JPS623792A - Ｌ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規微生物を利用するＬ−アミノ酸の製造方法
に関する。

なお、本発明において、特に断わらない限り５置換ヒダ
ントイン及びＮ−カルバモイルアミノ酸なる化合物基は
、各々０体、Ｌ体、ＤＬ体の総称を意味する。

〔従来の技術及び問題点〕

従来、ＤＬ−５置換ヒダントイン類を酵素的にＬ−アミ
ノ酸に転換する方法については、特公昭４２−１３８５
０号以降多くの特許出願がなされており、特に芳香族ア
ミノ酸の製造方法としては、フラボバクテリウム　アミ
ノゲネス（Ｆｌａｖｏｂａｃ−ｔｅｒｉｕｒｎ　ａｍｉ
ｎｏｇｅｎｅｓ　）　Ｆ　ＥＲＭ　−３１３３及びその
変異株ＦＥＲＭ−３１３４、ＦＥＲＭ−３１３５を５置
換ヒダントインに作用させる方法が知られている。

ｔ＊、Ｌ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸を酵素的にＬ−ア
ミノ酸に転換する方法としては、Ｌ−又ハＤ　Ｌ　−Ｎ
−カルバモイルメチオニンにコリネバクテリウムセペド
ニカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｅｐｅｄｏ
ｎｉｃａｍ　）　Ｉ　Ｆ　Ｏ３３０６等を作用させて、
含まれるＬ−Ｎ−カルバモイルメチオニンをＬ−メテオ
ニンに転換する方法が知られている（特公昭５５−２９
６７８号）。しかし、この方法によって転丸することが
できるのは５体のみであって９体をＬ−メチオニンに転
換することはできない。

更にまた、従来の酵素法によるし一アミノ酸の製造法で
は、５置換ヒダントインを原料とする場合とＮ−カルバ
モイルアミノ酸を原料とする場合とでは、各々側塊の微
生物を使用する必要があり、５置換ヒダントインとＮ−
カルバモイルアミノ酸の両方に作用し、対応するそれぞ
れのＬ−アミノ酸に転換しうる微生物は見出されていな
かった。

従って、ＤＬ−５置換ヒダントイン類を原料とする場合
には、その原料の製造の際に副生じたＤＬ−Ｎ−カルバ
モイルアミノ酸を除去する必要が６す、またＤＬ−Ｎ−
カルバモイルアミノ酸を原料とする場合にはＤ−Ｎ−カ
ルバモイルアミノ酸が反応系に混入するのを防止する措
置又は反応終了後残存するＤ−Ｎ−力ルバモイルアミノ
酸を分取、ラセミ化するための煩雑な工程を採らざるを
得なかった。更に、ＤＬ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸を
水浴性塩として用いれば反応液濃度を高くできるため反
応を有利に行ない得るはずであるが、Ｄ−Ｎ−カルバモ
イルアミノ酸に作用してＬーアミノ酸に転換し得る微生
物がなく操作の単純化は不可能であった。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、５置換−ヒダントイン類の微生物による
分解機作について研究中、発明者らが土壌中より新たに
分離した微生物がヒダントイン化合物を開裂し、アミノ
酸を生成する際にＬ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸とＤ−
Ｎ−カルバモイルアミノ酸を生成すること、そして遂次
的に生成してくるアミノ酸が５体であることをも発見し
た。本発明は、この新知見に基き５置換ヒダントイン及
びＮ−カルバモイルアミノ酸からＬ−アミノ酸を簡易か
つ高収率で製造する方法を完成するに至ったものである
。

すなわち本発明は、アルスロバクター （　Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）属に属し５置換ヒダ
ントイン及びＮ−カルバモイルアミノ酸をＬ−アミノ酸
に転換する能力を有する微生物又はその変異株の培譬物
を、次式（Ｔ）及び（旧、 ■ （１）　　　　　　　　　　　ｏ　　　（ＩＩ）Ｃ式中
、ＲはＮ−カルバモイルアミノ酸残基又はヒダントイン
残基を示す） で表わされるＮ−カルバモイルアミノ酸又は／及び５置
換ヒダントインに作用させることを特徴とする次式（Ｉ
ＩＩ）、 Ｒ　−　ＣＨＣＯＯＨ Ｈ２ （［［） （式中、Ｒは前記と同じ） で表わされるＬ−アミノ酸の製造方法である。

