SE457961B - Foerfarande foer framstaellning av immobiliserad mikroorganism - Google Patents

Description

457 961 - 2 20 ZS 30 35 40 föreliggande uppfinning framgår. _ Enligt föreliggande uppfinning tillhandahålles ett förfa- rande för framställning av en immobiliserad mikroorganism som innefattar odling av en mikroorganism i en odlingslösning, be- handling av lösningen med glutaraldehyd när odlingen är full- bordad, tillvaratagande av míkrobiella celler från lösningen, blandning av de mikrobiella cellerna med en vattenhaltig lös- ning av en polysackaríd uppvisande 10 % (vikt/vikt) eller mer av sulfatgrupp i molekylen därav, och efterföljande gelníng av polysackariden i erhållen blandning för inneslutning av de mikrobiella cellerna inuti gelmatrisen av polysackariden.

Enligt föreliggande uppfinning kan vilka som helst mikro- organismer som uppvisar önskvärda enzymatiska aktiviteter an- vändas. Föredragna exempel på sådana mikroorganismer innefattar Escherichia coli ATCC 11303 (IAM 1268) uppvisande aspartas- aktivitet, Pseudomonas dacunhae IAM 1152 uppvisande L-aspartat- -ß-dekarboxylas-aktivitet och liknande.

Såsom odlingslösningen kan vilken som helst konventionell 1ösning,som lämpar sig för odling av mikroorganismer användas, såsom ovannämnda och den kan innehålla lämpliga mängder av kon- ventionella beståndsdelar, såsom kolkällor, kvävekällor, orga- niska näringsämnen, oorganiska material och liknande.

Exempel på polysackarider uppvisande 10 % (vikt/vikt) eller mer av sulfatgrupp i molekylen därav som användes enligt före- liggande uppfinning innefattar karragen, furcellaran, sulfat och liknandeJan-agen är en cellulosa- polysackarid uppvisande 20-30 procent (vikt/vikt) av sulfatgrupp som erhållits genom rafinne- ring av ett extrakt av sjögräs av Rhodophyceae, såsom Gigartinaceae och Solíevianceae. Enligt föreliggande uppfinning kan kommersiellt tillgänglig karragen användas, exempelvis "GENU GEL WG", "GENU GEL CWG" och "GENU VISCO" (detta är varu- märken för karragen tillverkat av Kopenhagen Pectin Factory Ltd.). Furcellaran är en polysackarid uppvisande 12-16 % (vikt/vikt) av sulfatgrupper, som erhållits genom extraktion av en typ av sjögräs av Rhodophyceae, dvs Furcellaria fastigiota och furcellaran tillverkat av Litex Co., Danmark, kan exempel- vis användas. Ett exempel på cellulosasulfat "KELCO SCS", till- ' w verkas av Kelco Co.

Vid genomförande av förfarandet enligt föreliggande upp- fínning odlas först mikroorganismen i odlingslösningen. Odling 10 15 20 25 30 35 40 457 961 är ej~bÉgfänsad till en speciell sådan och kan genomföras enligt ett känt förfarande. När odlingen är fullbordad kan eventuellt enzymatísk aktivitet för ett sídoreaktíonssystem av mikroorganismen avlägsnas genom ett känt förfarande före nästa steg avseende behandling med glutaraldehyd.

Därefter behandlas odlingslösningen efter fullbordad od- ling med glutaraldehyd. Denna behandling kan lätt genomföras genom blandning av glutaraldehyd med odlíngslösningen under omröring eller skakning. Företrädesvis är mängden glutaralde- hyd som tillsättes sådan att slutkoncentrationen därav i od- lingslösningen är 0,1 mM till 0,5 M, speciellt då 1 mM till 0,1 M. Företrädesvis genomföres denna glutaraldehydbehandling vid 0-60°C, och speciellt vid 0-40°C. Tiden som fordras för denna behandling beror på temperaturen men vanligen föredrages att behandlingen åstadkommes under 1 minut till 24 timmar, speciellt under 5 minuter till 5 timmar. Efter behandling med glutaraldehyd uppsamlas mikrobiella celler, exempelvis genom centrifugering av odlingslösningen.

