CN101061214A - 多个多核苷酸拷贝的稳定基因组整合 - Google Patents
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Abstract
位点特异性重组酶和通过重组的体内整合构建细胞的方法，在该细胞的染色体中包含编码至少一种目的多肽的可读框(ORF)或操纵子的一或多拷贝，每拷贝在异源启动子的转录控制下；实施所述方法的方式、所得的细胞和使用所得细胞生产目的多肽的方法。
Description
发明领域
已经发现大量天然存在的生物体可以产生有用的多肽产物，例如酶，其大规模生产是研究和商业化目的所需的。一旦鉴定了这类产物，那么就进行尝试以便研发产生高产量产物的生产方法。基于重组DNA技术广泛使用的方法在于克隆编码产物的基因，将该基因插入允许产物表达的合适的表达系统，并且培养包含该表达系统的合适的宿主细胞，所述的表达系统在有利于所述产物表达的条件下在染色体中得以整合或整合为染色体外实体。
不考虑生产方法本身，一般理想的是能够增加所得多肽或蛋白质的生产水平。因此，进行尝试以便例如通过在强表达信号控制下插入编码所述产物的基因或通过在所述生产生物体中增加基因的拷贝数来增加产量。这后一种手段可以通过下列方式进行：将基因插入多拷贝质粒，不过，该质粒通常趋向于在所述宿主细胞中不稳定；或通过将基因的多种拷贝整合入生产生物体的染色体，一般认为该手段更具有吸引力，因为构建体的稳定性趋向于较高，使得可以将基因稳定地维持在生产生物体中。
背景技术
EP 0 284 126和EP 166 628中披露了用于将基因的一或多拷贝稳定整合入原核细胞染色体的方法，在所述的原核细胞的染色体中已经携带了至少一种所述基因的空白。按照EP 0 284 126，用包含所述基因的另一拷贝的DNA构建体转化包含所述基因的宿主细胞，由此在合适的选择操作步骤后，获得了细胞，在其染色体中包含被对宿主细胞而言至关重要的内源性染色体序列分隔开的基因的两拷贝，且由此确保对整合的基因的稳定维持。可以重复该操作步骤以便产生在其染色体中携带基因的多拷贝的细胞。WO2002/000907中描述了将多核苷酸以位点特异性方式整合入在条件上对细胞而言必需的失活的染色体基因座，其中这些基因座可通过整合方法恢复。
已经证实用链霉菌属(Streptomyces)噬菌体ΦC31的衍生物感染带有天然结合位点attB以及异位导入的attB位点的宿主细胞导致将噬菌体整合入二者attB位点(Smith等2004.Switching the polarity of a bacteriophageintegration system.Mol Microbiol 51(6)：1719-1728)。
实际上，可以使用Mx9噬菌体转化系统将基因的多拷贝导入包含由Mx9整合酶识别的多个结合位点的细胞(WO 2004/018635 A2)。
发明概述
当将基因导入细胞的DNA构建体上时，甚至在低-拷贝数构建体的情况下，通常可能难以在宿主细胞中实现编码目的多肽的基因的适当染色体整合，同时进行从该构建体上的启动子的活性地转录。这对为抑制性的或对宿主细胞而言甚至更具毒性的高于某些浓度的多肽类而言特别确切。避免这一问题的一种方式在于在使基因位于所述构建体上的同时使其沉默，以便仅在基因被适当整合入染色体时启动转录。
通常关注将编码目的多肽的几拷贝的基因整合入宿主细胞染色体，有时达10或10个以上拷贝。用于同时整合所需数量的拷贝的方法与如上所述的分步方法相比可以节省时间。
本发明提供了对这些问题的组合解决方法；它能够将编码目的多肽(类)的基因(或操纵子)的多拷贝进行同时染色体的位点特异性整合，同时还提供在通过异源启动子适当整合每个拷贝后启动所述基因转录的方式，所述的异源启动子可操作地与仅在成功整合后的基因连接。
因此，本发明在第一个方面中涉及构建细胞的方法，在该细胞的染色体中包含编码至少一种目的多肽的可读框(ORF)或操纵子的一或多拷贝，每拷贝在异源启动子的转录控制下，该方法包含下列步骤：
(a)提供在其染色体中包含位点特异性重组酶的第一识别序列(RS1)的一或多拷贝的细胞，其中RS1的每拷贝位于所述的异源启动子拷贝的下游；
(b)将包含位点特异性重组酶的ORF或操纵子和第二识别序列(RS2)的多核苷酸构建体导入所述的细胞，其中RS2相对于ORF或操纵子定位(located)和定向(oriented)，使得RS2与细胞染色体中RS1拷贝的体内重组可以将所述的构建体整合入该染色体并且将ORF或操纵子置于异源启动子的下游并且与异源启动子相同取向；和
(c)RS2与一或多拷贝的RS1在有位点特异性重组酶存在下重组，由此将目的ORF或操纵子的一或多拷贝整合入染色体并且置于下列条件下：(i)直接在异源启动子转录控制下；或(ii)在启动子的下游和与启动子相同取向，但通过区域而分隔开，该区可以在一种或多种任选重组事件(events)后切除，由此将目的ORF或操纵子置于异源启动子的转录控制下。
用于实施本发明的方式(means)之一为特别为该目的设计的宿主细胞；已经将该细胞改造成如下例示的包含位点特异性重组酶识别序列(RS)的一或多拷贝，其中RS的每拷贝位于异源启动子拷贝的下游。这种排列确保在本发明的多核苷酸构建体通过位点特异性重组酶的作用重组成染色体时，构建体中包含的ORF或操纵子可操作地与已经存在于染色体中的异源启动子连接。
因此，本发明在第二个方面中涉及细胞，在其染色体中包含位点特异性重组酶识别序列(RS)的一或多拷贝，其中RS的每拷贝位于异源启动子拷贝的下游。
本发明在第三个方面中涉及由第一个方面的方法生产的细胞，或在其染色体中包含目的可读框(ORF)或操纵子的一或多拷贝的细胞，其中每拷贝在异源启动子的转录控制下，并且(i)其中ORF或操纵子的每拷贝位于染色体中位点特异性重组酶识别序列(RS)的上游；或(ii)其中ORF或操纵子的每拷贝位于染色体中位点特异性重组酶识别序列(RS)的下游。
用于实施本发明的另一种方式当然为第一个方面的方法中所述的多核苷酸构建体。
因此，本发明的第四个方面涉及包含编码至少一种目的多肽的无启动子可读框(ORF)或操纵子的多核苷酸构建体，该构建体还包含位于所述ORF或操纵子上游或下游的位点特异性重组酶识别序列(RS)。
本发明在最后一个方面中涉及生产目的多肽的方法，该方法包含：
(a)培养在其染色体中包含目的可读框(ORF)或操纵子的一或多拷贝的细胞，其中每拷贝在异源启动子的转录控制下，并且(i)其中ORF或操纵子的每拷贝位于染色体中位点特异性重组酶识别序列(RS)的上游；或(ii)其中ORF或操纵子的每拷贝位于染色体中位点特异性重组酶识别序列(RS)的下游；和
(b)分离目的多肽。
附图
附图1.本发明优选实施方案的图示综述：
包含TP901-1噬菌体整合酶识别序列的环状多核苷酸构建体attP位于可读框genX的上游。该构建体进一步包含任选的标记、温度敏感性复制起点oriTS以及位于该构建体可读框下游的区，用表示″重复″的小箭头指示。
还显示了包含异源启动子和TP901-1噬菌体整合酶识别序列attB的宿主细胞染色体，所述的识别序列attB相应于位于启动子下游的构建体中的识别序列。此外，在染色体中用表示″重复″的小箭头指示染色体中的区。
染色体和多核苷酸构建体的″重复″区应充分同源以便在两种同源区之间进行体内同源重组，此时所述的两种区均存在于细胞中。
在有合适的整合酶(+整合酶)，例如TP901-1噬菌体整合酶存在下，attP和attB位点重组，由此将该构建体整合入染色体，以便在异源启动子转录控制下放置可读框genX，从而在该方法中产生所得的attL和attR位点。
在任选的下一步中，两种同源″重复″区重组，由此从染色体上切除两种区之间中的DNA，在染色体中仅保留可读框genX与新生成的attL位点。
定义
为了本发明的目的，可以使用用于蛋白质和DNA序列对比的全Smith-Waterman序列对比进行序列对比和同源性得分计算。分别将默认得分矩阵(default scoring matrices)BLOSUM50和同一性矩阵用于蛋白质和DNA序列对比。空位(gap)中第一个残基的罚分对于蛋白质为-12，而对于DNA为-16，而空位中额外的残基的罚分对于蛋白质为-2，而对于DNA为-4。使用FASTA包v20u6版进行序列对比(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological序列Analysis″，PNAS 85：2444-2448，和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive序列Comparison with FASTP和FASTA″，Methods in Enzymology，183：63-98)。
使用″ClustalW″进行蛋白质序列的多重序列对比(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic AcidsResearch，22：4673-4680)。可以使用蛋白质序列排列作为模板进行DNA序列的序列多重对比，从而用来自DNA序列的相应密码子取代氨基酸。
本文将″启动子″定义涉及RNA聚合酶结合的以启动基因转录核酸序列。本文将″串联启动子″定义为两个或多个启动子序列，每个可操作地与编码序列连接并且介导该编码序列转录成mRNA。本文将″可操作地连接″定义为一种构形(configuration)，其中控制序列，例如启动子序列适当位于与编码序列相关的位置上，以便控制序列指导由编码序列编码的多肽的产生。本文将″编码序列″定义为在适当控制序列控制下定位时转录成mRNA和翻译成多肽的核酸序列。编码序列的边界一般由恰好位于mRNA 5′末端上可读框上游的核糖体结合位点和恰好位于mRNA 3′末端上可读框下游的转录终止序列决定。编码序列可以包括，但不限于基因组DNA、cDNA、半合成、合成和重组核酸序列。
本文上下文中的宿主细胞″异源″DNA意旨并非来源于该细胞的外源性DNA。
本文中使用的术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其可分离自天然存在的基因，或者该核酸分子已受到修饰使得其以自然界中本来不存在的方式含有组合的或并列的核酸片段。当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需要的全部调控序列时，术语“核酸构建体”和术语“表达盒”是同义的表达盒。
本文将术语″控制序列″定义为包括所有成分，它们对表达编码本发明多肽的多核苷酸而言是所需的或有利的。每种控制序列对编码多肽的核苷酸序列而言可以为天然的或外来的。这类控制序列包括，但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。在最低限度上，控制序列包括启动子和转录和翻译终止信号。这些调控序列还可以具有接头(linkers)，这些接头用于导入特定的限制性位点，，以便有利于使控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接。
术语″可操作地连接″在本文中表示一种构型，其中控制序列位于与多核苷酸序列的编码序列相关的适当位置上，以便控制序列指导多肽编码序列的表达。
术语″编码序列″在本文中使用时意旨直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由通常从ATG起始密码子或可选择起始密码子，诸如GTG和TTG开始的可读框决定。编码序列可以为DNA、cDNA或重组核苷酸序列。
术语″表达″包括多肽产生中涉及的任意步骤，包括，但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
本文将术语″表达载体″定义为线性或环状DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸并且可操作地与提供其表达的额外核苷酸连接。
本文所用的术语″宿主细胞″包括任意细胞类型，其对用包含本发明多核苷酸的核酸构建体转化、转染、转导等敏感。
本发明的多肽可以获自任意属的微生物。就本发明的目的而言，本文所用的与指定来源相关的术语″获自″应指的是由核苷酸序列编码的多肽由所述来源或已经插入来自该来源的核苷酸序列菌株产生。在一个优选的方面中，获自指定来源的多肽在胞外分泌。
本发明的多肽可以为细菌多肽。例如，该多肽可以为革兰氏阳性菌多肽，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)多肽，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽；或链霉菌属(Streptomyces)多肽，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)多肽；或革兰氏阴性菌多肽，例如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)种类的多肽。
本发明的多肽还可以为真菌多肽，且更优选酵母多肽，诸如假丝酵母属(Candida)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia多肽；或更优选丝状真菌多肽，诸如支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)多肽。
在一个优选的方面中，所述的多肽为卡尔斯伯糖酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、Saccharomyceskluyveri、Saccharomyces norbensis或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另一个优选的方面中，所述的多肽为棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Trichoderma harzianum、康宁氏木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichodermareesei或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。
