリガーゼで処理後カルシ
ウム処理でコンピテント化したＥ、ｃｏｌｉＢ由来の株
、例えばＣ９１２株に導入するっ目的とするｆｓｈＩと
ｙｓｈｌＴの遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡ。
ウム処理でコンピテント化したＥ、ｃｏｌｉＢ由来の株
、例えばＣ９１２株に導入するっ目的とするｆｓｈＩと
ｙｓｈｌＴの遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡ。
（これをｐＢＲ３２２−Ｊ’５ｈｌＳＩ［と称する）を
保持する菌株の選択は、形質転換操作後の０９１２株を
ＴＭＴＤ １０ｐ’ｉｌ／ＷＬＩを含むＤＭ−寒天培地
に生育可能な菌株として容易に行なえる。同様に、ｐＢ
Ｒ３ｚｚ−ｙｓｈｉ（１１図（ロ）参照）を）（ｉｎｄ
Ｉ［［で処理してＲＣ９１２のＤＮＡ断片を切り出し、
これをＨ４ｎｄｌＩ で処理したｐＢＲ３２２−ｆｓｈ
Ｉに組み込ませることによっても可能である（第３図参
照）０かくしてベクターｐＢＲ３２２上に、ＧＳＨ−Ｉ
、Ｃ８Ｈ−Ｔ［（ｎ両遺伝子ｆｓｈ工 とＳ’Ｓｈｌを
持つ組み換え体ＤＮＡ ： ｐＢＲ３２２−ｆｓｈＩ
ｐ Ｘがは、ベクターｐＢ８３２２の代りにＰＢＲ３２
５を使うこともできる。ｐＢＲ３２５上［Ｃ８Ｈ−ｘ
、Ｃ８）（−ＩＩの２つの遺伝子ｆｓｈ 工と７ｓｂ■
を組み込む方法は、基本的には上述したｐＢＲ３２２の
場合と同じである。その手順は第４図に示すように、ｐ
ＢＲ３２２−ｆｓｈＩよりＰｓｔｌ処理で７ｓｂＩを含
むＤＮＡ断片を取り出す。また同様ＫｐＢＲ３２２−ｆ
ｓｈ■をＨｉｎ ｄｌｌ＋処理して？ ｓ ｈ ＩＩ
を含むＤＮＡ断片をとり出す。この２種のＤＮＡ断片を
、ｐＢ几３２５のＰｓｔ１部位および旧ｎｄｌ［Ｉｇ（
（位に％人し、ｐＢＲ３２５上にｆｓｈｌと７ｓｈｌｌ
をもつ組み換ので、形質転換株の選択が非常に容易とな
る。
保持する菌株の選択は、形質転換操作後の０９１２株を
ＴＭＴＤ １０ｐ’ｉｌ／ＷＬＩを含むＤＭ−寒天培地
に生育可能な菌株として容易に行なえる。同様に、ｐＢ
Ｒ３ｚｚ−ｙｓｈｉ（１１図（ロ）参照）を）（ｉｎｄ
Ｉ［［で処理してＲＣ９１２のＤＮＡ断片を切り出し、
これをＨ４ｎｄｌＩ で処理したｐＢＲ３２２−ｆｓｈ
Ｉに組み込ませることによっても可能である（第３図参
照）０かくしてベクターｐＢＲ３２２上に、ＧＳＨ−Ｉ
、Ｃ８Ｈ−Ｔ［（ｎ両遺伝子ｆｓｈ工 とＳ’Ｓｈｌを
持つ組み換え体ＤＮＡ ： ｐＢＲ３２２−ｆｓｈＩ
ｐ Ｘがは、ベクターｐＢ８３２２の代りにＰＢＲ３２
５を使うこともできる。ｐＢＲ３２５上［Ｃ８Ｈ−ｘ
、Ｃ８）（−ＩＩの２つの遺伝子ｆｓｈ 工と７ｓｂ■
を組み込む方法は、基本的には上述したｐＢＲ３２２の
場合と同じである。その手順は第４図に示すように、ｐ
ＢＲ３２２−ｆｓｈＩよりＰｓｔｌ処理で７ｓｂＩを含
むＤＮＡ断片を取り出す。また同様ＫｐＢＲ３２２−ｆ
ｓｈ■をＨｉｎ ｄｌｌ＋処理して？ ｓ ｈ ＩＩ
を含むＤＮＡ断片をとり出す。この２種のＤＮＡ断片を
、ｐＢ几３２５のＰｓｔ１部位および旧ｎｄｌ［Ｉｇ（
（位に％人し、ｐＢＲ３２５上にｆｓｈｌと７ｓｈｌｌ
をもつ組み換ので、形質転換株の選択が非常に容易とな
る。
ｐＢＲ３２５−ｒｓｈ Ｉ ： Ｉ［をＥ、ｃ０１ｉ由
来の種々の菌株に導入することによってＱ Ｓ ）ｉ
−■とＧＳＨ−■の活性が同時に増強されＡ１菌株を得
ることかで′きる。
来の種々の菌株に導入することによってＱ Ｓ ）ｉ
−■とＧＳＨ−■の活性が同時に増強されＡ１菌株を得
ることかで′きる。
グルタチオンの製造法
かくして得られるＣ８Ｈ−［とＧＳＨ−■およびＧＳＨ
−ＩＩの活性が増強された大腸菌を用いるＧ Ｓ Ｈの
生産は、以下のように行なうことができる。ＧＳＨ−Ｉ
ＩあるいはＣ８Ｈ−Ｉと０８Ｈ−にの画情性が増強され
た菌株を、炭素源、窒素源。
−ＩＩの活性が増強された大腸菌を用いるＧ Ｓ Ｈの
生産は、以下のように行なうことができる。ＧＳＨ−Ｉ
ＩあるいはＣ８Ｈ−Ｉと０８Ｈ−にの画情性が増強され
た菌株を、炭素源、窒素源。
無機塩などを含む栄養培地、あるいは最少培地（ＤＭ培
地など）に接種し振盪培養する。炭素源としては、グル
コース、７ラクトース、グリセロール、シュークロース
など、ま１−窒素源としては、塩化アン千ニウノ１．硝
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム（原票Ｊなどの無機
態窒素の他、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有
機態窒素を使用できる。また微量金属元素として、塩化
マグネシウム、塩化マンガンなどの汐加も効果的である
。
地など）に接種し振盪培養する。炭素源としては、グル
コース、７ラクトース、グリセロール、シュークロース
など、ま１−窒素源としては、塩化アン千ニウノ１．硝
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム（原票Ｊなどの無機
態窒素の他、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有
機態窒素を使用できる。また微量金属元素として、塩化
マグネシウム、塩化マンガンなどの汐加も効果的である
。
用いる炭素源の濃度は、０．１〜５チ、好適には０．５
チ、窒素源の濃度は０．０５〜５％、好適にはＵ、 Ｓ
チ、また微量金属元素は、０．００５％程度添加するの
が好ましい。培與濡度は２０〜４０℃、好適には３７℃
、また培養ｐＨは６〜８、好適には７が好ましい。かく
して培養終了液より菌体を集めて、一度０．８５チの生
理的食塩水で洗浄後、水懸濁液として、これを１００℃
の沸とう水中で１〜ｌＯ分、好適には１分処理すること
により大腸菌菌体内のＧＳＨを抽出できる。また、上記
培養後の菌体を集画した後、該菌体を以Ｆに述べるよう
な処理をし、これをグルタミン酸、システィン、グリシ
ン、マグネシウムイオン、ＡＴＰと好ましくは適当なＡ
ＴＰ再生糸存在下に反応せしめろことにより、ＧＳＨを
製造することができる。このような菌体処理物としては
、菌体の有＠溶媒処理物、界面活性剤処理物、菌体の音
波破砕物、音波処理後に遠心で得られる無細胞抽出液あ
るいは、適当な担体に固定した菌体、あるいは酵素が挙
げ０れる。
チ、窒素源の濃度は０．０５〜５％、好適にはＵ、 Ｓ
チ、また微量金属元素は、０．００５％程度添加するの
が好ましい。培與濡度は２０〜４０℃、好適には３７℃
、また培養ｐＨは６〜８、好適には７が好ましい。かく
して培養終了液より菌体を集めて、一度０．８５チの生
理的食塩水で洗浄後、水懸濁液として、これを１００℃
の沸とう水中で１〜ｌＯ分、好適には１分処理すること
により大腸菌菌体内のＧＳＨを抽出できる。また、上記
培養後の菌体を集画した後、該菌体を以Ｆに述べるよう
な処理をし、これをグルタミン酸、システィン、グリシ
ン、マグネシウムイオン、ＡＴＰと好ましくは適当なＡ
ＴＰ再生糸存在下に反応せしめろことにより、ＧＳＨを
製造することができる。このような菌体処理物としては
、菌体の有＠溶媒処理物、界面活性剤処理物、菌体の音
波破砕物、音波処理後に遠心で得られる無細胞抽出液あ
るいは、適当な担体に固定した菌体、あるいは酵素が挙
げ０れる。
この場合、利用できる有機溶媒として＋−１、アセトン
、トルエン、エーテルなど、界面活性剤としては、トリ
トン×１００、ドデシル硫酸・セチルトリメチルアンモ
ニウムプロミドなどが利用される。
、トルエン、エーテルなど、界面活性剤としては、トリ
トン×１００、ドデシル硫酸・セチルトリメチルアンモ
ニウムプロミドなどが利用される。
また、菌体、あるいは吟素の固定化にはポリアクリルア
