WO2000018935A1 - Procede de construction d'une bacterie produisant des acides amines, et procede de production d'acides amines par une technique de fermentation utilisant ladite bacterie - Google Patents

Procede de construction d'une bacterie produisant des acides amines, et procede de production d'acides amines par une technique de fermentation utilisant ladite bacterie Download PDF

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amino acid
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Yoko Asakura
Jun Nakamura
Sohei Kanno
Mikiko Suga
Eiichiro Kimura
Hisao Ito
Kazuhiko Matsui
Tsuyoshi Ohsumi
Tsuyoshi Nakamatsu
Osamu Kurahashi
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Ajinomoto Co.,Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression

Definitions

  • a method for constructing an amino acid-producing bacterium and a method for producing an amino acid by an enzymatic method using the constructed amino acid-producing bacterium BACKGROUND OF THE INVENTION
  • the present invention relates to a method for constructing a mutant strain having the ability to produce amino acids in high yield.
  • the present invention relates to a method for producing L-amino acids by fermentation methods using the same and its mutants. There are roughly two ways to construct mutant strains used for amino acid production by fermentation.One is to introduce a mutation into MA randomly using a chemical mutagen, and the other is This is a method using replacement.
  • the productivity of the target substance was improved by strengthening genes in the metabolic pathways involved in the biosynthesis of the target substance or weakening the genes of enzymes involved in degradation.
  • a strain can be developed.
  • a method for enhancing the target gene a plasmid capable of autonomous replication independently of a chromosome in a cell has been mainly used.
  • the degree of enhancement of the target gene is determined by the copy number of the plasmid itself. Depending on the type of the target gene, the copy number is too high and the expression level is too high, so that growth is significantly suppressed, Conversely, there are many cases where the ability to produce the target substance is reduced. In such a case, the degree of enhancement of the target gene can be reduced by using a plasmid with a low copy number, but the type of plasmid is often limited and the target gene is limited. It is not possible to freely control the expression level of the gene.
  • Another problem is that the replication of the plasmid is often unstable, and the plasmid is lost.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 6-26885 discloses a DNA fragment containing a glutamate dehydrogenase (GDH) producing gene (glutamic acid dehydrogenase gene) derived from a glutamate-producing coryneform bacterium. And genes required for autonomous replication in cells.
  • GDH glutamate dehydrogenase
  • a recombinant DNA containing a DNA fragment (plasmid) is disclosed. By introducing this recombinant DNA into cells, a GDH-enriched strain can be bred, and a substance (amino acid) It is disclosed that the production can be improved.
  • Japanese Patent No. 2520895 discloses that the above recombinant DNA is transferred to Corynebacterium to prepare a strain with enhanced enzymatic activity.
  • the company has produced minic acid, but its production and yield are still unsatisfactory, and it is hoped that the productivity of L-glutamic acid will be further improved.
  • the request was to transfer a recombinant DNA containing two genes, a glutamate dehydrogenase gene and a glutamate dehydrogenase gene (ICDH), from a glutamate-producing coryneform bacterium to a glutamate-producing coryneform bacterium. By doing so, the company has achieved this.
  • JP-A-6-502548 discloses a Corynebacterium strain and a second DNA encoding a first functional DNA sequence, amino acid, polypeptide and / or protein for expression in the strain. And a secretion cassette comprising a third DNA sequence inserted between the first and second DNA sequences, wherein the third DNA sequence is amino acid, polypeptide and / or A corynepacteria expression and secretion system characterized by encoding a protein element selected from PS1 or PS2 that ensures protein secretion is disclosed. Specifically, the secretion of polypeptides is disclosed.
  • Corynebacterium strains are subjected to NTG mutagenesis and resistant to the glutamate analog, 4-fluoroglutamate 4-fluoroglutaunate (4FG).
  • a strain which gives G.sup.3 is selected and subjected to transformation with pCGL141, and it is disclosed that a strain with enhanced GDH expression can be obtained from the above-mentioned analog-resistant strain.
  • the nucleotide sequences 251 to 266 of the GDH promoter are mutated.
  • the present invention provides a method for appropriately enhancing the expression level of a target gene without using plasmid. It is an object of the present invention to provide a method for constructing a mutant strain capable of producing an amino acid at a high yield by gene recombination or mutation.
  • An object of the present invention is to provide a promoter for GDH which can impart the ability to produce glumic acid in a high yield to a corynebacterium strain without causing a significant increase in by-product aspartic acid and alanine. With the goal.
  • Another object of the present invention is to provide a GDH gene having the above GDH promoter sequence.
  • Another object of the present invention is to provide an L-glutamic acid-producing Corynebacterium strain having the above gene.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an amino acid by a fermentation method using a constructed amino acid-producing bacterium.
  • An object of the present invention is to provide a glutamate fermentation method that uses a coryneform glutamate-producing bacterium, improves the yield of glutamate, and produces glutamate at lower cost. .
  • the present invention has been made based on the finding that the above problems can be efficiently solved by variously modifying the promoter of the amino acid biosynthesis system gene on the chromosome and adjusting the expression level of the target gene. It is a thing. In particular, it has been made based on the finding that the above problem can be efficiently solved by introducing a specific mutation into the 35 and / or 110 regions, which are specific regions of the promoter. is there.
  • the present invention relates to a method for introducing a mutation into a promoter sequence of an amino acid or a nucleic acid biosynthesis gene on a chromosome of a coryneform bacterium so as to approach a consensus sequence or introducing the mutation by genetic recombination.
  • Preparation of a coryneform bacterium with improved ability to produce amino acids or nucleic acids comprising preparing a mutant of a type bacterium and culturing the mutant to collect a mutant having a high yield of the target amino acid or nucleic acid.
  • the present invention also relates to at least one DNA sequence selected from the group consisting of CGGTCA, TTGTCA, TTGACA and TTGCCA in the 135 region and / or the TATAAT sequence or the ATAAT base of the sequence in the 10 region.
  • Base-substituted, promoter function To provide a promoter for a gene for the production of glumic acid dehydrogenase (GDH), characterized by having a sequence that does not inhibit E. coli.
  • the present invention also provides a glutamate dehydrogenase producing gene having the above promoter.
  • the present invention also provides a coryneform L-glutamic acid producing bacterium having the above gene.
  • the present invention also relates to a method for culturing a coryneform bacterium having an improved ability to produce an amino acid or nucleic acid constructed by the above method in a medium, producing and accumulating the target amino acid or nucleic acid in the medium, and collecting the target amino acid or nucleic acid from the medium And a method for producing the amino acid or nucleic acid by a fermentation method.
  • the present invention also provides a method for culturing coryneform L-glutamic acid-producing bacteria having resistance to 4-fluoroglutamic acid in a liquid medium, producing and accumulating L-glutamic acid in the medium, and collecting the L-glutamic acid from the medium.
  • a method for producing L-glucaminic acid by a fermentation method BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows a construction flow of a GDH gene having a mutant promoter.
  • FIG. 2 shows a construction flow of a CS gene having a mutant promoter.
  • FIG. 3 shows a construction flow of a shuttle vector having lacZ as a repo overnight gene.
  • the coryneform glutamate-producing bacterium referred to in the present invention includes a bacterium that has been conventionally classified into the genus Brevipacterium but is now integrated as a bacterium of the genus Corynepacterium (Int. J. Syst. Bacteriol). , 41, 255 (1981)), and also includes bacteria of the genus Brevipacterium which is very closely related to the genus Corynepacterium. Therefore, the mutant strain used in the present invention can be derived from the following coryneform glutamic acid-producing bacteria belonging to the genus Brevipacterium or Corynepacterium. In this specification, Unless glumic acid productivity is mentioned, the genus Corynebacterium and Brevipacterium may simply be referred to as coryneform bacteria.
  • Any amino acid may be used as the target substance as long as the genes involved in biosynthesis and their promoters are known.
  • enzymes involved in biosynthesis include, in the case of glutamic acid fermentation, GDH, citrate synthase (CS), isoquenate synthase (ICDH), pyruvate dehydrogenase (PDH), and nicotine.
  • Aze ACO is effective.
  • AK aspartate power rice
  • AK dihydrodipicolinate synthase
  • dihydrodibiconate reductase diaminobimerate dehydrogenase
  • diaminopimelate decarboxylase diaminopimelate decarboxylase
  • lysE gene lysine excretion protein involved in lysine membrane excretion is also effective.
  • N-acetylglutamic acid synthase In arginine fermentation, N-acetylglutamic acid synthase, Luminic acid kinase, N-acetyl gluminyl reductase, acetylolnitin aminotransferase, N-acetyl ornitinase, orditin rubamyltransferase, argininosuccinate synthase and Produced in reactions catalyzed by argininosuccinidase. And these enzymes are effective. These enzymes are encoded by the argA, argB, argC, argD, argE, argF, argG, and argH genes, respectively.
  • enzymes such as 3-phosphoglycerate dehydrogenase, phosphoserine transaminase, and phosphoserine phosphatase are effective.
  • sugar metabolizing enzymes such as transketolase, transaldolase, and phosphoenolpyruvate synthase are also effective.
  • enzymes belonging to the tributofan operon are effective in addition to the enzymes considered to be effective in the phenylalanine fermentation and the enzymes considered to be effective in the serine fermentation.
  • argle milkinkinase In proline fermentation, in addition to the above enzymes considered to be effective in glutamate-minic acid fermentation, argle milkinkinase, argle milkylsemialdehyde dehydrogenase, and bilin-5-carboxylate reductase are effective. is there.
  • the glutamate-mine synthase is effective in the glutamate-min fermentation.
  • inosine In the production of inosine, the expression of enzymes such as 5-phosphoribosyl 1-diphosphate synthase, 5-phosphoribosyl 1-2-phosphate aminotransferase, and phosphoribosylaminoimidazolecarboxyamide formyltransferase is important. Is considered to be effective.
  • 5-phosphoribosyl monophosphate synthase In the production of guanosine, 5-phosphoribosyl monophosphate synthase, It is effective to enhance the expression of 5'-inosinic acid dehydrogenase and 5'-xanthyl aminase in addition to suforibosyl phosphate diphosphate aminotransferase, phosphoribosylaminomidazole carboxyamide and formyltransferase. It is believed that there is.
  • the promoter sequence of a desired amino acid biosynthetic gene on the chromosome of a coryneform amino acid-producing bacterium for example, a promoter sequence such as the promoter sequence for GDH described above, is mutated so as to approach a consensus sequence. Is caused by a mutation using a chemical or the like, or the mutation is introduced by genetic recombination to prepare a mutant of a coryneform amino acid-producing bacterium.
  • consensus sequence is a sequence in which the most frequently occurring bases are arranged by comparing many promoters one by one.
  • consensus sequences include consensus sequences for E. coli, Bacillus subtilis and the like.
  • the consensus sequence of Escherichia coli is described in Diane K. Hawley and William R. McClure Nuc. Acid.Res. 11: 2232-2255 (1983), and the consensus sequence of Bacillus subtilis is described by Charles et al. Mol. Gen. Genet 186: 339-346 (1982).
  • the above mutation may be caused only in one promoter sequence, for example, only the promoter for GDH, but two or more promoter sequences, for example, promoter for GDH, citrate synthase (CS) and isoquenate synthesis May be caused by enzymes (ICDH).
  • the amino acid of interest is obtained by culturing the thus obtained mutant. A mutant that produces a large amount of is collected.
  • GDH a coryneform glutamic acid-producing bacterium
  • the promoter for GDH of the present invention the GDH gene having the promoter sequence for GDH and the L-glucaminic acid-producing corynebacterium strain having the gene can be obtained, for example, as follows. .
  • the above strains were subjected to mutation treatment such as ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, radiation irradiation, treatment with a mutagenic agent, etc., and then, on an agar plate medium containing 4-fluoroglucamic acid, 4-fluoroglutamate was obtained.
  • the mutated strain may be applied to an agar plate medium containing a concentration of 41-fluoroglucinic acid that suppresses the growth of the parent strain, and the grown mutant strain may be isolated.
  • the DNA sequence of one of the 35 regions of the GDH gene promoter is at least one DNA sequence selected from the group consisting of CGGTCA, TTGTCA, TTGACA and TTGCCA, and / or — It is preferable that the DNA sequence in the 10 region is TATMT or that the ATAAT base in the TATMT sequence is replaced with another base in the 10 region and the sequence does not inhibit the promoter function. .
  • the one in which the base of the ATMT of the -10 TATAAT sequence is replaced with another base and which does not inhibit the promoter function can be selected only at the beginning of the wild-type -10 sequence, CATMT. Since the GDH specific activity was dramatically increased only by replacing "C” with "T” in Table 1 (see Table 1, ⁇ 6-4), it is considered that other bases may be used. is there.
  • the promoter sequence of the GDH gene is described, for example, in Sahm et al. Molecular Microbiology (1992), 6, 317-326, supra, and in SEQ ID NO: 1.
  • the sequence of the GDH mosquito itself is, for example, the same as Sahm et al. Molecula r Microbiology (1992), 6, 317-326, and SEQ ID NO: 1.
  • C S citrate synthase
  • ICDH isoquenate synthase
  • the promoter for GDH at least one DNA sequence selected from the group consisting of CGGTCA, TTGTCA, TTGACA and TTGCCA in the 135 region and / or the TATMT sequence or the sequence in the 10 region.
  • the base of the ATMT is replaced with another base, and which has a sequence that does not inhibit the function of the promoter overnight.
  • glutamate dehydrogenase producing gene having the above promoter.
  • Examples of the CS promoter include those having a TTGACA sequence in the -35 region and / or a TATMT sequence in the 110 region, and which have a sequence that does not inhibit the function of the promoter overnight. Further, the present invention provides a CS gene having the above promoter.
  • a promoter for ICDH either the TTGCCA sequence or the TTGACA sequence in the first or second promoter of the 135 region and / or TATMT in the first or second promoter of the 10 region.
  • an icd gene having the above promoter is also provided.
  • promoters for PDH include those having a TTGCCA sequence in the -35 region and / or a TATMT sequence in the 110 region and which do not inhibit the promoter overnight function.
  • the present invention also provides a PDH gene having the above promoter.
  • the present invention also provides a coryneform L-glutamic acid producing bacterium having the above gene.
  • the promoter for argininosuccinate synthase at least one DNA sequence selected from the group consisting of TTGCCA, TTGCTA and TTGTCA and / or the TATAAT sequence or the ATAAT It has a sequence in which a base is replaced by another base and does not inhibit the promoter function. Further, the present invention provides an argininosuccinate synthase gene having the above promoter.
  • the present invention also provides a coryneform arginine-producing bacterium having the above gene.
  • the coryneform amino acid, preferably L-glucamic acid-producing bacterium of the present invention is cultured in a liquid medium to produce and accumulate a desired amino acid, preferably L-glutamic acid, in the medium, which is collected from the medium. By doing so, an amino acid can be obtained.
  • a liquid medium used for culturing the above strain a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, growth factors and the like is used.
  • glucose, fructose, sucrose, molasses, carbohydrates such as hydrolyzed starch, alcohols such as ethanol and glycerol, and organic acids such as acetic acid are used.
  • nitrogen source ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate, ammonia, lactic acid, meat extract, yeast extract, corn 'sticky liquor, etc. are used.
  • mutants with nutritional requirements it is advisable to add those required substances as a sample or a natural product containing them.
  • Coryneform bacteria generally produce L-glutamate under piotin restriction. Therefore, limit the amount of biotin in the medium, or add a biotin-inhibiting substance such as a surfactant or penicillin.
  • the fermentation is preferably performed for 2 to 7 days under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture while maintaining the pH of the culture solution between 5 and 9. It is preferable to use urea, calcium carbonate, ammonia gas, aqueous ammonia or the like to adjust pH.
  • the culture temperature is preferably 24 to 37 ° C.
  • the L-glutamic acid produced and accumulated in the culture solution may be collected by a conventional method, for example, an ion exchange resin method, a crystallization method, or the like. Specifically, L-glutamic acid may be adsorbed and separated by an anion exchange resin, or may be crystallized by neutralization.
  • a target amino acid can be obtained in high yield by introducing a mutation into the promoter region of the amino acid biosynthesis gene of a coryneform amino acid-producing bacterium and adjusting the expression level of the target gene. Since the desired amino acid can be stably obtained at a high yield without dropping off as in the case of plasmid, there is a great industrial advantage.
  • promoters particularly promoters for GDH, can be provided that can impart the ability to produce amino acids, particularly glutamic acid, in high yields to Corynebacterium strains without the need.
  • a coryneform L-glutamic acid-producing bacterium is subjected to a mutation treatment, and a strain having a resistance to 4-fluorogluminic acid, in which the mutation has occurred in the promoter overnight region of the GDH gene, is collected.
  • a strain having a resistance to 4-fluorogluminic acid, in which the mutation has occurred in the promoter overnight region of the GDH gene is collected.
  • glumic acid can be obtained at a high yield, which is a great industrial advantage.
  • a mutant GDH promoter overnight was prepared by the following method. (1) Generation of GDH gene with various mutant promoters
  • the wild-type sequence of the promoter region and the ⁇ 10 region of the GDH gene of the coryneform bacterium are shown in sequence 1. However, the wild-type promoter overnight sequence has already been reported (Molecular Microbiolgy (1992), 6, 317-326).
  • a method for preparing a plasmid carrying a GDH gene having a mutant promoter is as follows. As shown in Fig. 1, the chromosome gene of the ATCC13869 wild type strain of coryneform bacterium prepared based on the "Bacterial Genome DNA purification kit" (Advanced Genetic Technologies Corp.) After amplifying the gene by PCR and blunting both ends, it was inserted into the Smal site of plasmid PHSG399 (Takara Shuzo). Next, a plasmid PGDH was prepared by introducing a replication origin obtained from a plasmid PSA4 having a replication origin that can be replicated in coryneform bacteria into the Sail site of this plasmid.
  • a GDH gene having each of the above promoter sequences can be prepared by using a primer having a sequence shown in Sequence Listings 1 to 6 as a primer on the upstream side of the GDH gene.
  • p In order to construct SAK4, a plasmid pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901), which can be replicated autonomously with already obtained corynepacterium bacteria, is used.
  • -2903 (1984)) was digested with restriction enzymes BamHI and Kpnl to obtain a DNA fragment containing the replication origin, and the obtained fragment was obtained.
  • Plasmids prepared as described above were each introduced into a coryneform bacterium ATCC13869 strain.
  • the method of introduction was an electro-boration method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-27971).
  • the specific activity of GDH was examined. The activity was measured according to the method of Sahm et al. The results are shown in Table 1.
  • ATCC 13869 / p6 -2 to ATCC 13869 / p6-8 correspond to SEQ ID NOS: 2 to 6, and these sequences correspond to the sequence described in SEQ ID NO: 1 (wild type).
  • the underlined part has been changed as follows.
  • Example 2 Obtaining mutant strain
  • AJ13029 strain is a glutamate-producing strain described in W096 / 06180, and does not produce glutamate at a culture temperature of 31.5 ° C. However, when the culture temperature is shifted to 37 ° C, there is no biotin action inhibitor. However, it is a mutant that produces glumic acid. In this example, Brevipacterium lactofermentum AJ13029 strain was used as a parent strain for mutant induction. Of course, even glutamate-producing strains other than the AJ13029 strain can be mutant-derived parental strains having resistance to 4-fluoroglutamic acid.
  • the AJ13029 strain was cultured on CM2B agar medium (Table 2) at 31.5 ° C for 24 hours to obtain bacterial cells.
  • the obtained cells were treated with an aqueous solution of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosguanidine at 250 ° g / ml at 30 ° C for 30 minutes, and the cells having a 1% viability were obtained.
  • the body suspension was seeded on an agar plate medium (Table 3) containing 4 monofluoroglutamic acid (4FG) and 31.5. The cells were cultured in C for 20 to 30 hours to form colonies.
  • a medium containing lmg / ml of 4FG was first prepared with a gradient, and the same medium without 4FG was horizontally overlaid thereon.
  • a concentration gradient of 4 FG is created on the surface of the agar medium.
  • a boundary line is formed around the growth limit region of the strain.
  • a strain that formed a colony in a region where 4FG was present at a higher concentration than this boundary was collected.
  • about 50 4FG-resistant strains were obtained from about 10,000 mutant-treated strains.
  • Table 2 CM 2 B agar medium Ingredient Concentration Polypeptone (Nippon Pharmaceutical) 1.0%
  • AJ13029 and each mutant were grown on CM 2B agar medium at 31.5 ° C for 20 to 3
  • the cells obtained by culturing for 0 hours were inoculated into a liquid medium having the composition shown in Table 4 medium A. 31.
  • Shaking culture was started at 5 ° C. After about 22 hours, the final concentration is the concentration shown in Medium B in Table 4. A new medium was added to the medium, and the temperature was shifted to 37 ° C, followed by culturing for about 24 hours. After completion of the culture, the presence or absence of L-glucamic acid was examined using Asahi Kasei Biotech Analyzer-1. As a result, about 50 strains were cultured, and two strains having higher glutamate yield and higher GDH activity than the parent strain were isolated (strains A and B). When the GDH activity of each strain was measured, the specific activity of GDH was increased in both strains.
  • GDH activity can be measured by the method of E. R. Bormann et al. (Molecular Microbiol.
  • This example shows an example in which a promoter-enriched strain of a gene encoding glutamate dehydrogenase (GDH) and citrate synthase (CS) is prepared.
  • the nucleotide sequence of the gltA gene which encodes citrate synthase of coryneform bacteria, has already been elucidated (Microbiol. 140 1817-1828 (1994)). Based on this sequence, primers shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 were synthesized. On the other hand, a chromosome MA of Brevipacterium lactofarmentum ATCC13869 was prepared using the Bacterial Genome DNA Purification Kit (Advanced Genetic Technologies Corp.).
  • This reaction solution was subjected to 30 cycles of PCR using a thermocycler TP240 (Takara Shuzo) under the conditions of denaturation at 94 ° C for 30 seconds, association at 55 ° C for 15 seconds, and extension reaction at 72 ° C for 3 minutes, and the gltA gene and An approximately 3 Kbp DNA fragment containing the promoter was amplified.
  • the amplified fragment obtained is Takara After purification with SUPREC02 manufactured by Shozo Co., Ltd., the ends were blunted. Blunting was performed using a Blunting Kit manufactured by Takara Shuzo. This and pHSG399 (Takara Shuzo) completely degraded with Smal were mixed and linked.
  • the ligation reaction was performed using DNA ligation kit ver2 manufactured by Takara Shuzo. After ligation, transformation was performed using a competent cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and IPTG (isopropyl-5-D-thiogalactoviranoside) 10 ⁇ g / ml, X-Gal ( L-broth containing 40 jus / m and 40 zg / ml of chloramphenicol (10 g / l of pactotryptone, pactoyst extract) 5 g / l, NaC 15 g / K agar 15 g / l, PH 7.2), and after overnight culture, appeared white colonies were picked up and single colonies were separated to obtain transformed strains.
