CN100402657C

CN100402657C - 生产l-谷氨酸的细菌和生产l-谷氨酸的方法

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Publication number: CN100402657C
Application number: CNB991055497A
Authority: CN
Inventors: 泉井裕; 小野荣治; 松井和彦; 守屋美加; 伊藤久生; 原吉彦
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1999-03-18
Publication date: 2008-07-16
Anticipated expiration: 2019-03-18
Also published as: EP1462523A2; PE20000342A1; PL332072A1; DE69921881T2; CN1233660A; US20030119153A1; US20010019836A1; KR19990077973A; PL196781B1; KR100626102B1; AU756507B2; ID22246A; US6331419B1; KR100626568B1; ES2327838T3; ES2232984T3; MY126522A; US20090263874A1; KR20060061785A; EP0952221B1

Abstract

通过在液体培养基中培养微生物产生L-谷氨酸，该微生物属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属，并且具有产生L-谷氨酸的能力，其催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加，或催化L-谷氨酸分支反应并且产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性减少或缺乏，并且从培养基中收集产生的L-谷氨酸。

Description

生产L-谷氨酸的细菌和生产L-谷氨酸的方法

本发明涉及新的生产L谷氨酸的细菌和通过利用同样细菌发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是可作为食物，药物和诸如此类的重要氨基酸。

通常L-谷氨酸已经利用所谓的生产L-谷氨酸的棒状细菌通过发酵方法产生，该细菌原则上属于短杆菌属，棒状杆菌，和微杆菌或它们的变异体(“氨基酸发酵”，Gakkai Shuppan中心，第195-215页，1986)。至于通过利用其它细菌菌株发酵生产L-谷氨酸的方法，已知有利用芽孢杆菌，链霉菌，青霉菌和诸如此类的微生物的方法(美国专利号3,220,929)，利用假单孢菌，节杆菌，沙雷伯氏菌，念珠菌属和诸如此类的微生物的方法(美国专利号3,563,857)，利用芽孢杆菌，假单孢菌，沙雷伯氏菌属和诸如此类或产气气杆菌(目前称为产气肠杆菌)的方法(日本专利公开号(KOKOKU)，32-9393(1957))，利用大肠杆菌的变异体菌株的方法(日本未审专利申请公开号(KOKAI)5-244970(1993))和诸如此类的方法。

虽然通过前面所述培育这样的微生物或改善的生产方法已经相当大地提高L-谷氨酸的生产率，仍然需要开发更廉价和更有效的生产L-谷氨酸的方法，以便满足将来对氨基酸的明显增长的需要。

本发明的目的是发现生产L-谷氨酸的能力高的新的生产L-谷氨酸细菌，从而开发生产L-谷氨酸的更廉价和更有效的方法。

为了达到前面的目的，本发明人广泛地研究具有生产L-谷氨酸能力的微生物，这些微生物与过去报道的微生物不同。作为结果是，他们发现了某些起源于属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物的菌株具有高的生产L-谷氨酸的能力，并且已经完成本发明。

所以，本发明提供：

(1)属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物并且具有生产L-谷氨酸的能力，至少具有下面的一个特性：

(a)该微生物催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加；和

(b)该微生物催化L-谷氨酸生物合成的途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏；

(2)上面(1)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成的反应的酶是至少一种选自包括柠檬酸合成酶(下面简写为“CS”)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(下面简写为“PEPC”)，和谷氨酸脱氢酶(下面简写为“GDH”)的酶；

(3)上面(2)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成的反应的酶包括CS，PEPC和GDH三者；

(4)上面(1)到(3)中的任何一个的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成的途径的分支反应和生产不是L-谷氨酸的化合物的酶是α-酮戊二酸脱氢酶(下面简写为“αKGDH”)；

(5)上面(1)到(4)的任何一个的微生物是成团肠杆菌或液化沙雷伯氏菌；和

(6)生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养如上面(1)到(5)的任何一个定义的微生物以便生产和在培养基中积累L-谷氨酸，并收集来自培养基的L-谷氨酸。

由于本发明的微生物具有高的生产L-谷氨酸的能力，通过利用前面已知的生产L-谷氨酸的棒状细菌和诸如此类的培育技术使微生物具有更高的生产能力被认为是可能的，可以期望通过适当选择培养条件和诸如此类能够发展更廉价和更有效的生产L-谷氨酸的方法。

图1显示具有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒pMWCPG的构建。

图2显示了具有gdhA基因的质粒pSTVG的构建。

图3显示了具有广谱寄主范围的质粒RSF1010的复制原点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet的构建。

图4显示了具有广谱寄主范围的质粒RSF1010的复制原点，四环素抗性基因，gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒RSFCPG的构建。

图5显示了具有gltA基因的质粒pMWCB的构建。

图6显示了起源于成团肠杆菌的pTWVEK101的DNA片断的限制图谱。

图7显示了从起源于成团肠杆菌的sucA基因的核苷酸序列推测的氨基酸序列与起源于大肠杆菌的序列的比较。上面部分：成团肠杆菌，下面部分：大肠杆菌(下面同样应用)。

图8显示了从起源于成团肠杆菌的sucB基因的核苷酸序列推测的氨基酸序列与起源于大肠杆菌的序列的比较。

图9显示了从起源于成团肠杆菌的sdhB基因的核苷酸序列推测的氨基酸序列与起源于大肠杆菌的序列的比较。

图10显示了从起源于成团肠杆菌的sucC基因的核苷酸序列推测的氨基酸序列与起源于大肠杆菌的序列的比较。

下面将详细解释本发明。

本发明的微生物是属于肠杆菌或沙雷伯氏菌的微生物，并且具有至少一个下面的特性：

(a)该微生物催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加；和

(b)该微生物催化L-谷氨酸生物合成的途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏。

这样的微生物可以通过利用肠杆菌属或沙雷伯氏菌属的微生物作为亲本菌株并且使该微生物具有上面(a)和/或(b)的特性而得到。属于可以用作亲本菌株的肠杆菌属或沙雷伯氏菌属的微生物的实例如下列出：

