JP2009022293A - 選択された生物のための人工プロモーターライブラリー及び該ライブラリー由来のプロモーター - Google Patents
選択された生物のための人工プロモーターライブラリー及び該ライブラリー由来のプロモーター Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009022293A JP2009022293A JP2008232486A JP2008232486A JP2009022293A JP 2009022293 A JP2009022293 A JP 2009022293A JP 2008232486 A JP2008232486 A JP 2008232486A JP 2008232486 A JP2008232486 A JP 2008232486A JP 2009022293 A JP2009022293 A JP 2009022293A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- sequence
- group
- artificial promoter
- artificial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1051—Gene trapping, e.g. exon-, intron-, IRES-, signal sequence-trap cloning, trap vectors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】選択された生物又は生物の群のための人工のプロモーターライブラリーは、そのセンス鎖が前記生物又は生物の群からの有効なプロモーターの少なくとも2の共通配列又はその各々の少なくとも半分を含む一部分、及び少くとも7のヌクレオチドがヌクレオベースA,T,C及びGの中から無作偽に選択された不定の長さの周囲の又は介在するヌクレオチド配列(スペーサー)を含む二本鎖 DNAフラグメントの混合物として作製される。
【選択図】なし
Description
要約すると、流量最適化は、1)何部もの過剰発現でなく酵素濃度の細かい調節及びしばしば2)速度制限ステップを見つけ出すのでなく経路中のいくつかの酵素のレベルの最適化を必要とする。
我々が目指すプロモーターライブラリーは、特定の種の工学技術のための関心の活性になり得る全体の範囲のプロモーター活性、好ましくは検出できる最も弱いプロモーターから可能な最も強力なプロモーターをカバーするはずである。更に、我々は、小さなステップにおいてこの広範な活性範囲をカバーすること、即ち、上述のような流量最適化の目的に適したものであるために、ステップ当り50〜100 %だけ活性を増加させることを目指す。
本発明は、所定の生物又は生物の群のための人工的なプロモーターライブラリーであって、それらのセンス鎖が前記生物もしくは生物の群からの有効なプロモーターの少なくとも2の共通配列を含む二本鎖 DNAフラグメントの混合物、又は各々の少なくとも半分を含むその一部と、少なくとも7のヌクレオチドがヌクレオベースA,T,C及びGから無作偽に選択された種々の長さの周囲の又は介在するヌクレオチド配列(スペーサー)と、を含む人工プロモーターライブラリーを供する。但し、以前から周知であるプロモーター配列及び天然のソースから単離されたプロモーター配列は含まれない。
二本鎖 DNAフラグメントのセンス鎖は、ライブラリーのプロモーターに特定の調節特性を与える調節 DNA配列も含み得る。このような特定の調節特性は、好ましくは、増殖条件の変化、例えばpH、浸透度、温度又は増殖相の変化による活性化である。
選択される生物又は生物のグループは、原核生物から及び真核生物から、特に、原核及び真核微生物、例えばイースト、他の真菌及び高等生物の細胞系から選択することができる。
最も多くの場合、原核生物のための人工プロモーターライブラリー内に保持された共通配列は、−35シグナル(−35〜−30):TTGACA及び−10シグナル(−12〜−7):TATAAT又は各々の少なくとも3の保存されたヌクレオチドを含む両方の一部を含むであろう。
真核生物において、前記共通配列は、TATAボックス及び少なくとも1の上流活性化配列(UAS) を含むべきである。
調節可能な人工プロモーターライブラリーを得るために、合成される一本鎖 DNA配列は、特定の調節特性をライブラリーのプロモーターに与える調節 DNA配列を含み得る。このような特定の調節特性は、好ましくは、増殖条件の変化、例えばpH、浸透性、温度又は増殖相の変化による活性化である。
b)該一セットのプロモーターを、前記遺伝子を各々のクローン内で該セットからの少なくとも1のプロモーターの制御下におくように、前記生物内にクローニングし、
c)該選択されたクローンを増殖させ、そして産物形成の最適な流れを示すものを見い出すためにそれらをスクリーニングすることを含む方法を更に供する。