  • Plasmid was prepared from the transformant using the alkaline method (Biotechnical Experiments, edited by The Society of Biotechnology, Japan, p. 105, Baifukan, 1992), a restriction enzyme map was prepared, and the restriction enzymes shown in Fig. 2 were prepared. The one equivalent to the map was named pHSG399CS.
  • Mutan-Super Express Km manufactured by Takara Shuzo was used to introduce a mutation into the gltA promoter region. A specific method will be described below.
  • PHSG399CS was completely digested with EcoRI and SalI to prepare an EcoRI-Sall fragment containing the gltA gene, and this fragment was ligated to a fragment obtained by completely digesting pKF19kM (Takara Shuzo) with EcoRI and SalI.
  • transformation was performed using a competent cell of Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo), and L containing IPTG 10 ⁇ g / ml, X-Gal 40 g / ml and kanamycin 25 ⁇ g / ml. After the cells were applied to the medium and cultured for 1 hour, the appeared white colonies were picked and separated into single colonies to obtain transformed strains. Plasmid was prepared from the transformed strain, and one containing the gltA gene was designated as PKF19CS.
  • PCR was performed using 5′-terminal phosphorylated synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11 and selection primer attached to Mutan super Express Km.
  • transform cells of Escherichia coli MV1184 (Takara Shuzo)
  • traits A converted strain was obtained.
  • Plasmid MA was prepared from the transformant, and a portion of the gA promoter was synthesized by the method of Sanger (J. Mol.
  • nucleotide sequence was determined. Specifically, the nucleotide sequence was determined using a Dye terminator sequencing kit (Applied Biosystems) and analyzed with a Genetic Analyzer ABI310 (Applied Biosystems). The gA promoter substitution region was replaced with the sequence shown in Table 7 and named 0 "19031 ⁇ 1932, 1934. Table 7
  • PKF19CS constructed, pKF19CSl, pKF19CS2 3 pKF19CS respectively Sall, was completely digested with EcoRI (Takara Shuzo).
  • plasmid pSFK6 Japanese Patent Application No. 11-69896 having a replication origin derived from plasmid PAM330 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-67699), which can autonomously replicate in coryneform bacteria, was completely degraded with EcoRI and SalI. This was ligated with an approximately 2.5 kb fragment containing gltA. After ligation, transformation was performed using a competent cell of Escherichia coli E.
  • Plasmid was prepared from the transformant, and plasmids containing the gltA gene were designated as pSFKC, pSFKCl, pSFKC2, and pSFKC4, respectively.
  • the transformant was inoculated into the medium shown in Table S, and the culture was continued at 31 ° C., and the culture was terminated before glucose was completely consumed. The culture was centrifuged to separate the cells. The cells were washed with 50 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 200 m of sodium glutamate, suspended in the same buffer, and sonicated. Ultrasonic crushing was performed by UD-201 of T0Y.
  • citrate synthase may be measured according to (Methods Enzymol. 13, 3-11 (1969)). Specifically, a crude enzyme solution was added to a reaction solution containing TisHCl 100 mM (pH 8), DTNB O.lM, sodium glutamate 200 mM, and acetyl CoA 0.3 mM, and the increase in absorbance at 412 nm at 30 ° C was measured by Hitachi. It was determined by measuring with a spectrophotometer U-3210, and this was used as the background.
  • oxalic acid was added to a final concentration of 0.5 ⁇ , and the increase in absorbance at 412 nm was measured. The value obtained by subtracting the background value was defined as the activity of citrate synthase.
  • the protein concentration of the crude enzyme solution was measured using the Protein Assay (BIO-RAD). Bovine serum albumin was used as the standard protein. Table 9 shows the measurement results. It was confirmed that the citrate synthase activity was increased in the gltA promoter overnight mutant compared to the wild type gUA promoter overnight. Table 8
  • PSFKT2 Japanese Patent Application No. 11-81693
  • mutant gltA promoter sequences pKFCSl, pKFCS2, and pKFCS4 were completely digested with Sail and BstPI and smooth-ended, and this was ligated to those obtained by completely digesting PSFKT2 with Smal.
  • transformation was performed using a competent cell of Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.), and IPTG 10 ⁇ g / ml, X-Gal 40 ⁇ g / ml and kanamycin 25 ⁇ g / ml were transformed. After the cells were applied to the L medium containing the cells and cultured overnight, the white colonies that appeared were picked and separated into single colonies to obtain transformed strains. Plasmid was prepared from the transformant, and the temperature-sensitive shuttle vectors containing the gltA gene were named pSFKTCl, pSFKTC2, and PSFKTC4, respectively.
  • pSFKTCl, pSFKTC2, and pSFKTC4 were introduced into Brevipacterium lactofermentum FGR2 strain by the electric pulse method. Transformants were selected at 25 / g / ml. Performed at 25 ° C. on a CM2B plate medium containing kanamycin. After the introduction, the obtained strain was cultured in a CM2B liquid medium, and then diluted on a CM2B plate containing 25 ⁇ g / ml kanamycin so as to have a density of 10 3 to 10 5 cfu per plate, followed by application. The cells were cultured at 34 ° C.
  • strains retaining the temperature-sensitive plasmid become kanamycin-sensitive because colonization of the plasmid is inhibited at this temperature, and colonies cannot be formed.However, strains that have integrated plasmid DNA into the chromosome form colonies. You can choose. Emerging colonies were caught and single colonies were separated. Chromosomal DNA was extracted from this strain and subjected to PCR using the type III primers as shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 13 to confirm an amplified fragment of about 3 kb. Therefore, this strain was shown to have a mutant gltA gene derived from a temperature-sensitive plasmid integrated near the gltA gene in the host chromosome by homologous recombination.
  • the strains derived from pSFKTCl, 2,4 were named BLCS11, BLCS12, and BLCS14, respectively.
  • a kanamycin-sensitive strain was obtained from the BLCS11, BLCS12, and BLCS1 strains incorporating the mutant gltA gene by homologous recombination. Dilute the plasmid-incorporated strain on a CM2B plate, coat and incubate at 34 ° C. After colony formation, replicate on a CM2B plate containing 25 / g / ml kanamycin and incubate at 34 ° C. At this time, a strain that became kanamycin sensitive was obtained.
  • a chromosome was extracted from the kanamycin-sensitive strain, and PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 to prepare a gltA gene fragment.
  • the obtained amplified fragment was purified with SUPREC02 manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., and then subjected to a sequence reaction using the primers shown in SEQ ID NO: 13 to determine the sequence of the promoter region.
  • a strain having the same promoter sequence as PKF19CS1 in Table 7 was named GB01, a strain having the same promoter sequence as PKF19CS as GB02, and a strain having the same promoter sequence as pKF19CS4 as GB03. .
  • Each strain obtained in the above (7) was inoculated into a seed culture medium having the composition shown in Table 11, and cultured with shaking at 31.5 ° C for 2 hours to obtain a seed culture.
  • the main culture medium having the composition shown in Table 11 was dispensed at a rate of 300 ml each in a 500 ml glass jar amen and sterilized by heating. Then, 40 ml of the above seed culture was inoculated.
  • the culture was started at a culture temperature of 31.5 ° C with a stirring speed of 800 to 1300 rpm and aeration of l / 2 to l / lvvm.
  • the pH of the culture solution was maintained at 7.5 with ammonia gas. Eight hours after the start of the culture, the temperature was shifted to 37 ° C. In each case, the culture was terminated when glucose was completely consumed in 20 to 40 hours, and the amount of L-glucamic acid produced and accumulated in the culture solution was measured.
  • the nucleotide sequence of the gene icd which encodes citrate synthase of coryneform bacteria, has already been elucidated (J. Bacteriol. 177 774-782 (1995)). Based on this array The primers shown in column numbers 14 and 15 were synthesized, and PCR was performed using the chromosomal DNA of Brevipacterium lactofermentum ATCC13869 as type III to amplify an approximately 3 Kbp DNA fragment containing the icd gene and its promoter. did. The obtained amplified fragment was completely degraded with EcoRI, and this was combined with a completely degraded product of PHSG399 (Takara Shuzo) with EcoRI.
  • transformation was performed using a competent cell of Escherichia coli E. coli JM109, and L containing IPTG 10 ⁇ g / ml, X-Gal 40 / g / ml and chloram phenicol 40 / g / ml After spreading on the medium and culturing overnight, the emerged white colonies were picked and separated into single colonies to obtain transformed strains.
  • the plasmid having the icd gene was named pHSG399icd.
  • the exact promoter location of the icd gene has not been determined. Therefore, the possibility of increasing the transcript of ncc of the icd gene by artificially modifying the upstream sequence of the gene encoding ICDH to a promoter-like sequence was examined. Specifically, a mutation was introduced into a -10-like region present in the DNA sequence of about 190 bp (first promoter) and about 70 bp (second promoter) upstream of the first ATG of the ICDH protein. Muta-Super Express Km manufactured by Takara Shuzo was used to introduce mutations in the upstream region of the icd gene. A specific method will be described below.
  • pHSG399icd was completely digested with Pstl to prepare a Pstl fragment containing the promoter of the icd gene, and this was ligated to a fragment obtained by completely digesting pKF18kM (Takara Shuzo) with Pstl.
  • transformation is performed using a competent cell of Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo), containing IPTG 10 / zg / ml, X-Gal 40 zg / ml and kanamycin 25 ⁇ g / ml.
  • pKF18icd as type I, the 5'-terminal phosphorylated synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 and selection primer were used. PCR was carried out. Using the PCR product, a competent cell of Escherichia coli JM109 was transformed, and kanamycin 25 / The cells were spread on an L medium containing g / ml and cultured overnight. After that, the appeared colonies were picked up and isolated into single colonies to obtain transformed strains. Plasmid DNA was prepared from the transformant, and the icd promoter was prepared by the method of Sanger (J. Mol.
  • PKF18ICD2 was completely digested with Pstl to prepare a Pstl fragment containing the promoter of the icd gene, and this was ligated to a fragment obtained by completely digesting pKF18kM (Takara Shuzo) with Pstl.
  • transformation was performed using a competent cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and IPTG 10 ⁇ g / ml, X-Gal 40 / g / ml, and forcemycin 25 ⁇ g / ml
  • the cells were applied to an L medium containing ml, and after overnight culture, the white colonies that appeared appeared were picked and separated into single colonies to obtain transformed strains.
  • a plasmid was prepared from the transformant, and a plasmid containing the promoter of the icd gene was named PKF18ICDM2.
  • PCR was performed using 5'-terminal phosphorylated synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 and selection primer.
  • the PCR product was used to transform competent cells of Escherichia coli JM109, applied to an L medium containing 25 zg / ml of kanamycin, cultured overnight, and the colonies that appeared were picked up and isolated as single colonies. A transformant was obtained.
  • a plasmid DNA was prepared from the transformant, and the nucleotide sequence of a part of the icd promoter was determined using the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 22. Those in which the icd promoter overnight region was replaced with the sequence shown in Table 13 were named PKF18ICD25 and pKF18ICD26, respectively.
  • PKF18ICD GCGACT GAAAGT TTTCCA CACCAT PKF18ICD01 GCGACT TATAAT TTTCCA A
  • PKF18ICD05 GCGACT GAAAGT, TTGCCA TATAAT
  • a method of indirectly measuring the promoter activity using a repo-gene is considered. Desirable properties of the repo all-in-one gene include simple activity measurement, no significant decrease in activity even if amino acids are not available at the N-terminal side, no background reaction, and gene manipulation. Above, there is an appropriate restriction enzyme cleavage site. Escherichia coli /? Galactosidase (LacZ) is widely used as a repo overnight gene, and corynebacterium bacteria have no ability to assimilate lactose (J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 399-416 (1972)), it was determined that LacZ was optimally used as the repo overnight gene.
  • LacZ Galactosidase
  • a plasmid pNEOL that carries LacZ as a repo overnight gene (Fig. 3).
  • the process is described in detail below.
  • Chromosomal DNA obtained from E. coli ME8459 (ME8459 has been deposited with the National Institute of Genetics) in which the synthetic DNAs shown in SEQ ID NOS: 23 and 24 are used as primers.
  • PCR was performed. After the PCR product was completely digested with Smal and BamHI, pKF3 (Takara Shuzo) was digested with Hindlll and blunt-ended and ligated.
  • Plasmids PKF18ICD1, PKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKF18ICD25, PKF18ICD26, and pKF18ICD that had been mutated with SIC I, pF18ICD26, and pKF18ICD were obtained after the plasmids PKF18ICD1, PKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD6, and pKF18ICD constructed with the mutant icd promoter constructed in (2).
  • transformation was performed using the competent cells of Escherichia coli JM109, and the cells were applied to an L medium containing IPTG and X-Ga chloramphenicol 40 g / ml.After overnight culture, the blue colonies that appeared And a single colony was separated to obtain a transformed strain.
  • Plasmid was prepared from the transformant, and those having a structure capable of producing a fusion protein of ICDH and LacZ were designated as pNEOICDl, pNE0ICD2, pNE0ICD3, pNE0ICD4, pNE0ICD5, PNE0ICD6, pNE0ICD25, pNE0ICD26, and pNEOLICD. These plasmids and pNEOL were introduced into Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 by the electric pulse method.
  • Transformants were selected on a CM2B plate medium containing 25 mg / ml kanamycin and X-Gal40 / g / ml (Bacto-tripton 10 g / l, Bacto-straight extract 10 g, NaC 15 g). / K Piotin 10 zg / L, agar 15 g / l, PH7.0) at 31 ° C.
  • Z-Buffer (KCl 10 mM, MgS04 ImM, 2-ME270 / l / 100 mM NaPi (pH 7.5)) was used as a buffer. LacZ activity was measured according to the following procedure. Mix the Z-Buffer and the crude enzyme solution, add 0NPG dissolved in Z-Buffer to a final concentration of 0.8 mg / ml, and observe the increase in absorbance at 420 ° C at 30 ° C with Hitachi Spectrophotometer U-3210. The measured value was defined as LacZ activity.
  • Protein Assay (BIO-RAD) was used to measure the protein concentration of the crude enzyme solution. Bovine serum albumin was used as the standard protein. Table 14 shows the measurement results. It was confirmed that the strain expressing the ICDH-LacZ fusion protein having a mutation in the icd promoter had higher LacZ elemental activity than the strain expressing the wild-type ICDH-LacZ fusion protein. Table 14
  • a plasmid vector PSFKT2 (Japanese Patent Application No. 11-81693) whose replication is temperature-sensitive in coryneform bacteria was used. Mutant icd promoter evening one sequence as (pKF18ICDl, PKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4 , pKF18ICD5 3 pKF18ICD6, pKFICD25, pKFICD26 completely digested with Pstl and this and pSFKT2 after.
  • Plasmid was prepared from the transformed strain, and temperature-sensitive shuttle vectors containing the icd promoter were named pSFKTIl, PSFKTI2,, pSFKTI3, pSFKTI4, pSFKTI5, pSFKTI6, pSFKTI25, and pSFKTI26, respectively.
  • the plasmids constructed in (5) were introduced into Brevipacterium and lactofermentum GB02 strains by the electric pulse method. Transformants were selected on a CM2B plate medium containing 25 mg / ml of namycin (Pacto tryptone 10 g / l, Bactoist extract 10 g / U NaC 15 g / l, Piotin 10 g / L, agar 15 g / ml). 1, pH 7.0) at 25 ° C.
  • the obtained strain is cultured in CM2B liquid medium, and then diluted with CM2B plate containing 25 g / ml of kanamycin to obtain 10 3 to 10 5 cfu per plate, followed by application at 34 ° C. And cultured.
  • Strains that retain temperature-sensitive plasmids are kanamycin-sensitive and cannot form colonies because plasmid replication is inhibited at this temperature, but strains that have integrated plasmid DNA into their chromosomes will form colonies. , Can be selected. The emerged colonies were caught and single colonies were separated.
  • Chromosomal DNA was extracted from this strain, and the resulting DNA was subjected to PCR using the primers of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15 to confirm an amplified fragment of about 3 kb. Therefore, this strain was shown to have a mutant icd gene derived from temperature-sensitive plasmid integrated near the icd gene of the host chromosome by homologous recombination.
  • a kanamycin-sensitive strain was obtained from the strain described in (6) in which the mutant icd gene was incorporated by homologous recombination. Dilute the plasmid-incorporated strain on a CM2B plate, coat and incubate at 34 ° C. After colony formation, replicate on a CM2B plate containing 25 Adg / ml kanamycin and incubate at 34 ° C. At this time, a kanamycin-sensitive strain was obtained. Chromosomes were extracted from the kanamycin-sensitive strain, and PCR was performed using primers shown in SEQ ID NOS: 14 and 15 to prepare an icd gene fragment.
  • the obtained amplified fragment was purified with SUPREC02 manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., and then subjected to a sequence reaction using the primers shown in SEQ ID NO: 22 to determine the sequence of the promoter region.
  • a crude ICDH enzyme solution was prepared from the eight strains and the GB02 strain obtained in (7) in the same manner as in Example 3 (7).
  • ICDH activity was measured according to the following procedure.
  • the crude enzyme solution was added to a reaction solution containing 35 mM TisHCl (pH 7.5), 1.5 mM MnS04, 1.5 mM NADP O.lmM, and 1.3 mM isocitrate, and the increase in absorbance at 340 nm at 30 C was measured using a Hitachi spectrophotometer U-3210. The measured value was defined as the activity of ICDH.
  • Protein Assay (BIO-RAD) was used to measure the protein concentration of the crude enzyme solution.
  • Bovine serum albumin was used as the standard protein. Table 15 shows the measurement results. It was confirmed that the icd promoter overnight replacement strain had an increased isoquenate dehydrogenase activity compared to its parent strain.
  • Table 15 shows the measurement results. It was confirmed that the icd promoter
  • a region with high homology between the E1 subunits of pyruvate dehydrogenase (PDH) of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Mycobacterium tuberculosis was selected, and the primers shown in SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 were synthesized and synthesized by Advanced Genetic Technologies Corp. Brevi Pacterium Raku prepared by Genomic DM Purification Kit PCR was carried out under the standard reaction conditions described on page 8 of PCR technology — (Henry Ehritzch, Stockton Press, 1989). When the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, it was found that a DNA fragment of about 1.3 kilobase had been amplified.
  • PDH pyruvate dehydrogenase
  • the nucleotide sequences at both ends of the obtained DNA were determined using the synthetic DNAs of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26.
  • the nucleotide sequence was determined using a DNA Sequencing Kit (Applied Biosystems) according to the method of Sanger (J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)).
  • the determined nucleotide sequence was translated into amino acids and compared with the E1 subunit of pyruvate dehydrogenase of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Mycobacterium tuberculosis, the DNA fragment amplified by PCR was highly homologous.
  • Pacterium, lactofermentum, brevibacterium, lactofermentum ATCC Determined to be part of the pdhA gene that encodes the E1 subunit of pyruvate dehydrogenase of 13869, and upstream of that gene And the downstream section was cloned.
  • Cloning method is as follows: Brevipacterium 'Lactofermentum ATCC 133869 Chromosome is digested with restriction enzymes EcoRI, BamHI, HindII, PstI, SalI, XbaI (Takara Shuzo) From the fragment, use the primers shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 to clone the upstream part and the primers shown in SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 to clone the downstream part. Using one, we performed cloning using LA PCR in vitro cloning Kit (Takara Shuzo).
  • the upstream part was digested with EcoRI, HindII I, PstI, SalI, and XbaI, and amplified about 0.5, 2.5, 3.0, 1.5, and 1.8 kilobase DNA fragments, respectively.
  • the downstream portion was a fragment digested with BamHI, Hind III, and Pst I, which amplified about 1.5, 3.5, and 1.0 kilobase DNA fragments, respectively.
  • This DNA fragment was sequenced in the same manner as above. Made a decision. As a result, it was revealed that the amplified DNA fragment further contained an open reading frame of about 920 amino acids, and that a region presumed to be a promoter region was present upstream of the open reading frame.
  • the amino acid sequence of the product deduced from the nucleotide sequence of this open reading frame is the same as that of pyruvate dehydrogenase from known E. coli. Due to high homology to the 1 subunit, this open 'reading' frame must be the pdhA gene encoding the E1 subunit of pyruvate dehydrogenase of Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Became evident.
  • the nucleotide sequence of this open reading frame is as shown in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing. SEQ ID NO: 31 in the sequence listing also shows the amino acid sequence of the product deduced from the nucleotide sequence.
  • N-terminal methionine residue of the protein is derived from the initiation codon ATG, it often has no relation to the original function of the protein, and is often removed by the action of beptidase after translation. It is well known that the N-terminal methionine residue may have been removed even in the case of the above protein.
  • GTG sequence 6 bases upstream of the ATG shown in SEQ ID NO: 31 in the Sequence Listing and amino acids may be translated therefrom.
  • pyruvate dehydrogenase of other microorganisms such as Escherichia coli is composed of three sub-units, El, E2, and E3, and the genes encoding these are often open-ended.
  • the primers shown in SEQ ID NOs: 33 and 34 were synthesized based on the nucleotide sequence already cloned, and the chromosome of Brevibacterium lactofermentum AT CC 13869 prepared using Advanced Genetic Technologies Corp. Bacterial Genomic DNA Purification Kit The PCR was performed under standard reaction conditions described on page 8 of PCR Technology I (Henry Erich, Ed., Stokton Press, 1989) to amplify the pdhA gene.
  • SEQ ID NO: 33 corresponds to the sequence extending from nucleotides 1397 to 1416 in the nucleotide sequence diagram of the pdhA gene described in SEQ ID NO: 32 in Sequence Listing
  • SEQ ID NO: 34 It shows the reverse strand of the base sequence corresponding to the sequence from the 5355th base to the 5374th base in SEQ ID NO: 32 in the sequence list from the 5 'side.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, and then allowed to react with restriction enzymes Sal I and EcoT22I, and digested with restriction enzymes Sal I and Pst I. ) And transformed using Escherichia coli JM109 competent cells (Takara Shuzo Co., Ltd.) to give 10 g IPTG (Isopguchi pill 1 /?
  • soybean hydrolyzate solution 1 5 m 1 using Saiamin hydrochloride 2 0 0 jug, Piochin 60 zg, the KOH kanamycin 2 5 mg and C a C0 3 5 0 g medium containing in pure water 1 L And adjusted to pH 8.0) with shaking at 31.5 ° C until the sugar in the medium was consumed.
  • the obtained culture was added to a medium having the same composition as described above for GC25 / pSFK6 and GC25 / pSFKBPDHA, and to a culture pond except for biotin for ATCC13869 / pSFK6 and ATCC13869 / pSFKBPDHA as described above.
