CN1243827C - 选定生物体的人工启动子文库和得自这种文库的启动子 - Google Patents

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Abstract

选定生物体或生物体组的人工启动子文库被构建为双链DNA片段的混合物，所述双链DNA片段的有义链含有得自所述生物体或生物体组之有效启动子的至少两个共有序列或它们的包含各自至少一半的部分，以及长度可变的周围或中间核苷酸序列(间隔区)，所述间隔区序列中至少7个核苷酸随机选自核苷碱基A，T，C和G。双链DNA片段的有义链也包含将特定的调节特征，如由生长条件的变化引起的激活作用，赋予文库内启动子的调节DNA序列。另外，它们还可能具有添加于其一端或两端的包含一个或多个限制性内切核酸酶识别位点的序列。选定生物体或生物体组可选自原核生物和真核生物；在原核生物中，保留的共有序列最经常地含有-35信号(-35至-30)：TTGACA和-10信号(-12至-7)：TATAAT，或者它们的包含各自至少3个保守核苷酸的部分，而在真核生物中，所述共有序列应含有TATA盒和至少一个上游激活序列(UAS)。这种人工启动子文库可用于例如在多种选定生物体中使特定基因的表达最优化。

Description

选定生物体的人工启动子文库和得自这种文库的启动子
发明领域
本发明涉及人工启动子文库和构建可用于选定生物体或生物体组之人工启动子文库的方法。本发明还涉及得自这种文库的各个新启动子。另外，本发明涉及通过利用得自选定生物体的这种人工启动子文库的启动子使一个基因在该生物体中的表达最优化的方法。原则上，可构建本发明的人工启动子文库以用于任何活的生物体，但目前它们大多用于调节微生物的基因表达。对本发明而言，术语“微生物”应广义地包括如细菌的原核生物，以及如酵母、其它真菌和高等生物细胞系的真核微生物。
发明背景
尽管十多年来基因工程已变得容易实行，但活生物体的代谢工程在工业应用方面仍处于初级阶段。这在很大程度上应归因于迄今为止改善株系性能的很多尝试的令人失望的结果。增加代谢流量(flux)的尝试出现负结果至少有2个原因：
原因之一是基因工程趋向于忽略细胞代谢的精细控制和调节。通过将基因置于高拷贝数目的质粒上，使预期为限速性的酶的表达增加了10至100倍。或者，通过基因的缺失使途径中的一条分支流量被消除。这经常会对代谢产生次级作用，例如通过降低对细胞代谢的其它部分(如生物体生长必需的过程)至关重要的代谢物浓度，因而最后的结果是：就所需产物而言，细胞的总体性能反而降低了。因此，倒是有必要将相关基因的表达调节到正常表达水平左右，并测定最适的表达水平，例如使流量最大化或最小化的水平。
出现负结果的第二个原因在于其限速概念本身：代谢控制理论(Kacser和Burns，1973)和通过途径中的各个步骤对控制进行实验测定(Schaaff等，1989；Jensen等，1993)都表明，预期在特定流量方面会限制速率的反应步骤原来对流量没有或仅有很小的控制作用。已证明倒是途径中的几种酶共同承担着对细胞代谢的控制和调节，可能需要增强几种酶的表达以得到较高的流量。
根据代谢控制理论，由途径中所有酶产生的流量控制总和总是要达到1，因此，一种酶的浓度最优化之后，流量控制将转移至另一种或多种酶，进行多轮酶最优化有可能进一步增加流量。
总的说来，流量最优化需要1)细微调节酶浓度而不是很多倍的过量表达，并且经常需要2)对途径中几种酶的水平进行最优化，而不是寻找限速步骤。
目前可利用很多系统将基因表达增加1000倍以上，和/或在发酵过程的特定时间点启动基因表达(如使用温度诱导型系统)。至于在发酵罐中调到稳态基因表达状态，比如正常表达水平的150％或70％，这就更加困难了。原则上，可以在所需基因的前面使用lac型启动子，然后加入一定量的lac系统诱导物，例如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，或在正确的温度下使用温度敏感性系统。对于大规模的工业应用而言，这些可能性经常是不太现实的。另一种方法是使用恰好具有所需强度的启动子，然而，这些启动子很少能得到，另外人们还需要一定范围内的启动子活性以首先使基因表达最优化(见下文)。
在过去20年里，在确定和最优化微生物的共有序列方面做了很多工作。在很多原核生物中，相对于转录起始位点分别约-10和-35的位置处经常可发现2个或多或少保守的DNA序列：TATAAT和TTGACA，这2个序列之间有大约17个碱基对。本领域教导说，通过包含这些元件，所得启动子将趋向于变为强启动子。实际上，启动子增效突变(相对少见的事件)经常是导致与上述共有序列更加匹配，而减效突变则导致与共有序列匹配更差或使它们之间的距离更不合适。另外，若将随机DNA序列代替2个共有序列之一而克隆进去，所得启动子的强度经常与和共有序列的同源性程度相关。
原则上，通过改变共有序列中的碱基对或通过改变它们之间的间隔7区长度可使启动子的强度得以调节。但这种变化对启动子强度影响将较大(见本发明的实施例1)，因此，通过共有序列中碱基对的变化是不太可能达到小步幅地调节强度的。
尽管已知分隔2个共有序列的间隔区的长度对启动子强度起着重要的作用，但人们通常认为共有序列之间的间隔区序列对启动子强度不太重要，实际上，通过诱变来鉴定间隔区中的其它共有序列的尝试也未成功。迄今为止，没有人尝试过使间隔区随机化，而同时使共有序列和间隔区的长度保持相对恒定。
已进行了大量实验以确定和最优化微生物的共有序列，这些实验包括其中至少一个共有序列被随机化的实验。在一些这种实验中，共有序列周围的一部分核苷酸也被随机化以产生间隔区长度非17bp的启动子，和/或在共有序列周围发现可能有的新共有基序。如此产生有效启动子的机会非常小，必需进行选择以找出与共有序列的同源性足够高而导致产生甚至弱启动子的那些稀有事件。
发明目的
我们着重研究的启动子文库应覆盖启动子活性的整个范围，所述范围对于特定种类启动子的基因工程改造可能是重要的，优选从可测的最弱的启动子至可能达到的最强的启动子。另外，我们还致力于以小步幅方式覆盖上述宽活性范围，比如每一步将活性增加50％-100％以适于上述流量最优化的目的。
在本发明中，我们显示，共有序列之间的间隔区序列比人们以前所认识到的要重要得多。当1)以随机的方式同时改变间隔区序列的大部分，并且2)同时，共有序列的至少一半保持不变时，间隔区序列对启动子强度能产生很强的影响。我们还阐明，如果这两个条件都能满足，则可使用我们的方法来产生覆盖宽活性范围的启动子，包括很强的启动子。这一启动子活性范围内的活性变化幅度较密，因而使得这些启动子非常适于代谢工程目的。另外，我们还阐明，可使用上述方法，以不同寻常的高频率为宽范围的生物体产生启动子。
发明简述
本发明提供了可用于选定生物体或生物体组的人工启动子文库，在不含有以前已知的启动子序列和分离自天然来源的启动子序列的前提下，该文库含有双链DNA片段的混合物，所述双链DNA片段的有义链含有得自所述生物体或生物体组之有效启动子的至少两个共有序列或它们的包含各自至少一半的部分，还含有长度可变的周围或中间核苷酸序列(间隔区)，所述间隔区序列中至少7个核苷酸随机选自核苷碱基A，T，C和G。
当间隔区序列中的至少10个、优选至少12个、更优选至少14个核苷酸是在核苷碱基A，T，C和G中随机选取时，可得到最大的启动子强度变化范围。
双链DNA片段的有义链还可包括将特定调节特征赋予文库中启动子的调节DNA序列。这种特定调节特征优选是可被生长条件的变化(如pH、渗透性、温度或生长期的变化)导致的激活作用。
为了进行克隆，双链DNA片段通常具有添加于其一端或两端的含有一个或多个限制性内切核酸酶识别位点的序列；最合适的序列是多个限制性内切核酸酶识别位点(多克隆位点MCS)。
所述选定的生物体或生物体组可选自原核生物和真核生物，尤其是选自如酵母、其它真菌和高等生物体细胞系的原核和真核微生物。
对于乳品工业有用的一组原核生物包括乳球菌属(Lactococcus)，链球菌属(Streptococcus)，肠球菌属(Enterococcus)，乳杆菌属(Lactobacillus)和明串珠菌属(Leuconostoc)等乳酸菌，尤其是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等菌株。其它有用的原核生物是属于埃希氏菌属(Escherichia)，芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudo-monas)，尤其是大肠杆菌(Escherichiacoli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的细菌。
在用于原核生物的人工启动子文库中，所述共有序列可含有例如-10信号(-12至-7)：TATAAT和至少一个位于-10信号上游的激活蛋白结合位点或其含有各自至少3个保守核苷酸的部分。
绝大多数情况下，保留在原核生物人工启动子文库中的共有序列应含有-35信号(-35至-30)：TTGACA和-10信号(-12至-7)：TATAAT或者它们的包含各自至少3个保守核苷酸的部分。