成团肠杆菌

产气肠杆菌

河生肠杆菌

阿氏肠杆菌

阴沟肠杆菌

溶解肠杆菌

日勾维肠杆菌

霍氏肠杆菌

中间肠杆菌

超压肠杆菌

阪崎肠杆菌

生癌肠杆菌

液化沙雷伯氏菌

嗜虫沙雷伯氏菌

无花果沙雷伯氏菌

居泉沙雷伯氏菌

格氏沙雷伯氏菌

变形斑沙雷伯氏菌

气味沙雷伯氏菌

普城沙雷伯氏菌

深红沙雷伯氏菌

更优选地，可以提到下面列出的那些细菌菌株：

成团肠杆菌ATCC 12287

成团肠杆菌AJ 13355

液化沙雷伯氏菌ATCC 14460

成团肠杆菌AJ13355于1998年2月19日保藏在通商产业省，工业技术院，生命工学工业技术研究所，接受的登记号是FERM P-16644，然后于1999年1月11日根据布达佩斯条约转为国际保藏，登记号是FERM BP-6614。可从ATCC得到成团肠杆菌ATCC 12287，和液化沙雷伯氏菌ATCC 14460。

成团肠杆菌AJ13355是在Iwata-shi，Shizuoka，日本的土壤分离的菌株。

AJ13355的生理特性如下：

(1)革兰氏染色：阴性

(2)氧行为：兼性厌氧菌

(3)过氧化氢酶：阴性

(4)氧化酶：阳性

(5)硝酸盐还原：阴性

(6)Voges-Proskauer反应：阳性

(7)甲基红测试：阴性

(8)脲酶：阴性

(9)吲哚生产：阳性

(10)游动性：存在

(11)在TSI培养基中产生硫化氢：轻微活化

(12)β-半乳糖苷酶：阳性

(13)糖同化能力：

阿拉伯糖：阳性

蔗糖：阳性

乳糖：阳性

木糖：阳性

山梨糖醇：阳性

肌醇：阳性

海藻糖：阳性

麦芽糖：阳性

蜜二糖：阳性

阿东糖醇：阴性

蜜三糖：阳性

水杨苷：阴性

蜜二糖：阳性

(14)甘油糖同化能力：阳性

(15)有机酸同化能力：

柠檬酸：阳性

酒石酸：阴性

葡糖酸：阳性

乙酸：阳性

丙二酸：阴性

(16)精氨酸脱水酶：阴性

(17)鸟氨酸脱羧酶：阴性

(18)赖氨酸脱羧酶：阴性

(19)苯丙氨酸脱氨酶：阴性

(20)形成色素：黄色

(21)明胶液化：阳性

(22)生长pH：在pH4没有很好生长，在pH4.5到7生长很好

(23)生长温度：在25℃生长很好，在30℃生长很好，在37℃生长很好，在42℃能够生长，在45℃不能生长。

从这些细菌特性，确定AJ13355是成团肠杆菌。

在下面所述的工作实施例中，利用成团肠杆菌ATCC12287，成团肠杆菌AJ13355，和液化沙雷伯氏菌ATCC14460作为起始亲本菌株用于获得催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加的菌株，或催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏的菌株。但是，通过属于肠杆菌和沙雷伯氏菌属的任何细菌经Embden-Meyerhof途径完成糖代谢，在这一途径产生的丙酮酸在需氧条件下的三羧酸循环中氧化。通过GDH或谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶从三羧酸循环的中间产物α-酮戊二酸生物合成L-谷氨酸。所以，这些微生物拥有同样的L-谷氨酸生物合成途径，并且属于肠杆菌和沙雷伯氏菌属的微生物包含在本发明的一个构思中。所以，除了其它上面提到的种类和菌株，属于肠杆菌和沙雷伯氏菌属的其它微生物也在本发明的范围内。

本发明的微生物是属于肠杆菌属或沙雷伯氏菌属并且具有产生L-谷氨酸的能力的微生物。在本文使用的表述“具有生产L-谷氨酸的能力”指具有在培养过程中在培养基中积累L-谷氨酸的能力。根据本发明，产生L-谷氨酸的能力是通过给予下面的一个或两个特性得到的：

(a)该微生物催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加；和

(b)该微生物催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应，并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏。

作为催化肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物的L-谷氨酸的生物合成的反应的酶的例子，可以提到的是GDH，谷氨酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，异柠檬酸脱氢酶，乌头酸水合酶，CS，PEPC，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸激酶，烯醇化酶，磷酸甘油酸变位酶，磷酸甘油酸激酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，丙糖磷酸异构酶，果糖二磷酸醛缩酶，磷酸果糖激酶，葡糖磷酸异构酶和诸如此类。在这些酶中，CS，PEPC和GDH中的一个或两个或三种是优选的。作为本发明的微生物，更加优选的是所有三种酶CS，PEPC和GDH的活性增加。是否微生物增加了靶酶的活性，活性增强的程度通过细菌细胞提取物或纯化部分的酶活性的测量，并且将它与野生型菌株或亲本菌株比较可以确定。

本发明的微生物，属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属，其催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加，例如这种微生物可以作为变异体获得，其中在编码该酶的基因中已经产生突变，或通过利用上面提到的微生物作为起始亲本菌株的遗传重组菌株获得。

为了增强CS，PEPC或GDH的活性，例如，编码CS，PEPC或GDH的基因可以克隆进入适当质粒，可以利用得到的质粒转化作为寄主的前面提到的起始亲本菌株。这可以增加编码CS，PEPC和GDH的基因的拷贝数(下面分别简写为“gltA基因”，“ppc基因”，和“gdhA基因”)，结果，增强了CS，PEPC和GDH的活性。

将选自克隆gltA基因，ppc基因和gdhA基因的一种或两种或三种以任何联合导入上面提到的起始亲本菌株。当导入两或三种基因时，将这两或三种基因克隆进入一种质粒，并且导入寄主，或者它们分别克隆进入两或三种质粒，所述质粒可以在同一寄主中存在，并且导入寄主中。

对质粒没有特别限制只要它能够在属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物中自主复制。质粒的例子包括，例如，pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218和诸如此类。除了这些质粒，也可以使用噬菌体DNA载体。