De mikrobiella cellerna som erhållits sålunda blandas med en vattenhaltig lösning av polysackariden uppvisande 10 % (vikt/vikt) eller mer av sulfatgrupp i molekylen därav (betecknas hädan- efter helt enkelt polysackarid). Den vattenhaltiga lösningen av polysackariden kan lätt framställas genom blandning av poly- sackariden med vatten vid 30-100°C. Koncentrationen av poly- sackariden i lösningen är företrädesvis 0,2-20 % (vikt/vikt), och speciellt då 1-10 %(vikt/vikt). Den vattenhaltíga lösningen av polysackariden som erhållits sålunda blandas med ovanstående mikrobiella celler för framställning av en blandning. Vid fram- ställning av blandningen uppslammas företrädesvis de mikrobiella cellerna i vatten, en fysiologisk saltlösning eller en lämplig buffertlösning (pH 3-10, och företrädesvis pH 4-8) och därefter blandas erhállen suspension med den vattenhaltiga lösningen av polysackariden värmd till 30-60°C.

Nästa steg innefattar gelníng av polysackariden i bland- ningen för instängning av de mikrobiella cellerna inuti gel- matrisen av polysackariden. Gelningen av polysackariden kan lätt genomföras genom kylning av blandningen. Exempelvis gelas polysackariden när blandningen får stå vid cirka 0-ZOOC under cirka 1 minut till 5 timmar och samtidigt innesluts de mikro- biella cellerna inuti erhållen gelmatris av polysackariden. 457 961 i' 10 15 20 25 30 35 40 Sålundà_erhållen gel kan formas till olika former.

Dessutom kan ovanstående gelning också genomföras med ett annat förfarande än kylning av blandningen. Exempelvis kan gelningen genomföras genom att blandningen bríngas i kontakt med ammoníumjon eller en metalljon uppvisande en atomvíkt av 24 eller mer (exempelvis kaliumjon, magnesiumjon, kalciumjon, etc), att blandningen bringas i kontakt med en förening uppvi- sande två eller flera basíska funktionella grupper i molekylen därav (t.ex. metylendiamin, etylendíamin, p-fenylendiamin, etc) eller att blandningen bringas i kontakt med ett med vatten blandbart organiskt lösningsmedel(t.ex. aceton, metanol, etanol, propanol, dioxan, tetrahydrofuran, etc).

Den immobiliserade mikroorganismen som framställts med förfarandetenligt föreliggande uppfinning kan användas i olika enzymatiska reaktioner enligt ett känt förfarande.

I jämförelse med förfarandet som beskrives i ovannämnda amerikanska patentskrift 4 138 292 varvid glutaraldehydbehand- lingen åstadkommas efter inneslutningen av mikrobiella celler i gelen uppvisar förfarandet enligt föreliggande uppfinning, varvid glutaraldehydbehandlingen åstadkommes i odlíngslösningen efter fullbordad odling följande fördelar. ' Eftersom glutaraldehydbehandlingen i förfarandet enligt ovannämnda kända förfarande âstadkommes efter inneslutningen i gelen är det troligt att formbibehållande av gelen försämras och att det är svårt att åstadkomma behandlingen homogent.

Eftersom glutaraldehydbehandlingen däremot enligt förfarandet enligt föreliggande uppfínning.àstadkommes i odlingslösningen efter fullbordad odling undanröjes ovanstående svårigheter i förfarandet enligt teknikens ståndpunkt och behandlingen kan åstadkommas homogent med en mycket enkel operation. Enligt för- farandet enligt föreliggande uppfinning kan vidare en immobi- liserad mikroorganism uppvisande högre enzymatisk aktivitet än vad som framställes med förfarandet enligt teknikens ståndpunkt erhållas, I jämförelse med den immobílíserade mikroorganismen som erhålles med förfarandet enligt teknikens ståndpunkt bibe- håller vidare den immobiliserade mikroorganismen, erhàllen med förfarandet enligt föreliggande uppfinning, högre enzymatisk aktivitet under en längre tidsperiod i en kontinuerlig enzyme- tisk reaktion.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning är följaktligen S Exempel 1. 10 15 20 25 30 35 40 457 961 ett utmdrkt'industriellt förfarande för framställning av immobiliserade mikroorganismer.