図1。実施例1からのL.ラクチス(L. lactis )のための人工プロモーターのライブラリー。プロモーター活性(Miller単位)を、2μg/mlエリトロマイシンを補給したGM17培地中で増殖した株MG1363におけるプロモータークローニングベクター pAK80上での異なる合成プロモータークローンから転写されたb−ガラクトシダーゼをコードするリポーター遺伝子(lacLM )の発現からアッセイした。データ点のパターンは、−35もしくは−10共通配列のいずれかにおいて又はこれら2つの共通配列の間のスペーサーの長さにおいてプロモータークローンが異なることを示す。
文献によれば(de Vos及びSimons, 1994の報告を参照のこと)、L.ラクチスにおける強力なプロモーターは共通して次のヌクレオチド配列(数字は番号+1で与えられる転写開始部位に対する位置を示す):−12〜−7:TATAAT;−15〜−14:TG;−35〜−30:TTGACAを有する傾向がある。−10と−35との間のスペーシングは17ヌクレオチドであるようである。しかしながら、L.ラクチスについて出版されているプロモーター配列の親密な比較は、上述の1つを除くいくつかの位置において、ヌクレオチドが多少よく保存されていることを示す。
このオリゴヌクレオチド混合物は、最初は一本鎖であり、クローニングの目的のために二本鎖 DNAフラグメントに変換されなければならない。これは、プロモーターオリゴヌクレオチドの3′末端に相補的な配列を有する10bpオリゴヌクレオチドを試験管内で合成することにより行った。次にこのオリゴヌクレオチドをdATP, dCTP, dGTP及びdTTPの存在下での DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントによる第2鎖合成のためのプライマーとして用いた。この方法において第2 DNA鎖は正確に第1 DNAに相補的になった。
1)混合物をBamHI及び PstIで消化し、ベクター pAK80を PstI及び BglII(BglIIはBamHIに適合する)で消化した。
両方の場合、ベクター DNAを、クローニングベクターの再連結を防ぐために子ウシインテスチンホスファターゼ(CIP) で更に処理した。次に、そのフラグメント混合物及びベクター DNAを、T4 DNAリガーゼ及び標準連結条件を用いて16℃で一晩、連結した。
上述の46のクローンの DNA配列決定は、挿入されたプロモーターフラグメントのほとんどが、オリゴヌクレオチドデザインについてもとから特定された DNA配列を有していたが(上述を参照のこと)、残りのフラグメントの配列はその配列から少しずれていた。
先の種々の酵素反応に用いられる酵素は、 Pharmacia及びBoehringerから得て、それらにより推奨されるように用いた。
この例は、L.ラクチスのための温度制御されたプロモーターライブラリーの開発を示す。L.ラクチスのヒートショック応答に関連することが示されている8塩基対逆反復を含む調節因子を、−35配列の数塩基対上流に挿入する。これらの調節因子の最小の範囲は、9(又はそれ未満の)塩基対により分離された9bp(又はそれより長い)逆反復(IR)を含む27塩基対:
グラム陽性バクテリアバチルス・サブチリスは、所定範囲の異種タンパク質の生産のための工業用バイオリアクターとして広範囲に用いられる。それゆえ、本発明のランダムスペーサー法がこの生物のためのプロモーターライブラリーを作るのにも用いることができるか否かをテストすることに関心がある。バチルス・サブチリスのための共通配列は、大腸菌及びL.ラクチスのための共通配列に極めて類似しており、それゆえ、我々は、そのアプローチがバチルス・サブチリスにあてはまるか否かを、いくつかのCPプロモーターをこのバチルス・サブチリスのためのプロモータークローニングベクターにサブクローニングすることによりテストし、次に1)CPプロモーターがバチルス・サブチリス内で活性であるか否か及び2)更に、この生物内で、共通配列間のスペーサーがプロモーターの強さのために重要な役割を果たすか否かを問うことができよう。
実施例1のCPプロモーターを、L.ラクチスにおける使用のためにデザインしたが、大腸菌プロモーターの共通配列は、実施例1に供されるオリゴヌクレオチドの配列内に含まれる。更に、実施例1においてCPプロモーターライブラリーを作るために用いたベクターは、L.ラクチス及び大腸菌のためのシャトルベクターであり、これは、我々がグラム陰性バクテリア宿主大腸菌内のCPプロモーターの活性を分析するのを許容する。図3は、大腸菌内のCPプロモーターの33の活性を示す。明らかに、個々のCPプロモーターの活性も極めて異なり、そして同時に、プロモーターは広範囲の活性をカバーする。興味あることに、大腸菌及びL.ラクチスにおける個々のプロモーターの強さの間の相関はあまり強くなく;L.ラクチス内で強力なプロモーターであることが見出されたいくつかのプロモーターは大腸菌内で弱くその逆も成り立つことが見出された。
グラム陰性種に属するバクテリア、シュードモナスは、それらの適用において、例えば汚染された土壌中の化学老廃物のバイオデグラデーションにおける適用のため、次第に重要になってきている。しかしながら、ここでも、遺伝子工学は適切なプロモーター及び発現システムの欠如により妨げられている。シュードモナスプロモーターに関する文献は、シュードモナスのための共通配列は大腸菌、L.ラクチス及びバチルス・サブチリスのものほど十分には規定されていないことを示す。