当所述共有序列含有-35信号的4至6个保守核苷酸和-10信号的4至6个保守核苷酸，优选均含有5或6个保守核苷酸，更优选含有各自的所有6个核苷酸时，通常可得到更有效的启动子。当所述共有序列另外含有间插的保守基元，如选自-44至-41：AGTT，-40至-36：TATTC，-15至-14：TG，和+1至+8：GTACTGTT的保守基元时，可得到最有效的启动子。
在这种启动子中，-35信号和-10信号之间的间隔区的长度应为14-23bp，优选为16-18bp，更优选为17bp。这应理解为指的是两个六聚体信号之间间隔区的长度，甚至当信号中的一些核苷酸已突变时也是如此。
在真核生物中，所述共有序列应含有一个TATA盒和至少一个上游激活序列(upstream activation sequene，UAS)。
有用的真核微生物是一种酵母——酿酒酵母(Saccharomycescere-visiae)，这是一种标准的面包酵母。对于将在酵母属(Saccharomyces)中使用的启动子，其内共有序列可另外含有在酿酒酵母中起作用的转录起始信号(TI盒)。
在本发明用于酿酒酵母的人工启动子文库的一个具体实施方案中，所述共有序列含有TATA盒：TATAAA，UASGCN4p：TGACTCA和TI盒：CTCTTAAGTGCAAGTGACTGCGA，该TI盒也可作为精氨酸阻抑物argR的结合位点起作用。
本发明也包含上文限定的人工启动子文库内的各个启动子。根据下文实施例构建的具体启动子列于下文的SEQ ID NO：5至58。本发明另外还包括衍生自本发明人工启动子文库所限定的启动子的人工启动子。
本发明涉及一种构建适于在选定生物体或生物体组中最优化表达2一个基因的一套启动子的方法，所述方法包括以下诸步骤：(i)在所述生物体或生物体组内鉴定出包含由不保守的核苷酸序列(间隔区序列)分隔开的至少两个共有序列的启动子序列，(ii)构建一套单链DNA序列，其包含该已鉴定的启动子序列的每一共有序列各自至少一半以及不保守的核苷酸间隔区序列，相对于该已鉴定的启动子的间隔区序列，所述间隔区序列至少一部分已有所改变而包含随机选自A、T、C和G的核苷酸，而所述共有序列的至少一半保持不变，和(iii)将该单链DNA序列转变为双链DNA序列，以获得一套不同的启动子，在启动子强度方面，它们覆盖一个启动子活性范围。
本发明还涉及分离出能够使一种基因在选定生物体内最优化表达的启动子序列的方法，该方法包括：(i)利用上述方法，构建启动子强度覆盖一个启动子活性范围的一套启动子，(ii)将该套启动子克隆到该生物体中，其中，在每一克隆内，将待表达的基因置于该套启动子的至少一个启动子的控制之下，(iii)培养各克隆，并筛选出显示基因产物形成最优化流量的克隆，和(iv)从显示基因产物形成最优化流量的克隆中分离出所述启动子序列。
本发明还提供了构建可用于选定生物体或生物体组之人工启动子文库的方法，所述方法包括：从所述生物体或生物体组的有效启动子中选择出至少两个共有序列；合成单链DNA序列的混合物，所述单链DNA序列含有所述共有序列或它们的包含各自至少一半的部分，还含有长度可变的周围或中间核苷酸序列(间隔区)，所述间隔区序列中至少7个核苷酸随机选自核苷碱基A，T，C和G；通过第二条链的合成将单链DNA序列转变为双链DNA片段。
如上所述，当间隔区序列中的至少10个、优选至少12个、更优选至少14个核苷酸是在核苷碱基A、T、C和G中随机选取的时，可得到最大的变化范围。
为了得到对调节敏感的人工启动子文库，合成的单链DNA序列可包含一种能将特定调节特征赋予文库中启动子的调节DNA序列。这种特定调节特征优选是由生长条件的变化，如pH、渗透性，温度或生长期的变化而引起激活作用。
同样，为了得到适于克隆的人工启动子文库，可在合成中于单链DNA序列的一端或两端添加提供一个或多个限制性内切核酸酶识别位点的序列，或将含有这种限制性位点的接头与双链DNA片段的一端或两端连接。最为适宜的是这种序列包含限制性内切核酸酶多个识别位点(多克隆位点MCS)。
可通过本发明方法为其制备人工启动子文库的选定生物体和为特定生物体之启动子文库所选定的多种简并序列与上文就人工启动子文库的讨论在本质上是相同的。
在上述人工启动子文库可能的应用方面，本发明另外还提供了使基因在一种微生物中的表达最优化的方法，所述方法包括：
a)从根据权利要求1-26中任一项或通过权利要求30-55中任一项的方法构建的人工启动子文库中，选择一套启动子，这些启动子以相对较小步幅的活性变化方式覆盖启动子活性的一个范围；
b)将所述套启动子克隆至所述生物体中，其中在每个克隆内将所述基因置于得自该套的至少一个启动子的控制之下；
c)培养选定克隆并对它们进行筛选以找出显示出产物形成最优流量的克隆。
优选将此方法用于原核或真核微生物，如细菌、酵母、其它真菌和哺乳动物细胞系。
附图简述
图1.实施例1中乳酸乳球菌的人工启动子文库。在添加有2μg/ml红霉素的GM17培养基中培养菌株MG1363，由其中的启动子克隆载体pAK80上不同的合成启动子克隆所转录的编码β-半乳糖苷酶之报道基因(lacLM)的表达情况来检测启动子活性(Miller单位)。数据点的分布模式表明哪些启动子克隆的-35或-10共有序列、或这两个共有序列之间间隔区的长度有所不同。
图2.实施例2中乳酸乳球菌的人工的热激调节启动子文库。由菌株LB436染色体上不同的合成启动子克隆所转录的编码β-葡糖醛酸酶之报道基因(gusA)的表达情况来检测启动子活性(Miller单位)。于两种不同温度30和37℃下，在添加有2μg/ml红霉素的GM17培养基中培养细胞。β-葡糖醛酸酶的检测与β-半乳糖苷酶的检测(见实施例1)平行进行，不同的是此处使用X-gluc作为底物。
图3.检测实施例1中的人工启动子文库在大肠杆菌中的活性。在添加有200μg/ml红霉素的LB培养基中培养菌株BOE270，由其中的启动子克隆载体pAK80上不同的合成启动子克隆所转录的编码β-半乳糖苷酶之报道基因(lacLM)的表达情况来检测启动子活性(Miller单位)。数据点的分布模式表明哪些启动子克隆的-35或-10共有序列或这两个共有序列之间间隔区的长度有所不同。
图4.实施例7中酿酒酵母的人工启动子文库。在添加有2％葡萄糖的SD基本培养基中培养酿酒酵母菌株SG24(URA3-52)，由其中的启动子克隆载体pYLZ-2上不同的合成启动子克隆所转录的编码β-半乳糖苷酶之报道基因(lacZ)的表达情况来检测启动子活性(Miller单位)。YP24和YP435在UASGCN4p结合位点分别具有1bp的缺失和一个点突变。pTK101含有的启动子中UAS序列已缺失而TATA盒仍然存在。
图5.实施例7中通过外部精氨酸调节人工酵母启动子。在添加有2％葡萄糖，含(SDG)或不含1g/l精氨酸(SDG+arg)的SD基本培养基中培养酿酒酵母菌株SG24(URA3-52)，由其中的启动子克隆载体pYLZ-2上不同的合成启动子克隆所转录的编码β-半乳糖苷酶之报道基因(lacZ)的表达情况来检测启动子活性(Miller单位)。YP183在argR阻抑物的结合位点具有一个13bp的缺失。
图6.实施例7中通过外部氨基酸调节人工酵母启动子。在添加有2％葡萄糖的SD基本培养基(SDG)或不含尿嘧啶的复合培养基(含有氨基酸)(SC-ura)中培养酿酒酵母菌株SG24(URA3-52)，由其中的启动子克隆载体pYLZ-2上不同的合成启动子克隆所转录的编码β-半乳糖苷酶之报道基因(lacZ)的表达来检测启动子活性(Miller单位)。YP24在UASGCN4p结合位点具有一个1bp的缺失。
发明详述
在我们的方法中，为待构建启动子文库的生物体或生物体组合成了简并寡核苷酸。通过将得自文献的、有关使启动子在所述特定生物体中有效地行使功能的可用知识联合起来而得到寡核苷酸的序列。不同生物体中，在寡核苷酸中需要固定的信息量有点不同。例如，在大肠杆菌中，-35和-10共有序列中较不完全的匹配，并且这些序列之间间隔区非17bp(分别为TTGACA和TATAAT)也可能形成相当强的启动子，而对于形成乳酸乳球菌中的强启动子的要求似乎更加苛刻。
第二，将单链寡核苷酸转变为双链DNA片段并克隆至启动子探测载体中。通过例如它们赋予菌落在指示平板上显现不同程度颜色的能力可鉴定含有启动子的克隆。原则上，这仅能为我们提供很强的启动子，但我们发现通过使共有序列之间的间隔区序列以随机的方式变化，所得启动子的强度可以得到调节。实际上，通过使用此方法，我们得到了启动子文库，该文库以小步幅活性变化方式跨越了可能会有用的整个启动子活性范围。
然后可按下述对基因表达进行最优化：1)从启动子文库中选择出强度为野生型启动子的例如25％，50％，100％，200％和400％的启动子，2)然后将这些启动子克隆至所需基因的上游以替代野生型启动子，3)接着测定用这5个构建体中的每一个得到的待优化变量的数值(如一条通路的流量)，将最适的构建体直接用作生产用生物体。有可能需要进一步地细微调节表达或扩大启动子活性的范围。此系统优于上述诱导型系统的一个明显优点在于一旦测定了最适启动子活性，原则上该菌株则可立即用于发酵过程。