本発明において使用される微生物は、アルスロバクタ−
属に属し、５置換ヒダントイン及びＮ−カルバモイルア
ミノ酸をＬ−アミノ酸に転換する能力を有するものであ
れば特に制限されず、その変異株であってもよく、その
代表的なものとしては、本発明者らが土壌中より新たに
分離した微生物で、次の菌学的性質を有するアルスロバ
クタ−エスピー（　Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．
　）　Ｄ　Ｐ　−　Ｂ　−　１　０　０　１（微工研菌
寄第８１９０号）及びこれより誘導された変異株である
アルスロバクタ−　エスピーＤＰ−Ｂ−１　００２　（
微工研菌寄第８１９１号）が挙げられる。

以上の結果から、ＤＰ−Ｂ−１００１株及びＤＰ−Ｂ−
，１００２株の菌学的諸性質の特徴として・α）ダラム
染色性が微陽性であり、培養の経過とともに変化し、形
態的にも特徴ある多形性を示すこと、（２）胞子をつく
らないこと、（３）細胞壁の塩基性アミノ酸がリジンで
あること等が挙げられる。

コレらの性質を基準にしてバーシーズ・マニュアルーオ
ブ・デターミネーティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｌｖｅＢａｃｔｅｒｌｏｌｏｇｙ　）第８版にて検索す
ると、ＤＰ−Ｂ−１００１株及びＤＰ−Ｂ−１００２株
はアルスロバクタ−属に属する細菌であると判断される
。

しかし、アルスロバクタ−属に含まれる稲について、更
に検索を行なってもＤＰ−Ｂ−１００１株及びＤＰ−Ｂ
−１００２株と一致する菌種の記載を見出せない。

バーシーズ・マニュアル・オブ・デタミネーテイブ・バ
クテリオロジー第８版の記載によると、アルスロバクタ
−属に属する微生物は、ビタミン要求性等によシフ種に
分類されている。ＤＰ−Ｂ−１００１株及びＤＰ−Ｂ−
１００２株はビオチンのみを要求している点はアルスロ
バクタ−グロビフオルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　）Ｋ一致しているが、ＤＮ
ＡのＧＣ含量が５９．３％でアリアルスロバクタ−グロ
ビフオルミスの６０〜６４．４％の範囲になく明らかに
相違する。更に１ＤＰ−Ｂ−１００１株が５置換ヒダン
トインとＮ−カルバモイルアミノ酸の両方に作用して対
応するそれぞれのし一アミノ酸に転換する能力も本発明
の微生物の特徴である。

そこで、本発明者らはＤＰ−Ｂ−１００１株及びｐｐ−
ｎ−ｘｏｏ２株をアルスロバクタ−属罠属する新菌種と
認め、それぞれアルスロバクタ−エスピー　ＤＰ−Ｂ−
１００１及び同ＤＰ−Ｂ−１００２と命名し、前記した
如く工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。

本発明で酵素源として使用される培養物は、炭素源、窒
素源、無機塩類を含有する通常の培地において上記の微
生物を培養することにより得ることができる。

炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、シ
ュークロース、マルトース等ｏ１１；りｌＪセリン、マ
ンニット等の糖アルコール；フマル酸、クエン酸等の有
機酸が適宜使用できる。窒素源としてハ、肉エキス、酵
母エキス、ポリペプトン、コーンステイープリカー等の
天然有機窒素源の他、塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニア源及びフ
マル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸
のアンモニウム塩を使用することができる。また、無機
塩類としては、リン酸−ナトリウム、リン酸−カリウム
、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、
硫酸第一鉄、硫酸マンガン等が使用できる。さらに酢酸
コバルトなどの有機塩類も適宜使用することができる。

なお、ＤＰ−Ｂ−１００１’株についてはＤＩ、−５−
インドリルメチルヒダントインを培地Ｋ　Ｏ，０５〜０
．２重量％添加することで、さらに高い活性を得ること
ができる。