我々は、実施例5に記載される共通配列に基づくオリゴヌクレオチドをデザインし、実施例1に記載されるように多重クローニング部位を組み込んだ。次のオリゴヌクレオチドを合成した。
MCS-(N)8-TTGR-N19-TATRAT-(N)8-MCS
5′端からはじめて:EcoRI制限部位(後のクローニングストラテジーに用いるためのもの、以下を参照のこと)、共通な UASGCN4p 、59bpスペーサー(スペーサー1)、共通なTATAAA配列(TATAボックス)、38bpスペーサー(スペーサー2)、23bpレプレッサー結合配列(転写が開始される領域でもある)、T1ボックスとARG8遺伝子の最初のコドンとの間のスペーサー配列(このスペーサーはARG8遺伝子の最初のコドン、 ATGも含むARG8遺伝子からのネイティブ配列である)、並びに最後にBamHI部位を含む 199bpオリゴヌクレオチドをデザインした。これは、β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子との枠内融合物を供するようにデザインされる(以下を参照のこと)。
アミノ酸及び特定のアルギニン制御に基づく結果は、本発明のランダムスペーサー法は、広範囲のプロモーター活性をカバーし、そして外部シグナルにより制御することができるプロモーターを作るのに用いることができることを証明する。本発明の制御態様は、アミノ酸及びアルギニン制御により例示されるが、これらに限られない。
Crabeel, M., de Rijcke, M., Seneca, S., Heimberg, H., Pfeiffer, I., and Matisova, A., 1995. Further definition of the sequence and position requirements of the arginine control element that mediates repression and induction by arginine in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 11: 1367-1380
de Vos, W.M., and Simons, G., 1994. Gene cloning and expression systems in lactococci, p.52-105. In M.J.Gasson and W.M. de Vos (eds.), Genetics and biotechnology of lactic acid bacteria. Blackie Academic & Professional, Glasgow, United Kingdom.
Hermann, H., Hacker, U., Bandlow, W., and Magdolen, V., 1992. pYLZ vectors: Saccharomyces cerevisiae/Escherichia coli shuttle plasmids to analyze yeast promoters. Gene 119: 137-41.
Holo, H., and Nes, I.F., 1989. High frequency transformation, by electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media. Appl.Environ.Microbiol., 55, 3119-3123.
Jensen, P.R., Westerhoff, H.V., and Michelsen, O., 1993. Excess capacity of H + -ATPase and inverse respiratory control in Escherichia coli. EMBO J., 12, 1277-1282. Kacser, H. and Burns, J.A. 1973. The control of flux. Symp.Soc.Exp.Biol., 27: 65-104.
Miller, J.H., 1972. Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Nilsson, D., and Johansen, E., 1994. A conserved sequence in tRNA and rRNA promoters of Lactococcus lactis. Biochim.Biophys.Acta, 1219: 141-144.
Schaaff, I., Heinisch, J., Zimmermann, F.K., 1989. Overproduction of glycolytic enzymes in yeast. Yeast, 5: 285-290.
van Asseldonk, M., Simons, A., Visser, H., de Vos, W.M., and Simons, G., 1993. Cloning, nucleotide sequence, and regulatory analysis of the Lactococcus lactis dnaJ gene. J.Bacteriol. 175, 1637-1644.