在一个优选的实施方案中，使用本发明的随机间隔区方法产生了一系列组成型启动子以用于革兰氏阳性细菌乳酸乳球菌。在其它优选实施方案中，我们阐明了通过本发明的随机间隔区方法产生的启动子在至少两种革兰氏阴性细菌-大肠杆菌和假单胞菌，以及革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌中是有功能的。我们还阐明各个启动子的强度取决于在哪种生物体中使用该启动子，即在某些生物体中，特定的启动子较强，而在其它生物体中该启动子则较弱，但在所有被检测的生物体中，这些启动子均以小步幅活性变化方式覆盖了一个较宽的活性范围。
经常需要在发酵的某一时期将基因表达激活至某一水平，其原因可以是比如被表达的基因产物抑制了细胞生长。因此，将上述获得不同强度启动子的技术与某种调节机制联合起来是有用处的，例如可使启动子被pH，温度或生长期的变化所激活。
因此，在另一个优选的实施方案中，本发明的随机间隔区方法被用于产生一系列被特殊调节的启动子。如实施例2所述，可以将上述方法与特定的调节DNA序列联合使用而制备可用于革兰氏阳性细菌乳酸乳球菌的受热激调节的启动子的文库。
除了原核生物外，真核微生物(酵母和其它真菌以及哺乳动物细胞系)也是用于产生一系列有机化合物和多种蛋白质的重要微生物，因此，开发也可用于调节这些生物体中的基因表达的上述方法很有意义。因此，如实施例7所述，在另一个优选的实施方案中，采用本发明的随机间隔区方法产生可用于酿酒酵母这种面包酵母的一系列启动子。此处的启动子配备GCN4p和ARGR调节。
真核细胞中转录起始的调节相对于原核细胞而言更复杂一些。转录起始位点的前方一般有一个所谓的TATA盒，该盒含有共有序列TATAAA或其部分，但与原核细胞不同的是：TATA盒至转录起始位点之间的距离要不确定得多。在酿酒酵母中，此距离一般为40-120个核苷酸(Oliver和Warmington，1989)。酿酒酵母中缺乏很多原核生物启动子中均发现存在的所谓-35共有六聚体，倒是在转录起始位点的上游发现了所谓的上游激活序列(UAS)。这些UAS被特异的DNA结合蛋白识别，所述蛋白然后可作为转录起始的激活物起作用。例如，在参与氨基酸生物合成的基因的上游发现了一个UAS序列：UASGCN4p，该序列由确定GCN4蛋白结合位点的一段DNA序列组成，而GCN4蛋白可激活这些基因的转录(Hinnebusch，1992)。与原核生物中启动子元件之间的距离对于启动子强度而言似乎至关重要(见实施例1)这一现象形成对照的是，真核启动子中TATA盒和UAS序列之间的距离高度可变，可达约1000bp。一些基因甚至含有超过1拷贝的UAS，但1拷贝对于激活作用而言似乎已经足够了。
已知酵母的一个UAS序列是GCN4蛋白的结合位点。含有GCN4蛋白之结合位点的启动子应受生长培养基中氨基酸的供给状况所调节：在缺乏氨基酸时，GCN4蛋白形成并与特定的UAS序列结合，从而刺激由参与氨基酸生物合成之启动子启动的转录。GCN4蛋白结合位点(UASGCN4p)的共有序列是一段短的反向重复序列TGACTCA。
由GCN4蛋白激活的酿酒酵母启动子是ARG8启动子。在此启动子中，仅有1拷贝的UASGCN4p序列，它位于距TATA盒59bp处(我们将此距离称为间隔区1)。转录起始发生在TATA盒下游40-60个核苷酸处。ARG8启动子也含有作为精氨酸阻抑物argR之结合位点而起作用的一段DNA序列(Crabeel等，1995)，这使得该启动子可被外部精氨酸阻抑4倍。
因此，在这种情况下，启动子位于136bp内，它具有两个调节特征，这使得对于通过上文例子中所述的本发明随机间隔区方法建立启动子文库而言，该系统是有吸引力的。但此方法并不限于此模型系统；原则上，由小于约1000个核苷酸的间隔区分隔的TATA盒、UAS序列、阻抑蛋白结合位点等的任何组合均适于作为此方法的出发点。
实施例1
设计乳酸乳球菌启动子文库的简并寡核苷酸
根据参考文献(见de Vos & Simons，1994的综述)，乳酸乳球菌中的强启动子趋向于共享下列核苷酸序列(数字指的是相对于转录起始位点的位置，所述起始位点的位置数字为+1)：-12至-7：TATAAT；-15至-14：TG；-35至-30：TTGACA。-10和-35之间的间隔似乎为17个核苷酸。然而，已公开的乳酸乳球菌启动子序列的较细致的比较揭示出在除上述位置以外的很多位置处，核苷酸也或多或少地有些保守。一些这种位置是：-1：A；-3：A或T(＝W)；-6：A；-13：A或G(＝R)；-40至-36：TATTC。另外，Nilsson和Johansen(1994，BBA)指出了两个基元，+1至+8：GTACTGTT和-44至-41：AGTT，它们在乳酸乳球菌相对较强的启动子(用于转运RNA和核糖体RNA操纵子的启动子)之间似乎较保守，这些基元可赋予由启动子启动的强度和生长速率依赖性表达。
当包含这些额外的基元时，可得到乳酸乳球菌之有效启动子的下列53个核苷碱基的简并序列。在这53个核苷碱基中，有34个碱基是保守的，2个是半保守的(R和W)，17个可在4个核苷碱基之间随机变化。
5′ AGTTTATTC TTGACANNNNNNNNNNNNNN TGR TATAATANNWNA GTACTGTT 3′
另外，此简并序列的侧翼是可提供多个限制性内切核酸酶识别位点(多克隆位点MCS)的序列，实际上要合成的寡核苷酸混合物具有SEQ ID NO：1所述的下列简并序列：
MboI
DpnI
AlwI
NlaIV
BstYI
BamHI MseI
AlwI AflII SspI  NsiI
1           .         .         .         .          .        .
5′CGGGATCCTTAAGAATATTATGCATNNNNN AGTTTATTC TTGACANNNNNNNNNNNNNN T
                              AluI
                             PvuII
                             NspBII
                          SfcI
                      MseI Fnu4HI
                RsaI HpaI PstI
                ScaI HincII BbvI EcoRI
61       .         .         .         100
GR TATAATANNWNA GTACTGTTAACTGCAGCTGAATTCGG 3′
通过Hobolth DNA合成合成了根据此说明书的寡核苷酸混合物。
此寡核苷酸混合物起初是单链，必须转变为双链DNA片段以供克隆。通过在体外合成一个10bp的寡核苷酸可做到这一点，所述寡核苷酸具有与启动子寡核苷酸之3’末端互补的序列。然后将此寡核苷酸用作引物，在dATP、dCTP、dGTP和dTTP的存在下，通过DNA聚合酶I的Klenow片段合成第二条链。通过此方法，第二条DNA链与第一条DNA链精确互补。
结果产生了100bp的双链DNA片段混合物，所述片段在其3’和5’两末端都含有限制性内切核酸酶多个识别位点。然后用限制性内切核酸酶切割这些DNA片段以产生与载体DNA片段pAK80(Israelsen等，1995)之末端相容的适当“粘性”末端。pAK80是一种穿梭载体，这意味着它具有用于在大肠杆菌和乳酸乳球菌中增殖的复制起点。这样，可在大肠杆菌中方便地进行克隆步骤，而随后的生理学实验可在乳酸乳球菌中进行。另外，pAK80在多克隆位点的下游携有无启动子的β-半乳糖苷酶报道基因系统(lacLM)，因此，除非将启动子插入多克隆位点，否则的话pAK80不表达lacLM基因。
使用两种克隆策略将双链DNA片段的混合物克隆至克隆载体pAK80：
1)用BamHI和PstI消化混合物，用PstI和BglII消化载体pAK80(BglII与BamHI是相容的)。
2)用SspI和HincII消化混合物，用SmaI消化载体pAK80(这三种酶都产生钝末端DNA片段)。
在这两种情况下，均用牛肠道磷酸酶(CIP)进一步处理载体DNA以防止克隆载体重新连接。随后，在标准连接条件下使用T4 DNA连接酶，于16℃将片段混合物和载体DNA连接过夜。
用连接混合物转化E.coli K-12Δlac，并筛选红霉素抗性。经Ca++离子标准处理制备E.coli K-12菌株MT102的感受态细胞(Maniatis等，1982)，然后使用标准的转化方法(Maniatis等，1982)将连接混合物转化至这些细胞中，筛选所得克隆的β-半乳糖苷酶活性，该活性表现为在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的平板上会产生蓝色菌落。将转化混合物平铺在含有200μg/ml红霉素，1％甘油和100μg/ml X-gal的LB平板上。得到150个红霉素抗性转化子，所有菌落最初为白色，但延长保温时间后(4℃2周)，这些菌落中有46个变为浅蓝色。这样，使用策略1)，我们发现了17个蓝色菌落(CP30至CP46)，使用策略2)，我们发现了29个蓝色菌落(CP1至CP29)。
