JPS63214189A - Ｌ―グルタミン酸の製造方法 - Google Patents

Ｌ―グルタミン酸の製造方法

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JPS63214189A
JPS63214189A JP62047759A JP4775987A JPS63214189A JP S63214189 A JPS63214189 A JP S63214189A JP 62047759 A JP62047759 A JP 62047759A JP 4775987 A JP4775987 A JP 4775987A JP S63214189 A JPS63214189 A JP S63214189A
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glutamic acid
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幹夫 藤井
Yukihiro Nakajo
幸博 中條
Kenichiro Fujino
藤野　憲一郎
Hirohiko Takeda
裕彦 竹田
Katsuya Fukami
克哉 深見
Takenori Honmachi
本町　武徳
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野 本発明は遺伝子工学的手法により育種したグルタミン酸
生産性コリネ型細菌と該細菌を用いるし一グルタミン酸
の製造方法に関する。
（従来の技術） Ｌ−グルタミン酸は調味料として幅広い用途があり、グ
ルタミン酸生産性コリネ型細菌を培養して該細菌にＬ−
グルタミン酸を生産せしめ、生成するＬ−グルタミン酸
を該細菌の培養物から分離する発酵法により工業的に生
産されている．発酵法により工業的にＬ−グルタミン酸
を生産するのに用いられているグルタミン酸生産性コリ
ネ型細菌としては、ブレビバクテリウム属，コリネバク
テリウム属およびミクロバクテリウム属細菌が知られて
いる．これらの細菌を用いてグルタミン酸を製造する際
には、発酵終了時のＬ−グルタミン酸の培地中への蓄積
濃度を高めること、および使用原料（Ｗ）当りのグルタ
ミン酸の生成量（対糖収率）を向上させることが工業的
に重要である。
上記目的を達成するために、生産菌の育種改良が種々検
討されている．たとえば、グルタミン酸のアナログ（構
造類似体）またはグルタミン酸生合成経路の各種中間体
のアナログ等に耐性を示す菌株を作製することにより、
各種酵素活性のフィードバック阻害や抑制の解除された
菌株を育種する方法．またグルタミン酸生合成経路の途
中より分岐して副生産物の合成に向かう経路の酵素活性
の低下した菌株を育種する方法等が試みられている。
一方、グルタミン酸生合成に関与する酵素の活性を強化
することによりＬ−グルタミン酸の生産速度を高めると
ともに効率良くＬ−グルタミン酸を生成させる試みも近
年行われるようになり、この目的省達成するためにグル
タミン酸の生合成経路に関与する各種酵素遺伝子のクロ
ーニングが行われつつある．本発明者らは既にグルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌の一種であるコリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍ
ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１株（微工研条寄第５５８
号）のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（特願昭６
Ｏ−２９２５８４）。
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（特願昭６Ｏ−８
１５８）、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝・−子（特願
昭６ｌ−１３６０８３）、クエン酸シンターゼ遺伝子（
特願昭６ｌ−２７９８８８）、およびオスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（特願昭６ｌ−１０４
７６８）のクローニングに成功しており、これら遺伝子
をそれぞれ単独で含むＤＮＡ断片とコリネバクテリウム
・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　＋ｍ
ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）のベクタープラスミドとの組換
えプラスミドを各々構築後。
形質転換によりコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏ
ｒ　ｎａｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｗ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ）に移入して、各酵素活性がそれぞれ強化された菌株
を各々作製することに成功し、これらの菌株を用いて発
酵法によりＬ−グルタミン酸を製造することを試みた。
（本発明が解決しようとする問題点） しかしながら、上記の各酵素活性がそれぞれ強化された
菌株を用いて発酵法により得られるＬ−グルタミン酸の
生産量や収率についてはまだまだ十分に満足のいくもの
ではなく、更にＬ−グルタミン酸の生産性を向上させる
ことが望まれていた。
しかしながら、Ｌ−グルタミン酸発酵においてその生産
性を十分向上することのできる菌株については、これま
でに報告された例がなかった。
（問題点を解決するための手段および作用）本発明者ら
は上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グルタ
ミン酸生合成経路に関与する酵素遺伝子のうち、少なく
とも２種以上の酵素遺伝子を組換えＤＮＡ技術を用いる
ことにより同時に強化した種々の菌株を作製することに
成功し、これらの菌株を用いてグルタミン酸発酵を行っ
たところ、少なくともグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（
Ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：　
Ｇ　Ｄ　Ｈ）遺伝子とイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（
Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｄｅ−ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
：　Ｉ　ＣＤ　Ｈ）遺伝子を含む少なくとも２種以上の
グルタミン酸生合成経路に関与するグルタミン酸生産性
コリネ型細菌由来の酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで
形質転換された菌株を用いてグルタミン酸発酵を行なっ
た場合には親株を使用した場合に比較して培地中へのＬ
−グルタミン酸の蓄積レベルのみならず対糖収率も著し
く向上していることを見出し、本発明を完成するに到っ
た。
即ち１本発明によれば、グルタミン酸生合成経路に関与
するグルタミン酸生産性コリネ型細菌由来の酵素遺伝子
のうち、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍ
ａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：　Ｇ　Ｄ　Ｈ）
遺伝子およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｓｏ−
ｃｉｔｒａｔａ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：　Ｉ　
ＣＤ　Ｈ）　４伝子を含む少なくとも２種の酵素遺伝子
を含有する組換え体ＤＮＡを保有するグルタミン酸生産
性コリネ型細菌が提供される。
また、本発明によれば、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌を培養する発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造方法
において、グルタミン酸生産性コリネ型細菌としてグル
タミン酸生合成経路に関与するグルタミン酸生産性コリ
ネ型細菌由来の酵素遺伝子のうち、グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍａｔａ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅ
ｎａｓｅ：　Ｇ　Ｄ　Ｈ）遺伝子およびイソクエン酸デ
ヒドロゲナーゼ（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅｄｅｈｙｄｒｏ
ｇｅｎａｓｅ：　Ｉ　ＣＤ　Ｈ）遺伝子を含む少なくと
も２種の酵素遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡを保有す
るグルタミン酸生産性コリネ型細菌を用いることを特徴
とするＬ−グルタミン酸の製造方法が提供される。
本発明において、グルタミン酸生合成経路に関与する酵
素゛遺伝子として用いる遺伝子としては。
グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｗａｔａ　ｄｅｈｙｄｒｏ
ｇｅｎａｓｅ：ＧＤＨ）遺伝子、イソクエン酸デヒドロ
ゲナーゼ（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｄａｈｙｄｒｏｇｅ
ｎａｓｅ：　Ｉ　ＣＤ　Ｈ）遺伝子、アコニット酸ヒド
ラターゼ（Ａｃｏｎｉｔａｔｅ　ｈｙｄｒａｔ−ａｓｅ
：ＡＨ）遺伝子、およびクエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒ
ａｔｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ：　ＣＳ　）遺伝子が挙げら
れる。
本発明においては、Ｌ−グルタミン酸の生産性の点から
、これらの酵素遺伝子のうち少なくともＧＤＨ遺伝子お
よびＩＣＤＨ遺伝子を必ず含む２種類以上の酵素遺伝子
を組合わせて用いる。
本発明のグルタミン酸生産性コリネ型細菌は前記酵素遺
伝子の少なくとも２種を含有する組換え体ＤＮＡを保有
する細菌である。前記酵素遺伝子の少なくとも２種を含
有する組換え体ＤＮＡは、前記酵素遺伝子の各々を含む
ＤＮＡ断片を複製可能なベクターに組み入れることによ
って得ることができる。複製可能なベクターとしては、
グルタミン酸生産性コリネ型細菌の宿主−ベクター系で
用いられるベクター、例えば、プラスミドｐＡＧ１＋プ
ラスミドｐＡＧ３．プラスミドＰＡＧ５０及びそれらの
プラスミドより由来するプラスミドなどが挙げられる。
前述の各酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片は、通常の公知の
宿主−ベクター系を用いてグルタミン酸生産性コリネ型
細菌から分離することができる。
用いることのできる宿主−ベクター系の宿主としては１
例えば、大腸菌〔エシエリヒア・コリ（ハｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ））が挙げられる。大腸菌としては例
えばエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）　Ｋ１２株及びその変異株を挙げることができる
。その大腸菌又はその変異株を宿主として用いる宿主−
ベクター系において使用するベクターとしては上記大腸
菌又はその変異株を形質転換するために通常用いられる
公知のプラスミドを挙げることができる。また、宿主−
ベクター系として枯草菌の宿主−ベクター系、例えば、
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ）１６８の変異株を宿主として、そして該細菌に
適合するプラスミドをベクターとして用いる宿主−ベク
ター系や、グルタミン酸生産性コリネ型細菌を宿主とし
て、そして該細菌に適合するプラスミドをベクターとし
て用いる宿主−ベクター系を用いることもできる。グル
タミン酸生産性コリネ型細菌由来のＧＤＨ遺伝子、ＩＣ
ＤＨ遺伝子、ＡＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子をそれぞれ含む
ＤＮＡ断片は以下のようにして得ることができ゛る。
（１）　　グルタミン酸生産性コリネ型細菌の菌体より
全ＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断する。全ＤＮＡの抽
出は、通常用いられている方法（リゾチウム・ＳＤＳ処
理とフェノール・クロロホルム処理）により行うことが
できる。全ＤＮＡの切断に用いる制限酵素としては、上
記細菌の全ＤＮＡを適当に切断でき、かつ本目的に使用
する大腸菌。
枯草菌又はグルタミン酸生産性コリネ型細菌等のベクタ
ーの開裂に用いることができる制限酵素であればいずれ
も使用可能である。この除用いる制限酵素が目的遺伝子
の内部を切断するかどうかは事前に不明なので適当な条
件で制限酵素を弱く作用させ、ＤＮＡを部分的に分解す
ることにより目的遺伝子を完全に含む様な適当な大きさ
のＤＮＡ断片が得られる。
（２）ベクターＤＮＡを制限酵素で切断・開裂させる。
ベクターＤＮＡの開裂は、ベクターＤＮＡに適当な制限
酵素を充分作用させることにより行なう。
（３）ベクターＤＮＡの開裂部位に（１）で得たＤＮＡ
断片を組み込ませ、閉環した組換え体ＤＮＡをつくる。
ベクターＤＮＡの開裂部位にＤＮＡ断片を組み込ませる
には、公知の常法例えばマニアティスらの方法〔ティー
・マニアティス、イー・エフ・フリッチュ、ジェイ・サ
ンプルツク：モレキュラー　クローニング　ア　ラボラ
トリ−マニュアル、コールド　スプリング　ハーバ−ラ
ボラトリ−、コールド　スプリング　ハーバ−エフ・ワ
イ・１９８２　（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ
１ｔｓｃｈ、Ｊ。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎ−ｕａ
ｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｎ
、Ｙ、　１９８２）　）を用いることができる。
（４）組換え体ＤＮＡを宿主に移入する。宿主となる菌
株は、目的遺伝子をクローニングした場合宿主の表現型
に変化が現れるものであれば、いずれでも用いることが
できる。一般には、その様な変異株を使用する必要があ
る。たとえば、ＧＤＨ遺伝子をクローニングする場合に
は、宿主となる菌株はＧＤＨ活性を欠損している必要が
ある。同様に、ＩＣＤＨ遺伝子、ＡＨ遺伝子及びＣＳ遺
伝子をそれぞれクローニングする場合には、各々宿主と
してはＩＣＤＨ，ＡＨ及びＣＳ活性を欠損している必要
がある。そうすれば宿主はグルタミン酸を生育の為に要
求する。従って、例えばＧＤＨ遺伝子のクローニングの
場合前述のＧＤＨ欠損体を用いると外来のＧＤＨ産生逍
伝子を含むＤＮＡ断片が移入されると、その宿主はグル
タミン酸を生育に要求しなくなり他と識別することがで
きる。
ＧＤＨ欠損株を育種する場合には細菌をＮ−メチル−Ｎ
′−二トローＮ−二トロソグアニジン（Ｎ−Ｎｅｔｈｙ
ｌ　−Ｎ’　−ｎｉｔｒｏ　−Ｎ　−ｎｉｔｒｏｓｏｇ
ｕａｎｉｄｉｎｅ　、　ＮＴＧ）を用いて、公知の常法
に従って変異処理し、さらに公知の常法に従ってＬ−グ
ルタミン酸要求株を分離し、それらの酵素活性測定試験
を経て、ＧＤＨ欠損株を取得することができる。ＮＴＧ
変異処理の代りに、他の公知の変異誘導法〔例えば、紫
外線照射、Ｘ線照射、その他の変異誘起剤処理、挿入配
列（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ：　Ｉ　Ｓ
　）やトランスポゾン（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）による
変異誘−導等〕を用いることもできる。ＩＣＤＨ欠損株
、ＡＨ欠損株、ＣＳ欠損株についても同様の方法により
得ることができる。また、研究者や公的機関より分譲さ
れたＧＤＨ欠損株、ＩＣＤＨ欠損株、ＡＨ欠損株及びＣ
Ｓ欠損株を使用することもできる。宿主に選定した菌株
が、制限能を有している場合には、その宿主にベクター
ＤＮＡを一旦移入し、得られた形質転換株より調製した
ベクターＤＮＡを前記（２）で泪いる必要がある０組換
え体ＤＮＡの移入は、公知の方法例えばマンデルらの方
法（マンデル、エム０．ヒガ、エイ、ニジエイ、モル、
パイオル、。
５３巻１５９−１６２頁１９７０年（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ
、、Ｈｉｇａ、Ａ、：Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、、　５３，１５９−１６２（１９７０）））
あルイはチヤツプとコーエンの１（チヤツプ、ニス０、
コーエン、ニス、エフ、：モレキュラーアンドジエネラ
ルジェネティクス、１６８巻１１１−１１５頁、１９７
９年（Ｃｈａｎｇ、　Ｓ、、Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、：
Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、１６８，１１１−１１
５　（１９７９）　）のプロトプラストを用いる方法に
よって行なうことができる。
（５）得られた形質転換体の中から目的遺伝子を有する
菌株を選択分離する。上記の工程によって得られる菌株
の中で目的遺伝子を有するものはごくわずかなので目的
とする菌株を選択する必要がある。−次選択方法として
は、目的遺伝子が移入された菌株の表現型の変化を検出
できる培地で前記（４）で得られた菌体を常法通り培養
する。その結果予定の変化の現れた菌体を選択分離する
ことができる。前記の宿主でＧＤＨ産生遺伝子をクロー
ニングする場合には、グルタミン酸無添加合成培地上で
生育する菌株を選択する。最終的に目的遺伝子をクロー
ニングした菌株を選択するには目的遺伝子の産物の有無
を調べる。その結果により目的の菌株が選択できる。目
的遺伝子が酵素遺伝子の場合にはその酵素活性を測定す
る。ＧＤＨ産生遺伝子をクローニングする場合には、グ
ルタミン酸無添加合成培地で生育した菌株について、そ
れらの細胞抽出液を用いて常法によりＧＤＨ活性を測定
する。その結果、ＧＤＨ活性を有する形質転換株を分離
し、該株を培養することによりＧＤＨ産生遺伝子を含む
ＤＮＡ断片をクローニングすることができる。ＩＣＤＨ
遺伝子、ＡＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子をクローニングする
場合は、それぞれＩＣＤＨ活性、ＡＨ活性及びｃＳ活性
を測定して、各活性をそれぞれ有する形質転換株を分離
する以外は上記と同様の方法によりそれぞれの遺伝子を
含むＤＮＡ断片をクローニングすることができる。
目的の酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片は、上述のようにし
て得られる形質転換株から次のようにして分離すること
ができる。まず、得られた形質転換体から該ＤＮＡ断片
を含有する組換え体ＤＮＡを公知の常法によって分離す
る１次に得られた組換え体ＤＮＡを制限酵素で処理して
、ベクターＤＮＡと目的の酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片
とに切断し、次にこれらの制限酵素処理試料を、アガロ
ースゲル電気泳動に供する。その後、目的の分子の長さ
を有するＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを切り出し、
それぞれのアガロースゲルを溶かした後、フェノール抽
出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出
、エタノール沈殿により、目的の酵素遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を分離することができる。
このようにして得られるＧＤＨ遺伝子、ＩＣＤＨ遺伝子
、ＡＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子をそれぞれ含むＤＮＡ断片
を用いて本発明の細菌を調製することができる０本発明
の細菌を調製は下記の方法によって行うことができる。
（１）グルタミン酸生合成経路に関与する前記酵素遺伝
子即ちＧＤＨ遺伝子、ＩＣＤＨ遺伝子、ＡＨ遺伝子及び
ＣＳ遺伝子をそれぞれ含有するＤＮＡ断片は前述したよ
うに、それらの遺伝子を含む組換え体ＤＮＡをそれぞれ
該組換え体ＤＮＡを保持する形質転換株から分離生成す
る０組換え体ＤＮＡの分離は、該菌株を適当な培地で培
養後公知の常法たとえば塩化セシウムとエチジウムブロ
マイドを用いた密度勾配超遠心法により行うことができ
る。
（２）まずＧＤＨ遺伝子とＩ　ＣＤＨ″ｉｉ伝子を同時
に保有した組換え体ＤＮＡを作製する。この場合。
前述のように目的の酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡか
ら上記酵素遺伝子をそれぞれ含むＤＮＡ断片を分離し、
上記酵素遺伝子を各々含有するＤＮＡ断片を前述の複製
可能な発現ベクターに同時にあるいは順次組入れて目的
とする組換え体ＤＮＡを作製することができる。また、
既にどちらか一方の酵素遺伝子を含んだ前記（１）項で
得られる組換え体ＤＮＡをベクターとして新たに付加す
べき他方の酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を該組換え体の
適当な制限酵素切断部位に組込むこともできる。この場
合に用いる制限酵素は、組込むべき遺伝子を含む断片を
切り出すことができ、かつベクタープラスミドの機能発
現や既に組み込まれている酵素遺伝子の発現に影響を与
えない部分を切断し開裂させるようなものを選択する必
要がある。
組込むべきＤＮＡ断片と開裂したベクタープラスミドＤ
ＮＡを混合後、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼでこれらを結合さ
せ組換え体ＤＮＡを調製し、これを宿主菌であるグルタ
ミン酸生産性コリネ型細菌に移入する。ＤＮＡの宿主菌
への移入は、プロトプラストを用いる形質転換法により
行うことができる。′４られた形質転換株の中に全て目
的の組換え体ＤＮＡが含まれているとは限らないので、
複数個の形質転換株からそれぞれ組換え体ＤＮＡを抽出
後、それらの構造を制限酵素を用いた解析により決定す
る。目的の組換え体ＤＮＡは、数十個から数百側の形質
転換株を調べることにより分離することができる。
（３）目的の組換え体ＤＮＡを保持する形質転換株につ
いて、確認のために組換え体ＤＮＡ上の各遺伝子の形質
発現を調べる。形質発現は、形質転換株の目的とする各
酵素活性を、組換え体ＤＮＡを保持しない宿主菌の酵素
活性と比較することで簡単に調べることができる。
以上のようにして、ＧＤＨＩ伝子及びＩ　ＣＤＨ遺伝子
の２種の酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有するグ
ルタミン酸生産性コリネ型細菌が得られる。
（４）　このようにして得られた本発明の組換え体ＤＮ
Ａを前記工程（２）においてベクターとして用いて、前
記（１）から（３）までの操作を繰返してＡＨ遺伝子を
含むＤＮＡ断片および／またはＣＳ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を更に組入れることにより、少なくともＧＤＨとＩ
ＣＤＨを含む２種乃至４種の酵素が同時に強化された本
発明の菌株（以下しばしば多重強化株と称する）を構築
することができる。
以下に代表的な例として、コリネバクテリウム・メラセ
コラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓ
ｅｃｏｌａ）　８０１（微工研条寄第５５８号）を上記
酵素遺伝子のＤＮＡ供与体および宿主として用いた場合
の多重強化株の作製につき詳しく説明する。
多重強化株を作製する際の材料となる組換えプラスミド
として、ＧＤＨＪ伝子を含むｐＡＧｌｏｏｌ。
ＩＣＤＨ遺伝子を含むＰＡＧ３００１、ＡＨＩ伝子を含
むｐＡＧ５００１、およびＣＳ遺伝子を含むＰＡＧ４０
０３等が挙げられる。これらプラスミドの制限酵素によ
る切断点地図は第１図から第４図に示されている通りで
あり、グルタミン酸生産性コリネ型細菌のベクタープラ
スミドｐＡＧ５０の中にそれぞれＧＤＨｆｉ伝子を含む
断片、ＩＣＤＨ遺伝子を含む断片、ＡＨ遺伝子を含む断
片、またはＣ５遺伝子を含む断片が組込まれたものであ
る。ベクタープラスミドＰＡＧ５０は本発明者らが特開
昭６１−１０４７９１で示したプラスミドであり、また
各種遺伝子を含む組換えプラスミドの詳細もそれぞれ特
願昭６０−２９２５８４（ＧＤＨ）、特願昭６０−８１
５８　（Ｉ　ＣＤＨ）　、特願昭６１−１３６０８３　
（Ａ　Ｈ）および特願昭６１−２７９８８８（ＣＳ）に
本発明者らによって記述されている。尚、これらのプラ
スミドは後述の実施例に記載の方法によって調製するこ
とができる。最終的に構築されるべき組換え体ＤＮＡで
、本発明のグルタミン酸生産性コリネ型細菌が保有する
組換え体ＤＮＡの例としては、後述のプラスミドｐＩＧ
１０１．ＰＡＩＧ３２１゜ｐｃＩＧ２３１．ｐＣＡＩＧ
４等が挙げられる。　ｐＩＧｌｏｌはｐＡＧ５０にグル
タミン酸生産性コリネ型細菌由来のＧＤＨ遺伝子とＩＣ
ＤＨ遺伝子が同時に組込まれたものである。　ｐＡＩＧ
３２１は同時にＡＨ遺伝子、ＩＣＤＨ遺伝子およびＧＤ
Ｈ遺伝子が同時に組込まれたものである。また、　ｐｃ
ＩＧ２３１は同時にＣＳ、ＩＣＤＨ，ＧＤＨの３種の酵
素の遺伝子がＰＡＧ５０に同時に組込まれたものである
。さらにｐＣＡＩＧ４はｐＡＧ５０にＣＳ、ＡＨｌＩＣ
ＤＨ，およびＧＤＨの４種の酵素の遺伝子が同時に組込
まれたものである。これらプラスミドを用いてグルタミ
ン酸生産性コリ木型細菌を宿主として形質転換すること
により。
本発明のグルタミン酸生産性コリネ型細菌である目的の
多重強化株を得ることができる。上記組換えプラスミド
ＰＩＧＩＯＩ、　ＰＡＩＧ３２１．　ＰＣＩＧ２３１．
　ｐＣＡＩＧ４に限らず、グルタミン酸生産性コリネ型
細菌のうち宿主−ベクター系として用いられているもの
であるならば該菌株をＤＮＡ供与菌としてかつ組換え体
ＤＮＡの宿主として使用することで上記と同様の多重強
化株が作製し得ることは明白である。
本発明のグルタミン酸生産性コリネ型細菌の宿主として
は、上記のコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　
ｎｅｂａｃｔａｒｉｕｍ　＋５ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
　８０１株及びその他のコリネバクテリウム属に属する
細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒａｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）　＠に属する細菌およびミクロバクテリウム（Ｍ
ｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌を用いる
ことができる。
このようにして得られた本発明の多重強化株を用いてグ
ルタミン酸発酵を行なってＬ−グルタミン酸を製造する
方法は、公知の従来のグルタミン酸生産菌を使用する場
合とほとんど同じである。
すなわちグルコース、シュークロース等の糖類もしくは
糖類を含有したデンプンの加水分解物または糖蜜、エタ
ノール等のアルコール類、酢酸等の有機酸を炭素源とし
て、またアンモニアや尿素等を窒素源として使用し、そ
の他の副原料としてビオチンやチアミン等のビタミン類
、リン酸またはリン酸化合物、無機金属塩等を添加した
培地で培養すれば良い、また組換え体ＤＮＡの脱落を防
止する為に必要に応じて抗生物質等の薬剤（複製可能な
ベクターとして用いられるベクタープラスミドに耐性因
子としてコードされているもの）を添加しても良い。培
養を行う装置としては試験管やフラスコ、ジャーファー
メンタ−等が使用可能であり工業化スケールで運転する
ことも当然可能である。しかしながら、実験室レベルで
各種菌株のＬ−グルタミン酸生産能力を比較する場合に
は。
ｐＨの自動調整ができ、かつ原料の炭素源や窒素源を培
養途中で容易に補添することのできるジャーファーメン
タ−を用いることが望ましい、グルタミン酸発酵におい
ては、培地中に著量のＬ−グルタミン酸を蓄積させる為
に微生物の膜透過性を良くする必要があるが、これも公
知の従来の方法と同じく培地中のビオチン濃度を制御す
る方法、培養途中にペニシリンや界面活性剤等の薬剤を
添加する方法が有効である。用いる培地のＰＨは通常６
．０〜８．０、好ましくは７．０〜７．６である。
本発明の製造方法において１本発明のグルタミン酸生産
性コリネ型細菌の培養を行なう際の温度は２５〜３８℃
、好ましくは３０〜４０℃であり、主培養として２０〜
５０時間、好ましくは２８〜３６時間培養を行なう。培
養の方法としては好気的であればよく、振盪培養でも通
気攪拌振培養でもよい、培養により、培養液中に本発明
のグルタミン酸生産性コリネ型細菌の発酵作用によって
Ｌ−グルタミン酸がＭｕされる。