  • the culture was shake-cultured at 37 ° C until the sugar in the medium was consumed.
  • a plasmid pSFK6 which can be autonomously replicated by a corynebacterium belonging to the genus Corynebacterium, was added to the Brevipacterium lactofermentum ATCC13869 and GC25 by the electric pulse method.
  • the strain transformed by the above method was cultured in the same manner as described above. After completion of the culture, the amount of accumulated L-glucamic acid in the culture solution was measured using a Biotech Analyzer AS-211 manufactured by Asahi Kasei Corporation. Table 17 shows the results. Table 1 ⁇
  • the promoter region of the pdhA gene of Brevipacterium lactofermentum ATCC13869, which had already been cloned was determined and the promoter region was modified. The difference in the expression level was measured by measuring the activity of /?-Galactosidase.
  • SEQ ID NO: 35 corresponds to the sequence extending from nucleotides 2194 to 2221 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32 in the SEQ ID NO: 32.
  • the base at position 2202 has been changed to G, and a recognition sequence for the restriction enzyme Smal has been inserted.
  • SEQ ID NO: 36 corresponds to the sequence extending from the 2372nd to 2398th bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32 in the Sequence Listing, but changes the 2393rd and 2394th bases to G to recognize the restriction enzyme Smal. This is the reverse strand of the base sequence in which is inserted from the 5 'side.
  • the sequence of the DNA fragment inserted into the vector by a standard method was determined.
  • the plasmid containing the DNA fragment was named pNEOLBPDHAprol.
  • primers shown in SEQ ID NOs: 37, 38, and 39 were synthesized, and each of these primers was synthesized.
  • the primers shown in SEQ ID NO: 36 and the primers shown in SEQ ID NO: 36 the chromosomal DNA of Brevipacterium lactofermentum ATCC13869 was transformed into type III, and the promoter region of the pdhA gene was changed to a common sequence by PCR.
  • the amplified MA fragment was amplified.
  • SEQ ID NO: 37 corresponds to the sequence from the 2244th base to the 2273th base of the base sequence in SEQ ID NO: 32, and the 2255th base is C and the 2257th base is A.
  • SEQ ID NO: 38 corresponds to the sequence extending from the 2249th to 2288th bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32 in the Sequence Listing.
  • the 2279th and 2281st bases are changed to T, and only the -10 region is coryneated. It corresponds to the one changed to the consensus sequence of type bacteria.
  • SEQ ID NO: 39 corresponds to the sequence extending from the 2249th to 2288th bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32 in the Sequence Listing, and the 2255th base to C, the 2257th base to A, and the 2279th base. 2281th Is changed to T, and both the -35 region and the -10 region are changed to a common sequence of coryneform bacteria.
  • chromosome of Brevibacterium-Lactofermentum ATCC 13869 prepared with the Bacterial Genomic DNA Purification Kit manufactured by Advanced Genetic Technologies Corp. as type III, PCR technology (Henry-Illich, Ed., Sudockton Press, 1989), p.
  • PCR was performed under the standard reaction conditions described in, and the primers were used to amplify the promoter region of the pdhA gene in which the promoter region was changed to a consensus sequence.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, reacted with the restriction enzyme Smal, and pNEOL, which can be replicated in coryneform bacteria lacking the promoter region of the lacZ gene, was cut with the restriction enzyme Smal.
  • Shillon Kit Takara Shuzo
  • transformation was performed using Escherichia coli KM JM109 (commercial cell) (Takara Shuzo Co., Ltd.), and X-Gal (5-promo 4 monochrome—3—) was transformed.
  • the plasmid containing the DNA fragment in which only the -35 region was changed to a common sequence was named pNE0LBPDHApro35
  • the plasmid containing the DNA fragment in which only the -10 region was changed to a common sequence was named pNE0LBPDHApro35.
  • the plasmid into which a DNA fragment in which the -35 region and the -10 region were changed to a common sequence was inserted was named pNE0LBPDHApro3510.
  • the plasmids named pNE0LBPDHAprol, pNEOLBPDHAprolO, and pNE0LBPDHApro3510 were used to transform Brevibacterium 'Lactofermen ATCC13869 by the electric pulse method (see Japanese Patent Application Publication No. Hei 2-207791) to transform the transformant. Obtained.
  • Example of the /?-Galactosidase activity of the obtained transformant 4 Measured by the method described in (4).
  • the /?-Galactosidase activity when the promoter region was changed to a consensus sequence was as shown in Table 18 with the /?-Galactosidase enzyme activity of 1 having the promoter region of the pdhA gene.
  • plasmid for constructing a pdhA gene promoter mutant strain was constructed.
  • Three types of plasmids for constructing the promoter-mutant were constructed by changing the -35 region and the -10 region to a common sequence and by changing both of them to a common sequence.
  • SEQ ID NOs: 40 and 41 were newly synthesized based on the nucleotide sequences already cloned.
  • SEQ ID NO: 40 has a reverse strand of the base sequence corresponding to the sequence from bases 2491 to 2521 of SEQ ID NO: 32 in SEQ ID NO: 32 from the 5 'side, and an A at the 5' end. Is an array of three consecutive dashes followed by four consecutive ticks.
  • SEQ ID NO: 33 is a salt at positions 5020 to 5039 in the nucleotide sequence of the pdhA gene described in SEQ ID NO: 32 in the Sequence Listing. The reverse strand of the base sequence leading to the group is indicated from the 5 'side.
  • the chromosome of Brevipacterium lactofermentum ATCC 13869 prepared with the Advanced Genetic Technologies Corp. Bacterial Genomic DNA Purification Kit was type III, and the PCR technology was performed using the sequence listing SEQ ID NOS: 33 and 40 as the primer. PCR was carried out under the standard reaction conditions described on page 8 (Henry Erich, Ed., Stockton Press, 1989). In addition, PCR was also performed using the chromosome of Previbacterium 'lactofermentum ATCC 13869 as ⁇ type and SEQ ID NOS: 15 and 17 in the sequence listing.
  • the PCR product using SEQ ID NOS: 9 and 16 as a primer and the PCR product using SEQ ID NOS: 39 and 41 as a primer and SEQ ID NO: 33 as a primer were used.
  • PCR was performed using 41.
  • PCR was performed using LA taq (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) without adding type III in the reaction solution so that the concentration of these four DNAs was 10 ⁇ M.
  • the resulting PCR product is purified by a conventional method, and then reacted with restriction enzymes Sal I and Xhol.
  • Temperature-sensitive plasmid pSFKT2 which can be replicated in coryneform bacteria, is cut with restriction enzyme Sal I and ligated lysate kit (Takara Shuzo) After transformation using a combination cell of Escherichia coli 'M JM109 (manufactured by Takara Shuzo), IPTG (isopropyl-/?-D-thiogalactopyranoside) was added at 10 ⁇ g / ml, X-Gal (5-bromo_4-one-cloth 3-indolyl /?-D-galactoside) 40 / g / ml and kanamycin 25 ⁇ / 1111 L medium (pact tryptone 10 g / l, Apply to toast extract 5 g / l, NaC 15 g / l, agar 15 g /
  • Plasmid was prepared from the transformant using the alkaline method (Biotechnology Experiments, edited by Biotechnology Society of Japan, p. 105, Baifukan, 1992), and the DNA fragment inserted into the vector was sequenced. Compared with the nucleotide sequence of the pdhA gene reported in SEQ ID NO: 32, a plasmid into which a DNA fragment in which only the -35 and -10 regions of the promoter have been changed to a common sequence of coryneform bacteria has been inserted. was named pSFKTPDHApro3510.
  • a plasmid was constructed in which the -10 region of the pdhA gene promoter was changed to a common sequence of coryneform bacteria. These plasmids were named pSFKTDHApro35 and pSFKTPDHAprolO, respectively.
  • a promoter mutant of the pdhA gene was prepared by homologous recombination.
  • GC25 was transformed using the plasmid pSFKTPDHApro3510 for the production of a promoter mutant by the electric pulse method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791), and a CM2B plate medium (polypeptone 10 g / l, pactose) was used.
  • An extract 10 g / l, NaCl 5 g / 1, piotin 10 microg / ml, agar 15 g / l, pH 7.2) was applied to obtain a transformant at a culture temperature of 25 ° C.
  • the obtained transformant was cultured in a CM2B liquid medium overnight in a test tube, and then placed on a CM2B plate medium containing 25 g / ml of kanamycin, cultured at a culture temperature of 34 ° C, and subjected to homologous recombination.
  • a single recombinant strain in which the plasmid pSFKTPDHpro3510 was inserted above was obtained. After the single recombinant strain obtained is isolated as a single colony, cultivate it in a CM2B liquid medium and culture at a culture temperature of 31.5 ° C.
  • CM2B containing kanamycin 25 / g / ml By replicating on a plate medium, a kanamycin-sensitive strain was obtained.
  • the promoter region of the pdhA gene of the obtained strain can be obtained in two types: a wild-type sequence and a mutation-introduced strain. In this way, a promoter overnight mutant strain in which a mutation was introduced was obtained.
  • This strain was a strain in which the -35 region and the -10 region of the promoter of the pdhA gene were changed to a common sequence of coryneform bacteria, and this strain was named GD3510.
  • each of pdhA gene promoter - 35 territory Strains in which the region and the ⁇ 10 region were changed to a consensus sequence of coryneform bacteria were obtained and named GD35 and GD10, respectively.
  • CM 2 B plate medium promoter mutants obtained by culturing at GD3510, GD 35, cells of GD 10 and GC 25, glucose 30 g, KH 2 P 0 4
  • the obtained product was inoculated into a medium having the same composition as above at a concentration of 5%, and cultured with shaking at 37 ° C until the sugar in the medium was consumed. After the completion of the culture, the amount of accumulated L-glutamic acid in the culture solution was measured using a Biotech Analyzer AS-210 manufactured by Asahi Kasei Corporation. Table 19 shows the results. Table 19 — Kurutami (gdl)
  • GD3510 2.1 These are ⁇ : ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Example 6 Mutation of the Arginosuccinate Synthase Gene into the Promoter Region of Coryneform Arginine Producing Bacteria
  • nucleotide sequences of the upstream and downstream regions of the same 0RF were determined.
  • the nucleotide sequence can be determined by a known C. glutamicum argG gene 0RF nucleotide sequence.
  • a primer was synthesized based on (GenBank accession AF030520), and performed using an In vitro LA PCR cloning kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the instructions attached to the kit.
  • Specific examples of the primer include oligonucleotides (primers 1 and 2) having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 42 and 43 for the upstream region of 0RF, and SEQ ID NOs: 44 and 45 for the downstream region. Oligonucleotides with base sequences
  • AJ12092 was added to the site with the highest score using the primer for mutation introduction primer9 or primerlO or primerll or primerl2 or primerl3 and primer7 (SEQ ID NOS: 50, 51, 52, 53, 54, 48).
  • the first PCR was performed using the chromosomal DNA of the strain as type III, and this PCR product was used as the third primer, the primer 8 (SEQ ID NO: 49) was used as the fifth primer, and the same chromosomal DNA was again used as the type III.
  • SEQ ID NO: 49 the primer 8
  • the same chromosomal DNA was again used as the type III.
  • plasmids pNEOL-l, pNEOL-2, pNEOL-3, pNEOL-4, and pNEOL-7 inserted so as to be oriented in the same direction as the lacZ of the offspring were obtained.
  • a plasmid pNEOL-0 was constructed in which a DNA fragment obtained by performing PCR using chromosomal DNA as type I was inserted upstream of the lacZ gene of pNEOL.
  • pNEOL-0, pNEOL-1, pNEOL-2, pNEOL-3, pNEOL-4, and pNEOL-7 were introduced into AJ12092 strain. Plasmid was introduced by the electric pulse method (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 2-207779). Was used. Transformants were CM 2 G plate medium containing 4 g / ml chloramphenicol (10 g of polypeptone, 10 g of yeast extract, 5 g of glucose, 15 g of NaC, and 15 g of agar agar). Included in 1. Selected as a chloramphenicol-resistant strain at pH 7.2).
  • strains were plated on an agar medium containing 0.5 g / dl of glucose, polypeptone lg / dl, yeast extract lg / dl, NaCl 0.5 g / dl, and chloramphenicol 5 g / l, and cultured at 31.5 ° C for 20 hours.
  • the obtained bacterial cells 1 g, glucose 3 g / dl, ammonium sulfate ;: dimethyl 1.5 g / dl, KH 2 P0 4 0.1 g / dl, MgSO 4 0.04 g / dl, FeSO 4 O.OOlg / dl, MnS0 4 O.Olg / dl, VB l 5JLL g / dl, was inoculated into a medium containing biotin 5 zg / dl, 45mg / dl as soybean hydrolyzate N amount, obtained by 18 hours at 31.5 ° Galactosidase activity was measured using the resulting cells.
  • the primers 14, 15 were used to perform PCR on the chromosomal DNA of the AJ12092 strain as type III, and the DNA fragments obtained were used as primers for quink-ning, pHK398 pHSG398 (a product of TaKaRa).
  • Plasmid ⁇ was constructed by inserting it into the Small site of the cloning site. Next, ⁇ was digested with restriction enzymes EcoRV and BspHI, and similarly, pNEOL-3 and pNEOL-7 were digested with restriction enzymes EcoRV and BspHI. The resulting DNA fragment was ligated to obtain plasmid p3 for mutation introduction (mutation derived from primerll for mutation introduction), and p7 (mutation derived from primerl3 for mutation introduction).
  • the above Sd plasmid was introduced into an Arg-producing bacterium, Bevribacteri urn lactoiermen turn AJ 12092.
  • the introduction of the plasmid was carried out by the electric pulse method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-077791). Since these plasmids cannot replicate autonomously in Bevribacterium, only strains in which this plasmid has been integrated into the chromosome by homologous recombination can be selected as Cm-resistant strains.
  • oligonucleotides (primers 1, 5 and 6) having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 46 and 47 were synthesized, and the chromosomal DNA of Brevibacterium flavum 2247 was type III.
  • PCR was performed. In the PCR reaction, 25 cycles of 94 ° C: 30 seconds, 55 ° C: 1 second, 72 ° C: 2 minutes 30 seconds were performed.
  • the resulting DNA fragment was cloned into the Smal site of the cloning vector pSTV29 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) to create pSTVarG. Further, a pargG was prepared in which a fragment containing the replication origin obtained by Sail treatment of pSAK4 described in Example 1 (1) was inserted into the Sail site of pSTVargG.
  • argG was introduced into Bevribacterium lactofermen turn AJ12092 strain.
  • the introduction of plasmid was carried out by the electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-2007791).
  • Transformants were CM 2G plate medium containing 4 g / ml chloramphenicol (polypeptone 10 E, yeast extract 10 g, glucose 5 g, NaC 15 g: agar agar 15 g Included in 1. Selected as a chloramphenicol resistant strain at PH 7.2).
  • ArgG activity of the above two types of ArgG promoter mutant strains and the strain (AJ12092 / pargG) that amplified argG with the plasmid was measured. These strains were tested for glucose 0.5 g / dl, polypeptone lg / dl, yeast extract lg / dl, Wet cells on an agar medium containing 0.5 g / dl of NaCl and 5 U gil of chloramphenic acid, and cultured at 31.5 ° C for 20 hours. g / dl, KH 2 P0 4 0.
  • Table 21 shows the ArgG activity of the two types of ArgG promoter mutants and the strain (AJ12092 / pargG) in which argG was amplified using the plasmid. Table 21 Thus, by introducing a mutation into the promoter, ArgG activity was increased about twice as much as that of the parent strain in AJ12092-P3 and about three times in AJ12092-P7. In addition, in AJ12092 / pargG, The ArgG activity was about 4.5 times that of the parent strain.
  • a plasmid having the GDH promoter sequence shown in the FGR1 and FGR2 strains shown in Example 2 was constructed by site-directed mutagenesis.
  • PCR was performed using the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 57 and the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 60 as primers, and the chromosome MA of ATCC13869 was used as the type III.
  • PCR was performed using the synthetic DNA shown in 58 and the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 59 as primers and the chromosomal DNA of ATCC13869 as type III. Further, PCR was performed using the mixture of the PCR products as type I and the synthetic DNAs shown in SEQ ID NOS: 57 and 58 as primers.
  • PCR product thus obtained was inserted into the Smal site of pSFKT2 (Japanese Patent Application No. 11-69896) to construct pSFKTGll.
  • PCR was performed using the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 57 and the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 62 as primers and the chromosomal DNA of ATCC13869 as type III, and the sequence was obtained on the other hand.
  • PCR was performed using the synthetic DNA shown in No. 58 and the synthetic MA shown in SEQ ID No. 61 as primers and the chromosome MA of ATCC13869 as type III.
  • PCR was performed using the mixture of the PCR products as type I and the synthetic DNAs shown in SEQ ID NOs: 57 and 58 as primers.
  • the PCR product obtained in this way is called pSFKT2 (Japanese Patent Application 69896) was inserted into the Smal site to construct pSFKTG07.
  • pSFKT2 Japanese Patent Application 69896
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment inserted into the Smal site of pSFKTGll and PSFKTG07 was determined, and it was confirmed that no mutation was introduced except for the promoter region of GDH.
  • pSFKTGll and PSFKTG07 were introduced into the AJ13029 strain by the electric pulse method, and transformants growing on a CM2B plate containing 25 ⁇ g / inl kanamycin at 25 ° C. were selected.
  • the transformant was cultured at 34 ° C, and a strain showing kanamycin resistance at 34 ° C was selected. Showing kanamycin resistance at 34 ° C means that pSFKTGll or pSFKTG07 was integrated on the chromosome of AJ13029 strain.
  • a kanamycin-sensitive strain was obtained from such a strain in which plasmid was integrated on the chromosome.
  • the GDH promoter overnight sequence of these strains was determined, and strains having the same gdh promoter-night sequence as pSFKTGll and pSFKTG07 were designated GA01 and GA02, respectively.
  • PAJ220 a self-cloning vector PAJ220 was constructed.
  • pAJ226 JP-A-152289
  • PAJ224 JP-A-61-152289
  • PAJ220 is a plasmid ligated with a DNA fragment of approximately 0.7 kb generated by the treatment.
  • Book bra Smid can replicate autonomously in coryneform fungi and confer trimethoprim resistance to the host.
  • a gdh gene fragment was prepared by PCR using the chromosomal DNA of ATCC13869 strain of wild type coryneform bacterium as type I and the synthetic MA as shown in SEQ ID NO: 63 and SEQ ID NO: 64 as a primer to prepare the gdh gene fragment, which was used as the BalI site of PAJ220.
  • PAJ220G inserted in was constructed.
  • a promoter is present near the Ball site of PAJ220, and the expression level of the gene inserted into the Ball site is enhanced depending on the direction of insertion.
  • a strain in which PAJ220G and pGDH were introduced into the ATCC13869 strain by the electric pulse method was constructed, and GDH activity was measured by the method described in (1) above. As a result, the GDH activity of the PAJ220G-introduced strain was found to be about 1.5 times that of the pGDH-introduced strain. (Table 24) Table 24
  • pGDH and PAJ220G were introduced into AJ13029 by the electric pulse method. These strains and each of the strains obtained in (2) above were inoculated into a seed culture medium having the composition shown in Table 25, and incubated at 31.5 ° C for 24 hours.
  • a seed culture was obtained by shaking culture.
  • the main culture medium having the composition shown in Table 25 was dispensed at a rate of 300 ml each in a 500-ml glass jar amen and sterilized by heating. Then, 40 ml of the above seed culture was inoculated.
  • the culture was started at a culture temperature of 31.5 ° C with a stirring speed of 800 to 1300 rpm and an aeration rate of 1/2 to 1 / lvvm.
  • the pH of the culture solution was maintained at 7.5 with ammonia gas. Eight hours after the start of the culture, the temperature was shifted to 37 ° C.