从这些克隆(CP1至CP46)的每一个中分离质粒DNA，并通过限制性酶图谱的绘制进行分析。几乎所有质粒(除CP31和CP43外)都含有插入于pAK80之MCS的启动子片段，其方向使得可介导该载体上本来无启动子的lacLM基因发生转录。
然后将这46个质粒DNA制品转化至乳酸乳球菌亚种lactisMG1363中，并进行红霉素抗性选择。通过按Holo和Nes(1989)所述，在含有2％甘氨酸的SGM17培养基中将细胞培养过夜来制备乳酸乳球菌亚种lactis菌株MG1363(Gasson，1983)的感受态细胞，然后使用电穿孔方法(Holo和Nes，1989)将上述46个克隆中每一个的质粒DNA转化至这些细胞中。再生后，将细胞平铺在含有2μg/ml红霉素的SR平板上，随后筛选X-gal平板上的蓝色菌落，结果表明46个克隆之间β-半乳糖苷酶活性有很大的差异；一些克隆在保温24小时之后显现出深蓝色菌落，另一些在保温1周多之后仅显现出浅蓝色菌落。
然后按Miller(1972)所述和Israelsen等人(1995)的改进方法测定MG1363中46个克隆之液体培养物的β-半乳糖苷酶活性。菌株MG1363的诸培养物各携有pAK80的46个质粒衍生物之一，于30℃，在添加有1％葡萄糖的M17培养基上将所述培养物培养过夜。然后，在随后的β-半乳糖苷酶活性试验中使用这些培养物各25-100μl，与此不同的是对于最弱的启动子克隆而言，使用的是2ml培养物(通过离心浓缩20倍之后)，这些结果示于图1。显然，这些克隆的启动子片段的效力有很大的差异，而且这些克隆一起覆盖了从0.3单位至超过2000单位(这可能是该生物体目前已知的最强的启动子)的β-半乳糖苷酶活性的启动子活性范围。
另外，这一宽范围是以活性的细微变化方式所覆盖的，因此，这些启动子片段使我们不仅能在乳酸乳球菌中得到宽范围的基因表达，而且能小步幅调节乳酸乳球菌中的基因表达以使流量最优化。
上述46个克隆的DNA测序表明大多数插入的启动子片段具有最初为寡核苷酸设计而详细说明的DNA序列(见上文)，而其余片段的序列与此序列略有不同。
大多数在β-半乳糖苷酶试验中显示出较低活性(70单位或更低的β-半乳糖苷酶)的启动子片段或者在一个共有序列中有错误出现，或者在共有序列之间有一个16bp间隔区。此结果与理论一致，即共有序列中的变化对给定启动子的活性有很大的影响，这一结果还突出这样一个事实，即需要更加精巧的方法以产生以小步幅活性变化方式覆盖一个活性范围的启动子文库。显然，如果我们仅让共有序列发生变化和/或间隔区长度发生变化，而不是使间隔区序列随机改变，那么只会得到相当弱的启动子克隆，所得文库将不适于代谢工程。
总的说来，显示出高活性(大于70单位)的克隆具有与所述寡核苷酸指定序列相同的序列。总体上，具有完整的共有序列和间隔区长度为17个碱基对的克隆的活性范围从5单位(CP4)跨越至2000单位(CP25)。因此，这些结果表明，通过使间隔区随机化而同时使共有序列保持不变即可使启动子活性至少变化400倍。
通常，为了代谢工程的目的，需要相对较强的启动子。然而，有时也需要相当弱的启动子。上述寡核苷酸混合物合成过程中出现的相对少的错误原本不是有意要在这些启动子片段中引入的；我们的数据表明，谨慎地产生在共有序列中具有低百分比错误的寡核苷酸混合物是有用的。
在上述多种酶促反应中使用的酶得自Pharmacia和Boehringer，其使用方法如厂商所述。
实施例2
设计用于受温度调节的乳酸乳球菌启动子文库的简并寡核苷酸
此实施例阐明了用于乳酸乳球菌的受温度调节的启动子文库的开发。将含有8个碱基对反向重复序列的调节元件插入到-35序列上游几个碱基对处，所述反向重复序列已显示与乳酸乳球菌的热激反应有关。这种调节元件最低限度为27个碱基对：
5′-TTAGCACTCNNNNNNNNNGAGTGCTAA-3′
       IR      间隔区    IR
它含有由9个(或更少的)碱基对分隔开的9bp(或更长)的反向重复(IR)。因此应能将此反向重复序列与得到不同强度的组成型启动子的方法联合，从而得到一系列具有各种基本活性的启动子，通过改变培养基的温度可使活性诱导几倍。
因此，设计了一种寡核苷酸，它包括上述组成型启动子系列之序列(见实施例1和SEQ ID NO：1)的核心部分(-35位至+6位)。-35六聚体的上游序列已被上述反向重复序列所取代，+6位下游的序列也已被修饰过，与实施例1相比除去了2个保守区(+1至+8：GTACTGTT和-44至-41：AGTT)，所述保守区涉及生长速率调节，但经证明它不是产生乳酸乳球菌强启动子所必需的(见实施例1)。反向重复片段中两个反向DNA序列之间的间隔区(sp.1)序列此处可以随机变化以研究是否这种变化会对所得启动子的温度调节有任何影响，如改变温度会将它们诱导多少倍。反向重复片段和-35六聚体之间间隔区(sp.2)的重要性仍是未知的，但原则上此区域可能对启动子的热激反应起作用，或能调节启动子的热激反应。然而，为了限制参数的数目，我们选择包括一种天然构型(得自乳酸乳球菌的dnaJ启动子；van Asseldonk等，1993)：由5个T组成的短间隔区序列。
当将这些序列组合时，就得到了可用于乳酸乳球菌中的受温度调节之启动子的下列73bp共有序列。在这73bp中，45个是保守的，2个是半保守的(R和W)，26个是可以在4个核苷碱基之间随机变化的。
5′TTAGCACTCNNNNNNNNNGAGTGCTAATTTTT TTGACANNNNNNNNNNNNNN TGR
      IR            间隔区1             IR     sp.2               间隔区   3
TATAATANNWNAGTACTG 3′
另外，此简并序列的侧翼是表示限制性内切核酸酶多个识别位点(多克隆位点MCS)的序列，实际被合成的寡核苷酸混合物具有SEQ IDNO：2所述的下述简并序列：
MboI
DpnI
AlwI
NlaIV
BstYI    MseI  MseI
BamHI  AluI SspI
AlwI  HindIII  AseI
   1        .         .         .         .         .         .
5′CGGGATCCAAGCTTAATATTAATTAGCACTCNNNNNNNNNGAGTGCTAATTTTT TTGACA
                                                                                                   IR                                    IR                             -35
                                     AluI
                                     PvuII
                                     NspBII
                                 SfcI         EcoRI
                                 PstI         ApoI
                               RsaI Fnu4HI  MaeI
                              ScaI  BbvI  XbaI
61       .      A  .      T  .         .         .  113
NNNNNNNNNNNNNN TGG TATAATANNANAGTACTGCAGCTGTCTAGAATTCGG 3′
                                           -15            -10                        +1
将此寡核苷酸混合物转变为双链DNA片段(DSDF)并克隆至启动子克隆载体pLB85i中。pLB85i具有在大肠杆菌而不是乳酸乳球菌中复制的起点，和可用于这两种生物体的可选择标记。其不含有用于在乳酸乳球菌中复制的起点，而是含有attP序列，如果反式提供int基因产物，则attP序列可介导质粒插入乳酸乳球菌染色体中。因此，本实施例也可用于阐明通过使用经随机间隔区方法产生的启动子而对染色体编码基因进行的调节。pLB85i也是一种启动子克隆载体，它在无启动子的gusA基因上游含有多克隆位点。gusA类似于其它实施例中所用的lacZ和lacLM筛选系统，不同之处在于此处底物是X-gluc而不是X-gal。它在欲分析热激调节启动子的这种具体应用中被选择用作报道基因。这是因为gusA基因产物对热稳定，而热不稳定性看上去是与实施例1所用的lacLM基因有关的一个问题。