くドゲル、アルギン酸ゲル、光硬化樹脂などの他ｐＥＡ
Ｅ−セルロース、ＤＥＡＥ−セフアゾ２クス等も担体と
して用いることができる。またかかる反応に利用される
ＡＴＰ再生系としては、大腸菌のもつアセ１−トキナー
ゼ反応、カルバメートキナーゼ反応あるいは微生物の解
糖系が好適である。ＧＳＨ生成反応はｌ素含有物を５〜
４０ｍ Ｍのグルタミン酸（好適には２０ｍＭ）、５〜
４６ｍＭのシスティン（好適には２０ ｍ Ｍ） 、５
〜５０ｍＭのグリシン（好適には２０ｎＩＭ）、１〜３
０ｍＭのマグネシウムイオン（好適にはｌＯｍＭ） 、
１〜２ＱｍＭのＡＴＰ （好適には］ＯｍＭ）を含む反
応液で、２０℃〜４０℃（好適には３７℃）、また反応
ｐＨは６〜９ （好適には７．５）で数時間接触させる
ことによって行える。本反応系において、アセテートキ
ナーゼ反応をＡＴＰ再生糸として用いる場合には、アセ
チルリン酸５〜４０ｍＭ（好適にはｚｏｍＭ）を添加す
ればよい。
くドゲル、アルギン酸ゲル、光硬化樹脂などの他ｐＥＡ
Ｅ−セルロース、ＤＥＡＥ−セフアゾ２クス等も担体と
して用いることができる。またかかる反応に利用される
ＡＴＰ再生系としては、大腸菌のもつアセ１−トキナー
ゼ反応、カルバメートキナーゼ反応あるいは微生物の解
糖系が好適である。ＧＳＨ生成反応はｌ素含有物を５〜
４０ｍ Ｍのグルタミン酸（好適には２０ｍＭ）、５〜
４６ｍＭのシスティン（好適には２０ ｍ Ｍ） 、５
〜５０ｍＭのグリシン（好適には２０ｎＩＭ）、１〜３
０ｍＭのマグネシウムイオン（好適にはｌＯｍＭ） 、
１〜２ＱｍＭのＡＴＰ （好適には］ＯｍＭ）を含む反
応液で、２０℃〜４０℃（好適には３７℃）、また反応
ｐＨは６〜９ （好適には７．５）で数時間接触させる
ことによって行える。本反応系において、アセテートキ
ナーゼ反応をＡＴＰ再生糸として用いる場合には、アセ
チルリン酸５〜４０ｍＭ（好適にはｚｏｍＭ）を添加す
ればよい。
大腸菌は強いアセテートキナーゼ活性をもっているので
、アセテートキナーゼ源を添加する必要はない〇 上記の様にして、抽出あるいは反応液中に生成したＧ
Ｓ Ｈは西宮のイオン交換樹脂のカラムで容易に単離さ
れる。まず抽出液あるいは反応液のｐＩ−ｉを硫眼で３
．０に合わせた後、これをカチオン交換研側、例えはダ
イアイオンＰＫ−２２８ＨＫ導通し＼０．５Ｍの水酸化
アンモニウムで溶出する、溶出液のｐＨを硫酸で４．５
に合わせた後、アニメン交換樹脂、例えはデオライトＡ
２（ＣＨ３ＣＯ２型）に導油する。吸着したＧ ８ Ｈ
を０．５Ｍ（吃酷で溶出後。
、アセテートキナーゼ源を添加する必要はない〇 上記の様にして、抽出あるいは反応液中に生成したＧ
Ｓ Ｈは西宮のイオン交換樹脂のカラムで容易に単離さ
れる。まず抽出液あるいは反応液のｐＩ−ｉを硫眼で３
．０に合わせた後、これをカチオン交換研側、例えはダ
イアイオンＰＫ−２２８ＨＫ導通し＼０．５Ｍの水酸化
アンモニウムで溶出する、溶出液のｐＨを硫酸で４．５
に合わせた後、アニメン交換樹脂、例えはデオライトＡ
２（ＣＨ３ＣＯ２型）に導油する。吸着したＧ ８ Ｈ
を０．５Ｍ（吃酷で溶出後。
エタノールを５０％になるように添加すること（（よっ
て結晶Ｇ ８ Ｈ−に単離取得できる。
て結晶Ｇ ８ Ｈ−に単離取得できる。
以下実厳例をあげて本発明を具体的に説明する。
なお、ｐＢＲ３２２−ＦｓｈＩ［、ｐＢＲ３２２−９ｓ
ｈ工およびｐＢＲ３２２−ｆｓｈＩ［の両方、ｐＢＲ３
２２−！７ｓｈ１、ｎおよびｐＢＲ３２５，−ｆｓｈＩ
、Ｉ［の各々をｎ、ｃ９１２に移入し°た株は、工業
技術院微生物工業技術研究所に方々受託番号 微工研菌
寄第６７３１号（ＦＥＢＭＰ −〆Ｚ３〕 ）
、 １司第 ｔ７３２− ※「（ＦＥｆｔＭＰ−Ａ
り３２−）および同第 ｔり３３含（ＦＥ几Ｍ Ｐ−１
’／、３３ ）および同第 １’／許そ（ＦＥ几ＭＰ
−１７３す）として寄託された〇実施例１ （ｐＢ几
３２２−７ｓｈｌｉの調整およびそれを・保持覆る菌株
） エツシエリヒアーコリーＤ （Ｅ、ｃｏｌｉ Ｂ （
ＡＴＣＣ２３２２６）） より変異誘導された変異株
１（・Ｃ９１２をＬ−培地で対数増殖期まで生育さぜた
後集菌し、生理的食塩水（０８５チ）で１回洗浄する。
ｈ工およびｐＢＲ３２２−ｆｓｈＩ［の両方、ｐＢＲ３
２２−！７ｓｈ１、ｎおよびｐＢＲ３２５，−ｆｓｈＩ
、Ｉ［の各々をｎ、ｃ９１２に移入し°た株は、工業
技術院微生物工業技術研究所に方々受託番号 微工研菌
寄第６７３１号（ＦＥＢＭＰ −〆Ｚ３〕 ）
、 １司第 ｔ７３２− ※「（ＦＥｆｔＭＰ−Ａ
り３２−）および同第 ｔり３３含（ＦＥ几Ｍ Ｐ−１
’／、３３ ）および同第 １’／許そ（ＦＥ几ＭＰ
−１７３す）として寄託された〇実施例１ （ｐＢ几
３２２−７ｓｈｌｉの調整およびそれを・保持覆る菌株
） エツシエリヒアーコリーＤ （Ｅ、ｃｏｌｉ Ｂ （
ＡＴＣＣ２３２２６）） より変異誘導された変異株
１（・Ｃ９１２をＬ−培地で対数増殖期まで生育さぜた
後集菌し、生理的食塩水（０８５チ）で１回洗浄する。
かくして得られる菌体ｉｆ（湿７Ｊｆ量）より７エノー
ル法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Δｃｔａ。
ル法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Δｃｔａ。
７２．６１９−６２９ （１９６３）：］で染色体ＤＮ
Ａを抽出し、約１．６１％’のＤＮＡを得た。この染色
体ＤＮＡ１ｐ？をＨｉｎｄｌｌＩで３７℃、３０分間処
理して断片化し、別１７Ｈｉｎ ｄ ｌｌ［で２時間
処坤後、Ｕｌｌｒｉｃｈ らの）ｊｂに（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ １９６．１３１３−１３１９ （１９７７＞でア
ルカリ７オス７アターゼ処理したＩ ＩＩ ？のベクタ
ープラスミドｐ Ｂ Ｒ，３２２と混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼで１０℃１６時間処理し５、組み換え（、ｌｉ
ｌ） Ｎ Ａを調練する。目的の組み換え体ＤＮＡ
： ｐＢＲ３２２−ｒｓｂｌを選択するため得られた全
組み換え体をＥ、ｃ（＋ＩｉＢ より変異誘導されたＱ
ＳＨ−Ｉ［欠損株Ｃ１００１のコンピテントな菌体に導
入し、ｐＢＲ３２２−ｐｓＪをもつ菌株を選択するため
、ＴＭＴＤ８０μｆ ／ ａｔを含むＩ）Ｍ培地に塗布
する。３７℃で４０時間培養後・生じた大きなコロニー
を釣菌ずろことによってＧＳＨ，−ＩＩの遺伝子グ５ｈ
ｌｔを持つ組み換え体ＤＮΔ：ｐＢＲ３２２−ｒｓｌｔ
ｌＴを含む菌株を得た。該菌体よりｐＢ’Ｒ３２２−５
Ｆｓｈｌ［を蜜度勾配遠心により大量調製した。得られ
た組み換え体ＤＮＡの制限構造は第１図（イ）の通りで
あった。
Ａを抽出し、約１．６１％’のＤＮＡを得た。この染色
体ＤＮＡ１ｐ？をＨｉｎｄｌｌＩで３７℃、３０分間処
理して断片化し、別１７Ｈｉｎ ｄ ｌｌ［で２時間
処坤後、Ｕｌｌｒｉｃｈ らの）ｊｂに（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ １９６．１３１３−１３１９ （１９７７＞でア
ルカリ７オス７アターゼ処理したＩ ＩＩ ？のベクタ
ープラスミドｐ Ｂ Ｒ，３２２と混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼで１０℃１６時間処理し５、組み換え（、ｌｉ
ｌ） Ｎ Ａを調練する。目的の組み換え体ＤＮＡ
： ｐＢＲ３２２−ｒｓｂｌを選択するため得られた全
組み換え体をＥ、ｃ（＋ＩｉＢ より変異誘導されたＱ
ＳＨ−Ｉ［欠損株Ｃ１００１のコンピテントな菌体に導