Claims (57)
- 選択された生物又は生物の群のための人工のプロモーターライブラリーであって、二本鎖 DNAフラグメントのセンス鎖が、前記生物もしくは生物の群からの有効なプロモーターの少くとも2の共通配列又は該共通配列各々の少くとも半分を含む一部分と、ヌクレオベースA,T,C及びGの中から無作偽に少くとも7のヌクレオチドが選択された不定の長さの周囲の又は介在するヌクレオチド配列(スペーサー)と、を含む二本鎖 DNAフラグメントの混合物を含み、但し、以前から周知のプロモーター配列及び天然のソースから単離されたプロモーター配列を含まない、人工のプロモーターライブラリー。
- 前記スペーサー配列中の少くとも10、好ましくは少くとも12、より好ましくは少くとも14のヌクレオチドがヌクレオベースA,T,C及びGの中から無作偽に選択されることを特徴とする請求項1に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記二本鎖 DNAフラグメントのセンス鎖が、前記ライブラリーのプロモーターに特定の調節特性を与える調節 DNA配列を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記特定の調節特性が、増殖条件の変化による活性化であることを特徴とする請求項3に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記二本鎖 DNAフラグメントが、両端の一方又は両方に加えられた制限エンドヌクレアーゼのための1又は複数の認識部位を含む配列を有する請求項1〜4のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記二本鎖 DNAフラグメントが、両端の一方又は両方に加えられた制限エンドヌクレアーゼのための多重認識部位を特定する配列を有することを特徴とする請求項5に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記選択された生物又は生物の群が、原核生物からなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記原核微生物が、ラクトコッカス(Lactococcus )、ストレプトコッカス(Streptococcus )、エンテロコッカス(Enterococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus )、ロイコノストック(Leuconostoc )、エスケリキア(Escherichia )、バチルス(Bacillus)及びシュードモナス(Pseudomonas )属に属するバクテリアからなる群から選択されることを特徴とする請求項7に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記原核微生物が、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)、エスケリキア・コリ(Escherichia coli)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis )及びシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)からなる群から選択されることを特徴とする請求項8に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記共通配列が、−10シグナル(−12〜−7):TATAAT及び該−10シグナルの上流の少くとも1のアクティベータータンパク質結合部位又はその各々の少くとも3の保存されたヌクレオチドを含む一部分を含むことを特徴とする請求項7〜9のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記共通配列が、−35シグナル(−35〜−30):TTGACA及び−10シグナル(−12〜−7):TATAAT又はその各々の少くとも3の保存されたヌクレオチドを含む両方の一部分を含むことを特徴とする請求項7〜9のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記共通配列が、−35シグナルの4〜6の保存されたヌクレオチド及び−10シグナルの4〜6の保存されたヌクレオチド、好ましくは各々5又は6、より好ましくは各々全部で6のヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項11に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記共通配列が、介在する保存されたモチーフを更に含むことを特徴とする請求項10〜12のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記介在する保存されたモチーフが、保存されたモチーフ−44〜−41:AGTT、−40〜−36:TATTC 、−15〜−14:TG、及び+1〜+8:GTACTGTTからなる群から選択されることを特徴とする請求項13に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記−35シグナルと−10シグナルとの間のスペーサーの長さが14〜23bp、好ましくは16〜18bp、より好ましくは17bpであることを特徴とする請求項11〜14のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記二本鎖 DNAフラグメントのセンス鎖が、前記共通配列及びスペーサー長の少数の変異を伴う配列番号:1に記載の縮重した配列を有することを特徴とする請求項11〜15のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 上流温度調節 DNA配列を含む前記二本鎖 DNAフラグメントのセンス鎖が、前記共通配列及びスペーサー長の少数の変異を伴う配列番号:2に示される縮重した配列を有することを特徴とする請求項11〜15のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記選択された生物又は生物の群が、真核生物からなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記真核生物又は生物の群が、真核微生物からなる群から選択されることを特徴とする請求項18に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記真核微生物又は微生物の群が、イースト、他の真菌及び哺乳動物細胞系からなる群から選択されることを特徴とする請求項19に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記真核微生物が、種サッカロマイセス・セレビシアエのイーストであることを特徴とする請求項20に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記共通配列が、TATAボックス及び少くとも1の上流活性化配列(UAS) を含むことを特徴とする請求項18〜21のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記共通配列が、サッカロマイセス・セレビシアエ内で機能する転写開始シグナル(TIボックス)を更に含むことを特徴とする請求項22に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記共通配列が、アルギニンレセプターのための結合部位argRとしても機能する、TATAボックス:TATAAA、 UASGCN4p :TGACTCA 、及びTIボックス:CTCTTAAGTGCAAGTGACTGCGA を含むことを特徴とする請求項23に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- TATAボックスと第1の UASとの間及び存在するなら該第1の UASと次の UASとの間のスペーサーの長さが、1000bpまで、好ましくは10〜500bp 、より好ましくは15〜150bp であることを特徴とする請求項22〜24のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 前記二本鎖 DNAフラグメントのセンス鎖が、前記共通配列及びスペーサー長の少数の変異を伴い配列番号:3に示される縮重した配列を有することを特徴とする請求項22〜25のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー。