Följande exempel och experiment belyser föreliggande upp- finning ytterligare men begränsar ej dess omfång. 100-ml portioner av en odlingslösning (pH 7,0) innehållande majsstöpvätska (2,0 %), "meast" (2 %), fumar- syra (1,14 %), diammoniumfumarat (0,5 %), kaliumdivätefosfat (0,2 %) och magnesiumsulfat (0,05 %) fördelades i tio S00-ml Sakaguchi-kolvar. Escherichia coli ATCC 11303 (IAM 1268) ym- pades i varje kolv. Kolvarna inkuberades under skakning vid so°c under 16 timmer och kyides därefter till s°c för fuiiber- dande av odlingen. 25-procentig vattenhaltig lösning av glutar- aldehyd (2 ml) sattes till varje kolv så att slutkoncentratio- nen av glutaraldehyd var 5 mM och kolvarna skakades under 30 minuter. Mikrobiella celler (23 g, våt vikt) av Escherichia coli ATCC 11303 uppsamlades genom centrifugering av odlings- lösningen.

Separat löstes GENU GEL WG (karragen tillverkat av Kopenhagen Pectin Factory Ltd., 6 g)'i varmt vatten (129 ml) vid 45°C för framställning av en vattenhaltig lösning av karragen.

En uppslamning av ovanstående míkrobiella celler (23 g) i en fysiologisk saltlösning (23 ml) blandades med karragen- lösningen vid 40°C och erhållen blandning fick stå vid 4°C under 30 minuter för gelning av karragen. Erhållen gel forma- des till kubform uppvisande cirka 3-mm sidor. Gelen doppades i en substratlösning (400 ml) innehållande 1-M diammonium- fumarat, fick stå vid 37°C under 48 timmar och tvättades där- efter med 2-procentig vattenhaltig lösning av kaliumklorid för erhållande av en immobiliserad Escherichia coli-beredning (180 g, våt vikt). Den immobiliserade beredningen som erhållits sålunda uppvisade aspartasaktivitet av 48 680 Pmol/h, g celler.

Exempel 2. 120~ml portioner av en odlingslösning (pH 7,3) innehållande natriumglutamat (3,2 %), "meast" (0,5 %), kalium- divätefosfat (0,05 %) och magnesiumsulfat (0,01 %) fördelades i tio 500-ml Sakaguchi-kolvar. Pseudomonas dacunhae IAM 1152 ympades i varje kolv. Kolvarna inkuberades under skakning vid 30°C under 24 timmar. Efter fullbordad odling sattes ättiksyra (26 ml) till kolven för justering av pH till 4,75 och kolven fick stå vid 30°C under 1 timme. Till kolven sattes 3-N 1-1 457 961 ° 10 15 20 ZS 30 35 40 natriumhydrbxid (86 ml) för justering av pH till 6,0 och kolven" kyldes till 10°C. 25-procentig vattenhaltig lösning av glutar- aldehyd (2,6 ml) sattes till kolven så att slutkoncentrationen av glutaraldehyd var 5 mM och kolven skakades under 30 minuter.

Mikrobiella celler (20 g, våt vikt) av Pseudomonas dacunhae IAM 1152 uppsamlades genom centrifugering av odlingslösningen.

Separat löstes GENU GEL WG (karragen tillverkat av Kopenhagen Pectin Factory Ltd., 4,03 g) i varmt vatten (85 ml) vid SOOC för framställning av en vattenhaltig lösning av karragen.

En suspension av ovanstående mikrobiella celler (20 g) i en fysiologisk saltlösning (20 ml) blandades med karragen- lösningen vid 45°C och erhållen blandning fick stå vid 4°C under 30 minuter för gelning av karragen. Erhållen gel formades till kubform uppvisande cirka 3-mm sidor. Gelen tvättades med Z-procentig vattenhaltig lösning av kalíumklorid för erhållande av immobiliserad Pseudomonas dacunhae IAN 1152-beredning (130 g, våt vikt). Den sålunda erhållna immobíliserade bered- ningen uppvisade L-aspartat-Ö-dekarboxylas-aktivitet av 9050 Pmol/h, g-celler.

Experiment 1 Flera försök med följande kontinuerliga enzymatiska reak- tion genomfördes med användning av den ímmobiliserade bered- ningen av Escheríchia coli uppvisande aspartas-aktivitet fram- ställd i exempel 1 (den immobiliserade mikroorganismen enligt föreliggande uppfinning, betecknas hädanefter beredning A),.en immobiliserad Escherichia coliqberedning erhållen utan någon glutaraldehydbehandling (en immobiliserad kontroll-mikroorga- nism, betecknas hädanefter beredning B) och en immobiliserad Escheríchía coli-beredning erhállen genom åstadkommande av glutaraldehydbehandlingen efter inneslutningen av mikrobiella celler i gel (en immobiliserad kontroll-mikroorganísm, beteck- nas hädanefter beredning C) för åskådlíggörande av stabiliteten av den enzymatiska aktiviteten och bildningen av L-aspara syra av varje beredning. gin- Beredningar B och C som användes såsom kontroller fram- ställdes på följande sätt: Beredning B Denna beredning framställdes på samma sätt som beskrivits i exempel 1 förutom att behandlingen med glutaraldehyd ej genom- 10 15 20 ZS 457 961 fördes: _ Beredning C Denna beredning framställdes genom uppslamning av ovan- stående beredning B (10 g, våt vikt) i 2-procentig vattenhal- tig lösning av kaliumklorid (100 ml) innehållande S-mM glutar- aldehyd, skakning av suspensionen vid SOC under 15 minuter och efterföljande tvättning med 2-procentig vattenhaltig lösning av kaliumklorid.