通过例如，D.M.Morrison(酶学方法68，326(1979))的方法，利用氯化钙增强受体细胞对DNA的通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物学杂志，53，159(1970))，或诸如此类的方法可以达到转化。

CS，PEPC和GDH的活性也可以通过存在于作为寄主的起始亲本菌株的染色体DNA上的gltA基因，ppc基因和/或gdh基因的多个拷贝增强。为了在属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物的染色体DNA中导入多个拷贝的gltA基因，ppc基因和/或gdhA基因，可以利用存在于染色体DNA上的多个拷贝的序列如重复DNA，和存在于转座因子末端的倒转重复。可选择地，也可以将多个拷贝的基因导入染色体DNA，方法是利用携带gltA基因，ppc基因或gdhA基因的转座子的转座。这些技术可以增加转化体细胞中的gltA基因，ppc基因，和gdhA基因的拷贝数，结果增强了CS，PEPC和GDH的活性。

可以利用任何生物体作为用于增加拷贝数的gltA基因，ppc基因和gdhA基因的来源，只要生物体具有CS，PEPC和GDH活性。在这些生物体中，细菌，即原核生物，如那些属于肠杆菌，克雷伯氏菌，欧文氏菌，泛菌，沙雷伯氏菌，埃希氏菌，棒状杆菌，短杆菌，和芽孢杆菌属的细菌是优选的。作为特定的实例，可以提到大肠杆菌。从上面提到的这样的微生物的染色体DNA可以得到gltA基因，ppc基因和gdhA基因。

通过分离补充缺乏CS，PEPC或GDH活性的变异体菌株的营养缺陷型的DNA片断可以从前面提到的任何微生物的染色体DNA分别得到gltA基因，ppc基因和gdhA基因。可选择地，因为已经阐明了埃希氏菌或棒状杆菌属的细菌的这些基因的核苷酸序列(生物化学，22卷，5243-5249，1983；生物化学杂志，95卷，909-916，1984；基因，27卷，193-199，1984；微生物学，140卷，1817-1828，1994；分子遗传学，218卷，330-339，1989；和分子微生物学，6卷，317-326，1992)，利用根据每个阐明的核苷酸序列合成的引物和染色体DNA作为模板，通过PCR可以获得这些基因。

除了通过上面提到的基因扩增，通过增强gltA基因，ppc基因或gdhA基因的表达也可以增强CS，PEPC或GDH的活性。例如，通过利用另一个强启动子替代gltA基因，ppc基因或者gdhA基因的启动子增强表达。这样的强启动子的例子包括，例如lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体P_R启动子和P_L启动子和诸如此类。启动子已经被替代的gltA基因，ppc基因，gdhA基因可以克隆进入质粒和导入寄主微生物，或利用重复DNA，倒转重复，转座子或诸如此类导入寄主微生物的染色体DNA。

通过利用另一个较强启动子(参见WO87/03006，和日本未审专利申请公开号(KOKAI)，61-268183(1986))替代染色体上的gltA基因，ppc基因，gdhA基因的启动子或在每个基因的编码序列的上游插入强启动子(参见基因，29，231-241，1984)也可以增强CS，PEPC或GDH的活性。特定地说，通过在gltA基因，ppc基因，gdhA基因(这些基因的启动子用强启动子替代)或含有它们的一部分的DNA，和染色体上对应的基因之间的同源重组可以达到。

属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物的特定例子包括例如，成团肠杆菌ATCC12287/RSFCPG，成团肠杆菌AJ13355/RSFCPG，和液化沙雷伯氏菌ATCC14460/RSFCPG，其中这些微生物的CS，PEPC或GDH活性增强。

催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的例子包括例如，αKGDH，异柠檬酸裂合酶，磷酸乙酰转移酶，乙酸激酶，乙酰羟酸合成酶，乙酰乳酸合成酶，甲酸乙酰转移酶，乳酸脱氢酶，谷氨酸脱羧酶，1-吡洛啉脱氢酶和诸如此类。在这些酶中间，αKGDH是优选的。

为了在属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物中获得上面提到的酶活性的下降和缺乏，可以通过常规诱变技术或遗传工程技术在编码酶的基因中导入引起酶活性的下降或缺乏的突变。

诱变技术的例子包括例如，利用X-射线和紫外光辐射的方法，利用诱变试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍和诸如此类处理的方法。导入突变的基因的位置可以是编码酶蛋白的编码区或如启动子的表达调节区。

遗传工程技术的例子包括，例如基因重组，基因转导，细胞融合和诸如此类。例如，在靶基因中插入药物抗性基因以便产生功能失活的基因(缺陷基因)。然后，这一缺陷基因可以导入属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物的细胞，并且在染色体上的靶基因可以用缺陷基因通过同源重组替代(基因破坏)。

通过测量候选菌株的细菌细胞提取物或纯化部分的酶活性，并且将它与野生型菌株或亲本菌株的比较可以确定是否微生物降低了靶酶的活性或缺乏该活性，和该酶活性的降低程度。通过例如Reed等人的方法可以测量αKGDH酶活性(L J.Reed和B.B.Mukherjee，酶学方法，1969，13，p55-61)。

根据靶酶，可以在变异体的表现型的基础上选择靶变异体。例如，缺乏αKGDH活性或该活性降低的变异体在含有葡萄糖的基本培养基或含有乙酸或L-谷氨酸作为唯一碳源的基本培养基上不能生长，或显示了明显的在需氧条件下生长速率降低。但是，甚至在同样条件下，通过在含有葡萄糖的必需培养基中加入琥珀酸或赖氨酸，甲硫氨酸和二氨基庚二酸，该变异体可以展示出正常的生长。根据这些现象，可以选择缺乏αKGDH活性或该活性降低的变异体。