- 請求項1〜26のいずれか一に記載の人工のプロモーターから選択された人工のプロモーター。
- 配列番号:5〜58からなる群から選択された DNA配列を含む請求項27に記載のプロモーター。
- 請求項27又は28に記載の人工のプロモーター由来の人工のプロモーター。
- 選択された生物又は生物の群のための人工のプロモーターライブラリーを作製する方法であって、該生物又は生物の群からの有効なプロモーターの少くとも2の共通配列を選択し;該共通配列又はその各々の少くとも半分を含む一部分と、少くとも7のヌクレオチドがヌクレオベースA,T,C及びGの中から無作偽に選択された不定の長さの周囲の又は介在するヌクレオチド配列(スペーサー)と、を含む一本鎖 DNA配列の混合物を合成し;そして該一本鎖 DNA配列を、第2鎖合成により二本鎖 DNAフラグメントに変換することを含む方法。
- 前記スペーサー配列中の少くとも10、好ましくは少くとも12、より好ましくは少くとも14のヌクレオチドがヌクレオベースA,T,C及びGの中から無作偽に選択されることを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 前記一本鎖 DNA配列が、前記ライブラリーのプロモーターに特定の調節特性を与える調節 DNA配列を含むことを特徴とする請求項30又は31に記載の方法。
- 前記特定の調節特性が、増殖条件の変化による活性化であることを特徴とする請求項32に記載の方法。
- 制限エンドヌクレアーゼのための1又は複数の認識部位を特定する配列が前記合成において前記一本鎖 DNA配列の両端の一方もしくは両方に加えられ、又は前記制限部位を含むリンカーが前記二本鎖 DNAフラグメントの両端の一方もしくは両方に連結されることを特徴とする請求項30〜34のいずれか一に記載の方法。
- 制限エンドヌクレアーゼのための複数の認識部位を特定する配列が前記合成において前記一本鎖 DNA配列の両端の一方もしくは両方に加えられ、又は前記多重クローニング部位(MCS) を含むリンカーが前記二本鎖 DNAフラグメントの両端の一方もしくは両方に連結されることを特徴とする請求項34に記載の方法。
- 前記選択された生物又は生物の群が、原核生物からなる群から選択されることを特徴とする請求項30〜35のいずれか一に記載の方法。
- 前記原核微生物が、ラクトコッカス(Lactococcus )、エスケリキア(Escherichia )、バチルス(Bacillus)及びシュードモナス(Pseudomonas )属に属するバクテリアからなる群から選択されることを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 前記原核微生物が、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、エスケリキア・コリ(Escherichia coli)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis )及びシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)からなる群から選択されることを特徴とする請求項37に記載の方法。
- 前記共通配列が、−10シグナル(−12〜−7):TATAAT及び該−10シグナルの上流の少くとも1のアクティベータータンパク質結合部位又はその各々の少くとも3の保存されたヌクレオチドを含む一部分を含むことを特徴とする請求項36〜38のいずれか一に記載の方法。
- 前記共通配列が、−35シグナル(−35〜−30):TTGACA及び−10シグナル(−12〜−7):TATAAT又はその各々の少くとも3の保存されたヌクレオチドを含む両方の一部分を含むことを特徴とする請求項36〜38のいずれか一に記載の方法。
- 前記共通配列が、−35シグナルの4〜6の保存されたヌクレオチド及び−10シグナルの4〜6の保存されたヌクレオチド、好ましくは各々5又は6、より好ましくは各々全部で6のヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項40に記載の方法。
- 前記共通配列が、介在する保存されたモチーフを更に含むことを特徴とする請求項39〜41のいずれか一に記載の方法。
- 前記介在する保存されたモチーフが、保存されたモチーフ−44〜−41:AGTT、−40〜−36:TATTC 、−15〜−14:TG、及び+1〜+8:GTACTGTTからなる群から選択されることを特徴とする請求項42に記載の方法。
- 前記−35シグナルと−10シグナルとの間のスペーサーの長さが14〜23bp、好ましくは16〜18bp、より好ましくは17bpであることを特徴とする請求項40〜43のいずれか一に記載の方法。
- 前記一本鎖 DNA配列の混合物が、前記共通配列及びスペーサー長の少数の変異を伴う配列番号:1に記載の縮重した配列を有することを特徴とする請求項40〜44のいずれか一に記載の方法。
- 上流温度調節 DNA配列を含む前記一本鎖 DNA配列の混合物が、前記共通配列及びスペーサー長の少数の変異を伴う配列番号:2に示される縮重した配列を有することを特徴とする請求項40〜42のいずれか一に記載の方法。
- 前記選択された生物又は生物の群が、真核生物からなる群から選択されることを特徴とする請求項30〜35のいずれか一に記載の方法。
- 前記真核生物又は生物の群が、真核微生物からなる群から選択されることを特徴とする請求項47に記載の方法。
- 前記真核微生物又は微生物の群が、イースト、他の真菌及び哺乳動物細胞系からなる群から選択されることを特徴とする請求項48に記載の方法。
- 前記真核微生物が、種サッカロマイセス・セレビシアエのイーストであることを特徴とする請求項49に記載の方法。
- 前記共通配列が、TATAボックス及び少くとも1の上流活性化配列(UAS) を含むことを特徴とする請求項47〜50のいずれか一に記載の方法。
- 前記共通配列が、サッカロマイセス・セレビシアエ内で機能する転写開始シグナル(TIボックス)を更に含むことを特徴とする請求項51に記載の方法。
- 前記共通配列が、アルギニンレセプターのための結合部位argRとしても機能する、TATAボックス:TATAAA、 UASGCN4p :TGACTCA 、及びTIボックス:CTCTTAAGTGCAAGTGACTGCGA を含むことを特徴とする請求項52に記載の方法。
- TATAボックスと第1の UASとの間及び存在するなら該第1の UASと次の UASとの間のスペーサーの長さが、1000bpまで、好ましくは10〜500bp 、より好ましくは15〜150bp であることを特徴とする請求項51〜53のいずれか一に記載の方法。
- 前記二本鎖 DNAフラグメントのセンス鎖が、前記共通配列及びスペーサー長の少数の変異を伴い配列番号:3に示される縮重した配列を有することを特徴とする請求項51〜54のいずれか一に記載の方法。
- 微生物内の遺伝子の発現を最適化する方法であって、
a)請求項1〜26のいずれか一に記載の人工のプロモーターライブラリー又は請求項30〜55のいずれか一に記載の方法により作製された人工のプロモーターライブラリーから、活性変化の比較的少ないステップにおいて所定範囲のプロモーター活性をカバーする一セットのプロモーターを選択し;
b)該プロモーターのセットを、前記生物内に、各々のクローン内で前記遺伝子を前記セットからの少なくとも1のプロモーターの制御下におくようにクローニングし、
c)前記選択されたクローンを増殖させ、そしてそれを、産物形成の最適な流れを示すものを見出すためにスクリーニングすること
を含む方法。 - 前記選択された生物が、原核及び真核微生物からなる群から選択されることを特徴とする請求項56に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK88696 | 1996-08-23 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP51028798A Division JP2001503249A (ja) | 1996-08-23 | 1997-08-25 | 選択された生物のための人工プロモーターライブラリー及び該ライブラリー由来のプロモーター |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009022293A true JP2009022293A (ja) | 2009-02-05 |