培養終了後、得られる培養発酵液からＬ−グルタミン酸
を単離する。Ｌ−グルタミン酸を培養液から単離する方
法としては、公知の常法で行うことができる０例えば、
菌体を遠心分離等で除去した後、イオン交換樹脂を用い
る方法、等電点晶析する方法等公知の方法で効率良く単
離することができる。
以下実施例により本発明の詳細な説明するが、本発明が
以下の実施例に限定されるものでないことは云うまでも
ない。
（以下余白） （実施例） 実施例１ 本実施例では、グルタミン酸生産性コリネ型細菌で、Ｇ
ＤＨとＩＣＤＨの活性が同時に強化された２重強化株を
作製した例を示す。
ＧＤＨ遺伝子およびＩＣＤＨ遺伝子を含む組換えプラス
ミドとしてそれぞれｐＡＧｌｏｏｌおよびＰＡＧ３００
１を使用した。これらプラスミドはそれぞれＣｏｒ−ｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　８０
１菌由来のＧＤＨ逍伝子を含む約５．４Ｋｂ　（キロベ
ース）のＥｃｏＲＩ断片がｑｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕ＋ｗ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　８０１菌のベクター
プラスミドｐＡＧ５０のＥｃｏＲＩ切断部位に組込まれ
たもの。
およびＣｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｗ　ｍｅｌａｓ
ｓｅｃｏｌａ　８０１由来のＩＣＤＨ遺伝子を含む約３
．３Ｋｂの５ａｌＩ断片が上述のプラスミドｐＡＧ５０
の５ａｌＩ切断点に組込まれたものである。　Ｃｏｒ　
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　８
０１は微生物工業技術研究所（微工研）に微工研条寄５
５８号として寄託されている。組換えプラスミドの作製
は全て前述の蝕互朋胎Ｊ旦吐肌ｍｅｌａｓｓａｃｏｌａ
８０１を宿主菌として使用した。
〔１〕　組換えプラスミドＰＡＧ１００Ｉの調製（１）
コリネバクテリウム・メラセコラ（釦Ω’ｎｅ−ｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　＋ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８０１　
　（微工研条寄第５５８号）からの全ＤＮＡの調製とそ
の切断糖蜜培地（ビート廃糖蜜８０ｇＩＱ、阿ｇｓ０４
・７Ｈ２００，５ｇ／　Ｑ、尿素８ｇＩＱ、リン酸１．
５ｇ／Ｑ、を含む水溶液をｐＨ６，２に調整後１２０”
Ｃ２１５分間殺菌して調製する）１００ｍｆｉに、コリ
ネバクテリウム―メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｍａｌａｓｅｅｏｌａ）８０１（微工研条寄
第、５５８号）を植菌し、３２℃にて一晩振盪培養した
。得られた培養液より菌体を集め、洗浄した後、１０ｍ
１ｆ　　トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｊ２　ＣｐＨ８，０
）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ（７）緩衝液８ｍｆｆｉＬｍ懸
濁した。これにリゾチウムを最終濃度５　ｔａｇ／ｖａ
ｎになるように加え、３７℃にて４時間反応させた。こ
れにプロナーゼＥ（シグマ社、米国より購入）を最終濃
度２０−０μｍ　／＊　（１になるように加え、室温で
１５分間反応させた。その後、ドデシル硫酸ナトリウム
を最終濃度１％になるように添加して３７℃にて１時間
反応させた１反応終了後１反応液と等容のＴＮＥ緩衝液
〔５０ＩＩＭ　トリス（Ｔｒｉｓ）−）ＩＣＱ、５ｍＭ
　　ＥＤＴＡ、　１００＋Ｍ　ＮａＣｎ　、　ｐＨ８，
０）で飽和したフェノールを加え混合した後、１０００
０　ｒｐｍ（１１ｏＯｏ　ｇ）で１０分間遠心分離して
水層を回収した。この水層にフェノール・クロロホルム
（ｌ：１、ｖ／ｖ）液を等容加えて混合の後、１０００
０　ｒｐ＋ｎ（１１０００ｇ）で１０分間遠心分離して
水層を回収した。この水層に等容のクロロホルムを加え
て混合の後、１００００　ｒｐ＋ｓ　（１１０００ｇ）
で１０分間遠心分離して水層を回収した。この水層にリ
ボヌクレアーゼＡ（シグマ社、米国より購入）を最終濃
度４０μｇ／ｒｉ（ｌになる様に加えて３７℃にて１時
間反応させた０反応終了後、１１５容の５ＭＮａＣＱ水
溶液と１７４容の５０％ポリエチレングリコール６００
０水溶液を添加混合し、４℃にて４時間保持した。
次に試料を５０００　ｒｐｍ　（２７００ｇ　）で２０
分間遠心分離し、沈殿を回収した。得られた沈殿をＴＥ
緩衝液（１０ｍＭ　トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ、１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐｉ（７，５）　４　ｔａ　ｐ、に溶
かし、酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｄになるように
加えて、２倍容のエタノールを添加した。得られた混合
物を攪拌の後、−３０℃にて３時間保持し、１００００
　ｒｐｍ（１１０００ｇ　）で２０分間遠心分離し沈殿
を回収した。得られた沈殿を減圧乾燥の後、ＴＥ緩衝液
２ｍ１２に溶解し、ＤＮＡ濃度０．８５ｍｇ／ｍｕの全
ＤＮＡ溶液を得た。
ＤＮＡの切断のためには、３４μｇのＤＮＡに対して、
１６０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ　にツボフジ−２社よ
り購入）を加え、５０１ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣ
Ｑ　（ｐＨ７，４）、１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００
ｍＭ　ＮａＣｕの緩衝液６７μα中で３７℃にて３０分
間反応を行なわせた。その後、７０℃で１０分間加熱し
て、反応を停止させた。
（２）ベクターｐＢＲ３２５の調製と開裂エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＫＬ２
ＰＡ３４０を５０ｍＱのＬ−ブロス（ポリペプトン１０
　ｇＩＱ、酵母エキス５　ｇＩＱ　、　Ｎ’ａＣＩ２５
ｇ／ｆｌ　。
ｐＨ７，２）に植菌し、３７℃にて菌濃度５Ｘ１０”／
ａ＋Ｒまで増殖させた後、２℃で集菌した。得られた菌
体を５０１１Ｑの氷冷した１　００　ｍＭ　ＭｇＣＭ、
水溶液に懸濁した。得られた懸濁液から菌体を集菌後頁
に２５ＩＩＩ２の氷冷した１　００　ｍＭ　ＣａＣＱ　
ｚ水溶液に懸濁した。懸濁液を水中で３０分間保持した
後。
懸濁液から菌体を集菌して再度５■Ωの氷冷した１　０
０　ｍＭ　ＣａＣＱ＊水溶液に懸濁し、水中で１時間保
持した。得られた菌懸濁液２００μΩに、０゜１μｇの
ＰＢＲ３２５ＤＮＡ　（ベセスダ　リサーチラボラトリ
−社製、米国）を添加して、水中で１時間保持した。そ
の後４２℃にて２分間保持した後、　５　ｒｍＱのＬ−
ブロスを添加して、３７℃にて９０分間静置培養した。
得られた培養液を無菌水で適宜希釈して、１０μｇ７ｓ
ｍのテトラサイクリンを含有するＬ−寒天培地（Ｌ−ブ
ロスに１５ｇ／Ωの寒天を添加した培地）に塗布し、３
７℃で一晩培養し、プラスミドｐＢＲ３２５で形質転換
した大腸菌を得た。
ベクターｐＢＲ３２５を保持したエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　　Ｐ
　Ａ　３４０を、１００ｍＱのテトラサイクリン（１０
ｐｇ／ｍ１２）を含むし一ブロスに植菌し、３７℃にて
一晩培養した。同培養液より集菌し、ＴＥ緩衝液で洗浄
後１５％（ｗ／ｖ）シュークロース、５０ＩＩＩＭトリ
ス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ　（ｐＨ８，５）、　５０　ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ、２ｍ　ｇ　／ｒａ　Ｑリゾチウム（シグ
マ社製、米国社より購入）よりなる水溶液２ｍＱに懸濁
し、３７℃にて３０分間反応させた。
次にトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）溶液〔０，１％（ｗ／ｖ
）　　トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００，５０
ＩＩＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ　、　５０　ｍＭ
　ＥＤＴＡ、　ｐ）１８．５）　２　ｒｐｍを加えて、
３７℃にて３０分間保持した０次にこの溶液を、５℃に
て３００００　ｒｐｎ＋　（６４０００ｇ）で１時間遠
心分離し上滑を回収し、この上清にＴＥ緩衝液を加えて
１８ｍＡとした。この液に、１０ｍｇ／ｍ１２のエチジ
ウムブロマイド水溶液１．２ｍＱと塩化セシウム１８．
６４ｇとを加えて静かに溶解し、　４００００ｒｐｍ　
（１０００００ｇ）１５℃で４８時間遠心分離した。ベ
クターｐＢＲ３２５は、紫外線照射により遠心チューブ
中、２本のバンドの下方として見い出され、このバンド
を遠心チューブの側壁から注射器で抜き取ることにより
、ベクターｐＢＲ３２５画分を得た０次にこの分画液を
等容量のイソプロピルアルコールで４回抽出してエチジ
ウムブロマイドを除去し。
その後にＴＥ緩衝液に対して透析して、ＤＮＡ濃度１３
０μｇ／ｍＱのプラスミドＰＢＲ３２５の透析完了液１
ｍ１２を得た。
プラスミドＰＢＲ３２５Ｄ　Ｎ　Ａ　１７μｇを含む量
の上記透析完了液に対して４０単位の制限酵素ＥｃｏＲ
工を加えて、５０ｍＭ　トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣ１２
（ｐＨ７，４）、１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍＭ
　ＮａＣ１１の緩衝液１５０μΩ中で３７℃にて２時間
反応させた。
その後、７０℃で１０分間加熱して１反応を停止させた
。この反応液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭに
なる様に加え、更に２倍容のエタノールを添加して、−
３０℃にて３時間保持した。
次に１２００Ｏｒｐｍ　（８９００ｇ　）で室温で１０
分間遠心分離してＤＮＡ沈澱を回収し、得られた沈澱を
減圧乾燥した。乾燥した沈殿をＢＡＰＴ緩衝液（５０ｍ
Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｎ　、　ｐＨ８，４）　２
００μＱに溶解し、バクチリアル・アルカリ・ホスファ
ターゼ（Ｂａｃｔｅ−ｒｉ６１　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐ
ｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（宝酒造株式会社より購入）を
１単位添加して６５℃にて３０分間反応させた。更に同
じ酵素を１単位添加して、６５℃で３０分間反応させた
。その後反応液に等容のＴＮＥ緩衝液で飽和したフェノ
ールを加え、混合した後、１２０００　ｒｐｍ（８９０
０ｇ　）で室温で１０分間遠心分離して水層を回収し、
更にもう一度同じ操作を繰り返した１次に水層に等容の
フェノール・クロロホルム（１：　ｌ、ｖ／ｖ）液を添
加して混合した後、　１２０００　ｒｐｖｓ　（８９０
０ｇ）で室温で１０分間遠心分離し、水層を回収した。
更に水層に等容のクロロホルムを添加して攪拌した後、
１２０００　ｒｐｍ（８９００ｇ　）で室温で１ｏ分間
遠心分離し、水層を回収した。該水層に酢酸ナトリウム
を最終濃度３００ｍＭになる様に加え、更に２倍容のエ
タノールを添加し攪拌した後、−３０”Ｃにて３時間保
持した。
その後、　１２０００　ｒｐｍ　（８９００ｇ）で１０
分間遠心分離し、ＤＮＡ沈澱を回収した。これを減圧乾
燥した後、２３μａのＴＥ緩衝液で溶解した。
（３）ＤＮＡの組換え反応 実施例１工程（１）のＤ　Ｎ　Ａ　２．４μｇと前記実
施例１工程（２）のＤＮＡ１．４μｇと３単位のＴ４フ
ァージＤＮＡリガーゼにツボフジ−２社より購入）とを
、５０１１Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）−１（ＣＱ　（ｐＨ７
，４）、１０＋ｓＭ　ＭｇＣＱ、、１０　ｍＭジチオト
レイトール（Ｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒｅｉｔｏｌ）、　１
　ｍＭスペルミジン（Ｓｐａｒｍｉｄｉｎｅ）　ｅｌ　
ｍＭ　ＡＴＰ、　０．１ｍｇ／■Ω　ウシ血清アルブミ
ン（Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ、以下
しばしばＢＳＡと略す）（ベセスダリサーチラボラトリ
ー社、米国より購入）の緩衝液１ｏＯμΩ中で、１５℃
にて一晩反応させた。その後、７０’Ｃにて１０分間加
熱することにより、反応を停止させた。
（４）組換えプラスミドの大腸菌への移入前記工程（２
）の方法により、エシェリヒア・コリ　　（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　　ｃｃすＬｉ）　　　　Ｋ　　１　２　
　　　Ｐ　　Ａ　　３　４　０　　のコンピテント細胞
（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ）を調製した。
コンピテント細胞懸濁液４００μＱと前記工程（３）の
反応液４０μｇとを混合して、水中に１時間保持した。
その後、４２℃にて２分間加熱した後、５ＩＩＱのＬ−
ブロスを添加して３７℃にて９０分間静置培養した０次
に、得られた培養液から菌体を集菌し。
無菌水に懸濁した。得られた懸濁液を、合成寒天培地（
Ｎａ、ＨＰｏ、　ＳｇＩＱ　ＫＨ，ＰＯ４３ｇＨ１，Ｎ
ａＣｎ０．ＳｇＩＱ、ＮＨｌＣＱ　　Ｉｇ／塁、ＭｇＳ
Ｏ４１ｍＮ、ＣａＣ！ｉ。
０．１　ｍＭ、グルコース２ｇ７１．寒天１５ｇ／ｊ１
、Ｌ−スレオニン０．３　ｍＭ、Ｌ−ロイシン　０．３
鵬Ｎ。
Ｌ−ヒスチジン０．１鵬に、Ｌ−アルギニン　０．６ｍ
に、チアミン０．０５　ｍＭ）に塗布して培養した。
（５）コリネバクテリウム・メラセコラ８０１（Ｃｏｒ
　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓＳａｃｏｌａ　
８０１）（微工研条寄第５５８号）のＧＤＨ産生遺伝子
を有する大腸菌の選択分離 前記実施例１工程（４）で得られた菌体を、クロラムフ
ェニコール（２０Ｍｇ１層Ω）とテトラサイクリン（１
０Ｍｇ／ｍＱ）とを含む前記合成寒天培地と、テトラサ
イクリン（１０Ｍｇ／膳１２）のみを含む前記合成寒天
培地とでそれぞれ培養し、生育の有無を調べた。クロラ
ムフェニコール感受性テトラサイクリン耐性グルタミン
酸非要求性を示す大腸菌の細胞を分離した０分離した細
胞は目的のＧＤＨ産生遺伝子を保持しており、これをエ
シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
）　Ｋ　１２　　Ｐ　Ａ　３４０　（ｐＡＧ１０３）と
命名した０分離した大腸菌を培養してＧＤＨ産生遺伝子
をクローニングした。
分離した大腸菌のＧＤＨ活性を、下記の方法で測定する
ことにより、クローニングした遺伝子がＧＤＨ産生遺伝
子であることを確認した０合成液体培地（ＫＨ，Ｐｏ、
１３．６　ｇｉｎ　、　Ｋ、Ｓｏ、　２．６１ｇ／ｆｉ
　。
Ｍｇ５ｏ４−’ｙｕ、ｏ　Ｏ−２ｇ　／　Ｑ　、　Ｃａ
Ｃｎ　ｚ　１０　ｔａ　ｇ　／　Ｑ　、　ＦｅＳＯ４＊
７Ｈ，ＯＯ，５ｔａｇ／ｆｌ、グル：ｆ−Ｘ４ｇ／ｆｉ
、ＮＨ４ＣＱ３ｇ／Ω、Ｌ−スレオニン０．３１Ｍ、　
Ｌ−ロイシン０．３　ｍＭ、Ｌ−ヒスチジン０．１　ｍ
Ｍ、Ｌ−アルギニン０．６　ｍＭ、チアミン０．０５−
Ｍ、ｐＨ７，２）　１００＋Ｑに、エシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＰＡ３４
０　（ｐＡＧ１０３）を植菌し、３７℃で一日培養した
。
該大腸菌を集菌後、２■Ωの７Ｍ緩衝液（５０ｍＭトリ
ス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｎ　、　　ｌ　ＯｍＷ　２−メル
カプトエタノール、　ｐＨ７，６）に懸濁した。これを
超音波処理した後、１４０００　ｒｐｍ　（２００００
ｇ）で２０分間遠心分離して、細胞抽出液（粗酵素液）
を調製した。尚、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２ＰＡ３４０やエシェリ
ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）　Ｋ１
２　　ＰＡ３４０　（ｐＢＲ３２５）ヲ培養する場合に
は、前記合成液体培地に、１０ｍＭグルタミン酸ナトリ
ウムを添加した。
ＧＤＨ活性ハ、２．５　ｒａｎノ酵素反応１（５０ｒｍ
Ｍト！Ｊ　ス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣ２、４０ｍＭ　ＮＨ４
ＣＱ　、　０．２５　ｄ　ＮＡＯＰＨ１５ｍＭα−ケト
グルタル酸、１０〜１００μα細胞抽出液、ｐＨ７，６
）の３４０１の吸光度の減少を、日立製作所製分光光度
計（２２８型）で測定することにより求めた。また細胞
抽出液の蛋白質濃度の測定にはローリ−（Ｌｏｖｒｙ）
ら〔オー、エイチ、ローリ−（０，Ｈ，Ｌｏｖｒｙ）ｐ
　エフ、ジェイ、ローウェブロー（Ｎ、Ｊ、　Ｒｏｖｅ
ｂｒｏｕｇｈ）、アール、ジェイ、ランダル（Ｒ。
Ｊ、Ｒａｎｄａｌｌ）　ｅジエイ、パイオル、ケム（Ｊ
、　Ｒｉａｌ。
Ｃｈｅｗ、）　１９３巻２６５頁（１９５１年）〕の方
法を用いた。
尚、上記測定の標準蛋白質として、牛血清アルブミン（
和光紬薬工業社より購入）を用いた。
結巣を第１表に示す。
第　　１　　表 注＝（１）反応液中の蛋白質１　ｔａｇが、１分間に酸
化した還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸（β−Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｉ
ｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　
、　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｆｏｒｍ、以下ＮＡＤＰＨと略す
）の量（マイクロモル）で表示しである。
（２）イー・コリ　ジェネティック　ストックセンター
（Ｅ、　ｃａｌｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅ
ｎｔｅｒ）。
〔デパートメントオブヒューマンジェネティックス、エ
ールユニバーシティ、スクールオブメジシン、３３３．
シーダーストリート、ビー、オー、ボックス３３３３．
ニューヘイブン、コネチカット０６５１０、アメリカ合
衆国（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、　ＹａｌａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、５ｃ
ｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３３　Ｃｅｄａ
ｒＳｔｒｅｅｔ　　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　３３３３．Ｎｅｗ
　Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎ−ｎｅｃｔｉｃｕｔ　０６５１０
　　Ｕ、Ｓ、Ａ、））のバーバラシェイパツクマン（Ｂ
ａｒｂａｒａ　Ｊ、　Ｂａｃｈｍａｎｎ）より分譲され
たエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ）　ＫＩ２の変異菌株である。尚、上記機関からは、
！！でも菌株の分譲を受けることができる。本菌株は、
ＧＤＨとグルタミン酸合成酵素とを共に欠損している。
第１表のＧＤＨ比活性測定結果より、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　Ｋ　１２
　　Ｐ　Ａ　３４０　（ＰＡＧ１０３）は、極めで高い
ＧＤＨ比活性を有していた。
（６）複合プラスミドｐＡＧ　１０３の分離と解析プラ
スミドｐＢＲ３２５で形質転換されたエシェリヒア、コ
リに１２　ＰＡ３４０株の代わりにエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　Ｋ　１２　
　Ｐ　Ａ　３４０（ｐＡＧ１０３）を用いる以外は前記
工程（１）−（２）と実質的に同じ方法でプラスミドｐ
ＡＧ１０３のＤＮＡを分離精製して１５０μｇのプラス
ミドｐＡＧ１０３のＤＮＡを得た。このＤＮＡから各々
　０．３μｇの試料をｉ！ＩＩＬこれに、各々１０単位
の制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｂｇｌ　ＩＩ、Ｈ
ｉｎｄｍにツポンジーン社より購入）、Ｐｓｔｌ（ベセ
スダリサーチラボラトリー社、米国より購入）、Ｓａｃ
　Ｉ　（宝酒造株式会社より購入）、５ａｌｌにツポン
ジーン社より購入）、Ｘｂａ　Ｉ　にッポンジーン社よ
り購入）、Ｘｈｏｌ（宝酒造株式会社より購入）を単独
でおよ、び組合せて、それぞれの適正緩衝液２０μΩ中
にて３７℃で２時間反応させた。
その消化した試料をマニアティスら（Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ。
Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ：
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　ＡＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｎ、Ｙ、　Ｐ、１５
（１−１８５゜１９８２）の方法により、１％（ｖ／ｖ
）アガロースゲル電気泳動、および４％（ｖ／ｖ）ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動の終ったゲ
ルを１μｇ／　ｒｓ　ｎエチジウムブロマイド水溶液に
浸漬して３０分間染色した後、紫外線をゲルに照射して
生成したＤＮＡ断片に対応するバンドの数を判定し、各
断片の泳動距離から各々の分子の長さを算出した。
尚、分子の長さは、アガロースゲル電気泳動の場合は同
一アガロースゲル上で同時に電気泳動したラムダファー
ジ（λｐｈａｇａ）　Ｄ　Ｎ　Ａ　にツポンジーン社よ
り購入）の制限酵素Ｈｉｎｄ　ｍによる消化によって得
られる既知の分子の長さ断片の泳動距離との比較により
、またポリアクリルアミドゲル電気泳動の場合は同一ポ
リアクリルアミドゲル上で同時に電気泳動したファイエ
ックス１７４フアージ（φＸ１７４　ｐｈａｇｅ）　Ｄ
　Ｎ　Ａの制限酵素Ｈａｓ　ＩＩＩによる消化によって
得られる既知の分子の長さの断片（ベセスダリサーチラ
ボラトリー社、米国より購入）の泳動距離との比較によ
り算出した。更に、複数の制限酵素処理によって生じた
消化断片を解析することにより、プラスミド分子中の各
制限酵素切断部位を決定した。この様にして得られたプ
ラスミドＰＡＧ１０３の制限酵素切断地図を第１図に示
す。
各ＤＮＡ断片の分子長さ決定には、約１．Ｏｋｂ以上の
分子長さについては１％アガロースゲル電気泳動を用い
、約０．１ｋｂから約１．Ｏｋｂ未溝の分子長さについ
ては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた。
その結果、プラスミドｐＡＧ１０３は、ベクターｐａＲ
３２５の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に約５．４キロベ
ースの外来のＥｃｏＲＩ断片が組込まれていた。このＥ
ｃｏＲＩ断片が、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃ
ａｒ　ｎｅｂａｃｔａｒｉｕ＋ｍ　ｍｅｌａｓｓａｃｏ
ｌａ）　８０１（微工研条寄第５５８号）由来のＧＤＨ
産生遺伝子を含むＤＮＡ断片である。
プラスミドｐＡＧ１０３　ＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３
２５の代わりに用いる以外は前記実施例１工程（２）と
実質的に同様の方法でエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　ＰＡ３４０を形質
転換して形質転換体を得た。得られた形質転換体を薬剤
耐性及び栄養要求性に関して調べた結果、調べた形質転
換株は、全てテトラサイクリン耐性アンピシリン耐性ク
ロラムフェニコール感受性グルタミン酸非要求性であっ
た。更に、該形質転換株について。
それらが保有するプラスミドを解析した結果、それらの
プラスミドは、供与プラスミドと比べて制限酵素切断様
式で同一と判定されるプラスミドであった。
（７）　Ｇ　Ｄ　Ｈ産生遺伝子を含む約５．４キロベー
スのＤＮＡ断片の分離 前記実施例１工程（６）で調製したプラスミドＰＡＧ１
０３のＤＮＡ２０μｇに対して、１００単位の制限酵素
ＥｃｏＲＩ　、　ＳａＱ　Ｉをそれぞれ加えて、５０ｍ
Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）、１０
ｍＭ　ＮｇＳＯ，、１００ｍＭＮａＣＱの緩衝液１００
μΩ中で、３７℃にて２時間反応させた。消化して得ら
れた試料は、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社、米
国より購入したＬＭＰアガロース（Ａｇａｒｏｓａ）を
使用し、４℃で電気泳動を行なう以外は前記と同様の方
法により、１％アガロースゲル電気泳動に供した０次に
、アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色して紫
外線照射下に置き、ＧＤＨ産生遺伝子を含む約５．４キ
ロベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、その付近のアガ
ロースゲルを切り出した。切り出したアガロースゲルに
その重量の３倍量のＴＥ緩衝液を加えて、６５℃で１０
分間保持し、アガロースゲルを完全にＴＥ緩衝液に溶解
した０次に。
等容のフェノールを添加して、攪拌の後、水層を回収し
た。該水層に等容のフェノール・クロロホルム（１：　
１．ｖ／ｖ）液を添加して、攪拌の後。
水層を回収した。得られた水層に等容のクロロホルムを
添加して、攪拌の後、水層を回収した。得られた水層に
酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになるように添加
し、更に２倍容のエタノールを加えて攪拌の後、−３０
℃にて３時間保持した。
その後、　１００００　ｒｐｔｓ　（９０００ｇ）で室
温で１ｏ分間遠心分離して、ＤＮＡの沈澱を回収した０
次に、得られた沈澱を減圧乾燥後、ＧＤＨ産生遺伝子を
含む約５．４キロベースのＤＮＡ断片を約２μｇ取得し
た。
（以下余白） （８）プラスミドｐＡＧ５０の作成と該プラスミド保有
コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃａｒ　ｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８０１　（ｐ
ＡＧ５０）からの該プラスミドの分離 プラスミドＰＡＧ５０は、次の方法で作成した。先ずプ
ラスミドＰＡＧＩを縮小化してプラスミドｐＡＧ１４を
作成し、該プラスミドよりテトラサイクリン耐性遺伝子
を含むＤＮＡ断片を分離した０次に該ＤＮＡ断片をプラ
スミドｐＡＧ３に組込んでプラスミドｐＡＧ５０を作成
した。以下、上述の操作について詳細に説明する。
■コリネバクテリウム・メラセコラ（蝕■ｎａｂａｃ−
ｔｅｒｉｕｍ　ｌ１ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　２２２４
３　（微工研条寄第５６０号）菌体からのプラスミドｐ
ＡＧ１の分離上記菌株を、半合成培地（（ＮＨ４）ＪＯ
＋　１０　ｇ、尿素３　ｇ、　Ｋ、Ｉ（Ｐｏ、　１　ｇ
、　Ｎａ（１５０ｔ＠、河ｇｓｏ４−７８，０４００　
ｍｇ、Ｍｎ５Ｏ，・４−６８，０２　■、ＦｅＳＯ４”
４−６Ｈ，０２■、グルコース２０　ｇ、ビオチン５０
　μｇ、チアミン塩酸塩２００μｇ、酵母エキス１ｇを
純水に溶かして１０とし、ｐＨ７，２に調整した培地〕
で、３２℃、１晩振盪培養し、得られた培養液８＋ｓＱ
を２００ｍｇの前記半合成培地に移植して、３２℃で５
時間振盪培養した。
培養液から菌体を集菌し、リゾチウム液（５０ｒａｈグ
ルコース、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２５　ｍＭ　トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン［Ｔｒｉｓ　（ｈ
ｙｄｒｏｘｙ＋ｓｅｔｈｙｌ）−ａｍｉｎｏｍａｔｈａ
ｎｅ：Ｔｒｉｓ）、　１０　ｍｇ／ｙａＱリゾチウム（
シグマ社、米国より購入）、ｐＨ８，０１１０ｒａｉｌ
に懸濁し４２℃で１時間反応させた０本反応液にアルカ
リ−ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｄｏｄｅ
ｃｙｌ−ｓｕｌｆｔｅ以下ＳＤＳと略す）液（０，２Ｎ
　ＮａＯＨ１１％（ｖ／ｖ）　５Ｏ５）２０　ｍＱを添
加攪拌の後、水中に５分装置いた０次に本反応液に、氷