培養は、常法に従って実施することができ、例えば培地
のｐＨは５〜９、好ましくは６〜８．５の範囲に調節し
、菌株を接種した後、約２０〜３５℃、好ましくは２６
〜３０℃の範囲で通気攪拌下、１６〜７２時間培養する
方法が採用される０斯くして得られた培養物は、そのま
ま酵素源として用いることができるが、培＊ｉ、粗酵素
標品１精製酵素標品は勿論、該培養液から採取した菌体
又は例えば凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体破砕
物゛、洗浄菌体等の該菌体の処理物等の形態で使用する
こともできる。更に菌体あるいは菌体処理物を例えばポ
リアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、カラギーナ
ン、光架橋樹脂等に公知の方法により固定化して用いる
こともできる。

また、Ｎ−カルバモイルアミノＬｌｌ（１）及び／又は
５ｅ換ヒダントイン（ＩＩ）を対応するＬ−アミノ酸（
Ｉｎ）に転換する反応は、これらの化合物と上記培養物
とを水性媒体中に共存せしめることにより実施される。

Ｎ−カルバモイルアミノ酸（１）及び５置換ヒダントイ
ン（ｎ）は、それぞれ０体、５体、ＤＬ体のいずれであ
っても対応するＬ−アミノ酸（ＩＩＩ）に転換すること
ができる。従って、本発明方法によってＬ−アミノ酸（
Ｉｌｌ）を製造するための原料化合物としては、Ｎ−カ
ルバモイルアミノ酸（Ｉ）又は５置換ヒダントイン（Ｉ
ｆ）の０体、５体、ＤＬ体あるいはこれらの任意の組合
せからなる混合物が使用できる。なお、Ｎ−カルバモイ
ルアミノｌ！Ｒ（１）はそのナトリウム塩等の水溶性塩
の形で反応に供することもできる。

前記一般式（１）及び（ＩＩ）においてＲで示されるＮ
−カルバモイルアミノ酸残基又はヒダントイン残基とし
ては、特に制限はなく、その代表的なものとしては、例
えばベンジル基、３−メトキシ−４−ヒドロキシベンジ
ル基、４−ヒドロキシベンジル基、インドリルメチル基
、メチルメルカプトエチル基、インプロピル基、インブ
チル基等が挙げられる。

反応はｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ６，５〜９．５の
範囲で行なうのが好適である。ｐＨの調整は、リン酸緩
衝液、アンモニウム緩衝液等の通常使用されている緩衝
液が使用できる。反応温度は１０〜５０℃、好ましくは
３０〜４０℃の範囲に調節するのが好適である。

なお、反応液に鉄、マンガン、コバルト等の無機イオン
又は亜硫酸す）　１７ウム等の還元性物質を添加、ある
いは窒素ガスの吹き込みを行なうと、反応速度が増大な
いしは培養物の酵素活性を安定化することができ好まし
い結果を与える。また、菌体の反応液からの回収、反応
への再使用が可能になる。無機イオンは０．１〜１０ｍ
Ｍになるように添加するのが好ましい。

また、反応液に加えられる５置換ヒダントインの量はそ
の溶解度以上であっても、不溶分は反応進行に伴ない溶
解し遂次Ｌ−アミノ酸に転換されてゆくため反応に支障
は生じない。更にまた、Ｎ−カルバモイルアミノ酸は水
溶性塩の形で添加できるため、原料濃度を高く保つこと
ができる。従って、固定化菌体をカラムに充填した反応
器に原料溶液を流下させる方法により反応を行なう場合
、５置換ヒダントインのみではなく、Ｎ−カルバモイル
アミノ酸の水溶性塩を原料として使用できるため、殺菌
操作を行なう場合も含め操作を容易かつ高濃度で効率よ
く行なうことができる。

かくして反応は数時間〜８０時間程度で終了し、反応に
供した５置裸ヒダントイン及びＮ−カルノぐモイルアミ
ノ酸は完全にＬ−アミノ酸に転換され、反応液中に蓄積
される。生成したＬ−アミノ酸は通常の結晶化法、イオ
ン交換樹脂法その他公知の方法を適宜使用することによ
り、容易に分離精製することができる。特に、高濃度で
反応を行なった場合には、反応液の冷却、ｐＨ調整によ
ってＬ−アミノ酸を容易に結晶として得ることができる
。

なお、後記実施例において、得られたアミノ酸が目的と
するし一アミノ酸−であることは、ロイコノストックメ
ゼンテロイデスを用いたバイオアッセイ法及び高速液体
クロマトグラフィー、アミノ酸分析計を用いて確認した
。