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Description

ァミノ酸生産菌の構築方法及び構築されたァミノ酸生産菌を用いる醜酵法による アミノ酸の製造法 発明の背景 本発明は、 アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を構築する方法及 びその変異株を用いる発酵法による L—アミノ酸の製造方法に関するものである。 発酵法によるアミノ酸の生産に用いられる変異株の構築方法は、 大別すると 2 通りあり、 1つは化学変異剤をもちいて MAにランダムに変異を導入する方法で あり、 もう 1つは遺伝子組換えを用いる方法である。 遺伝子組換えを用いる方法 では、 目的物質の生合成に関与する代謝経路上の遺伝子を強化したり、 分解に関 与する酵素の遺伝子を弱化したりすることにより， 目的物質の生産性が向上した 菌株を開発出来る。 また、 その際に、 目的遺伝子を強化する方法として、 細胞内 で， 染色体とは独立して自立複製可能なプラスミ ドが主に用いられてきた。
しかし、 プラスミ ドを用いた目的遺伝子の強化方法には問題点がある。 具体的 には目的遺伝子の強化の程度はプラスミ ド自体のコピー数によって決まるため、 目的遺伝子の種類によってはコピー数が高過ぎて， 発現量が高くなり過ぎること により、 生育が著しく抑制されたり、 逆に目的物質の生産能が低下したりする例 が多くある。 この様な場合、 コピー数が低い種類のプラスミ ドを用いることによ り、 目的遺伝子の強化の程度を下げることが可能であるが、 プラスミ ドの種類は 多くの場合限定的であり、 目的遺伝子の発現レベルを自由に調節することは不可 能である。
もう一つの問題点は、 プラスミ ドの複製が不安定であることがしばしばであり、 プラスミ ドが脱落してしまうことである。
例えば、 特閧昭 6 1 - 2 6 8 1 8 5号公報には、 グル夕ミン酸生産性コリネ型 細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナ一ゼ （G D H ) 産生遺伝子 （グルタミン酸 脱水素酵素遺伝子） を含む D N A断片と細胞内での自立複製に必要な遺伝子を含 む DNA断片（プラスミ ド）とを含む組換え体 DNAが開示されており、 この組換 え体 DN Aを細胞に導入することによって、 GDH強化株を育種することができ、 微生物による物質 （アミノ酸、 蛋白質等） 生産を改善できることが開示されてい る。
これに対して、 特許第 2520895号公報には、 上記組換え体 DNAをコリ ネバクテリゥムに移入して該酵素活性が強化された菌株を作成し、 この菌株を用 いて醱酵法により L一グル夕ミン酸を製造したが、 その生産量や収率はまだまだ 満足のいくものではなく、 更に L一グルタミン酸の生産性を向上させることが望 まれているとしている。 そして、 この要望は、 グルタミン酸生産性コリネ型細菌 由来のグルタミン酸デヒドロゲナ一ゼ産生遺伝子とイソクェン酸デヒドロゲナー ゼ遺伝子 （ICDH) の 2種の遺伝子を含む組換え体 DN Aをグルタミン酸生産 性コリネ型細菌に移入することにより、 達成できたとしている。
一方、 特表平 6— 502548号公報には、 コリネバクテリア菌株と、 該菌株 中の発現のための第一機能性 DN A配列、 アミノ酸、 ポリペプチドおよび/また は蛋白質をコードする第二 DN A配列、 及び上記第一及び第二 DN A配列の間に 挿入された第三 DN A配列を含む分泌カセットとを含んでなり、 該第三 DNA配 列が該コリネバクテリァ菌株によりアミノ酸、 ポリベプチドおよび/または蛋白 質の分泌を保証する PS 1又は PS 2から選ばれた蛋白質の要素をコードするこ とを特徴とするコリネパクテリァの発現及び分泌系が開示されている。 具体的に は、 ポリペプチドの分泌が開示されており、 コリネバクテリア菌株に NTG変異 誘発を施し、 グル夕ミン酸アナログである 4一フルォログル夕ミン酸 4— fluorog lutaunate (4 FG) に対して耐性を与える変異株を選び、 これを pCGL 141 での形質転換に付しており、 上記アナ口グ耐性菌の中から G D Hの発現が強化さ れた株が取得できることが開示されている。 ここでは、 GDHプロモーターのヌ クレオチド配列 251〜266に変異が生じていることが示されている。
発明の開示
本発明は、 プラスミ ドを用いることなく目的遺伝子の発現量の適度な強化およ び調節を行うことができ、 アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を遺 伝子組換え又は変異により構築する方法を提供することを目的とする。
本発明は、 副生ァスパラギン酸およびァラニンの著しい増加を引き起こすこと なく、 コリネバクテリア菌株にグル夕ミン酸を高収率で生産する能力を付与する ことができる G D H用プロモ一夕一を提供することを目的とする。
本発明は、 又、 上記 G D H用プロモーター配列を持つ G D H遺伝子を提供する ことを目的とする。
本発明は、 又、 上記遺伝子を有する L一グルタミン酸生産性コリネバクテリア 菌株を提供することを目的とする。
本発明は、 構築されたアミノ酸生産菌を用いる醱酵法によるアミノ酸の製造法 を提供することを目的とする。
本発明は、 コリネ型グル夕ミン酸生産菌を用いる、 グル夕ミン酸の収率を向上 させ、 より安価にグル夕ミン酸を製造するグル夕ミン酸発酵法を提供することを 目的とする。 本発明は、 染色体上のァミノ酸生合成系遺伝子のプロモー夕一を様々に改変し， 目的とする遺伝子の発現量を調節することにより上記課題を効率的に解決できる との知見に基づいてなされたものである。 特に、 プロモー夕一の特異的領域であ る— 3 5領域および/または一 1 0領域に特定の変異を導入することにより上記 課題を効率的に解決できるとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、 本発明は、 コリネ型細菌の染色体上のアミノ酸又は核酸生合成系遺 伝子のプロモー夕一配列に、 コンセンサス配列に近づくような変異を起こさせる か又は遺伝子組換えにより導入して、 コリネ型細菌の変異体を調製し、 該変異体 を培養して目的とするアミノ酸又は核酸の産生量の多い変異体を採取することを 特徴とするアミノ酸又は核酸産生能が向上したコリネ型細菌の調製方法を提供す o
本発明は、 又、 一 3 5領域に CGGTCA 、 TTGTCA、 TTGACA及び TTGCCA からなる- 群から選ばれる少なくとも一種の D N A配列及び/又は— 1 0領域に TATAAT配列 若しくは該配列の ATAAT の塩基が別の塩基で置換されており、 プロモーター機能 を阻害しない配列を有することを特徴とするグル夕ミン酸デヒドロゲナ一ゼ （G D H ) 産生遺伝子用プロモーターを提供する。
本発明は、 又、 上記プロモーターを有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ産生 遺伝子を提供する。
本発明は、 又、 上記遺伝子を有するコリネ型 L一グルタミン酸生産菌を提供す る。
本発明は、 また、 上記の方法で構築したアミノ酸又は核酸産生能が向上したコ リネ型細菌を、 培地で培養し、 培地中に目的のアミノ酸又は核酸を生成蓄積させ、 これを該培地から採取することを特徴とする発酵法による該アミノ酸又は核酸の 製造方法を提供する。
本発明は、 また、 4一フルォログルタミン酸に対して耐性を有するコリネ型 L 一グルタミン酸生産菌を、 液体培地で培養し、 培地中に L一グルタミン酸を生成 蓄積させ、 これを該培地から採取することを特徴とする発酵法による L一グル夕 ミン酸の製造方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 変異プロモー夕一を有する G D H遺伝子の構築フローを示す。
図 2は、 変異プロモーターを有する C S遺伝子の構築フローを示す。
図 3は、 レポ一夕一遺伝子として lacZ を有するシャトルベクターの構築フロ 一を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明でいうコリネ型グル夕ミン酸生産菌とは、 従来ブレビパクテリゥム属に 分類されていたが現在コリネパクテリゥム属細菌として統合された細菌を含み（In t. J. Syst. Bacteriol. , 41， 255( 1981 ) ) 、 またコリネパクテリゥム属と非常 に近縁なブレビパクテリゥム属細菌を含む。 したがって、 本発明で使用する変異- 株は、 ブレビパクテリゥム属またはコリネパクテリゥム属に属する下記のような コリネ型グルタミン酸生産菌から誘導することができる。 尚、 本明細書において、 グル夕ミン酸生産性に言及しない場合は、 コリネバクテリゥム属細菌及びブレビ パクテリゥム属細菌を単にコリネ型細菌ということがある。
コリネバクテリゥム ァセトァシドフイノレム ATCC13870
コリネバクテリゥム ァセトグル夕ミクム ATCC15806
コリネバクテリゥム カルナェ ATCC15991
コリネバクテリゥム グル夕ミクム ATCC13032
ブレビパクテリゥム ディバリカタム ATCC 14020
ブレビバクテリウム ラクトファーメン夕ム ATCC13869
コリネバクテリゥム リリウム ATCC15990
ブレビバクテリウム フラバム ATCC14067
コリネバクテリゥム メラセコーラ ATCC17965
ブレビパクテリゥム サッカロリティクム ATCC14066
ブレビパクテリゥム ィンマリオフィルム ATCC14068
ブレビパクテリゥム ロゼゥム ATCC13825
ブレビパクテリゥム チォゲ二夕リス ATCC19240
ミクロバクテリゥム アンモニアフィラム ATCC15354
コリネバクテリゥム サーモアミノゲネス AJ12310(FEEM 9246)
目的物質としてのァミノ酸としては、 生合成に関与する遺伝子およびそのプロ モーターが明らかになっているものであれば何でもよい。 生合成に関与する酵素 の例として具体的には， グルタミン酸発酵の場合には、 G D H、 クェン酸合成酵 素 （C S ) 、 イソクェン酸合成酵素 （ I C D H ) 、 ピルビン酸デヒドロゲナーセ ( P D H ) 、 アコ二夕一ゼ （A C O ) 等が有効である。
リジン発酵では、 ァスパルテート力イネ一ス （AK) 、 ジヒドロジピコリネート シン夕一セ、 ジヒドロジビコネートレダク夕ーゼ、 ジアミノビメレ一トデヒドロ ゲナ一ゼ、 ジァミノピメレートデカルボキシラーセなどの生合成系酵素に加え、 - リジンの膜排出に関与するリジン排出蛋白（ lysE遺伝子）も同様に有効である。 アルギニン発酵では、 N—ァセチルグルタミン酸シン夕一ゼ、 N—ァセチルグ ル夕ミン酸キナーゼ、 N—ァセチルグル夕ミルリン酸レダク夕ーゼ、 ァセチルォ ルニチンアミノ トランスフェラ一ゼ、 N—ァセチルオルニチナーゼ、 オル二チン 力ルバミルトランスフェラ一ゼ、 アルギニノコハク酸シン夕ーゼ及びアルギニノ サクシナ一ゼによって触媒される反応で生成する。 そして、 これらの酵素が有効 である。 また、 これらの酵素は、 順に argA、 argB、 argC、 argD、 argE、 argF、 a rgG、 argHの各遺伝子によってコードされている。
セリン発酵では、 3—ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、 ホスホセリント ランスァミナ一ゼ、 ホスホセリンホスファタ一ゼ等の酵素が有効である。
フエ二ルァラニン発酵では、 デォキシァラビノヘプヅロン酸リン酸合成酵素、 3—デヒド口キナ酸合成酵素、 3—デヒドロキナ酸デヒドラ夕一ゼ、 シキミ酸デ ヒドロゲナ一ゼ、 シキミ酸キナーゼ、 5—ェノールピルビルシキミ酸— 3—リン 酸合成酵素、 コリスミ酸合成酵素、 コリスミ酸ム夕ーゼ、 プレフヱン酸デヒドラ 夕一ゼ等の生合成酵素が有効である。 また、 トランスケトラ一ゼ、 トランスアル ドラーゼ、 フォスフォェノールピルビン酸合成酵素等の糖代謝系酵素も有効であ o
トリプトファン発酵では、 上記フェニルァラニン発酵で有効と考えられる諸酵 素、 セリン発酵で有効と考えられる諸酵素に加えて、 トリブトファンオペロンに 属する酵素が有効である。
プロリン発酵では、 上記グル夕ミン酸発酵で有効と考えられる諸酵素に加え、 ァーグル夕ミルキナ一ゼ、 ァーグル夕ミルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、 ビ 口リン一 5—カルボキシレートレダク夕ーゼ等が有効である。
グル夕ミン発酵では上記グル夕ミン酸発酵で有効と考えられる諸酵素に加え、 グル夕ミンシンテ夕一ゼが有効である。
ィノシン生産においては 5—ホスホリボシル 1—ニリン酸合成酵素、 5—ホス ホリボシル 1一 2リン酸ァミノ トランスフェラーゼ、 ホスホリボシルアミノィミ ダゾ一ルカルボキシアミ ド ホルミルトランスフェラ一ゼなどの酵素の発現強ィ匕 が有効であると考えられる。
グアノシン生産においては 5—ホスホリボシル 1一 2リン酸合成酵素、 5—ホ スホリボシル 1一 2リン酸ァミノ トランスフェラ一ゼ、 ホスホリボシルアミノィ ミダゾ一ルカルボキシアミ ド ホルミルトランスフェラ一ゼに加えて 5 ' —イノ シン酸デヒドロゲナーゼ、 5 ' —キサンチル酸アミナーゼの発現強化が有効であ ると考えられる。
アデノシン生産においては 5—ホスホリボシル 1— 2リン酸合成酵素、 5—ホ スホリボシル 1— 2リン酸ァミノ トランスフェラ一ゼ、 ホスホリボシルアミノィ ミダゾ一ルカルボキシアミ ド ホルミルトランスフェラ一ゼに加えて、 アデ二口 サクシネートシンテ夕ーゼの発現強化が有効であると考えられる。
ヌクレオチド生産においてはフォスフオリボシルトランスフェラーゼゃイノシ ンキナーゼ、 グアノシンキナーゼ、 アデノシンキナーゼの発現強化が有効である と考えられる。
本発明では、 コリネ型アミノ酸生産菌の染色体上の所望のアミノ酸生合成系遺 伝子のプロモーター配列、 例えば、 上記 GD H用プロモー夕一などのプロモー夕 一配列に、 コンセンサス配列に近づくような変異を、 化学薬品などを用いる変異 により起こさせるか又は該変異を遺伝子組換えにより導入して、 コリネ型ァミノ 酸生産菌の変異体を調製する。
ここで、 コンセンサス配列は、 多くのプロモ一夕一配列を比較して最も高頻度 で出現する塩基を並べた配列である。 このようなコンセンサス配列としては、 大 腸菌、 バチルス サブチリスなどのコンセンサス配列があげられる。 大腸菌のコ ンセンサス配列は、 Diane K. Haw ley and William R. McClure Nuc. Acid. Re s. 11 :2237- 2255( 1983 )に記載されており、 バチルス サブチリスのコンセンサ ス配列は、 Charles et al . Mol . Gen. Genet 186 :339- 346( 1982 )に記載されて いる。
上記変異は、 1つのプロモーター配列、 例えば、 G D H用プロモーターのみに 起こさせてもよいが、 2つ以上のプロモーター配列、 例えば、 GD H用プロモー 夕一、 クェン酸合成酵素 （C S ) やイソクェン酸合成酵素 （ I C D H) に起こき せてもよい。
本発明では、 このようにして得られた該変異体を培養して目的とするアミノ酸 の産生量の多い変異体を採取する。
グル夕ミン酸発酵の場合に、 コリネ型グル夕ミン酸生産菌の GD Hはそれ自身 のプロモ一夕一配列をその上流域に持つことが明らかになつている （Sahm et al. Molecular Microbiology(1992), 6， 317-326 )0
例えば、 本発明の G D H用プロモー夕一、 該 G D H用プロモーター配列を持つ GD H遺伝子及び該遺伝子を有する L一グル夕ミン酸生産性コリネバクテリア菌 株は、 例えば次のようにして得ることができる。
つまり、 上記のような菌株に紫外線照射、 X線照射、 放射線照射、 変異誘起剤 処理等の変異処理を施し、 4一フルォログル夕ミン酸を含有する寒天平板培地上 で、 4一フルォログルタミン酸に対して耐性を有する菌株を得る。 すなわち、 親 株の生育を抑制する濃度の 4一フルォログル夕ミン酸を含有する寒天平板培地上 に変異処理を施した菌株を塗布し、 生育してきた変異株を分離すればよい。
又、 G D H遺伝子のプロモーター配列を、 部位特異的変異法を用いて各種変異 を導入した配列に置換したものを多数作製し、 それぞれの配列と G D H活性との 関係を調べて、 L一グル夕ミン酸生産性の高いものを選択することができる。 本発明では、 特に、 GD H遺伝子のプロモーターの一 3 5領域の D NA配列が CGGTCA、 TTGTCA, TTGACA及び TTGCCA からなる群から選ばれる少なくとも一種の D N A配列となっているか、 及び/又は該プロモーターの— 1 0領域の D N A配 列が TATMTとなっているか、 若しくは一 1 0領域に TATMT配列の ATAAT の塩基 が別の塩基で置換されており、 プロモーター機能を阻害しない配列となっている ものが好ましい。 -10 配列の TATAAT配列の ATMT の塩基が別の塩基で置換され ており、 プロモー夕一機能を阻害しない配列となっているものを選択できるのは、 野生型の- 10 配列である CATMTの最初の 「C 」 を 「T 」 に代えただけで劇的に G D H比活性の上昇が観察されたので （表 1、 ρ6- 4参照） 、 他の塩基にかえても かまわないと考えられるからである。
GD H遺伝子のプロモ一夕一配列は、 例えば、 前出の Sahm et al. Molecular Microbiology(1992), 6, 317- 326に記載されており、 又、 配列番号 1に記載され ている。 又、 G D H遺伝孑自体の配列は、 例えば、 同じく Sahm et al. Molecula r Microbiology( 1992), 6， 317- 326に記載されており、 又、 配列番号 1に記載さ れている。
同様にして、 クェン酸合成酵素 （C S ) やイソクェン酸合成酵素 （ I C D H ) のプロモ一夕一についても変異を起こさせることができる。
このようにして、 G D H用プロモー夕一としては、 一 3 5領域に CGGTCA 、 TT GTCA、 TTGACA及び TTGCCA からなる群から選ばれる少なくとも一種の D N A配列 及び/又は一 1 0領域に TATMT配列若しくは該配列の ATMT の塩基が別の塩基 で置換されており、 プロモ一夕一機能を阻害しない配列を有するものがあげられ る。 又、 上記プロモーターを有するグルタミン酸デヒドロゲナ一ゼ産生遺伝子を 提供する。
C S用プロモーターとしては、 —3 5領域に TTGACA配列及び/又は一 1 0領 域に TATMT配列を有しており、 プロモ一夕一機能を阻害しない配列を有するもの があげられる。 又、 上記プロモ一夕一を有する C S遺伝子を提供する。
I C D H用プロモー夕一としては、 一3 5領域の第一又は第二のプロモ夕—に TTGCCA配列及び TTGACA配列のいずれか及び/又は— 1 0領域の第一又は第二の プロモ夕一に TATMT配列を有しており、 プロモーター機能を阻害しない配列を有 するものあげられる。 又、 上記プロモー夕一を有する icd遺伝子を提供する。
P D H用プロモー夕一としては、 — 3 5領域に TTGCCA配列及び/又は一 1 0領 域に TATMT配列を有しており、 プロモ一夕一機能を阻害しない配列をものがあげ られる。 又、 上記プロモ一夕一を有する P D H遺伝子を提供する。
本発明は、 又、 上記遺伝子を有するコリネ型 L一グルタミン酸生産菌を提供す る。
アルギニノコハク酸シン夕一ゼ用プロモー夕一としては、 一3 5領域に TTGCCA、 TTGCTA及び TTGTCA からなる群から選ばれる少なくとも一種の D N A配列及び/ 又は— 1 0領域に TATAAT配列若しくは該配列の ATAAT の塩基が別の塩基で置換 されており、 プロモーター機能を阻害しない配列を有するがあげられる。 又、 上 記プロモー夕一を有するアルギニノコハク酸シン夕一ゼ遺伝子を提供する。
本発明は、 又、 上記遺伝子を有するコリネ型アルギニン生産菌を提供する。 本発明のコリネ型ァミノ酸、 好ましくは L一グル夕ミン酸生産菌を、 液体培地 に培養し、 培地中に所望のアミノ酸、 好ましくは L一グルタミン酸を生成蓄積さ せ、 これを該培地から採取することによりァミノ酸を得ることができる。
本発明において上記菌株の培養に用いられる液体培地としては、 炭素源、 窒素 源、 無機塩類、 生育因子等を含有する通常の栄養培地が用いられる。
炭素源としては、 グルコース、 フラクト一ス、 シュクロース、 廃糖蜜、 澱粉加 水分解物等の炭水化物、 エタノール、 グリセロール等のアルコール類、 酢酸等の 有機酸類が使用される。 窒素源としては、 硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 アンモニア、 ぺプ トン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーン 'スティ一プ ' リカー等が使用される。 栄 養要求性を有する変異株を用いる場合には、 それらの要求物質を標品もしくはそ れを含有する天然物として添加するのがよい。
コリネ型細菌は一般に、 ピオチン制限下で L一グルタミン酸を生産する。 従つ て、 培地中のピオチン量を制限するか、 界面活性剤やペニシリンなどのビォチン 作用抑制物質を添加する。
発酵は、 振とう培養や通気攪拌培養等による好気条件下にて、 培養液の P Hを 5 ~ 9の間に保持しつつ 2〜 7日間行うのがよい。 p Hの調節には、 尿素、 炭酸 カルシウム、 アンモニアガス、 アンモニア水等を用いるのがよい。 培養温度は 2 4〜3 7 °Cであるのが好ましい。
培養液中に生成蓄積した L一グルタミン酸の採取は常法によって行えばよく、 例えばイオン交換樹脂法、 晶析法等によることができる。 具体的には、 Lーグル タミン酸を陰イオン交換樹脂により吸着、 分離させるか、 または中和晶析させれ ばよい。 本発明によれば、 コリネ型アミノ酸生産菌のアミノ酸生合成遺伝子のプロモー 夕一領域に変異を導入し， 目的遺伝子の発現量を調節することにより、 目的アミ ノ酸を高収率で得ることができ、 又プラスミ ドのように脱落がなく、 安定して目 的アミノ酸を高収率で得ることができるので、 工業的に大きな利点がある。 また、 本発明によれば、 副生ァスパラギン酸およびァラニンの増加を引き起こ すことなく、 コリネバクテリア菌株にアミノ酸、 特にグルタミン酸を高収率で生 産する能力を付与することができる各種プロモー夕一、 特に GD H用プロモ一夕 —を提供することができる。
また、 本発明によれば、 コリネ型 L一グルタミン酸生産菌に変異処理を施し、 変異が G D H遺伝子のプロモ一夕一領域に起こった、 4一フルォログル夕ミン酸 に対して耐性を有する菌株を採取し、 この菌株を培養することによりグル夕ミン 酸を高収率で得ることができるので、 工業的に大きな利点がある。
次に実施例により本発明を説明する。
実施例 1 ：変異型 G D Hプロモー夕一の作製
部位特異変異法を用い：次の方法で変異型 G D Hプロモ一夕一を調製した。 (1) 各種変異型のプロモー夕一を持つ G D H遺伝子の作製
コリネ型細菌の G D H遺伝子のプロモ一夕一の一 3 5領域および— 1 0領域の 野生型配列を配列 1に示す。 但し、 野生型のプロモ一夕一配列は既に報告されて いる (Molecular Microbiolgy (1992)， 6, 317-326) 。
変異型プロモーターを持つ G D H遺伝子を運ぶプラスミ ドの作製方法は、 以下 の通りである。 図 1に示すように、 "Bacterial Genome DNA purification kit" (Advanced Genetic Technologies Corp. )に基づいて調製したコリネ型細菌野生 株 ATCC13869 株の染色体遺伝子を錶型とし、 GD H遺伝子の上流と下流とで P C Rにより遺伝子を増幅し、 両端を平滑末端化した後に、 それをプラスミ ド PHSG39 9 (宝酒造社製） の Smal 部位に挿入した。 次にこのプラスミ ドの Sai l部位に、 コリネ型細菌で複製可能な複製基点をもつプラスミ ド PSA 4から取得した複製起 点を導入することによりプラスミ ド P G D Hを作製した。 この方法において、 G D H遺伝子の上流側のプライマーとして配列表 1から 6に示す配列を持つプライ マーを用いることにより、 上記のおのおのプロモータ一配列を持つ G D H遺伝子 を作製することが出来る。 なお、 ここで用いた P C R増幅断片中には導入したプ 口モーター配列内の変異以外は変異は導入されていないことを塩基配列の決定に- より確認した。 p SAK4を構築するためには、 既に取得されているコリネパクテリ ゥム属細菌で自律複製可能なプラスミ ド pHM1519(Agric. Biol. Chem. , 48, 2901 -2903( 1984))由来の複製起点を持つプラスミ ド pHK4 (特開平 5-7491号） を制限 酵素 BamHI 及び Kpnlで消化して、 複製起点を含む D Ν Α断片を取得し、 得られ た断片を D N A平滑末端化キット （宝酒造社製、 Bluntingkit)を用いて平滑末端 化した後 Sai lリンカ一 （宝酒造社製） を結合し、 これを PHSG299 の Sal Iサイ 卜に挿入した。 得られたプラスミ ドが PSAK4である。
(2) 各プロモーター配列を有する GD Hの発現量の比較
上記の様にして作製したプラスミ ドをコリネ型細菌野生株 ATCC13869株にそれ それ導入した。 導入の方法はエレクトロボレ一シヨン法を用いた （特開平 2— 2 0 7 7 9 1号公報参照） 。 作製したこれらの菌株の G D Hの発現量を比較するた めに、 GD Hの比活性を調べた。 活性測定方法は上記の Sahm 等の方法に従った。 その結果を表 1に示す。
菌 株 プロモータ- -配列 G D H比活性 相対値
ー 35 一 10
ATCC 13869 TGGTCA CATAAT 7.7 0.1
/pGDH TGGTCA CATAAT 82.7 1.0
/p6-2 CGGTCA CATAAT 33.1 0.4
/p6 - 4 TGGTCA TATAAT 225.9 2.7
/p6-3 TTGACA TATAAT 327.2 4.0
/p6-7 TTGCCA TATAAT 407.0 4.9
/p6-8 TTGTCA TATAAT 401.3 4.9 上記 ATCC 13869/p6- 2〜ATCC 13869/p6-8は配列番号 2〜 6に対応するもの であり、 これらの配列は配列番号 1記載の配列 （野生型） を基に下線部を下記の 通り変更したものである。
配列番号 1 5 ' -TTAATTCTTTGTGGTCATATCTGCGACACTGC CATAATTTGAACGT- 3 ' 配列番号 2 CGGTCA CATAAT 配列番号 3 TGGTCA TATAAT
配列番号 4 TTGACA TATAAT
配列番号 5 TTGCCA TATAAT
配列番号 6 TTGTCA TATAAT
尚、 これらの配列は、 直鎖状、 2本鎖の合成 D N Aである。 実施例 2 ：変異株の取得
( 1 ) 4—フルォログル夕ミン酸に対する耐性を有する変異株の誘導
AJ13029 株は W096/06180に記載されるグルタミン酸生産株で、 培養温度が 3 1. 5 °Cではグルタミン酸を生産しないが、 培養温度を 3 7 °Cにシフトするとビォチ ン作用抑制物質の非存在下でもグル夕ミン酸を生産する変異株である。 本実施例 では、 ブレビパクテリゥム ·ラクトフアーメンタム AJ13029 株を変異株誘導の親 株として用いた。 もちろん、 AJ13029 株以外のグルタミン酸生産株であっても 4 一フルォログル夕ミン酸に対する耐性を有する変異株誘導の親株となりうる。
AJ13029 株を CM2B寒天培地 （表 2 ) 上にて 3 1. 5 °Cで 2 4時間培養して菌体を 得た。 得られた菌体を 2 5 0〃g/mlのN—メチル— N ' —ニトロ— N—二トロソ グァニジンの水溶液で 3 0 °Cで 3 0分間処理した後、 生存率 1 %の当該菌体の懸 濁液を 4一フルォログルタミン酸 （ 4 F G ) を含む寒天平板培地 （表 3 ) に播種 し、 3 1. 5。Cで 2 0〜 3 0時間培養しコロニーを形成させた。 この際、 初めに l m g/ml の 4 F Gを含む培地を傾斜をつけて作製し、 その上に 4 F Gを含まない同培 地を水平に重層した。 これにより、 寒天培地表面は 4 F Gの濃度勾配が作製され る。 このプレート上に上記変異処理菌体を播種すると、 菌株の生育限界の領域を 境に境界線が出来る。 この境界よりも高濃度の 4 F Gが存在する領域でコロニー を形成した株を採種した。 かくして約 1 0, 0 0 0個の変異処理菌株から約 5 0株 の 4 F G耐性株を取得した。 表 2 C M 2 B寒天培地 成 分 濃 度 ポリペプトン （日本製薬社製） 1. 0%
酵母エキス （ディフコ社製） 1. 0%
NaCl 0. 5%
d—ピオチン 10 g /1
寒 天 1. 5%
H 7.2 K0Hで調整 )_ 表 3 寒天培地
成 分 水 1リットル中の添加量
グルコース 10 g
MgSO · 7H20 1 g
FeS04 7H,0 0. 0 1
MnS04 · 4— 6H20 0. 0 1 - サイアミン塩酸塩 0 2 mg
d—ビォチン 0 05 mg
(NH4) 2S04 5 S
Na2HP04 · 12H20 7. 1 g
KH2P04 1. 36 g
L 5 S_
(2) 4 FGに対して耐性を示す変異株による L一グルタミン酸の生産能の確認 上記（1) において得られた約 50株の変異株及びその親株である AJ13029 株に ついて、 グル夕ミン酸の生産能を以下のようにして確認した。
AJ13029 及び各変異株をそれぞれ CM 2 B寒天培地上にて 31.5 °Cで 20〜 3
0時間培養して得た菌体を表 4の A培地に示す組成の液体培地に接種し、 31.