在WO95/34672详细叙述了通过同源重组生产缺乏αKGDH基因的乳发酵短杆菌菌株的方法，同样的方法可以用于肠杆菌和沙雷伯氏菌属的微生物。

另外，在分子克隆，第二版，冷泉港出版社(1989)和诸如此类中详细叙述了基因克隆，DNA切割和连接，转化和诸如此类。

如上所述得到的缺乏αKGDH活性或该活性降低的变异体菌株的例子是成团肠杆菌AJ13356。将成团肠杆菌AJ13356于1998年2月19日保藏在通商产业省，工业技术院，生命工学工业技术研究所，接受的登记号FERM P-16645，然后按照布达佩斯条约在1999年1月11日转为国际保藏，接受的登记号是FERMBP-6615。

属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属、具有至少(a)和(b)的特性之一和产生L-谷氨酸的能力的微生物，可以培养在液体培养基中以便在培养基中产生和积累L-谷氨酸。

培养基可以是如果需要，含有碳源，氮源，和无机盐，以及微量有机营如氨基酸，维生素，和诸如此类的普通营养培养基。这可以是合成培养基或天然培养基。任何碳源和氮源可以用于培养基，只要它们可以被培养的微生物利用。

碳源可以是糖，如葡萄糖，甘油，果糖，蔗糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，淀粉水解物，糖蜜和诸如此类。另外，有机酸如乙酸和柠檬酸也可以单独利用或联合其它碳源利用。

氮源可以是氨，铵盐如硫酸铵，碳酸铵，氯化铵，磷酸铵，和乙酸铵，硝酸盐和诸如此类。

作为微量有机营养，可以使用氨基酸，维生素，脂肪酸，核酸，含有它们的物质如蛋白胨，酪蛋白氨基酸，酵母提取物，和大豆蛋白质分解产物和诸如此类物质，并且当利用其生长需要氨基酸和诸如此类的营养缺陷型变异体时，必需补充需要的营养。

作为无机盐，可以使用磷酸盐，镁盐，钙盐，铁盐，锰盐和诸如此类。

至于培养条件，可以在需氧条件下进行培养，温度为20到42℃，pH为4到8。可以连续培养10小时到4天以便在液体培养基中积累相当量的L-谷氨酸。

在完成培养后，通过已知方法可以收集培养基中积累的L-谷氨酸。例如，通过包括在除去细胞后浓缩培养基以便结晶产物，离子交换层析和诸如此类的方法可以分离L-谷氨酸。

参考下面的实施例将更具体地说明本发明。

(1)构建含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒

参考图1到图5将能够解释构建含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒的方法。

利用HindIII和SphI消化含有起源于大肠杆菌的gdhA基因的质粒

pBRGDH(日本未审专利申请公开号(KOKAI)7-203980(1995))，通过T4DNA聚合酶处理将两个末端平齐化。然后，纯化和收集含有gdhA基因的DNA片断。在另一方面，利用XbaI消化含有起源于大肠杆菌的gltA基因和ppc基因的质粒pMWCP(WO97/08294)，利用T4DNA聚合酶处理将两个末端平齐化。将这与含有上面纯化的含有gdhA基因的DNA片断混合，利用T4连接酶连接，得到质粒pMWCPG，该质粒对应于另外携带gdhA基因的pMWCP(附图1)。

纯化和回收利用HindIII和SalI消化pBRGDH得到的含有gdhA基因的DNA片断，并导入质粒pSTV29(从Takara Shuzo购买)的HindIII-SalI位点，从而得到质粒pSTVG(图2)。

在同一时间，将通过用NotI消化含有广谱宿主范围质粒RSF1010(日本未审专利申请公开号(KOKAI)8-047397(1996))的复制原点的质粒pVIC40，接着通过T4DNA聚合酶处理和PstI消化得到的产物，和通过利用EcoT141消化pBR322，接着T4DNA聚合酶处理和PstI消化得到的产物混合，并用T4连接酶连接以便得到含有RSF1010的复制原点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet(图3)。

然后，利用EcoRI和PstI消化pMWCPG，纯化和回收含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的DNA片断。同样，利用EcoRI和PstI消化RSF-Tet，纯化和回收含有RSF1010的复制原点的DNA片断。混合这些DNA片断，利用T4连接酶连接以便得到由携带gltA基因，ppc基因和gdhA基因的RSF-Tet组成的质粒RSFCPG(附图4)。在缺乏gltA基因，ppc基因或gdhA基因的大肠杆菌菌株的营养缺陷型的补充和每种酶活性的测量的基础上证实了得到的质粒RSFCPG表达gltA基因，ppc基因和gdhA基因，和pSTVG表达gdhA基因。

如下构建含有起源于乳发酵短杆菌的gltA基因的质粒。利用含有选定的SEQID NO：6和7表示的核苷酸序列的引物，和乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板进行PCR以便得到约3kb的gltA基因。其中SEQ ID NO：6和7是基于谷氨酸棒状杆菌的gltA基因的核苷酸序列(微生物学，140，1817-1828，1994)。将这一3kb的片断插入利用SmaI消化的质粒pHSG399(从Takara Shuzo购买)，以便得到质粒pHSGCB(图5)。然后，利用HindIII消化pHSGCB，将切出的约3kb的gltA基因片断插入利用HindIII消化的质粒pMW218(从Nippon基因购买)，以便得到质粒pMWCB(图5)。通过在成团肠杆菌AJ13355确定酶活性证实得到的质粒pMWCB表达gltA基因。

(2)在成团肠杆菌或液化沙雷伯氏菌中导入RSFCPG，pMWCB和pSTVG，和评估L-谷氨酸生产率

利用RSFCPG，pMWCB和pSTVG通过电穿孔转化成团肠杆菌ATCC12287，成团肠杆菌AJ13355和液化沙雷伯氏菌ATCC 14460(Miller J.H.，“细菌遗传学的简短方法，手册”，冷泉港实验室出版，美国，1992)以便得到展示四环素抗性的转化体。

将每种得到的转化体和亲本菌株接种到50毫升体积的大小的试管，在试管中含有5毫升培养基，培养基中含有40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升7水硫酸镁，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0.25克/升7水氯化钙，0.02克/升七水硫酸亚铁，0.02克/升四水硫酸锰，0.72毫克/升二水硫酸锌，0.64毫克/升5水硫酸铜，0.72毫克/升六水氯化钴，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水钼酸纳，2克/升酵母提取物，和30克/升碳酸钙，并且在37℃振摇培养，直到在培养基中含有的葡萄糖耗尽。但是，和亲本菌株AJ13355一样，对于AJ13355/pMWCB菌株和AJ13355/pSTVG菌株，在消耗了约10克/升的葡萄糖，即培养15小时，终止培养。因为它们的葡萄糖消耗速度是低的。在转化体的培养基中，加入25毫克/升的四环素。在完成培养后，测量培养基中积累的L-谷氨酸。结果表示在表1。