JP4469005B2 JP4469005B2 (ja) | 2010-05-26 |
Family
ID=8098645
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP51028798A Withdrawn JP2001503249A (ja) | 1996-08-23 | 1997-08-25 | 選択された生物のための人工プロモーターライブラリー及び該ライブラリー由来のプロモーター |
JP2008232486A Expired - Lifetime JP4469005B2 (ja) | 1996-08-23 | 2008-09-10 | 選択された生物のための人工プロモーターライブラリー及び該ライブラリー由来のプロモーター |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP51028798A Withdrawn JP2001503249A (ja) | 1996-08-23 | 1997-08-25 | 選択された生物のための人工プロモーターライブラリー及び該ライブラリー由来のプロモーター |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7199233B1 (ja) |
EP (2) | EP2034021A1 (ja) |
JP (2) | JP2001503249A (ja) |
CN (1) | CN1243827C (ja) |
AU (1) | AU3938397A (ja) |
DE (1) | DE69739121D1 (ja) |
DK (1) | DK0934406T3 (ja) |
WO (1) | WO1998007846A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20210163963A1 (en) * | 2018-12-17 | 2021-06-03 | Jiangnan University | Bacillus Subtilis Efficiently-Induced Expression System Based on Artificial Series Promoter |
Families Citing this family (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999002737A1 (en) | 1997-07-14 | 1999-01-21 | Valentis, Inc. | Method for the identification of synthetic cell- or tissue-specific transcriptional regulatory regions |
US6475183B1 (en) | 1998-06-03 | 2002-11-05 | Baxter International Inc. | Direct dual filling device for sealing agents |
ES2335828T3 (es) | 1998-09-25 | 2010-04-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterias corineformes para producir l-glu. |
US6555674B2 (en) | 2000-08-09 | 2003-04-29 | Nsgene A/S | JeT promoter |
EP2157183A1 (en) | 2000-08-25 | 2010-02-24 | BASF Plant Science GmbH | Plant polynucleotides encoding prenyl proteases |
EP1400593A4 (en) * | 2001-06-06 | 2005-04-06 | Takeda Pharmaceutical | NEW PROMOTER |
CN1659282A (zh) | 2002-04-10 | 2005-08-24 | 诺维信公司 | 地衣芽孢杆菌的突变宿主细胞 |
ATE399869T1 (de) | 2002-04-10 | 2008-07-15 | Novozymes As | Verbesserte bacillus-wirtszelle |
US6644365B1 (en) | 2002-04-19 | 2003-11-11 | Baxter International, Inc. | Tilting direct dual filling device |
US20080076678A1 (en) | 2005-06-15 | 2008-03-27 | Philippe Soucaille | Method of creating a library of bacterial clones with varying levels of gene expression |
JP2005523015A (ja) * | 2002-04-22 | 2005-08-04 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | 種々の遺伝子発現レベルを有する細菌クローンのライブラリーを構築する方法。 |
WO2003089621A2 (en) * | 2002-04-22 | 2003-10-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Promoter and plasmid system for genetic engineering |
CA2483006C (en) * | 2002-04-22 | 2013-10-29 | Genencor International, Inc. | Methods of creating modified promoters resulting in varying levels of gene expression |
DK1546304T3 (da) | 2002-10-04 | 2013-08-05 | Danisco Us Inc | Forbedret produktion af bakteriestammer |
US20050079617A1 (en) | 2003-10-03 | 2005-04-14 | Cervin Marguerite A. | Glucose transport mutants for production of biomaterial |
WO2004046387A1 (en) * | 2002-11-15 | 2004-06-03 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for analysis of regulatory sequences |
JP4821606B2 (ja) | 2003-03-12 | 2011-11-24 | 味の素株式会社 | 効率的にL−グルタミン酸を生産するためのプロモーター変異による細菌のsucAB発現の最適化 |
WO2006116400A2 (en) | 2005-04-27 | 2006-11-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Promoter engineering and genetic control |
US20070294785A1 (en) * | 2006-06-13 | 2007-12-20 | Athenix Corporation | Methods for generating genetic diversity by permutational mutagenesis |
WO2008027558A2 (en) | 2006-08-31 | 2008-03-06 | Codon Devices, Inc. | Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits |
CN101600800B (zh) | 2006-11-29 | 2013-08-28 | 埃塞尼克斯公司 | 改良的grg23 epsp合酶:组合物和使用方法 |
US7618801B2 (en) | 2007-10-30 | 2009-11-17 | Danison US Inc. | Streptomyces protease |