入し、ｐＢＲ３２２−ｐｓＪをもつ菌株を選択するため
、ＴＭＴＤ８０μｆ ／ ａｔを含むＩ）Ｍ培地に塗布
する。３７℃で４０時間培養後・生じた大きなコロニー
を釣菌ずろことによってＧＳＨ，−ＩＩの遺伝子グ５ｈ
ｌｔを持つ組み換え体ＤＮΔ：ｐＢＲ３２２−ｒｓｌｔ
ｌＴを含む菌株を得た。該菌体よりｐＢ’Ｒ３２２−５
Ｆｓｈｌ［を蜜度勾配遠心により大量調製した。得られ
た組み換え体ＤＮＡの制限構造は第１図（イ）の通りで
あった。
分子量は４．２ ＭｄてベクターｐＢＲ，３２２のＨｉ
ｎｄｍ部位ニ１．、６ Ｍ ｄ Ｏ−） ＲＣ９１２［
ｌＪ光（７） Ｄ Ｎ Ａ ｉ：ｊ１片が組み込まれて
いる。不実部側においてＨｉ ｎｄ■の代りにＰｓｔ
Ｉを用いることによって同様な組み換え体ＤＮＡを得る
ことができる（軸１１頒（ロ））。この場合の組み換え
体ＤＮＡの分子量は８０λ４ｄでｐＢＲ３２２のＰｓｔ
Ｉ部位にＨ・０９１２由来の５．４ Ｍ ｄに相当
するＤＮＡ断片が組み込まれている。かくして？ｑら゛
れたｐＢＲ３２２−ｒｓｂｌ［（第１図（イ））をＥ、
ｃｏｌｉＢ 由来の種々の変異株に導入シた。変異株へ
の導入は、先述のカルシウム処理法（Ｍｏｉｅｃ、ｙｅ
ｎ、ｄｒ！ｎｅｔ、、１２４．１−１．０ （１９７
３） ）に匁りて菌体なコンピテント化して行ない、
形質転（シ、′ｉ株の選択は２Ｑｐ９／ａｔのアンピシ
リンを含むＬ−培地、又は１０μｙ／ｍｌ 〜８Ｑ Ｉ
ｆ ／ ｍｌのＴ ｉｋｌ ’Ｉ’ Ｄを含むＤ Ｍ培
地で、各薬剤の耐性株として行なうことが出来る。かく
して得られる形質転換株のもつＣｘ Ｓ Ｔ（、−Ｉお
よびＧ Ｓ Ｈ−ｌ活性を表ＩＫ示した。なお、各鱈累
活性は、ＤＭ培地で対数増殖期の菌体よりＭｋｇＬした
菌体ｈ１：出液を用いて行なった。また酸素活性はシト
−ナル オブ ジェネラル マイクロバイオロジー（Ｊ
、 Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ） １２８．
１０４７〜１０５２ （１９８２） に記載の測定法
Ｖζ従った。
ｎｄｍ部位ニ１．、６ Ｍ ｄ Ｏ−） ＲＣ９１２［
ｌＪ光（７） Ｄ Ｎ Ａ ｉ：ｊ１片が組み込まれて
いる。不実部側においてＨｉ ｎｄ■の代りにＰｓｔ
Ｉを用いることによって同様な組み換え体ＤＮＡを得る
ことができる（軸１１頒（ロ））。この場合の組み換え
体ＤＮＡの分子量は８０λ４ｄでｐＢＲ３２２のＰｓｔ
Ｉ部位にＨ・０９１２由来の５．４ Ｍ ｄに相当
するＤＮＡ断片が組み込まれている。かくして？ｑら゛
れたｐＢＲ３２２−ｒｓｂｌ［（第１図（イ））をＥ、
ｃｏｌｉＢ 由来の種々の変異株に導入シた。変異株へ
の導入は、先述のカルシウム処理法（Ｍｏｉｅｃ、ｙｅ
ｎ、ｄｒ！ｎｅｔ、、１２４．１−１．０ （１９７
３） ）に匁りて菌体なコンピテント化して行ない、
形質転（シ、′ｉ株の選択は２Ｑｐ９／ａｔのアンピシ
リンを含むＬ−培地、又は１０μｙ／ｍｌ 〜８Ｑ Ｉ
ｆ ／ ｍｌのＴ ｉｋｌ ’Ｉ’ Ｄを含むＤ Ｍ培
地で、各薬剤の耐性株として行なうことが出来る。かく
して得られる形質転換株のもつＣｘ Ｓ Ｔ（、−Ｉお
よびＧ Ｓ Ｈ−ｌ活性を表ＩＫ示した。なお、各鱈累
活性は、ＤＭ培地で対数増殖期の菌体よりＭｋｇＬした
菌体ｈ１：出液を用いて行なった。また酸素活性はシト
−ナル オブ ジェネラル マイクロバイオロジー（Ｊ
、 Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ） １２８．
１０４７〜１０５２ （１９８２） に記載の測定法
Ｖζ従った。
表１ 組み換えＤＮＡ：ｐＢＲ３２２−グ５ｈｌＪを保
持する菌株のＧ Ｓ Ｉ−１−ＩおよびＧ Ｓ ＬＩ−
Ｔ活性酵素活性 菌株 （７７ｍ０１ ｅ／ｌＩ／／ＩＶ−Ｊ Ｆ
：１）ＧＳＨ−Ｉ ＧＳ）ｉ−ＩＩ Ｃ９１ｚ ｏ （−） ０．６０ （１，０
）Ｃ９１２／ｐＢＲ３２２−ｆｓｂ Ｉｆ ’ ０
（−） ２２．０ （３６，７）Ｃ１００Ｉ
Ｑ、０６（１，０） ０ （−１Ｃ１００’ｌ／ｐＢ
Ｉ（３２２−ｆｓｈｌ［０，０５（１，０） ２０．２
（−）１（Ｃ９１２０，０６（＋、０） （１，５７
（１，０）ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２２−ｆｓｈｌ ０．
０６ （１，０） １８．８ （３１，２）（・）相対
［直を示す。
持する菌株のＧ Ｓ Ｉ−１−ＩおよびＧ Ｓ ＬＩ−
Ｔ活性酵素活性 菌株 （７７ｍ０１ ｅ／ｌＩ／／ＩＶ−Ｊ Ｆ
：１）ＧＳＨ−Ｉ ＧＳ）ｉ−ＩＩ Ｃ９１ｚ ｏ （−） ０．６０ （１，０
）Ｃ９１２／ｐＢＲ３２２−ｆｓｂ Ｉｆ ’ ０
（−） ２２．０ （３６，７）Ｃ１００Ｉ
Ｑ、０６（１，０） ０ （−１Ｃ１００’ｌ／ｐＢ
Ｉ（３２２−ｆｓｈｌ［０，０５（１，０） ２０．２
（−）１（Ｃ９１２０，０６（＋、０） （１，５７
（１，０）ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２２−ｆｓｈｌ ０．
０６ （１，０） １８．８ （３１，２）（・）相対
［直を示す。
￥園側２
実施例１０表１記載の菌株をｓ ｏ ｏ ｍｔのＤＭ培
地に接種し３７℃で３時間振盪培養する０かくして得ら
れる対数増殖期のｍ体を集め、０．８５チの生理的食塩
水で１回洗浄する。この菌体を再度水に懸濁し５０１ｎ
９／１ｎｌの溶液とする。このＰｖ濁液Ｏ５づを１００
℃で１分間加熱し１菌体中のグルタチオンを抽出する。
地に接種し３７℃で３時間振盪培養する０かくして得ら
れる対数増殖期のｍ体を集め、０．８５チの生理的食塩
水で１回洗浄する。この菌体を再度水に懸濁し５０１ｎ
９／１ｎｌの溶液とする。このＰｖ濁液Ｏ５づを１００
℃で１分間加熱し１菌体中のグルタチオンを抽出する。
かくして得られたグルタチオン凰は表２に示す通りであ
った。
った。
表２ 組み換え体ＤＮＡ ： ｐＢＲ３２’２− ｒｓ
ｈ ＩＩを保持ずろ菌体のグルタチオン含量 （’Ｖ／Ｓ’−ｖｒｅｔ ｃｅｌｌｓ）Ｃ９１２０ Ｃ９１２／ｐＢ１．（３２２−ｆｓｈ Ｈ０Ｃ１００Ｉ
ＯＣ］ ００１ ／ｐＢ
Ｒ３２２−ｆｓｈ ＩＴ １．２几Ｃ９］、
２ ０．７ＲＣ９１
２／ｐＢＲ３２２−１ｉ’ｓｈ ＩＩ １．
４定＆ｊＩｉ：：アナリティヵル バイオケミストリー
（Ａｎ（Ｌｌ、Ｄｉ□ｃｈｅｌＴ］、） ２７，５０２
−５２２（１９６９）実施例３ （Ｉ）Ｊ３Ｒ３２２−
５’ｓｈＩおよびｐＢＲ，３２２−ｉｉ２ｓｈ ［を合
せ持つ−１株） 実施例１の表１記載の菌株Ｃ９１２／ｐＢＲ３２２＋１
ｉｌｓｈＴ［、Ｃ１００Ｉ／ｐＢＲ３２２−ｒｓｈＵお
よびＲＣ９１２／ ｐＢＲ３２２−１ｉ’ｓｈＩ［を、
各々カルシウムイオン処理でコンピテント化した徒、組
み換え体ＤＮＡ：ｐＢＲ３２２−ｆｓｈＩを導し、同−
菌株中にｐ ＢＲ３２２−ｆｓｈｌとｐＢＲ３２２−ｆ
！ｓｈｌ［の両者を保持する形質転換株を造成した。こ
れら形質転換株のＧ Ｓ Ｈ−Ｉ 、ＧＳＨ−ＩＦ活性
および菌体内グルタチオン含量は表３に示す通りであっ
た。
ｈ ＩＩを保持ずろ菌体のグルタチオン含量 （’Ｖ／Ｓ’−ｖｒｅｔ ｃｅｌｌｓ）Ｃ９１２０ Ｃ９１２／ｐＢ１．（３２２−ｆｓｈ Ｈ０Ｃ１００Ｉ
ＯＣ］ ００１ ／ｐＢ
Ｒ３２２−ｆｓｈ ＩＴ １．２几Ｃ９］、
２ ０．７ＲＣ９１
２／ｐＢＲ３２２−１ｉ’ｓｈ ＩＩ １．
４定＆ｊＩｉ：：アナリティヵル バイオケミストリー
（Ａｎ（Ｌｌ、Ｄｉ□ｃｈｅｌＴ］、） ２７，５０２
−５２２（１９６９）実施例３ （Ｉ）Ｊ３Ｒ３２２−
５’ｓｈＩおよびｐＢＲ，３２２−ｉｉ２ｓｈ ［を合
せ持つ−１株） 実施例１の表１記載の菌株Ｃ９１２／ｐＢＲ３２２＋１
ｉｌｓｈＴ［、Ｃ１００Ｉ／ｐＢＲ３２２−ｒｓｈＵお
よびＲＣ９１２／ ｐＢＲ３２２−１ｉ’ｓｈＩ［を、