5°Cで振とう培養を開始した。 約 22時間後、 最終濃度が表 4の B培地に示す濃 度になるように新たに培地を添加し、 37°Cにシフトさせ、 その後約 24時間培 養を行った。 培養終了後、 旭化成社製バイオテックアナライザ一を用いて L—グ ル夕ミン酸の生成の有無を調べた。 その結果、 この約 50株を培養しグル夕ミン 酸収率が親株より高く、 GDH活性も高い株を 2株分離した （A株および B株） 。 それぞれの G D H活性を測定したところ両株とも G D Hの比活性が上昇していた
(表 5) 。 GDH活性の測定は E. R. Bormann等の方法 （Molecular Microbiol.
6, 317-326(1996)) に従った。 そこで GD H遺伝子の塩基配列を解析したとこ ろ GDHのプロモー夕一領域内にのみ変異点が存在していた （表 6) 。 表 4 成 分 Α培地 B培地
グルコース 3 g/dl 5 g/dl
KH2P04 0. 14 g/dl 0. 14 g/dl
MgS04 · 7¾0 0. 04 g/dl 0. 04 g/dl
FeS04 · 7H20 0. 001 g/dl 0. 001 g/dl
MnS04 · 4¾0 0. 001 g/dl 0. 001 g/dl
(NH4)2S04 1. 5 g/dl 2. 5 g/dl 大豆蛋白加水分解液 1. 5 ml/dl 0. 38 ml/dl サイアミン塩酸塩 0. 2 mg/1 0. 2 mg/1 ビォチン 0. 3 mg/1 0. 3 mg/1 消泡剤 0. 05 ml/1 0. 05 ml/1
CaC03 5 g/dl 5 g/dl
H 7. 0 ( 0H で調整） 変異株のグル夕ミン酸生成と GDH活性
囷 休 Glu(g/dl) GDH比活性 相対値 AJ13029 2.6 7.7 1.0
FGR1 2.9 23.1 3.0
FGR2 3.0 25.9 3.4 表 6 変異株の GDHプロモ一夕- -領域の塩基配列 菌 株 GDHプロモ一夕一配列
-35 一 10
AJ13029 TGGTCA TTCTGTGCGACACTGC CATAAT
FGR1 TGGTCA TTCTGTGCGACACTGC TATAAT
FGR2 TTGTCA T-CTGTGCGACACTGC TATAAT
実施例 3 コリネ型グル夕ミン酸生産菌の C S遺伝子プロモーター領域への変異 の導入
本実施例ではグルタミン酸デヒドロゲナ一ゼ （GDH) およびクェン酸合成 酵素 （CS) をコードする遺伝子のプロモー夕一強化株を作成した例を示す。 ( 1) g A遺伝子のクロ一ニング
コリネ型細菌のクェン酸合成酵素をコードする遺伝子 gltA の塩基配列は既に 明らかにされている (Microbiol. 140 1817-1828 (1994)) 。 この配列をもとに 配列番号 7および配列番号 8に示すプライ.マ一を合成した。 一方、 Bacterial Genome DNA Purification Kit (Advanced Genetic Technologies Corp.)を用レヽて、 ブレビパクテリゥム ·ラクトフアーメンタム ATCC13869の染色体 MAを調製した。 この染色体 DNA を 0.5 g、 前記オリゴヌクレオチドをそれぞれ 10pmol、 dNTP mixture (各 2.5^)8〃 1、 10 x LA Taq Buffer (宝酒造） 5〃1、 LA Taq (宝酒 造） 2Uに滅菌水を加えて全量 50 ^1の PCR反応液を調製した。 この反応液をサ 一マルサイクラ一 TP240 (宝酒造） を用いて、 変性 94°C 30秒、 会合 55°C 15秒、 伸長反応 72°C 3分の条件で 30サイクルの PCRを行ない、 gltA遺伝子およびそ のプロモーターを含む約 3Kbpの DNA断片を増幅した。 得られた増幅断片は宝酒 造社製の SUPREC02 にて精製した後平滑末端化した。 平滑末端化は宝酒造社製の Blunting Kitにより行なった。 これと pHSG399 (宝酒造） を Smal で完全分解し たものを混合し連結した。 連結反応は宝酒造社製 DNA ligation kit ver2 にて 行なった。 連結した後、 ェシエリヒア 'コリ JM109のコンビテントセル （宝酒造 社製） を用いて形質転換を行い、 IPTG (イソプロピル- 5 - D-チォガラクトビラノ シド） 1 0〃g/ml、 X-Gal (5-ブロモ -4-クロ口 -3_インドリル-/? -D—ガラクトシ ド） 4 0 jus/m 及びクロラムフエ二コール 40 zg/mlを含む L培地 （パクトトリ プトン 10g/l、 パクトイ一ストエキストラクト 5g/l、 NaC15g/K 寒天 15g/l、 PH7.2) に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コロニ 一分離し、 形質転換株を得た。
形質転換株からアルカリ法 （生物工学実験書、 日本生物工学会編、 105 頁、 培 風館、 1992 年） を用いてプラスミ ドを調製し、 制限酵素地図を作成し、 図 2に 示す制限酵素地図と同等であるものを pHSG399CSと名付けた。
(2) gltAプロモ一夕一への変異導入
gltA プロモーター領域への変異導入には宝酒造社製の Mutan-Super Express Kmを用いた。 具体的な方法を以下に示す。 PHSG399CSを EcoRI，SalI で完全分解 し、 gltA遺伝子を含む EcoRI-Sall断片を調製し、 これと pKF19kM (宝酒造） を EcoRI, SalI で完全分解した断片とを連結した。 連結した後、 ェシエリヒア 'コ リ JM109 のコンビテントセル （宝酒造） を用いて形質転換を行い、 IPTG 1 0〃 g/ml、 X-Gal 4 0 g/ml及びカナマイシン 25〃g/ml を含む L培地に塗布し、 一 晚培養後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株 を得た。 形質転換株からプラスミ ドを調製し、 gltA遺伝子を含むものを PKF19CS と名づけた。
PKF19CS を錡型とし、 配列番号 9、 配列番号 1 0、 配列番号 1 1に示す 5'末端 リン酸化合成 DNAと Mutan super Express Km付属の selection primerを用いて PCRを行なった。 この PCR産物を用いてェシエリヒア 'コリ MV1184のコンビテ ントセル （宝酒造） の形質転換を行ない、 カナマイシン 25〃g/ml を含む L培地 に塗布し、 一晩培養後、 出現したコロニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質 転換株を得た。 形質転換体よりプラスミ ド MAを調製し、 配列番号 1 2に示す合 成 MAを用いて Sangerの方法 (J.Mol . Biol . , 143, 161 , ( 1980)) で g Aプロモー 夕一部の塩基配列を決定した。 具体的には、 塩基配列の決定には Dye terminator sequencing kit( Appl ied Biosystems )を用 、て Genetic Analyzer ABI310 (Applied Biosystems) で解析した。 g A プロモー夕一領域が表 7に示 す配列に置換されたものを、 それぞれ 0"19031 ^19 32, 19 34と名づけた。 表 7
-35領域 -10領域
PKF19CS ATGGCT TATAGC
PKF19CS1 ATGGCT TATAAC
PKF19CS2 ATGGCT TATAAT
PKF19CS4 TTGACA TATAAT
(3) 変異型 gltAプラスミ ドの構築
( 2) で構築した pKF19CS,pKF19CSl,pKF19CS23pKF19CS をそれぞれ Sall、 EcoRI (宝酒造)で完全分解した。 一方で、 コリネ型細菌で自律複製可能なプラス ミ ド PAM330 (特開昭 58-67699) 由来の複製起点を持つプラスミ ド pSFK6(特願平 11 - 69896 )を EcoRI，Sal Iで完全分解し、 これと gltAを含む約 2.5kbの断片を連 結した。 連結した後、 ェシエリヒア 'コリ JM109のコンビテントセルを用いて形 質転換を行い、 IPTG 1 0〃g/ml、 X-Gal 4 0 g/ml 及びカナマイシン 25 zg/ml を含む L培地に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コ ロニ一分離し、 形質転換株を得た。 形質転換株からプラスミ ドを調製し、 gltA 遺伝子を含むプラスミ ドをそれぞれ pSFKC， pSFKCl，pSFKC2,pSFKC4とした。
( 4 ) 変異型 gltAプラスミ ドのコリネ型細菌における CS発現量の測定 上記 （3) で構築したプラスミ ドをブレビパクテリゥム ·ラクトファーメン夕 ム ATCC13869に導入した。 具体的には、 電気パルス法を用い （特開平 2-07791) 、 形質転換体の選択は 25〃g/mlのカナマイシンを含む CM2Bプレート培地 （パクト トリプトン 10g/l、 パクトイ一ストエキストラクト 10g/l、 NaC15g/ ピオチン 10 g/L、 寒天 15g八、 pH7.0) で、 31°Cにて行った。 ニ晚培養後、 出現したコロ 二一を釣り上げ、 単コロニー分離し pSFKC, pSFKCl, pSFKC2，pSFKC4を保持する形 質転換体をそれぞれ BLCS, BLCS1 , BLCS2, BLCS4 と名づけた。 形質転換体を表 Sに示す培地に接種し、 31°Cで培養を継続し、 完全にグルコースを消費する前 に培養を終了した。 培養液を遠心し、 菌体を分離した。 菌体は 200m のグルタミ ン酸ナトリウムを含む 50 のトリス緩衝液 （pH7. 5) にて洗浄したのち、 同緩衝 液に懸濁し超音波破砕を行なった。 超音波破砕は T0 Yの UD-201によった。 超音 波破砕後、 10000gにて 20分遠心を行ない、 未破砕菌体を取り除いたものを粗酵 素液とした。 クェン酸合成酵素の活性の測定は （Methods Enzymol . 13, 3- 11 ( 1969 ) ) にしたがって行なえばよい。 具体的には TisHCl 100mM(pH8) , DTNB O . l M, グル夕ミン酸ナトリウム 200mM, ァセチル CoA 0.3mMを含む反応液に粗 酵素液を添加し、 30°Cにおける 412nm の吸光度の増大を日立分光光度計 U-3210 で測定することにより求め、 これをバックグラウンドとした。 さらにォキサ口酢 酸を終濃度 0.5πιΜとなるよう添加し 412nmの吸光度の増大を測定し、 バックグラ ゥンドの値を差し引いた値をクェン酸合成酵素の活性とした。 また、 粗酵素液の 蛋白質濃度の測定には Protein Assay (BIO- RAD) を用いた。 標準蛋白質には牛 血清アルブミンを用いた。 測定結果を表 9に示す。 野生型の gUA プロモ一夕一 と比べて gltA プロモ一夕一変異株ではクェン酸合成酵素活性が上昇しているこ とが確認された。 表 8
成分 濃度
グルコース 50 g/1
KH2P04 1 /1
MnS04- 7H20 0.4 mg/1
FeS04- 7H2 10 mg/1 大豆蛋白加水分解物 20 ml/1
ピオチン 0.5 mg/1
サイアミン塩酸塩 2 mg/1 _
表 9
菌株 dABS/min/mg 相対活性 相対活性
野生株 6.8 1.0
BLCS00 38.8 5.7 1.0
BLCS01 57.1 8.4 1.2
BLCS02 92.5 13.6 1.9
BLCS04 239.4 35.2 4.8
( 5 ) 変異型 gUA遺伝子の温度感受性プラスミ ドへの導入
変異型 gltA プロモー夕一配列の染色体への遺伝子組み込み方法としては、 コ リネ型細菌内で複製が温度感受性であるブラスミ ドを用いる方法が知られている
(特開平 5-7491) 。 ここではコリネ型細菌内でその複製が温度感受性であるプ ラスミ ドベクタ一として PSFKT2 (特願平 11- 81693) を用いた。 変異型 gltAプロ モーター配列として pKFCSl，pKFCS2,pKFCS4を Sailおよび BstPIで完全分解し平 滑末端化したもの用い、 これと PSFKT2を Smalで完全分解したものを連結した。 連結した後、 ェシエリヒア 'コリ JM109のコンビテントセル （宝酒造社製） を用 いて形質転換を行い、 IPTG 1 0〃g/ml、 X- Gal 4 0〃g/ml及びカナマイシン 25〃 g/mlを含む L培地に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。 形質転換株からプラスミ ドを調製し、 gltA遺伝子を含む温度感受性シャトルベクターをそれぞれ pSFKTCl , pSFKTC2, PSFKTC4と名づけた。
( 6 ) 変異型 gltAプロモーターの染色体への導入
pSFKTCl , pSFKTC2, pSFKTC4 をそれぞれブレビパクテリゥム ·ラクトファ一メ ン夕ム FGR2 株に電気パルス法で導入した。 形質転換体の選択は、 25 /g/ml の カナマイシンを含む CM2B プレート培地で、 25°Cにて行った。 導入後、 得られた 株を CM2B液体培地にて培養した後、 25〃g/mlのカナマイシンを含む CM2Bプ レ —卜に、 プレートあたり 103〜105 cfu となるよう希釈した後に塗布し、 34°Cに て培養した。 温度感受性プラスミ ドを保持した株は、 この温度ではプラスミ ドの 複製が阻害されるため、 カナマイシン感受性となり、 コロニーを形成できないが、 染色体にプラスミ ド DNA を組み込んだ株は、 コロニーを形成 するため、 選択す ることができる。 出現しコロニーを釣り上げ、 単コロニー分離した。 この株より 染色体 DNAを抽出し、 これを錶型として配列番号 8と配列番号 1 3に示すプライ マ一を用い PCRを行ない、 およそ 3 k bの増幅断片が確認した。 したがつてこの 株は相同的な組換えにより、 宿主染色体の gltA遺伝子の近傍に、 温度感受性プ ラスミ ド由来の変異型 gltA 遺伝子が組み込まれていることが示された。 pSFKTCl,2,4より誘導された株をそれぞれ BLCS11、 BLCS12, BLCS14と名づけた。
(7) gltAプロモー夕一置換株の取得
相同組換えにより、 変異型 gltA遺伝子を組み込んだ BLCS11、 BLCS12, BLCS1 株 より、 まず、 カナマイシン感受性株を取得した。 プラスミ ド組み込み株を CM2B プレートに希釈、 塗布し、 34°Cで培養する。 コロニー形成後、 25 /g/ml のカナ マイシンを含む CM2B プレートにレプリカし、 34°Cで培養する。 このとき、 カナ マイシン感受性になった株を取得した。
カナマイシン感受性になった株から、 染色体を抽出し、 配列番号 7および配列 番号 8に示すプライマ一を用いて PCRを行ない gltA遺伝子断片を調製した。 得 られた増幅断片は宝酒造社製の SUPREC02 にて精製した後、 配列番号 1 3に示す プライマーを用いてシーケンス反応を行ない、 そのプロモー夕一領域の配列を決 定した。 その結果、 表 7中の PKF19CS1と同じプロモ一夕一配列をもつ株を GB01、 PKF19CS と同じプロモー夕一配列をもつ株を GB02、 pKF19CS4 と同じプロモ一夕 —配列をもつ株を GB03 と名づけた。 これらの株では、 染色体からプラスミ ドぉ よび重複する gltA 遺伝子が脱落する際、 プラスミ ドにより導入した変異型の gltA遺伝子は染色体上に残り、 元来染色体上にあった野生型の gltA遺伝子が、 ベクタープラスミ ドと共に脱落し、 遺伝子置換が起こったことを意味する。 ( 8 ) gltAプロモーター変異株のクェン酸合成酵素活性測定
( 7 ) で得られた FGR2， GB01, GB02, GB03株及び FGR2/pSFKC株を （4 ) に記載 した方法と同様にしてクェン酸合成酵素の活性を測定した。 測定結果を表 1 0に 示す。 gltA プロモーター置換株はその親株に比しクェン酸合成酵素活性が上昇 していることが確認された。 表 1 0
dABS/min/m¾ 相対活性
FGR2 7.9 1.0
GB01 9.5 1.2
GB02 15.0 1.9
GB03 31.6 4.0
FGR2/j)SFKC 61.6 7.8
( 9 ) gltAプロモー夕一置換株の培養成績
上記（ 7 )で取得した各株を表 1 1に示す組成の種培養培地に接種し、 31.5°Cに 2 時間振とう培養して種培養を得た。 表 1 1に示す組成の本培養培地を 500ml 容ガラス製ジャーフアーメン夕一に 300mlずつ分注し加熱殺菌した後、 上記種培 養を 40ml接種した。 攪拌速度を 800〜1300rpm、 通気量を l/2〜l/lvvmとし、 培 養温度 31.5°Cで培養を開始した。 培溶液の pHはアンモニアガスで 7.5に維持し た。 培養を開始して 8時間後に 37°Cにシフトした。 いずれも 20〜40時間でグル コースが完全に消費された時点で培養を終了し、 培溶液中に生成蓄積された L- グル夕ミン酸の量を測定した。
その結果、 表 1 2に示すように GB01 や FGR2/pSFKC株よりは、 むしろ GB02 や GB02株では L-グルタミン酸の大幅な収率向上が認められた。 以上のことより、 これらの株のグルタミン酸収率向上において、 プロモ一夕一に変異を導入し CS 活性を 2〜 4倍に強めることで好成績となりうることが示された。 表 11 成 分
本培養
f J 一
Figure imgf000025_0001
KH2P04 1 g/1 2 g/1
MgS04-7H20 0.4 g/1 1.5 g/1
coU4 llgU 1 π fflg/ j ing/
MnS04-4¾0 10 mg/1 15 mg/1
大豆蛋白加水分解 20 ml/1 50 ml/1
ピオチン 0.5 mg/1 2 mg/1
サイアミン塩酸塩 2 mg/1 3 mg/1 表 12
株 L -グル夕ミン酸 (g/1)
FGR2 8.9
GB01 9.1
GB02 9.4
GB03 9.4
FGR2/pSFKC 9.1 実施例 4 コリネ型グル夕ミン酸生産菌の ICDH遺伝子プロモ一夕一領域への変 異の導入
本実施例ではグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、 クェン酸合成酵素およびイソク ェン酸デヒドロゲナ一ゼをコ一ドする遺伝子のプロモー夕一強化株を作成した例 を示す。
( 1) icd遺伝子のクローニング
コリネ型細菌のクェン酸合成酵素をコードする遺伝子 icdの塩基配列は既に明 らかにされている (J.Bacteriol. 177 774-782 (1995)) 。 この配列をもとに配 列番号 1 4および 1 5に示すプライマーを合成し、 ブレビパクテリゥム ·ラクト フアーメンタム ATCC13869の染色体 DNAを錡型として PCRを行ない、 icd遺伝子 およびそのプロモータ一を含む約 3 Kbpの DNA断片を増幅した。 得られた増幅断 片は EcoRIにて完全分解し、 これと PHSG399 (宝酒造） を EcoRIで完全分解した ものを混合し連結した。 連結した後、 ェシエリヒア 'コリ JM109のコンビテント セルを用いて形質転換を行い、 IPTG 1 0〃g/ml、 X-Gal 4 0 /g/ml 及びクロラム フエニコ一ル 40 /g/ml を含む L培地に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコ ロニ一を釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。
icd遺伝子を有するプラスミ ドを pHSG399icdと名付けた。
(2) icdプロモ一夕一への変異導入
icd遺伝子の正確なプロモ一夕一の位置は決定されていない。 そこで、 ICDHを コードする遺伝子の上流配列をプロモーター様の配列に人為的に改変することに より、 icd遺伝子の] nRNA転写量を増大させうる可能性を検討した。 具体的には、 ICDH 蛋白質の第一 ATG から上流約 190bp (第一のプロモーター） 及び約 70bp (第二のプロモータ一） の D N A配列中に存在する- 10様領域に変異を導入した。 icd遺伝子上流域への変異導入には宝酒造社製の Mutan-Super Express Km を 用いた。 具体的な方法を以下に示す。 pHSG399icdを Pstl で完全分解し、 icd遺 伝子のプロモ一夕一を含む Pstl 断片を調製し、 これと pKF18kM (宝酒造） を Pstlで完全分解した断片とを連結した。 連結した後、 ェシエリヒア 'コリ JM109 のコンビテントセル （宝酒造社製） を用いて形質転換を行い、 IPTG 1 0 /zg/ml、 X-Gal 4 0 zg/ml及びカナマイシン 25〃g/ml を含む L培地に塗布し、 一晩培養 後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た 形質転換株からプラスミ ドを調製し、 icd 遺伝子のプロモー夕一を含むものを pKF18icdと名づけた。
pKF18icd を錡型とし、 配列番号 1 6、 配列番号 1 7、 配列番号 1 8、 配列番 号 1 9、 配列番号 2 0、 配列番号 2 1に示す 5'末端リ ン酸化合成 DNA と selection primer を用い PCR を行なった。 この PCR 産物を用いてェシエリヒ ァ . コリ JM109 のコンビテントセルの形質転換を行ない、 カナマイシン 25 / g/ml を含む L 培地に塗布し、 一晩培養後、 出現したコロニーを釣り上げ、 単コ ロニ一分離し、 形質転換株を得た。 形質転換体よりプラスミ ド DNAを調製し、 配 列 番 号 2 2 に 示 す 合 成 DNA を 用 い て Sanger の 方 法 (J.Mol . Biol. , 143, 161, (1980)) で icdプロモ一夕一部の塩基配列を決定した。 具体的には、 塩基配列の決定には Dye terminator sequencing kit(Applied Biosystems)を用レヽて Genetic Analyzer ABI310 (Applied Biosystems) で解析 した。 icd プロモーター領域が表 7 に示す配列に置換されたものを、 それぞれ PKF18ICD1, p龍薩, KF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6 と名づ けた。 このうち、 PKF18ICD2を Pstlで完全分解し、 icd遺伝子のプロモ一夕一を 含む Pstl断片を調製し、 これと pKF18kM (宝酒造） を Pstlで完全分解した断片 とを連結した。 連結した後、 ェシエリヒア ·コリ JM109のコンビテントセル （宝 酒造社製） を用いて形質転換を行い、 IPTG 1 0〃g/ml、 X-Gal 4 0 /g/ml 及び力 ナマイシン 25〃g/ml を含む L培地に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロ ニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。 形質転換株からブラ スミ ドを調製し、 icd遺伝子のプロモ一夕一を含むものを PKF18ICDM2 と名づけ た。 pKF18ICDM2 を铸型とし、 配列番号 2 0、 配列番号 2 1に示す 5'末端リン酸 化合成 DNAと selection primerを用い PCRを行なった。 この PCR産物を用いて ェシエリヒア ·コリ JM109のコンビテントセルの形質転換を行ない、 カナマイシ ン 25 zg/mlを含む L培地に塗布し、 一晩培養後、 出現したコロニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。 形質転換体よりブラスミ ド DNAを調製し、 配列番号 2 2に示す合成 DNAを用いて icdプロモ一夕一部の塩基配列を決定した。 icd プロモ一夕一領域が表 1 3に示す配列に置換されたものを、 それぞれ PKF18ICD25, pKF18ICD26と名づけた。 表 1 3