CN101981193B (zh) | 2008-03-28 | 2016-05-11 | 丹尼斯科美国公司 | 在细菌细胞中扩增基因座的方法 |
AR076941A1 (es) | 2009-06-11 | 2011-07-20 | Danisco Us Inc | Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina |
EP2311961A1 (en) * | 2009-10-15 | 2011-04-20 | DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum | Model-guided random assembly PCR for the synthesis of eukaryotic promoters |
US20120315670A1 (en) | 2009-11-02 | 2012-12-13 | Gen9, Inc. | Compositions and Methods for the Regulation of Multiple Genes of Interest in a Cell |
WO2012064975A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | Gen9, Inc. | Protein arrays and methods of using and making the same |
EP2638157B1 (en) | 2010-11-12 | 2015-07-22 | Gen9, Inc. | Methods and devices for nucleic acids synthesis |
CN102286517B (zh) * | 2011-06-10 | 2016-08-03 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 利用人工调控元件及其文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法 |
IL302248A (en) | 2011-08-26 | 2023-06-01 | Gen9 Inc | Preparations and methods for high-fidelity assembly of nucleic acids |
EP2573172A1 (en) | 2011-09-21 | 2013-03-27 | Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf | Means and methods for rhamnolipid production |
US9150853B2 (en) | 2012-03-21 | 2015-10-06 | Gen9, Inc. | Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis |
CA2871505C (en) | 2012-04-24 | 2021-10-12 | Gen9, Inc. | Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning |
EP2864531B2 (en) | 2012-06-25 | 2022-08-03 | Gen9, Inc. | Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing |
WO2014159850A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Codexis, Inc. | Low-phosphate repressible promoter |
EP3320088A1 (en) | 2015-07-08 | 2018-05-16 | Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen (RWTH) | Extracellular production of designer hydroxyalkanoyloxy alkanoic acids with recombinant bacteria |
CN105296486B (zh) * | 2015-11-18 | 2019-04-26 | 湖北大学 | 一种启动子文库构建方法和强启动子 |
US9988624B2 (en) * | 2015-12-07 | 2018-06-05 | Zymergen Inc. | Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform |
US11208649B2 (en) * | 2015-12-07 | 2021-12-28 | Zymergen Inc. | HTP genomic engineering platform |
CN105603537A (zh) * | 2016-03-11 | 2016-05-25 | 南京工业大学 | 一种启动子文库的构建方法及其应用 |
JP2020524492A (ja) * | 2017-06-07 | 2020-08-20 | ザイマージェン インコーポレイテッド | Corynebacterium glutamicum由来のプロモーターおよび補助遺伝子発現の制御におけるその使用 |
CN108118059B (zh) * | 2017-12-30 | 2021-03-19 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种改进的启动子及其组成的载体和应用 |
EP3546582A1 (en) * | 2018-03-26 | 2019-10-02 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Promoter activating elements |
CN110317807A (zh) * | 2018-03-29 | 2019-10-11 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种谷氨酸棒杆菌人工启动子文库 |
JP2023506254A (ja) * | 2019-12-16 | 2023-02-15 | ギンゴー バイオワークス, インコーポレイテッド | ヒスチジン、プリン経路代謝生成物およびプラスミドdnaの産生増強 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9215550D0 (en) | 1992-07-22 | 1992-09-02 | Celltech Ltd | Protein expression system |
AU6776194A (en) * | 1993-04-28 | 1994-11-21 | Hybritech Incorporated | Method for creating optimized regulatory regions affecting protein expression and protein trafficking |
-
1997
- 1997-08-25 DK DK97936613T patent/DK0934406T3/da active
- 1997-08-25 EP EP08169178A patent/EP2034021A1/en not_active Ceased
- 1997-08-25 US US09/242,657 patent/US7199233B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-25 DE DE69739121T patent/DE69739121D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-25 AU AU39383/97A patent/AU3938397A/en not_active Abandoned
- 1997-08-25 JP JP51028798A patent/JP2001503249A/ja not_active Withdrawn
- 1997-08-25 CN CNB971987033A patent/CN1243827C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-25 EP EP97936613A patent/EP0934406B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-25 WO PCT/DK1997/000342 patent/WO1998007846A1/en active Application Filing