〔作用〕

本発明において使用されるアルスロバクタ−属に属する
新規微生物は、５置換ヒダントインを開裂しＬ−アミノ
酸を生成する能力、かつ、Ｎ−カルバモイルアミノ酸か
らＬ−アミノ酸を生成する能力を有する。そして、この
能力は５ｆｔ換ヒダントイン及びＮ−カルバモイルアミ
ノ酸のそれぞれが９体、５体、ＤＬ体のいずれを問わず
発揮される。

〔発明の効果〕

本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、 （１）従来、適当な微生物がなく使用し得なかったＤ−
Ｎ−カルバモイルアミノ酸をも対応するＬ−アミノ酸製
造の出発原料にできる。

（２）化学的に５置換ヒダントインを製造する際に副生
ずるＤＬ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸を反応系から除去
する必要がないため、工業的に容易かつ安価に得られる
ＤＬ−５置換ヒダントインとＤＬ−Ｎ−カルバモイルア
ミノ酸の混合物から一段の反応で定量的にＬ−アミノ酸
を製造することができる。それ故、従来のＤＬ−５置換
ヒダントイン類を出発原料にするＬ−アミノ酸製造工程
に必要であったＤＬ−５ｉ換ヒダントインへのＤ−Ｎ−
カルバモイルアミノ酸の混入を防止する措置及び反応終
了後残存するＤ−Ｎ−カルバモイルアミノ収を分取、ラ
セミ化するための煩雑な工程が全く不要となシ、製造工
程が極めて単純化されると共に目的とするＬ−−アミノ
酸を高収率で製造できるようになった。

（３）ＤＬ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸の水溶性塩を原
料として固定化菌体カラムを用いて反応を行ない得るの
で、製造工程の連続化が容易でちる。

（滲　　アルスロバクタ−エスピー　ＤＰ−Ｂ−１００
２株は活性が高いので、菌体活性を窩めるための活性の
インデューサーとなる物質を培養液に添加する必要が全
く不要な変異株であるため、これを用いた本発明方法は
従来法に比べ培養コストを大幅に低減し得ると共に培養
管理を簡略化でき工業的に非常に有利である。

等、種々の利点を有する。

〔実施例〕

次に参考例及び実施例を挙けて説明する。

参考例１ アルスロバクタ−エスピー　ＤＰ−Ｂ−１００１株は栃
木県日光市の土壌から以下の方法でスクリーニングを行
なった結果単離されたものである。

土壌約０，５１を滅菌水５−に懸濁し希釈した後トリプ
トンイ寒天平板上に塗布し、２８℃にて培養を行って菌
を得た。このようにして得た菌をグルコース１０　？／
ｌ、酵母エキス５　ｙ７ｔ、ポリペプトン５Ｐ／ｌ、肉
エキス２２／１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，４Ｐ　７１
％Ｆｅ５Ｏａ”７ＨｚＯｏ、ｏ　１　？　／Ｌ。

Ｍｎ５Ｏ＜　会５　Ｎ２００．０１　？　／　ｔから成
りｐＨを７．０に調節した液体培地に接種し、２８℃２
日間振とう培養を行ない菌体を得た。菌体はｘｏｙ７ｔ
のＮ−カルバモイルアミノ酸（例えばＤＬ−Ｎ−カルバ
モイルトリプトファン）又は５置換ヒダントイン（例え
ばＤＬ−５−インドリルメチルヒダントイン）を含む０
．２　Ｍアンモニウム緩衝液（ｐＨ９，０）に添加し、
３７℃に２４時間保温した。保温後緩衝液上清中のし一
アミノ酸をロイコノストック・メゼンテロイデスＰ−６
０を用いたバイオアッセイ法及びシリカゲルプレートに
よる薄層クロマトグラフィーによ如測定した所、特に高
いアミノ酸生成活性を与えた菌株として本菌が得られた
。

参考例２ アルスロバクタ−エスピー　ＤＰ−Ｂ−１００２株は、
参考例１で得た同ＤＰ−Ｂ−１００１株の変異株で以下
の方法により単離されたものである。

ＤＰ−Ｂ−１００１株を参考例１で用いたものと同じ液
体培地に１ｍｑ／ｒｎｌのｐ−ジメチルアミノベンゼン
ジアゾスルホン酸ナトリウムを加えた液体培地にて培養
した後トリプトンイ寒天平板上に塗布し、２８℃にて培
養を行って菌を得、上述の方法によりアミノ酸生成−活
性を測定し、非常に高いアミノ酸生成活性を与えた変異
株として本菌を得た。