プラスミ ド プロモーター 1 プロモ一夕一 2
^ zlO 235 -10
PKF18ICD GCGACT GAAAGT TTTCCA CACCAT PKF18ICD01 GCGACT TATAAT TTTCCA し Aしし A 1
PKF18ICD02 TTGACA TATAAT TTTCCA し Aしし A 1
PKF18ICD03 TTGACT TAAAGT TTTCCA し Aしし A i
PKF18ICD04 GCGACT GAAAGT TTTCCA 1A1AA1
PKF18ICD05 GCGACT GAAAGT , TTGCCA TATAAT
PKF18ICD06 GCGACT GAAAGT TTGACA TATAAT
PKF18ICD25 TTGACA TATAAT TTGCCA TATAAT
PKF18ICD26 TTGACA TATAAT TTGACA TATAAT
( 3 )プロモー夕一活性測定用プラスミ ドの構築
プロモーター活性を簡便に測定するためには、 レポ—夕—遺伝子を用いて間接 的にプロモー夕一活性を測定する方法が考えられる。 レポ一夕一遺伝子として望 まれる性質として、 活性測定が簡単であること、 N 末端側にアミノ酸が不可され ても活性が著しく低下しないこと、 バックグランドの反応がないこと、 遺伝子操 作をする上で適当な制限酵素切断部位があることが挙げられる。 ェシエリヒア' コリの/?ガラクトシダ一ゼ （LacZ) は広くレポ一夕一遺伝子として用いられてお り、 またコリネバクテリゥム属細菌にはラク トース資化能がないことから (J. Gen.Appl .Microbiol . , 18, 399-416( 1972) ) 、 レポ一夕一遺伝子として LacZ を用いるのが最適であると判断した。 そこで、 LacZ をレポ一夕一遺伝子として 搭載するプラスミ ド pNEOLの構築を行なった （図 3 ) 。 以下その過程を詳細に記 す。 配列番号 2 3、 配列番号 2 4に示す合成 DNA をプライマ一として E. coli ME8459(ME8459 は、 日本の国立遺伝学研究所に寄託されている）から得られた染 色体 D N Aを錡型として PCRを行なった。 PCR産物は Smal、 BamHIで完全分解し た後、 pKF3(宝酒造）を Hindl l lで分解し平滑末端化したものとを連結した。 連結 した後、 ェシエリヒア 'コリ JM109のコンビテントセル （宝酒造社製） を用いて 形質転換を行い、 カナマイシン 25〃g/ml を含む L培地に塗布し、 一晩培養後、 出現したコロニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。 形質転換 株からプラスミ ドを調製し、 pKF3nptI I とした。 次にこれを Sail で分解し、 一 方で pSAK4を、 実施例 1の （1) と同様にして SmaI , SalIで完全分解し平滑末端 化したものを連結し、 コリネ型細菌内で複製可能なシャトルベクター pNEO を構 築した。 このプラスミ ドは宿主にクロラムフエ二コール耐性およびカナマイシン 耐性を付与する。 さらに p NEOを SmaI , Sse8387I で完全分解し、 これと pMC1871
(フアルマシア バイオテク） を PstI , SmaI で完全分解したものを連結し、 レ ポー夕一遺伝子として N末端側の 8アミノ酸を欠失した LacZを有するコリネ型 細菌内で複製可能なシャトルベクタ一 PNE0Lを構築した （図 3 ) 。
( 4 ) 変異型 icdプロモーター活性の測定
( 2 ) で構築した変異型 icd プロモ一夕一を有するプラスミ ド PKF18ICD1 , PKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKF18ICD25, PKF18ICD26および pKF18ICD を SacI I,PstI で完全分解した後、 平滑末端化し、 pNEOL を Smal で切断したものと連結した。 連結した後、 ェシエリヒア · コリ JM109 のコンビテントセルを用いて形質転換を行い、 IPTG、 X-Ga クロラムフ ェニコール 40 g/ml を含む L培地に塗布し、 一晩培養後、 出現した青色のコロ ニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。
形質転換株からプラスミ ドを調製し、 ICDHと LacZの融合たんばく質が産生さ れうる構造のものを、 pNEOICDl, pNE0ICD2, pNE0ICD3, pNE0ICD4, pNE0ICD5, PNE0ICD6, pNE0ICD25, pNE0ICD26, pNEOLICD とした。 これらのプラスミ ドお よび pNEOL を電気パルス法にてブレビバクテリゥム · ラク トフアーメンタム ATCC13869に導入した。 形質転換体の選択は 25〃g/mlのカナマイシンおよび X- Gal 4 0 //g/mlを含む CM2Bプレー卜培地 （バクト 卜リプトン 10g/l、 バク卜ィ —ス トエキス トラク ト 10g八、 NaC15g/K ピオチン 10 z g/L、 寒天 15g/l、 PH7.0) で、 31°Cにて行った。 ニ晚培養後、 出現したコロニーを釣り上げ、 単コ ロニ一分離し pNEOICDl, pNE0ICD2, pNE0ICD3, pNE0ICD4, pNE0ICD5, PNE0ICD6, pNE0ICD25, pNE0ICD26, pNEOLICD を保持する形質転換体をそれそ れ BLAC1SBLAC2 BLAC3 BLAC4 BLAC5 BLAC6 BLAC25 BLAC26 BLACBNEOL と名づけ た。 BNE0 以外の形質転換体はすべて青色のコロニーを形成していた。 これらの 形質転換体より実施例 3 ( 4 ) 記載の方法で袓酵素液を調製した。 ただし、 菌体 の洗浄および懸濁には緩衝液として、 Z- Buffer(KCl 10mM, MgS04 ImM, 2-ME 270 / l/100mM NaPi (pH7.5) )を用いた。 LacZ の活性の測定は以下の手順に従って行 なった。 Z- Bufferと粗酵素液を混合し、 終濃度 0.8mg/mlとなるように Z-Buffer に溶解した 0NPGを添加し、 30°Cにおける 420nmの吸光度の増大を日立分光光度 計 U- 3210で測定した値を LacZの活性とした。 また、 粗酵素液の蛋白質濃度の測 定には Protein Assay(BIO-RAD)を用いた。 標準蛋白質には牛血清アルブミンを 用いた。 測定結果を表 1 4に示す。 icd プロモーターに変異を有する ICDH- LacZ 融合蛋白を発現している株は、 野生型の ICDH- LacZ融合蛋白を発現している株に 比べて LacZ素活性が上昇していることが確認された。 表 1 4
dABS rain tng 植撤
BNE0L Not detected 0.0
PNE0LI 42 1.0
BNE0LI-1 84 2.0
BNE0LI-2 168 4.0
BNE0LI-3 80 1.9
BNE0LI-4 126 3.0
BNE0LI-5 139 3.3
BNE0LI-6 84 2.0
BNE0LI-25 168 4.0
BNE0LI-26 170 4.0
( 5 ) 変異型 icd遺伝子の温度感受性プラスミ ドへの導入
コリネ型細菌内でその複製が温度感受性であるプラスミ ドベクター PSFKT2 (特願 平 11-81693 ) を用いた。 変異型 icd プロモー夕一配列として （pKF18ICDl， PKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD53 pKF18ICD6, pKFICD25, pKFICD26 を Pstlで完全分解し、 これと pSFKT2を Pstlで完全分解したものを連結した。 連結した後、 ェシエリヒア 'コリ JM109のコンビテントセル （宝酒造社製） を用 いて形質転換を行い、 IPTG 1 0 zg/ml、 X-Gal 4 0 g/ml及びカナマイシン 25 / g/mlを含む L培地に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。 形質転換株からプラスミ ドを調製し、 icd プロモーターを含む温度感受性シャ トルべクタ一をそれぞれ pSFKTIl, PSFKTI2, , pSFKTI3, pSFKTI4, pSFKTI5, pSFKTI6, pSFKTI25, pSFKTI26 と名づ けた。
( 6 ) 変異型 icdプロモー夕一の染色体への導入
( 5 ) で構築したプラスミ ドをそれぞれブレビパクテリゥム ·ラクトファーメ ン夕ム GB02株に電気パルス法で導入した。 形質転換体の選択は、 25〃g/mlの力 ナマイシンを含む CM2B プレート培地 （パクト トリプトン 10g/l、 バクトイ一ス トエキストラクト 10g/U NaC15g/l、 ピオチン 10〃g/L、 寒天 15g/l、 pH7.0) で、 25°Cにて行った。 導入後、 得られた株を CM2B 液体培地にて培養した後、 25 g/mlのカナマイシンを含む CM2Bプ レートに、 プレートあたり 103 ~105 cfuと なるよう希釈した後に塗布し、 34°Cにて培養した。 温度感受性プラスミ ドを保持 した株は、 この温度ではプラスミ ドの複製が阻害されるため、 カナマイシン感受 性となり、 コロニーを形成できないが、 染色体にプラスミ ド DNAを組み込んだ株 は、 コロニーを形成 するため、 選択することができる。 出現したコロニーを釣 り上げ、 単コロニー分離した。 この株より染色体 DNAを抽出し、 これを錡型とし て配列番号 1 3と配列番号 1 5に示すプライマーを用い PCRを行ない、 およそ 3 k bの増幅断片を確認した。 したがつてこの株は相同的な組換えにより、 宿主染 色体の icd遺伝子の近傍に、 温度感受性プラスミ ド由来の変異型 icd遺伝子が組 み込まれていることが示された。
( 7 ) icdプロモー夕一置換株の取得
相同組換えにより、 変異型 icd遺伝子を組み込んだ （6 ) 記載の株より、 まず、 カナマイシン感受性株を取得した。 プラスミ ド組み込み株を CM2B プレートに希 釈、 塗布し、 34°Cで培養する。 コロニー形成後、 25 Adg/ml のカナマイシンを含 む CM2B プレートにレプリカし、 34°Cで培養する。 このとき、 カナマイシン感受 性になった株を取得した。 カナマイシン感受性になった株から、 染色体を抽出し、 配列番号 1 4、 配列番 号 1 5にしめすプライマーを用いて PCRを行ない icd遺伝子断片を調製した。 得 られた増幅断片は宝酒造社製の SUPREC02 にて精製した後、 配列番号 2 2に示す プライマーを用いてシーケンス反応を行ない、 そのプロモーター領域の配列を決 定した。 その結果、 pSFKTIl , pSFKTI2, , pSFKTI3, pSFKTR, pSFKTI5， pSFKTI6, PSFKTI25, pSFKTI26 由来の icd プロモー夕一配列を有する株をそれぞれ GC01, GC02, GC03, GC04, GC05, Gc065 Gc25，及び GC26と名づけた。 これらの株では、 染色体からプラスミ ドおよび重複する icd遺伝子が脱落する際に、 プラスミ ドに より導入した変異型の icd遺伝子が染色体上に残り、 元来染色体上にあった野生 型の icd遺伝子が、 ベクタ一プラスミ ドと共に脱落している。
( 8 ) icdプロモーター変異株のィソクェン酸脱水素酵素活性測定
( 7 ) で得られた 8株ならびに GB02株を実施例 3 (7) 記載の方法と同様にし て ICDH粗酵素液を調製した。 ICDHの活性の測定は以下の手順に従って行なった。 TisHCl 35mM(pH7.5 ), MnS04 1.5mM, NADP O. lmM，イソクェン酸 1.3mMを含む反応 液に粗酵素液を添加し、 30 Cにおける 340nm の吸光度の増大を日立分光光度計 U-3210で測定した値を ICDHの活性とした。 また、 粗酵素液の蛋白質濃度の測定 には Protein Assay(BIO-RAD)を用いた。 標準蛋白質には牛血清アルブミンを用 いた。 測定結果を表 1 5に示す。 icd プロモ一夕一置換株はその親株に比しイソ クェン酸脱水素酵素活性が上昇していることが確認された。 表 1 5
dABS/min/mg 相対活性
GB02 3.9 1.0
GC01 8.2 2.1
GC02 19.1 4.9
GC03 7.0 1.8
GC04 12.5 3.2
GC05 19. 1 4.9 GC06 10.5 2.7
GC25 30.4 7.8
GC26 24.2 6.2
(9) icdプロモー夕一置換株の培養成績。
(7) で取得した 8株を、 実施例 3 (9) 記載の方法と同様にして培養した。 その結果、 表 16に示すように GC02, GC04, GC05, GC25及び GC26株では L -グ ル夕ミン酸の収率向上が認められた。 icd プロモー夕一に変異を導入し ICDH活 性を 3倍以上に強めることで好成績となりうることが示された。 表 16
L-グル夕ミン酸
GB02 9.2
GC01 9.0
GC02 9.5
GC03 9.1
GC04 9.4
GC05 9.6
GC06 9.2
GC25 9.9
GC26 9.8 実施例 5 コリネ型グル夕ミン酸生産菌の PDH遺伝子プロモー夕一領域への 変異の導入
(1) コリネ型細菌からの pdhA遺伝子のクローニング
大腸菌、 緑膿菌および結核菌のピルビン酸デヒドロゲナーゼ （PDH) の E1 サブュニット間で相同性の高い領域を選び、 配列番号 25および配列番号 26に 示すプライマ一を合成し、 Advanced Genetic Technologies Corp.製 Bacterial Genomic DM Purification Kit によって調整したブレビパクテリゥム ·ラク トフエルメンタム A T C C 1 3 8 6 9の染色体を鎢型とし、 P C Rテクノロジ — (ヘンリーエーリツヒ編、 ストックトンプレス、 1 9 8 9年） 8頁に記載され ている標準反応条件で P C Rを行い、 反応液をァガロースゲル電気泳動したとこ ろ、 約 1 . 3キロベースの D N A断片増幅していることが判明した。 得られた D N Aは、 配列番号 2 5および配列番号 2 6の合成 DNAを用いて両端の塩基配列の 決定を行った。 塩基配列の決定は、 DNA Sequencing Kit (Applied Biosystems 社製） を用いて Sanger の方法 （J. Mol . Biol. , 143, 161 ( 1980) ) に従って 行った。 決定された塩基配列をアミノ酸に翻訳して、 大腸菌、 緑膿菌および結核 菌のピルビン酸デヒドロゲナ一ゼの E1 サブュニッ卜と比較したところ、 相同性 が高かったので、 P C Rにより増幅した DNA断片はブレビパクテリゥム ·ラクト フアーメン夕ムブレビバクテリゥム ·ラクトフエルメンタム A T C C 1 3 8 6 9のピルビン酸デヒドロゲナ一ゼの E1サブユニットをコードする pdhA遺伝子の 一部であると判断し、 その遺伝子の上流および下流部分のクロ一ニングを行った。 クロ一ニングの方法は、 ブレビパクテリゥム 'ラクトフェルメンタム A T C C 1 3 8 6 9染色体を制限酵素 EcoRI, BamHI , Hind I II , Pst I, Sal I， Xba I (宝酒造社製） で消化した DNA断片から、 上流部分をクローニングするために配 列表配列番号 2 7および配列番号 2 8に示したプライマ一を使い、 下流部分をク ローニングするために配列番号 2 9および配列番号 3 0に示したプライマ一を使 い、 LA PCR in vitro cloning Kit (宝酒造製） を用いてクロ一ニングを行った。 このキットで PCRを行った結果、 上流部分は EcoRI, Hind II I, Pst I , Sal I， Xba Iで消化した断片でそれぞれ約 0.5， 2.5, 3.0， 1.5， 1.8キロベースの D NA断片が増幅され、 また下流部分は BamHI, Hind I I I, Pst I で消化した断片 でそれぞれ約 1.5， 3.5, 1.0キロべ一スの DNA断片が増幅されたので、 この DNA 断片を上記と同様の方法で塩基配列の決定を行った。 その結果、 増幅された DNA 断片にはさらに約 920アミノ酸のオープン · リーディング ·フレームが含まれて おり、 さらにその上流にはプロモーター領域と推定される領域が存在することも 明らかとなった。 このオープン · リーディング 'フレームの塩基配列から推定さ れる産物のアミノ酸配列は既知の大腸菌などのピルビン酸デヒドロゲナ一ゼの E 1 サブユニットと相同性が高いことから、 このオープン ' リーディング ' フレー ムがブレビバクテリゥム ·ラクトフエルメンタム A T C C 1 3 8 6 9のピルビ ン酸デヒドロゲナーゼの E1サブユニットをコードする pdhA遺伝子であることが 明らかとなった。 このオープン · リ一ディング · フレームの塩基配列は配列表配 列番号 3 1に示す通りである。 配列表配列番号 3 1の配列には、 その塩基配列か ら推定される産物のアミノ酸配列も示した。 なお、 タンパク質の N末端にあるメ チォニン残基は開始コドンである ATGに由来するためタンパク質本来の機能とは 無関係であることが多く、 翻訳後べプチダ一ゼの働きにより除去されることがよ く知られており、 上記夕ンパク質の場合にも N末端側のメチォニン残基の除去が 生じている可能性がある。 ただし、 配列表配列番号 3 1に示した ATGの 6ベース 上流に GTGの配列があり、 ここからアミノ酸が翻訳されている可能性もある。 ま た、 大腸菌など他の微生物のピルビン酸デヒドロゲナ一ゼは、 El， E2 および E3 の 3つのサブュニッ卜から構成されており、 これらをコードする遺伝子はオペ口 ンであることが多いが、 ここで明らかとなった pdhA遺伝子の下流約 3 キロべ一 ス中にはピルビン酸デヒドロゲナーゼの E2および E3サブユニットと考えられる オープン . リーディング 'フレームは存在しなかった。 その代わり、 このオーブ ンり一 . リーディング ·フレームの下流には夕一ミネ一夕一と推定される配列が 存在していることが明らかとなっていることから、 ブレビパクテリゥム 'ラクト フェルメン夕ム A T C C 1 3 8 6 9のピルビン酸デヒドロゲナ一ゼの E2 およ び E3サブュニッ トは染色体上の他の部分に存在していると考えられた。
(2) pdhA増幅のためのプラスミ ドの構築
ブレビパクテリゥム ·ラクトフエルメンタム A T C C 1 3 8 6 9に E. col i の PDH を構成する 3つのサブュニットをコードする遺伝子を導入した株はグルタミ ン酸収率が向上していることが既に明らかとなっている （特願平 10-360619) 。 しかし、 ブレビパクテリゥム ·ラクトフエルメンタム A T C C 1 3 8 6 9の PDH は Elサブュニットをコードする pdhA遺伝子しかクローニングされておらず、 こ の遺伝子単独での増幅がグル夕ミン酸収率に効果があるかは、 まだ調べられてい なかったので、 ここで pdhA遺伝子単独増幅がグル夕ミン酸収率に効果があるか を調べることにした。
既にクローニングされている塩基配列に基づいて配列番号 33及び 34に示す プライマ一を合成し、 Advanced Genetic Technologies Corp. Bacterial Genomic DNA Purification Kitによって調整したブレビパクテリゥム ·ラク ト フェルメンタム AT CC 13869の染色体を錡型とし、 PCRテクノロジ一 (ヘンリーエーリツヒ編、 ストヅクトンプレス、 1989年） 8頁に記載されて いる標準反応条件で PC Rを行い、 pdhA遺伝子を増幅した。 合成したプライマ 一の内、 配列番号 33は、 配列表配列番号 32に記載されている pdhA遺伝子の 塩基配列図の 1397番目から 1416番目の塩基に至る配列に相当しており、 配列番 号 34は、 配列表配列番号 32の 5355番目から 5374番目の塩基に至る配列に相 当する塩基配列の逆ストランドを 5'側から表記したものである。
生成した PCR産物を常法により精製後、 制限酵素 Sal Iと EcoT22Iを反応さ せ、 制限酵素 Sal Iと Pst Iで切断した pSFK (特願平 11-69896) とライゲ一シ ヨンキット （宝酒造社製） を用いて連結した後、 ェシエリヒア ·コリ JM 109 のコンビテントセル （宝酒造社製） を用いて形質転換を行い、 IPTG (イソプ 口ピル一/?— D—チォガラクトビラノシド） 10〃g/ml、 X— Gal (5— ブロモ一 4—クロ口一 3—インドリル一/?— D—ガラクトシド） 40〃 g/m 1 及びカナマイシン 25 g/mlを含む L培地 （バクト トリプトン 10 g/l、 パクトイ一ストエキストラクト 5g/l、 NaC15g/l、 寒天 15g/l、 pH7. 2) に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コ ロニ一分離し、 形質転換株を得た。
形質転換株からアルカリ法 （生物工学実験書、 日本生物工学会編、 105頁、 培風館、 1992年） を用いてプラスミ ドを調製した後、 ベクターに挿入された DN A断片の制限酵素地図を作成し、 配列表配列番号 32に報告されている pdhA遺伝子の制限酵素地図と比較し、 同一制限酵素地図を有する DNA断片が 挿入されているプラスミ ドを pSFKBPDHAと名付けた。