Kontinuerlig enzymatisk reaktion Varje immobiliserad Escherichia coli-beredning (4 g) pac- kades i en mantelförsedd kolonn (1,6-cm innerdiameter och 10,5-cm längd) och 1-M vattenhaltig lösning av ammoniumfumarat innehållande 10-3 M magnesiumklorid (pH för lösningen justera- des till 8,5 medelst ammoniak) fick kontinuerligt passera genom kolonnen vid 37°C med en flödeshastighet av 40 ml/h. Eluatet från kolonnen tillvaratogs med intervaller och halveringstiden för aspartas-aktiviteten (dagar som fordras för att den enzyma- tiska aktiviteten skall reduceras till 50 % av den initiella aktiviteten) och L-asparaginsyrabildningen genom den immobili- serade beredningen bestämdes genom mätning av mängden av L-aspar- ginsyra i eluatet. Den kvantitativa mätningen av L-asparagín- syra genomfördes medelst ett biotest med användning av Leuconostoc mesenteroides P-60.

Resultat Resultaten anges i tabell 1. Som framgår av tabell 1 bibe- håller beredning A (den immobilíserade mikroorganismen enligt föreliggande uppfinning) högre'enzymatisk aktivitet och uppvíf sar utmärkt L~asparginsyrabildning i jämförelse med beredning- arna B och C. 457 961 f * -'~- Taben 1 I Kontinuerlig Aspartasaktivítet operations- Qnmol L-asparaeínsyra/h/g celler) ïâššâí) Beredning A Beredning B Beredning C 1 48 680 56 340 37 460 10 48 ooo 51 100 i 36 400 _ 20 47 360 46 030 35 410 30 45 100 41 860 34 260 40 43 880 37 900 33 290 S0 42 730 34 450 32 480 80 38 910 25 S30 29 710 100 36 700 20 910 28 110 150 32 830 12 760 23 900 200 27 940 - 7 730 21 070 250 24 300 4 750 18 120 Halveríngs- ' 250 70 240 aktivitet (dagar) L- asparagín-* , svra-bi1d- 309 100 228 ning *: L-aspargínsyra-bildningen uttryckas såsom det relativa värdet av den totala mängden av L-asparaginsyra som bildas inom halveringstiden för den enzymatiska akti- viteten genom att mängden som erhålles genom använd- ning av beredning B sättes till 100.

Experiment 2 Flera försök med följande kontinuerliga enzymatiska reak- tion genomfördes med användning av den immobilíserade bered- ningen av Pseudomonas dacunhae IAM 1152 uppvisande L-aspartas- -ß-dekarboxylas-aktivitet (den ímmobílíserade míkroorganismen enligt föreliggande uppfinning, hädanefter betecknad bered- ning D), en ímmobilíserad Pseudomonas dacunhae IAM 11SZ-bered- ning erhållen utan någon glutaraldehydbehandlíng (en immobíli- serad kontroll-mikroorganísm, hädanefter betecknad beredning E) och en immobiliserad Pseudomonas dacunahe IAM 1152-beredning erhållen genom åstadkommande av glutaraldehyd-behandling efter inneslutning i gelen av míkrobíella celler (en ímmobiliserad 10 15 nå; 10 15 20 25 30 35 ” 457 961 kontrollmíkroorganism, hädanefter betecknad beredning F) för undersökning av stabiliteten av den enzymatiska aktiviteten och L-alaninbíldningen för varje beredning.

Beredningarna E och F som användes såsom kontroller fram- ställdes på följande sätt: Beredning E Denna beredning framställdes på samma sätt som beskrivits i exempel 2 förutom att behandlingen av glutaraldehyd ej genom- fördes.