冷した酢酸カリウム溶液（５Ｍ酢酸カリウム水溶液６０
ｍｇ、酢酸１１．５ｒａｆｌ、純水２８．５ｍ１１の混
合液）１５ｍＱを添加攪拌の後、水中に１０分分間−て
溶菌物を得た。溶菌物の全量を遠心管に移し、４℃、５
分間、　１２，０００　ｒｐ■（１３０００ｇ）の遠心
分離を行い、上澄液を回収した。
これを等容のフェノール・クロロホルム液（１：１）で
抽出して水層を回収した。これに２倍容のエタノールを
添加攪拌して、５分間室温に置き。
２０℃で１０分間、１０．０００　ｒｐｍ（１１，００
０ｇ）の遠心分離を行い沈殿を得た。得られた沈殿を、
７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で洗浄の後減圧乾燥
して、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、　１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、　ｐＨ７，５３２ＯｍＱ中に溶解した。この液に
、１０＋＊ｇ／ｍ（１エチジウムブロマイド水溶液１．
２　ｍｇと塩化セシウム２３゜６ｇとを加えて静かに溶
解し、４０．０００　ｒｐｍ（１００，０００ｇ）１５
℃で４８時間遠心分離した。紫外線照射により遠心チュ
ーブ中、２本のバンドが見出され、下方のバンドを遠心
チューブの側壁から注射器で抜き取ることにより、プラ
スミドＰＡＧＩを得た０次いでこの分画液を等容量のイ
ソプロピルアルコールで４回抽出してエチジウムブロマ
イドを除去し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析して、
ＤＮＡ濃度５０μｇ／ｍＱのプラスミドｐＡＧ１の透析
完了液１ｍｊ２を得た。プラスミドｐＡＧ１を前記工程
（１）　−（６）の方法により解析して制限酵素切断地
図を作成した。結果を第２図に示す。
■プラスミドＰＡＧＩの試験管内ＤＮＡ組換え前記工程
（８）−〇で調製したプラスミドｐＡＧ１のＤＮＡ０．
５ｇｇに対して１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを加え、
５０ｍＭトリス（ＴｒＬｓ）−ＨＣ１Ａ　ＣｐＨ７，４
）、１０　ｒａＭＮｇＳＯ，、１００ｍＭ　ＮａＣＱの
緩衝液４０μα中で、３７℃にて２時間反応させた。そ
の後７０℃で１０分間加熱して反応を停止させた。この
反応液２０μΩと３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼ
にツボンジーン社より購入）とを、５０ｗＭ　トリス（
Ｔｒｉｓ）−ＨＣｎ　（ｐＨ７，４）、１０　ｍＭＭｇ
ＣＱ、、　１０　ｍＷジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉ
ｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１　ｒｘＭスペルミジン（Ｓｐ
ｅｒｍｉｄｉｎｅ）、１　ｍＭ　ＡＴＰ、０．１＋＊ｇ
／ｍ！ＢＳＡ（ベセスダリサーチラボラトリー社、米国
より購入）の緩衝液５０μΩ中で１５℃にて１晩反応さ
せた。
■プラスミドＰＡＧ１４の取得 （プラスミドのキユアリング） コリネバクテリウム・メラセコラ（並ａ組堕ｒｔｅｒｉ
ｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　２２２４３　（微工
研条寄第５６０号）をＬＧ培地（トリプトンＬｏｇ、酵
母エキス５　ｇ、　ＮａＣＱ　５　ｇ、グルコース２ｇ
を純水に溶かして１Ωとし、ｐＨ７，２に調整した培地
）５ＩＩＩＱに一白金耳植菌して、３７℃で１晩振盪培
養した。
この培養液を無菌水で希釈してＬＧ寒天培地（ＬＧ培地
に１．５重量％の寒天を添加した培地）に塗布し、３２
℃で２日間培養した。生じたコロニー１００個を取り、
テトラサイクリンｌＯμｇ／ｍＱを含有するＬＧ寒天培
地に釣菌した。３２℃で２日間培養して２株のテトラサ
イクリン感受性株を選択した。得られた２株のテトラサ
イクリン感受性株について、前記と同様なプラスミドの
単離法によりプラスミドＰＡＧＩの存在を調べた。その
結果得られた２株のテトラサイクリン感受性株は、いず
れもプラスミドを保持していないプラスミドキュアート
（Ｐｌａｓｍｉｄ−ｃｕｒｅｄ）株であった。これらの
一方の株を以後の形質転換実験の宿主として用いた。
（形質転換） コリネバクテリウム・メラセコラ（販■ｎａｂａｃ−ｔ
ｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　２２２４３　
（微工研条寄第５６０号）より前記の操作で分離したプ
ラスミドキュアート株を、前記半合成培地で３２℃、１
２時間振盪培養し、その培養液０．５ｍＭを同じ半合成
培地５０ｍｊｌに植菌して３２℃で振盪培養した。
日立製作所製分光光度計（２２８型）で波長６６０ｎｗ
における吸光度（０−Ｄ　）を測定し、ＯＤが０゜２に
なった時点で培養液にペニシリンＧを０．３単位／ｍＱ
の濃度になるように添加した。添加後頁に３２℃で１．
５時間培養を続けた。
その培養液より集菌し、Ｒ培地〔グルコース５ｇ、カザ
ミノ酸１０　ｇ、　＃母エキス１０　ｇ、　Ｋ、ＨＰＯ
４０，３５ｇ、　ＫＨ，Ｐｏ、　０．１５　ｇ、シュー
クロース１３７ｇ、Ｎ−トリス（ハイドロキシメチル）
メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｔ　Ｅ　Ｓ　：
　Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙ−ｍｅｔｈｙｌ）＋ｍ
ｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉ
ｃ　ａｃｉｄ）５．７３　ｇ、　ＭｇＣ９□０．９５　
ｇ、　ＣａＣＱ、　１．１１　ｇを純水に溶かして１ｎ
とし、ＮａＯＨ’ｔ”ｐＨ７，２に調整した培地〕５ｍ
Ｑに懸濁した。この菌懸濁液４．５ｍΩに、３ｍｇ７ｍ
ｆｌ濃度のりゾチウムを含有するＲ培地（ミリポアフィ
ルタ−で除菌した）０．５ｍＭを添加して、３５℃で５
時間静置し反応させてプロトプラスト化細胞を得た１反
応混合物を７．００Ｏｒｐｍ（４５００ｇ）で５℃で７
分間遠心分離してプロトプラスト化した細胞を回収し、
Ｒ培地５ｍｇに懸濁した。同様の操作を更にもう一度行
った後、Ｒ培地５ｍｇに再懸濁してプロトプラスト懸濁
液とした。
前記工程（８）−〇で得られたりガーゼ反応液５０ｐｎ
と２倍濃度ＴＳＭＣ液（ＴＳＭＣ液は、ＴＥＳ　２５　
ｖｌＭ、シュークロース０．４　Ｍ、　ＭｇＣＱ、　１
０　ｍＭ、ＣａＣＱ、　３０ｍＭを含み、ＮａＯＨでｐ
Ｈ７，２に調整した水溶液である）５０μａとの混合液
を上記プロトプラスト懸濁液０．５ｍ１２に添加混合し
た。その後頁にＰＥＧ液ＣＴＳＭＣ液にポリエチレング
リコール６．０００（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌａｎｓｇｌｙ
ｃｏｌ　６０００）を４０％（ｖ／ｖ）濃度に溶解する
）　１．５ｍＭを添加してゆるやかに混和し、２分間室
温で静置した。その後Ｒ−ＰＶＰ液〔Ｒ培地にポリビニ
ルビｏ　ＩＪトン（Ｐ　Ｖ　Ｐ　：　Ｐｏ１ｙ−ｖｉｎ
ｙｌ　ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）４０　ｇ／　４１を添
加する１５ｍＭを添加して、４，０００　ｒｐ腸（１８
００ｇ）で室温で１０分間遠心分離して上澄液を除去し
た。同様の遠心分離条件で洗浄操作を更にもう一度行い
プロトプラストを沈殿として得た。得られたプロトプラ
ストを０．５ｒｒＱのＲ−ＰＶＰ液にゆるやかに懸濁し
た。
得られた懸濁液を３時間、３０℃に保った後、Ｒ−ｐｖ
ｐ液で希釈し、希釈懸濁液を得た。一定量の希釈懸濁液
をテトラサイケリン１０μ度を含む再生培地に植菌した
．再生培地はＲ培地にＰＶＰ４Ｇｇ／Ｊ、寒天１５ｇ／
ｎを添加して得られる下層寒天培地と，その上に重層さ
れた，ＰｖＰ４０ｇＩＱ．寒天６ｇ／ｆｉを添加して得
られる上層寒天培地とからなる重層寒天培地である．植
苗はプロトプラスト懸濁液を溶けた上層寒天培地３ｍａ
と混合して，下層寒天培地上に重層することにより行な
った．植苗した再生培地を３２℃で４日間培養してテト
ラサイタリン耐性形質転換株を得た。
出現したテトラサイタリン耐性形質転換株から任意に１
０株を選び、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＱ濃度を含
むＬＧ寒天培地上で純化した後、工程（８）−■でプラ
スミドｐＡＧ１を分離した方法と実質的に同様の方法に
より、各菌株からプラスミドを分離した．各プラスミド
ＤＮＡ０．５　μｇに対して前記工程（６）の方法によ
り、各プラスミド中の制限酵素切断部位を決定した。そ
の結果、プラスミドｐＡＧ１４を取得した。このように
した得られたプラスミドｐＡＧ１４の制限酵素切断地図
を第３図に示す。
このプラスミドＤＮＡを用いて、前記と実質的に同様な
方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎ
ａｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　２
２２４３　（微工研条寄第５６０号）のプラスミドキュ
アート株を形質転換した。得られたテトラサイクリン耐
性株について、それらが保有するプラスミドを解析した
結果、それらのプラスミドは、供与プラスミドと比べて
、制限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミドであ
った。
■プラスミドＰＡＧ１４からのテトラサイクリン耐性遺
伝子を含むＤＮＡ断片の分離 前記工程（８）−〇で調製したプラスミドｐＡＧ１４の
ＤＮＡ２０μｇに対して、１００単位の制限酵素Ｂａ畦
１、Ｂｇｌｌｌを同時に加えて、１０　ｍＭ　トリス（
Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）、　１０　ｍＭＭｇ
ＳＯ，、５０ｍＷ　ＮａＣｊｌ、１　＋ｗＭジチオトレ
イトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒａｉｔｏｌ）の緩衝液１
００ｍＱ中で、３７℃にて２時間反応させた。消化した
試料は、前記工程（６）の方法により、１％アガロース
ゲル電気泳動に供した。ただし、ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリ−社、米国より購入したＬＭＰ　アガロース
（Ａｇａｒｏｓａ）を使用し・４℃で電気泳動した０次
に、エチジウムブロマイドで染色したアガロースを紫外
線照射下に置き、テトラサイクリン耐性遺伝子を含む約
３．１キロベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、その付
近のアガロースゲルを切り出した。切り出したアガロー
スにその重量の３倍量のＴＥ緩衝液を加えて、６５℃で
１０分間保持し、アガロースゲルを完全に溶かした０次
に等容のフェノールを添加して、攪拌の後、水層を回収
した。得られた水層に等容のフェノール・クロロホルム
（１：　１）液を添加して、攪拌の後、水層を回収した
。得られた水層に等容のクロロホルムを添加して、攪拌
の後、水層を回収した。得られた水層に、酢酸ナトリウ
ムを最終濃度３００　ｍＭになるように添加し、更に２
倍容のエタノールを添加して３時間保持した。その後。
１０．０００ｒｐ閣（９，０００ｇ）で室温で１０分間
遠心分離して、ＤＮＡの沈殿を回収し、得られた沈殿を
減圧乾燥した。
■プラスミドｐＡＧ３の調製と制限酵素Ｂａ諷Ｈ１処理 前記工程（８）−〇の方法により、コリネバクテリウム
０メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎａｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅ
ｌａｓｓｅｃ也）２２２２０（微工研条寄第５５９号）
から分離精製したプラスミドＰＡＧ３のＤＮＡ４μｇに
対して、２０単位の制限酵素Ｂａ■ＨＩを加えて、１０
ＩＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）、
１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、５０ｍＭ　ＮａＣＱ　、１　
ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ）の緩衝液１００ｍｊｌ中で、３７℃にて２時間反応
させた。そこへ等容のフェノール・クロロホルム（１：
　１）液を添加して攪拌の後、水層を回収した。更に等
容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収した
。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００　＋ｍＭにな
るように加え、次に２倍容のエタノールを添加して、−
３０℃にて３時間保持した後、１２．０００　ｒｐｍ（
８９００ｇ）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈
殿を回収し、これを減圧乾燥した。尚、プラスミドＰＡ
Ｇ３の制限酵素切断地図を第４＠に示す。
■プラスミドｐＡＧ５０の取得 前記工程（８）−■及び■で調製した夫々のＤＮＡ全量
と３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼとを５０１１Ｍ
トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）、１０　
ｍＭ　ＭｇＣΩ２，１０履Ｎジチオトレイトール（Ｄｉ
ｔｈｉｏｔｈｒａｉｔｏｌ）、Ｉ　ＷＭスペルミジン（
Ｓｐｅｒ−ｍｉｄｉｎｅ）、１　ｍＭ　ＡＴＰ、　０．
１　ｍｇ／ｍｆｆ１ＢｓＡを含む緩衝液５０μａ中で、
１５℃にて一晩反応させた。その後７０℃にて１０分間
加熱して反応を停止させた。
得られたりガーゼ反応液５０μＱを用いて、前記工程（
８）−■と同じ形質転換操作によりコリネバクテリウム
・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅ
ｌａｓ−ｇｅｃｏｌａ）　８０１　（微工研条寄第５５
８号）のテトラサイクリン耐性形質転換株を取得した。
ただし、再生培地による培養は、７日間とした。得られ
たテトラサイクリン耐性形質転換株について、前記工程
（８）の方法により、各株の保有するプラスミドを分離
し、前記工程（６）の方法によりそれぞれのプラスミド
を解析した。得られたプラスミドをＰＡＧ５０と命名し
た。
このプラスミドＤＮＡを用いて、前記と実質的に同様の
方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎ
ｅｂａｃｔａｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８
０１　（微工研条寄第５５８号）を形質転換してテトラ
サイクリン耐性形質転換体を得た。得られたテトラサイ
クリン耐性形質転換体について、それらが保有するプラ
スミドを解析した結果、それらのプラスミドは、供与プ
ラスミドと比べて制限酵素切断様式で同一と判定される
プラスミドであった。得られたプラスミドＰＡＧ５０の
制限酵素切断地図を第５図に示す。
（９）プラスミドｐＡＧ５０へのＧＤＨ産生遺伝子を含
むＤＮＡ断片の組込み 前記工程（８）−■で調製したプラスミドｐＡＧ５０の
ＤＮＡ　５　μｇに対して、制限酵素ＥｃｏＲＩを１５
単位加えて、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｇ）−ＨＣＱ　（
ｐＨ７，４）、１０　ｖａＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍＷ
　ＮａＣｆ１を含む緩衝液６０μＱ中で３７℃にて２時
間反応させた。その後、７０℃で１０分間加熱して、反
応を停止させた。この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３
００ＩＩＩＭになる様に加え。
更に２倍容のエタノールを添加して、−３０℃にて３時
間保持した０次に１２，０００　ｒｐｍ（８，９００ｇ
）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収し、
得られた沈殿を減圧乾燥した。得られた試料をＢＡＰＴ
緩衝液（５０ｍＷ　トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ　、　
ｐＨ８，４）２００μΩに溶解し、バクチリアル・アル
カリ・ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｉｒａｌ　ａｌｋａ
ｌｉｎｅ　ｐｈｏｓ−ｐｈａｔａｓｅ）　（宝酒造株式
会社より購入）を１単位添加して６５℃にて３０分間反
応させた。更に該酵素を１単位添加して、６５℃にて３
０分間反応させた。その後、反応液に等容のＴＮＥ緩衝
液で飽和したフェノールを加え、混合した後、１２．０
００　ｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離して
水層を回収し、更にもう１回同じ操作を繰り返した０次
に水層に等容のフェノール・クロロホルム（１：　１．
ｖ／Ｖ）液を添加して混合した後、１２，０００　ｒｐ
＋ｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離し、水層を回
収した。更に水層に等容のクロロホルムを添加して攪拌
した後、１２．０００　ｒｐｍ（８，９００ｇ）で室温
で１０分間遠心分離し、水層を回収した。得られた水層
に酢酸ナトリウムを最終濃度３００■Ｎになる様に加え
、２倍容のエタノールを添加し攪拌した後、−３０℃に
て３時間保持した。その後、　１２，０００　ｒｐｍ（
８，９００ｇ）で室温で１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈
殿を回収した。これを減圧乾燥した。このＤＮＡ全量と
前記工程（７）で調製したＤＮＡ　１　μｇと３単位の
Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼにツインジー２社より購入
）とを、　５０　ｍＷ　トリス（Ｔｒｉｇ）−ＨＣＱ　
（ｐＨ７，４）、１０菖にＭｇＣＬ、　１０　ｍＭジチ
オトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒａｉｔｏｌ）、
１　ｍＷスペルミジン（Ｓｐｅｒ＋ｗｉｄｉｎｅ）、１
ｍＭ　ＡＴＰ、　０．１　ｍｇ／ｍｊｌＢｓＡ（ベセス
ダリサーチラボラトリー社、米国より購入）の緩衝液５
０μΩ中で、１５℃にて一晩反応させた。その後、７０
℃にて１０分間加熱することにより、反応を停止させた
。
（１０）ＧＤＨ産生遺伝子を含有した複合プラスミドｐ
ＡＧ１００１の取得 前記工程（９）で得られたりガーゼ反応液５０μ２を用
いて前記工程（８）−〇と同じ形質転換操作によりコリ
ネバクテリウム・メラセコラ（Ｃａｒ　ｎｅｂａｃｔａ
−ｒｉｕｍ　＋５ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８０１　（
微工研条寄第５５８号）の形質転換操作を行なった。
得られたテトラサイクリン耐性形質転換体を、テトラサ
イクリン１０μｇ／ｍｍを含むＬＧ寒天培地（Ｌ−寒天
培地にグルコース５ｇ／Ωを添加した培地）上で純化し
た後、各菌株から前記工程（８）−■の方法により、プ
ラスミドを分離し、前記工程（６）の方法によりそれら
のプラスミドを解析した。得られたプラスミドをプラス
ミドｐＡＧ１００１と命名した。プラスミドｐＡＧ１０
０１は、第６図に示した様に、プラスミドｐＡＧ５０の
制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に、グルタミン酸生産性コ
リネ型細菌由来のＧＤＨ産生遺伝子を含む約５．４キロ
ベースのＤＮＡ断片が組込まれた複合プラスミドである
。
（１’１　）プラスミドＰＡＧ１００Ｉ保有菌株のＧＤ
Ｈ活性測定 プラスミドｐＡＧ１００１を保有するコリネバクテリウ
ム６メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍ
ｅｌａｓｓｅｃｏｌすを、テトラサイクリン１０μｇ／
ｒｓＱ含有前記糖蜜培地５０＋ｓＱで、３２℃にて一晩
培養した。この培養液より集菌し、０．８％ＮａＣ１水
溶液２０＋ｓＱで２回洗浄後、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ
　２−（モルフォリノ）エタンスルホン酸（以下ＭＥＳ
と略す）、　１０ｍＭＭｎ５Ｏ，、１０＋＊Ｍ　ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７，０３１０ｍｊｌに懸濁した。
これを、ブラウン社製（西独）のＭＳＫセルホモチナイ
ザ−（８５３０２１型）で処理した後、１４０００ｒｐ
ｍ（２００００ｇ　）で４℃で２０分間遠心分離して細
胞抽出液（粗酵素液）を調製した。
ＧＤＨ活性は、３．Ｏｍμの酵素反応液（１００ｍＭト
リス（Ｔｒｉｓ）−８０１（ｐｆ（８，１）、５ｍＭ　
ａ−ケトゲルタール酸、　１０　ｍＭ　（ＮＨ４）、Ｓ
ｏ、、　０．１５　ＭＷ　ＮＡＤＰｆ（，５０μＱ細胞
抽出液〕の３４０ｍｍの吸光度の減少を日立製作所製分
光光度計（２２８型）で測定することにより求めた。ま
た、細胞抽出液の蛋白質濃度の測定には、前記実施例１
工程（５）の方法を用いた。結果を第２表に示す。
注１）第１表の注１）と同じ。
注２）コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ−ｎｅ
ｂａｃｔａｒｉｕｍ　ｍａｌａｓＳｅｃｏｌａ）　８０
１　ｍ本菌株は。
微生物工業技術研究所に、微工研条寄第５５８号として
寄託されている。
（以下余白） （１２）　　ＰＡＧｌｏｏＩの調製 コリネバクテリウム・メラセコラ（７−ｔｅｒｉｕｍ　
ｍａｌａｓｅｃｏｌａ）　８０１　（ｐＡＧｌｏｏｌ）
より前記工程（８）−■の方法に従ってＤＮＡ濃度約５
５　μｇ／ｍＱのＰＡＧｌｏｏＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ溶液を１
鵬Ω得た。
〔２〕組換えプラスミドｐＡＧ３００１の調製（１）　
コリネバクテリウム・メラセコラ８０１（Ｃｏｒ　ｎａ
ｂａｃｔｅｒｉｕｗ　＋ｗｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　８０
１）（微工研条寄第５５８号）（７）ＩＣＤＨ産生遺伝
子を有する大腸菌の選択分離 のコリネバクテリウム・メラセコラ（蝕■肚二ｂａｃｔ
ｅｒｉｕ＋＊　ｍｅｌａｓｓｓｃｏｌａ）８０１（微工
研条寄第５５８号）からの全ＤＮＡの調製とその切断 前記工程（１）−（１）に記載と同様の方法によ’ＪＤ
ＮＡ濃度０　、８５ｍｇ／ｗａ　（７）全ＤＮＡ溶液を
得た。
全ｆ）ＮＡの切断のためには、４０μｇの全ＤＮＡに対
して、１６０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩにッポンジーン
社より購入）を加え、５ｏＩＩＭトリスーＨＣＱ　（ｐ
Ｈ７，４）、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１の緩衝液７０μρ中で３７℃にて３０分間反応させ
た。その後７０℃で１０分間加熱して反応を停止させた
。
■ベクターｐＢＲ３２５の調製と開裂 先ず、ベクターｐＢＲ３２５をエシェリヒア・コリＫ　
１２ＥＢ　１０６　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ　Ｋ　１２ＥＢ１０６）に移入し、得られた形質転換
株からｐＢＲ３２５を調製した。エシェリヒア・コリに
１２Ｅｅｌ　Ｏ６（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｆａ　ｃｏｌｉ
　Ｋ　１２　　ＥＢＩ　ＯＳ）を５０ｍＱのＬ−ブロス
（ポリペプトン１０　ｇ　／　１２、酵母エキス５　ｇ
　／　Ｑ　、　ＮａＣ１５ｇ　／　Ｑ　ｐＨ７，２）に
植菌し、３７℃にて菌濃度５　Ｘ　１０”個乙ｌまで増
殖させた後、２℃で集菌した。該菌体を５０＋Ωの氷冷
した１００ｍＭにｇＣＱ　、水溶液に懸濁し、集菌後頁
に２５＋ｅｆｉの氷冷した１　００　ｍＭ　ＣａＣＱ２
水溶液に懸濁した。水中で３０分間保持した後、集菌し
て再度５■Ωの氷冷した１　００　ｍＭ　ＣａＣＱｚ水
溶液に懸濁し、水中で１時間保持した〔コンピテントセ
ル（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ）］、この菌懸濁液
２００μΩに０．１μｇのｐＢＲ３２５ＤＮＡを添加し
て、水中で１時間保持した。その後４２℃にて２分間保
持した後、５履ＱのＬ−ブロスを添加して、３７℃にて
９０分間静置培養した。得られた培養液を適当に希釈し
て、３０ｇｇ／ｌｓＱのアンピシリンを添加したＬ−寒
天培地（Ｌ−ブロスに１５ｇ／Ωの寒天を添加した培地
）に塗布し３７℃で一晩培養した。得られたｐＢＲ３２
５による形質転換株より、以下のようにして該ベクター
の調製を行った。
ベクターｐＢＲ３２５を保持したエシェリヒア・コリＫ
　１２ＥＢ　１０６　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ　Ｋ　１２ＥＢ１０６）を、７’／ピシリン（３０
ｐｇ／ｍｌ）を含むＬ−ブロスＬｏｏｍに植菌し、３７
℃にて一晩振盪培養した。得られた培養液より集菌しτ
Ｅ緩衝液で洗浄後、１５％シュークロース、５０ｍＭ　
トリス　（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ（ｐＨ８，５）、　５０
ｍＭＥＤＴＡ、　２ｍｇ／ａＱリゾチウム（シグマ社、
米国より購入）よりなる水溶液２■］に懸濁し、室温に
て３０分間尺応させた０次にトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）
溶液〔０，１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、
５０ｍＭ　　トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ、　５０＋ｓ
Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、ｐＨ８，５）　２履Ｑを加えて３
７℃にて３０分間保持した０次にこの溶液を、５℃にて
３０．０００ｒｐｍ（６４，０００ｇ）で１時間遠心分
離し上溝を回収し、Ｌ、ＴＥ緩衝液を加えて１８ｍＱと
した。この液に、１０ｍｇ／ｍΩのエチジウムブロマイ
ド溶液１．２肩Ωと塩化セシウム１８．６４ｇとを加え
て静かに溶解し、４０＊０ＯＯｒｐ■（１０，ＯＯＯｇ
）　、１５℃で４８時間遠心分離した。ベクターｐＢＲ
３２５は、紫外線照射により遠心チューブ中、２本のバ
ンドの下方として見い出され、このバンドを遠心チュー
ブの側面から注射器で抜き取ることにより、ベクターｐ
ＢＲ３２５を分離した０次にこの分画液を等容量のイソ
プロピルアルコールで４回抽出して、エチジウムブロマ
イドを除去し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析して、
ＤＮＡ濃度１８０μｇ／ｖｓＱのベクターｐＢＲ３２５
の透析完了液１ｍＡを得た。
ベクターＰＢＲ３２５ＤＮＡ　　１５ｇｇに対して４５
単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを加えて、５０ｍＭトリス（
Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ　Ｍｇ５
Ｏ，、１００ｍＭ　ＮａＣ１（７）緩衝液１５０ｐｊｌ
中で３７℃にて２時間反応させた。その後、７０℃で１
０分間加熱して、反応を停止させた。この液に酢酸ナト
リウムを最終濃度３００ｍＭ３なる様に加え、２倍容の
エタノールを添加して、−３０℃にて３時間保持した０
次に１２．０００ｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠
心分離してＤＮＡ沈殿を回収し、同沈殿を減圧乾燥した
。得られた試料をＢＡＰＴ緩衝液（５０■にトリス−Ｈ
Ｃｌ、　ｐＨ８，４）　２００μΩに溶解し、バクチリ
アル・アルカリ−ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（宝酒造
株式会社より購入）を１単位添加して６５℃にて３０分
間反応させた。更に該酵素を１単位添加して６５℃にて
３０分間反応させた。その後、反応液に等容のＴＮＥ緩
衝液で飽和したフェノールを加え、混合した後、１２．
０００ｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離して
水層を回収し、更にもう一回同じ操作を繰り返した０次
に水層に等容のフェノール・クロロホルム（１：　ｌ　
、　Ｖ／Ｖ）液を添加して混合した後。
１２．０００　ｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心
分離し、水層を回収した。更に水層に等容のクロロホル
ムを添加して攪拌した後、１２．０００ｒｐｍ（８，９
００ｇ）で１０分間遠心分離し、水層を回収した。該水
層に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍ１Ｐ！になる様
に加え、２倍容のエタノールを添加し攪拌した後、−３
０℃にて３時間保持した。その後、　１２．ＯＯＯｒｐ
ｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿
を回収した。これを減圧乾燥した後、３０μΩのＴＥ緩
衝液で溶解した。
■ＤＮＡの組換え反応 前記工程（２）−（１）−〇のＤＮＡ４μｇと前記工程
（２）−（１）−〇のＤＮＡ２μｇと３単位のＴ４ファ
ージＤＮＡリガーゼにッポンジーン社より購入）とを、
５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）　−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４
）、１０ｍＭ　ＭｇＣ４ｍ３．１０ｍＭジチオトレイト
ール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒａｉｔｏｌ）、１ｍＭスペル
ミジン（Ｓｐｅｒ−ｍｉｄｉｎｅ）、１ｍＭ　ＡＴ　Ｐ
、　Ｏ、１ｍｇ／ｍｆｆ１ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖ
ｉｎａ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ、以下ＢＳＡと称
す）（ベゼスダリサーチラボラトリー社、米国より購入
）の緩衝液１００μα中で、１５℃にて−晩反応させた
。その後、７０℃にて１０分間加熱することにより１反
応を停止させた。
０組換えプラスミドの大腸菌への移入 前記工程（２）−（１）−〇の方法により、エシェリヒ
ア・コリＫ　１２　ＥＢ　１０６　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ収１ｉＫ１２　　ＥＢ１０６）のコンピテントセ
ル（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ）を調製した。得ら
れた細胞懸濁液４００μＱと前記工程（２）−（１）−
〇の反応液４ｏμＱとを混合して、水中に１時間保持し
た。
その後、４２℃にて２分間加熱した後、５ｍｇのし一ブ
ロスを添加して３７℃にて９０分間静置培養した０次に
、得られた培養液から集菌し、無菌水に懸濁した。得ら
れた懸濁液を、合成寒天培地（Ｎａ、ＨＰＯ４６ｇ／　
Ｑ　、にＨ，Ｐｏ、　３ｇ／ｆｆｉ　、　ＮａＣ１Ｏ，
５ｇ／ｆｆ、Ｎ）１４ＣＩ　Ｉｇ／ｆｉ　、Ｍｇ５０．
１ｍＭ、　ＣａＣｊｉ、　０．１ｍＭ、グルコース２ｇ
ＩＱ、寒天１５ｇ／旦、Ｌ−トリプトファン０．１ｍＭ
）を塗布して培養した。このようにして得られた菌株を
、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｕ）とテトラサ
イクリン（１０μｇ／■ｎ）とを含む前記合成寒天培地
と、テトラサイクリン（１０μｇｅｍΩ）のみを含む前
記合成寒天培地とでそれぞれ培養し、生育の有無を調べ
た。その結果、クロラムフェニコール感受性テトラサイ
クリン耐性グルタミン酸非要求性を示す菌株を、目的の
ＩＣＤＨ産生遺伝子を保有した大腸菌エシェリヒア・コ
リ　　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ　　
１　２　　　　Ｅ　　Ｂ　　１　０　６　　　（ｐＡＧ
３０２）として分離した。
該大腸菌のＩＤＣＨ活性を、下記の方法で測定すること
により、クローニングした遺伝子がＩＣＤＨ産生遺伝子
であることを確認した。前記Ｌ−ブロス５０ｗＭで、エ
シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉ−曲」４遠■）Ｋ１
２　（ｐＡＧ３０２）を３２℃で振盪培養した。該大腸
菌を集菌後、２＋ａｆｆｉのＭＥＳ緩衝液（５０＋Ｍ２
−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（２−（Ｎ　
−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃ
ａｃｉｄ）　：　ＭＥ　Ｓ、　１０ｍＭ　Ｍｎ　ＳＯ４
，１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７，０）に懸濁した。これを
超音波処理した後、１４０００ｒｐｍ＋　（２００００
ｇ）で２０分間遠心分離して、細胞抽出液（粗酵素液）
を調製した。尚、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
−肋ハ罠！は）Ｋ１２　　ＥＢ１０６　　（ｐＢＲ３２
５）。
エシェリヒア・コリ（［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）　Ｋ　１２ＥＢ１０６　（ｐＡＧ３０２）を培養
する場合には。
前記Ｌ−ブロスにテトラサイクリン１０μｇ／■ａを添
加した。エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ
組■）Ｋ１２　ＥＢ１０６　（ｐＡＧ３０３）を培養す
る場合には、前記Ｌ−ブロスにアンピシリン３０μｇ７
’ｗｎを添加した。エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏ旦）Ｋ１２　ＥＢ１０６　（ｐＡＧ３
１１）を培養する場合には、前記Ｌ−ブロスにクロラム
フェニール２０μｇ／■αを添加した。また。
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）　Ｋ　１２ＥＢ１０６やエシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ吐）Ｋ１２ＥＢ１０６　（ｐＢＲ３
２５）を培養する場合には、前記Ｌ−ブロスに、グルタ
ミン酸ナトリウム（ＭＳＧと略す）２ｇ／ｌを添加した
。
ＩＣＤＨ活性は、２．９ｍＭの酵素反応液（１０：（ｍ
阿　トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ　　（ｐＨ７，４）　
　１ｍＭイソクエン酸塩（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ）　、
１　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｎ　Ｃｎ　、　。
０．５ｍＭ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　Ａｄｅｎｉｎｅ
　Ｄｉｎｕ−ｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、
　０ｘｉｄｉｚｅｄ　Ｆｏｒｍ、以下ＮＡＤＰと略す）
、４０μΩ細胞抽出液〕の３４０ｎ■の吸光度の増大を
１日立分光光度計（２２８型）で測定するととにより求
めた。また、細胞抽出液の蛋白質濃度の測定には、ロー
リ−（Ｌｏｖｒｙ）ら〔オー・エイチ・ローリ−（０，
Ｈ，Ｌｏｖｒｙ）　、エフ・ジェイ・ローウェブロー（
Ｎ、Ｊ、Ｒｏｖｅｂｒｏｕｇｈ）　、アール・ジェイ・
ランダル（Ｒ，Ｊ、Ｒａｎｄａｌｌ）　、ジェイ・パイ
オル・ケム（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　１９３巻、
２６５頁１９５１年〕の方法を用いた。尚、同測定の標
準蛋白質として、ウシ血清アルブミン（和光紬薬工業社
より購入）を用いた。
測定結果を第３表に示す、第３表のＩＣＤＨＣＤ性測定
結果より、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ−ｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　　ＥＢ１０６　（ｐＡＧ３
０２）は、明らかにＩＣＤＨ活性を回復していた。
（２）　複合プラスミドｐＡｇ３０２の分離と解析エシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
　Ｋ１２　ＥＢ１０６　（ｐＡＧ３０２）より、前記工
程（１）−（２）の方法でプラスミドｐＡＧ３０２のＤ
ＮＡを、１６０μｇ分離精製した。このＤ　Ｎ　Ａ　０
．３μｇに、各１０単位の制限酵素（ＥｃｏＲＩｓＢａ
ｍＨＩ　にッポンジーン社より購入）　、　Ｈｉｎｄｍ
　にツボフジ−２社より購入）、Ｐｓｔｌ（ベゼスダリ
サーチラボトリー社、米国より購入）、５ａｌｌにツボ
フジ−２社より購入）、ＸｂａＩにッポンジーン社より
購入）〕を、それぞれの適正条件にて反応させ、その消
化した試料を前述の方法に従い１％アガロースゲル電気
泳動、および４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
した。泳動の終ったゲルを１μｇ／ｗ　Ｑエチジウムブ
ロマイド水溶液に浸漬して３０分間染色した後、紫外線
をゲルに照射して生成断片の数を判定し、各断片の泳動
距離から各々の分子量を算出した。尚１分子量は、同一
アガロースゲル上で同時に電気泳動したラムダファージ
（λｐｈａｇｅ）　Ｄ　Ｎ　Ａ　にツボフジ−２社より
購入）の制限酵素Ｈｉｎｄ　ｍによる消化断片の既知分
子量に、または同一ポリアクリルアミドゲル上で同時に
電気泳動したファイエックス１７４フアージ（φＸ１７
４　ｐｈａｇａ）　ＤＮＡの制限酵素Ｈａｅ　ｍによる
消化断片（ベゼスダリサーチラボラトリー社より購入）
の既知分子量に、基づいて算出した。更に、複数の制限
酵素処理によって生じた消化断片を解析することにより
、プラスミド分子中の各制限酵素切断部位を決定した。
このようにして得られたプラスミドｐＡＧ３０２の制限
酵素切断地図を第７図に示す。
その結果、プラスミドｐＡＧ３０２は、ベクターのｐＢ
Ｒ３２５の制限酵素の切断部位に約５．ｌｋｂのＩＣＤ
Ｈ遺伝子を含む外来のＥｃｏＲＥ断片が、組み込まれて
いた。このＥｃｏＲＩ断片がコリネバクテリウム０メラ
セコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　＋５ｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ）８ｏ１（微工研条寄第５５８号）由来
のＩ　ＣＤＨ産生遺伝子を含む断片である。
プラスミドｐＡＧ３０２　Ｄ　Ｎ　Ａにより、前記工程
〔１〕−（２）の方法でエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ−
ｈｅｒｉｃｈｉａ収旦）Ｋ１２　ＥＢ１０６を形質転換
した。その結果、調べた形質転換株は、全てテトラサイ
クリン耐性アンピシリン耐性クロラムフェニコール感受
性グルタミン酸非要求性であった。更に、該形質転換株
について、それらが保有するプラスミドを解析した結果
、それらのプラスミドは、供与プラスミドと比べて制限
酵素切断様式で同一と判定されるプラスミドであった。
（３）　　ＩＣＤＨ生産遺伝子を含む約５．１キロベー
スのＤＮＡ断片の縮小化 前記工程（２）で調製したプラスミドｐＡＧ３０２　Ｄ
ＮＡ　３μｇに対して２０単位の制限酵素５ａＱＩを加
えて、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）　−ＨＣＱ　（ｐＨ
７，４）、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，，１００ｍＭ　ＮａＣ
Ｊｌの緩衝液５０μＱ中で３７℃にて２時間反応させた
。
そこへ等容のフェノール・クロロホルム（１：　１゜ｖ
　／　ｖ　）液を添加して攪拌の後、水層を回収した。
更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回
収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭに
なるように加え、次に２倍容のエタノールを添加して、
−３０℃で３時間保持した後、１２　ｐ　ＯＯＯｒｐｍ
　（８ｔ　９００　ｇ　）で１０分間遠心分離してＤＮ
Ａの沈殿を回収し、これを減圧乾燥した（ＤＮＡ試料Ｉ
）。
前記のＤＮＡ試料Ｉの全量に対して、３単位のＴ、ファ
ージＤＮＡリガーゼを５０　ｍ　Ｍ　トリス（Ｔｒｉｓ
）−ＨＣＱ　　（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　ＭｇＣａ
２．１０ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒ
ｅｉｔｏｌ）、１ｍＭスペルミジン（Ｓｐａｒｍｉｄｉ
ｎａ）　、１　ｍＭＡＴＰ、Ｏ，１ｍｇ／ｍｆｆ１　　
ＢＳＡの緩衝液５０μＱ中で、１５℃にて一晩反応させ
た。その後、７０℃にて１０分間加熱することにより、
反応を停止させた。
このリガーゼ反応液を用いて、前記工程〔２〕−（１）
の方法により、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　　Ｅ　８１０　Ｂの形
質転換操作を行った。その結果、アンピシリン耐性クロ
ラムフェニコール感受性テトラサイクリン感受性グルタ
ミン酸非要求性を示す形質転換株を多数分離することが
できた。これらの菌株について、前記工程（２）の方法
により、各形質転換株の保有するプラスミドを分離し解
析した結果、プラスミドρＡＧ３０３を取得することが
できた。得られたプラスミドｐＡＧ３０３の制限酵素切
断地図を第８図に示す。
プラスミドｐＡＧ３０３を保有する菌株エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２
　　Ｅ　Ｂ　１０６（ｐＡＧ３０３）について、前記工
程（１）の方法により、ＩＣＤＨ活性を測定した。但し
、この場合には前記Ｌ−ブロスにアンピシリン３０μｇ
　／ｍｌを添加した。その結果、第３表に示すように、
ＩＣＤＨ活性の明らかな回復が認められた。プラスミド
ｐＡＧ３０３はベクターｐＢＲ３２５由来のＥｃｏＲＩ
　−Ｓａα夏断片に約３．４キロベースの外来のＥｃｏ
Ｒｌ−３ＡＱＩ断片が組込まれていた。このＥｃｏＲＩ
　−５ＡΩ■断片が、コリネバクテリウム・メラセコラ
（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　＋ａｅｌａｓｓｅ
ｃｏｌａ）　８０１　（微工研条寄第５５８号）由来の
ＩＣＤＨ生産遺伝子を含むＤＮＡ断片である。
プラスミドｐＡＧ３０３　　ＤＮＡにより、前記工程（
２］　−（１）の方法で、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦）Ｋ１２　ＥＢ１０６を形質
転換した。得られた形質転換株を調べた結果、調べた形
質転換株は、全てクロラムフェニコール感受性アンピシ
リン耐性テトラサイクリン感受性グルタミン酸非要求性
であった。更にそれら形質転換株について、それらが保
有するプラスミドを解析した結果、それらのプラスミド
は、供与プラスミドと比べて制限酵素切断様式で同一と
判定されるプラスミドであった。
（以下余白） （４）　　ＩＣＤＨ生産遺伝子を含む約３．４キロベー
スのＥｃｏＲＩ　−５ａ　Ｑ　Ｉ断片におけるＥｃｏＲ
Ｉ末端５ａｌＩ末端への変更前記工程（２）で調製した
プラスミドｐＡＧ３０２ＤＮＡ　５μｇに対して２０単
位の制限酵素ｆ！ｃｏＲＩを加えて５０ｍＭトリス（Ｔ
ｒｉｓ）　−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ　Ｍｇ
５Ｏ，，１００ｍＭ　ＮａＣｎの緩衝液１００μ０で３
７℃にて、２時間反応させた。
その後、７０℃で１０分間加熱して、反応を停止させた
。この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになる
様に加え、２倍容のエタノールを添加して、−３０℃に
て３時間保持した０次に１２゜０００ｒｐｍ　（８，９
００ｇ）で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収し、
得られた沈殿を減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。
ＤＮＡ試料■と３単位Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ　４
Ｄ　Ｎ　Ａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）　　（宝酒造株式
会社より購入）とを、３３　ｍ　Ｍ　トリス（Ｔｒｉｓ
）　−ＣＨ，Ｃ００Ｈ（ｐＨ７，９）、６６ｍＭ　ＣＨ
，Ｃ００Ｋ、１０　ｍ　Ｍ　（ＣＨｘ　ＣＯＯ）ａ　Ｍ
　ｇ、０．５ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔ
ｈｒｅｉｔｏｌ）　、　０．１ｍｇ／ｍＱＢ　Ｓ　Ａ、
０．１ｍＭ　２’−デオキシアデノシン５′−トリホス
フェート（シグマ社、米国より購入）　、０．１ｍＭ２
′−デオキシシチジン５′　トリホスフェート（シグマ
社、米国より購入）　、　０．１ｍＭ　　２’−デオキ
シグアノシン５′−トリホスフェート（シグマ社、米国
より購入）、０．１ｍＭチミジン５′−トリホスフェー
ト（シグマ社、米国より購入）の反応液４４μα中で３
０℃にて２０分間反応させた。この液に酢酸ナトリウム
を最終濃度３００ｍＭになる様に加え、２倍容のエタノ
ールを添加して、−３０℃にて３時間保持した０次に１
２．。
００ｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離してＤ
ＮＡ沈殿を回収し、得られた沈殿を減圧乾燥した（ＤＮ
Ａ試料■）。
５ａＡＩリンカ−（Ｓ　ａ　Ｑ　Ｉ　　１ｉｎｋａｒ）
　　（宝酒造株式会社より購入）１．５μｇとＴ、ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Ｔ、　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅ）（宝酒造株式会社より購入）２
．５単位とを、６６ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）　−ＨＣ４
１（ｐＨ７，６）、１ｍＭＡＴＰ、１０　ｍＭ　Ｍ　ｇ
　ＣＱｚ、　１　ｒｎＭスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄ
ｉｎｅ）　、１５　ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈ
ｉｏｔｈｒａｉｔｏｌ）　、　０　、２ｍｇ／ｗＱ　Ｂ
　Ｓ　Ａの反応液１０μΩ中で３７℃にて１時間反応さ
せた（ＤＮＡ試料■）。
ＤＮＡ試料■の１７２量とＤＮＡ試料試料量全量、ファ
ージＤＮＡリガーゼ（Ｔ４　Ｐｈａｇｓ　ＤＮＡｌｉｇ
ａｓｅ）　６単位とを、６６　ｍ　Ｍ　トリス（Ｔｒｉ
ｓ）−Ｈｅｌｌ　（ｐＨ７，６）、　１ｍＭ　ＡＴＰ、
１０ｍＭＭｇＣｆ１．．１ｍＭスペルミジン（Ｓｐｅｒ
ｍｉｄｉｎａ）　、１５　ｍＭジチオトレイトール（Ｄ
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）　、　０．２＋ｗｇ／ｍ
ＱＢｓＡ（７）反応液２２９Ｑ中で２２℃にて４時間反
応させた。この反応液に等容のフェノール・クロロホル
ム（１：１ｖ／ｖ）液を添加して攪拌の後、水層を回収
した。更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水
層を回収した。そこへ酢酸す°トリウムを最終濃度３０
０ｍＭになる様に加え、次に２倍容のエタノールを添加
して、−３０℃で３時間保持した後、１２　、　ＯＯＯ
ｒｐｍ　（８ｔ９００ｇ）で１０分間遠心分離してＤＮ
Ａ沈殿を回収し、これを減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）
。
ＤＮＡ試料試料量全量して、１５単位の制限酵素５ａｆ
ｆｉＩを加えて、５０　ｍ　Ｍ　トリス（Ｔｒｉｓ）−
ＨＣｊｌ　（ｐＨ７，４）　、　１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４
，１００ｍＭＮａｃｆｉの緩衝液５０μｎ中で３７℃に
て、２時間反応させた。消化した試料は、前記の方法に
より、１％アガロースゲル電気泳動に供した。
ただし、電気泳動には、ベゼスダリサーチラボトリー社
より購入したＬＭＰアガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）を使
用し、４℃で電気泳動した０次にエチジウムブロマイド
で染色したアガロースゲルを紫外線照射下に置き、約３
．４キロベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、その付近
の７ガロースゲルを切り出した。切り出したアガロース
ゲルにその重量の３倍量のＴＥ緩衝液を加えて、６５℃
で１０分間加熱し、アガロースゲルを完全にとかした６
次に等容のフェノールを添加して攪拌の後、水層を回収
した。得られた水層に等容のフェノール・クロロホルム
（１：ｌｖ／ｖ）液を添加して攪拌の後、水層を回収し
た。更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層
を回収した。得られた水層に酢酸ナトリウムを最終濃度
３００ｍＭになるように添加し、更に２倍容のエタノー
ルを加えて攪拌の後、−３０℃で３時間保持した。その
後。
１０　Ｆ　ＯＯＯｒｐｍ　（９ｐ　ＯＯＯｇ　）で１０
分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収した１次に、得られ
た沈殿を減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。
前記工程（１）−（２）で調製したプラスミドｐＢＲ３
，２５のＤＮＡ　４μｇに対して、２０単位の制限酵素
５ａｎＩを加えて、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）　−Ｈ
Ｃ１１（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，。
１００ｍＭＮａＣｌ２の緩衝液５０μΩ中で３７℃で２
時間反応させた。そこへ等容のフェノール・クロロホル
ム（１：１ｖ／ｖ）液を添加して攪拌の後、水層を回収
した。更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水
層を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００
ｍＭになるように加え、次に２倍容のエタノールを添加
して、−３０℃で３時間保持した後、１２．ＯＯＯｒｐ
ｍ（８゜９００ｇ）で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈
殿を回収し、これを減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。
ＤＮＡ試料試料量全量ＮＡ試料試料量全量単位のＴ、フ
ァージＤＮＡリガーゼとを、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ
）−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）、１０ｍＭＭｇＣＱ２．１
０ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒａｉｔ
ｏｌ）、１ｍＭスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎａ）
、１　ｍ　Ｍ　ＡＴＰ。
０．１ｍｇ／ｍＮ　　ＢＳＡの緩衝液１００／ｊｆｉ中
で、１５℃にて一晩反応させた。その後７０℃にて１０
分間加熱することにより、反応を停止させた。
このリガーゼ反応液４０μΩを用いて、前記工程（２）
−（１）の操作を行った。その結果、得られた菌株を、
テトラサイクリン（１０μｇ　／　ｍ　Ｑ　）とクロラ
ムフェニコール（２０ｕｇ／ｒｒｗ２）とを含む前記合
成寒天培地と、クロラムフェニコール（２０μｇ　／　
ｍ　（１）のみを含む前記合成寒天培地とでそれぞれ培
養し、生育の有無を調べた。その結果、グルタミン酸非
要求性で、テトラサイクリン感受性クロラムフェニコー
ル耐性を示す菌株を分離した０次に、これらの菌株から
前記工程〔１〕−（２）の方法により、それぞれの菌株
の保有するプラスミドを単離精製した。これらのプラス
ミドＤＮＡを用いて、前記工程（２）−（２）の方法に
より、各プラスミドの構造を調べた結果、目的の複合プ
ラスミドｐＡＧ３１１を取得した。プラスミドｐＡＧ３
１１は、プラスミドｐＢ１３２５の制限酵素５ａｎｌ切
断部位に、約３．４キロベースのＩＣＤＨ生産遺伝子を
含む外来の５ａｎＩ断片が組込まれていた。
得られたプラスミドｐＡＧ３１１の制限酵素切断地図を
第９図に示す、この５ａｎＩ断片が、コリネバクテリウ
ム９メラセコラ（Ｃａｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍ
ｅｌａｓｓｅｃ。
旦）８０１（微工研条寄第５５８号）由来のＩ　ＣＤＨ
産生遺伝子を含む約３．４キロベースのＥｃｏＲＩ　−
５ａｆｆｉＩ断片のＥｃｏＲＩ末端を５ａｆｉＩ末端に
変更したＤＮＡ断片である。
プラスミドＰＡＧ３１１を保有する菌株エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２
　　ＥＢ　１０６（ｐＡＧｊｌｌ）について、前記工程
（２］−（１）の方法により、ＩＣＤＨ活性を測定した
。但し、この場合には前記Ｌ−ブロスにクロラムフェニ
コール２０μｇ／ｍｌを添加した。その結果、第３表に
示すように、ＩＣＤＨ活性の明らかな回復が認められた
。
プラスミドＰＡＧ３１１　ＤＮＡにより、前記工程〔２
〕−（１）の方法で、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
−ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　Ｅ　Ｂ　１０
６を形質転換した。
その結果、Ｗべた形質転換株は、全てテトラサイクリン
感受性クロラムフェニコール耐性アンピシリン耐性グル
タミン酸非要求性であった。更に該形質転換株について
、それらが保有するプラスミドを解析した結果、それら
のプラスミドは、供与プラスミドと比べて制限酵素切断
様式で同一と判定されるプラスミドであった。
第３表 注１）反応液中の蛋白質１ｍｇが、１分間に生成させた
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ（Ｎｉｃｏｔ土ｎａｍｉｄａ　Ａｄ
ａｎｉｎｓ　Ｄｉ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ、　Ｒｅｄｕｃｅｄ　Ｆｏｒｍ）のマイクロモ
ル数で表示しである。
注２）イー・コリ　ジェネティック　ストックセンター
（Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅ
ｎｔｅｒ）、デパートメントオブヒューマンジェネティ
ックス、エールユニバーシティ、スクールオブメディシ
ン、３３３シーダーストリート、ビー・オー・ボックス
３３３３．ニューヘイブン、コネチカット０６５１０、
アメリカ合衆国（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｕｍ
ａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｙａｌａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｅｃｉｎａ。
３３３　Ｃｅｄｅｒ　５ｔｒｅｅｔ　Ｐ、　Ｏ，Ｂｏｘ
　３３３３．　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ。
Ｃｏｎｎ５ｃｔｉｃｕｔ　０６５１０υ、　Ｓ、　Ａ）
のバーバラシェイパツクマン（Ｂａｒｂａｒａ　Ｊ、　
Ｂａｃｈｍａｎｎ）より分譲されたエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２の変異株
である０本菌株は、ＩＣＤＨ活性を欠損している。尚、
上記機関からは、誰でも該菌株の分譲を受けることがで
きる。
（５）　プラスミドｐＡＧ３１１からのＩＣＤＨ産生遺
伝子を含む約３．４キロベースの Ｓａｎｇ断片の分離 前記工程（２）−（４）で調製したプラスミドｐＡＧ　
３１１（７）ＤＮＡ２０ｕｇニ対シテ、制限ＷＩＪ素Ｓ
ａ　Ｑ　Ｉを６０単位加えて、　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｆｌ　（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，，
１００ｍＭ　ＮａＣＱの緩衝液１００μΩ中で、３７℃
にて２時間反応させた。消化した試料は、前記工程（１
）−（７）の方法によりアガロースゲル電気泳動に供し
た０次にＩＣＤＨ産生遺伝子を含む約３．４キロベース
のＤＮＡ断片の存在を確認し、その付近のアガロースゲ
ルを切り出した。切り出したアガロースゲルからのＤＮ
Ａの抽出は、前記工程（１１−（７）の方法を用いた。
その結果、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＩＣ
ＤＨ産生遺伝子を含む約３．４キロベースのＥｃｏＲＩ
　−Ｓａ　Ｑ　Ｉ断片の制限酵素ＥｃｏＲＩ処理によっ
て生じる末端を制限酵素ＳａＱ■処理によって生じる末
端に変更した断片を約４μｇ取得した。
（６）　プラスミドｐＡＧ５ｏへのＩＣＤＨ産生遺伝子
を含むＤＮＡ断片の組込み。
前記工程［１）−（８）−〇で調製したプラスミドｐＡ
Ｇ５０のＤＮＡ５μｇに対して、制限酵素５ａＱｌを１
５単位加えて、５０　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ
７，４）、　１０ｍＭ　Ｍｇ　Ｓｏ、、　１００ｍＭＮ
　ａ　ＣＱの緩衝液６０μα中で、３７℃にて２時間反
応させた。その後、７０℃で１０分間加熱して、反応を
停止させた。この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００
ｍＭになる様に加え、２倍容のエタノールを添加して、
−３０℃にて３時間保持した０次に１２　ｖ　ＯＯＯｒ
ｐｍ（８ｔ　９００　ｇ　）で１０分間遠心分離してＤ
ＮＡ沈殿を回収し、同沈殿を減圧乾燥した。得られた試
料をＢＡＰＴ緩衝液（５０ｍ　Ｍ　トリス（Ｔｒｉｓ）
　−ＨＣＱ　、　ｐＨ８，４）２００μΩに溶解し、バ
クチリアル・アルカリ・ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒ
ｉａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔ−ａｓａ
）　（宝酒造株式会社より購入）を１単位添加して６５
℃にて３０分間反応させた。更に該酵素を１単位添加し
て６５℃で３０分間反応させた。その後１反応液に等容
のＴＮＥ緩衝液で飽和したフェノールを加え、混合した
後、１２．ＯＯＯｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠
心分離して水層を回収し、更にもう１回同じ操作を繰り
返した１次に水層に等容のフェノール・クロロホルム（
１：１、ｖ　／　ｖ　）液を添加して混合した後。
１２、ＯＯＯｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分
離し、水層を回収した。更に水層に等容のクロロホルム
を添加して攪拌した後、１２．００Ｏｒｐｍ（８、９０
０ｇ）で１０分間遠心分離し、水層を回収した。該水層
に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになる様に加え
、２倍容のエタノールを添加し攪拌した後、−３０℃に
て３時間保持した。その後、１２，０ＯＯｒｐ園（８，
９００ｇ）で１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿を回収し
た。
これを減圧乾燥した。このＤＮＡ全量と前記工程（２）
　−（５）で調製したＤＮＡ　１μｇと３単位のＴ４フ
ァージＤＮＡリガーゼにッポンジーン社より購入）とを
５０　ｍ　Ｍ　）−リス（Ｔｒｉｓ）−１（ＣＩ（ｐＨ
７，４）、　１０　ｍＭ　ＭｇＣΩ２．１０　ｍＭジチ
オトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒａｉｔｏｌ）、１
ｍＭスペルミジン（Ｓｐａｒ＋ｍ１ｄｉｎａ）、　１　
ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐ　、　０．１＋ｎｇ／ｍＱＢＳＡＣベ
ゼスダリサーチラボラトリー社より購入）の緩衝液５０
μΩ中で、１５℃にて一晩反応させた。その後、７０℃
にて１０分間加熱することにより、反応を停止させた。
（以下余白） （７）　　ＩＣＤＨ産生遺伝子を含有した複合プラスミ
ドｐＡＧ　３００１の取得 前記工程（２）−（６）で得られたりガーゼ反応液５０
μａを用いて前記工程（１）−（８）−〇と同じ形質転
換操作によりコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃａｒ
　ｎｅｂａｃｔａｒｉｕ＋ｍ　ｍｅｌａｓｓａｃｏｌａ
）　８０１（微工研条寄第５５８号）の形質転換操作を
行なった・ 得られたテトラサイタリン耐性形質転換株を。
テトラサイクリン１０μｇ乙ｉを含むＬＧ寒天培地（Ｌ
−寒天培地にグルコース５ｇ／Ｑを添加した培地）上で
純化した後、各菌株から前記工程（２）　−（６）の方
法により、プラスミドを分離し、前記工程（１）−（６
）の方法によりそれらのプラスミドを解析した。その結
果、プラスミドＰＡＧ３００１を取得した。プラスミド
ｐＡＧ３００１は第１０図に示した様に、プラスミドｐ
ＡＧ５０の制限酵素ＳａＱ■切断部位に、グルタミン酸
生産性コリネ型細菌由来ＩＣＤＨ産生遺伝子を含む約３
．４キロベースのＤＮＡ断片が組込まれた複合プラスミ
ドである。
（８）プラスミドＰＡＧ　３００１保有菌株のＩ　ＣＤ
Ｈ活性の測定 プラスミドＰＡＧ　３００１保有のコリネバクテリウム
・メラセコラ（Ｃａｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅ
ｌａｓｓｅｃｏｌａ）＋３０１（ｐＡＧ３００１）をテ
トラサイクリン１０μｇ／ｍΩ含有ＬＧリン酸培地（Ｌ
−ブロスに、グルコース２ｇＩＱ、に、ＨＰＯ，０，７
ｇ／Ｊ、ＫＨ，Ｐｏ。
０．３ｇ／ｆｌを加えてＰＨ７，２に調整した培地）５
０＋ａＱで、３２℃にて一晩振盪培養した。この培養液
より集菌し、０．８％ＮａＣΩ水溶液２０■悲で２回洗
浄後、　ＭＥＳ緩衝液１０＊１２に懸濁した。
これを、ブラウン社製のＭＳＫセルホモジナイザー（８
５３０２１型）で処理した後、１４０００ｒｐｍ＋（２
００００ｇ）で２０分間遠心分離して、細胞抽出液（粗
酵素液）を調製した。この細胞抽出液を用りまたＩＣＤ
ＨＣＤＨ活性は、前記工程〔２〕−（１）の方法により
行った。その結果、第４表に示した様に、プラスミドＰ
ＡＧ３００１保持菌株は、ベクターｐＡＧ５０保持菌株
やプラスミド非保持菌株に比べて、高いＩＣＤＨＣＤ性
を示した。尚、プラスミド非保持菌株の培養はテトラサ
イクリン無添加で行った。
第４表 注１）第３表の注１）と同じ 注２）第２表の注２）と同じ （９）　　ｐＡＧ３００１の調製 Ｃｏｒ　　ｎｅｂａｃｔａｒｉｕｍ　　−ａｌａｓｓｅ
ｃｏｌａ　　８０１（ｐＡＧ３００１）を糖蜜培地１０
０＋１１２で培養し、前記工程（１）　−（１０）と同
様の方法で処理することによりｐＡＧ３００１　ＤＮＡ
溶液（約５０ｕｇ／ｍｆｉ）１．２ｍＭを得た。
（３）ＧＤＨ遺伝子とＩＣＤＨ遺伝子を含む組換えプラ
スミドの作製 （１）ＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製前記工程〔
１〕で得られたｐＡＧｌｏｏｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（２μｇ
）を１００μＡの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ
７，５）、１００ｍＭＮａＣＱ　、　１０ｍＭ　Ｍｇ５
Ｏ，の緩衝液中で、１０単位の５ａｊｌＩにより３７℃
で２時間反応させることにより切断した０本ＤＮＡ溶液
に等容のフェノール／クロロホルム液を加えて攪拌、遠
心分離（１２＝　００　Ｏｒｐｍ　（８ｔ　９００ｇ）
、５分〕後、水層を回収し、さらに等容のクロロホルム
を加えて上記操作を繰り返した。水層に１／１０容の酢
酸ナトリウム（３Ｍ）と２．５倍容のエタノールとを添
加混合後−８０℃で３０分間静置し、遠心分離（１２，
０００ｒｐｍ（８，９００ｇ）、１０分間〕により沈殿
を分離した。これに７０％エタノール水溶液を少量加え
て遠心洗浄後、沈殿を減圧乾燥させてｐＡＧｌｏｏｌ　
ＤＮＡのＳａΩ工分解物を得た（ＤＮＡ試料■）。
（２）　Ｉ　ＣＤ　Ｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製前
記工程〔２〕で得られたＰＡＧ３００１　ＤＮＡ溶液　
２００ｕ　Ｑ　　（１００μｇＤＮＡ）を５０ｗＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｎ　（ｐＨ７，５）、１００ｍＭ　ＮａＣ
ｆ１．１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４の緩衝液４００μＱ中で５
ａｆｌＩ（２０単位）で切断した０反応は３７℃で２時
間行った０反応液を７０℃で１０分間加熱して制限酵素
を失活させた後、アガロースゲル電気泳動によりＩＣＤ
Ｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＩＣＤＨ断片）を分離した
。すなわち、１％アガロースゲル（米国ベセスダ―リサ
ーチ・ラボラトリ−社（ＢＲＬと略す〕製のＬＭＰ−ア
ガロースを使用）を用いて、８０Ｖの定電圧、４℃で４
時間電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド水溶液
（１薦ｇ／Ｑ）に３０分間浸して染色し、紫外線（ＵＶ
）の照射下に約３．４ｋｂのＤＮＡバンドの存在を確認
した０本バンドの部分のゲルを切出してゲルの重量の３
倍のＴＥ緩衝液を加えて６５℃で１０分間加熱を行い、
ゲルを完全に溶解させた。
これに等容のフェノール液を加えて攪拌した後、２０℃
で１０．０００ｒｐｍ（９，ＯＯＯｇ）、１０分間の遠
心分離を行って、水層を回収した。さらに同様にフェノ
ール／クロロホルム抽出、およびクロロホルム抽出を行
った。尚、フェノール液、フェノール／クロロホルム液
及びクロロホルム液の調製はマニアティス等の文献（Ｔ
、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｊ
、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ、ｐｐ、４５８−４５９．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）
に従った。水層に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２
．５倍容のエタノールとを添加混合の後、−８０℃で３
０分間静置し、その後４℃で１０．ＯＯＯｒｐｍ（９，
ＯＯＯｇ）、　１０分間の遠心分離を行って、沈殿を回
収した。沈殿に少量の７０％エタノール水溶液を静かに
加えて洗浄した後、減圧乾燥してＩＣＤＨ断片を約２μ
ｇ得た（ＤＮＡ試料］Ｘ）。
（３）組換えプラスミドの作製 ＤＮＡ試料■およびＤＮＡ試料■の全量をそれぞれ少量
の蒸留水で溶解後混合し、これを５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｆｆｉ　（ｐＨ７，４）、１０＋ｍＭ　ＭｇＣＱ、、
　１０ｍＭジチオスレイトール、１鳳阿スペルミジン、
１ｍＭ　ＡτＰ、０．１ｍｇ／ｖｓ　Ｑ　ＢＳＡ（ＢＲ
Ｌ社製）の緩衝液５０μΩ中でリガーゼ反応を行った０
反応は１単位のＴ、ファージリガーゼを加えて８℃で１
晩行った０反応終了後、本反応液を７０℃で１０分間加
熱処理を行いリガーゼを失活させた。さらに上記と同様
に酢酸ナトリウムとエタノールを加えて遠心分離により
ＤＮＡの沈殿を得。
これを５０μ悲のＴＥ緩衝液に再溶解させて次の形質転
換の操作に使用した（ＤＮＡ試料ｘ）。
（４）　Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓ
ｓｅｃｏｌａ　８０１の形質転換 前記ＤＮＡ試料Ｘを用いて前記実施例１−（８）−■と
同じ操作によりコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏ
ｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ＋　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ）８０１（微工研条寄第５５８合）の形質転換を行な
った。出現したテトラサイクリン耐性コロニーをテトラ
サイクリン１０μｇｅｔｓ党を含むＩ、Ｇ寒天培地（Ｌ
Ｇ培地に寒天１５ｇ／　ａを含む培地：ＬＧ培地とはペ
プトン１０ｇ、酵素エキス５ｇ、ＮａＣａ　録、グルコ
ース２ｇを純水ＩＱに溶かしｐＨ７，２に調整したもの
）上で純化した後４℃で保存した。
〔５〕組換えプラスミドの確認 上記形質転換株の中から目的の組換えプラスミドを保持
した菌株を選択するために、プラスミドの解析を行った
。上記形質転換株２０株をテトラサイクリン１０μｇｅ
ｍ　Ｑを含むＬＧＰ培地（ＬＧ培地にｘ、ｕｐｏ、　０
．７ｇ／　ｎとＫＨ，ＰＯ４０，３ｇとを添加したもの
）５ｓ０にそれぞれ植菌して３２℃で１晩振とう培養し
た。各培養液から常法に従いプラスミドＤＮＡを分離し
た（アルカリ溶菌法：Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ
。
Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　　Ｊ、Ｓａ＋＊ｂｒｏｏｋ、（１９
８２）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ｐｐ３６８−３
６９、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ、　ＮｅｗＹｏｒｋ参照、但しリゾチーム濃度２０＋
ｍｇ／■ａ、リゾチーム処理条件を４２℃１時間に変更
した）、各ＤＮＡを５ａｌｌで切断後アガロースゲル電
気泳動を行い、５ａＩＩ処理で約１３ｋｂと約３．４ｋ
ｂの２本の断片が生じるものを目的のプラスミドとし、
そのようなプラスミドを含む菌株を２株分離した。
上記２株のうちの１株、　Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ｍｅｌａｓ−ｓｅｃｏｌａ　８０１（ｐＩＧｌｏ
ｌ）より、前記工程（１）　−（８）　−■の方法に従
って新規組換えプラスミドｐＩＧ１０１のＤＮＡ溶液（
４０μｇ／ｍ　ｎ　）を１．５ｍｆｆ１取得した０本プ
ラスミドにつき、常法に従って制限酵素による切断点地
図を決定した。結果を第１１図に示す、その結果ｐＩＧ
１０１はｐＡＧｌｏｏｌのＳａｌ　Ｉ切断点に３．４ｋ
ｂのＩＣＤＨ断片が組込まれた組換えプラスミドである
ことが判明した。
（６３ＧＤＨおよびＩＣＤＨ活性の測定前記糖蜜培地５
０ＩＩＱにＣａｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｌａ
ｓ−ｓａｃｏｌａ　８０１（ｐＩＧｌｏｌ）を植菌し、
３２℃で１晩培養した。遠心分離により菌体を集め、０
．８％（Ｖ／Ｖ）ＮａＣ１水溶液２０ｍｆｉテ２回洗浄
後、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌ
ｉｎｏ）ｅｔｈａｎａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ：Ｍ
ＥＳ、１０ｍＭＭｎ５Ｏ，、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）１２
ｍＭに懸濁した。これをブラウン社（西独）製のＭＳＫ
セルホモジナイザー（８５３０１２型）で処理した後、
１４．０００ｒｐｍ（２０，ＯＯＯｇ）で２０分間遠心
分離して細胞抽出液（粗酵素液）を調製した。同様に比
較対照としてプラスミドを保持しないＣｏｒ　ｎａｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｗ＋ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　８０１か
らも粗酵素液を得た。但し、この場合の菌の培養はテト
ラサイクリンを含まない糖蜜培地で行った。各粗酵素液
を用いてこれらのＧＤＨおよびＩＣＤＨの活性を以下の
様にして測定した。　ＧＤＨ活性は２．５ｍＭの酵素反
応液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）、
２０ｍ？（（ＮＨＪ−５Ｏい２５ｙａＭ　ＮＡＤＰＨ，
５■にα−ケトグルタル酸、１ｏ−１００μΩの細胞抽
出液〕の３０℃における３４０ｎ■の吸光度の減少を日
立分光光度計（２２８型）で測定することで求めた。ま
たＩＣＤＨ活性は２．９■Ωの酵素反応液（５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）　１ｍＭイソクエン
酸塩。
１ｍＭ　ＭｎＣＱ、、０．５ｍＭ　ＮＡＤＰ”、１０−
１００μＱの細胞抽出液〕の３０℃における３４０ｎｍ
における吸光度の増大を測定することで求めた。細胞抽
出液のタンパク質濃度はローリ−ら（０、Ｈ、Ｌｏｖｒ
ｙ　、　Ｎ　、　Ｊ　、　Ｒｏｗａｂｒｏｕｇｈ　。
Ｒ，Ｊ、Ｒａｎｄａｌｌ、（１９５１）、Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、１９３，２６５）の方法に従い、ウシ血清
アルブミン（和光紬薬工業社製）を標準タンパク質とし
て測定した。　ＧＤＨおよびＩＣＤＨの測定結果を第５
表に示したが、この結果からＣａｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　ｍａｌａｓｓｅｃｏｌａ　８０１（ｐＩＧｌｏ
ｌ）は明らかにＧＤＨとＩＣＤＨとが同時に強化されて
いることが確認された。
注１）第３表の注１）と同じ。
注２）第１表の注１）と同じ。
注３）第２表の注２）と同じ。
（ス″Ｔ：乗臼） 実施例２ 本実施例ではＡＨ＋ＩＣＤＨ＋ＧＤＨの３重強化株を作
成した例を示す。
ＡＨ遺伝子を含む組換えプラスミドとしてはｐＡＧ５０
０１を使用した。　ｐＡＧ５００１はコリネバクテリウ
ム・メラセコラ（蝕■朋α回見１姐ｍａｌａｓｓｅｃｏ
ｌａ）８０１由来のＡＨ遺伝子を含む約４，７ｋｂのＸ
ｂａ　Ｉ断片がベクタープラスミドｐＡＧ５０のＸｂａ
　Ｉ切断点に組込まれたものであり１本プラスミドの作
製方法は特願昭６１−１３６０８３に詳細に記述されて
いる。
ＩＣＤＨ遺伝子とＧＤＨ遺伝子を同時に保持するプラス
ミドとして、前記実施例１−（５）に記載したｐＩＧｌ
ｏｌを使用した。
（１）　ｐＡＧ５００１からのＡＨ遺伝子を含むＤＮＡ
断片の調製 （１）　Ａ　Ｈを欠損し、かつ制限能を欠損した宿主菌
の育種 ■ＡＨ欠損株からの染色体ＤＮＡの調製バチルス・ズブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）１６８
６０８７１（米国エフ・アイ・エイチのイー・フリース
博士（ＤｒＪ、Ｆｒａａｓｅ、ＮＩＨ，ＵＳＡ）より分
譲をうけた。
をＬ−ブロス（ポリペプトン１０ｇ／　ｆｆｉ　、酵母
エキス５ｇ／Ｑ　、　ＮａＣＱ　　Ｌｏｇ／　Ｑ　、　
ｐＨ７，２）１００ｍｊｌ　ニ植菌し。
３７℃にて一晩振どう培養した。同培養液より菌体を集
め、洗浄した後、１０■にトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｎ
（ｐＨ８，０）、１重Ｍ　ＥＤＴＡの緩衝液８鵬αに懸
濁した。これにリゾチウムを最終濃度５ｍｇ／■塁にな
るように加え、３７℃にて１時間反応させた。これにプ
ロナーゼＥ（シグマ社より購入）を最終濃度２００μｇ
／■ａになるように加え、室温で１５分間反応させた。
その後。
ドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度１％になるように添
加して３７℃にて１時間反応させた０反応終了後、反応
液と等容のＴＮＥ緩衝液（５０ｓ＋Ｍ　トリス−ＨＣｎ
、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　ＮａＣｊｌ　、　　
ｐＨ８，０）で飽和したフェノールを加え混合した後、
１０，０ＯＯｒｐ■（１１，ＯＯＯｇ）で１０分間遠心
分離して水層を回収した。この水層にフェノール・クロ
ロホルム（１：１、Ｖ／Ｖ）液を等容態えて混合の後、
１０．０００ｒｐ■（１１，０００ｇ）で１０分間遠心
分離して水層を回収した。この水層に更に等容のクロロ
ホルムを加えて混合の後、１Ｇ、０ＯＯｒｐ■（１１，
ＯＯＯｇ）で１０分間遠心分離して水層を回収した。
この水層にリボヌクレアーゼＡ（シグマ社より購入）を
最終濃度４０μｇ／ｗ　Ｑになる様に加えて３７℃にて
１時間反応させた０反応終了後、１１５容の５ＭＮａＣ
１！水溶液と１／４容の５０％ポリエチレングリコール
６．０００水溶液を添加混合し、４℃にて４時間保持し
た。得られた試料を５．０００ｒｐｍ（２，７００ｇ）
で２０分間遠心分離し、沈殿を回収した。沈殿をＴＥ緩
衝液（１０ＩＩＭトリスーＨＣｊｌ　、　１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、　ｐＨ７，５）４ｍΩに溶かし、酢酸ナトリウム
を最終濃度３００諺阿になるように加えて、２倍容のエ
タノールを添加した。同試料を攪拌の後、−３０℃にて
３時間保持し、１０．００Ｏｒｐｍ（１１，０００ｇ）
で２０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
同沈殿を減圧乾燥の後、　ＴＥ緩衝液５ｍΩに溶解し。
ＤＮＡ濃度０．３５ｍｇ／ｖａ　ｆｌ　（７）全ＤＮＡ
溶液を得た。　（ＤＮＡ試料ＸＩ） ■製限能欠損株の形質転換 バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ）１６８にＩ　１１３（アルギニン要求かつトリ
プトファン要求かつ制限能欠損株）（大阪大学工学部、
合葉修−教授より分譲をうけた。〔命中ら、ジャーナル
オブバクテリオロジー、第１４６巻、　１０９１−１０
９７頁、１９８１年（Ｉｍａｎａｋａ　ａｔ　ａｌ、、
　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１４６゜１０９１−１０
９７．（１９８１）］、　）を］Ｌ−ブＯＸ５ｍ　Ａ　
ニ植菌し。
３７℃にて１晩培養した。その培養液２■Ｑを１４ｇ／
　ＱＫＪＰＯ＊、６ｇ／ｆｉ　ＫＨ，ＰＯい２ｇ／　Ｑ
　硫酸アンモニウム、Ｉｇ／　ｎ　　クエン酸ナトリウ
ム、５ｇ／　Ｑ　　グルコース、０．２ｇ／ΩＭｇＳＯ
４・７Ｈ２０，０，２ｇ／Ｎ　　カザミノ酸（ディフコ
社製）、５０ｍｇ／　Ｍ　Ｌ−アルギニン、５０ｍｇ／
　ｎ　Ｌ−トリプトファンを含む培地４０ｍ２に移植し
、３７℃で４時間振とう培養後、その培養液ｈｌを１４
ｇ／Ωに、　ＨＰＯい６ｇ／１２ＫＨ，ＰＯい２ｇ／　
ｆｆｉ　硫酸アンモニウム、Ｉｇ／　Ｑ　　クエン酸ナ
トリウム、５ｇ／ｆｆｉ　　グルコース。
０．２ｇ／Ｑ　Ｍｇ５Ｏ，−７８，Ｏ，０，１ｇ／１２
　　カザミノ酸、５＋ｓｇ／ΩＬ−アルギニン、５ｙｓ
ｇ／Ｑ　Ｌ−トリプトファンを含む培地３６■Ωに移植
してさらに３７℃で９０分間振どう培養した１本培養液
１曹ａに、前記工程■で得られたＤＮＡ試料Ｘ　１１０
０μＱを加えて３７℃で３０分間はげしく振どう培養後
、５０ｍｇ／１２のＬ−トリプトファンとＩｇ／　Ｑの
Ｌ−グルタミン酸ナトリウムとを含むスピッツアイゼン
の最少寒天培地（１４ｇ／　Ｑ　Ｋ、ＨＰＯい６ｇ／　
Ｑ　ＫＨｚＰＯ４，２ｇ／　（１硫酸７’／−Ｔ−ニウ
ム、Ｉｇ／ｎクエン酸ナトリウム、５ｇｉ　　グルコー
ス、０．２ｇ／Ａ　Ｍｇ５ｏ４−’７）１．ｏ、　１５
ｇ／　１１寒天（ディフコ社製）、（ジェイ・スピッツ
アイゼン、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス・ニー・ニス・エイ：第４
４巻、１０７２−１０７８頁、１９５８年（Ｊ、５ｐｅ
ｚｉｚｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ、、４４　ｖ１０７２−１０７８（１９
５８））））上に塗布し、３７℃で２日間培養した。生
じたアルギニン非要求性コロニーを。
５０肩ｇ／Ｑのし一トリプトファンとＩｇ／　Ｑのし一
グルタミン酸ナトリウムを含むスピッツアイゼンの最少
寒天培地（Ａ）と５０ｇ／　ＱのＬ−トリプトファンの
みを含むスピッツアイゼンの最少寒天培地（Ｂ）とにつ
まようじで移植し、（Ａ）上で増殖して（Ｂ）上で増殖
できないコロニーをＡＨ欠損かつ制限能欠損株として単
離し、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ
ｂｔｉ１ｉｓ）１６８　ＮＡ３株と名づけた。尚、該菌
株は、微生物工業技術研究所に微工研条寄第１０４２号
として寄託されている。
（２）コリネバクテリウム・メラセコラ８０１（Ｃｏｒ
　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｌａｓｓａｃｏｌａ）
（微工研条寄第５５８号）からの全ＤＮＡの調製とその
切断コリネバクテリウム・メラセコラ８０１（７ｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｍａｌａｓｓａｃｏｌａ　８０１）（微工研
条寄第５５８号）から前記実施例１工程（１）−（１）
と同様の方法によりＤＮＡ濃度０．８５ｍｇ／ｗ　Ｑの
全ＤＮＡ溶液２ｍＱを得た。全ＤＮＡの切断のためには
、１２８ｇｇの全ＤＮＡに対して１３単位の制限酵素Ｘ
ｂａ　Ｉ　（ＴＯＹＯＢＯ社より購入）を加え、５０Ｉ
ＩＭトリスーＨＣｒｔ　（ｐＨ７，４）、　１０ｍＭＭ
ｇ５Ｏ，、１００ｍＭ　ＮａＣｆｆ１の緩衝液２００ｐ
Ｑ中で３７℃にて２時間反応させた。その後７０℃で１
０分間加熱して反応を停止させた。　（ＤＮＡ試料ｘｎ
）（３）プラスミドｐＵＢ１１０の調製 光づ、プラスミドｐＵＢ１１０をバチルス・ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　１６８　Ｎ
Ａ３に移入し、得られた形質転換株からｐＵＢｌｌｏを
調製した。即ち、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　１６８ＭＡ３（微工研条寄
第１０４２号）を５０ｍ　ＱのＬ−ブロスに植菌し、日
立２２８型分光光度計で波長６６０ｎｍにおける吸光度
が０．５となるまで増殖させた後、集菌した。
該菌体を５１１ＱのＳＭに緩衝液（０，５Ｍシュークロ
ース。
０．０２Ｍマレイン酸、０．０２Ｍ　ＭｇＣΩ２、ｐＨ
６，５）で洗浄後、５ｍＭの５ＭＭ緩衝液に再懸濁した
。この懸濁濁液４．５ｍΩに１０−ｇｅｍ　Ｑ濃度のリ
ゾチームを含有する５ＭＭ緩衝液（ミリポアフィルタ−
で除菌した）０．５ｒｓＱを添加して、４２℃で１時間
静置反応させた。プロトプラスト化した細胞を７　、０
００ｒｐｍ　（４、５００ｇ）、５℃、７分間の遠心分
離で回収し、５ＭＭ緩衝液５＋ｓｎに懸濁した。同様の
操作を更にもう一度行った後。
ＳＭＭ緩衝緩衝液５屹Ω懸濁してプロトプラスト菌液と
した。
プラスミドＰＵＢＩＩＯ（ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリ−社より購入）をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−
ＨＣｊｉ（ｐＨ７，０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に１００
μｇｅｒｍ　Ｑの濃度となるように溶解し、このＤＮＡ
溶液５０μａと２倍濃度のＳＭに緩衝液５０μΩとの混
合液を上記プロトプラスト菌液０．５＋Ｅｌに添加した
。その後頁にＰ２Ｏ液（ＳＭに緩衝液にポリエチレング
リコール６０００　（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ−ａｎａ　ｇ
ｌｙｃｏｌ　６０００）を４０％濃度に溶解する）１．
５ｍＭを添加してゆるやかに混合し、２分間室温で静置
した。その後ＳＭＭＬ　−ＰＶＰ培地（Ｌ−ブロスと２
倍濃度のＳにＮ緩衝液を等量混合し、更にポリビニルピ
ロリドン（ＰＶＰ：Ｐｏ１ｙｖｉｎｙｌ　ｐｙｒｏｌｉ
ｄｏｎａ）を終濃度４０ｇ／　Ｑとなるように添加した
もの）を５−０添加して、４．０００ｒｐｍ（１，８０
０ｇ）で１０分間遠心分離して、上澄液を除去した。沈
降したプロトプラストに０．５醜αのＳＭＭＬ−ｐｖｐ
培地１ｍ１２を加えてゆるやかに懸濁後３０℃で２時間
ゆるやかに振とう培養し、一定量をカナマイシン７００
μｇ／ｗｆｌ濃度を含む再生培地（重層寒天培地を用い
る。下層寒天培地はＤＮＳ培地〔グルコース５ｇＩＱ、
カザミノ酸５ｇ／嚢、　Ｋ、ＨＰＯ４３，５ｇ／　Ｑ　
、　ＫＨ，ＰＯ４１，５ｇ／Ｑ、　ＰＶＰ３０ｇ／ｆｉ
　、　ＭｇＣΩ８０．４ｇ／　Ｑ　、　コハク酸２ナト
リウム１３５ｇ／Ω〕に１５ｇ／ｎの寒天を添加して作
成し、上層寒天培地は上記ＤＮＳ培地に６ｇ／　ｆｌの
寒天を添加して作成する。プロトプラスト懸濁液と溶解
した上層寒天培地３■Ωとを混合して、下層寒天培地上
に重層する）に植菌し、３２℃で５日間培養した。出現
したカナマイシン耐性形質転換株を４μｇ／璽Ω濃度の
カナマイシンを含有するし一寒天培地（し−ブロスに１
５ｇ／Ωの寒天を添加した培地）上で純化し、バチルス
・ズブチリス１６８　ＭＡ３（ＰＵＢＩＩＯ）を得た。
ベクターｐＵ８１１０を保持したバチルス・ズブチリス
１６８　ＭＡ３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
　１６８　ＭＡ３）をカナマイシン（４μｇｅｒｍ　Ｑ
　）を含む２０α腸ΩＬ−ブロスに植菌し。
３７℃にて一晩培用した。得られた培養液を集菌し。
１５％シュークロース、５０ＩＩＩＭトリスーＨ（１（
ｐＨ８，５）。
５０＋ａＭ　ＥＤＴＡ、５１ｍｇ／−ｇリゾチウム（シ
グマ社）よりなる水溶液２ｍＭに懸濁し、３７℃にて３
０分間反応させた。次にトリトン溶液（０，１％トリト
ンＸ−１００）、５０■にトリス−ＨＣΩ、５０ｍＭ　
ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，５）２閣怠を加えて３７℃にて３
０分間保持した０次にこの溶液を５℃にて３０　、　Ｏ
ＯＯｒｐｍ　（６４、ＯＯＯｇ）で工時間遠心弁離し上
清を回収し、　ＴＥ緩衝液を加えて１８ｍｆｉとした。
この液に、　１０ｍｇ／ｍ　Ｑのエチジウムブロマイド
水溶液１．２１１１０と塩化セシウム１８．６４ｇとを
加えて静かに溶解し、　４０．０００ｒｐｍ（１００，
０００ｇ）、　１５℃で４８時間遠心分離した。プラス
ミドｐＵＢ１１０は、紫外線照射により遠心チューブ中
、２本のバンドの下方として見い出され、このバンドを