(3) ブレビバクテリウム ·ラクトフエルメンタム ATCC13869および CG25へ の p ASFKBPDHAの導入と醱酵培養評価 ブレビバクテリウム ·ラクトフエルメン夕ム ATCC13869 および GC25 を電気 パルス法 （特開平 2— 2 0 7 7 9 1号公報参照） によりプラスミ ド pSFKBPDHAで 形質転換して、 形質転換株を得た。 ブレビパクテリゥム ·ラクトフエルメンタム ATCC13869および G C25にプラスミ ド pSFKBPDHAを導入して得られた形質転換株 ATCC13869/pSFKBPDHA および G C25/pSFKBPDHA を用いて L一グルタミン酸生産 のための培養を以下のように行った。 2 5〃g/mLのカナマイシンを含む CM 2 Bプレート培地にて培養して得た ATCC13869/pSFKBPDHA および GC25 / pSFKBPDHA株の菌体を、 グルコース 8 0 ：、 KH2P04 1 g：、 Mg S 04 · 7 H2〇 0. 4 g、 (NH4) 2S 04 3 0 g、 F e S 04 · 7 H20 0. 0 1 g、 Mn S 04 - 7 H20 0. 0 1 g、 大豆加水分解液 1 5 m 1、 サイァミン塩酸塩 2 0 0 jug, ピオチン 60 zg、 カナマイシン 2 5mg及び C a C03 5 0 g を純水 1 L中に含む培地に KOHを用いて pH 8. 0に調整されている） に接 種し 3 1. 5°Cにて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。 得られた培養 物を、 GC25/pSFK6 及び GC25/pSFKBPDHA については上記と同じ組成の培地に、 又 ATCC13869/pSFK6 及び ATCC13869/pSFKBPDHA については上記と同じようにビ ォチンを除いた培池に、 5%量接種し、 37°Cにて培地中の糖が消費されるまで振 とう培養した。 コントロールとしてブレビパクテリゥム ·ラクトフエルメンタム ATCC13869および GC25に、 既に取得されているコリネパクテリゥム属細菌で自 律複製可能なプラスミ ド pSFK6を電気パルス法 （特閧平 2— 2 0 7 7 9 1号公報 参照） により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。 培養終了後、 培養 液中の L—グル夕ミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイォテックアナライザー A S - 2 1◦により測定した。 このときの結果を表 1 7に示した。 表 1 Ί
Lーグル夕ミ |辦
ATCC13869/pSFK 3.6
ATCC13869/pSFKBPDHA 3.8 GC25/pSFK6 5.1
GC25/pSFKBPDHA
これらの結果から、 プレビバクテリウム ·ラク トフエルメンタム ATCC13869 および G C25において pdhA遺伝子の単独増幅でも Glu収率向上に効果があるこ とが明らかとなった。
( 4 ) 変異した pdhAプロモ夕一活性測定用のプラスミ ドの構築
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ （PDH) のプロモ一夕一変異株の作製を行うため に、 既にクローニングがなされたブレビパクテリゥム · ラクトフエルメン夕ム ATCC13869 の pdhA遺伝子のプロモーター領域の決定およびプロモーター領域の 改変による発現量の違いの測定を/? -ガラクトシダ一ぜの活性を測定することに よって行った。
クローニングを行って既に明らかとなっている塩基配列から pdhA遺伝子のプ ロモ一夕一部位を推定したところ、 配列表配列番号 3 2の 2252番目から 2257番 目と 2279番目から 2284番目がそれぞれ- 35領域および- 10領域である可能性が 高いことが推定された。 そこで、 配列表配列番号 3 5及び 3 6に示すプライマ一 を合成し、 ブレビパクテリゥム ·ラクトフエルメンタム ATCC13869 の染色体 D N Aを錶型にして P C R法により pdhA遺伝子のプロモー夕一領域を含む DNA断 片を増幅した。 合成したプライマ一の内、 配列番号 3 5は、 配列表配列番号 3 2 の塩基配列の 2194番目から 2221番目の塩基に至る配列に相当するが、 2198番 目の塩基を Cに、 2200番目と 2202番目の塩基を Gに変更し、 制限酵素 Smalの 認識配列を挿入している。 配列番号 3 6は、 配列表配列番号 3 2の塩基配列の 2372番目から 2398番目の塩基に至る配列に相当するが、 2393番目と 2394番目 の塩基を Gに変更し、 制限酵素 Smal の認識配列を挿入した塩基配列の逆ストラ ンドを 5 ' 側から表記したものである。 Advanced Genetic Technologies Corp. 製 Bacterial Genomic DNA Purification Kit によって調整したブレビパクテリ ゥム 'ラクトフェルメンタム A T C C 1 3 8 6 9の染色体を錶型とし、 P C R テクノロジー （ヘンリーェ一リヅヒ編、 ストックトンプレス、 1 9 8 9年） 8頁 に記載されている標準反応条件で PCRを行い、 pdhA遺伝子のプロモーター領 域を増幅した。 生成した PCR産物を常法により精製後、 制限酵素 Smal を反応 させ、 lacZ遺伝子のプロモ一夕一領域を欠いるコリネ型細菌で複製が可能な pNEOL を制限酵素 Smal で （実施例 4の （3) ) 切断したものとライゲーシヨン キット （宝酒造社製） を用いて連結した後、 ェシエリヒア 'コリ JM 109のコ ンピテントセル （宝酒造社製） を用いて形質転換を行い、 X— Gal (5—プロ モ一 4—クロロー 3—インドリル一/?— D—ガラクトシド） 40〃g/ml及び カナマイシン 25〃g/mlを含む L培地 （バクトトリプトン 10 g/l、 バク トイ一ストエキストラクト 5 g/l、 NaC 15 g/l 寒天 15g/l、 pH 7. 2) に塗布し、 一晩培養後、 出現した青色のコロニーを釣り上げ、 単コロニ 一分離し、 形質転換株を得た。 形質転換株からアルカリ法 （生物工学実験書、 日 本生物工学会編、 105頁、 培風館、 1992年） を用いてプラスミ ドを調製し た後、 定法によりベクターに挿入された DNA断片のシーケンスを行い DNA断 片が揷入されているブラスミ ドを pNEOLBPDHAprolと名付けた。
さらにプロモータ一部位と推定される領域をコリネ型細菌のプロモーターの共 通配列に変えたプラスミ ドを構築するために、 配列表配列番号 37， 38, 39 に示すプライマ一を合成し、 これらのそれぞれのプライマーと配列表配列番号 3 6に示すプライマ一を用いて、 ブレビパクテリゥム · ラク トフエルメンタム ATCC13869の染色体 D N Aを鎵型にして P C R法により pdhA遺伝子のプロモー 夕一領域を共通配列に変えた MA断片を増幅した。 合成したプライマ一の内、 配 列番号 37は、 配列表配列番号 32の塩基配列の 2244番目から 2273番目の塩基 に至る配列に相当し、 2255番目の塩基を Cと 2257番目の塩基を Aに変更て、 一 35領域のみをコリネ型細菌の共通配列に変えたものに相当している。 また、 配 列番号 38は、 配列表配列番号 32の塩基配列の 2249番目から 2288番目の塩基 に至る配列に相当し、 2279番目と 2281番目の塩基を Tに変更て、 -10領域のみ をコリネ型細菌の共通配列に変えたものに相当している。 また、 配列番号 39は、 配列表配列番号 32の塩基配列の 2249番目から 2288番目の塩基に至る配列に相 当し、 2255番目の塩基を Cに、 2257番目の塩基を Aに、 2279番目と 2281番目 の塩基を Tに変更て、 -35領域および- 10領域の両方をコリネ型細菌の共通配列 に変えたものに相当している。 Advanced Genetic Technologies Corp.製 Bacterial Genomic DNA Purification Kit によって調整したブレビバクテリウ ム -ラクトフエルメンタム AT C C 13869の染色体を錄型とし、 PCRテ クノロジ一 （ヘンリーェ一リヅヒ編、 スドックトンプレス、 1989年） 8頁に 記載されている標準反応条件で PC Rを行い、 これらのプライマーを使って、 プ ロモ—夕一領域を共通配列に変えた pdhA遺伝子のプロモー夕一領域を増幅した。 生成した PCR産物を常法により精製後、 制限酵素 Smalを反応させ、 lac Z遺伝 子のプロモー夕一領域を欠いるコリネ型細菌で複製が可能な pNEOL を制限酵素 Smal で切断したものとライゲ一シヨンキッ ト （宝酒造社製） を用いて連結した 後、 ェシエリヒア 'コリ JM 109のコンビテントセル （宝酒造社製） を用いて 形質転換を行い、 X— Gal (5—プロモー 4一クロ口— 3—インドリル—/?一 D—ガラクトシド） 40 zg/ml及びカナマイシン 25〃g/mlを含む L培 地 （パクトトリプトン 10 g/l、 バクトイ一ストエキストラクト 5g/l、 N aC15g/l、 寒天 15g/l、 pH7. 2) に塗布し、 一晩培養後、 出現し た青色のコロニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。 形質転換 株からアルカリ法 （生物工学実験書、 日本生物工学会編、 105頁、 培風館、 1 992年） を用いてプラスミ ドを調製した後、 定法によりベクターに挿入された DN A断片のシーケンスを行い、 -35領域のみを共通配列に変えた DN A断片が 挿入されているプラスミ ドを pNE0LBPDHApro35と名付け、 -10領域のみを共通配 列に変えた DNA断片が挿入されているプラスミ ドを pNE0LBPDHApro35と名付け、 -35領域および- 10領域を共通配列に変えた DNA断片が挿入されているプラス ミ ドを pNE0LBPDHApro3510と名付けた。
(5) 変異した pdhAプロモ夕一活性の評価
ここで構築した pNE0LBPDHAprol、 pNEOLBPDHAprolO, pNE0LBPDHApro3510 と名 付けたプラスミ ドによって、 ブレビバクテリウム ' ラク トフェルメン夕ム ATCC13869 を電気パルス法 （特閧平 2— 207791号公報参照） で形質転換し て形質転換株を得た。 得られた形質転換体の/?-ガラクトシダーゼ活性を実施例 4 ( 4 ) に記載の方法により測定した。 プロモータ一領域を共通配列に変えた時 の/? -ガラクトシダ一ゼ活性は、 pdhA遺伝子のプロモー夕一領域を持つ/? -ガラ クトシダーゼの酵素活性を 1として、 表 1 8のような結果であった。 表 1 8
? -ガラクトシダ一ゼ活性 （相対値）
ATCC13869/pNE0LBPDHAprol 1 ATCC13869/pNE0LBPDHAprol0 6
ATCC 13869/pNE0LBPDHApro3510 7^ この結果は、 推定したプロモー夕一部位が pdhA遺伝子のプロモー夕一である ことを意味しており、 この領域を共通配列に変えることで、 PdhA の発現量を変 えること （増幅すること） ができることを示している。 これは、 PdhA遺伝子の プロモータ一領域を変えることで、 プラスミ ドを使わずに発現量を変えることが できることを示している。
( 6 ) プロモーター変異株作製用プラスミ ドの構築
プロモーターに変異を起こさせることにより PdM の発現量を変えられること が明らかとなったので、 pdhA遺伝子のプロモーター変異株を作製するためのプ ラスミ ドの構築を行った。 プロモータ一変異株構築用のプラスミ ドは、 -35 領域 および- 10 領域をそれぞれ共通配列に変えたものとその両方を共通配列に変えた もの 3種類の構築を行った。
4—1 ) プロモー夕一変異株作製用プラスミ ドの構築
既にクローニングされている塩基配列に基づいて配列番号 4 0、 4 1に示すプ ライマーを新たに合成した。 合成したプライマーの内、 配列番号 4 0は、 配列表 配列番号 3 2の 2491番目から 2521番目の塩基に至る配列に相当する塩基配列の 逆ストランドを 5 ' 側から表記したものの 5 ' 末端に Aが 3個連なった後に丁が 4個連なった配列を付与したものである。 また、 配列番号 3 3は配列表配列番号 3 2に記載されている pdhA遺伝子の塩基配列図の 5020番目から 5039番目の塩 基に至る塩基配列の逆ストランドを 5' 側から表記したものである。 Advanced Genetic Technologies Corp.製 Bacterial Genomic DNA Purification Kit によ つて調整したブレビパクテリゥム ·ラクトフエルメンタム AT CC 13869 の染色体を錶型とし、 プライマ一として配列表配列番号 33および 40を用いて P CRテクノロジ一 （ヘンリ一ェ一リッヒ編、 ストックトンプレス、 1989 年） 8頁に記載されている標準反応条件で P CRを行った。 また、 プレビバクテ リウム 'ラクトフエルメン夕ム AT CC 13869の染色体を錡型とし、 配列 表配列番号 15および 17を用いても P CRを行った。 生成した PC R産物を常法 により精製後、 プライマーとして配列表配列番号 9および 16 を用いたときの PCR産物と配列表配列番号 39および 41を用いたときの PCR産物および配列表 配列番号 33と 41を用いて PCRを行った。 このときの条件は、 これら 4つの DNAの濃度が 10マイクロ Mとなるように反応液中に加えて、 錡型を入れずに LA taq (宝酒造社製） を用いて PCRを行った。 生成した PCR産物は常法により精 製後、 制限酵素 Sal I と Xholを反応させ、 コリネ型細菌で複製可能な温度感受 性プラスミ ド pSFKT2を制限酵素 Sal Iで切断したものとライゲ一シヨンキヅト (宝酒造社製） を用いて連結した後、 ェシエリヒア 'コリ JM 109のコンビテ ントセル （宝酒造社製） を用いて形質転換を行い、 IPTG (イソプロピル—/? —D—チォガラクトピラノシド） 10〃g/ml、 X— Gal (5—ブロモ _4 一クロ口一 3—インドリル一/?— D—ガラクトシド） 40 /g/ml及びカナマ イシン 25〃 /1111を含む L培地 （パクト トリプトン 10 g/l、 パク トイ一 ストエキストラク ト 5 g/l、 NaC15g/l、 寒天 15g/l、 p H 7. 2) に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コロニ一分 離し、 形質転換株を得た。 形質転換株からアルカリ法 （生物工学実験書、 日本 生物工学会編、 105頁、 培風館、 1992年） を用いてプラスミ ドを調製した 後、 ベクターに挿入された DNA断片のシーケンスを行い、 配列表配列番号 32 に報告されている pdhA遺伝子の塩基配列と比較し、 プロモー夕一の- 35領域と- 10領域だけがコリネ型細菌の共通配列に変わっている DN A断片が挿入されて いるプラスミ ドを pSFKTPDHApro3510と名付けた。 上記の方法の配列表配列番号 39を配列表配列番号 37および 38にそれぞれ 変えて、 全く同様の方法で、 pdhA遺伝子のプロモーターの- 35領域をコリネ型細 菌の共通配列に変えたプラスミ ドおよび pdhA遺伝子のプロモーターの- 10 領域 をコリネ型細菌の共通配列に変えたプラスミ ドを構築した。 これらのプラスミ ド はそれぞれ pSFKTDHApro35および pSFKTPDHAprolOと名付けた。
(7) プロモーター変異株の作製
(6) で構築したプロモー夕一変異株作製用のプラスミ ドを用いて、 相同組み換 えにより pdhA遺伝子のプロモ一夕一変異株の作製を行った。
まず、 プロモー夕一変異株作製用プラスミ ド pSFKTPDHApro3510 を用いて GC 25 を電気パルス法 （特開平 2— 20779 1号公報参照） で形質転換を行い、 CM2B プレート培地 （ポリペプトン 10 g/l、 パクトイーストエキストラクト 10 g/l、 NaC l 5 g/1、 ピオチン 10 マイクロ g/ml、 寒天 15 g/l、 pH7. 2) に湿布して培養温度 25°Cで形質転換株を得た。 得られた 形質転換株は、 CM2B液体培地で一晩試験管培養した後に、 カナマイシン 25 g/mlを含む CM2B プレート培地に湿布して、 培養温度 34 °Cで培養して、 相 同組み換えで染色体上にプラスミ ド pSFKTPDHpro3510が挿入された 1回組み換え 株を得た。 得られた 1回組み換え株を単コロニー分離した後に、 CM2B 液体培地 に湿布して、 培養温度 31. 5°Cで培養し、 コロニ一が出現してきたら、 カナマ イシン 25 /g/mlを含む CM2B プレート培地にレプリカすることで、 カナマ イシン感受性株を取得した。 取得された株の pdhA遺伝子のプロモーター部位は 野生株の配列の株と変異が導入されている株の 2種類が得られるので、 この部分 のシーケンスを行うことで、 pdhA遺伝子のプロモ一夕一部位に変異が導入され たプロモ一夕一変異株を取得した。 この株は、 pdhA遺伝子のプロモ一夕一の- 35 領域および- 10 領域がコリネ型細菌の共通配列に変えた株であり、 この株を GD3510と名付けた。
また、 上記のプロモー夕一変異株作製用プラスミ ド pSFKTPDHApro3510 をプロ モー夕—変異株作製用プラスミ ド pSFKTPDHApro35および pSFKTPDHAprolOに代え て、 上記と全く同様の方法により、 それぞれ pdhA遺伝子プロモーターの- 35 領 域および- 10領域がコリネ型細菌の共通配列に変えた株を取得し、 それぞれ GD35 および GD10と名付けた。
(8) pdhA遺伝子プロモーター変異株のフラスコ培養評価
取得した 3種類の pdhA遺伝子プロモー夕一変異株 GD3510、 GD35、 GD10 及び GC25 を用いて L一グル夕ミン酸生産のためのフラスコ培養を以下のよう に行った。 CM 2 Bプレート培地にて培養して得たプロモーター変異株 GD3510、 GD 35、 GD 10及び G C 25の菌体を、 グルコース 30 g、 KH2P 04
1 g、 Mg S04 · 7 H20 0. 4 g、 (NH4) ZS04 30 g、 F e S 04 · 7 H20 0. 01 g、 MnS04 · 7H20 0. 01 g、 大豆加水分解液 15 m 1、 サイアミン塩酸塩 200 zg、 ピオチン 60 及び CaC 03 50 g を 純水 1 L中に含む培地に KOHを用いて pH 8. 0に調整されている） に接種 し 31. 5°Cにて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。 得られた生成物 を、 上記と同様の組成の倍地に 5%の濃度で接種し、 倍地中の糖が消費されるま で 37°Cで振とう培養した。 培養終了後、 培養液中の L—グルタミン酸蓄積量を 旭化成工業社製バイオテックアナライザー AS— 210により測定した。 このと きの結果を表 19に示した。 表 19 —クルタミ (gdl)
GC25 1.9
GD35 2.0
GD10 2.0
GD3510 2.1 これら ら、 寻した： Τπΐ~夕"^^ *¾Gli»が tしていること力月らかとなつ た。 実施例 6 コリネ型アルギニン生産菌へのアルギノコハク酸シン夕一ゼ遺伝子の プロモー夕一領域への変異の導入
1 ) argG遺伝子の上流域の塩基配列決定
ブレビパクテリゥム ·フラバムの argG遺伝子を PCR により増幅するために、 同 0RF の上流及び下流の領域の塩基配列を決定した。 塩基配列の決定は、 公知 のコ リネバクテリゥム . グルタ ミカムの argG 遺伝子の 0RF の塩基配列
(GenBank accession AF030520) に基づいてプライマ一を合成し、 In vitro LA PCR cloning kit (宝酒造 （株） 製） を用いて、 キッ 卜に添付の説明書に従つ て行った。 前記プライマ一として具体的には、 0RF の上流領域用には配列番号 42及び 43に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド （プライマ一 1、 2 ) を、 下流領域用には配列番号 44及び 45に示す塩基配列を有するォリゴヌクレオチド
(プライマ一 3、 4 ) をそれぞれ用いた。 ブレビパクテリゥム 'フラバムの野生 株である 2247株 （ATCC14067) の染色体 D N Aを制限酵素 EcoRI で完全消化し、 一次 PCR をプライマ一 2または 3で行い、 二次 PCR をプライマ一 1または 4を 用いて行うことにより、 argGの上流、 下流の塩基配列を決定した。
2) promoter部位の予測
上記配列より， 市販のソフト （GENETYX) を用いて， argG 遺伝子の ORF の上流にある promoter様配列を検索した. 最もスコアの高かった部位 (最初の ATGから約 120bp上流)に変異を導入し、 次いでプロモ一夕一の活性を評価した。
3) promoter配列への変異導入と変異型 promoterの活性測定
最もスコアの高かった部位に、 変異導入用プライマー primer9 または primerlOまたは primerllまたは primerl2または primerl3と primer7 (それ それ配列番号 5 0、 5 1、 5 2、 5 3、 5 4、 4 8 ) を用いて AJ12092 株の染 色体 DNAを铸型として 1回目の PCRを行い， この PCR産物を 3，側の primer とし， primer8 (配列番号 4 9 ) を 5，側の primer として再度同染色体 DNAを 錡型として PCR を行うことにより， 目的の promoter部分に変異が導入された DNA断片を得た. 次にこの変異型 promoter の活性を測定する為に， これらの DNA断片を promoter probe vector pNEOLの Smalサイ トにリポ一夕一遺伝 子の lacZ と順向きになるように挿入した plasmid pNEOL-l,pNEOL-2, pNEOL-3, pNEOL- 4 , pNEOL-7 を得た. また活性の対照として primer7 と primer8 を用いて AJ12092株の染色体 DNAを錡型として PCRを行って得た DNA断片を同様に pNEOLの lacZ遺伝子の上流に揷入した plasmid pNEOL- 0を構築した.
pNEOL-0 ,pNEOL- 1 ,pNEOL-2 , pNEOL-3, pNEOL- 4 、 pNEOL-7 を AJ12092 株に導入した. プラスミ ドの導入は電気パルス法 （特開平 2— 2 0 7 7 9 1 ) を用いた。 形質転換体は 4〃g/ml のクロラムフエ二コールを含む C M 2 Gプレート培地 （ポリペプトン 1 0 g , 酵母エキス 1 0 g、 グルコース 5 g , N a C 1 5 g、 寒天 1 5 gを純水 1 1に含む。 p H 7 . 2 ) にてクロラムフエ二 コ一ル耐性株として選択した.