Beredning F Denna beredning framställdes genom tillsats av 0,2-M fos- fatbuffertlösning (pH 7, 20 ml) innehållande 1,67-M L-lysín- hydroklorid till ovanstående beredning E (10 g, våt vikt), att erhanen blandning får sta vid 1o°c i w minuter, nu en 25-procentig vattenhaltig lösning av glutaraldehyd (13,3 ml) sattes därcni, nu binndningen får Std vid 1o°c under 10 minn- ter och att det hela därefter tvättas med 2-procentig vatten- haltig lösning av kaliumklorid. ' Kontinuerlig enzymatisk reaktion Varje immobiliserad Pseudomonas dacunhae IAM 1152-bered- ning (4 g) packades i en mantelförsedd kolonn (1,6-cm diameter och 10,5-cm längd) och en 1-M vattenhaltig lösning av ammonium- -L-aspartat innehållande 10-4-M pyridoxalfosfat (pH för lös- ningen justerades till 5,5 medelst ammoniak) bringades konti- nuerligt att passera genom kolonnen vid 37°C med en flödeshas- tighet av 18 ml/h. Eluatet från kolonnen tíllvaratogs med inter- valler och halveringstiden för-L-aspartat-ß-dekarboxylasaktiví- teten (dagar) och L-alanin-bildningen av den immobiliserade beredningen bestämdes genom mätning av mängden av L-alanin i eluatet. Den kvantitativa mätningen av L-alanin genomfördes medelst biotest med användning av Leuconostoc citrovorum ATCC 8081.

Resultat Resultaten anges i tabell 2. Såsom framgår av tabell 2 bibehåller beredning D (den immobiliserade mikroorganismen enligt föreliggande uppfinning) högre enzymatisk aktivitet och uppvisar utmärkt L-alanin-bildning i jämförelse med bered- ningarna E och F 457 961 [O ' Tabell z Kontinuerlig L-aspartat-0-dekarboxylas-aktivitet operations- -mol L-a1anín/h/ celler) period re 1ng re lng - Berednlng F (dagar) 1 9 050 9 050 4 680 10 8 910 5 S20 4 550 20 8 320 3 330 4 400 30 8 000 2 080 4 240 40 7 530 1 210 4 120 S0 6 910 750 4 110 70 7 S30 280 3 750 100 6 910 - 3 390 150 6 090 3 - 2 910 200 5 350 - 2 470 250 4 610 - 2 190 300 4 140 - 1 860 350 3 eso 7 1 soo Halverings- tkíför L-aspartat1ß- dekarboxylas- 270 3 14 225 aktivitet (dagar) L-alanin-* 1 929 100 831 bildning *: L-alanín-bildningen uttryckes såsom det relativa värdet av den totala mängden av L-alanín bildat inom halveringstiden för den enzymatiska aktiviteten genom att mängden erhållen genom användning av beredning E sättes till 100.

Claims (6)

110. ,, 457 961 Patentkrav

1. Förfarande för framställning av en immobiliserad mikró- organism, k ä n n e t e c k n a t därav, att en mikroorganism odlas i en odlingslösning, att lösningen behandlas med glutars. aldehyd efter det att odlingen är fullbordad, att mikrobiella celler uppsamlas fran lösningen, att de mikrobiella cellerna blandas med en vattenhaltíg lösning av en polysackarid uppvi- sande 10 % (vikt/vikt) eller mer av sulfatgrupp i molekylen därav och att polysackariden i erhållen blandning gelas för inneslutning av de mikrobiella cellerna inuti en gelmatris av polysackariden.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att mikroorganismen utgöres av Escherichia coli uppvi- sande aspartas-aktivítet eller att Pseudomonas dacunhae uppvi- sande L-aspartat-ß-dekarboxylas.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att polysackariden utgöres av karragen, furcellaran eller cellulosasulfat. I

4. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att behandlingen med glütaraldehyd genomföres genøm blandning av glutaraldehyd med lösningen under omröríng eller skakning i en sådan mängd att slutkoncentratíonen av glutar- aldehydlösningen är 0,1 mM till 0,5 M.

5. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att den vattenhaltiga lösningen av polysackaríden inne- håller 0,2-20 % (vikt/vikt) av pølysackariden.

6. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att de mikrobiella cellerna uppslammas i vatten, en fysiologisk saltlösning eller en buffertlösníng av pH 3-10 och att därefter erhållen suspension blandas med den vatten- haltiga lösningen av polysackariden vid 30-60°C.