表1：L-谷氨酸的积累量

尽管成团肠杆菌ATCC12287，成团肠杆菌AJ13355和液化沙雷伯氏菌ATCC14460不积累L-谷氨酸，但通过导入RSFCPG扩增了CS，PEPC和GDH活性的菌株分别积累6.1克/升，3.3克/升，和2.8克/升L-谷氨酸。CS活性单独扩增的AJ13355菌株积累0.8克/升L-谷氨酸，GDH活性单独扩增的菌株也积累0.8克/升的L-谷氨酸。

(3)克隆成团肠杆菌AJ13355的αKGDH基因(下文中称为“sucAB”)

从成团肠杆菌AJ13355的染色体DNA通过选择补充缺乏αKGDH-E1亚单位基因的大肠杆菌菌株的乙酸非同化的DNA片断(下文中称为：“sucA”)克隆成团肠杆菌AJ13355的sucAB基因。

通过如常规使用的从大肠杆菌提取染色体DNA的同样方法分离成团肠杆菌AJ13355的染色体DNA(Seibutsu Kogaku Jikken-sho(生物工程实验教科书)，发酵和生物工程协会编辑，日本，97-98，Baifukan，1992)。用作载体的pTWV228(氨苄青霉素抗性)是Takara Shuzo的市售产品。

利用T4连接酶连接利用EcoT221消化的AJ13355的染色体DNA得到的产物和利用PstI消化的pTWV228得到的产物，利用它们转化缺乏sucA的大肠杆菌JRG465(Herbert J.等人，分子遗传学，1969，105，p182)。从如上所述得到的转化体选择在乙酸基本培养基上生长的菌株，将从它们提取的质粒命名为pTWVEK101。携带pTWVEK101的大肠杆菌JRG465恢复了乙酸非同化性以及琥珀酸或L-赖氨酸和L-甲硫氨酸的营养缺陷型的特征。这表明pTWVEK101含有成团肠杆菌的sucA基因。

图6显示了起源于成团肠杆菌的pTWVEK101D DNA片断的限制图谱。SEQ IDNO：1中显示了图6中的阴影部分的核苷酸测序的结果，在该序列中，发现了两个全长ORFs和被认为是ORF的部分序列的两个核苷酸序列。SEQ ID NO：2到5从5’末端开始显示了这些ORF和其部分序列编码的氨基酸序列。作为这些序列同源分析的结果，发现核苷酸序列已经确定的部分含有琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白质基因(sdhB)的3’部分序列，全长sucA和αKGDH-E2亚单位基因(sucB基因)，和琥珀酰CoA合成酶β亚单位基因(sucC基因)的5’部分序列。图7到9显示了从这些核苷酸序列推测的氨基酸序列与大肠杆菌的那些的比较(欧洲生物化学杂志，141，351-359(1984)，欧洲生物化学杂志，141，361-374(1984)，和生物化学，24，6245-6252(1985))。如这些结果显示，氨基酸序列展示了明显的高度同源性。同时发现如大肠杆菌，在成团肠杆菌染色体形成了sdhB-sucA-sucB-sucC簇(欧洲生物化学杂志，141，351-359(1984)，欧洲生物化学杂志，141，361-374(1984)，和生物化学，24，6245-6252(1985))。

(4)获得起源于成团肠杆菌AJ13355的αKGDH缺陷菌株

利用如上所述获得的成团肠杆菌的sucAB基因，通过同源重组获得成团肠杆菌的缺乏αKGDH的菌株。

首先，利用BglII消化pTWVEK101以便除去对应于约一半的sucA基因和全长的sucB基因的C末端区。在这一位点，插入了利用AccI从pHSG399(TakaraShuzo)切出的氯霉素抗性基因片断。利用AflII和SacI切出上面得到的SdhB-ΔsucAB：：Cmr-sucC区。将得到的片断通过电穿孔用于转化成团肠杆菌AJ13355菌株以便得到氯霉素抗性菌株，从而获得了缺乏sucAB基因的成团肠杆菌AJ13356菌株，在这一菌株中染色体上的sucAB基因用sucAB::Cmr替代了。

为了证实如上所述获得的AJ13356菌株缺乏αKGDH活性，通过Reed的方法确定它的酶活性(L.J.Reed和B.B.Mukherjee，酶学方法1969，13，p55-61)。结果，如表2所示，在AJ13356菌株中不能检测到αKGDH活性，从而证实该菌株缺乏需要的sucAB。

表2：αKGDH活性

(5)评估缺乏αKGDH的成团肠杆菌菌株的L-谷氨酸生产率

在含有20毫升培养基的500毫升体积烧瓶中接种AJ13355和AJ13356菌株，该培养基中含有40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升7水硫酸镁，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0.25克/升7水氯化钙，0.02克/升7水硫酸亚铁，0.02克/升四水硫酸锰，0.72毫克/升二水硫酸锌，0.64毫克/升7水硫酸铜，0.72毫克/升六水氯化钴，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水钼酸纳，2克/升酵母提取物，30克/升碳酸钙，200毫克/升L-赖氨酸单盐酸，200毫克/升L-甲硫氨酸和200毫克/升DL-α，ε-二氨基庚二酸(DAP)，在37℃振摇培养直到培养基中含有的葡萄糖耗尽。在完成培养后，测量在培养基中积累的L-谷氨酸和α-酮戊二酸(下文中简写为“αKG”)。表3显示了结果。