これらの菌株をグルコース 0.5g/dl,ポリペプトン lg/dl, 酵母エキス lg/dl, NaCl 0.5g/dl，クロラムフエ二コール 5〃g/l を含む寒天培地にぬりつけ 31.5 度 で 20 時間培養して得た菌体 1ェ-セ、、を，グルコース 3g/dl,硫酸アンモ;:ゥム 1.5g/dl, KH2P04 0.1g/dl, MgSO4 0.04g/dl, FeSO4 O.OOlg/dl, MnS04 O.Olg/dl, VBl 5JLL g/dl, biotin 5 z g/dl, 大豆加水分解物 N 量として 45mg/dl を含む培地に植菌 し, 31.5度で 18 時間培養して得た菌体を用い， ガラクトシダ一ゼ活性を測定 した.
表 2 0に示す様に AJ12092/pNEOL-0 で ガラクトシダ一ゼ活性が検出され たことから， lacZ構造遺伝子の上流に挿入した DNA断片が promtoerとして機 能していることがわかった. また， AJ12092/pNEOL-0 に比して各 plasmid 導 入株では 5 -ガラクトシダーゼ活性が高くなつており， この promoter様配列へ の変異導入により， 転写活性が表 2 0の様に上昇することが判った. 表 2 0 相対活性
(AJ12092/PNEOL-0=1 ) AJ12092 nd
AJ12092/pNEOL-0 1 .0
AJ12092/PNEOL-1 2.8
AJ12092/pNEOL-2 2.7
AJ12092/PNEOL-3 1.8
AJ12092/pNEOL-4 0.8
AJ12092/pNEOL-7 3.0
4)変異導入用 plasmidの構築
primer 14, 15 (配列番号 5 5と 5 6 ) を用いて AJ12092 株の染色体 DNA を 錡型として PCRを行って得た DNA断片をク ϋ-ニンク、、ぺク夕一 pHSG398(TaKaRa 製のマルチクローニングサイ 卜の Smal l部位に挿入し plasmid ρθを構築した. 次に ρθ を制限酵素 EcoRV及び BspHI で消化し， 同様に pNEOL-3 及び pNEOL-7を制限酵素 EcoRV及び BspHIで消化することによってえられる D N A断片をライゲ一シヨンすることにより変異導入用 plasmid p3(変異導入用 primerll由来の変異),及び p7(変異導入用 primerl3由来の変異）を得た.
5)変異導入用 plasmidの Arg生産菌への導入
上 Sd plasmidを Arg生産菌 Bevribacteri urn lactoiermen turn AJ 12092株に 導入した. プラスミ ドの導入は電気パルス法 （特閧平 2— 2 0 7 7 9 1 ) を用い た。 Bevribacterium 中でこれらのプラスミ ドの自律複製不可能な為， 本 plasmid が相同組換えによって染色体に組み込まれた株のみが Cm 耐性株とし て選択できる. 変異導入用 plasmidが染色体に組み込まれた株は 5〃g/mlのク 口ラムフエニコ一ルを含む C M 2 Gプレート培地 （ポリペプトン 1 0 g , 酵母ェ キス 1 0 g、 グルコース 5 g , N a C 1 5 g、 寒天 1 5 gを純水 1 1に含む。 p H 7 . 2 ) にてクロラムフエ二コール耐性株として選択した. 次に再度相同組 換えをおこして Cm感受性になった株の中から， argG遺伝子の promoter部分 が目的の変異配列に置換された株を選択した. その結果， P3の配列に置換されたもの (AJ12092-P3),及び P7の配列に置換さ れたもの (AJ12092-P7)を得た.
6) argG遺伝子のクローニング
1 ) のようにして決定した塩基配列をもとに、 配列番号 46及び 47に示す塩基 配列を有するオリゴヌクレオチド （プライマ一 5、 6 ) を合成し、 ブレビバクテ リウム · フラバム 2247の染色体 D N Aを錡型として PCR を行った。 PCR 反応は、 94°C： 30秒、 55°C： 1秒、 72°C： 2分 30秒からなるサイクルを 25サイクル行 つた。 得られた DNA 断片をクローニングベクタ一 pSTV29 (宝酒造 （株） 製） の マルチクローニングサイ ト内の Smal 部位にクローニングし、 pSTVarG を作製し た。 さらに、 pSTVargGの Sai l部位に、 実施例 1 ( 1 ) 記載の pSAK4 を Sai l処理 して得られた複製起点を含む断片を挿入した pargG を作製した。
7 ) pargGの Brev.への導入
argG を Bevribacterium lactofermen turn AJ12092株に導入した. プラス ミ ドの導入は電気パルス法 （特開平 2— 2 0 7 7 9 1 ) を用いた。 形質転換体は 4 g/ml のクロラムフエ二コールを含む C M 2 Gプレート培地 （ポリペプトン 1 0 E , 酵母エキス 1 0 g、 グルコース 5 g， N a C 1 5 g：、 寒天 1 5 gを純水 1 1に含む。 P H 7 . 2 ) にてクロラムフエ二コール耐性株として選択した.
8 ) promoter変異株の ArgG活性
上記 2種類の ArgG promoter変異株 及び plasmidにて argGを増幅した株 (AJ12092/pargG)の ArgG活性を測定した. これらの菌株をグルコース 0.5g/dl, ポリペプトン lg/dl, 酵母エキス lg/dl, NaCl 0.5g/dl,クロラムフエ二コール 5 U gilを含む寒天培地にぬりつけ 31.5度で 20時間培養して得た菌体 I I-セ、、を,グ ルコース 3g/dl,硫酸アン ΐニゥム 1.5g/dl, KH2P04 0. lg/dl, MgS04 0.04g/dl, FeS04 0.00 lg/dl, MnS04 0.0 lg/dl, 5 g/dl, biotin 5〃g/dl， 大豆加水分解物 N量 として 45mg/dlを含む培地に植菌し, 31.5度で 18時間培養して得た菌体を用い， 既報 (Journal of General Microbiology(1990),136,1177- 1183)に従って ArgG活 性の測定をした. 上記 2 種類の ArgG promoter 変異株 及び， plasmid にて argG を増幅した株 (AJ12092/pargG)の ArgG活性を表 2 1に示す. 表 2 1に示 すように， promoter に変異を導入することにより， AJ 1 2 0 9 2 -P3 では親株 の約 2 倍に， AJ12092-P7 では約 3倍に ArgG 活性が上がっていた. また， AJ12092/pargGでは ArgG活性は親株の約 4.5倍であつた. 表 2 1 相対活性
(AJ 12092=1 )
AJ12092 1.0
AJ1 2092-P3 2.1
AJ12092-P7 2.9
AJ1 2092/pargG 4.4
9 )promoter変異株による Arg生産
ArgG promoter変異株のフラスコ培養を行つた . 対照として親株 AJ12092及 び AJ12092/pargG も同様に培養した. KH2P04 0.1g/dl, MgS04 0.04g/dl, FeS04 O.OOlg/dl, MnS04 O.O lg/dl, VB! 5 z g/dl, biotin 5 g/dl, 大豆加水分解 物 N量として 45mg/dlを含む培地に植菌し， グルコース 0.5g/dl,ポリぺプトン lg/dl, 酵母エキス lg/dl, NaCl 0.5g/dl，クロラムフエニコ一ル 5 を含む寒 天培地にぬりつけ 31.5度で 20時間培養して得た菌体 I I- ITを，グルコース 4g/dl, 硫酸アンモニゥム 6.5g/dl， フラスコにて 31.5 度で グルコースを完全に消費するまで 培養した. 培養液を 0.2N HC1 で 5 1倍希釈した液の 6 2 0 n mでの吸光度 ( O D 6 2 0 ) , アルキ、、ニン生成量 （濃度 （g/ d 1 ) 及び培養時間を示した.
表 2 2に示す様に， argG promoter 変異株では Arg収率が向上し， plasmid での argG増幅株と同等の収率であった. また， plasmid増幅株では培養時間が 遅延したのに対し， promoter変異株では AJ12092-P3,AJ12092-P7 ともに培養 時間は親株と同等であり， Arg生産性が plasmid増幅株よりも向上することが 判った. 表 2 2
OD Arg(g/dl) 培養時間 生産性
(h ) (g/dl/h)
AJ12092 0.502 1.25 48 0.026
AJ12092-P3 0.510 1 .47 48 0.031
AJ1 2092-P7 0.514 1 .43 48 0.030
AJ12092/pargG 0.520 1 .47 52 0.028 実施例 7 ：コリネ型グル夕ミン酸生産菌の GDH遺伝子プロモー夕一領域への変異 の導入
( 1 ) 変異型 gdhプラスミ ドの構築
上記実施例 2に示した FGR1株および FGR2株がもつ GDHプロモー夕一配列を有 するプラスミ ドを部位特異的変異手法により構築した。 FGR1 株の GDH プロモー 夕一配列を得るためには、 配列番号 57に示す合成 DNAと配列番号 60に示す合成 DNAをプライマーに用い ATCC13869の染色体 MAを錶型として PCRを行ない、 一 方で配列番号 58に示す合成 DNAと配列番号 59に示す合成 DNAをプライマーとし て用い ATCC13869の染色体 DNAを錶型として PCRを行なった。 さらにこの PCR産 物を混合したものを錡型として配列番号 57および 58に示す合成 DNAをプライマ 一に用い PCR を行なった。 こうして得られた PCR 産物を pSFKT2 (特願平 11— 69896) の Smal部位に挿入した pSFKTGllを構築した。 FGR2株の GDHプロモ一夕 一配列を得るためには、 配列番号 57に示す合成 DNA と配列番号 62 に示す合成 DNAをプライマーに用い ATCC13869の染色体 DNAを錡型として PCRを行ない、 一 方で配列番号 58に示す合成 DNAと配列番号 61に示す合成 MAをプライマ一とし て用い ATCC13869の染色体 MAを錡型として PCRを行なった。 さらにこの PCR産' 物を混合したものを錶型として配列番号 57および 58に示す合成 DNAをプライマ 一に用い PCR を行なった。 こうして得られた PCR 産物を pSFKT2 (特願平 11— 69896) の Smal 部位に挿入した pSFKTG07 を構築した。 なお、 pSFKTGll および PSFKTG07の Smal部位に挿入した DNA断片の塩基配列決定を行ない、 GDHのプロ モーター領域以外に変異が導入されていないことを確認している。
( 2 ) gdhプロモーター変異株の構築
次に pSFKTGll および PSFKTG07 を電気パルス法により AJ13029株に導入し、 25°Cで 25〃g/inlのカナマイシンを含む CM2Bプレート上に生育する形質転換体を 選択した。 この形質転換体を 34°Cで培養し、 34°Cでカナマイシン耐性を示す株 を選択した。 34°Cでカナマイシン耐性を示すことは pSFKTGllあるいは pSFKTG07 が AJ13029株の染色体上に組み込まれたことを意味する。 このような染色体上に プラスミ ドが組み込まれた株よりカナマイシン感受性株を取得した。 これらの株 の GDHプロモ一夕一配列を決定し、 pSFKTGllおよび pSFKTG07と同じ gdhプロモ —夕一配列を持つ株をそれぞれ GA01, GA02とした。
( 3 ) gdhプロモー夕一変異株の L一グルタミン酸生産能の確認
GA01株、 GA02株およびその親株 AJ13029株についてグル夕ミン酸の生産能を 上記実施例 2 ( 2 ) と同じ方法で確認した。 その結果、 GA01および GA02では顕 著なグルタミン酸の蓄積向上が認められた （表 23) 。 表 23
離 GDH腿生 綱直
AJ13029 2.6 7.7 1.0
GA01 3.0 22.3 2. 9
GA02 2.9 27.0 3. 5
( 4 ) セルフクローニング型 gdhプラスミ ドの構築
まず、 セルフクローニングベクター PAJ220 を構築した。 pAJ226 (特開昭 6卜 152289) を EcoRV, Pstl で処理し、 コリネ型細菌内で自律複製可能な領域を含む 断片を調製し、 これと PAJ224 (特開昭 61-152289) を EcoRV，Pstl で処理して生 じるおよそ 0.7kbの DNA断片とを連結したプラスミ ドが pAJ220である。 本ブラ スミ ドはコリネ型菌類内で自律複製可能であり、 宿主にトリメ トプリム耐性を付 与する。
コリネ型細菌野生型の ATCC13869株の染色体 DNAを錶型として配列番号 63お よび配列番号 64に示す合成 MAをプライマ一として PCR反応を行ない gdh遺伝 子断片を調製し、 これを PAJ220 の Bal l 部位に挿入した pAJ220G を構築した。 PAJ220の Ball部位近傍にはプロモーターが存在しており、 Bal l部位に揷入され た遺伝子はその挿入された向きによっては発現量が増強されることとなる。 PAJ220Gおよび pGDHを ATCC13869株に電気パルス法で導入した株を構築し、 上 記 （ 1 ) 記載の方法で GDH活性を測定した。 その結果、 PAJ220G導入株では pGDH 導入株に比しおよそ 1.5倍の GDH活性が認められた。 （表 24) 表 24
GDH腿生 謹直
ATCC13869 7.7 1.0
ATCC13869/pGDH 82.7 10.7
ATCC13869/pAJ220G 120. 1 15.6
( 5 ) gdh 活性が収率および副生 Asp に与える影響の検討
pGDHおよび PAJ220G を AJ13029 に電気パルス法にて導入した。 これらの株と 上記 （2 ) で取得した各株を表 25 に示す組成の種培養培地に接種し、 31. 5°Cに 24時間
振とう培養して種培養を得た。 表 25に示す組成の本培養培地を 500ml 容ガラス 製ジャーフアーメン夕一に 300ml ずつ分注し加熱殺菌した後、 上記種培養を 40ml接種した。 攪拌速度を 800 ~ 1300rpm 、 通気量を 1/2 〜l/lvvm とし、 培 養温度 31.5°Cで培養を開始した。 培溶液の pH はアンモニアガスで 7.5 に維持 した。 培養を開始して 8時間後に 37°Cにシフトした。 いずれも 20〜40時間でグ ルコースが完全に消費された時点で培養を終了し、 培溶液中に生成蓄積された L -グルタミン酸の量を測定した （表 26) 。 収率を最高にする GDH 活性は 3倍程 度であり、 それよりも GDH 活性が上昇すると収率向上幅は減少し、 およそ 16倍 に強化したところではむしろ収率は低下していた。 副生アミノ酸を日立のァミノ 酸アナライザ一 L- 8500 にて分析したところ、 GDH 活性の上昇に伴いァスパラギ ン酸およびァラニンの蓄積が上昇していることが明らかとなった。 これらの結果 から、 グル夕ミン酸収率を向上させるためにはァスパラギン酸およびァラニンの 著しい増加を引き起こさないように GDH 活性を適度に強化する必要があり、 そ の方法の一つして gdh プロモー夕一に各種の変異を導入することで GDH 活性を 親株の 3倍前後に調節することが有効な手段であることが示された。 表 25 成分
種培養 本培養
グルコース 50 g/1 150 g/1
KH2P04 1 g/1 2 g/1
MgS04 · 7H20 0.4 g/1 1.5 g/1
FeS04 · 7H20 10 mg/1 15 mg/1
MnS04 · 4H20 10 mg/1 15 mg/1
大豆蛋白加水分解 20 ml/1 50 ml/1
ピオチン 0.5 mg/1 2 mg/1
サイアミン塩酸塩 2 mg/1 3 mg/1 表 26
Glu(^ dl ) Asp(mg/dl ) Ala(mg dl ) GDH比活性 相対値
AJ 13029 8.3 49 60 7.7 1.0
GA01 9.0 145 152 22.3 2. 9
GA02 8. 9 153 155 27.0 3.5
AJ13029/pGDH 8.6 201 190 82.7 10.7
AJ13029/pAJ220G 7.5 290 590 120. 12 15.6

Claims

請求の範囲
1. コリネ型細菌の染色体上のアミノ酸又は核酸生合成系遺伝子のプロモー 夕一配列に、 コンセンサス配列に近づくような変異を起こさせるか又は遺伝 子組換えにより導入して、 コリネ型細菌の変異体を調製し、 該変異体を培養 して目的とするアミノ酸又は核酸の産生量の多い変異体を採取することを特 徴とするアミノ酸又は核酸産生能が向上したコリネ型細菌の調製方法。
2. アミノ酸が、 グルタミン酸、 リジン、 アルギニン、 セリン、 フエニルァ ラニンからなる群から選ばれ、 核酸がイノシン、 グアノシン、 アデノシン及 びヌクレオチドからなる群から選ばれる請求項 1記載に方法。
3. アミノ酸が、 グルタミン酸であり、 そのプロモー夕一が、 グルタミン酸 デヒドロゲナ一ゼ （GDH) 、 クェン酸合成酵素 （CS) 、 イソクェン酸合 成酵素 （I CDH) 、 ビルビン酸デヒドロゲナ一セ （PDH) 及びアコ二夕 —ゼ （ACO) 産生遺伝子用プロモ一夕一からなる群から選ばれる請求項 1 言己載に方法。
4. グルタミン酸デヒドロゲナ一ゼ （GDH) 産生遺伝子用プロモーターが、 一 35領域に CGGTCA 、 TTGTCA、 TTGACA及び TTGCCA からなる群から選ば れる少なくとも一種の D N A配列及び 又は一 10領域に TATAAT配列若しく は該配列の ATMT の塩基が別の塩基で置換されており、 プロモーター機能を 阻害しない配列を有するものである請求項 3記載に方法。
5. GDHのプロモ一夕一が、 一 35領域として TGGTCAを有し一 10領域と して TATAATを有するもの、 または、 一 35領域として TTGTCAを有し一 10 領域として TATAATを有するものである請求項 4記載の方法。
6. CS用プロモーターが、 —35領域に TTGACA配列及び/又は一 10領 域に TATMT配列を有しており、 プロモ一夕一機能を阻害しない配列を有する ものである請求項 3記載に方法。
7. I CD H用プロモーターが、 一 35領域の第一又は第二のプロモ夕一に TTGCCA配列及び TTGACA配列のいずれか及び/又は一 10領域の第一又は第 二のプロモ夕一に TATAAT配列を有しており、 プロモ一夕一機能を阻害しない 配列を有するものである請求項 3記載に方法。
8 . P D H用プロモ一夕一が、 一 3 5領域に TTGCCA配列及び/又は— 1 0 領域に TATAAT配列を有しており、 プロモー夕一機能を阻害しない配列を有す るものである請求項 3記載に方法。
9 . アミノ酸が、 アルギニンであり、 そのプロモ一夕一が、 アルギニノコハ ク酸シン夕一ゼ用プロモー夕一である請求項 1記載に方法。
1 0 . アルギニノコハク酸シン夕一ゼ用プロモ一夕一が、 一 3 5領域に 丁60 CA、 TTGCTA及び TTGTCA からなる群から選ばれる少なくとも一種の D N A配 列及び/又は一 1 0領域に TATMT配列若しくは該配列の ATMT の塩基が別 の塩基で置換されており、 プロモーター機能を阻害しない配列を有するもの である請求項 9記載に方法。
1 1. アルギニノコハク酸シン夕一ゼ用プロモーターが、 一 3 5領域に 6 A配列及び/又は一 1 0領域に TATMT配列を有するものである請求項 10記 載に方法。
1 2 . 請求項 4から 8記載のプロモー夕一を有するグルタミン酸合成遺伝子。
1 3 . 請求項 1 0記載のプロモー夕一を有するアルギニン合成遺伝子。
1 4 . 請求項 1 2記載のグルタミン酸合成遺伝子を有するコリネ型グルタミ ン酸生産菌。
1 5 . 請求項 1 3記載のアルギニン合成遺伝子を有するコリネ型アルギニン
1 6 . 請求項 1から 1 1の方法で構築したアミノ酸又は核酸産生能が向上し たコリネ型細菌、 請求項 1 4又は 1 5のコリネ型細菌を、 培地で培養し、 培 地中に目的のアミノ酸又は核酸を生成蓄積させ、 これを該培地から採取する ことを特徴とする発酵法による該ァミノ酸又は核酸の製造方法。
1 7 . 4一フルォログルタミン酸に対して耐性を有するコリネ型 L一グル夕 ミン酸生産菌を、 液体培地で培養し、 培地中に L—グルタミン酸を生成蓄積 させ、 これを該培地から採取することを特徴とする発酵法による L一グル夕 ミン酸の製造方法。
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