遠心チューブの側面から注射器で抜き取ることにより、
プラスミドｐＵＢ１１０を分離した０次にこの分画液を
等容量のイソプロピルアルコールで４回抽出し、エチジ
ウムブロマイドを除去し、その後のＴＥ緩衝液に対して
透析して。
ＤＮＡ濃度１００μｇ／−〇のプラスミドｐＵＢ１１０
の透析完了液１層Ωを得た。
（４）プラスミドＰＵＸ２の作成と該プラスミド保有菌
からの該プラスミドの調製 プラスミドＰＵＢＩＩＯＤＮＡ　５μｇに対して２０単
位の制限酵素ＢａｍＨＩ　（ＴＯＹＯＢＯ社より購入）
を加えて、１０■Ｎトリス−ＨＣＱ（ｐＨ７，４）、１
０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＊、５０ｍＭＮａＣＱ、１−Ｎジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）の緩衝液５０μΩ中で３７℃に
て２時間反応させた。この反応液に等容のフェノール・
クロロホルム（１：１　ｖ／ｖ）液を添加して攪拌の後
、水層を回収した。更に等容のクロロホルムを添加して
攪拌の後、水層を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最
終濃度０．３Ｍになる様に加え、次に２倍容のエタノー
ルを添加して一８０℃で３０分間保持した後、１２，０
００ｒｐ＋＊（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離して
ＤＮＡ沈殿を回収し、同沈殿を減圧乾燥した（ＤＮＡ試
料ｘｍ）。
ＤＮＡ試料ｘｍと３単位（７）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｔ４ｋＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（宝酒造株式
会社より購入）とを、３３ＩＩＭトリスーＣＨ１ＣＯＯ
Ｋ、６６ｍＭ　ＣＨｓＣＯＯＫ、　１０ｍＭ（ＣＨ３Ｃ
ＯＯ）、Ｍｇ、　０．５ｍＭジチオトレイトール、　０
．１ｍｇ／ｍｆｆ１　　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
　（ベゼスダリサーチラボラトリー社より購入）　、０
．１■Ｍ　２’−デオキシアデノシン５′−トリホスフ
ェート（シグマ社、米国より購入）、　０．１ｍＭ　２
’−デオキシシチジン５′−トリホスフェート（シグマ
社、米国より購入）、０．１ｍＭ　２’−デオキシグア
ノシン５′−トリホスフェート（シグマ社、米国より購
入）、０．１■阿チミジン５′−トリホス、フェート（
シグマ社、米国より購入）の反応液４４μΩ中で３０℃
にて２０分間反応させた。この液に酢酸ナトリウムを最
終濃度３００■Ｎになる様に加え、２倍容のエタノール
を添加して、−８０℃にて３時間保持した。
次に１２．０００ｒｐ＋ｓ（８，９００ｇ）で１０分間
遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収し、得られた沈殿を減圧
乾燥した（ＤＮＡ試料ＸｒＶ）。
Ｘｂａ　Ｉリンカ−（Ｘｂａ　Ｉ　１ｉｎｋｅｒ）　（
宝酒造株式会社より購入）１．５μｇとＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｔ、　Ｐｌｏｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
　ｋｉｎａｓｓ）（宝酒造株式会社より購入）２．５単
位とを、６６ｍＭ　トリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，６）　
。
１ｍＭ　ＡＴＰ、　１０ｍＭ　ＭｇＣｊＬ、１ｍＭ　Ｘ
　／＜　ＪＬｔ　ミジン、１５ｍＭジチオトレイトール
、０．２膳ｇｕｙｓ　Ｑ　ＢＳＡの反応液１０μΩの中
で３７℃にて１時間反応させた（ＤＮＡ試料ＸＶ）。
ＤＮＡ試料ＸＴＶ全量とＤＮＡ試料ＸＶ全量とＴ、ファ
ージＤＮＡリガーゼ（Ｔ４Ｐｈａｇａ　ＤＮＡ　ｌｉｇ
ａｓａ）（宝酒造株式会社より購入）６単位とを、６６
ｍＭ　トリス−ＨＣΩ（ｐＨ７，６）、　１ｍＭ　ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ　ＭｇＣｊＬ、　１ｍＭスペルミジン。
１５＋ｓＭジチオトレイトール、０．２＋ｗｇ／ｍ　Ｑ
　ＢＳＡの反応液２２μΩ中で２２℃にて４時間反応さ
せた。この反応液にＴＥ緩衝液を加えて１００μａとし
、これに等容のフェノール・クロロホルム（１：Ｉ　Ｖ
／Ｖ）液を添加して攪拌の後、水層を回収した。更に等
容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収した
。
そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００鱈になる様に加
え、次に２倍容のエタノールを添加して、−８０℃で３
０分間保持した後、１２．０００ｒｐｍ（８，９００ｇ
）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収しこ
れを減圧乾燥した（ＤＮＡ試料ＸＶＩ）。
ＤＮＡ試料ＸＶＩ全量に対して、１５単位の制限酵素Ｘ
ｂａ　Ｉを加えて、５０ＩＩＭトリスー）ＩＣｆｉ　（
ｐＨ７，４）、１０ｍＭＭｇ５Ｏ，、１００ｍ１’ｌ　
ＮａＣｆ１の緩衝液５０μα中で３７℃にて。
４時間反応させた。消化した試料は、前述と実質的に同
様の方法により、１％アガロースゲル電気泳動に供した
。ただし電気泳動には、ベゼスダリサーチラボラトリー
社より購入したＬＭアガロースを使用し、４℃で電気泳
動した０次にエチジウムブロマイドで染色したアガロー
スゲルを紫外線照射下に置き、４．１キロベースのＤＮ
Ａ断片の存在を確認し、その付近の７ガロースゲルを切
り出した。切り出したアガロースゲルにその重量の３倍
量のＴＥ緩衝液を加えて、６５℃で１０分間加熱し、ア
ガロースゲルを完全にとかした０次に等容のフェノール
を添加して攪拌後、水層を回収した。得られた水層に１
等容のフェノール・クロロホルム（１：１　ｖ／ｖ）液
を添加して攪拌の後、水層を回収した。得られた水層に
等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収し
た。得られた水層に、酢酸ナトリウムを最終濃度３００
ｍＭになるように添加し、更に２倍容のエタノールを加
えて攪拌の後、−８０℃で３０分間保持した。その後１
０．０００ｒｐｍ（９，０００ｇ）で１０分間遠心分離
してＤＮＡ沈殿を回収した０次に、得られた沈殿を減圧
乾燥した。得られたＤＮＡ試料を５０ｍＭトリＸ−ＨＣ
Ｑ　（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　ＭｇＣＡ　、、１０
ｄジチオトレイトール、　１ｍＮスペルミジン、１層Ｈ
ＡτＰ、　０．１ｍｇ１■Ｑ　ＢＳＡの緩衝液５０μａ
に溶解し、３単位のＴ、ファージＤＮＡリガーゼを添加
して１５℃にて一晩反応させた。該反応液全量を用いて
前記実施例２−（１）−（４）の方法によりバチルス・
ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１
６８ＭＡ３（微工研条寄第１０４２号）のプロトプラス
トを形質転換し、バチルス・ズブチ’Ｊ　Ｘ１６８ＭＡ
３（ｐＵＸ２）を得た。
バチルス・ズブチリス１６８ＭＡ３（ｐＵＸ２）より、
前記実施例２−　（１）−（４）と全く同様の方法でプ
ラスミドＰＵＸ２を調製し、９０μｇ／■ａ濃度のプラ
スミドｐＵＸ２を含むτＥ緩衝液１．６■Ωを得た。
プラスミドｐＵＸ２５Ｍｇに対して２０単位の制限酵素
Ｘｂａ　Ｉを加えテ、５０ｍ＋Ｍｈリス−ＨＣＡ　（ｐ
Ｈ７，４）、　１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００ｗＭ　Ｎ
ａＣＱの緩衝液５０μΩ中で３７℃にて２時開反応させ
た。この反応液に等容のフェノール・クロロホルム（１
：１　ｖ／ｖ）液を添加して攪拌の後、水層を回収した
。更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を
回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度０．３Ｍと
なる様に加え、次に２倍容のエタノールを添加して一８
０℃で３０分間保持した後、１２．０００ｒｐｍ（８，
９００ｇ）で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収し
、同沈殿を減圧乾燥した（ＤＮＡ試料Ｘ■）。
（５）組換え体プラスミドの作成と該プラスミドの枯草
菌への移入 ＤＮＡの試料ＸＩ［２ＭｇとＤＮＡ試料ＸＶ１１ｕｇと
３単位のＴ、ファージＤＮＡリガーゼとを、５０ｍＭト
リス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　ｋＣＱ　
＊、１０ｍＭジチオトレイトール、工ｌ１Ｍスヘルミジ
ン、　１ｍＮ　ＡＴＰ、　０．１ｍｇ／贈ｊ２ＢＳＡの
緩衝液５０μａ中で１５℃にて一晩反応させた。
その後、７０℃にて１０分間加熱することにより１反応
を停止させた。この反応液全量を用いて、前記実施例２
−　（１）−（４）と同様の方法によりバチルス・ズブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）１６８
　ＮＡ３（微工研条寄第１０４２号）を形質転換し、得
られたテトラサンクリン耐性形質転換株について下記の
ごとく試験した。
（６）コリネバクテリウム・メラセコラ（匠ｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｇｅ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１（微
工研条寄第５５８号）のＡＨ産生遺伝子を有する枯草菌
の選択分離 前記実施例２−（１３−（５）で得られた菌株を。
Ｓｏｎｇ／　Ｑのトリプトファンと４μｇｅｍ　Ｑのカ
ナマイシンを含有した、スピッツアイゼンの最少寒天培
地で培養し、生育の有無を調べた。その結果、カナマイ
シン耐性、グルタミン酸非要求性を示す菌株が得られ、
該菌株を目的のＡ）Ｉ遺伝子を保有した枯草菌バチルス
・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）
１６８　ＮＡ３（ＰＡＧ５０１）として分離した。
該枯草菌のＡＨ活性を、下記の方法で測定することによ
り、クローニングした遺伝子がＡＨ産生遺伝子であるこ
とを確認した。
Ｌ−ブロス（カナマイシン耐性株を培養する場合にはカ
ナマイシン４μｇ／ｗ　Ｑを添加した）２００■Ωで。
バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）１６８ＭＩ　１１３、バチルス・ズブチリス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ−ｉｓ）１６８　ＮＡ
３．バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ−
ｂｔｉｌｉｓ）１６８　ＮＡ３（ｐＵＸ２）およびバチ
ルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ）１６８　ＮＡ３　（ｐＡＧ５０１）をそれぞれ振ど
う培養した。該培養液より菌体を遠心分離により集め、
０．８％のＮａＣ１２水溶液で洗浄後、１２−ΩのＭＥ
Ｓ緩衝液（５０ｉ＋Ｍ　２−（Ｎ−モルフォリノエタン
スルホン酸：ＭＥＳ、１０ｍＭ　Ｎｎ５Ｏ，、１０ｉ＋
Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０）に懸濁した。これを、ブ
ラウン社（西独）製のＭＳＮセルホモジナイザー（８５
３０２１型）で処理した後、１４゜０００ｒｐｍ（２０
，ＯＯＯｇ）で２０分間遠心分離して、細胞抽出液（粗
酵素液）を調製した。
ＡＨ活性は２．６ｍＱの酵素反応液（７７ｍＭ　トリス
−ＨＣＱ（ｐＨ７，２）、　１１５ｍＭ　ＮａＣｆｆ１
．０．１１５ｍＭシス−アコニット酸、５０μ塁の細胞
抽出液〕の３０℃における２４０ｎｍの吸光度の減少を
１日立分光光度計（２２８型）で測定することにより求
めた。
また、細胞抽出液の蛋白質濃度の測定には、ローリ−ら
（オー・エイチ・ローリ−、エフ・ジェイ・ローウェブ
ロー、アール・ジェイ・ランダル、ジェイ・パイオル・
ケム、１９３巻２６５頁１９５１年（０，Ｈ，Ｌｏｖｒ
ｙｙＮ、Ｊ、Ｒｏｖｅｂｒｏｕｇｈ、Ｒ，Ｊ、Ｒａｎｄ
ａｌｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１９３゜２６５（
１９５１）））の方法を用いた。尚、同測定の標準蛋白
質として、ウシ血清アルブミン（和光紬薬工業社より購
入）を用いた。８Ｉ定結果を第６表に示した。第６表の
ＡＩ比活性測定結果より、バチルス・ズブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）１６８　ＮＡ３（ｐ
ＡＧ５０１）は明らかにＡＨ活性を回復していた。
（以下余白） 第６表 注１）反応液中の蛋白質１ｍｇが、１分間に消費したシ
ス−アコニット酸のマイクロモル数で表示している。
注２）バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕ
ｂ見圭ｉｇ）　１６８の野生型ＡＨ株である。
注３）バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）　１６８のＡＨ欠損株である。
（メＴ余ｆＩ） （７）複合プラスミドＰＡＧ　５０１の分離と解析バチ
ルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）１６８ＭＡ　３（ＰＡＧ５０１）より、前記実施例
２−　（１）　−（３）と同様の方法でプラスミドｐＡ
Ｇ５０１のＤＮＡを１２０μｇ分離精製した。このＤＮ
Ａ０．３μｇに対して、各々過剰の制限酵素（ＥｃｏＲ
Ｉ　、　ＢａｍＨＩ　、ＢｇｌＩＩ　、ＨｉｎｄＩ［［
、Ｋｐｎ　Ｉ　（ＴＯＹ−０８０社より購入）、Ｍｌｕ
ｌ（全酒造より購入）、Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｐｖｕ　ｎ、
５ａｃｌ　、５ａｌＩ　、ＸｂａＩ、Ｘｈｏ　Ｉ　（Ｔ
ＯＹＯＢＯ社より購入）〕を、それぞれの適正条件にて
反応させ、その消化した試料を前述の方法により１％ア
ガロースゲル電気泳動および４％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に供した。泳動の終ったゲルを１μｇｅｔｓ
　Ｑエチジウムブロマイド水溶液に浸漬して３０分間染
色した後、紫外線をゲルに照射して生成断片の数を判定
し、各断片の泳動距離から各々の分子の長さを算出した
。尚１分子の長さは、同一アガロースゲル上で同時に電
気泳動したラムダファージ（λｐｈａｇｅ）　ＤＮＡ　
にッポンジーン社より購入）の制限酵素Ｈｉｎｄ　ｍに
よる消化断片の既知の分子の長さに、または同一ポリア
クリルアミドゲル上で同時に電気泳動したファイエック
ス１７４フアージ（φＸｉ）４ｐｈａｇａ）ＤＮＡの制
限酵素Ｈａｓ　ＩＨによる消化断片（ベゼスダリサーチ
ラボラトリー社より購入）の既知の分子の長さに基づい
て算出した。更に、複数の制限酵素処理によって生じた
消化断片を解析することにより、プラスミド分子中の各
制限酵素切断部位を決定した。得られたプラスミドｐＡ
Ｇ５０１の制限酵素切断地図を第１２図に示す。
第１２図から明らかなように、プラスミドｐＡＧ５０１
はベクターｐＵＸ２の制限酵素Ｘｂａ　Ｉ切断部位に、
約４゜７キロベースのＡＨ産生遺伝子を含む外来のＸｂ
ａ　Ｉ断片が組込まれていた。このＸｔｉａ　Ｉ断片が
コリネバクテリウム・メラセコラ（蝕■朋ｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓａｃｏｌａ）８０１（微工研条寄
第５５８号）由来のＡＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片で
ある。
プラスミドｐＡＧ５０１のＤＮＡにより、前記実施例２
−（１）−（４）と同様の方法で、バチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）１６８　Ｍ
Ａ３を形質転換した。その結果、調べた形質転換株は、
全てカナマイシン耐性かつグルタミン酸非要求性であっ
た。
更に、該形質転換株について、それらが保有するプラス
ミドを解析した結果、それらのプラスミドは、供与プラ
スミドと比べて制限酵素切断様式で同一と判定されるプ
ラスミドであった。
（８）ＡＨ産生遺伝子を含む約４．７キロベースのＤＮ
Ａ断片の分離 前記実施例２−　（１）−（７）で調製したプラスミド
ＰＡＧＳＯＩのＤＮＡ　２０μｇに対して、６Ｏ単位の
制限酵素Ｘｂａ　Ｉを加えて、５軸にトリス−ＨＣＱ　
（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００膳Ｍ　
ＮａＣＲの緩衝液１００ｐｆｉ中で３７℃にて２時間反
応させた。消化した試料は、前記の方法により、　１％
アガロースゲル電気泳動に供した。ただし、ベゼスダ・
リサーチ・ラボトリー社より購入したＬＭＰアガロース
を使用し、４℃で電気泳動した０次にエチジウムブロマ
イドで染色したアガロースゲルを紫外線照射下に置き、
　ＡＨ産生遺伝子を含む約４．７キロベースのＤＮＡ断
片の存在を確認し、その付近のアガロースゲルを切り出
した。該アガロースゲルにその重量の２倍量のＴＥ緩衝
液を加えて、６５℃で１０分間保持し、アガロースゲル
を完全にとかした０次に等容のフェノールを添加して攪
拌の後、水層を回収した。得られた水層に。
等容のフェノール・クロロホルム（１：１　ｖ／ｖ）液
を添加して攪拌の後、水層を回収した。得られた水層に
、等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収
した。得られた水層に、酢酸ナトリウムを最終濃度３０
０ｍＭになるように添加し、更に２倍容のエタノールを
加えて攪拌の後、−８０℃にて３０分間保持した。その
後、１０．０００ｒｐｍ（９，ＯＯＯｇ）で１０分間遠
心分離して、　ＤＮＡ沈殿を回収した０次に。
同沈殿を減圧乾燥後、ＴＥ！！Ｗ液２０μΩに溶解した
。
以上の操作により、ＡＨ産生遺伝子を含む約４．７キロ
ベースのＤＮＡ断片を約６μｇ取得した。
（９）プラスミドｐＡＧ５０へのＡＨ産生遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の組込み 前記実施例１工程（１）−（８）−■で調製したプラス
ミドＰＡＧ　５ＧのＤＮＡ５μｇに対して、制限酵素Ｘ
ｂａｌを１５単位加えて、５０ｍＭトリス−ＨＣＱ　（
ＰＨ７，４）、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍＭ　Ｎ
ａＣＱの緩衝液６０ｐｎ中で。
３７℃にて２時間反応させた。その後、７０℃で１０分
間加熱して、反応を停止させた。この液に酢酸ナトリウ
ムを最終濃度３００ｍＭになる様に加え、２倍容のエタ
ノールを添加して、−３０℃にて３時間保持した０次に
１２．０００ｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分
離してＤＮＡ沈殿を回収し、同沈殿を減圧乾燥した。
得れた試料をＲＡＰＴ緩衝液（５０ｍＭ　トリス−ＨＣ
（１，ＰＨ８，４）　２００μａに溶解し、バクチリア
ル・アリカリ・ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　
ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔ−ａｓｅ）　（宝
酒造株式会社より購入）を１単位添加して６５℃にて３
０分間反応させた。更に同じ酵素を１単位添加して６５
℃で３０分間反応させた。その後、反応液に等容のＴＮ
Ｅ緩衝液で飽和したフェノールを加え、混合した後１２
，０００ｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離し
て水層を回収し、更にもう１回同じ操作を繰り返した１
次に水層に等容のフェノール・クロロホルム（１：１　
ｖ／ｖ）液を添加して混合した後。
１２．０００ｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分
離し、水層を回収した。更に水層に等容のクロロホルム
を添加して攪拌した後、１２　、　ＯＯＯｒｐｍ　（８
、９００ｇ）で１０分間遠心分離し、水層を回収した。
該水層に酢酸ナトリウムを最終濃度３００■にになる様
に加え、２倍容のエタノールを添加し攪拌した後、−３
０℃にて３時間保持した。その後、１２．０００ｒｐｍ
（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離し、　［ｌＮＡ沈
殿を回収した。これを減圧乾燥した。このＤＮＡ全量と
前記実施例２−（１）−（８）で調製したＤＮＡＩμｇ
と３単位のＴ、ファージＤＮＡリガーゼにツボフジ−２
社より購入）とを、５０ｍＭ　トリス−ＨＣＱ　（ｐＨ
７，４）、１０ｍＭＮｇＣｍ　ｓ、１０ｍＮジチオトレ
イトール、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭ　ＡＹＰ、　０
．１ｉｔｇ／１ｍＱ　　Ｂ　Ｓ　Ａ（Ｂｏｖｉｎａ　ｓ
ｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）（ベゼスダリサーチラボラ
トリー社より購入）の緩衝液５０μα中で、１５℃にて
一晩反応させた。その後、７０℃にて１０分間加熱する
ことにより１反応を停止させた。
（１０）ＡＩ産生遺伝子を含有した複合プラスミドｐＡ
Ｇ５００１の取得 前記実施例２−（１）−（９）で作成した組換え体ＤＮ
Ａにより、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８
０１（微工研条寄第５５８号）を形質転換した。前記実
施例１工程〔１〕−（８）−〇に記載の方法で得られた
テトラサイクリン耐性形質転換株の保有するプラスミド
を解析することにより、目的プラスミドを取得した。
得られたプラスミドをＰＡＧ５００１と命名した。
得られたテトラサイクリン耐性形質転換株を。
テトラサイクリン１０μｇ／園Ωを含むＬＧ寒天培地（
Ｌ−寒天培地にグルコース５ｇ／　Ｑを添加した培地）
上で純化した後、各菌株から前記実施例１工程〔１〕−
（８）−■と同様の方法により、プラスミドを分離し、
前記実施例１−　（１）−（６）と同様の方法によりそ
れらのプラスミドを解析した。その結果。
プラスミドＰＡＧ５００１を取得した。プラスミドｐＡ
Ｇ５００１は、第１３図に示した様に、プラスミドｐＡ
Ｇ５０の制限酵素Ｘｂａ　Ｉ切断部位に、グルタミン酸
生産性コリネ型細菌由来のＡＨ産生遺伝子を含む約４．
７キロベースのＤＮＡ断片が組込まれた複合プラスミド
である。
（１１）プラスミドＰＡＧ５００１保有菌株のＡ）ｒ活
性の測定 プラスミドｐＡＧ５００１保有のコリネバクテリウム・
メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎａｂａｃｔａｒｉｕｍ　ｍｅｌ
ａｓｓｅｃｏｌａ）８０１を、テトラサイクリン１０μ
ｇｅｒｍ　４１含有の前記糖蜜培地５０■Ωで、３２℃
にて一晩振どう培養した。ただし、プラスミド非像持株
は、テトラサイクリン無添加で培養した。この培養液よ
り集菌し、０．８％ＮａＣΩ水溶液２０＋ｓ　Ｑで２回
洗浄後、前記ＭＥＳ緩衝液１０ｍｊｌに懸濁した。これ
を、ブラウン社製（西独）のＭＳＫセルホモジナイザー
（８５３０２１型）で処理した後、１４．０００ｒｐｍ
（２０，０００ｇ）で２０分間遠心分離して、細胞抽出
液（粗酵素液）を調製した。この細胞抽出液を用いて、
前記実施例２−　（１）−（６）と同様の方法により、
ＡＨ活性を測定した。その結果、第７表に示した様に、
プラスミドＰＡＧ５００１保持菌株は。
ベクターｐＡＧ５０保持菌株やプラスミド非保持菌に比
べて、高いＡ）Ｉ比活性を示した。
（メＴ−章白） 第　　７　　表 注１）第６表の注１）と同じ。
注２）第２表の注２）と同じ。
故に、プラスミドＰＡＧ５００１にふくまれている約４
゜７キロベースのＸｂａ　Ｉ断片には、グルタミン酸生
産性コリネ型細菌由来のＡＨ産生遺伝子が含まれている
ことは明らかである。
（１２）ＡＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片の分離ＰＡＧ　５
００１　Ｄ　Ｎ　Ａを前記実施例１−　（３）　−（１
）に記載の方法で１００−Ωの培養液から約６０μｇ（
ＤＮＡ濃度約５０μｇ／■Ω）を得た０本プラスミドＤ
ＮＡ約１０ｐｇ相当分を、　５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ
ｆｉ　（ｐＨ７，５）、　１００　ｍＷＮａＣＱ　、　
１０　ｍＷ　ＭｇＣｌ、の緩衝液４００μＡ中で２０単
位のＸｂａ　Ｉを添加して３７℃で２時間反応させるこ
とにより切断し、前記実施例１−（２）に記載のＬＭＰ
アガロースを用いたアガロースゲル電気泳動を行った。
ＡＨ遺伝子を含む約４．７ｋｂのＤＮＡ断片を実施例１
−（２）と同様にゲルから抽出し、該ＤＮＡ断片約２μ
ｇを取得した（ＡＨ断片：ＤＮＡ試料Ｘ■）。
（２）ｐＩＧｌｏｌからの６，９ｋｂおよび６，５ｋｂ
のＸｂａ　１断片の調製 実施例１で得られたＰＩＧＩＯＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ約１０μ
ｇを２０単位のＸｂａ　Ｉにより切断後ＬＭＰアガロー
スを用いたアガロースゲル電気泳動を行った。　ｐＩＧ
ＩＱｌはＸｂａ　Ｉ切断により６．９ｋｂ、　６，５ｋ
ｂおよび３．Ｏｋｂの３断片に分かれるが、　６．９ｋ
ｂと６ｊｋｂの断片をそれぞれ別個に調製することは困
難であったので、これら２断片を混合物のまま抽出した
。すなわち、６．９ｋｂおよび６，５ｋｂのバンドの部
分のアガロースゲルをまとめて切出し、前記実施例１−
（３）の方法でこれら断片の混合物的５μｇを得た（Ｄ
ＮＡ試料ＸＩＫ）。
〔３〕組換えプラスミドの作製 前記ＤＮＡ試料Ｘ■およびＤＮＡ試料ｘｍの全量を用い
て、前記実施例１−（３）および１−（４）と実質的に
同様の方法により、リガーゼ反応とコリネバクテリウム
・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌ
ａｓｓａｃｏｌａ）８０１の形質転換を行った。得られ
たテトラサイクリン耐性形質転換株約６０株について前
記実施例１−（５）に記載したアルカリ溶菌法により、
それぞれ少量のプラスミドＤＮＡを調製した。各プラス
ミドＤＮＡサンプルの半量をまずｘｂａｌで切断し、電
気泳動で６．９ｋｂ、６．５ｋｂ、および４．７ｋｂの
３断片が確認できるものを選択後、これらについて残り
半量のサンプルを用いて５ａｌＩ処理で３．４ｋｂの断
片が生じるものをスクリーングした。
その結果、目的の構造を持つプラスミドが２種得られ、
そのうちの１種をｐＡＩＧ３２１と命名して詳しい解析
を行った。
コリネバクテリウム・メラセコラ（並ｎμ＝ｂａｃ−ｔ
ａｒｉｕ＋ｓ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１（ｐＡ
ＩＧ３２１）より前記実施例１−（３）の方法でｐＡＩ
Ｇ３２１　Ｄ　Ｎ　Ａを約５０μｇ（約４５μｇｅｍ　
ｎ　）取得した０本プラスミドＤＮＡを用いて前述の方
法により制限酵素による切断点地図を決定した。その結
果、　ｐＡＩＧ３２１はｐＩＧｌｏｌ（７）　３．Ｏｋ
ｂ　１７）　ＸｂａＩ断片の代わりにＡＨ遺伝子を含む
４．７ｋｂのＸｂａＩ断片が組み込まれたプラスミドで
あることが判明した。得られたプラスミドＰＡＩＧ３２
１の制限酵素切断地図を第１４図に示す。
［４］ｐＡＩＧ３２１保持菌の酵素活性の測定コリネバ
クテリウム・メラセコラ（如ｎμ山匹−ｔｅｒｉｕｍ　
＋ｍｅｌａｓｓａｃｏ１ａ）８０１（ｐＡＩＧ３２１）
を５０ｒａ　Ｑの糖蜜培地で培養し、前記実施例１−（
６）と全く同じ方法で細胞抽出液を調製した０本細胞抽
出液のＧＤＨ活性およびＩＣＤＨ活性を前記実施例１−
（６）の方法で測定した。またＡＨ活性については下記
の方法で測定を行なった。ＡＨ活性は、２，６ｓＱの酵
素反応液（７７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ　（ｐＨ７，
２）、１１５＋＋＋Ｍ　ＮａＣ１゜０．１１５　ｍＭシ
ス−アコニット酸、１０〜５０μΩの細胞抽出液〕の３
０℃における２４０ｎ−の吸光度の減少を日立分光光度
計（２２８型）で測定することにより測定した。これら
の結果およびプラスミドを保持しないコリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Ｃａｒ　ｎｅｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ　
ｍａｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１の細胞抽出液を用いた
場合の結果を第２表に示した０本結果より明らかなよう
に、コリネバクテリウム・メラセコラ（垣■匣−ｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　＋＊ａｌａｓｓｅｃｏ１ａ）８０１（ｐ
ＡＩＧ３２１）はＡＨ，ＩＣＤＨおよびＧＤＨの３種の
酵素が同時に強化された菌株であった。
第８表 注１）第６表の注１）に同じ 注２）第３表の注１）に同じ 注３）第１表の注１）に同じ 注４）第２表の注２）に同じ （坂五含６） 実施例３ 実施例では、Ｃ５＋ＩＣＤＨ＋ＧＤＨの３重強化株を作