应理解就上述种类而言，本发明包括其完全和不完全状态(imperfectstates)以及其它分类学上的等价物，例如无性型，与已知它们的种类名称无关。本领域技术人员易于识别合适的等价物的身份。
这些种类的菌株易于公众在许多培养物保藏所得到，诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSM)，真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构保藏中心(Agricultural ResearchService Patent Culture Collection，Northern Regional Research RegionalResearch Center)(NRRL)。
此外，此外，上述多肽可被鉴定或获得自其他来源，包括使用上述探针从自然界(如土壤、堆肥、水等)分离的微生物。用于从天然环境分离微生物的技术是本领域众所周知的。然后，可通过类似方法筛选其他微生物的基因组或cDNA文库获得多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就可使用本领域技术人员众所周知的技术(参见如Sambrook等，1989，同上)分离或克隆所述多核苷酸。
本发明的多肽还包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽融合到所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。通过将编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到本发明的核苷酸序列(或其部分)产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域公知的，包括连接编码所述多肽的编码序列使得它们符合读框，并在相同的启动子和终止子控制下表达所述融合多肽。
核酸构建体
本发明还涉及包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明分离的多核苷酸的核酸构建体，所述控制序列在与其相容的条件下，在合适的宿主细胞中指导编码序列表达。
可以多种方式处理编码本发明多肽的分离的多核苷酸，以供所述多肽表达之用。取决于表达载体，在多核苷酸序列插入载体前对其的处理可能是期望的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域众所周知的。
所述控制序列可以是适合的启动子序列，一种为宿主细胞所识别用于编码本发明多肽的多核苷酸表达的核苷酸序列。所述启动子序列含有调节多肽表达的转录控制序列。所述启动子可以是任何在所选择的宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列，包括突变、截短和杂合的启动子，并且可获得自编码与所述宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
适合指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的启动子的例子是获得自大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、和原核生物β内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 75：3727-3731)的启动子，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。更多的启动子描述于″Useful proteins from recombinant bacteria″in Scientific American，1980，242：74-94；和Sambrook等，1989，同上。
适合指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的启动子的例子是获得自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡萄糖苷酶(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Quinn(WO00/56900)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶的基因的启动子，以及NA2-tpi启动子(一种来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的杂合启动子)；及其突变、截短和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子是获得自编码酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)，酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)，酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)，酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)，酿酒酵母金属硫蛋白(metallothionine)(CUP1)，酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其他用于酵母宿主细胞的启动子描述于Romanos等，1992，Yeast8：423-488。
所述控制序列还可以是适合的转录终止子序列，一种为宿主细胞所识别以终止转录的序列。所述终止子序列可操作地连接到编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端。任何在所选择的宿主细胞中起作用的终止子都可用于本发明。
优选用于丝状真菌宿主细胞的终止子获得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
优选用于酵母宿主细胞的终止子获得自编码酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。其他用于酵母宿主细胞的终止子描述于Romanos等，1992，同上。
所述控制序列还可以是适合的前导序列，一种对于宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。所述前导序列可操作地连接到编码所述多肽的核苷酸序列的5’末端。任何在所选择的宿主细胞中起作用的前导序列都可用于本发明。
所述控制序列还可以是适合的前导序列，一种对于宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。所述前导序列可操作地连接到编码所述多肽的核苷酸序列的5’末端。任何在所选择的宿主细胞中起作用的前导序列都可用于本发明。
优选用于丝状真菌宿主细胞的前导序列获得自编码米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。
适合于酵母宿主细胞的前导序列是获得自编码酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。
所述控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接到所述核苷酸序列的3’末端，并且当转录时为宿主细胞所识别作为信号以添加多腺苷残基到转录的mRNA上的序列。任何在所选择的宿主细胞中起作用的多腺苷酸化序列都可用于本发明。
优选用于丝状真菌宿主细胞的多腺苷酸化序列是获得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列描述于Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990。
所述控制序列还可以是编码连接多肽氨基末端并指导所编码多肽进入细胞分泌途径的氨基酸序列的信号肽编码区。所述核苷酸序列的编码序列的5’末端可固有地包含在翻译读框中与编码所述分泌多肽的编码区区段天然连接信号肽编码区。或者，所述编码序列的5’末端可含有对于编码序列是外源的信号肽编码区。当天然不含有信号肽编码区的编码序列时，所述外源信号肽编码区可能是必需的。或者，所述外源信号肽编码区可简单地取代天然的信号肽编码区，以便增强所述多肽的分泌。然而，任何指导所述表达的多肽进入所选择宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可用于本发明。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是获得自编码芽孢杆菌NCIB11837产麦芽糖淀粉酶，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因的信号肽编码区。更多的信号肽描述于Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137。
用于丝状真菌宿主细胞的信号肽编码区是获得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂酶的基因的信号肽编码区。
用于酵母宿主细胞的信号肽是获得自编码酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他有用的信号肽编码区描述于Romanos等，1992，同上。地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌所述控制序列还可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得到的多肽称为前多肽或多肽原(或有时称为酶原)。前多肽通常是失活的，并且可通过来自前多肽的前肽催化或自催化裂解，而转变为成熟的活性多肽。所述前肽编码区可获得自编码枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)漆酶(WO 95/33836)的基因。
当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端时，所述前肽区靠近在多肽的氨基末端，而信号肽区则靠近在前肽区的氨基末端。
还期望的是添加提供调节与宿主细胞生长相关的多肽的表达的调节序列。调节系统的例子是响应化学或物理刺激，包括存在调节化合物情况下，引起基因表达启动或关闭的那些。原核生物系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作为调节序列。调节序列的其它实例为那些允许进行基因扩增的调节序列。在真核系统中，它们包括在有氨甲蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和上游重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的核苷酸序列可以可操作地与调节序列连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明多核苷酸、启动子、以及转录和翻译停止信号的重组表达载体。上述不同的核酸和控制序列可连接以产生重组表达载体，其可包括一个或多个便利的限制酶切位点以供编码多肽的核苷酸序列在该位点的插入或取代之用。或者，本发明的核苷酸序列可通过将所述核苷酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当的表达载体中而得以表达。在创建表达载体中，所述编码序列位于载体中以便其可操作地连接适当的控制序列用于表达。
所述重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作且可使所述核苷酸序列发生表达的载体(如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与其所要导入的宿主细胞的相容性。所述载体可以是线性或闭合环状质粒。。
载体可以为在导入宿主细胞时被整合入基因组并且与它所整合入的染色体一起复制的载体。此外，可以使用：单一载体或质粒或两种或多种载体或质粒，其共同含有可导入宿主细胞基因组的总DNA；或转座子。
本发明的载体优选含有一个或多个选择标记，其使转化细胞易于选择。选择标记是一种其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型原营养(prototrophy to auxotrophs)等的基因。
细菌选择标记的实例为来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因或提供抗生素抗性，诸如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的合适的标记为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括，但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，及其等价物。优选供曲霉属细胞使用的标记是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有允许将该载体整合入宿主细胞基因组的元件。
为了整合入宿主细胞基因组或随后切除部分载体，该载体依赖于编码多肽的多核苷酸序列或通过同源或非同源重组整合入基因组的载体的任意其它元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，它们通过同源重组定向整合入宿主细胞染色体重基因组的精确位置上，或将它们通过同源重组从宿主细胞染色体重基因组的精确位置上切除。为了增加在精确位置上整合或从其中切除的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，诸如100-10,000个碱基对，优选400-10,000个碱基对，且最优选800-10,000个碱基对，它们与相应的靶序列具有高度同一性以便提高同源重组的可能性。整合元件可以为与宿主细胞基因组中靶序列同源的任意序列。此外，整合元件可以为非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以通过非同源重组将载体整合入宿主细胞基因组。