-
2008
- 2008-09-10 JP JP2008232486A patent/JP4469005B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20210163963A1 (en) * | 2018-12-17 | 2021-06-03 | Jiangnan University | Bacillus Subtilis Efficiently-Induced Expression System Based on Artificial Series Promoter |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK0934406T3 (da) | 2009-01-26 |
DE69739121D1 (de) | 2009-01-02 |
CN1243827C (zh) | 2006-03-01 |
CN1233287A (zh) | 1999-10-27 |
WO1998007846A1 (en) | 1998-02-26 |
US7199233B1 (en) | 2007-04-03 |
JP4469005B2 (ja) | 2010-05-26 |
EP0934406B1 (en) | 2008-11-19 |
EP2034021A1 (en) | 2009-03-11 |
JP2001503249A (ja) | 2001-03-13 |
EP0934406A2 (en) | 1999-08-11 |
AU3938397A (en) | 1998-03-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4469005B2 (ja) | 選択された生物のための人工プロモーターライブラリー及び該ライブラリー由来のプロモーター | |
Reznikoff et al. | The regulation of transcription initiation in bacteria | |
Reverchon et al. | Characterization of kdgR, a gene of Erwinia chrysanthemi that regulates pectin degradation | |
US6808896B2 (en) | Method for stable chromosomal multi-copy integration of genes | |
US5300431A (en) | Positive selection vector for the bacteriophage P1 cloning system | |
Kaminski et al. | The expression of nifA in Azorhizobium caulinodans requires a gene product homologous to Escherichia coli HF-I, an RNA-binding protein involved in the replication of phage Q beta RNA. | |
US5837509A (en) | Recombinant lactic acid bacterium containing an inserted promoter and method of constructing same | |
AU675821B2 (en) | Recombinant lactic acid bacterium containing an inserted promoter and method of constructing same | |
US5529908A (en) | Lactococcus promoters and signal sequences for heterologous gene expression in bacteria | |
EP0925364B1 (en) | A lactic acid bacterial regulatable expression system | |
HU201116B (en) | Process for producing plasmids having uncontrolled replication conduct under given circumstances | |
Lewis et al. | Interaction of LexA repressor with the asymmetric dinG operator and complete nucleotide sequence of the gene | |
EP0228726B1 (en) | Method for preparing proteins using transformed lactic acid bacteria | |
WO2004018635A2 (en) | Myxococcus xanthus bacteriophage mx9 transformation and integration system | |
EP0310619B1 (en) | Light inducible promoter | |
US6929931B1 (en) | Expression contructs using Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis lac repressor protein and its lac repressor binding site, microorganisms and methods thereof | |
US20030027286A1 (en) | Bacterial promoters and methods of use | |
WO2000068253A1 (en) | Dna promoter sequence for gene expression | |
Ouimet et al. | Transcription reporters that shuttle cloned DNA between high-copy Escherichia coli plasmids and low-copy broad-host-range plasmids | |
US20050042756A1 (en) | Intergenic and intragenic integration sites for foreign gene expression in recombinant S. gordonii strains | |
WO2002051982A2 (en) | Bacterial promoters and methods of use | |
JPS60188073A (ja) | バチルス・ブレビスを宿主とするプラスミド | |
Nærdal et al. | Combinatorial Mutagenesis and Selection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090623 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090916 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091105 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091224 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100126 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100225 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130305 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130305 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140305 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |