JP5598329B2 - Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Description

本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン等のＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料として、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、または、アミノ酸輸液等として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。

Ｌ−アミノ酸は、種々の微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の微生物を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株（例えば、特許文献１参照）等を用いる方法が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントエア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献２〜４参照）。

上記のような微生物を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。

さらに、近年は、目的物質の発酵生産に、組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献５、特許文献６）、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献７）によって、微生物のＬ−アミノ酸生産性を向上させることが行われている。

グルコース脱水素酵素には、大きく分けてNAD(P)依存型とPQQ（ピロロキノリンキノン）依存型が知られている。さらに、PQQ依存型（EC1.1.5.2）には可溶型と膜結合型が存在し、後者は腸内細菌ではペリプラズム空間（外膜、内膜間の空隙）に存在することが知られており、腸内細菌に広く存在することが知られている。以下、このようなペリプラズム空間に存在し、PQQを補酵素とするグルコース脱水素酵素を「GCD」とも記載する。
エシェリヒア・コリ等の一部の細菌では、GCDの補酵素であるPQQの合成能がないために、PQQを添加することで初めてGCD活性を発現することが知られている（非特許文献２）。一方、パントエア属細菌等の細菌では、PQQ合成能があり、GCDホロ酵素を持つ。

GCDに関する技術としては、GCDをコードする遺伝子を欠損させたグルコノバクター・キシリナス（Gluconobacter xylnus）を用いてグルコースからセルロースを製造する方法が知られている（J. Biosci. Bioeng. 99(4), 415-422, 2005）。また、グルコース脱水素酵素活性が低下したエシェリヒア属細菌、又は本来的にグルコース脱水素酵素活性を欠失したエシェリヒア属細菌を用いて[5S,6S]-5,6-ジヒドロキシシクロヘキサ-1,3-ジエン-1-カルボン酸を製造する方法が知られている（特許文献８）。

しかしながら、細菌のGCD活性の低下がＬ−アミノ酸生産能に及す影響については知られていない。

特開平５−２４４９７０号公報 米国特許第３，５６３，８５７号明細書 特公昭３２−９３９３号公報 特開２０００−１８９１７５号公報 米国特許第５１６８０５６号明細書 米国特許第５７７６７３６号明細書 米国特許第５９０６９２５号明細書 国際公開第ＷＯ２００６／１３３８９８号パンフレット

明石邦彦ら著 アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年 FEMS Microbiol. Lett., 24, 329-333, 1984

本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する微生物を提供すること、及び該微生物を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本来的にGCD活性を有する腸内細菌を、GCD活性が低下するように改変することによって、Ｌ−アミノ酸生産能が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）腸内細菌科に属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を培地で培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法であって、前記細菌は本来的にピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素の活性を有するが、同酵素の活性が低下するように改変された細菌であることを特徴とする方法。
（２）前記酵素をコードするgcd遺伝子が不活化されたことにより、GCD活性が低下した、前記方法。
（３）前記gcd遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記方法。
（４）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインからなる群から選択される、前記方法。
（５）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸又はＬ−システインである、前記方法。
（６）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸であり、前記細菌がクエン酸シンターゼ、メチルクエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、前記方法。
（７）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−システインであり、前記細菌が３-フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系から選択される少なくとも１種又は２種以上の活性、及び／又は、yeaS遺伝子の発現が増強されている、前記方法。
（８）前記細菌が、パントエア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、モルガネラ属、及びイェルシニア属から選ばれる属に属する細菌である前記方法。

本発明の微生物を用いることにより、効率よく、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、又はＬ−システイン等のＬ−アミノ酸を発酵生産することが出来る。

ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構造を示す図。 ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築を示す図。 プロモーターPnlpの配列を示す図。

以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明で使用される腸内細菌科に属する細菌
本発明で使用される細菌は、本来的にGCD活性を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であって、GCD活性が低下するように改変された細菌である。本発明の細菌は、本来的にGCD活性を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、GCD活性が低下するように改変することによって取得することができる。また、本発明の細菌は、本来的にGCD活性を有するが、GCD活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与するか、前記細菌のＬ−アミノ酸生産能を増強することによっても、取得することができる。

Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリンのような塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシンのような脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリンのようなヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリンのような環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンのような芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンのような含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等のような酸性アミノ酸が挙げられ、特にＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファンが好ましい。本発明の微生物は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
また、本発明においてＬ−アミノ酸とは、フリー体のＬ−アミノ酸及び／またはその塩、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む。

本発明において、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、Ｌ−アミノ酸を生産し、培地中に分泌する能力を有する細菌をいう。また、好ましくは、目的とするＬ−アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量を培地に蓄積させることができる細菌をいう。

以下に、GCD活性が低下するように改変される、本発明の細菌の親株として使用される細菌、及びＬ−アミノ酸生産能の付与又は増強の方法を以下に例示する。

＜２−１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、腸内細菌科に属する細菌である。
腸内細菌科は、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。

エシェリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されていることを意味する。エシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ（E.coli）が挙げられるが、これに限定されない。

エシェリヒア属に属する細菌には、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。

これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。
エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。

パントエア属細菌の代表的な細菌として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。

パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13601株（FERM BP-7207）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。

エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。

エルビニア・アミロボーラATCC15580株
エルビニア・カロトボーラATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)

本発明の細菌は、上記のような腸内細菌であって、本来的にGCD活性を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌である。本来的にGCD活性を有する腸内細菌とは、野生株又はgcd遺伝子非改変株がGCD活性を有する細菌を意味する。このような腸内細菌科に属する細菌としては、パントエア、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、モルガネラ属、及びイェルシニア属、シトロバクター属、プロテウス属等の属に属する細菌が挙げられる。より具体的には、Int. J. Syst. Bacteriol., 39(1), 61-67, 1989に記載された細菌が挙げられる。

エシェリヒア・コリは、gcd遺伝子を持ち、GCDアポ酵素を産生するが、PQQ産生能を有していないため、PQQ非添加下ではGCD活性を有さない。しかしながら、ある外来遺伝子を発現させるとPQQを代替する物質が生成し、GCD活性を発現することが知られている（WO2006/133898）。このように、エシェリヒア属細菌のように通常はGCD活性を有さない細菌であっても、GCD活性を発現する状態にある細菌は、本発明にいう「本来的にGCD活性を有する腸内細菌」に含まれる。GCD活性については後述する。

以下、前記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌Ｌ−アミノ酸生産能を増強する方法について例示する。

Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。

Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。

また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。

上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターは目的とする細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。

以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する具体的方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。尚、以下の記載は、主としてエシェリヒア属細菌に関するものであるが、以下の方法は本発明に用いる腸内細菌にも適用できる。

Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制された細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001−346578号）等が挙げられる。

Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。

スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。

このようにＬ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。

Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット)、フォスフォエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。

また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。

Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で国際寄託されている。

E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。

Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。

スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。

rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。

E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。

また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。

Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。

Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。

Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。

好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子が破壊されたWC196株に、米国特許第6040160に記載されたプラスミドpCABD2が導入することにより得られた株である。WC196株は、E.coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352番目のスレオニンをイソロイシンに置換することによりL-リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldc自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。

Ｌ−システイン生産菌
細菌のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン生合成経路の酵素、又はＬ−セリン等、同経路の基質となる化合物の生成に関与する酵素、例えば、３-フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、又はセリンアセチルトランスフェラーゼ等の活性を増強することにより、向上させることができる。３-フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは、セリンによるフィードバック阻害を受けるが、このフィードバック阻害が低減又は解除された変異型３-フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。
また、セリンアセチルトランスフェラーゼは、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受ける。したがって、このフィードバック阻害が低減又は解除されたセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型cysE遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。エシェリヒア・コリのSATをコードする遺伝子として、cysEが野生株及びＬ−システイン分泌変異株よりクローニングされ、塩基配列が明らかになっている（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）。その塩基配列及び同塩基配列がコードするアミノ酸配列を、配列番号３７及び３８に示す。

また、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系の活性を増強することによっても、Ｌ−システイン生産能を向上させることができる。硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系タンパク質群は、cysPTWA遺伝子クラスターによってコードされている（特開2005-137369号公報、EP1528108号明細書）。

また、細菌のＬ−システイン生産能は、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）の発現を上昇させることによっても、向上させることができる。yeaS遺伝子の塩基配列及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号３９及び４０に示す。細菌では、ATG以外にもGTGなどの種々のコドンが開始コドンとして使用されていることが知られている（http://depts.washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htm）。配列番号３９及び４０において、最初のコドンgtgに相当するアミノ酸をValと表記しているが、実際はMetである可能性が高い。

Ｌ−システイン生産能を有するエシェリヒア属細菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

細菌のＬ−システイン生産能は、yhaM遺伝子によりコードされるタンパク質（以下、「YhaM」と記載することがある）の活性が低下するように改変することによって、向上させることができる。yhaM遺伝子は、ECK3099、b4470、yhaN遺伝子と同義であり、以前はb3109、又はb3108とも呼ばれていた。

Ｌ−システイン生産能を有するパントエア属細菌としては、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下するように改変されたパントエア・アナナティス菌株、及び、さらにＬ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有するパントエア・アナナティス菌株が挙げられる。このようなＬ−システイン生産菌を育種するための親株としては、パントエア・アナナティスAJ13355株、SC17株、及びSC17(0)株が挙げられる。AJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株であり、同株から粘液質低生産変異株として選択された株が、SC17株である（米国特許第6,596,517号）。AJ13355株は、平成10年2月19日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、平成11年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。SC17(0)株は、パントエア・アナナティスにおいて遺伝子破壊を行うために、λ Red遺伝子産物に耐性な菌株として構築された株である（参考例１参照）。

SC17株は、プライベート番号AJ416が付与され、平成２１年２月４日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。また、SC17(0)株は、2005年9月21日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に受託番号VKPM B-9246のもとに国際寄託されている。

細菌が産生したＬ−システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がＬ−シスチンに変換することがある。また、後述するように、Ｌ−システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってＳ-スルホシステインが生成することがある（Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958)）。さらに、細菌の細胞内で生成したＬ−システインは、細胞中に存在するケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある（特許第2992010参照）。これらのチアゾリジン誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。したがって、本発明においてＬ−システイン生産能とは、Ｌ−システインのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、Ｌ−システインに加えて、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、例えばＳ-スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、もしくはヘミチオケタール、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力も含まれる。

Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。

Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。

hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。

Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。

Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素１種又は２種以上の活性が増強された株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼが好ましい。

シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。

細菌のＬ−グルタミン酸合成能は、呼吸鎖に関与する酵素、例えばシアン耐性呼吸末端酸化酵素（cioA, cioB）の活性を高めることによって、向上させることができる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素、又はＬ−グルタミン酸を分解又は消費する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)、γ-グルタミル転移酵素(ggt)、γ-グルタミン酸システイン合成酵素(gshA)、γ-グルタミン酸プトレシン合成酵素(ycjK)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。

具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。

Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。

パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、前記パントエア・アナナティスAJ13355株が挙げられる。

また、パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。

さらに、パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、実施例に記載したように、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。また、前記RSFCPGのgltA遺伝子をprpCに置き換えたRSFPPG（WO2008/020654、後記実施例参照）を持つNP106株も、好ましいＬ−グルタミン酸生産菌である。

Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1、WO03/044192)。

Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。

Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（CM-PD）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。

Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。

Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。

Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。

Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。

Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H⁺-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。

Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。

Ｌ−チロシン生産菌
チロシン生産菌としては、チロシンによる阻害を受けない脱感作型のプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子(tyrA)を有するエシェリヒア属細菌（欧州特許出願公開1616940号公報）が挙げられる。

遺伝子組換えにより、上記のＬ−アミノ酸生産菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、それらの遺伝子のバリアント、すなわち、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、それらの遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個を意味する。また、保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように公知の遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。

さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。
また、遺伝子の配列におけるそれぞれのコドンは、遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。

保存的変異を有する遺伝子は、変異剤処理等、通常変異処理に用いられる方法によって取得されたものであってもよい。

また、遺伝子は、公知の遺伝子配列の相補配列又はその相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、公知の遺伝子産物と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。

プローブとしては、遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。

上記した遺伝子のバリアントに関する記載は、下記のgcd遺伝子についても同様に適用される。

＜２−２＞GCD活性の低下
次に、腸内細菌科の属する細菌のGCDの活性を低下させる改変について説明する。

GCD活性とは、下記反応を触媒する活性をいう。

β-D-グルコース＋酸化型PQQ → D-δ-グルコノラクトン＋還元型PQQ

GCD活性は、例えば、以下の反応による還元型DCPIPの生成を600nmの吸光度測定で検出することより、測定することができる（特開2007-129965）。

D-グルコース＋酸化型PMS → D-グルコノ-1,5-ラクトン ＋ 還元型PMS
還元型PMS＋ 酸化型DCPIP → 酸化型PMS ＋ 還元型DCPIP
PMS：フェナジンメトサルフェート
DCPIP：2,6-ジクロロフェノール-インドフェノール

「GDC活性が低下するように改変された」とは、細菌の細胞あたりのGCD活性が、非改変株、例えば野生型の腸内細菌科に属する菌株よりも低くなったことをいう。例えば、細胞あたりのGCDの分子数が低下した場合や、分子あたりのGCD活性が低下した場合等が該当する。細胞あたりのGCD活性の比較は、例えば、同じ条件で培養した細菌の細胞抽出液に含まれるGCD活性を比較することによって、行うことができる。尚、活性の「低下」には、活性が完全に消失した場合も含まれる。比較の対照となる野生型のパントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）などが挙げられる。

GCDの活性の低下は、GCDをコードする遺伝子（gcd）を不活化することによって達成される。gcd遺伝子の「不活化」とは、同遺伝子によってコードされるGCDの活性が低下又は消失するように、同遺伝子を遺伝子組換えにより改変するか、又は、同遺伝子に変異を導入することをいう。

gcd遺伝子としては、配列番号１に示した塩基配列を有するパントエア・アナナティスのgcd遺伝子が挙げられる。このgcd遺伝子がコードするGCDのアミノ酸配列を配列番号２に示す。gcd遺伝子は、これらの配列に基づき、合成オリゴヌクレオチドを合成し、パントエア・アナナティスの染色体を鋳型としてＰＣＲ反応を行うことによってクローニングすることができる。また、相同組換えによってgcd遺伝子を欠損させる場合には、染色体上のgcd遺伝子と一定以上の相同性、例えば、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の相同性を有する遺伝子を用いることもできる。また、染色体上のgcd遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いることもできる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。

gcd遺伝子の不活化は、具体的には例えば、染色体上のgcd遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させたり、コード領域中に他の配列を挿入することによって達成される。これらの手法は、遺伝子破壊とも呼ばれる。
また、gcd遺伝子のプロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変することなどによって、gcd遺伝子の発現を低下させることによっても、gcd遺伝子を不活化することができる。発現の低下には、転写の低下と翻訳の低下が含まれる。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現を低下させることができる。

さらには、染色体上の標的遺伝子の前後の配列を含めて、標的遺伝子全体を欠失させてもよい。また、gcd遺伝子の不活化は、染色体上のgcd遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。

各遺伝子の改変は、遺伝子組換えにより行われることが好ましい。遺伝子組換えによる方法として具体的には、相同組換えを利用して、染色体上の標的遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入することが挙げられる。

発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、各遺伝子が産生するタンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に標的遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。

コード領域に他の配列を挿入する場合も、挿入する位置は標的遺伝子のいずれに領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に標的遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、標的遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−アミノ酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。

染色体上の標的遺伝子を上記のように改変するには、例えば、標的遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の標的遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の標的遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型標的遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、又は、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。

標的遺伝子の転写量が低下したことの確認は、標的遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。転写量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して低下していれば、いずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下に低下していることが望ましく、全く発現していないことが特に好ましい。

標的遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、同タンパク質に結合する抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下以下に減少していることが望ましく、全くタンパク質を産生していない（完全に活性が消失している）ことが特に好ましい。

GCDの活性を低下させるには、上述の遺伝子操作法以外に、例えば、パントエア属細菌等の腸内細菌を紫外線照射または、Ｎ-メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、GCDの活性が低下した菌株を選択する方法が挙げられる。

GCDの活性の低下は、PQQの合成能を低下させることによっても、行うことができる。PQQの合成能は、例えば、PQQ生合成に必要なオペロンであるpqqABCDEFの一部又は全部を欠失させることによって、低下させることができる (J.S.Velterop, P.W.Postma, J. Bacteriology 177(17):5088-5098 (1995))。

エシェリヒア・コリや、コリネ型細菌のようなGCD活性を持たない微生物では、グルコースはグルコースPTS（糖ホスホトランスフェラーゼシステム）またはグルコースパーミアーゼと呼ばれるトランスポーターを利用して取り込まれる。PTSはPEP（フォスフォエノールピルビン酸）がPyr（ピルビン酸）に変換される反応と共役して、グルコース6−リン酸の形で細胞内に取り込まれる。グルコース6−リン酸はフルクトース6−リン酸になり、いわゆる解糖系（EMP:エムデンマイヤーホフ経路）により代謝されてピルビン酸が生成する。
一方、GCD活性をもつ微生物では、グルコースはペリプラズム空間で一旦グルコン酸に変換されたのちに、グルコン酸パーミアーゼによって取込まれ、リン酸化反応により6-ホスホグルコン酸が生成する。

6−ホスホグルコン酸はペントースリン酸サイクル、あるいはエントナードゥドルフ(ED)経路により代謝されてグリセルアルデヒド３-リン酸やピルビン酸などが生成する。

酢酸菌等のGCDを持つ微生物は、グルコースの一部をペリプラズムで一旦グルコン酸に変換してから取り込むという特有の糖代謝特性を持つことが知られている。微生物によって細胞内のEMP経路、ED経路、ペントースリン酸サイクルのキャパシティーが異なるため、GCDを欠損して糖代謝を変換すると、それより下流の代謝パターンが変化することが予想される。

パントエア・アナナティスに関しては、通常の培養温度、例えば34℃ではすべてのグルコースをGCD経由で資化しているわけではなく、PTS経由で資化されるものも相当量存在していると考えられる。一方、高温、例えば38℃で培養すると、GCDは至適温度が高いため、GCD活性が上昇し、それによってGCD経由の糖消費が増えると予想される。パントエア・アナナティスには、ＥＤ経路が存在しないため、6-ホスホグルコン酸は、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素化され、ペントースリン酸サイクルにて代謝される。6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼによる脱水素化の際、一分子の6-ホスホグルコン酸から、一分子の二酸化炭素が放出されるため、GCD経由の糖消費が増えると、アミノ酸生成量が低下すると予想される。また、高温での培養でGCD経由の糖消費が増えると、ペントースリン酸サイクルのキャパシティーに不足が生じ、オーバーフローした代謝物が副生物のほうに流れて、結果としてＬ−アミノ酸収率が低下することも推定される。本発明では、GCD活性を低下させることによって、特に高温で培養したときに、二酸化炭素の放出とペントースリン酸サイクルへのオーバーフローが解消することで、Ｌ−アミノ酸生産性が向上すると考えられる。

また、ED経路を導入したようなパントエア・アナナティス(特開2003-274988)においても、GCD経由の糖消費が増えると、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼによる6-ホスホグルコン酸の脱水素反応における二酸化炭素の放出と、ED経路やペントースリン酸サイクルのキャパシティー不足によって、Ｌ−アミノ酸収率が低下すると推定される。したがって、ED経路を導入したパントエア・アナナティスでも、GCD活性を低下させることにより、Ｌ−アミノ酸生産性が向上すると考えられる。

本発明に用いる細菌は、GCD活性が低下し、さらに糖の取り込み活性が強化されたものであってもよい。糖の取り込み活性を上昇させるためには、例えば、グルコースPTSやグルコースパーミアーゼの活性を上昇させればよい。また、ガラクトースパーミアーゼ（Flores et al. J Mol Microbiol Biotechnol 2007;13:105-116）、キシロースパーミアーゼ(EP1807445A1)、アラビノースパーミアーゼ等のメジャーファシリテイタースーパーファミリー（Major Facilitator Superfamily(MFS)(Griffith, J.K. et al, Curr. Opin. Cell Biol. 4(4); 684-95 (1992))のメンバーとされるトランスポーターもグルコース等を取り込む活性を有することが知られている。したがって、GCD活性の低下した細菌において、これらのトランスポーターの活性を強化させることによっても、グルコース等の糖の取り込みが上昇し、Ｌ−アミノ酸生産性が向上する。

＜２＞本発明のＬ−アミノ酸の製造法
本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造することができる。

培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。

炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。

特にＬ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いる場合、培地中にパントテン酸を添加すると、より効率よく晶析できる（WO2004/111258号パンフレット）。無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。

培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に目的アミノ酸が蓄積される。

本発明においては、細菌の生育に適した温度での培養で、効率よくＬ−アミノ酸を生産することができるが、特に高温で培養した場合に、効果が顕著である。例えば、パントエア・アナナティス等のパントエア細菌では、通常３４℃前後が生育に好ましい温度であり、GCD活性を低下させた細菌は、非改変株よりもこの培養温度でＬ−アミノ酸生産能が高いが、例えば３６℃、又は３８℃では一層Ｌ−アミノ酸生産能が向上する。

また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。

また、Ｌ−グルタミン酸を培地中に析出させる場合には、予めＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジンの結晶を種晶として添加しておくとより効率よく晶析できる（欧州特許1233069号、欧州特許出願公開1624069号）。

培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。

なお、塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御するか、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照、米国特許出願公開第2002025564号）。
本発明において採取されるＬ−アミノ酸は、目的とするＬ−アミノ酸以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたＬ−アミノ酸の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (US5,431,933, JP1214636B, US4,956,471, US4,777,051, US4946654, US5,840358, US6,238,714, US2005/0025878)。

本発明の方法によりＬ−システインを製造する場合は、得られるＬ−システインはＬ−システイン誘導体の製造に用いることができる。Ｌ−システイン誘導体としては、メチルシステイン、エチルシステイン、カルボシステイン、スルホシステイン、アセチルシステイン等が含まれる。

また、Ｌ−システインのチアゾリジン誘導体が培地に蓄積した場合は、培地からチアゾリジン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とＬ−システインとの間の反応平衡をＬ−システイン側に移動させることによって、Ｌ−システインを製造することができる。 また、培地にＳ-スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスライトール等の還元剤を用いて還元することによってＬ−システインに変換することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
〔参考例１〕λ Red遺伝子産物に耐性なパントエア・アナナティス菌株の構築
パントエア・アナナティスにおいて遺伝子欠損を行うために、「Red-driven integration」あるいは「Red-mediated integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97. 6640-6645 (2000)）を高効率で行うための受容菌を構築した。

まず、λのgam、bet及びexoの各遺伝子（以下、「λ Red遺伝子」）を発現する新規なヘルパープラスミドRSF-Red-TERを構築した（図１）。詳細は、参考例２に記載する。

このプラスミドは、異なる遺伝子背景を持つ広い範囲の宿主に使用できる。その理由は、１）これは、多くのグラム陰性菌及びグラム陽性菌、並びに植物においてさえも安定に維持され得るRSF1010広宿主域プラスミドのレプリコンを有しており（Scholz, et al., 1989; Buchanan-Wollaston et al., 1987）、２）λ Red遺伝子、gam、bet及びexo遺伝子は、多くの細菌のRNAポリメラーゼによって認識される、PlacUV5プロモーターの調節下にあり（例えば、Brunschwig, E. and Darzins, A., Gene, 111, 1, 35-41 (1992); Dehio, M. et al, Gene, 215, 2, 223-229 (1998)）、３）自己調節因子P_lacUV5-lacI、及びエシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ非依存性転写ターミネーター（TrrnB）は、λ Red遺伝子の基底発現レベルを低くする（Skorokhodova, A.Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)）からである。さらに、RSF-Red-TERプラスミドは、レバンスクラーゼ（levansucrase）遺伝子（sacB）を含んでおり、この遺伝子により、スクロースを含む培地で細胞からプラスミドを回収することができる。

エシェリヒア・コリでは、RSF-Red-TERプラスミドにより提供される短いフランキング領域と共に、PCRで生成したDNA断片がインテグレートする頻度は、pKD46ヘルパープラスミド（Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Nat1.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, (2000)）を用いた場合と同程度に高い。しかし、λ Red遺伝子の発現は、パントエア・アナナティスにとって毒性を示す。RSF-Red-TERヘルパープラスミドで形質転換された細胞は、IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイド、1mM)及び適当な抗生物質（クロラムフェニコール25μg/ml又はカナマイシン40μg/ml）を含むLB培地で非常に低い生育速度を示し、λ Red介在組換え（λ Red-mediated recombination）の効率は、観察されたとしても極端に低い（10^-8）。

λ Red遺伝子の３つの遺伝子すべての発現に耐性なパントエア・アナナティスの変異株を選択した。そのために、パントエア・アナナティスSC17株（米国特許第6,596,517号）を、RSF-Red-TERプラスミドでエレクトロポレーションにより導入した。１８時間培養後、約10⁶個の形質転換株が得られ、１０クローンまではコロニーが大きいサイズであり、残りはすべて非常に小さかった。１８時間培養後、大きいコロニーは約2mmであり、小さいコロニーは約0.2mmであった。培養を２４時間まで延長しても、小さいコロニーはそれ以上生育しなかったが、大きいコロニーは生育を続けた。λ Red遺伝子の３つの遺伝子すべて（gam、bet及びexo）の発現に耐性な、大きいコロニーのパントエア・アナナティス変異株の一つを、更なる解析に用いた。