细菌复制起点的实例为允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点和允许在芽孢杆菌属中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMU1。
用于酵母宿主细胞的复制起点的实例为2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合和ARS4和CEN6的组合。
用于丝状真菌细胞的复制起点的实例为AMA1和ANSI(Gems等1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。可以按照WO 00/24883中披露的方法分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体。
可以将本发明多核苷酸的一种以上拷贝插入宿主细胞以便增加基因产物的产量。可以通过将所述序列的至少一种额外的拷贝整合入宿主细胞基因组或通过包括可用多核苷酸扩增的选择标记基因而获得多核苷酸拷贝数额增加，其中可以通过在有适当选择剂存在下培养细胞来选择含有选择标记基因的扩增拷贝和由此的多核苷酸额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的操作步骤为本领域技术人员众所周知的(例如，参见Sambrook等，1989，文献同上)。
宿主细胞
本发明还涉及包含本发明多核苷酸的重组宿主细胞，其便于所述多肽的重组生产。将包含本发明多核苷酸的载体导入宿主细胞，使得所述载体保持为染色体整合体或如上所述的自主复制的染色体外载体。由于在复制过程中发生突变，术语“宿主细胞”包含任何与亲本细胞不相同的亲本细胞后代。宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码所述多肽的基因及其来源。
所述宿主细胞可以是单细胞微生物如原核生物，或非单细胞微生物如真核生物。
有用的单细胞微生物是诸如革兰氏阳性细菌的细菌细胞，包括但不限于，芽孢杆菌属细胞，如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、Bacillus clausii、凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；或链霉菌属细胞，如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌和假单胞菌(Pseudomonas sp)。在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的方面，所述芽孢杆菌属细胞是嗜碱芽孢杆菌。
将载体导入细菌宿主细胞中可例如通过原生质体转化(参见如Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、使用感受态细胞(参见如Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、电穿孔(参见如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)、或接合(参见如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)来实施。
宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。本文中使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等，在Ainsworth和Bisby’s Dictionaryof The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，文献同上，第171页中所提及的)以及所有有丝分裂孢子(mitosporic)真菌(Hawksworth等，1995，文献同上)。
在更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenous)和属于半知菌(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类将来可能会有所变化，对本发明而言，应按照Biology and Activities ofYeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述的定义酵母。
在更加优选方案中，酵母宿主细胞可以是念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia细胞。
在一个最优选的方面中，酵母宿主细胞为卡尔斯伯糖酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensis或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方案中，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。
在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，文献同上所定义的)所有丝状形式的亚类。丝状真菌特征在于通常由几丁质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖、以及其它复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长依靠菌丝延长，且碳分解代谢是专性需氧的。相反，诸如酿酒酵母的酵母的营养生长通过单细胞原植体的芽殖进行，且碳分解代谢可以是发酵的。
在一个还优选的方面，所述丝状真菌宿主细胞是一种(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprinus)、采绒革盖菌(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filobasidium、镰孢霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Phanerochaete、Phlebia、Piromyces、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、耐热子囊菌(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium、Trametes或木霉属(Trichoderma)细胞。
在一个最优选的方面，所述丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense，大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum细胞。在另一个最优选的方面中，丝状真菌宿主细胞为黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、Coprinuscinereus、Coriolus hirsutus、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Phanerochaete chrysosporium、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、Pleurotus eryngii、Thielavia terrestris、Trametesvillosa、Trametes versicolor、Trichoderma harzianum、康氏木霉(Trichodermakoningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株细胞。
真菌细胞可通过在某种意义上就其本身而论是已知的涉及原生质体形成、原生质体转化以及细胞壁再生的过程得到转化。适合曲霉属和木霉属宿主细胞转化的方法描述于EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 81：1470-1474。适合镰孢属(Fusarium)菌种转化的方法描述于Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO96/00787。使用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编，Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York中；Ito等，1983，Journal ofBacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：1920描述的方法可转化酵母。
生产方法
本发明还涉及用于生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养其野生型能生产所述多肽的细胞；和(b)回收所述多肽。本发明还涉及生产本发明多肽的方法：包含(a)在有助于生产多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收多肽。
在本发明的生产方法中，使用本领域众所周知的方法，在适合于所述多肽生产的营养培养基中培养所述细胞。例如，可在实验室或工业发酵罐中，在适合的培养基中和在容许所述多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、和小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料、或固态发酵)培养所述细胞。使用本领域公知的方法，在包含碳源和氮源及无机盐的适合的营养培养基中进行所述培养。适合的培养基可从供应商处获得或可根据公布的成分进行制备(如在美国典型培养物保藏中心目录中)。如果所述多肽分泌到营养培养基中，则其可直接从该培养基中回收。如果所述多肽不分泌，则其可从细胞裂解液中回收。
可使用本领域公知的特异于所述多肽的方法检测多肽。这些检测方法可包括使用特异性抗体、形成多肽产物、或多肽底物的消失。例如，本文所述的酶测定法可用于测定所述多肽的活性。
可使用本领域公知的方法回收所得到的多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基中回收所述多肽。
本发明的多肽可过多种本领域公知的方法进行纯化，包括但不限于，层析法(如离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳操作(如制备型等电聚焦)、差异的溶解度(如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(参见如Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCH Publishers，NewYork，1989)。
发明详述
本发明在第一个方面中涉及构建细胞的方法，在该细胞的染色体中包含编码至少一种目的多肽的可读框(ORF)或操纵子的一或多拷贝，每个拷贝在异源启动子的转录控制下，该方法包含下列步骤：
(a)提供在其染色体中包含位点特异性重组酶的第一识别序列(RS1)的一或多拷贝的细胞，其中RS1的每拷贝位于所述的异源启动子拷贝的下游；
(b)将包含位点特异性重组酶的ORF或操纵子和第二识别序列(RS2)的多肽构建体导入所述的细胞，其中RS2相对于ORF或操纵子定位和定向，使得RS2与细胞染色体中RS1拷贝的体内重组可以将所述的构建体整合入该染色体并且将ORF或操纵子置于异源启动子的下游并且与异源启动子相同取向；和
(c)RS2与一种或多种RS1的拷贝在有位点特异性重组酶存在下重组，由此将ORF或操纵子的一或多拷贝整合入染色体并且置于下列条件下：(i)直接在异源启动子转录控制下；或(ii)在异源启动子的下游和与异源启动子相同取向，但通过区分隔开，该区可以在一种或多种任选重组事件后切除，由此将目的ORF或操纵子置于异源启动子的转录控制下。
在步骤(a)的细胞中，RS1的每拷贝位于异源启动子拷贝的下游。启动子RS1的下游在细胞中定位的程度为试验值与误差的近似值(a matter oftrial and error)；唯一的限制因素在于在将构建体整合入染色体后，启动子必须可操作地与ORF或操纵子连接。优选RS1位于达10,000bp的启动子下游，甚至更优选达5,000bp的启动子下游，且最优选不超过500bp的启动子下游。
相应地，在多核苷酸构建体中，″RS2位于和定向于ORF或操纵子，使得细胞内染色体中RS2与RS1拷贝的体内重组将构建体整合入染色体并且使ORF或操纵子处于异源启动子转录控制下″。这可以确保ORF或操纵子和RS2在染色体中具有彼此之间正确的取向和RS1极性，以便重组酶介导的RS1与RS2之间的重组将ORF或操纵子置于启动子的转录控制下。RS2优选位于达10,000bp的ORF或操纵子上游，甚至更优选达5,000bp的ORF或操纵子上游，且最优选不超过500bp的ORF或操纵子上游。
宿主细胞的选择必须根据编码多肽的基因及其来源的不同而达到较大的程度。宿主细胞可以为单细胞微生物，例如原核生物，或非-单细胞微生物，例如真核生物。有用的单细胞为细菌细胞，诸如革兰氏阳性菌，包括，但不限于：芽孢杆菌属细胞，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属细胞，浅青紫链霉菌和鼠灰链霉菌；或革兰氏阴性菌；或革兰氏阴性菌，诸如大肠杆菌或假单胞菌属种类。在一个优选的方面中，细菌宿主细胞为迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。
在本发明任意方面的一个实施方案中，所述的细胞为原核细胞，优选芽孢杆菌属细胞，且更优选枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞。
在本发明的任意方面中的ORF或操纵子优选编码至少一种酶；优选氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶；更优选淀粉分解酶、脂解酶、蛋白水解酶、溶细胞酶、氧化还原酶或植物细胞-壁降解酶，且最优选具有选择下述的活性的酶，其选自下列酶组成的组：氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、糖苷酶、haloperoxidase、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
WO 1993/010249中披露了各种启动子变体，并且WO 1999/043835中披露了具有改善特性的串联和三联启动子构建体。串联启动子的每种启动子序列可以为任意的核酸序列，其在选择的芽孢杆菌属细胞中表现出转录活性，包括突变、截短和杂合启动子，并且可以获自编码与芽孢杆菌属细胞同源或异源的胞外或胞内多肽类的基因。每种启动子序列可以对编码多肽的核酸序列而言为天然或外源性的并且对芽孢杆菌属细胞而言为天然的或外源性的。启动子序列可以为相同的启动子序列或不同的启动子序列。
在一个优选的实施方案中，启动子序列可以获自细菌来源。在一个更优选的实施方案中，启动子序列可以获自革兰氏阳性菌，诸如芽孢杆菌属菌株，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属菌株，例如浅青紫链霉菌和鼠灰链霉菌；或革兰氏阴性菌；或获自革兰氏阴性菌，诸如大肠杆菌或假单胞菌属种类。
用于指导本发明方法中核酸序列转录的合适的启动子的实例为获自大肠杆菌lac操纵子的启动子。另一个实例为天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂酶基因(dagA)的启动子。另一个实例为迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子。另一个实例为地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)的启动子。另一个实例为枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的启动子。另一个实例为枯草芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyE)的启动子。另一个实例为地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyL)的启动子。另一个实例为嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖(maltogenic)淀粉酶基因(amyM)的启动子。另一个实例为解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyQ)的启动子。另一个实例为具有″-35″区的序列TTGACA和″-10″区的TATAAT的″共有″启动子。另一个实例为地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)的启动子。另一个实例为枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子。另一个实例为Bacillus thuringiensissubsp.tenebrionis CryIIIA基因(cryIIIA，SEQ ID NO.1)的启动子或其部分。另一个实例为原核β-内酰胺酶基因的启动子(Villa-Kamaroff等1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)。另一个实例为spol细菌噬菌体启动子的启动子。另一个实例为tac启动子(DeBoer等1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。进一步的启动子描述在下列文献中：″Useful proteins from recombinant bacteria″-Scientific American，1980，242：74-94；和Sambrook，Fritsch，和Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York。
串联启动子的两个种或多个启动子序列可以同时促进核酸序列转录。或者，串联启动子的一个或多个启动子序列可以促进芽孢杆菌属细胞生长的不同阶段的核酸序列转录。
在一个优选的实施方案中，串联启动子至少含有解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因的amyQ启动子。在另一个优选的实施方案中，串联启动子至少含有具有″-35″区的序列TTGACA和″-10″区的TATAAT的″共有″启动子。在另一个优选的实施方案中，串联启动子至少含有地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因的amyL启动子。在另一个优选的实施方案中，串联启动子至少含有cryIIIA启动子或其部分(Agaisse和Lereclus，1 994，文献同上)。
在一个更优选的实施方案中，串联启动子至少含有amyL启动子和cryIIIA启动子。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子至少含有amyQ启动子和cryIIIA启动子。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子至少含有具有″-35″区的序列TTGACA和″-10″区的TATAAT的″共有″启动子和cryIIIA启动子。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子至少含有amyL启动子的两个拷贝。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子至少含有amyQ启动子的两个拷贝。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子至少含有具有″-35″区的序列TTGACA和″-10″区的TATAAT的″共有″启动子的两个拷贝。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子至少含有cryIIIA启动子的两个拷贝。
可以通过位点定向诱变构建″共有″启动子以便生成与枯草芽孢杆菌营养″sigma A-型″启动子的″-10″和″-35″区的建立的共有序列更完全一致性的启动子(Voskuil等1995，Molecular Microbiology 17：271-279)。″-35″区的共有序列为TTGACA，且″-10″区的共有序列为TATAAT。共有启动子可以获自任意的启动子，它们可以在芽孢杆菌属宿主细胞中起作用。
在一个优选的实施方案中，″共有″启动子获自从大肠杆菌lac操纵子中获得的启动子。天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis CryIIIA基因(cryIIIA，SEQ ID NO.1)或其部分或原核β-内酰胺酶基因spol细菌噬菌体启动子。
在一个更优选的实施方案中，″共有″启动子获自解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyQ)。在一个最优选的实施方案中，共有启动子为包含在SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4的1-185位核苷酸中的″共有″amyQ启动子。在另一个最优选的实施方案中，共有启动子为包含在SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的86-185位核苷酸中的短″共有″amyQ启动子。SEQ ID NO.3的″共有″amyQ启动子含有下列核酸序列突变，所述的核酸序列含有分别在135和136位上-35区中(相对于转录起始位点而言)的野生型amyQ启动子(SEQ IDNO.2)：T到A和T到C；和SEQ ID NO.2的156位上的-10区中的A到T改变。″共有″amyQ启动子(SEQ ID NO.2)进一步含有如附图21(SEQ ID NO.4)中所示在116位上的-35区上游的约20个碱基对的T到A改变。这一改变显然对启动子功能不具有有害作用，因为可以将其从关键的-10和-35区很好地中除去。
因此，在本发明任意方面的一个优选的实施方案中，异源启动子包含两或多个启动子；优选两或多启动子包含来源于一种或多种芽孢杆菌属基因的一个或多个启动子；更优选两个种或多个启动子包含下述的一或多个：amyQ启动子；amyL启动子；cryIIIA启动子；和包含-35区的核苷酸序列TTGACA和-10区的核苷酸序列TATAAT共有启动子。
位点特异性重组酶，包括噬菌体整合酶为本领域众所周知的，其中通常将它们分成酪氨酸重组酶或丝氨酸重组酶。丝氨酸重组酶亚组为大的丝氨酸重组酶，它们含有所有已知的丝氨酸重组酶-类噬菌体整合酶。大的丝氨酸重组酶含有所有丝氨酸重组酶的解离酶/转化酶-类N-末端催化结构域，而其C-末端区更大并且极为不同(Smith和Thorpe，2002.Diversity in theserine recombinases.MoI Microbiol 44：299-307)。有关噬菌体整合酶的综述从Groth和Calos(J.Mol.Biol.2004，335：667-678)中得到。
因此，本发明所有方面的优选实施方案中均涉及位点特异性重组酶包含噬菌体整合酶，优选酪氨酸重组酶或丝氨酸重组酶，更优选大的丝氨酸重组酶，且最优选TP901-1整合酶。
TP901-1整合酶为充分表征的，例如在Breüner等2001。解离酶-类重组由TP901-1整合酶进行。Microbiology 147：2051-2063。此外，TP901-1整合酶的识别序列(attP、attB、attL和attR)为众所周知的。
优选的实施方案涉及第一个方面的方法，其中RS1包含至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或最优选至少98％与attB161(SEQ IDNO：21)或attBmin(SEQ ID NO：22)相同的核苷酸序列，RS2包含至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或最优选至少98％与affPmin(SEQ IDNO：23)相同的核苷酸序列，并且位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶。
由于attP和attB识别序列可以环绕转换，所以另一种优选的实施方案涉及第一个方面的方法，其中RS1包含至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或最优选至少98％与attPmin(SEQ ID NO：23)相同的核苷酸序列，RS2包含至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或最优选至少98％与attS161(SEQ ID NO：21)或afttmin(SEQ ID NO：22)相同的核苷酸序列，并且位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶。
在本发明的方法中attP和attB序列还可以被相应的attL和attR序列替代，由此也可以环绕转换(switched around)，只要用切除酶Xis补充整合酶。
因此，本发明的一个优选的实施方案涉及第一个方面，其中RS1包含至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或最优选至少98％与attLmin(SEQ ID NO：24)同一性的核苷酸序列，RS2包含至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或最优选至少98％与attRmin(SEQ ID NO：25)同一性的核苷酸序列，并且位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶和切除酶Xis。
本发明的另一个优选的实施方案涉及第一个方面，其中RS1包含至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或最优选至少98％与attRmin(SEQID NO：25)同一性的核苷酸序列，RS2包含至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或最优选至少98％与attLmin(SEQ ID NO：24)相同的核苷酸序列，并且位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶和切除酶Xis。
Agaisse和Lereclus(1994，Molecular Microbiology 13：97-107)披露了苏云金芽孢杆菌cryIIIA毒素基因完整表达中涉及的启动子区的结构和功能分析。WO 94/25612中披露了启动子的mRNA稳定区下游和增加基因表达的cryIIIA基因编码序列的上游。
Hue等(1995，Journal of Bacteriology 177：3465-3471)披露了5′mRNA稳定序列，其在存在于5′末端上时稳定几种异源RNA序列并且增加几倍枯草芽孢杆菌中下游编码序列的表达。