成した例を示す、またＣＳ＋４ＣＤＨの２重強化株およ
びＣＳ＋ＧＤＨのの２重強化株を作成した例についても
同時に示す。
組換えプラスミドを作製する際の材料としては前述のｐ
ＡＧｌｏｏｌ、　ＰＡＧ３００１の他にＣＳ遺伝子を含
む組換えプラスミドＰＡＧ４００３を用いた。　ｐＡＧ
４００３はコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｇｏｒ　
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ■ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０
１のベクタープラスミドＰＡ６５０の約０．７ｋｂ　Ｂ
ａｎ＋ＨＩ−５ａｌＩ断片の代わりに、コリネバクテリ
ウム９メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔａｒｉｕｍ　
ｍｅｌａｓｓｅ−ｃｏｌａ）８０１由来のＣＳ遺伝子を
含む約３．２ｋｂ　ＢａｍＨＩ−５ａｌＩ断片が組み込
まれた組換えプラスミドであり、本プラスミドの作製方
法は特願昭６１−２７９８８８に詳細に記述されている
。
〔１〕組換えプラスミドＰＡＧ４００３の調製（１）コ
リネバクテリウム・メラセコラｑ庄ｌ−ｎｅｂａｅｔｅ
ｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８０１　（微工
研条寄５５８号）のＣＳ産生遺伝子を有する大腸菌の選
択分■　コリネバクテリウム・メラセコラ（蝕■組−ｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓａｃｏｌａ）　８０１
　（微工研条寄第５５８号）からの全ＤＮＡの調製とそ
の切断実施例１工程（１）　−（１）に記載と同様の方
法によりＤＮＡ濃度０．８５ｍｇ／ｗｆｆｉの全ＤＮＡ
溶液を得た。
全ＤＮＡの切断のためには、１２８μｇの全ＤＮＡに対
して、１重単位の制限酵素ＸｂａＩ　にツポンジーン社
より購入）を加え、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ７，４）　　、　　１　０ｍＭ　　Ｍｇ５Ｏ，、１０
０ｍＭ　　ＮａＣ１、の緩衝液２００μα中で３７℃に
て２時間反応させた。その後７０℃で１０分間加熱して
反応を停止させた。（ＤＮＡ試料ＸＸ） ■　ベクターｐＢＲ３２５の調製と開裂とＸｂａＩリン
カ−の組込み 先づ、ベクターｐＢＲ３２５をエシェリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　Ｋ　１２　　Ｗ
　６２０に移入し、得られた形質転換株からｐＢＲ３２
５を調製した。即ち、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
−ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　Ｋ　１２　　Ｗ　６２
０を５０ｍＱのＬ−ブロス（ポリペプトン１０　ｇ　／
　Ｑ、酵母エキス５ｇ／Ｑ、ＮａＣ１５ｇ／Ｊ　　ｐＨ
７，２）に植菌し、３７℃にて菌濃度５　Ｘ　１０”個
／ｍ１２まで増殖させた後、２℃で集菌した。該菌体を
５０ｍＱの氷冷した１　００ｍＭ　ＭｇＣ１□水溶液に
懸濁し、集菌後頁に２５　ｍ　Ｑの氷冷した１　００ｄ
　ＣａＣ１，水溶液に懸濁した。水中で３０分保持した
後、集菌して再度５ｍＱの氷冷した１　００＋ａＭ　Ｃ
ａＣ１，水溶液に懸濁し、水中で１時間保持した［コン
ピテントセル（Ｃｏ閣−ｐａｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ）］　
＊この懸濁濁液２００μｍに０゜１μｇのｐＢＲ３２５
ＤＮＡを添加して、水中で１時間保持した。その後４２
℃にて２分間保持した後、５ｍｇのＬ−ブロスを添加し
て、３７℃にて９０分間静置培養した。得られた培養液
を適当に希釈して、１０ｇｇ／ｍΩのテトラサイクリン
を添加したＬ−寒天培地（Ｌ−ブロスに１５ｇ／Ｑの寒
天を添加した培地）に塗布し３７℃で一晩培養した。得
られたＰＢＲ３２５による形質転換株エシェリヒア　コ
リに１２　　Ｗ６２０　（ｐＢＲ３２５）より、以下の
ようにして該ベクターの調製を行った。
ベクターｐＢＲ３２５を保持したエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　Ｗ　
６２０を、１００　ｍ　Ｑのテトラサイクリン（１０ｇ
ｇ／ｍ１２）を含むＬ−ブロスに植菌し、３７℃にて一
晩培養した。得られた培養液より集菌しＴＥ緩衝液で洗
浄後、１５％シュークロース、５０＋ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ（ｐＨ８，５）、　５０＋ａＭ　ＥＤＴＡ、２　
ｍ　ｇ　／　ｍ　ｎリゾチウム（シグマ社）よりなる水
溶液２ｍΩに懸濁し、室温にて３０分間反応させた１次
にトリトン溶液〔０，１％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉ
ｔｏｎ　Ｘ−１００）、５０１！ＩＭＴｒｉｓ　−ＨＣ
Ｉ、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８、５）　　２　ｍ　
Ｑを加えて３７℃にて３０分間保持した０次にこの溶液
を、５℃にて３０．０００　ｒ　ｐ　ｍ　（６４，００
０ｇ　）で１時間遠心分離し上滑を回収し、ＴＥ緩衝液
を加えて１８　ｍ　Ｑとした。この液に、　１０　ｒａ
ｇ／ｍＱのエチジウムブロマイド水溶液１　、２　ｍ　
Ｑと塩化セシウム１８．６４ｇとを加えて静かに溶解し
、４０，０００ｐ　ｐ　ｍ　（１００，０００ｇ）　、
　１５℃で４８時間遠心分離した。ベクターｐＢＲ３２
５は、紫外線照射により遠心チューブ中、２本のバンド
の下方として見い出され、このバンドを遠心チューブの
側面から注射器で抜き取ることにより、ベクターＰＢＲ
３２５を分離した０次にこの分画液を等容量のイソプロ
ピルアルコールで４回抽出して、エチジウムブロマイド
を除去し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析して、ＤＮ
Ａ濃度１９０μｇ／ｍｎのベクターｐＢＲ３２５の透析
完了液１ｍ１２を得た。
ベクターｐＢＲ３２５ＤＮＡ５μｇに対して２０単位の
制限・酵素ＥｃｏＲＩを加えて、５０ｍＭτｒｉｓ　−
）ＩＣＩ　（ｐＨ７，４）　、　１０＋＋＋Ｍ　Ｍｇ５
Ｏイ１００ｍＭ　ＮａＣ１゜の緩衝液５０μα中で３７
℃にて２時間反応させた。その後、７０℃で１０分間加
熱して反応を停止させた。この液に酢液ナトリウムを最
終濃度３ｏｏＩＩＩＭになる様に加え、２倍容のエタノ
ールを添加して、−３０’Ｃにて３時間保持した０次に
１２，０００　ｐ　ｐ　ｍ　（８，９００ｇ　）で１０
分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収し、同沈殿、を減圧
乾燥した（ＤＮＡ試料ＸＸＩ）。
ＤＮＡ試料ＸＸＩと３単位Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ
　、　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｐｏｌｙ＋ｍｅｒａｓａ）　（宝酒
造株式会社より購入）とを、３３　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃ
Ｈ，Ｃ００Ｈ（ｐ）１７　、９　）、６６　ｍＭ　ｃｔ
ｔ、ｃｏｏに、１０ｍＭ　（ＣＩ、Ｃｏｏ）、Ｍｇ、　
０．５ｍＭジチオトレイトール、Ｏ、ｌ　Ｉ１ｇ／ｍｌ
　Ｑ　ＢＳＡ（Ｂｏｗｉｎｅｓｅｒｕ■ａｌｂｕ＋ｍ１
ｎ）　（ベゼスダリサーチラボラトリー社より購入）、
０．１ｍＭ　２’−デオキシアデノシン５′−トリホス
フェート（シグマ社、米国より購入）、０．１腸Ｍ　２
’−デオキシシチジン５′−トリホスフェート（シグマ
社、米国より購入）、０．１ｍＭ２′−デオキシグアノ
シン　５′−トリホスフェート（シグマ社、米国より購
入）、０．１ｍＭチミジン　５′−トリホスフェート（
シグマ社、米国より購入）の反応液４４μλ中で３０℃
にて２０分間反応させた。この液に酢酸ナトリウムを最
終濃度３００ｍＭになる様に加え、２倍容のエタノール
を添加して、−３０℃にて３時間保持した０次に１２゜
０００　ｒｐｍ　（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離
してＤＮＡ沈殿を回収し、得られた沈殿を減圧乾燥した
（ＤＮＡ試料ｘｘｎ）。
Ｘｂａ　Ｉリンカ−（Ｘｂａ　Ｉ　１ｉｎｋｅｒ）　（
宝酒造株式会社より購入）１．５μｇとＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｔ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄａ　
ｋｉｎａｓｅ）（宝酒造株式会社より購入）２．５単位
とを、　６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）　
、１ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｏＭ　ＭｇＣ１，，１ｍＭスペ
ルミジン、１５ｍＭジチオトレイトール、０゜２ｍｇ１
０ＱＢＳＡの反応液ｉｏμｎ中で３７℃にて１時間反応
させた（ＤＮＡ試料ｘｘｍ）。
ＤＮＡ試料ＸＸＩＩ（７）　１　／　２量とＤＮＡ試料
ｘｘｍ全量とＴ、ファージＤＮＡリガーゼ（Ｔ、Ｐｈａ
ｇａＤ　Ｎ　Ａ　ｌｉｇａｓｅ）　（宝酒造株式会社よ
り購入）６単位とを、６６　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ７、６）、１＋ｓＭＡＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣ１，
、１ｍＷスペルミジン、１５ｍＭジチオトレイトール、
０．２ｍｇ／＋ｍＱ　　ＢＳＡの反応液２２μΩ中で２
２℃にて４時間反応させた。この反応液に等容のフェノ
ール・クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）液を添加して攪
拌の後、水層を回収した。
更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回
収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００　ｍＭ
になる様に加え１次に２倍容のエタノールを添加して、
−３０℃で３時間保持した後、１２，０００ｒｐ＋ｎ（
８，９００ｇ　）で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を
回収しこれを減圧乾燥した（ＤＮＡ試料ＸＸＩＶ）。
ＤＮＡ試料ＸＸＩＶ全量に対して、１５単位の制限酵素
Ｘｂａ　Ｉを加えて、５０＋ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
（ｐＨ７，４）　、１０＋ｓＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１の緩衝液５０μΩ中で３７℃にて、２時開
反応させた。消化した試料は、前記の方法により、１％
アガロースゲル電気泳動に供した。ただし電気泳動には
、ベゼスダ・リサーチラボラトリ−社より購入したＬＭ
Ｐアガロースを使用し、４℃で電気泳動した。
次にエチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルを
紫外線照射下に置き、６．０キロベースのＤＮＡ断片の
存在を確認し、その付近のアガロースゲルを切り出した
。切り出したアガロースゲルにその重量の３倍量のＴＥ
緩衝液を加えて、６５℃で１ｏ分間加熱し、アガロース
ゲルを完全にとかした０次に等容のフェノールを添加し
て攪拌後、水層を回収した。得られた水層に、等容のフ
ェノール・クロロホルム（１：　１．ｖ／ｖ）液を添加
して、攪拌の後水層を回収した。得られた水層に等容の
クロロホルムを添加して攪拌後、水層を回収した。得ら
れた水層に、酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭにな
るように添加し、更に２倍容のエタノールを加えて攪拌
の後、−３０℃で３時間保持した。その後１０．０００
　ｒｐｍ（９，０００ｇ　）で１０分間遠心分離してＤ
ＮＡ沈殿を回収した０次に、得られた沈殿を減圧乾燥し
た（ＤＮＡ試料ＸＸＶ）。
■　組換え体プラスミドの作成 りＮＡ試料ＸＸ２ｕｇとＤＮＡ試料ＸＸＶ全量と３単位
のＴ、ファージＤＮＡリガーゼとを、５０　ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７、４）、１０ｍＭ　Ｍ（Ｃ１，。
１０＋ｓＭジチオトレイトール、１■Ｎスペルミジン、
ｌｄ　ＡＴＰ、０．１ｍｇ／＋ｍＱＢＳＡの緩衝液４０
μΩ中で、１５℃にて一晩反応させた。その後７０℃に
て１０分間加熱することにより、反応を停止させた。
■　組換え体プラスミドの大腸菌への移入前記工程■の
方法により、エシェリヒア・フリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　Ｗ６２０のコンピテントセ
ル（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃａｌｌ）を調製した。得ら
れた細胞Ｓ濁液４００μａと前記工程■の反応液４０μ
ａとを混合して、水中に１時間保持した。その後、４２
℃にて２分間加熱した後、　５＋＊ｆｉのＬ−ブロスを
添加して３７℃にて９０分間静置培養した。
次に、得られた培養液から集菌し、無菌水に懸濁した。
得られた懸濁液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＱ
）を添加した合成寒天培地（ＭｇＳＯ４・７Ｈ。
００．２ｇ／Ｑ、クエン酸（Ｃｉｔｒｉｃ　ａｃｉｄ−
ＩＨ，Ｏ）　２ｇ／　Ｑ　。
無水リン酸水素二カリウム（Ｋ、ＨＰＯ４・ａｎｈｙｄ
ｒｏｕｓ）１０ｇ／　Ｑ　、　ＮａＨＮＨ，ＰＯ，・４
Ｈ，０３，５ｇ／　Ｑ、グルコース１ｇ　／　Ｑ　、寒
天１．６ｇ／ｊ２．塩酸チアミン５ｍｇＩＱ。
ウラシル３５■ｇ／Ｑ）に塗布して培養した。この様に
して得られた菌株を、アンピシリン（３０μｇｉｍｌ）
とテトラサイクリン（１０μｇ／ｍ！りとを含む前記合
成寒天培地で培養し、生育の有無を調べた。
その結果、アンピシリン耐性テトラサイクリン耐性グル
タミン酸非要求性を示す菌株を目的のＣＳ産生遺伝子を
保有した大腸菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　Ｗ６２０　（ｐＡＧ４０
ｉ）として分離した。
該大腸菌のＣＳ活性を、下記の方法で測定することによ
り、クローニングした遺伝子がＣＳ産生遺伝子であるこ
とを確認した１合成液体培地（前記合成寒天培地より寒
天を削除した培地組成）５０ｒａｍで、エシェリヒア・
コリ（ｔＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２
　Ｗ　６２０　（ｐＡＧ４０１）を振盪培養した。該大
腸菌を集菌後、０．８％のＮａＣ１水溶液１０■ａで洗
浄し。
２脂ΩのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ　２−（Ｎ−モリフオ
リノエタンスルホン酸：ＭＥＳ、１０　ｍＭ　Ｍｎ５Ｏ
，、１０ｄ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，０〕に懸濁した。これ
を超音波処理した後、　１４．０００　ｒｐｍ　（２０
，０００ｇ）で２０分間遠心分離して、細胞抽出液（粗
酵素液）を調製した。尚、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　Ｗ　６２０
、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）’Ｋ　１２　Ｗ　６２０　（ｐＢＲ３２５）を培
養する場合には、前記合成液体培地にグルタミン酸ナト
リウム（ＭＳＧ）　０．５　ｇ／Ωを添加した。エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ組■）Ｋ　１２
　Ｗ　６２０　（ｐＡＧ４０１）、エシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　　
Ｗ　６２０　（ｐＢＲ３２５）を培養する場合には、前
記合成液体培地にテトラサイクリン１０μｇ／ｙａＱを
添加した。
ＣＳ活性は、３．０ｍＡの酵素反応液（９５ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、０．２　ｄオキザロ酢酸
、０．１　ｍＭ　５．５’−ジチオビス−（２−ニトロ
安息香酸）（ＤＴＮＢ）。
０．１６　ｍＭアセチル−ＣｏＡ、　１０　ｐ　Ｑ細胞
抽出液〕の４１２　ｎｍの吸光度の増大を、日立分光光
度計（２２８型）で測定することにより求めた。
また、細胞抽出液の蛋白質濃度の測定には、ローリ−ら
（オー、エイチ、ローリ−、エフ、ジェイ。
ローウェブロー、アール、ジエイ、ランダル、ジエイ、
パイオル、ダム。１９３巻２６５頁１９５１年（０，Ｈ
，Ｌｏｗｒｙ。
Ｎ、Ｊ、Ｒｏｖｅｂｒｏｕｇｈ、　Ｒ，Ｊ、Ｒａｎｄａ
ｌｌ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｍ。
里、　２６５　（１９５１）））の方法を用いた。尚、
同測定の標準蛋白質として、ウシ血清アルブミン（和光
補薬工業社より購入）を用いた。測定結果を第１表に示
した。第１表のＣＳ比活性測定結果より、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２　
Ｗ６２０（ｐＡＧ４０１）は、明らかにＣ５活性を回復
していた。
（２）複合プラスミドＰＡＧ４０１の分離と解析エシェ
リヒア・コリ（ｔＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
　Ｋ　１２Ｗ　６２０　（ｐＡＧ４０１）より、前記実
施例１−（１）−（２）の方法でプラスミドｐＡＧ４０
１の［ｌＮＡを、１６０μ区分離精製した。このＤＮＡ
０．３μｇに、１０単位）制限酵素ＥｃｏＲＩにツイン
ジー２社より購入）、１０単位の制限酵素Ｂａ■ＨＩに
ツインジー２社より購入）、１０単位の制限酵素Ｂｉｎ
ｄｍにツインジー２社より購入）、１０単位の制限酵素
ＰｓｔＩ（ベゼスダリサーチラボラトリー社より購入）
、１０単位の制限酵素５ａｌＩにツインジー２社より購
入）、１０単位の制限酵素ＸｈｏＨニツボンジーン社よ
り購入）１０単位の制限酵素ＸｂａＩにツインジー２社
より購入）の少なくとも１種類の制限酵素を加えて、そ
れぞれの適正緩衝液２０μλ中にて、３７℃で２時間反
応させた。消化した試料は、マニアティスら〔ティ゛−
，マニアテイス、イー、エフ。
フリッチュ、ジェイ、サンプルツク：モレキュラークロ
ーニングアラポラトリーマニュアル、コールドスプリン
グハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハーバー
エフ、ワイ、（Ｔ。
Ｎａｎ１ａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　
Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ：　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ
、　Ｃｏ１ｄ　５ｐ−ｒｉｎ（Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈ
ａｒｂｏｒ　　Ｎ。
Ｙ、）　１５０〜１８５頁１９８２年）の方法により、
１％アガロースゲル電気泳動および４％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に供した。泳動の終ったゲルを１μｇ
／ｌａＱエチジウムブロマイド水溶液に浸漬して３０分
間染色した後、紫外線をゲルに照射してゲル上に観察さ
れるバンドの数から生成りＮＡ断片の数を判定し、各断
片の泳動距離から各々の分子の長さを算出し、それらを
加算してプラスミドＰＡＧ４０１の分子の長さを求めた
。同時にそれらの結果に基づき、プラスミドｐＡＧ４０
１の分子中の各制限酵素切断部位を決定した。各ＤＮＡ
断片の分子の長さの決定には、　１　ｋｂ以上の分子の
長さについては１％アガロースゲル電気泳動を用い、約
０．１　ｋｂから１　ｋｂ未満の分子の長さについては
４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた。尚、分
子の長さのマーカーとしては、同一アガロースゲル上で
同時に電気泳動したラムダファージＤＮＡ　にツボレジ
−２社より購入）の＃限酵素Ｈｉｎｄ　ｍによる消化断
片と。
同一ポリアクリルアミドゲル上で同時に電気泳動したフ
ァイエックス１７４フアージＤＮＡの制限酵素Ｈａａｍ
の消化断片（ベゼスダリサーチラボラトリー社より購入
）とを用いた。このようにして得られたプラスミドＰＡ
Ｇ４０１の制限酵素切断地図を第１５図に示す。
第１５図から明らかなように、プラスミドＰＡＧ４０１
は、ベクターＰＢＲ３２５の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部
位にＸｂａＩリンカ−を組込んで作成したベクターの制
限酵素ＸｂａＩ切断・部位に、約４．９キロベースのＣ
Ｓ産生遺伝子を含む外来のＸｂａＩ断片が組込まれてい
た。
このＸｂａＩ断片が、コリネバクテリウム・メラセコラ
（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔａｒ− ｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１（微工研条寄
第５５８号）由来のＣＳ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片で
ある。
プラスミドｐＡＧ４０１のＤＮＡにより、前記実施例１
−（１）−（２）の方法で、エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　Ｗ６２０を
形質転換した。
その結果、調べた形質転換株は、全てテトラサイクリン
耐性アンピシリン耐性グルタミン酸非要求性であった。
更に、該形質転換株について、それらが保有するプラス
ミドを解析した結果、それらのプラスミドは、供与プラ
スミドと比べて制限酵素切断様式で同一と判定されるプ
ラスミドであった。
注１）反応液中の蛋白質１■ｇが、１分間に生成させた
クエン酸のマイクロモル数で表示しである。
実際には、クエン酸と同時に生成するコエンザイムＡを
、ＳＨ基定量試薬（ＤＴＮＢ）を用いて定量した。
注２）ジェイ・アール・ゲスト（Ｊ、Ｒ，Ｇｕｅｓｓｔ
）より分譲をうけたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ皿）Ｋ１２のＣＳ欠損株である〔バーバート
アンドゲスト（Ｈｅｒｂｅｒｔ　ａｎｄ　Ｇｕｅｓｔ）
、ジェイ、ジエン、マイクロパイオル、（Ｊ、　Ｇａｎ
、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　５３ｙ　３６３（１９６
ｇ））、尚、該菌株は、イー・コリ　ジェネティックス
トックセンター〔イー・コリ　ジェネティックストック
センター、デパートメントオブヒューマンジェネティッ
クス、エールユニバーシティースクールオブメディシン
、３３３シーダーストリート　ビー、オー、ボックス３
３３３、ニューヘイブン、コネチカット０６５１０アメ
リカ合衆国（Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｇａｎｅｔｉｃ　５ｔｏ
ｃｋ　Ｃｅｎｔａｒ、　Ｄｅｐａｒｔ−ｍｅｎｔ　ｏｆ
　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎａｔｉｃｓ、　Ｙａｌａ　Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌ　　ｏｆ　　Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ、　　３３３　　Ｃｅｄａｒ　　５ｔｒａａｔ　　
Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ３３３３　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎ
ｎｅｃｔｉｃｕｔ　０６５１０　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、））の
バーバラシェイパツクマン（Ｂａｒｂａｒａ　Ｊ、　Ｂ
ａｃｈｍａｎｎ）より分譲を受けることもできる。
（３）ＣＳ産生遺伝子を含む約４．９キロベースのＤＮ
Ａ断片の分離 前記工程（１）−（２）で調製したプラスミドｐＡＧ４
０１のＤＮＡ２０μｇに対して、６０単位の制限酵素Ｘ
ｂａＩを加えて、　５０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
７，４）、　１０　ｒａＭＭｇＳＯ４′、１００　ｍＷ
　ＮａＣ１（７）緩衝液ｔｏｏｐｏ中テ３７℃にて２時
間反応させた。消化した試料は、前記の方法により、１
％アガロースゲル電気泳動に供した。ただし、ベゼスダ
・リサーチ・ラボラトリ−社より購入したＬＩＰアガロ
ースを使用し、４℃で１気泳動した０次にエチジウムブ
ロマイドで染色したアガロースゲルを紫外線照射下に置
き、Ｃ５産生遺伝子を含む約４．９キロベースのＤＮＡ
断片の存在を確認し、その付近のアガロースゲルを切り
出した。該アガロースゲルにその重量の３倍量の７８緩
衝液を加えて、６５℃で１ｏ分間保持し、アガロースゲ
ルを完全にとがした０次に１等容のフェノールを添加し
て、攪拌の後、水層を回収した。得られた水層に１等容
のフェノール・クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）液を添
加して、攪拌の後、水層を回収した。
得られた水層に１等容のクロロホルムを添加して、攪拌
の後、水層を回収した。得られた水層に、酢酸ナトリウ
ムを最終濃度３００　ｍＭになるように添加し、更に２
倍容のエタノールを加えて攪拌の後、−３０℃にて３時
間保持した。その後、１０，０００　ｒｐｍ（９，００
０ｇ）で１０分間遠心分離して、ＤＮＡの沈殿を回収し
た０次に、同沈殿を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液２０μａに
溶解した１以上の操作により、ＣＳ産生遺伝子を含む約
４．９キロベースのＤＮＡ断片を、約３μｇ取得した。
（以下余白） （４）プラスミドＰＡＧ５０へのＣＳ産生遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の組込み 前記実施例１工程（１）−（８）−〇で調製したプラス
ミドｐＡＧ５０のＤＮＡ　５μｇに対して、制限酵素Ｘ
ｂａＩを１５単位加えて、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐ）１７．４）、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍＭ
　ＮａＣ１の緩衝液６０ｐＱ中で、３７℃にて２時間反
応させた。その後、７０℃で１０分間加熱して１反応を
停止させた。この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００
　ｍＭになる様に加え、２倍容のエタノールを添加して
、−３０℃にて３時間保持した０次に１２．０００　ｒ
ｐｍ（ＩＩＩ、９００　ｇ）で１０分間遠心分離してＤ
ＮＡ沈殿を回収し、同沈殿を減圧乾燥した。
得られた試料をＢＡＰＴ緩衝液（５０ｖａＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ、ＰＨ８，４）　２００　μＱに溶解し、バク
チリアル・アルカリ・ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉ
ａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔ−ａｓｅ）
　（宝酒造株式会社より購入）を１単位添加して６５℃
にて３０分間反応させた。更に該酵素を１単位添加して
、６５℃で３０分間反応させた。その後２反応液に等容
のＴＨＥ緩衝液で飽和したフェノールを加え、混合した
液、１２，０００　ｒｐ曹（８，９００ｇ）で１０分間
遠心分離して水層を回収し、更にもう１回同じ操作を繰
り返した０次に水層に等容のフェノール・クロロホルム
（１：１、ｖ／ｖ）液を添加して混合した後。
１２．０００　ｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心
分離し、水層を回収した。更に水層に等容のクロロホル
ムを添加して攪拌した後、１２，０００　ｒｐｍ（８，
９００ｇ）で１０分間遠心分離し、水層を回収した。該
水層に酢酸ナトリウムを最終濃度３００　ｍＭになる様
に加え、２倍容のエタノールを添加し攪拌した後、−３
０℃にて３時間保持した。その後、１２．００Ｏｒｐｍ
　（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離し、［ｌＮＡ沈
殿を回収した。これを減圧乾燥した。このＤＮＡ全量と
前記実施例３−（１）−（３）で調製したＤＮＡ　１　