RSF-Red-TERプラスミドDNAを、大きいコロニーのクローン１つ、及びいくつかの小さいコロニーのクローンから単離し、エシェリヒア・コリMG1655を再形質転換して、Red遺伝子の活性な産物を合成するプラスミドの能力を調べた。得られた形質転換体におけるRed依存的インテグレーションのコントロール実験により、大きいコロニーのクローンから単離されたプラスミドのみが、Red依存的インテグレーションに必要なλ Red遺伝子の発現をもたらすことが示された。選択された大きいコロニーのクローンにおいて、Red媒介インテグレーションが起るかを調べるために、Km^Rマーカー及びhisD遺伝子に相同な40bpのフランキング領域を含み、パントエア・アナナティスのhisD遺伝子のSmaI認識部位にインテグレートするようにデザインされた、PCRで生成した直鎖状のDNA断片を用いて、エレクトロポレーションを行った。２個の小さいコロニーのクローンをコントロールとして用いた。パントエア・アナナティスのhisD遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。PCRには、配列番号４及び５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、pMW118-(λattL-Km^r-λattR）プラスミドを鋳型として使用した。λ Red遺伝子に耐性ではない２個の小さなコロニーのクローンをコントロールとして使用した。pMW118-(λattL-Km^r-λattR)プラスミドの構築は、参考例３で詳述する。

RSF-Red-TERプラスミドは、同プラスミド上にあるlacI遺伝子によって、Red遺伝子の発現を誘導することができる。２つの誘導条件について調べた。第１のグループでは、IPTG(1mM)をエレクトロポレーションの１時間前に添加し、第２のグループでは、IPTGはエレクトロポレーション可能な細胞の調製のための培養開始時に添加した。大きいコロニーのクローンからのRSF-Red-TERを保持する細胞の後代の生育速度は、同プラスミドを持たない菌株よりも有意に低くはなかった。IPTGの添加により、これらの培養物の生育速度はわずかに低下しただけであった。一方、小さいコロニーのクローンの後代は、IPTG非添加で非常にゆっくり生育し、誘導すると生育は事実上停止した。大きいコロニーのクローンの後代の細胞をエレクトロポレーションした後、たくさんのKm^Rクローン（短い誘導時間で１８クローン、誘導時間を延長すると約１００クローン）が生育した。調べた100クローンの全ては、His^-表現型を有し、20クローンについてPCRで確認したところ、これらの細胞の染色体の構造が期待どおりであることが確認された。一方、小さいコロニーのクローンの後代の細胞をエレクトロポレーションしても、インテグレーションされた株は得られなかった。

得られた大きいコロニーのクローンを、7%スクロースを含むプレートで生育させてプラスミドを脱落させ、RSF-Red-TERで再形質転換した。プラスミドを持たない株をSC17(0)と命名した。

上記再形質転換の後に生育した全てのクローンは、親株クローンSC17(0)と同様に大きなコロニーサイズを有していた。RSF-Red-TERプラスミドで再形質転換したSC17(0)株におけるRed媒介インテグレーションの実験を行った。得られた３つの独立した形質転換株について、前の実験に用いたのと同じDNA断片を用いて調べた。短い誘導時間（エレクトロポレーション１時間前）を採用した。各々の実験で、１０個を超えるKm^Rクローンが生育した。試験した全てのクローンは、His^-表現型を有していた。こうして、λ Red遺伝子の発現に耐性なSC17(0)と名付けた変異株が選択された。この菌株は、パントエア・アナナティス染色体へのRed依存的インテグレーションのための好適な受容菌として使用できる。

〔参考例２〕ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築
ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築スキームを図２に示す。
構築の最初の工程として、RSFsacBPlacMCSベクターをデザインした。そのために、pACYC184プラスミドのcat遺伝子、及びバチルス・サブチリスのsacB遺伝子の構造部分を含むＤＮＡ断片を、それぞれ配列番号６、７、８、９のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは各々、さらなるクローニングに必要な、都合のよいBglII、SacI、XbaI、及びBamHI制限酵素部位を5'末端に含んでいる。得られた1.5kbのsacB断片を、先に得たpMW119-P_laclacIベクターのXbaI-BamHI部位にクローニングした。このベクターは、pMW118-P_laclacIベクターについての記載（Skorokhodova, A.Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)）と同様にして構築した。但し、同ベクターは、pMW218プラスミドの代りにpMW219からのポリリンカー部位を含んでいる。

次に、前記の1.0kbのcat断片をBglII及びSacIで処理し、先の工程で得たRSF-P_laclacIsacBプラスミドのBamHI-SacI部位にクローニングした。得られたプラスミドpMW-P_laclacIsacBcatは、PlacUV5-lacI-sacB-cat断片を含んでいる。この断片をRSF1010ベクターにサブクローンするために、pMW-P_laclacIsacBcatをBglIIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、続いてSacIで切断した。pMWP_laclacIsacBcatプラスミドの3.8kbのBglII-SacI断片を1%アガロースゲルから溶出させ、PstI、及びSacIで処理したRSF1010ベクターに連結した。ライゲーション混合液でエシェリヒア・コリTG1を形質転換し、クロラムフェニコール（50mg/L）を含むL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）にプレートした。生育したクローンから単離したプラスミドの制限酵素解析を行い、RSFsacBプラスミドを得た。RSFsacBP_lacMCSベクターを構築するために、配列番号１０及び１１のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pMW119-P_laclacIプラスミドを鋳型として用いて、P_lacUV5プロモーターを含むDNA断片をPCRにより増幅した。得られた146bpの断片をSacI及びNotIで消化し、RSFsacBプラスミドのSacI-NotI大断片と連結した。その後、配列番号１２及び１３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pKD46プラスミド（Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Nat1.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, (2000)）を鋳型とし用いたPCRにより、λRedαβγ遺伝子、及び転写ターミネーターtL3を含む2.3kbのDNA断片を増幅した。得られた断片をRSFsacBP_lacMCSベクターのPvuI-NotI部位にクローニングした。こうして、RSFRedプラスミドをデザインした。

Red遺伝子のリードスルー転写を排除するために、エシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ−依存性転写ターミネーターを、cat遺伝子とP_lacUV5プロモーターとの間に挿入した。そのために、配列番号１４及び１１のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、エシェリヒア・コリBW3350の染色体を鋳型として用いたPCRにより、P_lacUV5プロモーターとTrrnBターミネーターを含むDNA断片を増幅した。得られたこれらの断片をKpnIで処理して、連結した。その後、配列番号１１及び１５のオリゴヌクレオチドをプライマーとするオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、P_lacUV5及びTrrnBの両方を含む0.5kb断片を、増幅した。得られたDNA断片をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、BamHIで切断し、RSFsacBPlacMCSベクターのEcl136II-BamHI大断片と連結した。得られたプラスミドをRSF-Red-TERと命名した。

〔参考例３〕pMW118-(λattL-Km^r-λattR)プラスミドの構築
pMW118-(λattL-Km^r-λattR)プラスミドは、pMW118-attL-Tc-attR (WO2005/010175)プラスミドから、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をpUC4Kプラスミドのカナマイシン耐性遺伝子で置換することによって構築した。そのために、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドのEcoRI-HindIII大断片を、pUC4KプラスミドのHindIII-PstI(676bp)及びEcoRI-HindIII(585bp)の２つの断片に連結した。基本となるpMW118-attL-Tc-attRは、以下の４つの断片を連結することによって得た。

１）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattLに相当する領域から、プライマーP1（配列番号１６）及びP2（配列番号１７）を用いたPCR増幅により得たattL（配列番号１８）を持つBglII-EcoRI断片(114bp)。これらのプライマーは、BglII及びEcoRIのための副次的な認識部位を含んでいる。

２）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattRに相当する領域から、プライマーP3（配列番号１９）及びP2（配列番号２０）を用いたPCR増幅により得たattR（配列番号２１）を持つPstI-HindIII断片(182bp)。これらのプライマーは、PstI及びHindIIIのための副次的な認識部位を含んでいる。

３）pMW118-ter_rrnBのBglII-HindIII大断片(3916 bp)。プラスミドpMW118-ter_rrnBは、次の３つのDNA断片を連結することによって得た。
・pMW118のAatII-EcoRI断片を持つ大断片(2359 bp)。この断片は、pMW118をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、次いでAatIIで消化することによって得た。
・アンピシリン耐性（Ap^R）の遺伝子blaを持つpUC19のAatII-BglII小断片(1194 bp)。この断片は、pUC19プラスミドの相当する領域をプライマーP5及びP6（配列番号２２及び２３）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びAatII及びBglIIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・転写ターミネーターter_rrnBのBglII-PstI小断片(363bp)。この断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域をプライマーP7及びP8（配列番号２４及び２５）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びBglII及びPstIのための副次的な認識部位を含んでいる。

４）テトラサイクリン耐性遺伝子及びter_thrL転写ターミネーターを持つpML-Tc-ter_thrLのEcoRI-PstI小断片(1388bp)（配列番号２６)。pML-Tc-ter_thrLプラスミドは、次の２工程で得た。
・pML-MCSプラスミド(Mashko, S.V. et al., Biotekhnologiya (in Russian), 2001, no. 5, 3-20)をXbaI及びBamHIで消化し、次いで大断片(3342bp)を、ter_thrLターミネーターを含むXbaI-BamHI断片(68bp)と連結した。このter_thrLターミネーターを含む断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域を、プライマーP9及びP10（配列番号２７及び２８）を用いたPCRにより得た。こうしてpML-ter_thrLプラスミドを得た。これらのプライマーは、PstI及びXbaI及びBamHIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・pML-ter_thrLプラスミドをKpnI及びXbaIで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つpBR322のEcoRI-Van91I小断片(1317bp)と連結して、pML-Tc-ter_thrLプラスミドを得た。尚、pBR322は、EcoRI及びVan91Iで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理した。

〔参考例４〕グルタミン酸生産プラスミドRSFPPGの構築
Ｌ−グルタミン酸生合成系遺伝子、prpC遺伝子（国際公開2006/051660号パンフレット）、ppc遺伝子、gdhA〔欧州出願公開0999282号明細書〕遺伝子を増幅したプラスミドRSFPPGを構築した（WO2008/020654）。

RSFCPG（欧州出願公開1233068号明細書）のgltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するプライマー１（配列番号２９）とプライマー２（配列番号３０）を設計した。このプライマーを用いて、RSFCPGを鋳型にPCRを行い、約14.9kbの断片を取得した。一方、prpCに関してはプライマー３（配列番号３１）とプライマー４（配列番号３２）を用い、E.coli W3110株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、約1.2kbの断片を取得した。両PCR産物をそれぞれBglII、KpnIで処理し、ライゲーション後、E. coli JM109株を形質転換した。出現したコロニーを全て集菌し、混合物としてプラスミドを抽出した。このプラスミド混合物でクエン酸シンターゼ（CS）欠損株であるE. coli ME8330株を形質転換し、50mg/Lウラシル、5mg/Lチアミン-HClを含有するM9最少培地（グルコース5 g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に塗布した。出現したコロニーを全て集菌し、混合物としてプラスミドを抽出し、このプラスミド混合物でP. ananatisのＬ−グルタミン酸生産菌であるNP106株を形質転換した。出現したクローンについて中性条件で試験管培養を行い、G106S株と同等のＬ−グルタミン酸収率を示す株をNA1とした。また本菌株よりプラスミドを抽出しこれをprpC, gdh, ppc強化用プラスミドRSFPPGとした。Ｌ−グルタミン酸生産菌であるパントエア・アナナティスNP106株に前記プラスミドRSFPPGを導入し、Ｌ−グルタミン酸生産菌NP106/RSFPPG（本菌株を「NA1株」と呼ぶ）を構築した。

NP106株は、以下のようにして得られた。先に例示したパントエア・アナナティスAJ13601株を、L培地（バクトトリプトン10 g/L、イーストエキストラクト 5 g/L、NaCl 5 g/L、pH7.0）に、最少培地成分（グルコース5g/L、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g/L、塩化ナトリウム0.5g/L、塩化アンモニウム1g/L、リン酸2ナトリウム6g/L）を添加した液体培地（以下、「LBGM9培地」と記載する。）で34℃にて終夜振とう培養を行い、１プレートにつき100〜200コロニーとなるよう希釈し、テトラサイクリン12.5mg/Lを含むLBGM9プレートに塗布した。出現したコロニーについて、テトラサイクリン12.5mg/L、及びクロラムフェニコール25mg/Lを含むLBGM9プレートにレプリカし、クロラムフェニコール感受性となった株を選択し、pSTVCBが脱落した菌株を取得し、G106Sと命名した。さらに、G106S株を、LBGM9液体培地で34℃にて終夜振とう培養を行い、１プレートにつき100〜200コロニーとなるよう希釈し、薬剤を含まないLBGM9プレートに塗布した。出現したコロニーについて、テトラサイクリン12.5mg/Lを含むLBGM9プレート及び薬剤を含まないLBGM9プレートにレプリカし、テトラサイクリン感受性となった株を選択し、RSFCPGが脱落した菌株を取得し、NP106と命名した。こうして得られたNP106株はAJ13601株が保持する２つのプラスミドRSFCPGとpSTVCBの両方を持たない株である。
G106S株は、同様にして、AJ13601株からpSTVCBのみを脱落させた株である。

〔実施例１〕gcd遺伝子欠損株によるＬ−グルタミン酸生産
（１）gcd遺伝子欠損株の構築
配列番号３３及び３４に示す合成DNAプライマー２本を通常の方法で合成した。
配列番号３３に示すプライマーは、パントエア・アナナティスのgcd遺伝子上流の相同配列にλattL-Km^r-λattRの５’端の相同配列が続くという構成になっている。配列番号３４のプライマーは、パントエア・アナナティスのgcd遺伝子下流の相補配列に、λattL-Km^r-λattRの３’端の相補配列が続くという構成になっている。これらのプライマーを用い、pMW118-(λattL-Km^r-λattR)を鋳型としてPCRを行なうことにより、λattL-Km^r-λattRの配列の５’端にgcd遺伝子上流の相同配列がつながり、λattL-Km^r-λattRの配列の３’端にgcd遺伝子下流の相同配列がつながる、約1.5kbpの断片を増幅した。

上記PCR断片を精製し、パントエア・アナナティス染色体へのλ依存インテグレーションに用いた。ヘルパープラスミドRSF-Red-TERを、λファージRed遺伝子の担体として使用した。パントエア・アナナティスのエレクトロコンピテント細胞を得るために、RSF-Red-TERプラスミドでSC17(0)株を形質転換し、50μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB培地で34℃で一夜培養した。続いて、培養液を50μg/mlのクロラムフェニコールを含む新鮮なLB培地で100倍に希釈し、OD₆₀₀が0.3になるまで34℃で通気下で生育させた。その後、IPTGを1mM添加し、OD₆₀₀が0.7になるまで培養を続けた。10mLの培養液中の菌体を等量の冷10%グリセロールで３回洗浄し、80μlの冷10%グリセロールに懸濁させた。上記PCR産物を10μlの脱イオン水に溶解させ、100〜200ngのPCR断片を細胞懸濁液に加えた。作業は、細菌エレクトロポレーション装置（「BioRad」米国、カタログ番号165-2089, バージョン2-89）を用いて行った。使用したパルスのパラメータは、電界強度：18kV/cm、パルス時間：5m秒であった。

エレクトロポレーション後、直ちにグルコース（0.5%）を補填した1mlのLB培地を細胞懸濁液に加えた。そして、細胞を34℃で２時間通気下で生育させ、40mg/Lカナマイシンを含むL培地（バクトトリプトン10g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）にて選択し、約20個のコロニーを形質転換体として取得した。gcd遺伝子領域にカナマイシン耐性遺伝子の断片が挿入されたことを、配列番号３５と配列番号３６に示される合成DNAプライマー2本を用いたPCRにより確認し、断片の挿入が確認できた菌株をSC17(0)::Δgcdと名付けた。この菌株からゲノムDNAを抽出し、エレクトロポレーションによりNA1株を形質転換した。

SC17(0)::ΔgcdのゲノムDNAを導入したNA1株を、40mg/Lのカナマイシン、12.5mg/Lのテトラサイクリン塩酸塩、及び寒天15 g/Lを添加したLBGM9培地プレートにて選択し、約20個のコロニーを形質転換体として取得した。これらの株はすべてgcd遺伝子領域にλattL-Km^r-λattRの断片が挿入されており、そのうちの１クローンを選び、NA1::Δgcdと名付けた。

（２）gcd遺伝子欠損株のＬ−グルタミン酸生産能評価
gcd遺伝子の欠損が、Ｌ−グルタミン酸生産に与える影響を検討するため、NA1::Δgcd株とNA1株を用いて、Ｌ−グルタミン酸生産培養を行った。
培養は、菌体を形成させる種培養と、Ｌ−グルタミン酸を生成する本培養の２段階に分けて行った。
種培養は以下の培地組成にて行った。

〔種培養培地組成〕
シュークロース 50g/L
MgSO₄・7H₂O 0.4g/L
GD113（消泡剤） 0.1mL/L
(NH₄)₂SO₄ 4.0g/L
KH₂PO₄ 2.0g/L
イーストエキストラクト 4.0g/L
FeSO₄・7H₂O 0.01g/L
MnSO₄・5H₂O 0.01g/L
クエン酸 0.02g/L
Ｌ−リジン塩酸塩 0.4g/L
DL-メチオニン 0.4g/L
ε−ジアミノピメリン酸 0.4g/L
パントテン酸カルシウム 18mg/L
テトラサイクリン塩酸塩 12.5mg/L
120℃、20分間蒸気滅菌を行った。

NA1::Δgcd株とNA1株を、12.5mg/Lテトラサイクリン、及び寒天15 g/Lを加えたLBGM9培地プレートで前培養し、プレート1枚分を上記の組成の種培養培地を300mL張り込んだ1L容ミニジャーに植菌し、34℃、pH6.0にて、通気1/1vvm、酸素濃度が3％以上になるように制御して約12時間攪拌培養を行った。培養中のpHは6.0となるようにアンモニアガスを添加することにより調整を行った。培地中の糖の枯渇を指標に種培養を終了した。
本培養培地組成は以下に示す。

〔培養培地組成〕 (20%種培養液を植菌した後の濃度)
グルコース 100g/L
MgSO₄・7H₂O 0.4g/L
GD113 0.1mL/L
(NH₄)₂SO₄ 5.0g/L
KH₂PO4 6.0g/L
イーストエキストラクト 6.0g/L
FeSO₄・7H₂O 0.02g/L
MnSO₄・5H₂O 0.02g/L
クエン酸 0.02g/L
ベタイン ^* 2.0g/L
Ｌ−リジン塩酸塩 0.8g/L
DL-メチオニン 0.6g/L
ε−ジアミノピメリン酸 0.6g/L
パントテン酸カルシウム 18mg/L
テトラサイクリン塩酸塩 25mg/L
*：N-N-N-トリメチルグリシン

種培養で得られた菌体60mLを上記の組成の本培養培地を240mL張り込んだ1L容ミニジャーに注入し、温度34℃、36℃または38℃にて、pH4.9で培養を行った。培地中のグルコースを全て消費した時点で培養を終了した。Ｌ−グルタミン酸濃度は、培養液上清を適当倍率に水で希釈した後に、バイオテックアナライザー（AS-210 サクラエスアイ(株)）により測定した。

結果を、表１に示す。gcd欠損株であるNA1::Δgcd株は、比較対照株NA1株と比べ、Ｌ−グルタミン酸の蓄積が向上することが判明した。

〔実施例２〕gcd遺伝子欠損株によるＬ−システイン生産
（１）Ｌ−システイン生産菌の構築
P. ananatisにおいてgcd遺伝子欠損のＬ−システイン生産に及ぼす効果を調べるために、Ｌ−システイン生産菌を構築した。

（１−１）yeaS遺伝子発現プラスミドの構築
まず、上記菌株を構築するためのプラスミドを構築した。その方法を以下に示す。
E. coli MG1655（ATCC No.47076）の染色体DNAをテンプレートとしてP11（agctgagtcg acccccagga aaaattggtt aataac：配列番号５１）、及びP12（agctgagcat gcttccaact gcgctaatga cgc：配列番号５２）をプライマーとして用いたPCRによってnlpD遺伝子のプロモーター領域（以下、野生型nlpD遺伝子プロモーターを「Pnlp0」と記載する。）約300bpを含むDNA断片を取得した。これらプライマーの5’末端、３’末端には制限酵素SalI及びPaeIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。得られた断片をSalI及びPaeIで処理し、pMIV-5JS（特開2008-99668）のSalI−PaeIサイトに挿入し、プラスミドpMIV-Pnlp0を取得した。このpMIV-Pnlp0プラスミドに挿入されたPnlp0プロモーターのPaeI-SalI断片の塩基配列は配列番号４１に示したとおりである。

次に、MG1655の染色体DNAをテンプレートとして、P13（agctgatcta gaaaacagaa tttgcctggc ggc：配列番号５３）、及びP14（agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc：配列番号５４）をプライマーとして用いたPCRによってrrnB遺伝子のターミネーター領域約300bpを含むDNA断片を取得した。これらプライマーの5’末端には制限酵素XbaI及びBamHIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、59℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。得られた断片をXbaI及びBamHIで処理し、pMIV-Pnlp0のXbaI−BamHIサイトに挿入しプラスミドpMIV-Pnlp0-terを取得した。

続いてMG1655の染色体DNAをテンプレートとして、P15（agctgagtcg acgtgttcgc tgaatacggg gt：配列番号５５）、及びP16（agctgatcta gagaaagcat caggattgca gc：配列番号５６）をプライマーとして用いたPCRによってyeaS遺伝子を含む約700bpのDNA断片を取得した。これらプライマーの5’末端には制限酵素SalI及びXbaIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。得られた断片をSalI及びXbaIで処理し、pMIV-Pnlp0-terのSalI−XbaIサイトに挿入しプラスミドpMIV-Pnlp0-YeaS3を取得した。こうして、pMIV-5JSベクター上に、nlpDプロモーター、yeaS遺伝子、及びrrnBターミネーターが、この順に繋がったyeaSの発現ユニットが構築された。

nlpDプロモーターの-10領域を改変することでより強力なプロモーターとするため、以下の手法で-10領域のランダム化を行った。nlpDプロモーター領域（図３）には、２箇所のプロモーターとして機能すると推定される領域が存在し、それぞれ図中ではpnlp1、pnlp2と示してある。プラスミドpMIV-Pnlp0をテンプレートとして、P11及びP17（atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgc acggtnatna ngtcactgg（"n"- はa,t,g,cのいずれでも良いことを意味する）：配列番号５７）をプライマーとして用いたPCRによってnlpDプロモーターの３’末端側に含まれる-10領域(-10(Pnlp1)と記載)をランダム化したDNA断片を取得した（図３）。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。

一方、同様にプラスミドpMIV-Pnlp0をテンプレートとして、P12及びP18（tggaaaagat cttcannnnn cgctgacctg cg（"n"- はa,t,g,cのいずれでも良いことを意味する）：配列番号５８）をプライマーとして用いたPCRによってnlpDプロモーターの５’末端側に含まれる-10領域（-10(Pnlp2)と記載）をランダム化したDNA断片を取得した（図３）。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。

得られた３’末端側と５’末端側の断片は、プライマーP17とP18にデザインされてあるBglIIサイトによってつなぎ合わせることができ、2箇所の-10領域がランダム化されたnlpDプロモーター全長を構築することができる。この断片をテンプレートとして、P11及びP12をプライマーとして用いたPCRによって改変型nlpDプロモーター全長のDNA断片を取得した。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 15秒を12サイクル、最後に72℃ 5分。

増幅断片を、プライマーの5’末端にデザインされている制限酵素SalI及びPaeIで処理し、同じくSalI及びPaeIで処理したプラスミドpMIV-Pnlp0-YeaS3に挿入することで、プラスミド上の野生型nlpDプロモーター部位（Pnlp0）を変異型Pnlpと置き換えた。その中から図３に示すプロモーター配列（Pnlp8）を持つものを選び、pMIV-Pnlp8-YeaS7とした。このプラスミドに挿入されたPnlp8プロモーターのPaeI−SalI断片の塩基配列は配列番号４２に示したとおりである。

（１−２）変異型cysE発現プラスミドの構築
次に、pMW-Pomp-cysE5（WO2005007841）からPaeI、SacIでPomp-cysE5カセット部分を切り出し、pMIV-5JSの同じサイトに挿入、pMIV-Pomp-CysE5を構築した。pMW-Pomp-cysE5は、ompC遺伝子プロモーターに連結された変異型SATをコードする遺伝子cysE5をpMW118に挿入して得られたプラスミドである。pACYC184（GenBank/EMBL accession number X06403、ニッポンジーンから購入可能）から、XbaI、Eco88Iでテトラサイクリン耐性遺伝子を切り出し、同遺伝子断片をKlenow fragmentで処理をした後、pMIV-Pomp-CysE5のPvuIサイトに挿入し、pMT-Pomp-CysE5を構築した。続いて、pMIV-Pnlp8-YeaS7をHindIIIで消化し、Klenow fragmentで平滑末端化した後、NcoIで消化して、Pnlp8-YeaS-rrnBターミネーターのカセットとクロラムフェニコール耐性マーカーを含む断片を切り出した。この断片を、同じくpMIV-5JSをバックボーンにもつpMT-Pomp-CysE5のSmaI、NcoI切断断片と繋ぎ合わせ、pMT-EY2を構築した。pMT-EY2は、Pnlp8-YeaS-rrnBターミネーターカセットと、Pomp-CysE5カセットを一つのプラスミド上に持つプラスミドである。

（１−３）P. ananatis SC17株へのcysE5、yeaSの導入
先述のpMT-EY2は、pMIV-5JS（特開2008-99668）に由来するMuファージのアタッチメントサイトを備えている。このプラスミドをMu transposaseを持つヘルパープラスミドpMH10（Zimenkov D. et al., Biotechnologiya (in Russian), 6, 1-22 (2004)）と同一細胞内で共存させることにより、このpMT-EY2プラスミド上でMuファージのアタッチメントサイトに挟まれる形で存在するクロラムフェニコール耐性マーカーを含むPompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB terminatorのカセットを、P. ananatis SC17株（米国特許6596517）の染色体上に挿入することができる。さらに、pMT-EY2プラスミド上に存在するクロラムフェニコール耐性マーカーは、2つのλファージのアタッチメントサイト（λattRとλattL）間に挟まれる構造を持っているため、後述の方法によりクロラムフェニコール耐性マーカーを切り出し除去することができる。

まず、SC17株にエレクトロポレーションによりpMH10が導入された株を、20mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地にて30℃で一晩培養することにより選択した。得られた形質転換株を30℃で培養し、さらにこの株にエレクトロポレーションによりpMT-E2を導入した。このpMH10とpMT-EY2の両方で形質転換された株に、42℃、20分間の条件でヒートショックを与えた後、20mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地にてクロラムフェニコール耐性株のコロニーを選択した。このとき培養温度は39℃とした。このようにして、約50クローンを取得し、それぞれをLB寒天培地で39℃、48時間培養することで、pMH10及びpMT-EY2のキュアリングを行った。染色体上にカセットが挿入されたことによりクロラムフェニコール耐性を示し、かつ、両プラスミドをキュアリングした結果カナマイシン及びアンピシリン感受性を示す株を取得した。さらに、この株の染色体DNAを鋳型として、P11とP16をプライマーとして用いたPCRにより、得られた株の染色体上に目的のカセットが挿入されていることを確認した。得られた全クローンをそれぞれEY01〜EY50と命名し、EY01〜EY50株のＬ−システイン生産培養を行った。培養は後述の方法を用いた。その結果、最も多くＬ−システインを生産したクローンであるEY19株を選抜した。

EY19株に導入されたクロラムフェニコール耐性マーカーを、ラムダファージ由来の切り出しシステムによって除去した。具体的には、ラムダファージのInt-Xis遺伝子を搭載したpMT-Int-Xis2（WO2005/010175）でEY19株を形質転換し、得られた形質転換株からクロラムフェニコール感受性を示すEY19(s)株を取得した。
（１−４）EY19(s)株からのcysPTWA遺伝子発現強化株の作製
次に、cysPTWA遺伝子の発現を強化させるため、染色体上のcysPTWA遺伝子クラスターの上流に存在するプロモーターを、先述の強力なプロモーターPnlp8に置換した。まずpMIV-Pnlp8-YeaS7をテンプレートに、P11及びP12を用いたPCRによってnlp8プロモーター約300bpを含むDNA断片を取得した。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、59℃ 20秒、72℃ 15秒を20サイクル、最後に72℃ 5分。

増幅されたnlp8プロモーターを含むDNA断片をKlenowフラグメントで処理し、XbaIで切断後にKlenowフラグメントで処理されたプラスミドpMW118-(λattＬ−KmR-λattR)（WO2006/093322A2）に挿入し、プラスミドpMW-Km-Pnlp8を取得した。pMW-Km-Pnlp8をテンプレートに使用し、プライマーP19（tccgctcacg atttttttca tcgctggtaa ggtcatttat cccccaggaa aaattggtta：配列番号５９）、及びP20（tttcacaccg ctcaaccgca gggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag ttg：配列番号６０）を用いたPCRによって、Km-Pnlp8カセットを含む約1.6kbのDNA断片を増幅した。このときのPCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、54℃ 20秒、72℃ 90秒を30サイクル、最後に72℃ 5分。両プライマー上にはλ依存インテグレーション（「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645））によって目的の断片を挿入するための染色体上のターゲットとなる配列（この場合はcysPTWAのプロモーター近傍の配列）がデザインされている。そのため、取得されたDNA断片を目的の菌株にこのλ依存インテグレーションによって挿入した場合には、染色体上のcysPTWA遺伝子の直前にKm-Pnlp8が挿入され、nlp8プロモーターにcysPTWA遺伝子が連結される構造となる。cysPTWA遺伝子クラスターの塩基配列を配列番号４３に、cysP、cysT、cysWの各遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を配列番号４４〜４６に示す。cysA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４７、４８に示す。

P. ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER株は、λ依存インテグレーションを効率よく行うためのホスト菌株であり、λRed遺伝子産物に耐性なP. ananatis菌株であるSC17(0)株にλのgam、bet及びexoの各遺伝子（以下、「λRed遺伝子」）を発現するヘルパープラスミドRSF-Red-TERが導入された菌株である(WO2008/075483)。SC17(0)株は、2005年9月21日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。また、このRSF-Red-TERプラスミドの構築方法はWO2008/075483に詳細に記載されている。

上記SC17(0)/RSF-Red-TER株を、λRed遺伝子発現誘導のためIPTGを添加した条件で培養して、エレクトロポレーション用の細胞を調製した。これらの細胞に、上述の目的のDNA断片をエレクトロポレーションにて導入し、カナマイシン耐性を指標にλ依存インテグレーションによりcysPTWA遺伝子上流にnlp8プロモーターが挿入された組み換え株を取得した。取得された株の染色体DNAをテンプレートに、P21（ctttgtccct ttagtgaagg：配列番号６１）、P22（agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac：配列番号６２）をプライマーに用いたPCRにて、目的のKm-Pnlp8-cysPTWAの構造が形成されていることを確認し、この株をSC17(0)-Pnlp8-PTWA株と命名した。

次に、SC17(0)-Pnlp8-PTWA株の染色体DNAを精製し、この染色体DNA 10μgをエレクトロポレーション法によりEY19(s)株に導入し、カナマイシン耐性株を取得した。得られた株の染色体DNAを鋳型として、P21 、P22をプライマーとして用いたPCRによる増幅を行い、EY19(s)株の染色体にKm-Pnlp8-cysPTWAの構造が導入されたことを確認した。こうして取得された株をEYP197株と命名した。さらに上述のpMT-Int-Xis2を用いたカナマイシン耐性マーカーの染色体上からの除去を行い、カナマイシン感受性となった株をEYP197(s)株と命名した。

（１−５）EYP197(s)株からの変異型３−フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ（serA348）遺伝子搭載株の作製
Ｌ−システイン生産菌に導入する３−フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼとして、パントエア・アナナティス由来の３−フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であって、348位のアスパラギン残基がアラニンに置換した変異型酵素(N348A)をコードするserA348遺伝子（J. Biol. Chem. 1996; 271(38):23235-8）を以下の方法で構築した。

パントエア・アナナティス由来の野生型serA遺伝子の配列を配列番号４９に示す。同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号５０に示す。上記変異が導入されたserA遺伝子の３’側DNA断片を得るため、SC17株染色体DNAをテンプレートに、P23（agctgagtcg acatggcaaa ggtatcactg gaa：配列番号６３）及びP24（gagaacgccc gggcgggctt cgtgaatatg cagc：配列番号６４）をプライマーに用いたPCR（95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 60秒を25サイクル、最後に72℃ 5分）を行った。次に同様にして変異が導入された５’側DNA断片を得るため、SC17株染色体DNAをテンプレートに、P25（agctgatcta gacgtgggat cagtaaagca gg：配列番号６５）、及びP26（aaaaccgccc gggcgttctc ac：配列番号６６）をプライマーに用いたPCR（95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 20秒を20サイクル、最後に72℃ 5分）を行った。得られた両PCR断片を制限酵素SmaIにより処理した後、DNAライゲースによるライゲーションにより連結し、目的の変異（N348A）を含む変異型serA遺伝子全長のDNA断片を得た。このDNA断片をテンプレートとし、P23とP25をプライマーに用いてPCR増幅（95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 75秒を15サイクル、最後に72℃ 5分）を行った。P23およびP25プライマーにデザインされているSalI、XbaI制限酵素サイトをSalI、XbaIで処理した後、同じくSalI、XbaI で処理したpMIV-Pnlp8-terに挿入し、pMIV-Pnlp8-serA348を作製した。

構築されたpMIV-Pnlp8-serA348にはpMIV-5JS（特開2008-99668）に由来するMuのアタッチメントサイトが搭載されている。このプラスミドを用いれば、先述のとおり、Mu transposaseを持つヘルパープラスミドpMH10を用いることで、クロラムフェニコール耐性マーカーを含むPnlp8-serA348-rrnB terminatorのカセットをP. ananatis SC17株の染色体上に挿入することができる。SC17(0)株にpMIV-Pnlp8-serA348プラスミドおよびpMH10を導入し、染色体にPnlp8-serA348-rrnB terminatorのカセットが挿入された株を取得した。プライマーP11、P25を用いたPCRにより、目的のカセットが細胞中に存在することを確認した。得られた５０クローンについて、細胞抽出液中の３−フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ活性を測定し、最も活性の高かった菌株を選抜し、SC17int-serA348株と命名した。次に、SC17int-serA348株の染色体DNA 10μgをエレクトロポレーションによりEYP197(s)株に導入し、クロラムフェニコール耐性株を取得し、プライマーP11 、P25を用いたPCRにより、EYP197(s)株の染色体にクロラムフェニコール耐性マーカーと共にPnlp8-serA348の構造が導入されたことを確認した。こうして取得された株をEYPS1976株と命名した。
先述のpMT-Int-Xis2を用いたマーカー除去の方法により、クロラムフェニコール耐性マーカーの除去を行い、クロラムフェニコール感受性となった株をEYPS1976(s)株と命名した。

（１−６）EYPS1976(s)株からのgcd遺伝子欠損株の作製
実施例１に記載のSC17(0)::Δgcd株よりゲノムDNAを調製し、エレクトロポレーションによりEYPS1976(s)株に導入し、カナマイシン耐性を指標にEYPS1976(s)株からgcd欠損株（EYPS1976Δgcd株）を取得した。

(２)Ｌ−システイン生産菌EYPS1976(s)株とEYPS1976Δgcd株の培養
gcd遺伝子欠損がＬ−システイン及びＬ−システインの前駆体であるO-アセチルセリンの発酵生産に及ぼす効果を調べるため、Ｌ−システイン生産菌EYPS1976(s)株とこれより誘導されたgcd欠損株EYPS1976Δgcd株による発酵生産培養を行い、生産されるＬ−システイン及びO-アセチルセリンの量を比較した。培養には下記組成のＬ−システイン生産培地を用いた。

〔Ｌ−システイン生産培地〕（各成分の濃度は最終濃度）
成分１：
(NH₄)₂SO₄ 15g/L
KH₂PO₄ 1.5g/L
MgSO₄・7H₂O 1g/L
チアミン塩酸塩 0.1mg/L
成分２：
FeSO₄・7H₂O 1.7mg/L
Na₂MoO₄・2H₂O 0.15mg/L
CoCl₂・6H₂O 0.7mg/L
MnCl・4H₂O 1.6mg/L
ZnSO₄・ 7H₂O 0.3mg/L
CuSO₄・5H₂O 0.25mg/L
成分３：
トリプトン 0.6g/L
イーストエクストラクト 0.3g/L
塩化ナトリウム 0.6g/L
成分４：
炭酸カルシウム 20g/L
成分５：
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物 135mg/L
成分６：
チオ硫酸ナトリウム 6g/L
成分７：
ピリドキシン塩酸塩 2mg/L
成分８：
グルコース 40g/L

各成分について、それぞれ10倍（成分１）、1000倍（成分２）、100/6倍（成分３）、100倍（成分５）、350g/L（成分６）、1000倍（成分７）、10倍（成分８）のストック溶液を作製しておき、使用時に混合し、滅菌水で規定の量までメスアップして最終濃度とした。殺菌は、110℃、30分のオートクレーブ（成分１、２、３、５、８）、180℃、5時間以上の乾熱滅菌（成分４）、及びフィルター滅菌（成分６、７）により行った。

Ｌ−システイン生産培養は以下の手順で行った。EYPS1976(s)株とEYPS1976Δgcd株をLB寒天培地に塗り広げ、34℃で一晩前培養を行った後、10マイクロリッターサイズの植菌用ループ（NUNC社ブルーループ）でプレート上約7cm分の菌体を2回掻き取り、大試験管（内径23mm、長さ20cm）に2ml張りこんだＬ−システイン生産培地中に植菌し、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調製した。

34℃及び38℃それぞれにて振とう培養を行い、24時間後に培養を終了した。この時点で炭素源であるグルコースを完全に消費し終わっていることが確認された。培地中に生産されたＬ−システインの定量はGaitonde, M.K.（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33.）に記載の方法で行った。また、培地中に生産されたOAS（O-アセチルセリン）の定量はHPLCによって行った。その際、サンプルを200 mMのTris-HCl（pH9.0）で希釈することでOASをより安定なNAS（N-acetylserine）に変換して検出する方法をとった。HPLCの条件は次の通りである。

カラム：Inertsil ODS-3（疎水性カラム/GLサイエンス社製）
バッファー流速：1.0mL/min
カラム温度：40℃
検出器：UV210nm
サンプルアプライ量：10mL
バッファー：0.1M KH₂PO₄・H₃PO₄（pH2.2）、5mM 1-オクタンスルホン酸Na。

各株とも6連で実験を行い、各平均値と標準偏差を表２に示した。表２に示したとおり、gcd欠損は34℃、38℃いずれの培養温度においてもＬ−システインとO-アセチルセリンを増加させる効果があることがわかった。この増加の幅は38℃でより顕著であり、高温での培養において特に大きな効果があることがわかった。また、38℃では菌量（OD）を増やす効果があることもわかった。

〔配列表の説明〕
配列番号１：パントエア・アナナティスのgcd遺伝子の塩基配列
配列番号２：パントエア・アナナティスのGCDのアミノ酸配列
配列番号３：パントエア・アナナティスのhisD遺伝子の塩基配列
配列番号４：Km^r遺伝子のhisD遺伝子への組込みのための断片の増幅用プライマー
配列番号５：Km^r遺伝子のhisD遺伝子への組込みのための断片の増幅用プライマー
配列番号６：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号７：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号８：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号９：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号10：PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号11：PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号12：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号13：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号14：PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号15：PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号16：attL増幅用プライマー
配列番号17：attL増幅用プライマー
配列番号18：attLの塩基配列
配列番号19：attR増幅用プライマー
配列番号20：attR増幅用プライマー
配列番号21：attRの塩基配列
配列番号22：bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号23：bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号24：ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号25：ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号26：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片の塩基配列
配列番号27：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号28：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号29：gltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号30：gltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号31：prpC遺伝子増幅用プライマー
配列番号32：prpC遺伝子増幅用プライマー
配列番号33：gcd欠損用プライマー
配列番号34：gcd欠損用プライマー
配列番号35：gcd欠損確認用プライマー
配列番号36：gcd欠損確認用プライマー
配列番号37：野生型cysE遺伝子の塩基配列
配列番号38：野生型cysEがコードするセリンアセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号39：野生型yeaS遺伝子の塩基配列
配列番号40：野生型YeaSのアミノ酸配列
配列番号41：Pnlp0の塩基配列
配列番号42：Pnlp8の塩基配列
配列番号43：cysPTWA遺伝子クラスターの塩基配列
配列番号44：cysP遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号45：cysT遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号46：cysW遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号47：cysA遺伝子の塩基配列
配列番号48：cysA遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号49：パントエア・アナナティス野生型serA遺伝子の塩基配列
配列番号50：パントエア・アナナティス野生型serA遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号51〜66：プライマーP11〜P26

Claims (6)

1. 腸内細菌科に属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を培地で培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法であって、前記細菌は本来的にピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素の活性を有するが、同酵素をコードするgcd遺伝子が不活化されたことにより同酵素の活性が低下するように改変された細菌であり、パントエア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、モルガネラ属、及びイェルシニア属から選ばれる属に属する細菌である、Ｌ−アミノ酸の製造法。
2. 前記gcd遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインからなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸又はＬ−システインである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸であり、前記細菌がクエン酸シンターゼ、メチルクエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−システインであり、前記細菌が３-フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系から選択される少なくとも１種又は２種以上の活性、及び／又は、yeaS遺伝子の発現が増強されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
   

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