表3：L-谷氨酸和αKG的积累量

缺乏αKGDH活性的AJ13356菌株积累1.5克/升L-谷氨酸，同时积累了3.2克/升αKG。

(6)在缺乏αKGDH的成团肠杆菌菌株中导入RSFCPG和评估L-谷氨酸的生产率

利用RSFCPG转化AJ13356，将利用RSFCPG导入得到的菌株，AJ13356/RSFCPG接种到500毫升体积的烧瓶，该烧瓶含有20毫升培养基，该培养基中包括40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升7水硫酸镁，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0，25克/升7水氯化钙，0.02克/升7水硫酸亚铁，0.02克/升四水硫酸锰，0.72毫克/升二水硫酸锌，0.64毫克/升7水硫酸铜，0.72毫克/升六水氯化钴，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水钼酸纳，2克/升酵母提取物，25毫克/升四环素，30克/升碳酸钙，200毫克/升L-赖氨酸单盐酸，200毫克/升L-甲硫氨酸和200毫克/升DL-α，ε-DAP，并在37℃振摇培养直到在培养基中含有的葡萄糖耗尽。在完成培养后，测量在培养基中积累的L-谷氨酸和αKG。表4显示了结果。

表4：L-谷氨酸和αKG的积累量

在通过导入RSFCPG扩增CF，PEPC和GDH活性的菌株中，αKG的积累量减少了，L-谷氨酸的积累量进一步提高。

序列表

<110>Ajinomoto Co.，Inc.

<120>生产L-谷氨酸的细菌和生产L-谷氨酸的方法

<130>

<150>JP 10-69068

<151>1998-03-18

<150>JP 10-297129

<151>1998-10-19

<160>7

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>4556

<212>DNA

<213>成团肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(2)..(121)

<220>

<221>CDS

<222>(322)..(3129)

<220>

<221>CDS

<222>(3145)..(4368)

<220>

<221>CDS

<222>(4437)..(4556)