在本文中将″mRNA加工/稳定序列″定义为位于一或多个启动子序列的下游和编码序列的上游的序列，其中一个或多个启动子序列可操作地与所述的编码序列连接，使得所有由各启动子序列合成的mRNAs可以得到加工而产生在转录物的5′末端上带有稳定序列的mRNA转录物。在mRNA转录物的5′末端上存在这类稳定序列增加了其半衰期(Agaisse和Lereclus，1994，文献同上，Hue等1995，文献同上)。mRNA加工/稳定序列与细菌16S核糖体RNA的3′末端互补。在一个优选的实施方案中，mRNA加工/稳定序列产生基本上单一大小的在转录物的5′末端上带有稳定序列的转录物。
在一个更优选的实施方案中，mRNA加工/稳定序列序列为WO94/25612和Agaisse和Lereclus，1994，文献同上中披露的苏云金芽胞杆cryIIIA mRNA加工/稳定序列或其保留mRNA加工/稳定功能的部分。在另一个更优选的实施方案中，mRNA加工/稳定序列为Hue等1995，文献同上中披露的枯草芽孢杆菌SP82 mRNA加工/稳定序列或其保留mRNA加工/稳定功能的部分。
当本发明的方法中使用cryIIIA启动子及其mRNA加工/稳定序列时，可以使用含有WO 94/25612和Agaisse和Lereclus，1994，文献同上中披露的序列或其保留启动子和mRNA加工/稳定功能的部分的DNA片段。此外，可以使用本领域众所周知的制备仅含cryIIIA启动子或仅含cryIIIA mRNA加工/稳定序列的DNA片段以便构建不同的串联启动子和mRNA加工/稳定序列组合。在该实施方案中，cryIIIA启动子及其mRNA加工/稳定序列优选位于另一启动子序列的下游，所述的另一启动子序列构成了目的基因的串联启动子和编码序列的上游。
在本发明第一个方面的一个优选实施方案中，其中至少一种mRNA稳定区位于步骤(a)细胞染色体中的异源启动子与RS1之间；优选至少一种mRNA稳定区包含来源于cryIIIA的mRNA稳定区；更优选至少一种mRNA稳定区包含至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或最优选至少98％与SEQ ID NO：26的35-580位中所示序列相同的核苷酸序列。
另一个优选的实施方案涉及第一个方面的方法，其中多核苷酸构建体进一步包含至少一种mRNA稳定区，该稳定区位于ORF或操纵子与RS2之间的ORF或操纵子上游。
另一个优选的实施方案涉及第二个方面的细胞，其中至少一种mRNA稳定区位于细胞染色体中异源启动子与RS之间。
另一个优选的实施方案涉及第三个方面的细胞，其中至少一种mRNA稳定区位于细胞染色体中异源启动子与ORF或操纵子的一或多拷贝之间。
在第四个方面的多核苷酸构建体实施方案中，优选至少一种mRNA稳定区位于ORF或操纵子的上游。
为了能够切除整合的多核苷酸构建体的载体部分，包括任选的标记，可以在整合前在宿主细胞染色体内的构建体和与识别序列相邻的适当位置上设计同源区。这一情况由附图1中命名为″重复″的区解释。该区可以为插入的异源多核苷酸区，或可以基于相应的天然在另一序列中发现的区设计一种区。在通过RS1和RS2识别序列之间的位点特异性重组整合质粒后的这两种区之间的同源重组导致切除两种区之间的多核苷酸，染色体上仅保留所关注的ORF或操纵子，与因第一整合事件产生的识别序列位点相邻。
因此，在第一个方面的方法的一个优选的实施方案中，多核苷酸构建体进一步包含位于构建体中ORF或操纵子的上游或下游的区，该区与相应地位于细胞染色体中RS1上游或下游的相应区充分同源，以便在两种区存在于细胞中时在这两种同源区之间进行体内同源重组。
或者，可以在与上述重复相同的位置上插入不同于用于整合的为位点特异性重组酶的识别位点的两种区。然后在两个位点之间有适当位点特异性重组酶重组存在下导致切除两种位点之间的区，仅在染色体上保留所关注的基因。非限制性实例为众所周知的带有两个res位点的解离酶和在两个位点之间进行重组的特异性解离酶的系统。例如，对广宿主范围质粒RP4的重组系统描述了使用位点特异性重组相同从细菌染色体中切除序列的重组系统的概念(Eberl，L.，Kristensen，CS.，Givskov，M.，Grohmann，E.，Gerlitz，M.，Schwab，H.(1994)，Analysis of the multimer resolution system encoded bythe parCBA plasmid of broad-host-range plasmid RP4，MoI.Microbiol.，12，131-141))。Stark，W.M.，Boocock，M.R.，Sherratt，D.J.(1992)，Catalysis bysite-specific recombinases，Trends in genetics，8，432-439)为一篇有关解离酶作用机制的综述文章。Camilli等((1994)，Use of genetic recombination as areporter of gene expression，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，2634-2638)描述了来自δγ-转座子霍乱弧菌(Vibrio cholera)的res位点和解离酶作为来自染色体基因的基因表达的持久可遗传标记的应用。Chang，L.-K.等((1994，Construction of Tn917as1，a transposon useful for mutagenesis and cloning ofBacillus subtilis genes，Gene，150，129-134)描述了含有erm-res-tnpA(转座酶)-tnpR(解离酶)samt IR-res-ori colE1-ABR1-ABR2-IR(pD917；Tn917acl)的质粒(pE194)。
已经描述了广宿主范围革兰氏阳性质粒pAMβ1(Clewell，D.B.，Yagi，Y.，Dunny，G.M.，Schultz，S.K.(1974)Characterization of three plasmiddeoxyribonucleic acid molecules in a strain of Streptococcus faecalis：identification of a plasmid determining erythromycin resistance.J.Bacterid.117，283-289)含有分解(resolution)系统，它可通过位点特异性重组活动将质粒多聚体分解成单体，从而需要特异性质粒编码的酶(解离酶)和质粒上的位点res(Swinfield，T.-J.，Janniere，L.，Ehrlich，S.D.，Minton，N.P.(1991).Characterization of a region of the Enterococcus faecalis plasmid pAMβ1 whichenhances the segregational stability of pAMβ1-derived cloning vector inBacillus subtilis.Plasmid 26，209-221；Janniere，L.，Gruss，A.，Ehrlich，S.D.(1993)Vector，pp.625-644，Sonenshein，A.L.，Hoch，J.A.，Losick，R.(eds.)Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria：Biochemistry，Physiology andmolecular genetics.American society for microbiology，Washington D.C)。已经提示了位点特异性重组系统在从细菌细胞的基因组中除去单一选择标记基因中的应用。例如，Dale等((1991)Gene transfer with subsequent removal of theselection gene from the host genome，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，10558-10562)描述了cre/lox系统在从转基因植物中除去标记中的应用并且提及了该系统的应用可以消除在后面的基因转入相同宿主的循环中对不同选择标记的需求。Kristensen，CS.等在(1995)，J.Bacterid.，177，52-58中描述了质粒RP4的多聚体分解系统在从革兰氏阴性菌中精确切除染色体片段中的应用(诸如与异源DNA导入的标记基因)。据报导可以预计该系统在产生最终不使用任何选择标记的异源DNA片段的染色体插入中具有意义。WO95/02058中描述了来自含有转座酶、解离酶和res位点的苏云金芽孢杆菌新转座子(tn5401)。该转座子用于含有苏云金芽孢杆菌DNA(例如起点和毒素基因)和被res位点侧接的非-苏云金芽孢杆菌DNA(例如大肠杆菌起点，选择标记基因)的质粒。将该质粒导入苏云金芽孢杆菌。随后导入表达解离酶的质粒(例如含有完整转座子-但仅用作解离酶供体的热敏性质粒)，由此从第一质粒中切除非-苏云金芽孢杆菌DNA。
为易于鉴定已经进行切除的克隆，反选择标记，诸如ysbC基因(丹麦专利申请PA 2004 00227；13-02-2004提交；Novozymes A/S)可以存在于多核苷酸构建体的载体-部分上。当所有在染色体中整合的构建体切除并且从细胞中缺失时，标记不再存在于细胞中，而细胞然后变成对选择产生抗性。
作为反选择标记的备选，可以使用得到可筛选表型的基因，诸如抗生素选择标记、GFP或淀粉酶。然后通过切除缺失所有整合的构建体导致对抗生素的抗性缺失，绿色荧光缺失或淀粉酶表型缺失。
因此，在第一个方面的一个优选的实施方案中，多核苷酸构建体进一步包含至少一选择标记、至少一反选择标记或至少一可筛选标记；优选至少一选择标记、反选择标记或可筛选标记侧接于第二位点特异性重组酶，优选解离酶的两侧。
本发明的第二个方面涉及一种细胞，在其染色体中包含位点特异性重组酶的识别序列(RS)的一或多拷贝，其中RS的每拷贝位于异源启动子拷贝的下游。
本发明的第三个方面涉及一种细胞，在其染色体中包含所关注的可读框(ORF)或操纵子的一或多拷贝，其中每拷贝均处于异源启动子的转录控制下，并且(i)其中ORF或操纵子的每拷贝均位于染色体中位点特异性重组酶识别序列(RS)的上游；或(ii)其中ORF或操纵子的每拷贝均位于染色体中位点特异性重组酶识别序列(RS)的下游。
本发明的第四个方面涉及多肽构建体，其包含无启动子的编码至少一种目的多肽的可读框(ORF)或操纵子，该构建体还包含位于所述ORF或操纵子上游或下游的位点特异性重组酶识别序列(RS)。
在第二个或第三个方面细胞优选的实施方案中，第四个方面的多核苷酸或最后方面的方法中，RS包含至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或最优选至少98％与attB161(SEQ ID NO：21)、attBmin(SEQ ID NO：22)或attPmin(SEQ ID NO：23)同一性的核苷酸序列，并且位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶；
或RS包含至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或最优选至少98％与attLmin(SEQ ID NO：24)或attRmin(SEQID NO：25)同一性的核苷酸序列，并且位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶和切除酶Xis。
实施例
材料和方法
菌株
枯草芽孢杆菌DN1885描述在下列文献中：Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.(1990).Cloning of aldB，whichencodes acetolactate decarboxylase，an exoenzyme from Bacillus brevis.Journalof Bacteriology 172，4315-4321。
枯草芽孢杆菌PL1801为带有破坏的apr和npr基因的枯草芽孢杆菌DN1885菌株。
带有在xyl基因座中整合的161bp attB片段的AEB43：枯草芽孢杆菌PL1801。
AEB165：带有在amyE基因座中整合的43bp最小attB的AEB43。
引物：
pattB19DraIII(SEQ ID NO：1)：CCCCCACTAAGTGCCTGACTTTCAACTAC
pattB179NotI(SEQ ID NO：2)：CCCCGCGGCCGCAAAAAAAGCAAAAAGC
PEP140(SEQ ID NO：3)：AATATTGGCCGGGGAAGCGGAAGAATGAAG
PEP218(SEQ ID NO：4)：CTATACTAGTCATCCTTGCAGGGTATGTTTC
pamyE-EI(SEQ ID NO：5)：GGGGGAATTCAACGGCCTCAACCTACTACTG
M13-正向(SEQ ID NO：6)：GTTTTCCCAGTCACGAC
M13-反向(SEQ ID NO：7)：CAGCTATGACCATGATTACGC
pCI-5(SEQ ID NO：8)：CTTCTACCCATTATTACAGCAGGA
pCI-9(SEQ ID NO：9)：AGTAGTTCG CCAGTTAATAGTTTG
p1224seq-2(SEQ ID NO：10)：GCCATACAGCTACTCACTCG
pPxyl-up(SEQ ID NO：11)：CACTATGAATTCAGAAATACTCCTA
pPxyl-down(SEQ ID NO：12)：GATTGAGTCATGAGATTTCCCCCTTA
pattPcry3A(SEQ ID NO：13)：CTCGAGTCCAACTCGCTTAATTGCGAGTTTTTATTTCGTTTATTTCAATTAAGGTA ATTAAAGATAATATCTTTGAATTG
pcry3ACIal(SEQ ID NO：14)：ATCGATTGTTGTTTCATGATTCTCCTC
pint-up(SEQ ID NO：15)：GGGGTCATGACTAAGAAAGTAGCAATC
pint-down(SEQ ID NO：16)：GGGGAAGCTTAAGCGAGTTGGAATTTA
pxylint-2(SEQ ID NO：17)：CAGGTCTTCTTCCGCCACTTG
pM1632-1(SEQ ID NO：18)：AGCGAAAATGCCTCACA
pattP-ExtTerm(SEQ ID NO：19)：GGGGGGTACCTCCAACTCGCTTAATTGCGAGTTTTTATTTCGTTTATTTCAATTAAGGTAATTAAACCATGGCGGCCGCTAGCGTCGACTAGTC AAAGATAGAAGAGCAGAGAG
pTermBI(SEQ ID NO：20)：CCCCGGATCCCCCGCGATACCGTCATTTTC
质粒
pLB44：含有噬菌体TP901-1基因组的2kb区，包括int基因和attP位点的大肠杆菌质粒(Christiansen等(1996).J.Bacteriol.178(17)：5164-5173)。
pBC16购自DSMZ(DSM 4424)；(Kreft，J.等(1978)Recombinantplasmids capable of replication in B.subtilis and E.coli.MoI.Gen.Genet 162：59-67)。
pSJ2739(描述在美国专利US6,100,063中)来源于pE194，其对复制而言为天然温度敏感性的。与本发明相关的pSJ2739的部分由pE194复制子以及来源于质粒pUB110的片段组成，从而能够接合入地衣芽孢杆菌。
pAEB142：在pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)载体中的木糖-诱导型Pxyl启动子后插入的编码噬菌体整合酶的TP901-1的int基因。首先通过两次单独的PCR-反应扩增PxyI和int片段。使用来自枯草芽孢杆菌PL1801的染色体DNA作为模板获得PxyI片段，并且引物为pPxyl-up & pPxyl-down，得到1.5kb片段。为了扩增int基因，将质粒pLB44用作模板并且引物为pint-up& pint-down，再次得到1.5kb片段。用BspHI消化两个片段，通过连接结合并且用作与引物pPxyl-up & pint-down的第三次PCR-反应的模板，得到2.9kb片段。然后在Zero BluntTOPOPCR克隆试剂盒(Invitrogen)中将该片段插入pCR-BluntII-TOPO载体。
pAEB146：在pSJ2739中插入pAEB142的PxyI-int片段。通过两步法获得该片段，其中Pxyl片段和int的上游部分获自1.7 EcoRI-HindIII-片段上的pAEB142并且与pSJ2739的4.3kb EcoRI-HindIII-片段连接，且随后int的下游部分在来自pAEB142的HindIII片段上获得并且插入第一质粒的HindIII位点。pAEB146含有提供对红霉素产生(Em)抗性的erm基因和温度敏性复制子以及接合所需的因子，使其能够在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中使用。
pAEB148：带有最小attP(attPmin)和在pCR-BluntII-TOPO载体中插入的cryIIIA区的PCR-片段。使用引物pattPcry3A和pcry3ACIaI获得该PCR片段，并且模板为含有cryIIIA区的质粒。这可以得到约650bp片段，通过使用Zero BluntTOPOPCR克隆试剂盒(Invitrogen)将其在载体中克隆。
pAEB153：通过用XhoI和CIaI消化从pAEB148中获得636bpattPmin-cryIIIA-片段(SEQ ID NO：26)并且将其插入pMOL1632的2.1kbSaII-CIaI片段。该质粒含有与整合酶供体质粒pAEB146相同的复制起点，但不编码复制蛋白。因此，pAEB153的复制依赖于从另一载体，诸如pAEB146中提供复制蛋白，即pAEB153为所谓的pAEB146的″从属″(″slave″)。
pAEB267：通过PCR，使用引物pattP-ExtTerm和pTermBI，并且来自地衣芽孢杆菌的染色体DNA作为模板获得含有最小TP901-1 attP位点和地衣芽孢杆菌染色体区的360bp片段。用BamHI和Kpnl消化该片段并且插入BamHI-KpnI消化的pAEB146。
pAEB288：带有编码淀粉酶的基因amyL的pAEB267，将其插入NcoI-NheI消化的pAEB267。
实施例1.染色体中含有两个TP9O1-1 attB位点的枯草芽孢杆菌菌株的构建
作为第一步，在枯草芽孢杆菌菌株PL 1801中的xyl基因座中整合161bpattB位点(attB161，SEQ ID NO：21)，得到菌株AEB43。通过对含有xyI基因座上游和下游区环绕的cat基因相邻的attB161的DNA片段进行双交换而获得整合。通过使用引物在来自枯草芽孢杆菌的染色体DNA上进行PCR获得xyl片段的上游和下游，所述的引物适合于通过同源重组扩增用于有效整合的足够大小的区(0.5kb或0.5kb以上)。通过PCR，使这些片段与attB161片段(获自乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.Cremoris)3107)和cat基因连接，从而产生氯霉素(Cm)抗性。
通过转化将这种xylup-attB-cat-xyldown片段导入PL1801并且将转化体在含有Cm的平板上铺板。在两个xyl区内已经发生DNA-片段与染色体之间重组的细胞保留了cat基因并且由此可以为CmR。分离含有这种表型的转化体并且通过PCR和测序发现它们具有在xyl基因座上整合的attB161位点。
第二步，在AEB43中的amyE基因座上整合43bp的最小attB位点(attBmin，Breüner等(2001)Microbiology 147 2051-2063；SEQ ID NO：22)，得到菌株AEB165，它具有两种功能形式或在染色体内整合的TP901-1 attB位点的拷贝(copies)，attB161和attBmin。通过将amyup-tet-attB-amydown转入AEB43的染色体和随后的双交换获得attBmin的整合。基本上如对xyl基因座上attB161整合所述获得PCR片段，但amyE基因座的上游和下游区侧接于tet-attB-片段，并且通过使用引物pattB-tet & ptet-down，通过PCR从pBC16获得这些区。
当将该片段转入AEB43 TcR时，如果PCR-片段与在PCR-片段的两端上的细菌染色体之间发生双交换，那么转化体唯一可能产生，在染色体上保留了tet基因和attBmin。分离了大量TcR转化体并且通过PCR发现其含有在amyE基因座上的指定位置上整合的attBmin位点。
实施例2.整合酶-供体质粒的构建
需要TP901-1整合酶在attB与attP位点之间进行重组。可以将整合酶的表达置于组成型或诱导型启动子的控制下。在质粒pAEB146中，整合酶的表达处于Pxyl-启动子的控制下，其在添加木糖时，被从低诱导至高活性的水平。pAEB146具有在芽孢杆菌属中起作用的温度敏感性复制子和来自能够接合的质粒pUB110的oriT区，且由此可以用于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。或者，可以由具有不同类复制子的质粒表达整合酶，或可以将其整合入染色体。
实施例3.attP质粒的构建
pAEB153含有Brφndsted和Hammer(1999)App.Environ.Microbiol.65752-758中测定的TP901-1(SEQ ID NO：23)最小attP位点，但也可以使用较大的attP区或较小的区，只要其仍然在重组中具有活性。pAEB153的复制依赖于来自另一具有pE194复制子，诸如pAEB146的质粒的复制提供。或者，可以在不同的质粒载体上克隆attP位点，例如一种具有不依赖于其它用于复制的质粒的起点和/或热敏性起点。在表达整合酶的质粒上也包括attP位点。
可以将含有attP的质粒用作用于克隆基因的载体，其方式为在染色体内attB中整合质粒导致来自存在于与attB位点邻近的染色体中启动子的基因表达。我们由此包括了pAEB153中稳定mRNA的cryIIIA区以便获得对所述基因的最大程度的表达。为了使启动子与cryIIIA区之间的距离尽可能地短，attPmin和cryIIIA重叠。为了获得最优化重叠，改变attP区中的单碱基。attP中的突变不会干扰该区参与与attB重组的能力，正如实施例5中所示。
实施例4.attB中两种拷贝的同时整合
用pAEB146(Int-供体)转化AEB165(2×attB)而产生菌株AEB182。由此依次用pAEB153(attP)转化AEB182。使转化体生长并且在33℃(许可温度)下划线且对两种质粒的选择允许在attP与attB位点之间进行重组。然后在仅对pAEB153进行选择的平板上对许多菌落划线并且使孵育温度增加至50℃，使得pAEB146无法复制且由此也使pAEB153无法复制。仅在这些条件下可以生长的细胞为那些pAEB153已经整合入染色体的细胞。还通过在选择平板(Em)上划线对分离物检测Int-供体质粒pAEB146的存在。
按照这种方式对8个菌落划线并且发现分离物中的6个能够在50℃下生长并且已经失去了Int供体。通过来自这6个菌株的染色体DNA上的PCR检查了attP与attB之间的重组。研究了存在完整的attB位点与attL位点(SEQID NO：24)，其为attB与attP重组的结果。所用的引物如表1中所示并且将PCR-反应结果概况在表2中。
表1：用于检测重组的引物
| 位点 | xyl-基因座 | amyE-基因座 |
| attB | pxylint-2 & pCI-5 | pamy-1 & ptet-1 |
| attP | pM1632-1 & pxylint-2 | pM1632-1 & pamy-1 |
表2：对整合-菌株的PCR-检查
| PCR-片段 | AEB182/pAEB153 | |||||
| A | B | C | D | E | F | |
| xyI中的 | √ | - | - | - | √ | - |
| attB161 | ||||||
| xyI中的attL | - | √ | √ | √ | - | √ |
| amyE中的attBmin | - | √ | - | - | √ | √ |
| amyE中的attL | √ | - | √ | √ | - | - |
√：观察到了正确大小的PCR片段。
-：未观察到正确大小的PCR片段。
在下列attB位点中发生pAEB153整合：A：在amyE中；B：在xyI中；C和D：在两种位点中；E.无一attB位点；和F：在xyI中。因此，在测试的6个菌株中由2个中发生双重整合。
本实验在不向培养基中添加木糖的情况下进行。为了增加进一步的整合效率，可以通过添加木糖且由此活化Pxyl启动子来增加整合酶的产量，从而导致对整合酶的较高程度的表达。例如，木糖的浓度可以在0.05 og 5％；在高浓度木糖下，整合酶得到超表达并且对细胞而言变成毒性的。
实施例5.在所有attB位点中的整合均已发生的细胞的鉴定。
为了便于鉴定在所有可利用的attB位点中attP质粒已经进行位点特异性整合的细胞，反选择标记，诸如ysbC基因(丹麦专利申请PA 2004 00227；2004年2月13日提交)可以位于与染色体中所有attB位点邻近，但通过attB位点隔离的启动子的启动子下游。由该启动子表达反选择标记会导致细胞对选择压力敏感(使用ysbC.氟-乳清酸盐(fluoro-orotate))。当在这类attB位点中发生attP质粒整合时，从启动子中分离反选择标记并且不再由这一基因座上表达所述标记。然而，仅在所有attB位点中发生整合时，无标记产生，并且该细胞变成对选择产生抗性。
作为反选择标记的备选，可以使用得到可筛选表型的基因，诸如抗生素选择标记、绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、淀粉酶等。在所有attB位点中attP质粒的整合随后导致对抗生素抗性、绿色荧光、X-gal平板上的颜色、淀粉酶表型或由标记表达前体表型缺失。
实施例6：attB和attP位点可互换
按照与上述实施例中所述之一类似的方式，所述的位点可以互换，使得在宿主基因组中插入一种或多种attP位点并且attB位点存在于要整合入染色体上的attP位点的载体中。
在另一种方案中，attP和attB可以与宿主染色体中的attL(SEQ ID NO：24)和质粒上的attR(SEQ ID NO：25)的拷贝互换；或反之亦然。attL与attR位点之间的重组导致在重组后生成attP与attB位点。然而，除整合酶外，TP901-1的attL与attR位点之间的有效重组要求存在切除酶Xis(Breüner等(1990)Novel Organization of Genes Involved in Prophage Excision Identified in theTemperate Lactococcal Bacteriophage TP901-1.J Bacteriol 181(23)：7291-7297。
实施例7.具有各自与一或多个启动子相邻近的基因组中一或多个attB位点的菌株的构建
使用与上述实施例1中所述之一类似的手段，在地衣芽孢杆菌染色体的几个位置上插入attB位点，将每个位点与异源串联启动子的下游一起插入(如WO 1999/043835中披露的)。然后将包含attP位点和编码淀粉酶的基因的载体通过整合酶整合入染色体attB位点。当将载体通过attB与attP位点之间的重组整合入染色体时，载体中相对于attP位点的淀粉酶基因的取向可确保该基因变成可操作地于串联启动子连接。