実施例１ （１）種菌の培養 参考例１で用いたものと同じ液体培地を５００−容三角
フラスコに２００−分注し、滅菌後参考例１で得たアル
スロバクタ−エスピーＤＰ−Ｂ−１００１株を一白金耳
接種し、２８℃で２４時間振とう培養した。

（２本培養、菌体作成 参考例１で用いたものと同じ液体培地に０．１５チの５
−インドリルメチルヒダントインを添加した培地を調製
し、α）で得られた培養液を４　ｍｌ接種し、２８℃で
２４時間振とう培養した。培養液から、１８０００Ｇ、
１０分間の遠心によシ菌体を集め、生理食塩水によ９１
回洗浄し、湿菌体を得、酵素反応に用いる洗浄菌体とし
た。

（３）酵素反応 ■で得られた洗浄菌体１０？を精製水５０ｍ１に懸濁し
たものに、０．８　Ｍ　ＮＨａＯＨＮＨ４Ｃｌ　（ｐＨ
８，０）、４　ｍＭ　ＦｅＳＯ４’　７　Ｎ２０及び４
　ｍＭ　Ｍｎ５０４１１５ＨｚＯなる組成の緩衝液２５
−を加え、更に原料トシて■Ｄ−Ｎ−カルバモイルフェ
ニルアラニン２００・２／１１■Ｄ−Ｎ−カルバモイル
−３−０−メチルドーパ２０　ｔ／ｌ、■Ｄ−Ｎ−ＤＬ
バモイルチロシン　２０ｔ／ｌ、■Ｄ−Ｎ−カルバモイ
ルトリプトファン　２０？／ｌ、■Ｄ−Ｎ−カルバモイ
ルメチオニン　２ｏｙ／Ｌ、■Ｄ−Ｎ−カルバモイルバ
リン　２０１／ｌ、■Ｄ−Ｎ−カルバモイルロイシン　
２０　？／Ｌの各ナトリウム塩溶液２５ゴを加え、Ｎ３
気流を吹き込み、３７℃に４８時間保温した。

反応終了後、菌体を遠心分離により除き、遠心上清中の
アミノ酸を日立６３８−５０型、反応型液体クロマトグ
ラフィーＣカラム：日立ゲルｍ２６１９．４ｕφＸ１５
０ｍ、溶出液：クエン酸ナトリウム緩衝液０．４　ｍ１
７分、アッセイ；ニンヒドリン反応５７０　ｎｍ　）及
びロイコノストックメセンテロイデスを用いたバイオア
ッセイ法にて定量したところ、次の第１表に示す量のＬ
−アミノ酸が蓄積していた。

以下余白 第１表 来アミノ酸分析計による測定値。

実施例２ 実施例１の（１）、（２）と同様にして得ら些たＤＰ−
Ｂ−１００１株の洗浄菌体ＩＱＰを精製水５〇−に懸濁
したものに、０．４　Ｍ　ＮＨｉＣｌ−ＮＨ４０Ｈ（ｐ
Ｉ（９，０）、２　ｍＭ　Ｆｅ１ｏｎ　・７　＆０及び
２　ｍＭ　ＭｎＳＯ４ｅ５Ｈ２０なる組成の緩衝液５０
−を加え１００ｄとした。これに■ＤＬ−５−ペンジル
ヒタ゛ントイン１０ｆ１■Ｄ　Ｌ　−５−（３’−メト
キシ−４′−ヒドロキシベンジル）ヒダントイン１０１
、［相］ＤＬ−５−（４’−ヒドロキシベンジル）ヒダ
ントイン１？、■ＤＬ−５−インドリルメチルヒダント
インＩＰ、＠ＤＬ−５−メチルメルカプトエチルヒタ１
ントイン１　ｒ、＠ＩＩＬ’−５−インプロピルヒダン
トインｌＰ１［相］ＤＬ−５−インブチルヒダントイン
１２をそれぞれ懸濁し、Ｎ２気流を吹き込み３７℃に４
８時間保温した。