<400>1

t gca ttc agc gtt ttc cgc tgt cac agc atc atg aac tgt gta agt gtt 49

Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val

1 5 10 15

tgt cct aaa ggg cta aac ccg acg cgc gct atc ggc cac att aag tcg 97

Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser

20 25 30

atg ctg ctg caa cgc agc gcg tagttatacc accgggaacc tcaggttccc 148

Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala

35

ggtattttac ggaagcctct gtaaacgcgg tcccaaccac gtttacaaag gttcccttac 208

gggccgggcg cgcgctgcgc acagtgctcg tatcgctgaa ctcactacgg caaaccgcga 268

aagcggcaac aaatgaaacc tcaaaaaagc ataacattgc ttaagggatc aca atg 324

Met

1

cag aac agc gcg atg aag ccc tgg ctg gac tcc tcc tgg ctg gcc ggc 372

Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala Gly

5 10 15

gcg aat cag tct tac ata gag caa ctc tat gag gat ttc ctg acc gat 420

Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr Asp

20 25 30

cct gac tct gtg gat gca gtg tgg cgc tcg atg ttc caa cag tta cca 468

Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu Pro

35 40 45

ggc acg gga gtg aaa cct gag cag ttc cac tcc gca act cgc gaa tat 516

Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu Tyr

50 55 60 65

ttc cgt cgc ctg gcg aaa gac gca tct cgt tac acc tcc tca gtt acc 564

Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val Thr

70 75 80

gat ccg gca acc aac tcc aaa caa gtg aaa gtg ctg cag ctg att aac 612

Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile Asn

85 90 95

gcg ttt cgt ttc cgc gga cat cag gaa gca aat ctc gat ccg ctt ggc 660

Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu Gly

100 105 110

ctg tgg aaa cag gac cgc gtt gcc gat ctc gat cct gcc ttt cac gat 708

Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His Asp

115 120 125

ctg acc gac gcc gat ttt cag gaa agc ttt aac gta ggt tct ttt gcc 756

Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe Ala

130 135 140 145

att ggc aaa gaa acc atg aag ctg gcc gat ctg ttc gac gcg ctg aag 804

Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu Lys

150 155 160

cag acc tac tgt ggc tcg att ggt gca gag tat atg cac atc aat aac 852

Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn Asn

165 170 175

acc gaa gag aaa cgc tgg atc cag cag cgt atc gaa tcc ggt gcg agc 900

Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala Ser

180 185 190

cag acg tca ttc agt ggc gaa gag aaa aaa ggt ttc ctg aaa gag ctg 948

Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu Leu

195 200 205

acc gcg gca gaa ggg ctg gaa aaa tat ctg ggc gcg aaa ttc ccg ggt 996

Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly

210 215 220 225

gca aaa cgt ttc tcg ctg gaa ggc ggt gat gcg ctg gtg ccg atg ctg 1044

Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met Leu

230 235 240

cgc gag atg att cgt cat gcg ggc aaa agc ggc aca cgt gaa gtg gta 1092

Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val Val

245 250 255

ctg ggg atg gcg cac cgt ggc cgt ctt aac gta ctg att aac gta ctg 1140

Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val Leu

260 265 270

ggt aaa aag cca cag gat ctg ttc gac gaa ttc tcc ggt aaa cac aaa 1188

Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His Lys

275 280 285

gag cat ctg ggc acc ggt gat gtg aag tat cac atg ggc ttc tct tcg 1236

Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser

290 295 300 305

gat att gaa acc gaa ggt ggt ctg gtg cat ctg gcg ctg gcg ttt aac 1284

Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn

310 315 320

ccg tct cac ctg gaa att gtc agc ccg gtg gtc atg gga tcg gta cgt 1332

Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val Arg

325 330 335

gca cgt ctc gat cgt ctg gcc gaa ccg gtc agc aat aaa gtg ttg cct 1380

Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu Pro

340 345 350

atc acc att cac ggt gat gcg gcg gtg att ggt cag ggc gtg gtt cag 1428

Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val Gln

355 360 365

gaa acc ctg aac atg tct cag gcg cgc ggc tac gaa gtg ggc ggc acg 1476

Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr

370 375 380 385

gta cgt atc gtc att aac aac cag gtt ggt ttt acc acc tcc aac ccg 1524

Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro

390 395 400

aaa gat gcg cgt tca acc ccg tac tgt act gac atc ggc aag atg gtg 1572

Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val

405 410 415

ctg gca ccg att ttc cac gtc aat gct gac gat ccg gaa gcg gtg gcc 1620

Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala

420 425 430

ttt gtt acc cgc ctg gcg ctg gac tat cgc aac acc ttc aaa cgc gat 1668

Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp

435 440 445

gtg ttt atc gat ctg gtg tgc tat cgc cgt cat ggt cac aac gag gcg 1716

Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala

450 455 460 465

gat gag cca agt gct acc cag ccg ttg atg tac cag aaa atc aaa aag 1764

Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys

470 475 480

cat ccg acg ccg cgt aaa att tac gcc gat cgt ctg gaa ggc gaa ggt 1812

His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu Gly

485 490 495

gtc gcg tcg cag gaa gat gcc acc gag atg gtg aac ctg tac cgc gat 1860

Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp

500 505 510

gcg ctc gat gcg ggc gaa tgc gtg gtg ccg gaa tgg cgt ccg atg agc 1908

Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met Ser

515 520 525

ctg cac tcc ttc acg tgg tcg cct tat ctg aac cac gaa tgg gat gag 1956

Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu

530 535 540 545

cct tat ccg gca cag gtt gac atg aaa cgc ctg aag gaa ctg gca ttg 2004

Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu

550 555 560

cgt atc agc cag gtc cct gag cag att gaa gtg cag tcg cgc gtg gcc 2052

Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val Ala

565 570 575

aag atc tat aac gat cgc aag ctg atg gcc gaa ggc gag aaa gcg ttc 2100

Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala Phe

580 585 590

gac tgg ggc ggt gcc gag aat ctg gcg tac gcc acg ctg gtg gat gaa 2148

Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu

595 600 605

ggt att ccg gtt cgc ctc tcg ggt gaa gac tcc ggt cgt gga acc ttc 2196

Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe

610 615 620 625

ttc cat cgc cac gcg gtc gtg cac aac cag gct aac ggt tca acc tat 2244

Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr Tyr

630 635 640

acg ccg ctg cac cat att cat aac agc cag ggc gag ttc aaa gtc tgg 2292

Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val Trp

645 650 655

gat tcg gtg ctg tct gaa gaa gcg gtg ctg gcg ttt gaa tac ggt tac 2340

Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr

660 665 670

gcc acg gct gag ccg cgc gtg ctg acc atc tgg gaa gcg cag ttt ggt 2388

Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly

675 680 685

gac ttt gcc aac ggt gct cag gtg gtg att gac cag ttc atc agc tct 2436

Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser

690 695 700 705

ggc gaa cag aag tgg ggc cgt atg tgt ggc ctg gtg atg ttg ctg ccg 2484

Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro

710 715 720

cat ggc tac gaa ggt cag gga ccg gaa cac tcc tct gcc cgt ctg gaa 2532

His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu

725 730 735

cgc tat ctg caa ctt tgc gcc gag cag aac atg cag gtt tgc gtc ccg 2580

Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro

740 745 750

tcg acg ccg gct cag gtg tat cac atg ctg cgc cgt cag gcg ctg cgc 2628

Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg

755 760 765

ggg atg cgc cgt ccg ctg gtg gtg atg tcg ccg aag tcg ctg tta cgc 2676

Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg

770 775 780 785

cat cca ctg gcg atc tcg tcg ctg gat gaa ctg gca aac ggc agt ttc 2724

His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser Phe

790 795 800

cag ccg gcc att ggt gag atc gac gat ctg gat ccg cag ggc gtg aaa 2772

Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val Lys

805 810 815

cgc gtc gtg ctg tgc tcc ggt aag gtt tac tac gat ctg ctg gaa cag 2820

Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln

820 825 830

cgt cgt aaa gac gag aaa acc gat gtt gcc atc gtg cgc atc gaa cag 2868

Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln

835 840 845

ctt tac ccg ttc ccg cat cag gcg gta cag gaa gca ttg aaa gcc tat 2916

Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala Tyr

850 855 860 865

tct cac gta cag gac ttt gtc tgg tgc cag gaa gag cct ctg aac cag 2964

Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn Gln

870 875 880

ggc gcc tgg tac tgt agc cag cat cat ttc cgt gat gtc gtg ccg ttt 3012

Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro Phe

885 890 895

ggt gcc acc ctg cgt tat gca ggt cgc ccg gca tcg gct tct ccg gcc 3060

Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala

900 905 910

gtg ggt tat atg tcc gta cac caa caa cag cag caa gac ctg gtt aat 3108

Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val Asn

915 920 925

gac gca ctg aac gtc aat taattaaaag gaaagata atg agt agc gta gat 3159

Asp Ala Leu Asn Val Asn Met Ser Ser Val Asp

930 935 1 5

att ctc gtt ccc gac ctg cct gaa tcg gtt gca gat gcc aca gta gca 3207

Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala Asp Ala Thr Val Ala

10 15 20

acc tgg cac aag aaa cca ggc gat gca gtc agc cgc gat gaa gtc atc 3255

Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser Arg Asp Glu Val Ile

25 30 35

gtc gaa att gaa act gac aaa gtc gtg ctg gaa gtg ccg gca tct gcc 3303

Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu Val Pro Ala Ser Ala

40 45 50

gat ggc gtg ctg gaa gcc gtg ctg gaa gac gaa ggg gca acc gtt acg 3351

Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu Gly Ala Thr Val Thr

55 60 65

tcc cgc cag atc ctg ggt cgc ctg aaa gaa ggc aac agt gcg ggt aaa 3399

Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly Asn Ser Ala Gly Lys

70 75 80 85

gaa agc agt gcc aaa gcg gaa agc aat gac acc acg cca gcc cag cgt 3447

Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr Thr Pro Ala Gln Arg

90 95 100

cag aca gcg tcg ctt gaa gaa gag agc agc gat gcg ctc agc ccg gcg 3495

Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp Ala Leu Ser Pro Ala

105 110 115

atc cgt cgc ctg att gcg gag cat aat ctt gac gct gcg cag atc aaa 3543

Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp Ala Ala Gln Ile Lys

120 125 130

ggc acc ggc gta ggc gga cgt tta acg cgt gaa gac gtt gaa aaa cat 3591

Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu Asp Val Glu Lys His

135 140 145

ctg gcg aac aaa ccg cag gct gag aaa gcc gcc gcg cca gcg gcg ggt 3639

Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly

150 155 160 165

gca gca acg gct cag cag cct gtt gcc aac cgc agc gaa aaa cgt gtt 3687

Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg Ser Glu Lys Arg Val

170 175 180

ccg atg acg cgt tta cgt aag cgc gtc gcg gag cgt ctg ctg gaa gcc 3735

Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu Arg Leu Leu Glu Ala

185 190 195

aag aac agc acc gcc atg ttg acg acc ttc aac gaa atc aac atg aag 3783

Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu Ile Asn Met Lys

200 205 210

ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggc gat gcg ttc gag aag cgt 3831

Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Lys Arg

215 220 225

cac ggt gtg cgt ctg ggc ttt atg tct ttc tac atc aag gcc gtg gtc 3879

His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr Ile Lys Ala Val Val

230 235 240 245

gaa gcg ctg aag cgt tat cca gaa gtc aac gcc tct atc gat ggc gaa 3927

Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser Ile Asp Gly Glu

250 255 260

gac gtg gtg tac cac aac tat ttc gat gtg agt att gcc gtc tct acg 3975

Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser Ile Ala Val Ser Thr

265 270 275

cca cgc gga ctg gtg acg cct gtc ctg cgt gac gtt gat gcg ctg agc 4023

Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Ala Leu Ser

280 285 290

atg gct gac atc gag aag aaa att aaa gaa ctg gca gtg aaa ggc cgt 4071

Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val Lys Gly Arg

295 300 305

gac ggc aag ctg acg gtt gac gat ctg acg ggc ggt aac ttt acc atc 4119

Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly Gly Asn Phe Thr Ile

310 315 320 325

acc aac ggt ggt gtg ttc ggt tcg ctg atg tct acg cca atc atc aac 4167

Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro Ile Ile Asn

330 335 340

ccg cca cag agc gcg att ctg ggc atg cac gcc att aaa gat cgt cct 4215

Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ale Ile Lys Asp Arg Pro

345 350 355

atg gcg gtc aat ggt cag gtt gtg atc ctg cca atg atg tac ctg gct 4263

Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro Met Met Tyr Leu Ala

360 365 370

ctc tcc tac gat cac cgt tta atc gat ggt cgt gaa tct gtc ggc tat 4311

Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ser Val Gly Tyr

375 380 385

ctg gtc gcg gtg aaa gag atg ctg gaa gat ccg gcg cgt ctg ctg ctg 4359

Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro Ala Arg Leu Leu Leu

390 395 400 405

gat gtc tgattcatca ctgggcacgc gttgcgtgcc caatctcaat actcttttca 4415

Asp Val

gatctgaatg gatagaacat c atg aac tta cac gaa tac cag gct aaa cag 4466

Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln

1 5 10

ctg ttt gca cgg tat ggc atg cca gca ccg acc ggc tac gcc tgt act 4514

Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr

15 20 25

aca cca cgt gaa gca gaa gaa gcg gca tcg aaa atc ggt gca 4556

Thr Pro Arg Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala

30 35 40

<210>2

<211>39

<212>PRT

<213>成团肠杆菌

<400>2

Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val

1 5 10 15

Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser

20 25 30

Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala

35

<210>3

<211>935

<212>PRT

<213>成团肠杆菌

<400>3

Met Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr

20 25 30

Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu

35 40 45

Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu

50 55 60

Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val

65 70 75 80

Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile

85 90 95

Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu

100 105 110

Gly Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His

115 120 125

Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe

130 135 140

Ala Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu

145 150 155 160

Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn

165 170 175

Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala

180 185 190

Ser Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu

195 200 205

Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro

210 215 220

Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met

225 230 235 240

Leu Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val

245 250 255

Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val

260 265 270

Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His

275 280 285

Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser

290 295 300

Ser Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe

305 310 315 320

Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val

325 330 335

Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu

340 345 350

Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val

355 360 365

Gln Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly

370 375 380

Thr Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn

385 390 395 400

Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met

405 410 415

Val Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val

420 425 430

Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg

435 440 445

Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu

450 455 460

Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys

465 470 475 480

Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu

485 490 495

Gly Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg

500 505 510

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515 520 525

Ser Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp

530 535 540

Glu Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala

545 550 555 560

Leu Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val

565 570 575

Ala Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala

580 585 590

Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp

595 600 605

Glu Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr

610 615 620

Phe Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr

625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe

675 680 685

Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser

690 695 700

Ser Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu

705 710 715 720

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725 730 735

Glu Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val

740 745 750

Pro Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu

755 760 765

Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu

770 775 780

Arg His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser

785 790 795 800

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805 810 815

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865 870 875 880

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885 890 895

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<210>4

<211>407

<212>PRT

<213>成团肠杆菌

<400>4

Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala

1 5 10 15

Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser

20 25 30

Arg Asp Glu Val Ile Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu

35 40 45

Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu

50 55 60

Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly

65 70 75 80

Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr

85 90 95

Thr Pro Ala Gln Arg Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp

100 105 110

Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp

115 120 125

Ala Ala Gln Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu

130 135 140

Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala

145 150 155 160

Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu

180 185 190

Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Ile Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala

245 250 255

Ser Ile Asp Gly Glu Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly

305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Glu Ser Val Gly Tyr Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro

385 390 395 400

Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val

405

<210>5

<211>40

<212>PRT

<213>成团肠杆菌

<400>5

Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln Leu Phe Ala Arg Tyr Gly

1 5 10 15

Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu

20 25 30

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35 40

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>6

gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>7

aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt

Claims

1.生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养一种微生物，以便在培养基中产生和积累L-谷氨酸，并从培养基中收集L-谷氨酸，其中该微生物为成团肠杆菌并且具有至少一个以下特征：

(a)该微生物中选自柠檬酸合成酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和谷氨酸脱氢酶的一种酶的活性增加；和

(b)该微生物中α酮戊二酸脱氢酶的活性降低或缺乏。

2.权利要求1的方法，其中该微生物具有至少一个以下特征：

(a)该微生物中柠檬酸合成酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和谷氨酸脱氢酶三者的活性均增加；和

(b)该微生物中α酮戊二酸脱氢酶的活性降低或缺乏。