将编码淀粉酶的基因插入含有质粒pAEB267的attP-int，按照这类方式，通过attB与attP之间由TP901-1整合酶催化的位点-特异性重组整合质粒导致将淀粉酶基因插入染色体，使得它可以由在重组后通过attL位点与基因分隔开(附图1)的异源串联启动子表达。在含有淀粉酶的平板上对发生这类整合活动的菌株(通过如实施例4中所述的PCR验证)划线并且形成亮区，证明淀粉酶由与attL位点邻近的串联启动子表达。在按照与对照组相似的方式整合不含淀粉酶基因的pAEB267时，未观察到亮区。
实施例8.具有各自与启动子邻近的基因组中淀粉酶基因三拷贝的菌株的构建
使用与上述实施例1中所述之一类似，但适合于所用引物和染色体片段设计中的地衣芽孢杆菌的手段，在地衣芽孢杆菌染色体中的三个位置上插入attBmin位点(amyL，xyl和gnt基因座)。将每个attBmin位点一起插入并异源串联启动子的下游(如WO 1999/043835中披露的)。然后将被设计为附图2中的在″genX″位置上含有淀粉酶的质粒，即包含attP位点和编码淀粉酶的基因的载体通过整合酶整合入所有染色体attB位点。CryIIIA区位于淀粉酶基因的上游并且载体中相对于attP位点的淀粉酶基因的取向可确保该基因如附图2中间部分中对″genX″所示的三个基因座上的定位和定向。随后通过每个基因座上两个cryIIIA区之间的同源重组切除所有三个基因座的载体部分而产生菌株，其中三个基因座各自包含附图2下部中所示的区：启动子，cryIIIA、淀粉酶和attR。
序列表
<110>诺维信公司(Novozymes A/S)
<120>多个多核苷酸拷贝的稳定基因组整合
<130>10639.204-WO
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pattB19DraIII
<400>1
cccccactaa gtgcctgact ttcaactac 29
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pattB179NotI
<400>2
ccccgcggcc gcaaaaaaag caaaaagc 28
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PEP140
<400>3
aatattggcc ggggaagcgg aagaatgaag 30
<210>4
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PEP218
<400>4
ctatactagt catccttgca gggtatgttt c 31
<210>5
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pamyE-EI
<400>5
gggggaattc aacggcctca acctactact g 31
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M13-forward
<400>6
gttttcccag tcacgac 17
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M13-revers
<400>7
cagctatgac catgattacg c 21
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pCI-5
<400>8
cttctaccca ttattacagc agga 24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pCI-9
<400>9
agtagttcgc cagttaatag tttg 24
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1224seq-2
<400>10
gccatacagc tactcactcg 20
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pPxyl-up
<400>11
cactatgaat tcagaaatac tccta 25
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pPxyl-down
<400>12
gattgagtca tgagatttcc ccctta 26
<210>13
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pattPcry3A
<400>13
ctcgagtcca actcgcttaa ttgcgagttt ttatttcgtt tatttcaatt aaggtaatta 60
aagataatat ctttgaattg 80
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pcry3AClaI
<400>14
atcgattgtt gtttcatgat tctcctc 27
<210>15
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pint-up
<400>15
ggggtcatga ctaagaaagt agcaatc 27
<210>16
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pint-down
<400>16
ggggaagctt aagcgagttg gaattta 27
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pxylint-2
<400>17
caggtcttct tccgccactt g 21
<210>18
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pM1632-1
<400>18
agcgaaaatg cctcaca 17
<210>19
<211>161
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pattP-ExtTerm
<400>19
gtgcctgact ttcaactact ttaactactg ctgcttcacc agttttttga acttgtgctt 60
tttcttttat caaatttggc acaaaaagca aaattaaaat actgataatt gccaacacaa 120
ttaacatctc aatcaaggta aatgcttttt gctttttttg c 161
<210>20
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pTermBI
<400>20
ctgataattg ccaacacaat taacatctca atcaaggtaa atg 43
<210>21
<211>161
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>attB161位点
<400>21
gtgcctgact ttcaactact ttaactactg ctgcttcacc agttttttga acttgtgctt 60
tttcttttat caaatttggc acaaaaagca aaattaaaat actgataatt gccaacacaa 120
ttaacatctc aatcaaggta aatgcttttt gctttttttg c 161
<210>22
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>attBmin位点
<400>22
ctgataattg ccaacacaat taacatctca atcaaggtaa atg 43
<210>23
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>attPmin位点
<400>23
tccaactcgc ttaattgcga gtttttattt cgtttatttc aattaaggta actaaa 56
<210>24
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>attLmin位点
<400>24
ctgataattg ccaacacaat taacatctca attaaggtaa ctaaa 45
<210>25
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>attRmin位点
<400>25
tccaactcgc ttaattgcga gtttttattt cgtttatttc aatcaaggta aatg 54
<210>26
<211>636
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pAEB153中克隆的attPmin-cryIIIA片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(35)..(580)
<223>cryIIIa衍生的mRNA稳定区
<400>26
atcgattgtt gtttcatgat tctcctcccc caatgagctc cataatacat aattttcaaa 60
ctgataaaat gatttttcat aaatccatta gacggtgcaa atatatgttt ttaatgttct 120
tcgtttttag gcatccctcc tttcaagata aataatttat acactattct attggaatct 180
taatcattcc aatagaaaaa tatgtaatga ttataaataa gtcgcttctt atcataaata 240
tatttacata ttcatttaat actacatcat gttaggtata gtaaggctat caagggtgtc 300
ttaatttcta cttgtaacaa tgtattggca tattatatat tgaattgaga aaattaaata 360
cagcgataat tcacatgaac aagttcattg gtagttatat tttcaaattt tcaaggttgt 420
gcttgtatgt cattctatag ttagataagc atttgaggta gagtccgtcc gaatatattt 480
gtaatctgaa gaaggttcaa acatatttct atataacgta ttcttttttt gtagttctta 540
cttttgaggg gcgttacaat tcaaagatat tatctttaat taccttaatt gaaataaacg 600
aaataaaaac tcgcaattaa gcgagttgga ctcgag 636
Claims (79)
1.构建细胞的方法，在该细胞的染色体中包含编码至少一种目的多肽的可读框(ORF)或操纵子的一个或多个拷贝，每个拷贝在异源启动子的转录控制下，所述方法包含下列步骤：
(a)提供在其染色体中包含位点特异性重组酶的第一识别序列(RS1)的一个或多个拷贝的细胞，其中RS1的每个拷贝位于所述的异源启动子拷贝的下游；
(b)将包含位点特异性重组酶的ORF或操纵子和第二识别序列(RS2)的多核苷酸构建体导入所述的细胞，其中RS2相对于ORF或操纵子定位和定向，使得RS2与细胞染色体中RS1拷贝的体内重组可以将所述的构建体整合入该染色体，并且将ORF或操纵子置于异源启动子的下游，并且与异源启动子相同取向；和
(c)RS2与一个或多个RS1的拷贝在有位点特异性重组酶存在下重组，由此将ORF或操纵子的一个或多个拷贝整合入染色体并且置于下列条件下：
(i)直接在异源启动子转录控制下；或
(ii)在异源启动子的下游且与异源启动子相同方向，但用区将其分隔开，该区可以在一种或多种任选重组事件后切除，由此将所关注的ORF或操纵子置于异源启动子的转录控制下。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的细胞为原核细胞。
3.权利要求2所述的方法，其中所述的原核细胞为芽孢杆菌属细胞。
4.权利要求3所述的方法，其中所述的芽孢杆菌属细胞为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
5.权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述的ORF或操纵子编码至少一种酶。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的ORF或操纵子编码氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。
7.权利要求6所述的方法，其中所述的ORF或操纵子编码淀粉酶。
8.权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中所述的异源启动子包含两个或多个启动子。
9.权利要求8所述的方法，其中所述的两个或多个启动子包含一个或多个来源于一种或多种芽孢杆菌属基因的启动子。
10.权利要求8-9中任意一项所述的方法，其中所述的两个或多个启动子包含下列的一种或多种：amyQ启动子、amyL启动子、cryIIIA启动子、和包含-35区的核苷酸序列TTGACA和-10区的核苷酸序列TATAAT的共有启动子。
11.权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中所述的位点特异性重组酶包含噬菌体整合酶，优选酪氨酸重组酶或丝氨酸重组酶，更优选大丝氨酸重组酶，且最优选TP9O1-1整合酶。
12.权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中RS1包含与attB161(SEQ ID NO：21)或attBmin(SEQ ID NO：22)具有至少70％同一性的核苷酸序列，RS2包含与attPmin(SEQ ID NO：23)具有至少70％同一性的核苷酸序列，且所述的位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶。