反応終了後、菌体を遠心分離により除き、遠心上清中の
アミノ酸を実施例１と同様にして定量したところ、次の
第２表に示す量のＬ−アミ゛ノ酸が蓄積していた。

第２表 奄第１表と同じ。

実施例３ Ｄ−Ｎ−カルバモイルフェニルアラニン　６０ｔ７ｔ％
ＤＰ−Ｂ−１００１株の湿菌体１００　ｆ／ｌ　。

０、２　Ｍ　ＮＨａｃｔ−ＮＨ４ｏＨ（ｐＨ８，０）、
１　ｍＭ　ＦｅＳＯ４ｍ７　Ｈ２０ｓ　１　ｍＭ　Ｍｎ
ＳＯ４”　５　Ｈ２０なる組成の反応液１ｔを作成し、
Ｎ２ガスを吹き込みつつ、３７℃に４８時間保温した。

反応終了後、遠心分離により、菌体を除き、上清を得た
。上清中には、Ｌ−フェニルアラニン４６？（収率９６
％）が蓄積していた。この上清を濃縮、活性炭処理し、
冷却することにより、結晶を得た。結晶の比旋光度を測
定したところ、Ｃ（１〕　−３４，ｘ°ですべてＬ体で
あった。

実施例４ （１）種菌の培養、菌体作成 参考例１で用いたものと同じ液体培地を５００ｄ容三角
フラスコに２００−分注し、滅菌後参考例２で得たアル
スロバククー　エスピーＤＰ−Ｂ−１００２株を接種し
、２８℃で７２時時間表り培養した。培養液から、１８
０００Ｇ１０分間の遠心により菌体を集め、生理食塩水
により、１回洗浄し、湿菌体を得、酵素反応に用いる洗
浄菌体とした。

■　酵素反応 ■で得られた洗浄菌体１０ｙを精製水５〇−に懸濁した
ものに、０．８　Ｍ　ＮＨ４ＯＨ−ＮＨ２Ｃｌ　（Ｉ）
Ｈ８，０）、４　ｒｎＭ　Ｆｅ１ｏｎ　・７　Ｈ２０及
び４　ｍＭ　ＭｎＳＯ４’５Ｈ２０なる組成の緩衝液２
５−を加え、更に原料トシテ■Ｄ−Ｎ−カルバモイルフ
ェニルアラニン　ｚｏｏｖ７ｔ、■Ｄ−Ｎ−カルバモイ
ル３−〇−メチルドーパ　２Ｑｔ／ｌ、■Ｄ−Ｎ−カル
バモイルチロシン　２ｃ）ｙ７ｔ、■Ｄ−Ｎ−カルバモ
イルトリプトファン　２０ｙ／ｌ、■Ｄ−Ｎ−カルバモ
イルメチオニン　２Ｑ？／ｌ、■Ｄ−Ｎ−カルバモイル
バリン　２０ｙ／ｌ、■Ｄ−Ｎ−力ルバモイルロイシン
　２０　？／ｌの各ナトリウム塩溶液２５−を加え、Ｎ
２気流を吹き込み、３７′Ｃに４８時間保温した。

反応終了後、菌体を遠心分離により除き、遠心上清中の
アミノ酸を実施例１と同様にして定量したところ、次の
第３表に示す量のし一アミノ酸が蓄積していた。

第３表 来館１表と同じ。

実施例５ 実施例４の（１）と同様にして得たＤＰ−Ｂ−１００２
株の洗浄菌体１０Ｐを水５０−に懸濁したものに。

０、　４　　Ｍ　　ｈ丁Ｈ４Ｃｔ−ＮＨ＜ＯＩ（（ｐＨ
９，Ｏン　、　　２　　ｍＭ　　Ｆｅ　Ｓ０４　１１７
　Ｈ２Ｏ、２ｍＭ　Ｍｎ８０４番５　Ｈ２Ｏなる組成の
緩衝液５０ｒｎｔを加え１００−とした。これに、■Ｄ
Ｌ−５−ベンジルヒダントイン１０？、■ＤＬ−５−（
３′−メトキシ４′−ヒドロキシベンジル）ヒダン、ト
イン１０？％■Ｄ　Ｌ　−５−（４’−ヒドロキシベン
シル）ヒダントイン１２、■ＤＬ−５−インドリルメチ
ルヒダントイン１ｙ、■ＤＬ−５−メチルメルカプトエ
チルヒダントインｌ　？　、＠　Ｄ　Ｌ　−５−インプ
ロピルヒダントインｌ　ｒ　、＠ｌ　Ｄ　Ｌ　−５−イ
ンブチルヒダントイン１ｙをそれぞれ懸濁し、Ｎｚ気流
を吹き込み、３７℃に４８時間保温した。