各々カルシウムイオン処理でコンピテント化した徒、組
み換え体ＤＮＡ：ｐＢＲ３２２−ｆｓｈＩを導し、同−
菌株中にｐ ＢＲ３２２−ｆｓｈｌとｐＢＲ３２２−ｆ
！ｓｈｌ［の両者を保持する形質転換株を造成した。こ
れら形質転換株のＧ Ｓ Ｈ−Ｉ 、ＧＳＨ−ＩＦ活性
および菌体内グルタチオン含量は表３に示す通りであっ
た。
実施例４ （ｐＢＲ３２２−Ｉ、ＩＦの調罎およびそれ
を保持する菌株） ｐＢＲ３２２−ｊｉｉ’ｓｈ■５０ ｐｆ をＰｓｔｌ
Ｔ’処理した後、アガロースゲル電気泳動によって生じ
たＤＮＡ７１１片を分離する。小断片を含むゲルを切り
出し、これを透析チューブに入れて再び電気泳動にかけ
、ゲル中に存在するＤＮＡ断片をゲル外へ出す。かくし
て約５μ２０ｆｔ、ｈ工を含むＤＮＡ断片を得た。
を保持する菌株） ｐＢＲ３２２−ｊｉｉ’ｓｈ■５０ ｐｆ をＰｓｔｌ
Ｔ’処理した後、アガロースゲル電気泳動によって生じ
たＤＮＡ７１１片を分離する。小断片を含むゲルを切り
出し、これを透析チューブに入れて再び電気泳動にかけ
、ゲル中に存在するＤＮＡ断片をゲル外へ出す。かくし
て約５μ２０ｆｔ、ｈ工を含むＤＮＡ断片を得た。
次に、ｐＢＲ３，２２−ハｈ）（ｌｐｆをＰｓｔＩで処
理した後、上記調製したｆｓｈＩを含むｒｌＮＡ断片１
μ２を加え、Ｔ、ＤＮＡＩＪガーゼで処理する。
理した後、上記調製したｆｓｈＩを含むｒｌＮＡ断片１
μ２を加え、Ｔ、ＤＮＡＩＪガーゼで処理する。
かくしてＩ）ＢＲ３２２上に、ｆｓｈＩとＳ’ Ｓ ｈ
ｌ［の両遺伝子を合せ持つ糾み換え体ＤＮ Ａ ：
ｐＦＩＲ３２２−ｙｓｂｒｙ［Ｍ得られる。このｐＢｌ
（３２２−ｙＳｈ工、■ をＨ，ｃ０１ｉＢ由来の菌株
にカルシウム処理で導入する。形質転換株は４２０μｆ
／ ｌｆｆ１のＴＭＴＤを含むＤＭ培地上に生育する
大コロニーを釣菌することによって容易に選択できる。
ｌ［の両遺伝子を合せ持つ糾み換え体ＤＮ Ａ ：
ｐＦＩＲ３２２−ｙｓｂｒｙ［Ｍ得られる。このｐＢｌ
（３２２−ｙＳｈ工、■ をＨ，ｃ０１ｉＢ由来の菌株
にカルシウム処理で導入する。形質転換株は４２０μｆ
／ ｌｆｆ１のＴＭＴＤを含むＤＭ培地上に生育する
大コロニーを釣菌することによって容易に選択できる。
かくして得られる形質転換株のもつＧＳ）（；Ｉ、ＧＳ
Ｈ−Ｘ活性およびＧ８Ｈ含量は下表の通りであった。
Ｈ−Ｘ活性およびＧ８Ｈ含量は下表の通りであった。
実姉例５ （ｐＢＲ３ｚｓ−ｙｓｈＩ弓ｆの読値およ
びそれを保持する四株） ｐＢＲ３２２−ｒｓｈｌ ５０ μ２をＰｓｔＩで処
理し、実施例４と同様にｆ ｓ ＩＩ ｌを含むＤＮＡ
断片４μ２を取得した。他方ベクターｐＢ几３２５をＰ
ｓｔＩで処理し、この１μ？に９ｓｈＩを含むＤＮＡ断
片１μ７を加えてＴ、ＤＮＡリガーゼで処理する。目的
とする組み換えＤＮＡ： Ｉ）ＢＲ３２５−７ｓｈＩを
取得するためリガーゼ処理物でＣ９１２株を形質転換し
、ｐＢＲ３２５−ｆｓｂＩを保持する菌株を２０μ７／
ｉｆ’のＴＭＴＤと５μり／献のテトラサイクリンを
含むＤＭ培地上に生育するコロニーとして取得した。次
いでこの菌株より密度勾配遠心でｐＢ Ｒ３２５−５’
ｓｈＩを大鼠調製する。この組み換え体ＤＮＡ ： ｐ
ＢＲ３２５−ｆｓｈＩ Ｋ？ｓｈＫを組み込まぜるため
、まずｐＢＲ３２２−ｒｓｈｌＩ （５０μ７）をＨｉ
ｎｄＩｌ［で処理し実施例４同様に１その断片を電気泳
動で分離し、ｆ ｓ ｈ ＩＩを含むＤＮＡ断片約７μ
？を得た。このＤＮＡ断片１μ７をＨｉｎｄｌｌ［で処
理したｐＢＲ・３２５−ｒ８ｈＩ １μグと混合し、丁
番ＤＮＡリガーゼで処理する。かくして、ｐＢＲ３２５
上にｆｓｈＩとｆｓｈＴ［の両遺伝子を合せ持つ組み換
え体ＤＮＡ ： ｐＢＲ３２５−９ｓｈ工・Ｉｔをｉｌ
ｖｉｔｒ。
びそれを保持する四株） ｐＢＲ３２２−ｒｓｈｌ ５０ μ２をＰｓｔＩで処
理し、実施例４と同様にｆ ｓ ＩＩ ｌを含むＤＮＡ
断片４μ２を取得した。他方ベクターｐＢ几３２５をＰ
ｓｔＩで処理し、この１μ？に９ｓｈＩを含むＤＮＡ断
片１μ７を加えてＴ、ＤＮＡリガーゼで処理する。目的
とする組み換えＤＮＡ： Ｉ）ＢＲ３２５−７ｓｈＩを
取得するためリガーゼ処理物でＣ９１２株を形質転換し
、ｐＢＲ３２５−ｆｓｂＩを保持する菌株を２０μ７／
ｉｆ’のＴＭＴＤと５μり／献のテトラサイクリンを
含むＤＭ培地上に生育するコロニーとして取得した。次
いでこの菌株より密度勾配遠心でｐＢ Ｒ３２５−５’
ｓｈＩを大鼠調製する。この組み換え体ＤＮＡ ： ｐ
ＢＲ３２５−ｆｓｈＩ Ｋ？ｓｈＫを組み込まぜるため
、まずｐＢＲ３２２−ｒｓｈｌＩ （５０μ７）をＨｉ
ｎｄＩｌ［で処理し実施例４同様に１その断片を電気泳
動で分離し、ｆ ｓ ｈ ＩＩを含むＤＮＡ断片約７μ
？を得た。このＤＮＡ断片１μ７をＨｉｎｄｌｌ［で処
理したｐＢＲ・３２５−ｒ８ｈＩ １μグと混合し、丁
番ＤＮＡリガーゼで処理する。かくして、ｐＢＲ３２５
上にｆｓｈＩとｆｓｈＴ［の両遺伝子を合せ持つ組み換
え体ＤＮＡ ： ｐＢＲ３２５−９ｓｈ工・Ｉｔをｉｌ
ｖｉｔｒ。
で合成できる。これをＥ、ｃｏｌｉＢ由来の種々の株に
カルシウム処理法で導入する。形質転換株の選択は、Ｆ
Ｉ Ｏμｍｉ′／ ｍｌのＴＭＴＤと２μり／ｌｕツク
ロランフェニコールを含むＤＭ培地上で大コロニーを釣
菌ずろことによって行なうことができる。
カルシウム処理法で導入する。形質転換株の選択は、Ｆ
Ｉ Ｏμｍｉ′／ ｍｌのＴＭＴＤと２μり／ｌｕツク
ロランフェニコールを含むＤＭ培地上で大コロニーを釣
菌ずろことによって行なうことができる。
かくして造成し、たｐＢＲ３２５−ｒ８ｈ Ｉ拳■を含
む菌株のもつＧＳＨ−Ｉ、ＧＳ）Ｉ−１１活性およびＧ
Ｓ）ｌ含量は下表の通りであった。
む菌株のもつＧＳＨ−Ｉ、ＧＳ）Ｉ−１１活性およびＧ
Ｓ）ｌ含量は下表の通りであった。
実施例６
実施例２表２記載の株几Ｃ９１２／ｐＢＲ３２２−４ｉ
’ｓｈ■、実施例３表３記載の株ＲＣ９１２／Ｉ）ＢＲ
３２２−ｙＳ ｈ ｌ［、実施例４表４記載の株ＲＣ９
１２／ｐＢＲ３２２−４ｉ’ｓｈＩ・■、および実施例
５表５記載の株ＲＣ９１２／ｐＤ几３２５−２ｓｈＩ・
■を実施例２と同様に、ＤＭ培地にて培養する。対数増
殖期の菌体を集菌後、０、８５ ％の生理的食塩水で１
回洗浄後、５ｍＭトリス塩酸緩’０１６Ｍ （ｐＨ７，
５） に懸濁し、９０ＫＨｚで５分間破砕し、破砕物
を１５．ｏｏＯｒ、ｐ、ｍ ３０分遠心する。かくして
得られる菌体抽出液を２０ｍＭＬ−グルタミン酸、２０
ｍＭＬ−システィン、２０ｍ Ｐ、Ａグリシン、１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、ｌＱｍＭＡＴＰ、ｌ ＯｍＭ ア
セチルリン酸、５ＱｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
０）を含む反応液中で３７℃ ２時間インキュベートす
る。かくして反応液中に生成したグルタチオンは下表の
通りであった。
’ｓｈ■、実施例３表３記載の株ＲＣ９１２／Ｉ）ＢＲ
３２２−ｙＳ ｈ ｌ［、実施例４表４記載の株ＲＣ９
１２／ｐＢＲ３２２−４ｉ’ｓｈＩ・■、および実施例
５表５記載の株ＲＣ９１２／ｐＤ几３２５−２ｓｈＩ・
■を実施例２と同様に、ＤＭ培地にて培養する。対数増
殖期の菌体を集菌後、０、８５ ％の生理的食塩水で１
回洗浄後、５ｍＭトリス塩酸緩’０１６Ｍ （ｐＨ７，
５） に懸濁し、９０ＫＨｚで５分間破砕し、破砕物
を１５．ｏｏＯｒ、ｐ、ｍ ３０分遠心する。かくして
得られる菌体抽出液を２０ｍＭＬ−グルタミン酸、２０
ｍＭＬ−システィン、２０ｍ Ｐ、Ａグリシン、１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、ｌＱｍＭＡＴＰ、ｌ ＯｍＭ ア