13.权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中RS1包含与attPmin(SEQ ID NO：23)具有至少70％同一性的核苷酸序列，RS2包含与attB161(SEQ ID NO：21)或attBmin(SEQ ID NO：22)具有至少70％同一性的核苷酸序列，且所述的位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶。
14.权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中RS1包含与attLmin(SEQ ID NO：24)具有至少70％同一性的核苷酸序列，RS2包含与attRmin(SEQ ID NO：25)具有至少70％同一性的核苷酸序列，且所述的位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶和切除酶Xis。
15.权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中RS1包含与attRmin(SEQ ID NO：25)具有至少70％同一性的核苷酸序列，RS2包含与attLmin(SEQ ID NO：24)具有至少70％同一性的核苷酸序列，且所述的位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶和切除酶Xis。
16.权利要求1-15中任意一项所述的方法，其中至少一种mRNA稳定区位于步骤(a)中细胞染色体中的异源启动子与RS1之间。
17.权利要求16所述的方法，其中至少一种mRNA稳定区包含来源于cryIII的mRNA稳定区。
18.权利要求17所述的方法，其中至少一种mRNA稳定区包含与SEQID NO：26的35-580位上所示序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
19.权利要求1-15中任意一项所述的方法，其中所述的多核苷酸构建体进一步包含至少一种位于ORF或操纵子与RS2之间的在ORF或操纵子上游的mRNA稳定区。
20.权利要求19所述的方法，其中所述的至少一种mRNA稳定区包含来源于cryIIIA的mRNA稳定区。
21.权利要求20所述的方法，其中所述的至少一种mRNA稳定区包含与SEQ ID NO：26的35-580位上所示序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
22.权利要求1-21中任意一项所述的方法，其中所述的多核苷酸构建体进一步包含位于所述构建体中ORF或操纵子上游或下游的区，所述区与相应地位于细胞染色体中RS1的上游或下游的区充分同源，以便在两种区均存在于细胞中时进行两种同源区之间的体内同源重组。
23.权利要求1-22中任意一项所述的方法，其中所述的多核苷酸构建体进一步包含至少一选择标记、至少一反选择标记或至少一可筛选标记。
24.权利要求23所述的方法，其中所述的选择标记、反选择标记或可筛选标记的两侧被第二位点特异性重组酶，优选解离酶的识别序列包围。
25.在染色体中包含位点特异性重组酶识别序列(RS)的一个或多个拷贝的细胞，其中RS的每拷贝位于异源启动子拷贝的下游。
26.权利要求25所述的细胞，其中所述的细胞为原核细胞。
27.权利要求26所述的细胞，其中所述的原核细胞为芽孢杆菌属细胞。
28.权利要求27所述的细胞，其中所述的芽孢杆菌属细胞为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞。
29.权利要求25-28中任意一项所述的细胞，其中所述的异源启动子包含两个或多个启动子。
30.权利要求29所述的细胞，其中所述的两个或多个启动子包含一个或多个来源于一种或多种芽孢杆菌属基因的启动子。
31.权利要求29-30中任意一项所述的细胞，其中所述的两个或多个启动子包含下列的一个或多个：amyQ启动子、amyL启动子、cryIIIA启动子、和包含-35区的核苷酸序列TTGACA和-10区的核苷酸序列TATAAT的共有启动子。
32.权利要求25-31中任意一项所述的细胞，其中所述的位点特异性重组酶包含噬菌体整合酶，优选酪氨酸重组酶或丝氨酸重组酶，更优选大丝氨酸重组酶，且最优选TP901-1整合酶。
33.权利要求25-32中任意一项所述的细胞，其中RS包含与attB161(SEQ ID NO：21)、attBmin(SEQ ID NO：22)或attPmin(SEQ ID NO：23)具有至少70％同一性的核苷酸序列，并且所述位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶。
34.权利要求25-32中任意一项所述的细胞，其中RS包含与attLmin(SEQ ID NO：24)或attRmin(SEQ ID NO：25)具有至少70％同一性的核苷酸序列，并且所述位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶和切除酶Xis。
35.权利要求25-34中任意一项所述的细胞，其中至少一种mRNA稳定区位于细胞染色体中异源启动子与RS之间。
36.权利要求35所述的细胞，其中至少一种mRNA稳定区包含来源于cryIIIA的mRNA稳定区。
37.权利要求36所述的细胞，其中至少一种mRNA稳定区包含与SEQID NO：26的35-580位上所示序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
38.在染色体中包含目的可读框(ORF)或操纵子的一个或多个拷贝的细胞，其中每个拷贝在异源启动子的转录控制下，并且(i)其中所述ORF或操纵子的每个拷贝位于染色体中位点特异性重组酶识别序列(RS)的上游；或(ii)其中所述ORF或操纵子的每个拷贝位于染色体中位点特异性重组酶识别序列(RS)的下游。
39.权利要求38所述的细胞，其中所述的细胞为原核细胞。
40.权利要求39所述的细胞，其中所述的原核细胞为芽孢杆菌属细胞。
41.权利要求40所述的细胞，其中所述的芽孢杆菌属细胞为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞。
42.权利要求38-41中任意一项所述的细胞，其中所述的异源启动子包含两个或多个启动子。
43.权利要求42所述的细胞，其中所述的两个或多个启动子包含一个或多个来源于一种或多种芽孢杆菌属基因的启动子。
44.权利要求42-43中任意一项所述的细胞，其中所述的两个或多个启动子包含下列的一个或多个：amyQ启动子、amyL启动子、cryIIIA启动子、和包含-35区的核苷酸序列TTGACA和-10区的核苷酸序列TATAAT的共有启动子。
45.权利要求38-44中任意一项所述的细胞，其中所述的位点特异性重组酶包含噬菌体整合酶，优选酪氨酸重组酶或丝氨酸重组酶，更优选大丝氨酸重组酶，且最优选TP901-1整合酶。
46.权利要求38-45中任意一项所述的细胞，其中所述的RS包含与attB161(SEQ ID NO：21)、attBmin(SEQ ID NO：22)或attPmin(SEQ ID NO：23)具有至少70％同一性的核苷酸序列，并且所述的位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶。
47.权利要求38-45中任意一项所述的细胞，其中所述的RS包含与attLmin(SEQ ID NO：24)或attRmin(SEQ ID NO：25)具有至少70％同一性的核苷酸序列，并且所述的位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶和切除酶Xis。
48.权利要求38-47中任意一项所述的细胞，其中至少一种mRNA稳定区位于细胞染色体中异源启动子与所述的ORF或操纵子的一或多拷贝之间。
49.权利要求48所述的细胞，其中所述的至少一种mRNA稳定区包含来源于cryIIIA的mRNA稳定区。
50.权利要求49所述的细胞，其中所述的至少一种mRNA稳定区包含与SEQ ID NO：26的35-580位上所示序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
51.权利要求38-50中任意一项所述的细胞，其中所述的ORF或操纵子编码至少一种酶。
52.权利要求51所述的细胞，其中所述的ORF或操纵子编码氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。
53.权利要求52所述的细胞，其中所述的ORF或操纵子编码淀粉酶。
54.多核苷酸构建体，其包含编码至少一种目的多肽的无启动子可读框(ORF)或操纵子，该构建体还包含位于所述ORF或操纵子上游或下游的位点特异性重组酶识别序列(RS)。
55.权利要求54所述的多核苷酸构建体，其中所述的ORF或操纵子编码至少一种酶。
56.权利要求55所述的多核苷酸构建体，其中所述的ORF或操纵子编码氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。
57.权利要求56所述的多核苷酸构建体，其中所述的ORF或操纵子编码淀粉酶。
58.权利要求54-57中任意一项所述的多核苷酸构建体，其中所述的位点特异性重组酶包含噬菌体整合酶，优选酪氨酸重组酶或丝氨酸重组酶，更优选大丝氨酸重组酶，且最优选TP901-1整合酶。
59.权利要求54-58中任意一项所述的多核苷酸构建体，其中RS包含与attB161(SEQ ID NO：21)、attBmin(SEQ ID NO：22)或attPmin(SEQ ID NO：23)具有至少70％同一性的核苷酸序列，并且所述的位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶。
60.权利要求54-58中任意一项所述的多核苷酸构建体，其中RS包含与attLmin(SEQ ID NO：24)或attRmin(SEQ ID NO：25)具有至少70％同一性的核苷酸序列，并且所述位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶和切除酶Xis。
61.权利要求54-60中任意一项所述的多核苷酸构建体，其中至少一种mRNA稳定区位于ORF或操纵子的上游。
62.权利要求61所述的多核苷酸构建体，其中所述的至少一种mRNA稳定区包含来源于cryIIIA的mRNA稳定区。
63.权利要求62所述的多核苷酸构建体，其中所述的至少一种mRNA稳定区包含与SEQ ID NO：26的35-580位上所示序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
64.生产目的多肽的方法，所述的方法包含：
(a)培养在其染色体中包含目的可读框(ORF)或操纵子的一个或多个拷贝的细胞，其中每个拷贝在异源启动子的转录控制下，并且(i)其中ORF或操纵子的每个拷贝位于染色体中位点特异性重组酶识别序列(RS)的上游；或(ii)其中ORF或操纵子的每个拷贝位于染色体中位点特异性重组酶识别序列(RS)的下游；和
(b)分离目的多肽。
65.权利要求64所述的方法，其中所述的细胞为原核细胞。
66.权利要求65所述的方法，其中所述的原核细胞为芽孢杆菌属细胞。
67.权利要求66所述的方法，其中所述的芽孢杆菌属细胞为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
68.权利要求64-67中任意一项所述的方法，其中所述的异源启动子包含两个或多个启动子。
69.权利要求68所述的方法，其中所述的两个或多个启动子包含来源于一种或多种芽孢杆菌属基因的一个或多个启动子。
70.权利要求68-69中任意一项所述的方法，其中所述的两个或多个启动子包含下列的一种或多种：amyQ启动子；amyL启动子；cryIIIA启动子；和包含-35区的核苷酸序列TTGACA和-10区的核苷酸序列TATAAT的共有启动子。
71.权利要求64-70中任意一项所述的方法，其中所述的位点特异性重组酶包含噬菌体整合酶，优选酪氨酸重组酶或丝氨酸重组酶，更优选大丝氨酸重组酶，且最优选TP9O1-1整合酶。
72.权利要求64-71中任意一项所述的方法，其中所述的RS包含与attB161(SEQ ID NO：21)、attBmin(SEQ ID NO：22)或attPmin(SEQ ID NO：23)具有至少70％同一性的核苷酸序列，并且所述的位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶。
73.权利要求64-71中任意一项所述的方法，其中所述的RS包含与attLmin(SEQ ID NO：24)或attRmin(SEQ ID NO：25)具有至少70％同一性的核苷酸序列，并且所述的位点特异性重组酶包含噬菌体TP901-1整合酶和切除酶Xis。
74.权利要求64-73中任意一项所述的方法，其中至少一种mRNA稳定区位于细胞染色体中异源启动子与ORF或操纵子的一或多拷贝之间。
75.权利要求74所述的方法，其中所述的至少一种mRNA稳定区包含来源于cryIIIA的mRNA稳定区。
76.权利要求75所述的方法，其中所述的至少一种mRNA稳定区包含与SEQ ID NO：26的35-580位上所示序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
77.权利要求64-76中任意一项所述的方法，其中所述的ORF或操纵子编码至少一种酶。
78.权利要求77所述的方法，其中所述的ORF或操纵子编码氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。
79.权利要求78所述的方法，其中所述的ORF或操纵子编码淀粉酶。
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