用XbaI和AseI消化DSDF混合物，用XbaI和NdeI(NdeI与AseI相容)消化载体pLB85i，并用碱性磷酸酶进一步处理以除去载体的5磷酸基团。将DFDS混合物与载体连接之后，用连接混合物转化菌株KW1，该菌株为gusA阴性的大肠杆菌菌株，对氨苄青霉素抗性进行选择。结果产生了约100个菌落，80％的菌落具有不同的蓝色强度，这表明这些克隆携有推定的热激启动子片段。挑选20个蓝色克隆供进一步分析。对得自这些克隆的质粒制品的限制性分析表明它们具有差不多正确大小的插入片段。随后，使用这些质粒制品中的6个转化LB436(乳酸乳球菌MG1363的衍生物，它含有第二个质粒pLB81，该质粒可提供将质粒整合至乳酸乳球菌染色体上的attB位点所必需的int基因)。从各个转化物中分离出其中构建体推定已整合至乳酸乳球菌染色体上的attB结合位点的菌落。使用attB区域的一个引物和pLB85i区域的一个引物，经标准的菌落PCR进一步证实构建体的整合。随后，分别检测克隆于30℃和37℃下在添加有红霉素和100μg/ml X-gluc的GM17培养基上形成蓝色菌落的能力，在这两种温度下，克隆显示出明显不同的颜色强度，这表明启动子活性目前受到温度调节。接着在这两种温度下，在液体培养基中，对5个选定的热激调节启动子测定由热激启动子引起的gusA表达，结果见图2。30℃下，这些克隆具有不同的活性，并覆盖了一个宽范围的启动子活性。并且，在37℃下，5个克隆中的4个(除HP6外的所有克隆)显示出更高的启动子活性，这表明启动子确实受温度调节。有趣的是，温度从30调至37℃，这些启动子被调节的倍数几乎相同，即1.7-2.3倍，这表明反向重复片段中的间隔区(间隔区1)对确定这些人工启动子的诱导倍数不太重要。
我们一直在观察积累的gusA活性，尽管数据明显显示出启动子受温度调节，但分析基因表达的领域内技术人员应理解这使得观察由例如外部参数(如温度)的某种变化所引起的启动子活性的改变更为困难。另外，与图2中比较稳态水平时的活性的结果相比，热激调节的启动子的活性在温度变化之后立即暂时性地提高10倍。为了更仔细地观察启动子活性的变化，应在改变温度之前和之后的不同时间观察蛋白质或mRNA合成的速率。因此，我们在温度从30℃变化至37℃之后的不同时间从5个克隆中分离出RNA，并通过标准的Northern印迹(Maniatis等，1983)观察gusA mRNA，以分析这一温度变化将各个启动子克隆诱导了多少倍。
实施例3
革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌被广泛用作生产一系列异源蛋白质的工业化生物反应器。因此，检测本发明的随机间隔区方法是否也能用于产生该生物体的启动子文库是很有意义的。枯草芽孢杆菌的共有序列非常类似于大肠杆菌和乳酸乳球菌的共有序列，因此，我们通过将大量CP启动子亚克隆至枯草芽孢杆菌的启动子克隆载体中即可检测该方法是否对枯草芽孢杆菌也有效，然后可以研究1)CP启动子在枯草芽孢杆菌中是否有活性，和2)在此生物体中，共有序列之间的间隔区是否对启动子强度也起着重要的作用。我们选择使用启动子克隆载体pDG268，该载体被设计用于将与lacZ的启动子融合物整合至枯草芽孢杆菌染色体上的amy基因座。该载体具有氨苄青霉素和新霉素抗性，为了进行最初的克隆，它可在大肠杆菌中复制，但它不能在枯草芽孢杆菌中复制。当将载体的线性化形式转化至枯草芽孢杆菌中时，它将插入枯草芽孢杆菌染色体上的amy基因座。因此，此实施例也可作为使用经随机间隔区方法产生的启动子调节染色体编码基因的例子。
CP启动子确实在枯草芽孢杆菌中也具有活性，各个启动子互相之间的强度还是非常不同。该启动子文库也覆盖枯草芽孢杆菌宽范围的启动子活性的事实表明随机间隔区方法对此生物体也有效。
实施例4
实施例1的CP启动子被设计用于乳酸乳球菌，但实施例1给出的寡核苷酸序列中包含大肠杆菌启动子的共有序列。另外，实施例1中用于产生CP启动子文库的载体是可用于乳酸乳球菌和大肠杆菌的穿梭载体，因此，这使得我们也能分析CP启动子在革兰氏阴性细菌宿主大肠杆菌中的活性。图3显示出33个CP启动子在大肠杆菌中的活性，显然，各个CP启动子的活性在这里也有很大程度的不同，这些启动子合在一起覆盖了一个宽的活性范围。有趣的是，各个启动子在大肠杆菌和乳酸乳球菌中强度之间的关联并不很强：在乳酸乳球菌中为强启动子的一些启动子在大肠杆菌中却是弱启动子，反之亦然。
就β-半乳糖苷酶活性而言的启动子活性一般比乳酸乳球菌中的活性低很多，这可能是由于启动子克隆载体pAK80是被设计和优化成用于革兰氏阳性细菌乳酸乳球菌，因此在大肠杆菌中的翻译效力可能较低。因此，我们将3个CP启动子(CP20，CP22和CP25)亚克隆至启动子克隆载体pCB267中，该载体被设计用于将大肠杆菌启动子克隆至无启动子的编码β-半乳糖苷酶之lacZ基因的上游。在此启动子系统中，CP启动子被证明是很有效的启动子，但3个启动子之间强度的相对差异是保守的，因此，CP25启动子比据认为是已知用于大肠杆菌中的最强启动子之一的杂合启动子ptac的活性高2.5倍。因此，这些数据进一步阐明我们方法的长处：通过分析经本发明的随机间隔区方法得到的相对少量的启动子克隆，我们已成功得到了一些在大肠杆菌和乳酸乳球菌中都最强的启动子。
实施例5
属于革兰氏阴性类的细菌假单胞菌因其在例如被污染土壤中化学废物的生物降解中的应用而变得越来越重要，但其基因工程也受缺乏适当启动子和表达系统的限制。有关假单胞菌启动子的文献揭示出假单胞菌的共有序列没有大肠杆菌、乳酸乳球菌和枯草芽孢杆菌那么确定，因此，在-35区域，人们经常会发现TTGR是保守的(R＝A或G)，而不同启动子的-35共有序列的其余部分却不太相同。-10共有序列可能是TATRAT。TTGR基元和-10序列之间的间隔区是18-19bp，这等同于在大肠杆菌中经常会发现的16-17bp的间隔区，因此可得出结论：此生物体中的营养型启动子的共有序列与大肠杆菌和乳酸乳球菌的共有序列非常接近。
因此，通过将启动子克隆至含有无启动子的β-半乳糖苷酶基因的克隆载体中，我们在恶臭假单胞菌中检测了一系列得自实施例1中的CP启动子。CP启动子的活性在强度上仍在一启动子活性宽范围内互不相同。这些结果表明在此类生物体中，本发明的随机间隔区方法也可用于产生相对较强的启动子和以小步幅活性变化方式覆盖的启动子活性宽范围。
实施例6
我们基于实施例5所述的共有序列设计了一段寡核苷酸，并如实施例1所述在其中掺入了多克隆位点。合成了下列寡核苷酸：
     MCS-(N)8-TTGR-N19-TATRAT-(N)8-MCS
使用与寡核苷酸3’末端同源的引物将此寡核苷酸转变为双链DNA，再将其克隆至启动子探测载体上无启动子的β-半乳糖苷酶基因的上游。直接用连接混合物转化恶臭假单胞菌菌株，并在含有X-gal的平板上对质粒携带的抗生素抗性进行选择。结果产生约100个多种蓝色强度的克隆。随后，按上述分析30个克隆的β-半乳糖苷酶活性。结果表明在此类生物体中，本发明的随机间隔区方法也可用于产生相对较强的启动子和以小步幅活性变化方式覆盖的一个启动子活性宽范围。
实施例7
设计酿酒酵母启动子文库的简并寡核苷酸
设计一段199bp的寡核苷酸，它从5’末端开始包括：一个EcoRI限制性位点(用于随后的克隆策略，见下文)，共有的UASGCN4p，一个59bp的间隔区(间隔区1)，共有的TATAAA序列(TATA盒)，一个38bp的间隔区(间隔区2)，23bp的阻抑物结合序列(这也是转录起始的区域)，TI盒和ARG8基因之第一个密码子之间的间隔区序列(此处，该间隔区为ARG8基因的天然序列，其中也包括ARG8基因的第一个密码子ATG)，最后，还包括BamHI位点，设计这一位点是为了与β-半乳糖苷酶报道基因读框一致地融合，见下文。
间隔区1和间隔区2的序列可以随机变化，实际合成的寡核苷酸混合物具有SEQ ID NO：3所述的下述简并序列：
         PleI
  EcoRI  HinfI
  ApoI MaeIII
   1        .         .         .         .         .         .
5′CAGAATTCGTGACTCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
             UASGCN4p
  61        .         .         .         .         .         .
   NNNNNNNNNNNNNNNNTATAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
                                      TATA-盒
          MseI                                           TfiI
           AflII      MaeIII                               HinfI
 121        .         .         .         .         .         .