セチルリン酸、５ＱｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
０）を含む反応液中で３７℃ ２時間インキュベートす
る。かくして反応液中に生成したグルタチオンは下表の
通りであった。
表６ 各種紐み換え体ＤＮＡを保持するＲＣ９１２株の
グルタチオン生成活性 菌 株 ダ
ルタチオン生成活性■／ｄ／２時間） 几Ｃ９１２０，４ ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２２−ｉｉ’５ｈＩＩ （ＦＦＪ
ｉＭ Ｐ−６７３１） ０．８几Ｃ９１２／１ｌＩ
ＢＲ３２２−ｆｓｈｌ、−１ｉ’ｓｈｍ（ＦＥＢＭＰ−
６７３２２，１ＲＣ９１２／Ｉ）ＢＲ３２２−ｒｓｈＩ
・Ｉ［（ＦＥＢＭ Ｐ−６７３３）２．３ＲＣ９１２／
ｐＢＲ３２５−ｆ’ｓｈＩやＩＩ （ＦＥＢＭＰ−６７
３４）２．８
グルタチオン生成活性 菌 株 ダ
ルタチオン生成活性■／ｄ／２時間） 几Ｃ９１２０，４ ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２２−ｉｉ’５ｈＩＩ （ＦＦＪ
ｉＭ Ｐ−６７３１） ０．８几Ｃ９１２／１ｌＩ
ＢＲ３２２−ｆｓｈｌ、−１ｉ’ｓｈｍ（ＦＥＢＭＰ−
６７３２２，１ＲＣ９１２／Ｉ）ＢＲ３２２−ｒｓｈＩ
・Ｉ［（ＦＥＢＭ Ｐ−６７３３）２．３ＲＣ９１２／
ｐＢＲ３２５−ｆ’ｓｈＩやＩＩ （ＦＥＢＭＰ−６７
３４）２．８
第１図−組み換え体ＤＮＡ ｐＢＲ３２２−ｆｓｈＩ
［の環状制限地図 ＜図中の数値はメガダルトン） ：ＲＣ９１２の染色体ＤＮＡ断片 ： Ｉ）ＢＲ３２２ Ｐ ： Ｐｓｔ ｌ Ｅ、： ＥｃＯＲＩ Ｂ
： Ｂ（Ｚｎ Ｈ７Ｓ ： Ｓａｌ Ｉ Ｍ：
Ｍｌｕ Ｉ Ｈ： Ｈｉｎ ｄ ＩＩＩＰ
ｖ ： Ｐ ｖ ｕ ｌ［ 第２図−組み換え体ＤＮＡ ｐＢＲ３２２−５’ｓｈＩ
の環状制限地図 ：ＲＣ９１２の染色体ＤＮＡ断片 ：ｐＢＲ３２２ （記号は第１図に同じ） 第３図−組み換え体ＤＮＡ ｐＢＲ３２２−５’ｓｈｌ
拳■の調製と環状制限地図 ：ＲＣ９１２の染色体ＤＮＡ断片（ｉｉ’ｓｈｌ［）同
゛ 上 （ｌｉ’ｓＪ）：ｐＢＲ３２
２ （記号は第１図に同じ） 第４図−組み換え体ＤＮ’ＡｐＢＲ３２５−ｆｓｈｌ争
ＩＩの調製と環状制限地図 ：ＲＣ９１２の染色体ＤＮＡ断片（ｓ’５ｈｎ）同
上 （ｆｓｈＩ）： Ｉ）ＢＲ３２２ ： ｐＢＲ３２５ （記号は第１図に同じ） 什 理 人 弁理士 途山俊− 第２図 第３図 コ ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ ｘ−ｎ 手紛補正書（自発） 昭和５８年２月１日 特許庁長官 若杉和夫殿 １、事件の表示 特願昭５７−１７０７２７ 号 ２ 発明の名称 遺伝子組換えで遣屹されるプラスミドおよび該グラスミ
ドによるグルタチオンの製造法 ３、伸圧をする者 事１１ｒとの関係 特許出願人 木 伺 光 ４、代理人 明細書 （１）・明細書１５頁、１行目、「リルアミドゲル、」
の次に１カラギーナンゲル、」を加入する。 （２）実施例８を追加する。 実施例 ８ 実施例５０表５に記載の林ＲＣ９１２／ｐＢ几３２５−
９ｓｈＩ・■及びＲＣ９１２株を実施例７と回し培地で
培養する。菌体を集菌後、生理食塩水で−ｒ９゛洗浄し
た後、生理食塩水１０１＋ｌＪ［ｐｌ濁Ｌ、；う７℃に
加温する。これに３１−のカラギーナン水溶液（３７℃
）２０ｔｕｌを加えて混合し、この混合液を２条塩化カ
リウム水溶液中にノズルから滴下させ直径約３ｒＭＩの
球状ゲルを調整する。この固定化菌体２，５りを実施例
７と同じ反応液５ ｍｌ中で３７℃にて伽とう反応させ
、経時的に生成したグルタチオンを定量した結果、表８
の如くであった（転換率はＬ−システィンからの転換率
を示す。）０又４時間反応後固宇化菌体をｐ別し、同じ
ノス、ｆｉＬ、、液で繰返し反応した場合の反応４時間
目Ｊ）グルタチオン生成給を定結した結果を表９に示す
。な」５反応液中のＡＴＰおよびアセチルリン酸の濃度
を棹々変化させてもほぼ同様の結果が得られた。 表８ 表 ９ 手続補正嘗（自弁） 昭和５８年１１月２５日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １、事件の表示 特願昭５７−１７０７２７ 号 λ 発明の名称 遺伝子組換えで造成されるプラスミドおよび該プラスミ
ドによるグルタチオンの製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 木 村 光 ４、代理人 明 細 書 ６、補正の内容 別紙のとおり 明細書を下記のとおり訂正します。 （１）明細１８９頁２行の「４．６ＭｄＪを［４，７Ｍ
ｄＪに改める。 （２ン 明１１１Ｗｘｔ頁１３行「易に行乙「える。 」の次に「（第３図参照）」を挿入し、同頁同行「同様
に、・・・・・・・・・」以下１７行の「（第３図参照
）。」まで削除する。 （’ｌ） 明細書１５頁７行の１５〜４０」を「１０
〜１００」に改める。 （４）明細書１５頁８行のＪ２０ｍＭＪを「８０ｍＭＪ
Ｋ改める。 （５）昭和５８年１月３１日付手続補正２頁９行の［ｏ
ｙＪを「２ＢｆＪに改める。 ２頁１４行〜１５行の「５℃にて５分間」を「２０℃で
ゲルが生成されるまで」に改める。 ３頁１行の「２．５ＴＲｔ」を［５ｆＪに改める０ （６〕 昭和５８年２月１日付手続補正書１頁７行の
「菌体を集菌後」の次Ｋｒ（湿重量１０２）」を挿入す
る。 以 上 手続補正書（自発） 昭和５８年１月３１日 特許庁長官 若杉和夫殿 １、事件の表示 ′ｌｖＩＭ昭５７−１７０７２７号 ２、発明の名称 遺伝子組換えで造成されるプラスミドおよび該プラスミ
ドによるグルタチオンの製造法 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 木 村 光 ４、代理人 （１１代理権を証する書面 （２１明細書６、補正
の内容 別紙のとおり （１１明細＃ｆＩ２頁、特！′Ｆ請求の範囲（８）に紗
【すて、次の（ＤＪ ’、 ００）を加入する。 （９） ゲル状担体に固定化することを特徴とする特
ｆｆ趙求の範囲第（８）項記載の製造法０（ｌＯ）ゲル
状担体がポリアクリルアミドゲルである鳴許請求の範囲
（９）項記載の製ｆ＋’ｊ法０（２）明細書７頁下から
２行目の［Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、） 。 ７．１５１３−１５１７ （１９７９）ｊを［Ａｃ１ｄ
Ｒｅｓ、）。 ７．１５１３−１５１７ （１９７９））ｊとｉＩ正す
る。 （８）明細書１１頁下から２行目のｌ’ ｐＢＩＬ３２
２−ｙｓｈ−ｆｌｊを［ｐＢＲ３２２−ｙｓｈ １１１
１１ ＪとＭＪ ｉＥする。 （４） 明細褐１６貴下から１行目の「および」を「
、（および）」と訂正する。 ｔ５） 明１１１１ ｔ’ｊ ２９頁４行目１７）ｒ
ｒｓｈｌＪ＆ｒ１３ｃｒ、ｍＨＩＪと訂正する０ （７）明細書３０頁、実施例６に続けて、次σ）実施例
７を追加する。 実施例 ７ 実施例５０表５に記載の株ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２５−
ｆＳｈＩ・■をペプトン１．０チ、酵母エキス１．０％
。 肉エキス０５％、グルコースｌ、０チ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物０８０１％、リン＠１カリウム０．５チ、
クロラムフェニフール２０μ９ ／ ｖｓｌを含む培地
（ＰＨ７，０）１０００−に接種し、３０℃で２０時間
通気振とり培養する。菌体を集菌後、生理食塩水で一度
洗浄した後、生菌体１０７（湿重量）を３０％塩化カリ