μｇと３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼにツポンジ
ーン社より購入）とを、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０　ｍＭジ
チオトレイトール、１　ｍＮスペルミジン、　１　ｄ　
ＡＴＰ、０．１　ｒａ＠／ｍＱ　　ＢＳＡ（Ｂｏ−ｖｉ
ｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）　（ベゼスダリサ
ーチラボラトリー社より購入）の緩衝液５０μα中で、
１５℃にて一晩反応させた。その後、７０℃にて１０分
間加熱することにより１反応を停止させた。
（５）Ｃ３産生遺伝子を含有した複合プラスミドｐＡＧ
４００１の取得 前記実施例３−（１）−（４）で作成した組換え体ＤＮ
Ａにより、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓＳａｃｏｌａ）８
０１（微工研条寄第５５８号）を形質転換した。実施例
１工程〔１〕−（８）−〇に記載と同様の方法で得られ
たテトラサイクリン耐性形質転換株の保有するプラスミ
ドを解析することにより、目的プラスミドを取得した。
得られたプラスミドをｐＡＧ４００１と命名した。
得られたテトラサイクリン耐性形質転換株を、テトラサ
イクリン１０μｇ／ｒａＱを含むＬＧ寒天培地（Ｌ−寒
天培地にグルコース５ｇＩＱを添加した培地）上で純化
した後、各菌株から前記実施例１−［１］−（１）と同
様の方法により、プラスミドを分離し、前記実施例１−
（１）−（６）と同様の方法により制限酵素ＥｃｏＲＩ
％ＨｉｎｄＩ［［、ＰｓｔＩ、５ａ１１．　ＸｂａＩを
用いて、それらのプラスミドを解析した。その結果、プ
ラスミドｐＡＧ４００１を取得した。プラスミドｐＡＧ
４００１は、プラスミドｐＡＧ５０の制限酵素ＸｂａＩ
切断部位に、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＣ
５産生遺伝子を含む約４．９キロベースのＤＮＡ断片が
組込まれた複合プラスミドである。得られたプラスミド
ｐＡＧ４００１の制限酵素切断地図を第１６図に示す。
（６）プラスミドｐＡＧ４００１保有菌株のＣＳ活性の
測定 プラスミドｐＡＧ４００１の保有のコリネバクテリウム
・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｕｉｍ　＋５
ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１を、テトラサイクリン１
０μｇｅｒｍ　１２含有の前記糖蜜培地５０ｖａ　Ｑで
、３２℃にて一晩振盪培養した。ただし、プラスミド非
像持株は、テトラサイクリン無添加で培養した。この培
養液より集菌し、０．８％ＮａＣ１水溶液２０ｍΩで２
回洗浄後、前記ＭＥＳ緩衝液１０＋ｗＩ２に懸濁した。
これを、ブラウン社製（西独）のＭＳＫセルホモジナイ
ザー（８５３０２１型）で処理した後。
１４０００ｒｐｍ（２００００ｇ）で２０分間遠心分離
して、細胞抽出液（粗酵素液）を調整した。この細胞抽
出液を用いて、前記工程（１）−（２）の方法により、
ＣＳ活性を測定した。その結果、第１０表に示した様に
、プラスミドＰＡＧ４００１保持菌株は、ベクターｐＡ
Ｇ５０保持菌株やプラスミド非像詩画に比べて、高いＣ
Ｓ比活性を示した。
注１）第９表の注１）と同じ。
注２）第２表の注２）と同じ。
（７）ＣＳ産生遺伝子を含む約４．９キロベースのＤＮ
Ａ断片の縮小化 前記実施例３−（１）−（５）で調製したプラスミドｐ
ＡＧ４００１のＤＮＡ　５　μｇに対して、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩを１５単位加えて、１０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，４）、　１０　ｍＭＭｇＳＯ４，５０ｍＷ
　ＮａＣ１，１ｍＭジチオトレイトールの緩衝液５０μ
Ω中で、３７℃にて２時間反応させた。そこへ等容のフ
ェノール・クロロホルム（１：１ｖ／ｖ）液を添加して
攪拌の後、水層を回収した。更に等容のクロロホルムを
添加して攪拌の後、水層を回収した。そこへ酢酸ナトリ
ウムを最終濃度３００　ｍＷになるように加え、次に２
倍容のエタノールを添加して、−３０℃で３時間保持し
た後、１２０００　ｒｐｍ（８９００ｇ）で１０分間遠
心分離してＤＮＡの沈殿を回収し、これを減圧乾燥した
（ＤＮＡ試料Ｘｘ■）、前記実施例１工程［１）−（８
）−〇で調製したプラスミドｐＡＧ５０のＤＮＡ５μｇ
に対して、制限酵素Ｂａ＋ａＨＩを１５単位加えて、　
１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１０　
ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、５０ｍＷ　ＮａＣ１，１ｍＭジチオ
トレイトールの緩衝液５０μａ中で、３７℃にて２時間
反応させた。その後、前記実施例２−（２）の方法によ
、す、バクチリアル・アルカリ・ホスファターゼ処理、
エタノール沈殿を行なった（ＤＮＡ試料ｘＸ■）。
前記のＤＮＡ試料ＸＸＶＩとＤＮＡ試料ｘｘ■との全量
に対して、３単位のＴ４ファ―ジＤＮＡリガーゼを５０
　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１０　ｍＮ
　ＭｇＣ１，、１０ｍＭジチオトレイトール、１　ｔａ
Ｍスペルミジン、１腸Ｍ　ＡＴＰ、０゜１　ｍｇ／ｍ　
Ｑ　ＢＳＡの緩衝液５０μΩ中で、１５℃にて一晩反応
させた。その後、７０℃にて１０分間加熱することによ
り１反応を停止させた。このリガーゼ反応液を用いて、
前記実施例１工程（１）−（８）−■の方法により、コ
リネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔ
ｅｒｕｉｗ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１　（微工
研条寄第５５８号）を形質転換した。得られたテトラサ
イクリン耐性形質転換株をテトラサイクリン１０μｇ／
ｌａｎを含む前記ＬＧ寒天培地上で純化した後、各株か
ら前記実施例１工程（１）−（８）−■の方法によりプ
ラスミドを分離し、制限酵素としてＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎ
ｄ　ｍ、Ｐｓｔｌ、　５ａｌＩ及びＸｂａＩを用いる以
外は前記実施例１−（１）−（６）と同様の方法により
それらのプラスミドを解析した。その結果、プラスミド
ｐＡＧ４００２を取得した。プラスミドＰＡＧ４００２
は、プラスミドｐＡＧ５０の制限酵素ＢａｍＨＩ切断部
位に、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＣＳ産生
遺伝子を含む約４．９キロベースのＤＮＡ断片に含まれ
ている約３．２キロベースのＢａｍＨＩ断片が組込まれ
た複合プラスミドである。得られたプラスミドＰＡＧ４
００２の制限酵素切断地図を第１７図に示す。
コリネバクテリウム・メラセコラ（４お＋ｃｔｅ−ｒｉ
ｕｍ　ｍ５ｌａｓｓｅｃｏ１ａ）８０１（ｐＡＧ４００
２）について、前記実施例３−（１）−（６）の方法に
よりＣＳ活性を測定した結果、第１０表に示した様に高
いｃＳ比活性が認められた。故に、プラスミドｐＡＧ４
００２に含まれている３、２キロベースのＢａ■ＨＩ断
片には、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＣＳ産
生遺伝子が含まれていることは明らかである。
（８）ＣＳ産生遺伝子を含む約３．２キロベースのＤＮ
Ａ断片の縮小化 前記実施例３−（１）−（７）で調製したプラスミドＰ
ＡＧ４００２のＤＮＡ　５μｇに対して、２０単位の制
限酵素５ａｌＩを加えて、　５０＋ｓＭτｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，４）、　１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍ
Ｗ　ＮａＣ１の緩衝液５０μｎ中で３７℃にて２時間反
応させた。そこへ等容のフェノール・クロロホルム（１
：１　ｖ／ｖ）液を添加して、攪拌の後、水層を回収し
た。更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層
を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００＋
ｏＭになるように加え、次に２倍容のエタノールを添加
して、−３０℃で３時間保持した後、　１２．０００　
ｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離してＤＮＡ
の沈殿を回収し、これを減圧乾燥した。このＤＮＡ全量
に対して、３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼを５０
　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１０　ｍＭ
ＭｇＣｌ、、１０　ｗＭジチオトレイトール、１ｍＭス
ペルミジン、１　ｍＭ　ＡＴＰ　Ｏ，１ｍｇ／ｍｊｌＢ
ｓＡの緩衝液５０μΩ中で、１５℃にて一晩反応させた
。その後、７０℃にて１０分間加熱することにより１反
応を停止させた。
このリガーゼ反応液を用いて、前記実施例１工程（１）
−（８）−■の方法により、コリネバクテリウム・メラ
セコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｗ　ｍｅｌａｓ
ｓｅｃｏｌａ）８０１（微工研条寄第５５８号）を形質
転換した。
得られたテトラサイクリン耐性形質転換株を、テトラサ
イタリン１０μｇｅｍΩを含む前記ＬＧ寒天培地上で純
化した後、各株から前記実施例１工程〔１）−（８）−
〇の方法によりプラスミドを分離し、制限酵素としてＥ
ｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｍ、　ＰｓｔＩ、５ａｌＩ及びＸｂ
ａＩを用いる以外は前記実施例１−（１）−（６）と同
様の方法によりそれらのプラスミドを解析した。得られ
たプラスミドをプラスミドｐＡＧ４００３と命名した。
第１８図に示した様にプラスミドＰＡＧ４００３はプラ
スミドｐＡＧ４００２の約０．７キロベースの５ａｌＩ
断片が欠失したプラスミドである。
コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎａｂａｃ
ｔａ−ｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１（ｐ
ＡＧ４００３）について、前記実施例３−（１）−（６
）の方法によりＣＳ活性を測定した結果、第１０表に示
した様に高いＣＳ比活性が認められた。故に、プラスミ
ドｐＡＧ４００３にふくまれている約３．２キロベース
のＢａｗＨＩ−ＳａｌＩ断片には、グルタミン酸生産性
コリネ型細菌由来のＣＳ産性遺伝子が含まれていること
は、明らかである。
（以下余白） （２３Ｇ　Ｄ　Ｈ遺伝子、ＩＣＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝
子を含む組換え体ＤＮＡの作製 前記実施例３−（１）で得られたｐＡＧ４００３を前記
実施例１−（３）に記載と同様の方法で１００ｍΩの培
養液から約６０μｇ（６０μｇ／ｒａｔ）を調製した。
またＩＣＤＨ断片およびＧＤＨ断片は前記実施例１−〔
３〕の方法に従いそれぞれ約２μｇおよび約３μｇを調
製後、実施例１−　（３）に記載の方法に従いｐＡＧ４
００３の５ａｌＩ切断点にＩＣＤＨ断片を組み込むこと
によりｐｃＩ３１を得た。またＰＡＧ４００３のＥｃｏ
Ｒ工切断煮切断点Ｈ断片を組み込むことによりｐｃｃｓ
を得た。　ｐｃＩ３１およびｐＣＧ５はそれぞれＣＳと
ＩＣＤＨを同時に含む組換えプラスミドおよびＣＳとＧ
ＤＨを同時に含む組換えプラスミドである。ＣＳ＋ＩＣ
ＤＨ＋ＧＤＨの組換えプラスミドはｐＣＩ３１のＥｃｏ
ＲＩ切断点にＧＤＨ断片を組み込むことにより得られ、
本発明のプラスミドＰＣＩＧ２３１についてさらに詳細
な解析を行った。
〔３〕組換え体ＤＮＡの解析 前記実施例３−（２）で得られた組換え体ＤＮＡである
プラスミドｐｃＩ３１．ｐＣＧ５．およびρＣｌＧ２３
）、を前記実施例１−　（３）に記載した方法によりそ
れぞれの保詩画から調製し、実施例１−　（１）−（６
）に記載の方法に従ってそれぞれの制限酵素による切断
点地図を作成した。結果を第１９〜２１図に示す。
その結果これら３種の組換えプラスミドは全て目的の構
造を持っていることが確認された。
〔４〕酵素活性の測定 前記実施例１−　（６）記載の方法に従ってＰＣｌ３１
　、　ＰＯＣ３、およびｐｃＩＧ２３１の各プラスミド
を保持する宿主菌（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｍｅｌａｓｓａｃｏｌａ　８０１）よりそれぞれ細胞抽
出液を調製し、ＣＳ，ＩＣＤＨ。
ＧＤＨの酵素活性をプラスミドを保持しない宿主菌の細
胞抽出液を用いた場合と比較した。ＣＳ活性は、３．０
ｍＭの酵素反応液（９５ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ４１（ｐ
Ｈ８゜０）、０．２ｍＭオキザロ酢酸、０．１−Ｍ　５
．５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮ
Ｂ）、０．１６ｍＭアセチル−ＣｏＡ、１０μΩ細胞抽
出液〕の４１２ｎｗにおける吸光度の増加を日立分光光
度計（２２８型）で測定することにより求めた。ＩＣＤ
Ｈ活性およびＧＤＨ活性の測定は前記実施例１−［６）
記載の方法で行った。
注１）第９表の注１）に同じ。
注２）第３表の注１）に同じ。
注３）第１表の注１）に同じ。
注４）第２表の注２）に同じ。
第１１表の結果によりｐｃＩ３１保持株、　ｐＣＧ５保
持株、　ｐｃＩＧ２３１保持株はそれ保持口的の酵素活
性が全て強化されていることが確認された。
（ぷ下金ｆｊ） 実施例４ 本実施例では、Ｃ５，ＡＨ，ＩＣＤＨ，およびＧＤＨの
４種の酵素が同時に強化された菌株を作成した例を示す
、この場合、４種の酵素遺伝子を同時に含む組換えプラ
スミドの構築は、前記実施例２と実質的に同様の方法で
行った。
（１）組−えプラスミドの作製 まず、前記実施例２−　（１）に記載の方法でＡＨ遺伝
子を含む約４．７ｋｂのＸｂａＩ断片を調製し、約２μ
ｇの該断片を得た。また、ＰＣＩＧ２３１をＸｂａｌで
消化することにより得られる３断片のうち、約９．４ｋ
ｂの断片と約６，５ｋｂの断片をｐｃＩＧ２３１　Ｄ　
Ｎ　Ａ　１０μｇからそれぞれ約３μｇおよび約２μｇ
の収量で別個に調製した。得られた３種のＸｂａＩ断片
（４，７ｋｂ、９．４ｋｂ、および６．５ｋｂ）を全量
混合し、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてこれらを
結合させた０本リガーゼ反応液を用いてコリネバクテリ
ウム・メラセコラ（Ｃａｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｍｅｌａｓｓａｃｏｌａ）８０１を形質転換し、得られ
たテトラサイクリン耐性形質転換株約３００株について
それらが各々の保有する組換えプラスミドの解析を行い
、　ＸｂａＩ処理により９．４ｋｂ、　６．５ｋｂ、お
よび４．７ｋｂの３断片が生じる組換えプラスミドを１
４種選択し、これらのうち更に５ａｌＩ処理で３．４ｋ
ｂの断片が生じるもの２種を目的の組換えプラスミドと
して分離した。これらのうち１種、ＰＣＡＩＧ４を保有
する形質転換株コリネバクテリウム・メラセコラ（（Ｃ
ｏｒ　ｎａｂａｃｔａｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ）８０１（ｐＣＡＩＧ４）と称する〕を培養し、その
培養液２００■ｌから収量約１００μｇ（濃度約５０μ
ｇ／■１）のプラスミドｐＣＡＩＧ　４を調製し、制限
酵素による切断点地図を作成した。
その結果、第２２図に示したとおりｐＣＡＩＧ４はＰＧ
Ａ５０にＣ３，ＡＨｌＩＣＤＨ，およびＧＤＨの各断片
が組込まれた目的のプラスミドであることが確認された
。
（２）酵素活性の測定 コリネバクテリウム・メラセコラ（並ｎμ匝匹−ｔｅｒ
ｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１およびコリネ
バクテリウム０メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔａｒ
ｉｕｍ　ｗｅｌａｓｓａｃｏｌａ）８０１　（ｐＣＡＩ
Ｇ４）よりそれぞれ細胞抽出液を調製後、ＣＳ，ＡＨｌ
ＩＣＤＨｌおよびＧＤＨの各酵素活性を比較した。酵素
活性の測定はそれぞれ前記実施例３−（１）、２−　（
１）及び１−　（１）および〔２〕に記載の方法で行っ
た。第１２表にその結果を示すが、コリネバクテリウム
・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａ
ｌａｓｓｓｃｏｌａ）８０１（ｐＣＡＩＧ４）が明らか
に目的の４種の酵素が全て強化されていた。
注１）第９表の注１）に同じ。
注２）第６表の注１）に同じ。
注３）第３表の注１）に同じ。
注４）第１表の注１）に同じ。
注５）第２表の注２）に同じ。
実施例５ 本実施例では、実施例１〜４で得られた多重強化株を用
いたグルタミン酸発酵の例を示す、これらの菌株の培養
は２Ｑジャーファーメンタ−を用い、実際の工業プロセ
ス同様に培養液の残着濃度を一定に保つように粘液を連
続的に添加して行った。
各菌株をそれぞれ５０ｍｆｌのケーン廃糖蜜４ｇ／ｉ　
　（全糖として）、尿素０．８　ｇ／ｄΩ、　Ｍｇ５Ｏ
，・７Ｈ２００，０５ｇ／ｄ　ｎ　、リン酸０．１５　
ｇ／ｄｊ２　（殺菌前ｐＨ７，０，１２０℃２０分殺菌
）を含む培地に接種し、３２℃で１６時間培養後、その
全量をケーン廃糖蜜５．４　ｇ／ｄ　Ｑ　（全糖として
）　、Ｍｇ５ｏ４−７ｎ、ｏ　ｏ、ｏｓ　ｇ／ｄ　（１
−リン酸０．２３　ｇ／ｄ　Ｑ　（殺菌前ｐＨ８，０，
１２０℃３０分殺菌）を含む培地１αを含む２Ω容ジャ
ーファーメンタ−に接種し、３２℃、　８００ｒｐｍ、
　Ｉｖｙｓ　ｐＨ７，８（アンモニア水で自動調整）の
条件で培養した。乾燥菌体重量が約１．５ｇ／ｄ　１１
　ニなった時点で（約７時間）培養液４０ＩＩＱを主培
養液に接種した。主培養はケーン廃糖蜜８ｇ／ｄΩ（全
糖として）　、　Ｍｇ５Ｏ，・７８．ＯＯ，０５ｇ／ｄ
　Ｑ、リン酸０．２１３　ｇ／ｄｎ　、　１２０℃２０
分殺菌の培地１Ωを含む培地２ｎ容ジャーファーメンタ
−を用いて、３２−３４℃、　９００　ｒｐｍ、１　ｖ
ｖ＋ｍ、ｐＨ７，３（アンモニア水で自動調整）の条件
で行い、乾燥菌体重量が約１．２ｇ／ｄ　ｊｌになった
時点でニラサンノニオンＰ−６（日本油脂製）を１ｇ添
加し、さらに乾燥菌体重量が約１．４ｇ／ｄＡになった
時点でニラサンカチオンＨＡ（日本油脂！１）を０．２
　ｇ−０，３ｇ添加した。また培養１５時間目にペニシ
リンＧを４，０００単位添加した。培養中の残着濃度は
テクニコン社製オートアナライザーにより適宜測定し、
糖濃度４５ｇ／ｄｊｌ（全糖として）の補糖液を連続添
加することにより培養液の残着濃度を１〜２　ｇ／ｄΩ
前後に制御した。尚１組換えプラスミドの脱落を防ぐた
め、主培養液と補糖液以外にはテトラサイクリンを１０
μｇ／曹ａ添加した。
培養は３６時間行い、培養終了後、各菌株培養液の一部
を分取し、Ｌ−グルタミン酸゛の濃度をテクニコン社製
オートアナライザーを使用して測定した。
また、それまでの全使用糖量とＬ−グルタミン酸生産量
より収率を求めた。得られた結果を第１３表に示す、ま
た、各菌株の培養液ＩＱを取り、遠心分離により菌体を
除去した後、塩酸を加えてｐＨ３゜２に調整するいわゆ
る等電点法により粗グルタミン酸結晶を取得した。その
結果、菌株８０１　（ｐＩＧ１０４）、　８０１（ｐＡ
ＩＧ３２１）、８０１（ｐｃＩＧ２３１）および８０１
　（ｐＣＡＩＧ５）から粗グルタミン酸結晶をそれぞれ
７６　ｇ、７１　ｇ、７９　ｇおよび７８　ｇが得られ
た。
第１３表 注１）テクニコン社製オートアナライザーを使用して測
定した。
注２）グルタミン酸生成量（ｇ）／使用糖量（ｇ）　Ｘ
　１００注３）第２表の注２）に同じ。
第１３表から明らかなように、少なくともＧＤＨとＩＣ
ＤＨの両酵素が同時に強化された菌株では。
他の菌株に比較してグルタミン酸蓄積量、対糖収率とも
に高い成績を示した。
（発明の効果） 本発明によりＬ−グルタミン酸を著量蓄積する新規なグ
ルタミン酸生産性コリネ型細菌が供給され、またその細
菌を用いることによりＬ−グルタミン酸を大量に製造す
ることが可能になった。
【図面の簡単な説明】
第１図は組換えプラスミドｐＡＧ１０３の、第２図はＰ
ＡＧＩの、第３図はｐＡＧ１４の、第４図はｐＡＧ３の
、第５図はＰＡＧ５０の、第６図はＰＡＧｌｏｏｌの、
第７図はｐＡＧ３０２の、第８図はｐＡＧ３０３の、第
９図はｐＡＧ３１１の、第１０図はｐＡＧ３００１の、
第１１図はｐＩＧｌｏｌの、第１２図はｐＡＧ５０１の
、第１３図はＰＡＧ５００１の、第１４図はｐＡＩＧ３
２の、第１５図はｐＡＧ４０１の、第１６図はＰＡＧ４
００１の、第１７図はｐＡ０４００２の、第１８図はｐ
ＡＧ４００３の、第１９図はｐｃＩ３１の、第２０図は
ｐＣＧ５の、第２１図はｐｃＩＧ２３１の、第２２図は
ρＣＡｌＧ４の制限酵素切断地図をそれぞれ示す０図中
の英文字はそれぞれ下記の制限酵素による切断点を示す
。 Ｂ：ＢａｍＨＩｔ　Ｅ：ＥｃｏＲＩ、　Ｈ：１（ｉｎｄ
ＩＩＩ。 Ｐ：ＰｓｔＩ、　Ｓ：５ａｌＩ、　Ｘ：ＸｂａＩ第６．
１０．１１．１３．１４．１８．１９．２０．２１及び
２２図中、内側の円と数値は各プラスミドの基準となる
ＸｂａＩ切断点からの距離をキロベース（ｋｂ）で示し
ている。ＡＨ，Ｃ５，ＩＣＤＨ，ＧＤＨはそれぞれＡＨ
遺伝子を含むＤＮＡ断片、ＣＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片
、ＩＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片、ＧＤＨ遺伝子を含
むＤＮＡ断片であることを示している。また、第１図に
おいてＤ　Ｎ　Ａ　−（Ａ）はＧＤＨ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片、ｐＢＲ３２５−（Ａ）はプラスミドｐＢＲ３２
５をＥｃｏＲＩで開環したＤＮＡ断片を示し、第５図に
おいてｏ　Ｎ　Ａ　−（ａ）はプラスミドＰＡＧＩ由来
のテトラサイクリン耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を示す。 特許出願人　　旭化成工業株式会社 第　１図 第５図 第７図 ＥｃｏＲｌ（５，１） 第８図 第９図 第１２図 第１７図

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）グルタミン酸生合成経路に関与するグルタミン酸
    生産性コリネ型細菌由来の酵素遺伝子のうち、グルタミ
    ン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｈｙｄ
    ｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＤＨ）遺伝子およびイソクエン酸
    デヒドロゲナーゼ（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｄｅｈｙｄ
    ｒｏｇｅｎａｓｅ：ＩＣＤＨ）遺伝子を含む少なくとも
    ２種の酵素遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡを保有する
    グルタミン酸生産性コリネ型細菌。
  2. （２）少なくとも２種の酵素遺伝子がグルタミン酸デヒ
    ドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子およびイソクエン酸デヒ
    ドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）遺伝子である特許請求の範囲
    第（１）項に記載のグルタミン酸生産性コリネ型細菌。
  3. （３）少なくとも２種の酵素遺伝子がグルタミン酸デヒ
    ドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子、イソクエン酸デヒドロ
    ゲナーゼ（ＩＣＤＨ）遺伝子およびアコニット酸ヒドラ
    ターゼ（Ａｃｏｎｉｔａｔｅ　ｈｙ−ｄｒａｔａｓｅ：
    ＡＨ）遺伝子である特許請求の範囲第（１）項に記載の
    グルタミン酸生産性コリネ型細菌。
  4. （４）少なくとも２種の酵素遺伝子がグルタミン酸デヒ
    ドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子、イソクエン酸デヒドロ
    ゲナーゼ（ＩＣＤＨ）遺伝子およびクエン酸シンターゼ
    （Ｃｉｔｒａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＣＳ）遺伝子で
    ある特許請求の範囲第（１）項に記載のグルタミン酸生
    産性コリネ型細菌。
  5. （５）少なくとも２種の酵素遺伝子がグルタミン酸デヒ
    ドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子、イソクエン酸デヒドロ
    ゲナーゼ（ＩＣＤＨ）遺伝子、アコニット酸ヒドラター
    ゼ（ＡＨ）遺伝子およびクエン酸シンターゼ（ＣＳ）遺
    伝子である特許請求の範囲第（１）項に記載のグルタミ
    ン酸生産性コリネ型細菌。
  6. （６）グルタミン酸生産性コリネ型細菌がコリネバクテ
    リウム属細菌である特許請求の範囲第（１）項から第（
    ５）項記載のグルタミン酸生産性コリネ型細菌。
  7. （７）グルタミン酸生産性コリネ型細菌を培養して該細
    菌にＬ−グルタミン酸を生産せしめ、生成するＬ−グル
    タミン酸を該細菌の培養物から分離することからなる発
    酵法によるＬ−グルタミン酸の製造方法において、該Ｌ
    −グルタミン酸生産性コリネ型細菌としてグルタミン酸
    生合成経路に関与するグルタミン酸生産性コリネ型細菌
    由来の酵素遺伝子のうち、グルタミン酸デヒドロゲナー
    ゼ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
    ：ＧＤＨ）遺伝子およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼ
    （Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：
    ＩＣＤＨ）遺伝子を含む少なくとも２種の酵素遺伝子を
    含有する組換え体ＤＮＡを保有するグルタミン酸生産性
    コリネ型細菌を用いることを特徴とするＬ−グルタミン
    酸の製造方法。
  8. （８）少なくとも２種の酵素遺伝子がグルタミン酸デヒ
    ドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子およびイソクエン酸デヒ
    ドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）遺伝子である特許請求の範囲
    第（７）項に記載のＬ−グルタミン酸の製造方法。
  9. （９）少なくとも２種の酵素遺伝子がグルタミン酸デヒ
    ドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子、イソクエン酸デヒドロ
    ゲナーゼ（ＩＣＤＨ）遺伝子およびアコニット酸ヒドラ
    ターゼ（Ａｃｏｎｉｔａｔｅ　ｈｙ−ｄｒａｔａｓｅ：
    ＡＨ）遺伝子である特許請求の範囲第（７）項に記載の
    Ｌ−グルタミン酸の製造方法。
  10. （１０）少なくとも２種の酵素遺伝子がグルタミン酸デ
    ヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子、イソクエン酸デヒド
    ロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）遺伝子およびクエン酸シンター
    ゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＣＳ）遺伝子
    である特許請求の範囲第（７）項に記載のＬ−グルタミ
    ン酸の製造方法。
  11. （１１）少なくとも２種の酵素遺伝子がグルタミン酸デ
    ヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子、イソクエン酸デヒド
    ロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）遺伝子、アコニット酸ヒドラタ
    ーゼ（ＡＨ）遺伝子およびクエン酸シンターゼ（ＣＳ）
    遺伝子である特許請求の範囲第（７）項に記載のＬ−グ
    ルタミン酸の製造方法。
  12. （１２）グルタミン酸生産性コリネ型細菌がコリネバク
    テリウム属細菌であることを特徴とする特許請求の範囲
    第（７）項から第（１１）項記載のＬ−グルタミン酸の
    製造方法。
JP62047759A 1987-03-04 1987-03-04 Ｌ―グルタミン酸の製造方法 Expired - Lifetime JP2520895B2 (ja)

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