   N CTCTTAAGTGCAAGTGACTGCGAACATTTTTTTCGTTTGTTAGAATAATTCAAGAATCG
                                     TI 盒
               MboI
               DpnI
               AlwI
              NlaIV
              BstYI
              BamHI
              AlwI
           NlaIII
 181        .       199
   CTACCAATCATGGATCCCG 3′
                ARG8 起始
按实施例1所述，使用与该199bp简并寡核苷酸之3’末端最后23bp互补的寡核苷酸，将此寡核苷酸混合物转变为双链DNA片段(DSDF)，随后，按下述将它克隆至两个启动子克隆载体pYLZ-2和pYLZ-6(Hermann等，1992)中的任一个：用EcoRI和BamHI双消化DSDF混合物和载体，并将DSDF与载体DNA连接。按实施例1所述，用连接混合物转化大肠杆菌，并对氨苄青霉素抗性进行选择。从500个单个克隆中分离质粒DNA并通过用限制性酶EcoRI和BamHI消化来筛选推定启动子片段的存在。
发现17个克隆具有约200bp的EcoRI-BamHI插入片段。用得自这17个克隆的质粒DNA转化酿酒酵母，对质粒携带的URA3标记进行选择，并测定β-半乳糖苷酶的产生。图4显示出17个克隆的所得β-半乳糖苷酶活性。所有这些启动子均比未插入启动子片段的克隆载体(pYLZ-2)自身的活性高，然而，更重要的是，在这种情况下，这些克隆也以小步幅活性变化方式覆盖了一个启动子活性范围。
序列分析的结果表明，上文讨论的17个克隆在间隔区1和间隔区2之间具有精确的TATA盒(TATAAA)，而这17个克隆中的2个，即YP24和YP435在UASGCN4p中各有缺陷。然而，YP435的活性为39单位，这与YP212所得值很接近。这些数据显示，间隔区的随机序列对启动子强度的影响比UASGCN4p结合位点状态对启动子强度的影响要更大。
如上文所讨论的，人工酵母启动子建立了两个不同的调节特征，一个是启动子应受生长培养基中精氨酸的存在情况的调节。为了检测人工酵母启动子是否也受精氨酸的调节，我们在含和不含精氨酸的基本培养基(SD+2％葡萄糖；SD+2％葡萄糖+1g/l精氨酸)中培养了大量克隆，图5显示出这些实验的结果。精氨酸的存在确实分别将克隆YP18、YP212、YP435调节了5、8、15倍。YP183不受精氨酸的调节，序列分析证实此启动子克隆在精氨酸阻抑物结合位点处具有一个13bp的缺失。
通过在基本培养基(SD+2％葡萄糖)，和丰富培养基(SC+2％葡萄糖-URA)中分析一些酵母启动子克隆的启动子活性，我们也检测了启动子是否受培养基中的外部氨基酸调节。图6显示出这些实验的结果。氨基酸的存在确实分别将克隆YP18、YP212、YP435和YP183中存在的启动子调节了2至10倍。YP24不受调节，这与此克隆在UASGCN4p位点中出现错误(见上文)一致。
氨基酸和特异的精氨酸调节方面的结果证明本发明的随机间隔区方法可用于产生覆盖一宽范围启动子活性并受外部信号调节的启动子。在本文中，本发明的调节方面由氨基酸和精氨酸调节举例说明，但并不局限于这些例子。
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                        序列表
(1)一般资料：
(i)申请人：
(A)姓名：Peter Ruhdal Jensen
(B)街道：Soegaardsvej 19
(C)城市：Gentofte
(E)国家：丹麦
(F)邮政编码：DK-2820
(ii)发明名称：选定生物体的人工启动子文库和得自这种文库的启动子
(iii)序列数：58
(v)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC可兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)
(vi)在先申请资料：
(A)申请号：DK 886/96
(B)申请日：1996年8月23日
(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：100个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：26..82
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“人工启动子文库”
           /附注＝“提供乳酸乳球菌中以小步幅覆盖一个
            宽范围表达的人工启动子混合物的简并序列”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc特征
(B)位置：31..45
(D)其它资料：/标准名称＝“共有序列”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc特征
(B)位置：60..69
(D)其它资料：/标准名称＝“共有序列”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc特征
(B)位置：74..82
(D)其它资料：/标准名称＝“共有序列”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：-35信号
(B)位置：40..45
(D)其它资料：/标准名称＝“-35盒”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：-10信号
(B)位置：63..68
(D)其它资料：/标准名称＝“Pribnow盒”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc_recomb
(B)位置：3..25
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
           /标准名称＝“多克隆位点”
         /附注＝“提供限制性内切核酸酶NlaIV，BstYI，
          BamHI，AlwI，MboI，DpnI，AflII，MseI，SspI，
          NsiI识别位点的序列”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc_recomb
(B)位置：74..98
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
           /标准名称＝“多克隆位点”
          /标记＝MCS
         /附注＝“提供限制性内切核酸酶ScaI，RsaI，
          HpaI，HincII，MseI，SfcI，PstI，Fnu4HI，
          BbvI，PvuII，NspBII，AluI，EcoRI识别位点
          的序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
CGGGATCCTT AAGAATATTA TGCATNNNNN AGTTTATTCT TGACANNNNN NNNNNNNNNT    60
GGTATAATAN NANAGTACTG TTAACTGCAG CTGAATTCGG                         100
(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：113个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：23..95
(D)其它资料：/标准名称＝“人工启动子文库”
         /附注＝“提供乳酸乳球菌中以小步幅方式覆盖
          一个表达宽范围表达的受温度
          调节之人工启动子混合物的简并序列”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc_特征
(B)位置：23..49
(D)其它资料：/标准名称＝“为启动子提供温度调节的序
              列”
             /附注＝“含有两个被短间隔区隔开的反向重
             复序列的此序列为启动子提供在革兰氏阴性
             细菌中的温度(热激)调节”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc特征
(B)位置：50..60
(D)其它资料：/标准_名称＝“共有序列”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc特征
(B)位置：75..84
(D)其它资料：/标准名称＝“共有序列”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc特征
(B)位置：89..95
(D)其它资料：/标准名称＝“共有序列”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：-35信号
(B)位置：55..60
(D)其它资料：/标准名称＝“-35盒”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：-10信号
(B)位置：78..83
(D)其它资料：/标准名称＝“Pribnow盒”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc_recomb
(B)位置：3..22
(D)其它资料：/标准名称＝“多克隆位点”
            /标记＝MCS
         /附注＝“提供限制性内切核酸酶NlaIV，BstYI，
         BamHI，AlwI，MboI，DpnI，HindIII，AluI，
         MseI(2个位点)，SspI，AseI识别位点的序列”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc_recomb
(B)位置：89..111
(D)其它资料：/标准名称＝“多克隆位点”
           /标记＝MCS
          /附注＝“提供限制性内切核酸酶ScaI，RsaI，
           SfcI，PstI，Fnu4HI，BbVI，PVuII，NspBII，
        AluI，XbaI，MaeI，EcoRI，ApoI识别位点的序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
CGGGATCCAA GCTTAATATT AATTAGCACT CNNNNNNNNN GAGTGCTAAT TTTTTTGACA    60
NNNNNNNNNN NNNNTGGTAT AATANNANAG TACTGCAGCT GTCTAGAATT CGG          113
(2)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：199个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：蛋白质结合
(B)位置：10..16
(D)其它资料：/功能＝“酿酒酵母中的激活启动子”
            /结合_组成成分＝“GCN4蛋白”
           /标准_名称＝“上游激活序列”
          /标记＝UAS_GCN4p
         /附注＝“GCN4蛋白结合位点的特定DNA序列，
          所述DNA序列可激活参与酿酒酵母氨基酸合成
          之基因的转录”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：TATA信号
(B)位置：67..72
(D)其它资料：/标准名称＝“TATA盒”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc信号
(B)位置：122..144
(D)其它资料：/功能＝“转录起始”
             /标准名称＝“TI盒”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：蛋白质结合
(B)位置：122..144
(D)其它资料：/结合组成成分＝“精氨酸阻抑物”
            /标准名称＝“精氨酸阻抑物结合位点”
            /标记＝argR
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc_RNA
(B)位置：145..192
(D)其它资料：/功能＝“间隔区”
             /标准名称＝“包括第一个密码子的ARG8基
             因天然序列的部分”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc_recomb
(B)位置：3..8
(D)其它资料：/标准名称＝“限制性内切核酸酶EcoRI的
             识别位点”
            /标记＝EcoRI_位点
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc_recomb
(B)位置：192..197
(D)其它资料：/标准名称＝“限制性内切核酸酶BamHI的
             识别位点”
            /标记＝BamHI_位点
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：10..192
(D)其它资料：/标准名称＝“人工启动子文库”
         /附注＝“提供酿酒酵母中以小步幅方式覆盖一
         个表达宽范围的人工启动子混合物的简并序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
CAGAATTCGT GACTCANNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN     60
NNNNNNNNNN NNNNNNTATA AANNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN    120
NCTCTTAAGT GCAAGTGACT GCGAACATTT TTTTCGTTTG TTAGAATAAT TCAAGAATCG    180
CTACCAATCA TGGATCCCG                                                 199
(2)SEQ ID NO：4的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：45个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：恶臭假单胞菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：1..45
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
           /标准名称＝“人工启动子文库”
          /附注＝“提供恶臭假单胞菌中以小步幅方式覆
       盖一个表达宽范围的人工启动子混合物的简并序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
NNNNNNNNTT GRNNNNNNNN NNNNNNNNNN NTATRATNNN NNNNN                   45
(2)SEQ ID NO：5的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp1
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
CATACCGGAG TTTATTCTTG ACAGTTCCAC CTCGGGTTGA TATAATATCT CAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：6的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp10
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
CATGGCTTAG TTTATTCTTG ACAGGGTAGT ATCACTGTGA TATAATAGGA CAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：7的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：59个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..59
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp11
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
CATAAGTGAG TTTATTCTTG ACCCGGACGC CCCCCTTTGA TATAATAAGT AGTACTGTT    59
(2)SEQ ID NO：8的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp12
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
CATATACAAG TTTATTCTTG ACACTAGTCG GCCAAAATGA TATAATACCT GAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：9的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp13
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
CATGCTTTAC TTTATTCTTG ACAAAACCAC CAGCTTTTGG TATAATACGT GAGAACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：10的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp14
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
CATGACGGAG TTTATTCTTG ACACAGGTAT GGACTTATGA TATAATAAAA CAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：11的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp15
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
CATTACNTAG TTNATTCTTG ACAGAATTAC GATTCGCTGG TATAATATAT CAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：12的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：58个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..58
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
          /标记＝Cp16
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
CATTGTGTAG TTTATTCTTG ACAGCTATGA GTCAATTTGG TATAATAACA GTACTCAG    58
(2)SEQ ID NO：13的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：59个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..59
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp17
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
CATTCTGGAG TTTATTCTTG ACCGCTCAGT ATGCAGTGGT ATAATAGTAC AGTACTGTT    59