ウム溶液１５ｍ／に懸濁し、これに３３．５％アクリル
アミドモノマー１３１ｄ％２０％Ｎ、Ｎ’−メチレンビ
スアクリルアミド２”Ｎ５．０チβ−ジメチルアミノプ
ロピオニトリル５プおよび６．５％過硫酸カリウム６ｍ
ｌを加え、５℃にて５分間放置する。ついでこの固定化
した菌を１辺２市の立方体に成型し、生理食塩水にて洗
浄することにより固定化エッシェリヒア・コリーＲＣ９
１２／ｐＢＲ３２５−＠５ｈＩ−１ｓｏ ｒを得る。
プラスミドを含有しないＲＣ９１２株についても同様の
方法で固定化菌体を調整した０ 調整した固定化菌体２．５ ＃ｌＡ！を８０ｍＭＬ−グ
ルタミン歯、２０ｍＭＬ−システィン、２０ｍＭ グリ
シン、２５ ｍＭｊＪ（化マグネシウム、２０ｍＭΔＴ
Ｐｓ２０ｍＭアセチルリ＞ｆｆＪ、２５ ｍＭ リ＞
ａＶカリウム緩衝液（ｐＨ７，０） を含む反応液５
ｍｌ中で３７℃で振とう反Ｊｌｌ；’：させ、経時的
に生成したグルタチオンを定ＪＡシた結果、下表の曲り
であった（転（すｉ率はＬ−システィンからの１１へ侠
率な承す）。 表 ７ 手 続 補 正 ＩＪ（方式）昭和５９年５月
２２日 特許庁長官 若杉和夫 殿 ！、＄件の表示 特願昭 ５７−１７０７２７ 号 ２・発明の名称 遺伝子組換えで造成されるプラスミドおよび該プラスミ
ドによるグルタチオンの暉向法３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 京都府京都市下京区若宮通り六条上ＪＶ±若宮町８０番
曲の２ 木 村 光 ４、代 理 人 〒 １０５ 東京都港区虎ノ門１丁目９−１０港電設ビ
ル 置 ５０８−０８７６ 昭和５９年 ５ 月１８日 （発送日）６、捕ＩＥのせ
象 昭和５８年１月３１日付押出の手続補正管の補正（別紙
） 明細書中「特許請求の範囲」の項の記載を次のとおり訂
正する。 「（１） グルタチオン合成に関与する２種の酵素、
γ−グルタミルーＬ−システィン合成酵素および／また
はグルタチオン合成酵素の遺伝子をエツシエリヒア・コ
リー（Ｅ、０ｏｌｉ）糸ベクターに組込んだ大腸菌にて
複製できる組換えプラスミド。 （２） プラスミドが７）ＢＲろ２２−ｔｙｓｈｎ
である特許請求の範囲第（１）項記載の組換えプラス
ミド。 （６） プラスミドがｐＢＲ３２２−ｔｉｓｈＩ−ｍ
である特許請求の範囲第（１）項記載の組換えプラスミ
ド。 （４） プラスミドがｐＢＲ３２５−ｔｙ ｓ ｈ
Ｉ・■である特許請求の範囲第（１）項記載の組換えプ
ラスミド。 （９グルタチオン合成に関与する２種の酵素、γ−グル
タミルーＬ−システィン合成酵素および／またはグルタ
チオン合成酵素の遺伝子を取り込んだ組換えプラスミド
を有する大腸菌を培養し、培養物からグルタチオンを採
取するか、該大腸菌の菌体処理物をグルタミン酸、シス
ティン、グリシン、アデノシン−５−三リン酸およびマ
グネシウムイオンと接触せしめてグルタチオンを生成さ
せることを特徴とするグルタチオンの製造法。 （６）反応系にアデノシン−５′−三リン酸の再生系を
共役させることを特徴とする特許請求の範囲第（５）項
記載の製造法。 （７）アデノシン−５′−三リン酸の再生系がアセテー
トキナーゼ反応、カルバメートキナーゼ反応あるいはバ
クテリア、酵母の解糖反応系であることを特徴とする特
許請求の範囲第（６）項記載の製造法。 （８）菌体処理物が大腸菌の無細胞抽出液、細胞懸濁液
又は固定化された菌体、酵素であることを特徴とする特
許請求の範囲第（５）項記載の製造法１゜（９）ゲル状
担体に固定化することを特徴とする特許請求の範囲第（
８）項記載の製造法。
［の環状制限地図 ＜図中の数値はメガダルトン） ：ＲＣ９１２の染色体ＤＮＡ断片 ： Ｉ）ＢＲ３２２ Ｐ ： Ｐｓｔ ｌ Ｅ、： ＥｃＯＲＩ Ｂ
： Ｂ（Ｚｎ Ｈ７Ｓ ： Ｓａｌ Ｉ Ｍ：
Ｍｌｕ Ｉ Ｈ： Ｈｉｎ ｄ ＩＩＩＰ
ｖ ： Ｐ ｖ ｕ ｌ［ 第２図−組み換え体ＤＮＡ ｐＢＲ３２２−５’ｓｈＩ
の環状制限地図 ：ＲＣ９１２の染色体ＤＮＡ断片 ：ｐＢＲ３２２ （記号は第１図に同じ） 第３図−組み換え体ＤＮＡ ｐＢＲ３２２−５’ｓｈｌ
拳■の調製と環状制限地図 ：ＲＣ９１２の染色体ＤＮＡ断片（ｉｉ’ｓｈｌ［）同
゛ 上 （ｌｉ’ｓＪ）：ｐＢＲ３２
２ （記号は第１図に同じ） 第４図−組み換え体ＤＮ’ＡｐＢＲ３２５−ｆｓｈｌ争
ＩＩの調製と環状制限地図 ：ＲＣ９１２の染色体ＤＮＡ断片（ｓ’５ｈｎ）同
上 （ｆｓｈＩ）： Ｉ）ＢＲ３２２ ： ｐＢＲ３２５ （記号は第１図に同じ） 什 理 人 弁理士 途山俊− 第２図 第３図 コ ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ ｘ−ｎ 手紛補正書（自発） 昭和５８年２月１日 特許庁長官 若杉和夫殿 １、事件の表示 特願昭５７−１７０７２７ 号 ２ 発明の名称 遺伝子組換えで遣屹されるプラスミドおよび該グラスミ
ドによるグルタチオンの製造法 ３、伸圧をする者 事１１ｒとの関係 特許出願人 木 伺 光 ４、代理人 明細書 （１）・明細書１５頁、１行目、「リルアミドゲル、」
の次に１カラギーナンゲル、」を加入する。 （２）実施例８を追加する。 実施例 ８ 実施例５０表５に記載の林ＲＣ９１２／ｐＢ几３２５−
９ｓｈＩ・■及びＲＣ９１２株を実施例７と回し培地で
培養する。菌体を集菌後、生理食塩水で−ｒ９゛洗浄し
た後、生理食塩水１０１＋ｌＪ［ｐｌ濁Ｌ、；う７℃に
加温する。これに３１−のカラギーナン水溶液（３７℃
）２０ｔｕｌを加えて混合し、この混合液を２条塩化カ
リウム水溶液中にノズルから滴下させ直径約３ｒＭＩの
球状ゲルを調整する。この固定化菌体２，５りを実施例
７と同じ反応液５ ｍｌ中で３７℃にて伽とう反応させ
、経時的に生成したグルタチオンを定量した結果、表８
の如くであった（転換率はＬ−システィンからの転換率
を示す。）０又４時間反応後固宇化菌体をｐ別し、同じ
ノス、ｆｉＬ、、液で繰返し反応した場合の反応４時間
目Ｊ）グルタチオン生成給を定結した結果を表９に示す
。な」５反応液中のＡＴＰおよびアセチルリン酸の濃度
を棹々変化させてもほぼ同様の結果が得られた。 表８ 表 ９ 手続補正嘗（自弁） 昭和５８年１１月２５日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １、事件の表示 特願昭５７−１７０７２７ 号 λ 発明の名称 遺伝子組換えで造成されるプラスミドおよび該プラスミ
ドによるグルタチオンの製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 木 村 光 ４、代理人 明 細 書 ６、補正の内容 別紙のとおり 明細書を下記のとおり訂正します。 （１）明細１８９頁２行の「４．６ＭｄＪを［４，７Ｍ
ｄＪに改める。 （２ン 明１１１Ｗｘｔ頁１３行「易に行乙「える。 」の次に「（第３図参照）」を挿入し、同頁同行「同様
に、・・・・・・・・・」以下１７行の「（第３図参照
）。」まで削除する。 （’ｌ） 明細書１５頁７行の１５〜４０」を「１０
〜１００」に改める。 （４）明細書１５頁８行のＪ２０ｍＭＪを「８０ｍＭＪ
Ｋ改める。 （５）昭和５８年１月３１日付手続補正２頁９行の［ｏ
ｙＪを「２ＢｆＪに改める。 ２頁１４行〜１５行の「５℃にて５分間」を「２０℃で
ゲルが生成されるまで」に改める。 ３頁１行の「２．５ＴＲｔ」を［５ｆＪに改める０ （６〕 昭和５８年２月１日付手続補正書１頁７行の
「菌体を集菌後」の次Ｋｒ（湿重量１０２）」を挿入す
る。 以 上 手続補正書（自発） 昭和５８年１月３１日 特許庁長官 若杉和夫殿 １、事件の表示 ′ｌｖＩＭ昭５７−１７０７２７号 ２、発明の名称 遺伝子組換えで造成されるプラスミドおよび該プラスミ