反応終了後、菌体を遠心分離により除き、遠心上清中の
アミノ酸を実施例１と同様にして定量したところ、次の
第４表に示す債のし一アミノ酸が蓄積していた。

来館１表と同じ。

実施例６ グルコース　Ｉ　Ｑ　？／ｌ、コーンステイーフリカー
２ｃ）ｙ／ｌを含有する培地をｐＨ７，０に調整し、３
Ｌ容ミニジャーファーメンタ−に２を分注し、アルスロ
バクタ−エスピー　Ｄ　Ｐ　−Ｂ　−１００２株を接種
し、１２７分の通気、７００　ｒｐｍの攪拌下、２８℃
で３６時間培養した。培養終了後、遠心により菌体を集
め、７８１の湿菌体を得た。

上記湿菌体を８００ｍの精製水に懸濁し、１．２ｍＭの
酢酸コバルト溶液４００−と、８Ｑ　？／ＬのＤＬ−Ｎ
−カルバモイルフェニルアラニン４００ゴを加え、Ｎ２
気流吹き込み下、ｐＨを塩酸とアンモニアで６，７に調
節しつつ、３７’Ｃに２２時間保温した。反応終了後、
菌体は、遠心により回収し、再び上記反応液作成方法に
従い、新たな反応に用いた。

以上の操作を７回にわたって行った結果、下表に記す量
のＬ−フェニルアラニンを含む上清液が得られた。

第５表 実施例７ グルコース　１ｏｙ７ｔ、コーンステイーフリカー２０
？／ｌを含有する培地をｐＨ７’、’Ｑに調整し、３０
を容ジャーファーメンタ−に２０１仕込み、アルスロバ
クタ−エスピー　ＤＰ−Ｂ−１００２株を接種し、１０
ｔ／分の通気、４　Ｑ　Ｏｒｐｍの゛攪拌のもと、２８
℃、４０時間の培養を行った。

２０１の培養液からは、平均６４２２の湿菌体が得られ
た。

反応ｈ２０？／ｌ　ＤＬ−Ｎ−カルバモイルフエニル７
７ニン及び０．３　ｍＭ酢酸コバルトを含む反応液に、
第１図に示す菌濃度となるように菌体を加え、ＮＺ気流
を吹き込み、塩酸とアンモニアでｐＨ６，７に調節しつ
つ、３７℃に２２時間保温して行った。

反応終了後、菌体は遠心によって回収し、培養液より新
たに得られる菌体とともに、上記反応方法に従い反応液
を作成し、反応液量を増加させる操作を３回繰り返し、
１回当りの反応で５４０？のし一フェニルアラニンを生
成する反応液とした。

それ以後、反応１０回目と１４回目に新たに菌を補充し
つつ１８回の反応を行ったところ、第１図に示す如く合
計８．４　ＫｙのＬ−フェニルアラニンカ得られた。

実施例８ グルコース　１０ｙ７ｔ、コーンステイーフリカー　　
２０１／ｌ、ＤＬ−５−インドリルメチルヒダントイン
　ｉ、５　ｙ７ｔを含有するｐＨ７，０の培地を３を容
ミニジャーファーメンタ−に２を仕込み、アルスロバク
タ−エスピー　ＤＰ−Ｂ−１００１株を接種し、別にグ
ルコース　１０９／ｌ、コーンステイープリカー　２０
　？／ｌを含有するｐＨ７，０の培地に、同様にアルス
ロバクタ−エスピー〇Ｐ−Ｂ−１００２株を接種した。

そして、各爲のミニジャーファーメンタ−を１ｔ／分の
通気、７００　ｒｐｔｎの攪拌のもと、２８℃４０時間
の培養を行った。培養ｉ５０ゴから遠心により菌体を集
め、生理食塩水で洗浄し、各々の洗浄菌体を得た。

反応は、５０？／１ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン、
ｌ　ｍＭ　ＦｅＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ、ｌ　ｍＭ　ＭｎＳ
Ｏ４−５Ｈ２ｏ。