(2)SEQ ID NO：14的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：58个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..58
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp18
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
CATTTTGCAG TTTATTCTTG ACATTGTGTG CTTCGGGTGT ATAATACTAA GTACTGTT    58
(2)SEQ ID NO：15的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：58个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..58
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp19
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
CATCGCTTAG TTTTTCTTGA CAGGAGGGAT CCGGGTTGAT ATAATAGTTA GTACTGTT    58
(2)SEQ ID NO：16的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp2
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
CATTTGCTAG TTTATTCTTG ACATGAAGCG TGCCTAATGG TATATTACTT GAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：17的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp20
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
CATGGGTGAG TTTATTCTTG ACAGTGCGGC CNGGGGCTGA TATCATAGCA GAGTACTATT    60
(2)SEQ ID NO：18的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：59个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..59
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp21
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
CATTACCGAG TTTATTCTTG ACACCGTTTA TCGGGGTTGT ATAATACTAT AGTACTGTT    59
(2)SEQ ID NO：19的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp23
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
CATGTAGGAG TTTATTCTTG ACAGATTAGT TAGGGGGTGG TATAATATCT CAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：20的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp24
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
CATGGGTAAG TTTATTCTTC ACACTATCTG GGCCCGATGG TATAATAAGT GACTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：21的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：59个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：3..59
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp25
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
CTTTGGCAGT TTATTCTTGA CATGTAGTGA GGGGGCTGGT ATAATCACAT AGTACTGTT    59
(2)SEQ ID NO：22的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp26
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
CATTCTACAG TTTATTCTTG ACATTGCACT GTCCCCCTGG TATAATAACT ATACATGCAT    60
(2)SEQ ID NO：23的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp28
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
CATGGGGCCG TTTATTCTTG ACAACGGCGA GCAGACCTGG TATAATAATA TAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：24的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：59个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..59
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp29
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
CATCGGTAAG TTATTCTTGA CATCTCAGGG GGGACGTGGT ATAATAACTG AGTACTGTT    59
(2)SEQ ID NO：25的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp3
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：
CATCCTGTAG TTTATTCTTG ACACACGTNN TTAGCTGTGG TATAATAGGA GAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：26的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp30
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：
CATGACAGAG TTTATTCTTG ACAGTATTGG GTTACTTTGG TATAATAGTT GAGTACTGTT    60
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(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp32
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
CATACGGGAG TTTATTCTTG ACATATTGCC GGTGTGTTGG TATAATAACT TAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：28的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
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             /标记＝Cp33
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CATGTTGGAG TTTATTCTTG ACATACAATT ACTGCAGTGA TATAATAGGT GAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：29的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
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         /标记＝Cp34
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CATCGCGAAG TTTATTCTTC ACACACCGCA GAACTTGTGG TATAATACAA CAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：30的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：59个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..59
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp37
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CATCATTAAG TTTATTCTTC ACATTGGCCG GAATTGTTGT ATAATACCTT AGTACTGTT    59
(2)SEQ ID NO：31的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
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         /标记＝Cp38
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CATAGAGAAG TTTATTCTTG ACAGCTAACT TGGCCTTTGA TATAATACAT GAGTACTGTT    60
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(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp39
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CATTGCGAAG TTTATTCTTG ACAGTACGTT TTTACCATGA TATAATAGTA TAGTACTGTT    60
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(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
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(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp4
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GATGTTTTAG TTTATTCTTG ACACCGTATC GTGCGCGTGA TATAATCGGG ATCCTTAAGA    60
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(i)序列特征：
(A)长度：59个碱基对
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(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp40
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CATAGAACAG TTTATTCTTG ACATTGAATA AGAAGGCTGA TATAATAGCC AGTACTGTT    59
(2)SEQ ID NO：35的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp41
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CATCCGCAAG TTTATTCTTG ACAGCTGAAT GTAGACGTGG TATAATAGTT AAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：36的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp42
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：
CATTCGTAAG TTTATTCTTG ACACCTGAGA TGAGGCGTGA TATAATAAAT AAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：37的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：59个碱基对
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(C)链型：双链
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(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..59
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp44
(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：
CATCGGGTAG TTTATTCTTG ACAATTAAGT AGAGCCTGAT ATAATAGTTC AGTACTGTT    59
(2)SEQ ID NO：38的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：59个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..59
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“组成型启动子”
           /标记＝Cp5
(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：
CATGGGGGAG TTTATTCTTG ACATCATCTT CGTAGCCTGG TATACTACAT GAGTATGTT    59
(2)SEQ ID NO：39的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp6
(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：
CATGTGGGAG TTTATTCTTG ACACAGATAT TTCCGGATGA TATAATAACT GAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：40的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp7
(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：
TATGCGGTAG TTTATTCTTG ACATGACGAG ACAGGTGTGG TATAATGGGT CTAGATTAGG    60
(2)SEQ ID NO：41的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp8
(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：
CATTCTTTAG TTTATTCTTG ACAAACGTAT TGAGGACTGA TATAATAGGT GAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：42的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：乳酸乳球菌
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：4..60
(D)其它资料：/标准名称＝“组成型启动子”
         /标记＝Cp9
(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：
CATAGTCTAG TTTATTCTTG ACACGCGGTC CATTGGCTGG TATAATAATT TAGTACTGTT    60
(2)SEQ ID NO：43的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：177个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..177
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp102
(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：
GAATTCGTGA CTCAAACGGG TGGTCGACGG GTGGTTCCAA TTAATTGGCG TCCCTCTTAT     60
AAAGGCGAGG GTACGTGCGA CAATTGGTAG AGCGAGCGGG GCTCTTAAGT GCAAGTGACT    120
GCGAACATTT TTTTCGTTTG TTAGAATAAT TCAAGAATCG CTACCAATCA TGGATCC       177
(2)SEQ ID NO：44的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：182个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..181
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp112
(xi)序列描述：SEQ ID NO：44：
GAATTCGTGA CTCACGGCAT CTGATGGTTG ACCATAGTCA GGAACATTGT GCTGGAGTTC     60
CTTGAGGAAT GAGTTATAAA ATGGGAGGTT GCGGCTAATG CCAGGCAGGA GAGGAACCCT    120
CTTAAGTGCA AGTGACTGCA AACATTTTTT TCGTTTGTTG AATCGCTACC AATCATGGAT    180
CC                                                                   182
(2)SEQ ID NO：45的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：191个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..181
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp13
(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：
GAATTCGTGA CTCACTAGGC AGGTCACGTT GGCTCTTCGC GGCGCAGGTT CGTATGCCGC     60
GCCGCCAGGG GCTTTATAAA GGTCGTCCTG GGTACAGTTG GGATGGCTCC ACGTTTCGGC    120
TCTTAAGTGC AAGTGACTGC GAACATTTCG TTTGTTAGAA TAATTCAAGA ATCGCTACCA    180
ATCATGGATC C                                                         191
(2)SEQ ID NO：46的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：167个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..167
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp15
(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：
GAATTCGTGA CTCAGGGCCG TACTAAGTAG CTTTCGTATG CTATGCGGGG TTTTATAAAT     60
CTTTGGGCCA TGGTCTTGCT GGAAAACACC TCTCTTAAGT GCAAGTGACT GCGAACATTT    120
TTTTCGTTTG TTAGAATAAT TCAAGAATCG CTACCAATCA TGGATCC                  167
(2)SEQ ID NO：47的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：191个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..191
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
            /标记＝Yp154
(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：
GAATTCGTGA CTCACCGCTC GGGTGCAGGG CCAAGGCGGC GGAATGTGCG GGGCGTTCTA     60
GCGCAATCGG GGTATAAATT TATAAGGAGG CTGCGGGTGC TAGTTTGTCT AGTTTGACTC    120
TTAAGTGCAA GTGACTGCGA ACATTTTTCG TTTGTTAGAA TAATTCAAGA ATCGCTACCA    180
ATCATGGATC C                                                         191
(2)SEQ ID NO：48的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：195个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..190
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp18
(xi)序列描述：SEQ ID NO：48：
GAATTCGTGA CTCAGGATTA GCTATGCCGG TTGGGATAAG CGAACAACTG GAGGTGAGAA     60
GCTTTTTGTC AGAATATAAA CCCGTTAGTC AGGGTTTGGT GGGATAGGGG GTACTGTACC    120
TCTTAAGTGC AAGTGACTGC GAACATTTTT TTCGTTTGTT AGAATAATTC AAGAATCGCT    180
ACCAATCATG GATCC                                                     195
(2)SEQ ID NO：49的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：179个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..179
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp183
(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：
GAATTCGTGA CTCACTAAGG GTTCGCCATT AACAGAATCG CTGGTAGAAC ATCGGTAGTT     60
AGGCACCCGA GTATAAACAG GCGGACCCCT CACGGATATC AGCTGATAGT GCGAGCCTCA    120
ATGCGAACAT TTTTTTCGTT TGTTAGAATA ATTCAAGAAT CGCTACCAAT CATGGATCC     179
(2)SEQ ID NO：50的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：195个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..190
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp190
(xi)序列描述：SEQ ID NO：50：
GAATTCGTGA CTCAGTATCC ACGGGTGTTT GAGGGCTGGT CGCAGGTTAG CAGGCGAGGG     60
CGGGTGGTTA CGGCTATAAA TGAGTGTTTG CAGCCGGGTA CGGGCGTACG AGTAGTGATC    120
TCTTAAATGC AAGTGACTGC GAACATTTTT TTCGTTTGTT AGAATAATTC AAGAATCGCT    180
ACCAATCATG GATCC                                                     195
(2)SEQ ID NO：51的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：193个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..189
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp191
(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：
GAATTCGTGA CTCAATGCTG CGGGCGGCAG GAGTCTGGTG TAACTTCCCA TTTTGAGTGA     60
AAGACAGACC ATCTATAAAC ATTTGGTGGG CAAAGTGGCC TGGCGGATTT GTTTGGACTC    120
TTAAGTGAAA GTGACTGCGA ACATTTTTTT CGTTTGTTAG AATAATTCAA GAATCGCTAC    180
CAATCATGGA TCC                                                       193
(2)SEQ ID NO：52的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：166个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..166
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp192
(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：
GAATTCGTGA CTCACTTAAG GCTACTGCGG AAGTTTAGAT CTAAGGTCGG AAATAATTTA     60
GAAAATTACG ACATTATAAA TAGCGGAGAG GCCAGGTGAT GGGCACCATT GTGGGGGGGC    120
TCTTAATTGT TAGAATAATT CAAGAATCGC TACCAATCAT GGATCC                   166
(2)SEQ ID NO：53的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：195个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..190
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp212
(xi)序列描述：SEQ ID NO：53：
GAATTCGTGA CTCAGTCGCC CGCAAGATGG GATGGTGCAT TTTAAACACC CGAATTATAC     60
TCGTCAACTT ATAGTATAAA CGGAACGCGA CGATACGTTC TAGTTTTCGG CGAAGTCGAC    120
TCTTAAGTGC AAGTGACTGC GAACATTTTT TTCGTTTGTT AGAATAATTC AAGAATCGCT    180
ACCAATCATG GATCC                                                     195
(2)SEQ ID NO：54的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：188个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..183
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp24
(xi)序列描述：SEQ ID NO：54：
GAATTCGTAC TCACGACAGC GTTATGACTT CGAGGACCAG CTACTTCCGG TCGCGTACTA     60
GTTTTTACCT GTATAAACTT TGCTACCGCT GGGCCTTGGT GGTGCTGTCC CGCTCTTAAG    120
TGCAAGTGAC TGCGAACATT TTTTTCGTTT GTTACAATAA TTCAAGAATC GCTACCAATC    180
ATGGATCC                                                             188
(2)SEQ ID NO：55的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：195个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..190
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp435
(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：
GAATTCGTGA CTAAATGGAT AAGGTTATCG CCATCACGGA GTCTTCTCTC ACGTCTGGAG     60
CAGAGGCTAG ACCTTATAAA TTATACATGG TGGGAGAGGC GATAGTCTTT AGAGACGTGC    120
TCTTAAGTGC AAGTGACTGC GAACATTTTT TTCGTTTGTT AGAATAATTC AAGAATCGCT    180
ACCAATCATG GATCC                                                     195
(2)SEQ ID NO：56的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：189个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..184
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp68
(xi)序列描述：SEQ ID NO：56：
GAATTCGTGA CTCACAAGAA TGTGGGCGGG TCGTTAAACT GAGCCTGGAC ACCTTGGCTG     60
CGTCGCTTTC GTATAAAGAT CTTAGAGCTG TGGAGTCTGG GTCGAGTGGC CAGCTCTTAA    120
ATGCAAGTGA CTGCGAACAT TTTTTTCGTT TGTTAGAATA ATTCAAGAAT CGCTACCAAT    180
CATGGATCC                                                            189
(2)SEQ ID NO：57的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：195个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..190
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp89
(xi)序列描述：SEQ ID NO：57：
GAATTCGTGA CTCACTCGGA AGATTGGGTT TACGATTAGG ATGGCGCGGC AGAACCGGGG     60
GGGATTCCCT TCTATATAAA GGGTTCCGAT ACTACGTGCT GCGGACGGCC GATCGAGTTA    120
TCTTAAGTGC AAGTGACTGC GAAAATTTTT TTCGTTTGTT AGAATAATTC AAGAATCGCT    180
ACCAATCATG GATCC                                                     195
(2)SEQ ID NO：58的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：176个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假设：是
(iv)反义：否
(vi)来源：
(A)生物：酿酒酵母
(ix)特征：
(A)名称/关键词：启动子
(B)位置：8..171
(C)鉴定方法：实验
(D)其它资料：/evidence＝EXPERIMENTAL
            /标准名称＝“酵母启动子”
           /标记＝Yp96
(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：
GAATTCGTGA CTCATCTAGT GAGAGGAGCC GTGGTATCTT GTGTCACCAC CAGGGGAAAA     60
TAATGGCAGG GGTGTATAAA TGGTCGAGTA GTCGCGACCC ACGCTGCAAG GCAAGGAACT    120
CTTAAATTTT TTTCGTTTGT TAGAATAATT CAAGAATCGC TACCAATCAT GGATCC        176

Claims (36)

1.一种启动子文库，所述文库包含一套各自不同的启动子序列，对待表达基因的启动子强度而言，该文库覆盖一个启动子活性范围；该套各自不同的启动子序列包含双链DNA序列，其有义链含有在所述生物体中鉴定出来的启动子序列的至少两个共有序列，在文库内的所有启动子序列中所述共有序列各自至少一半保持不变，并且，相对于所述已鉴定出的启动子的相应间隔区序列，在所述共有序列之间或至少一个所述共有序列侧翼的核苷酸间隔区序列的至少一部分已有所改变而包含随机选自核苷碱基A、T、C和G的核苷酸；在所述基因的启动子活性方面，该启动子文库以小步幅方式跨越了一个有用范围，每一步改变活性25-400％。
2.根据权利要求1的启动子文库，其中所述间隔区序列内至少10个核苷酸随机选自核苷碱基A、T、C和G。
3.根据权利要求1的启动子文库，其中所述启动子序列包含将特定调节特征赋予具有所述启动子序列的启动子的调节DNA序列。
4.根据权利要求1的启动子文库，其中所述启动子序列包含至少一个限制性内切酶识别位点。
5.根据权利要求1的启动子文库，其中所述选定的生物体选自原核生物。
6.根据权利要求5的启动子文库，其中所述共有序列包含-10信号TATAAT的至少3个保守核苷酸。
7.根据权利要求5或6的启动子文库，其中所述共有序列包含-35信号TTGACA的至少3个保守核苷酸。
8.根据权利要求5的启动子文库，其中所述共有序列还包括间插的保守基元。
9.根据权利要求5或6的启动子文库，其包含选自由SEQ IDNO：5至SEQ ID NO：42组成之组中的至少2个启动子序列。
10.根据权利要求7的启动子文库，其中-35信号和-10信号之间的间隔区序列是14-23bp。
11.根据权利要求5的启动子文库，其中所述启动子序列包含选自由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2组成之组的一个序列。
12.根据权利要求1的启动子文库，其中所述选定生物体选自真核生物。
13.根据权利要求12的启动子文库，其中所述共有序列包括TATA盒和至少一个上游激活序列。
14.根据权利要求12或13的启动子文库，其中所述启动子序列包含SEQ ID NO：3。
15.根据权利要求12或13的启动子文库，其中包含选自由SEQID NO：43至SEQ ID NO：58组成之组中的至少2个启动子序列。
16.构建启动子文库的方法，所述方法包括以下诸步骤：
(i)在所述生物体内鉴定出包含由不保守的核苷酸序列分隔开的至少两个共有序列的启动子序列，
(ii)构建一套单链DNA序列，其包含该已鉴定的启动子序列的每一共有序列各自至少一半以及不保守的核苷酸间隔区序列，相对于该已鉴定的启动子的间隔区序列，所述间隔区序列至少一部分已有所改变而包含随机选自A、T、C和G的核苷酸，而所述共有序列的至少一半保持不变，和
(iii)将该单链DNA序列转变为双链DNA序列，
以获得一套不同的启动子，在启动子强度方面，它们覆盖一个启动子活性范围。
17.根据权利要求16的方法，其中所获得的该套不同启动子是权利要求1-15中任一项所述的启动子文库。
18.优化一种基因在一种生物体中的表达的方法，包括：
(i)从权利要求1的启动子文库中选择出覆盖所需的启动子活性范围的一套启动子，
(ii)将该套启动子克隆到该生物体中，其中，在每一克隆内，将待表达的基因置于该套启动子的至少一个启动子的控制之下，
(iii)培养各克隆，并筛选出显示基因产物形成最优化流量的克隆。
19.根据权利要求18的方法，其中所述间隔区序列内至少10个核苷酸随机选自核苷碱基A、T、C和G。
20.根据权利要求18的方法，其中所述启动子序列包含将特定调节特征赋予具有所述启动子序列的启动子的调节DNA序列。
21.根据权利要求18的方法，其中所述启动子序列包含至少一个限制性内切酶识别位点。
22.根据权利要求18的方法，其中所述选定的生物体选自原核生物。
23.根据权利要求22的方法，其中所述共有序列包含-10信号TATAAT的至少3个保守核苷酸。
24.根据权利要求22或23的方法，其中所述共有序列至少包含-35信号TTGACA的至少3个保守核苷酸。
25.根据权利要求22的方法，其中所述共有序列还包括间插的保守基元。
26.根据权利要求18的方法，其中所述启动子文库包含选自由SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：42组成之组中的至少2个启动子序列。
27.根据权利要求24的方法，其中-35信号和-10信号之间的间隔区序列是14-23bp。
28.根据权利要求22的方法，其中所述启动子序列包含选自由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2组成之组的一个序列。
29.根据权利要求18的方法，其中所述选定生物体选自真核生物。
30.根据权利要求29的方法，其中所述共有序列包括TATA盒和至少一个上游激活序列。
31.根据权利要求29或30的方法，其中所述启动子序列选自SEQ ID NO：3。
32.根据权利要求29或30的方法，其中所述启动子文库包含选自由SEQ ID NO：43至SEQ ID NO：58组成之组中的至少2个启动子序列。
33.根据权利要求18的方法，其中由该套启动子的一个启动子至另一启动子的活性的增加步幅不超过25-400％。
34.根据权利要求18的方法，其中选定生物体是选自原核生物和真核生物。
35.分离出能够使一种基因在选定生物体内最优化表达的启动子序列的方法，该方法包括：
(i)利用权利要求16或17的方法，构建启动子强度覆盖一个启动子活性范围的一套启动子，
(ii)将该套启动子克隆到该生物体中，其中，在每一克隆内，将待表达的基因置于该套启动子的至少一个启动子的控制之下，
(iii)培养各克隆，并筛选出显示基因产物形成最优化流量的克隆，和
(iv)从显示基因产物形成最优化流量的克隆中分离出所述启动子序列。
36.能够使基因在选定生物体中最优化表达的启动子序列，所述启动子序列通过权利要求35的方法获得。
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