ドによるグルタチオンの製造法 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 木 村 光 ４、代理人 （１１代理権を証する書面 （２１明細書６、補正
の内容 別紙のとおり （１１明細＃ｆＩ２頁、特！′Ｆ請求の範囲（８）に紗
【すて、次の（ＤＪ ’、 ００）を加入する。 （９） ゲル状担体に固定化することを特徴とする特
ｆｆ趙求の範囲第（８）項記載の製造法０（ｌＯ）ゲル
状担体がポリアクリルアミドゲルである鳴許請求の範囲
（９）項記載の製ｆ＋’ｊ法０（２）明細書７頁下から
２行目の［Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、） 。 ７．１５１３−１５１７ （１９７９）ｊを［Ａｃ１ｄ
Ｒｅｓ、）。 ７．１５１３−１５１７ （１９７９））ｊとｉＩ正す
る。 （８）明細書１１頁下から２行目のｌ’ ｐＢＩＬ３２
２−ｙｓｈ−ｆｌｊを［ｐＢＲ３２２−ｙｓｈ １１１
１１ ＪとＭＪ ｉＥする。 （４） 明細褐１６貴下から１行目の「および」を「
、（および）」と訂正する。 ｔ５） 明１１１１ ｔ’ｊ ２９頁４行目１７）ｒ
ｒｓｈｌＪ＆ｒ１３ｃｒ、ｍＨＩＪと訂正する０ （７）明細書３０頁、実施例６に続けて、次σ）実施例
７を追加する。 実施例 ７ 実施例５０表５に記載の株ＲＣ９１２／ｐＢＲ３２５−
ｆＳｈＩ・■をペプトン１．０チ、酵母エキス１．０％
。 肉エキス０５％、グルコースｌ、０チ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物０８０１％、リン＠１カリウム０．５チ、
クロラムフェニフール２０μ９ ／ ｖｓｌを含む培地
（ＰＨ７，０）１０００−に接種し、３０℃で２０時間
通気振とり培養する。菌体を集菌後、生理食塩水で一度
洗浄した後、生菌体１０７（湿重量）を３０％塩化カリ
ウム溶液１５ｍ／に懸濁し、これに３３．５％アクリル
アミドモノマー１３１ｄ％２０％Ｎ、Ｎ’−メチレンビ
スアクリルアミド２”Ｎ５．０チβ−ジメチルアミノプ
ロピオニトリル５プおよび６．５％過硫酸カリウム６ｍ
ｌを加え、５℃にて５分間放置する。ついでこの固定化
した菌を１辺２市の立方体に成型し、生理食塩水にて洗
浄することにより固定化エッシェリヒア・コリーＲＣ９
１２／ｐＢＲ３２５−＠５ｈＩ−１ｓｏ ｒを得る。
プラスミドを含有しないＲＣ９１２株についても同様の
方法で固定化菌体を調整した０ 調整した固定化菌体２．５ ＃ｌＡ！を８０ｍＭＬ−グ
ルタミン歯、２０ｍＭＬ−システィン、２０ｍＭ グリ
シン、２５ ｍＭｊＪ（化マグネシウム、２０ｍＭΔＴ
Ｐｓ２０ｍＭアセチルリ＞ｆｆＪ、２５ ｍＭ リ＞
ａＶカリウム緩衝液（ｐＨ７，０） を含む反応液５
ｍｌ中で３７℃で振とう反Ｊｌｌ；’：させ、経時的
に生成したグルタチオンを定ＪＡシた結果、下表の曲り
であった（転（すｉ率はＬ−システィンからの１１へ侠
率な承す）。 表 ７ 手 続 補 正 ＩＪ（方式）昭和５９年５月
２２日 特許庁長官 若杉和夫 殿 ！、＄件の表示 特願昭 ５７−１７０７２７ 号 ２・発明の名称 遺伝子組換えで造成されるプラスミドおよび該プラスミ
ドによるグルタチオンの暉向法３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 京都府京都市下京区若宮通り六条上ＪＶ±若宮町８０番
曲の２ 木 村 光 ４、代 理 人 〒 １０５ 東京都港区虎ノ門１丁目９−１０港電設ビ
ル 置 ５０８−０８７６ 昭和５９年 ５ 月１８日 （発送日）６、捕ＩＥのせ
象 昭和５８年１月３１日付押出の手続補正管の補正（別紙
） 明細書中「特許請求の範囲」の項の記載を次のとおり訂
正する。 「（１） グルタチオン合成に関与する２種の酵素、
γ−グルタミルーＬ−システィン合成酵素および／また
はグルタチオン合成酵素の遺伝子をエツシエリヒア・コ
リー（Ｅ、０ｏｌｉ）糸ベクターに組込んだ大腸菌にて
複製できる組換えプラスミド。 （２） プラスミドが７）ＢＲろ２２−ｔｙｓｈｎ
である特許請求の範囲第（１）項記載の組換えプラス
ミド。 （６） プラスミドがｐＢＲ３２２−ｔｉｓｈＩ−ｍ
である特許請求の範囲第（１）項記載の組換えプラスミ
ド。 （４） プラスミドがｐＢＲ３２５−ｔｙ ｓ ｈ
Ｉ・■である特許請求の範囲第（１）項記載の組換えプ
ラスミド。 （９グルタチオン合成に関与する２種の酵素、γ−グル
タミルーＬ−システィン合成酵素および／またはグルタ
チオン合成酵素の遺伝子を取り込んだ組換えプラスミド
を有する大腸菌を培養し、培養物からグルタチオンを採
取するか、該大腸菌の菌体処理物をグルタミン酸、シス
ティン、グリシン、アデノシン−５−三リン酸およびマ
グネシウムイオンと接触せしめてグルタチオンを生成さ
せることを特徴とするグルタチオンの製造法。 （６）反応系にアデノシン−５′−三リン酸の再生系を
共役させることを特徴とする特許請求の範囲第（５）項
記載の製造法。 （７）アデノシン−５′−三リン酸の再生系がアセテー
トキナーゼ反応、カルバメートキナーゼ反応あるいはバ
クテリア、酵母の解糖反応系であることを特徴とする特
許請求の範囲第（６）項記載の製造法。 （８）菌体処理物が大腸菌の無細胞抽出液、細胞懸濁液
又は固定化された菌体、酵素であることを特徴とする特
許請求の範囲第（５）項記載の製造法１゜（９）ゲル状
担体に固定化することを特徴とする特許請求の範囲第（
８）項記載の製造法。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） グルタチオン合成に関与する２種の酵素、γ
−クルタミルーし一システィン合成酵素および／・また
はグルタチオン合成酵素の遺伝子をエツシエリヒア・コ
リー（Ｂ、 Ｃ□Ｉ ｉ ）糸ベクターに組込んだ大腸
菌にて複１できる組換えプラスミド。 （２） プラスミドがｐＢＲ３２２−ｆｓＪ である
特許請求の範囲第（コ）項記載の紹換えプラスミド。 （３） プラスミドがｐＢＲ３２２〜Ｊｓｈｌ−７１
で庚る特許請求の範囲第（１）項記載の組換えグラスミ
ド０（駒 グラスミドがｐＢＲ−３２５−２ＳｈＩＩＩ
Ａである特許請求の範囲第（］）項記載の組換えグラス
ミド。 （５） グルタチオン合成に関与する２ ｍ ノ酵素
％γ−グルタミルーＬ−システィン合成酵素および／ま
たはグルタチオン合戊酵累の遺伝子を取り込んだ組換え
プラスミドを有する大腸菌を培養し１培養物からグルタ
チオンを採取するか、該大腸し、１の菌体処理物をグル
タミン酸、シスナイン、グリシン、アデノシン−５゛−
三リン酸およびマクネシウムイオンと接触せしめてグル
タチオンを生成させることを特徴とするグルタチオンの
製造法っ（６）反応系にアデノシン−５゛−三リン酸の
再生系を共役させることを特徴とする特許訂Ｉ求の範囲
第（５２項記載の＠分法。 （７） アデノシン−５°−三リン酸の（１）生糸が
アセテートキナーゼ反応、カルバメートキナーセ反応あ
るいはバクテリア２酵母のＭ糖反応糸であることな特徴
とする特許請求の範囲第（６）項記載の製佑法。 （８） 菌体処理物か大腸菌の無細ｊ抱抽出液、細胞
懸濁液又は固定化された菌体、酵素であることを特徴と
する特許請求の範囲第（５）項記載の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17072782A JPS59192088A (ja) | 1982-09-29 | 1982-09-29 | 遺伝子組換えで造成されるプラスミド |
| ES526050A ES526050A0 (es) | 1982-09-29 | 1983-09-28 | Un procedimiento para la produccion de glutation |