０、２　Ｍ　ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４０Ｈ（ｐＨ９，０）を
含有する反応液１０ｍ、及び５　Ｑ　ｔ／ｌ　　Ｄ−Ｎ
−カルバモイルフェニルアラニｙ、ｌ　ｔｎＭ　ＦｅＳ
Ｏ４・７　Ｈ２Ｏ＊　　１　ｍＭＭｎＳＯｎ　　”　　
５　　Ｈ２Ｏ、０，２Ｍ　　ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ（
ｐＨｓ、　　Ｏ）を含有する反応液１０ゴの２種類の反
応液を調製し、ＤＰ”−Ｂ−１００１株又はＤ　Ｐ　−
Ｂ　−１００２株の上記洗浄菌体を各々等量ずつ加えて
密栓をし、３７℃に２４時間保温して行った。

反応終了後、遠心により菌体を除き、上ａ液を得、含ま
れるＬ−フェニルアラニンを定量した。

その結果を第６表に示す。

第６表 実施例９ グルコース　１０り／１１コーンステイー１リーｈ−２
０９／ｌを含有する培地をｐＨ７，０に調節し、３０を
容ジャーファーメンタ−に２０１仕込み、アルスロバク
タ−エスピー　Ｄ　Ｐ　−Ｂ　−１００２株を接種し、
１ｏｔ／分の通気、４００　ｒｐｒｎｃＤ攪拌のもと、
２８℃、４０時間培養した。培養終了後、遠心によシ菌
体を集め、８２８Ｆの湿菌体を得た。

この湿菌体を１．５ｔの精製水に懸濁させ、これに５０
％アクリルアミドモノマー１．２５％、Ｎ。

Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド渚ｇｘ、ｓｚを加え
、均一にし、Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’　、　Ｎ’−テトラ
メチルエチレンジアミン３ゴ及び２チ過硫酸アンモニウ
ム溶液１５０ｒｎｔを加え混和し、厚さ２朋の薄膜状に
固化させた。完全に固化した後、２１１１１四方に切断
し、固定化菌体ゲル断片を得、６を容のカラムに充填し
た。

次いで、４．４９？／ｌのＤＬ−５−インドリルメチル
ヒダントインと４．８４？／ｌのＤＬ−Ｎ−カルバモイ
ルトリプトファン及び０．３　ｍＭ酢酸コバルトを含む
０．１　Ｍリン酸緩衝＠　（ｐＨ６，７）を・約９０’
Ｏｍ／／時の流速で３７℃に保温された上記カラムに導
いた。

上記反応の操作を１５日間にわたって行った結果、第７
表に示す量のＬ　−ト１）ブトファンを含む反応液合計
３４６ｔが得られた。

以下余白 第７表

【図面の簡単な説明】

ｇ１図はＤＬ−Ｎ−カルバモイルフェニルアラニンにア
ルスロバクタ−エスピー　ＤＰ−Ｂ−１００２を作用さ
せた場合のし一フェニルアラニンの生成量と反応の際の
反応液中の菌濃度を各反応毎に表わした図である。 以上 第１図 反応回数（回） 手続ｈｌｉ正書（自発） 昭和６０年゛７月　２４日 ２　発明の名称 住　所　東京都中央区日本橋三丁目１３番５号名　（ｆ
Ｉ・　第一化学薬品株式会社 代表者　内　藤　武　男 自　　　発 ６、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ７、　補正の内容 α）　明細書中、第７頁第１０行 「マドロー色」とあるを 「ストロ−色」と訂正する。 （２）同、第１８頁第６行 「Ｎ−カルバモイルアミノ酸俣）」とあるを「Ｎ−カル
バモイルアミノ酸ＣＪ）」と訂正する。 丁−ｉ、、’、　　ｉ山　正　１１Ｆ（自発）昭和６１
年５　月１５日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルスロバクター属に属し５置換ヒダントイン及び
   Ｎ−カルバモイルアミノ酸をＬ−アミノ酸に転換する能
   力を有する微生物又はその変異株の培養物を、次式（
   I ）及び（II）、 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）▲数式、化
   学式、表等があります▼（II） （式中、ＲはＮ−カルバモイルアミノ酸残基又はヒダン
   トイン残基を示す） で表わされるＮ−カルバモイルアミノ酸又は／及び５置
   換ヒダントインに作用させることを特徴とする次式（I
   II）、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （III） （式中、Ｒは前記と同じ） で表わされるＬ−アミノ酸の製造方法。