| DE8383305914T DE3379962D1 (en) | 1982-09-29 | 1983-09-29 | Hybrid plasmid and process for producing glutathione using said plasmid |
| EP83305914A EP0107400B1 (en) | 1982-09-29 | 1983-09-29 | Hybrid plasmid and process for producing glutathione using said plasmid |
| CA000438038A CA1220734A (en) | 1982-09-29 | 1983-09-29 | Hybrid plasmid and process for producing glutathione using said plasmid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17072782A JPS59192088A (ja) | 1982-09-29 | 1982-09-29 | 遺伝子組換えで造成されるプラスミド |
Related Child Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP1032584A Division JPH0231690A (ja) | 1989-02-13 | 1989-02-13 | 遺伝子組換えで造成されるプラスミドによるグルタチオンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59192088A true JPS59192088A (ja) | 1984-10-31 |
| JPH0142672B2 JPH0142672B2 (ja) | 1989-09-13 |
Family
ID=15910269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17072782A Granted JPS59192088A (ja) | 1982-09-29 | 1982-09-29 | 遺伝子組換えで造成されるプラスミド |
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|---|---|
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| JP (1) | JPS59192088A (ja) |
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| DE (1) | DE3379962D1 (ja) |
| ES (1) | ES526050A0 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS62163698A (ja) * | 1986-01-13 | 1987-07-20 | Kohjin Co Ltd | γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−α−アミノ−ｎ−ブチリルグリシンの製造方法 |
| JPH01228473A (ja) * | 1988-03-08 | 1989-09-12 | Hikari Kimura | 新規な組み換え体ｄｎａおよびグルタチオンの製造法 |
| JPH03219881A (ja) * | 1989-03-08 | 1991-09-27 | Kikkoman Corp | 新規な組み換え体ｄｎａ及び生理活性物質の製造法 |
| JPH08799U (ja) * | 1995-11-15 | 1996-05-17 | 松下電工株式会社 | 小形スイッチ |
Families Citing this family (4)
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|---|---|---|---|---|
| JPS6152299A (ja) * | 1984-08-21 | 1986-03-14 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 酵母によるグルタチオンの製造方法 |
| JPH0746994B2 (ja) * | 1984-10-04 | 1995-05-24 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| DE3724345A1 (de) * | 1987-07-23 | 1989-02-02 | Huels Chemische Werke Ag | Verfahren zur synthese von glutathion in hefen |
| CN101541827A (zh) | 2006-10-16 | 2009-09-23 | 协和发酵生化株式会社 | 谷胱甘肽的结晶及其制造方法 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPS5820188A (ja) * | 1981-07-30 | 1983-02-05 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 新規微生物及びそれを用いるグルタチオンの製造法 |
-
1982
- 1982-09-29 JP JP17072782A patent/JPS59192088A/ja active Granted
-
1983
- 1983-09-28 ES ES526050A patent/ES526050A0/es active Granted
- 1983-09-29 EP EP83305914A patent/EP0107400B1/en not_active Expired
- 1983-09-29 DE DE8383305914T patent/DE3379962D1/de not_active Expired
- 1983-09-29 CA CA000438038A patent/CA1220734A/en not_active Expired
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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| JP2710136B2 (ja) * | 1989-03-08 | 1998-02-10 | キッコーマン株式会社 | 新規な組み換え体ｄｎａ及び生理活性物質の製造法 |
| JPH08799U (ja) * | 1995-11-15 | 1996-05-17 | 松下電工株式会社 | 小形スイッチ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0107400B1 (en) | 1989-05-31 |
| ES8507180A1 (es) | 1985-08-16 |
| DE3379962D1 (en) | 1989-07-06 |
| JPH0142672B2 (ja) | 1989-09-13 |
| EP0107400A1 (en) | 1984-05-02 |
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| CA1220734A (en) | 1987-04-21 |
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