PL196781B1 - Mikroorganizm wytwarzający kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego - Google Patents

Mikroorganizm wytwarzający kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego

Info

Publication number
PL196781B1
PL196781B1 PL332072A PL33207299A PL196781B1 PL 196781 B1 PL196781 B1 PL 196781B1 PL 332072 A PL332072 A PL 332072A PL 33207299 A PL33207299 A PL 33207299A PL 196781 B1 PL196781 B1 PL 196781B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ala
leu
val
gly
glu
Prior art date
Application number
PL332072A
Other languages
English (en)
Other versions
PL332072A1 (en
Inventor
Hiroshi Izui
Eiji Ono
Kazuhiko Matsui
Mika Moriya
Hisao Ito
Yoshihiko Hara
Original Assignee
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Kk
Publication of PL332072A1 publication Critical patent/PL332072A1/xx
Publication of PL196781B1 publication Critical patent/PL196781B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/425—Serratia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/88—Serratia

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1. Mikroorganizm nale zacy do rodzaju Enterobacter wykazuj acy zdolno sc do wytwarzania kwa- su L-glutaminowego i posiadaj acy co najmniej jedn a z nast epuj acych cech: (c) mikroorganizm wykazuje wzrost aktywno sci enzymu wybranego z grupy obejmuj acej synta- z e cytrynianow a, karboksylaz e fosfoenolopirogronianow a i dehydrogenaz e glutaminianow a; i (d) mikroorganizm wykazuje zmniejszon a aktywnosc lub brak aktywno sci dehydrogenazy kwa- su a-ketoglutarowego. PL PL PL PL PL

Description

(22) Data zgłoszenia: 18.03.1999 (19) PL (11) 196781 (13) B1 (51) Int.Cl.
C12N 1/21 (2006.01) C12P 13/14 (2006.01) C12N 15/53 (2006.01) C12N 15/60 (2006.01) C12R 1/01 (2006.01)
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej
(54) Mikroorganizm wytwarzający kwas L-glutaminowy (54) i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego
(73) Uprawniony z patentu: AJINOMOTO CO., INC.,Tokio,JP
(30) Pierwszeństwo:
18.03.1998,JP,10-69068 (72) Twórca(y) wynalazku:
19.10.1998,JP,10-297129 Hiroshi Izui,Kanagawa-ken,JP Eiji Ono,Kanagawa-ken,JP Kazuhiko Matsui,Kanagawa-ken,JP
(43) Zgłoszenie ogłoszono: Mika Moriya,Kanagawa-ken,JP
27.09.1999 BUP 20/99 Hisao Ito,Kanagawa-ken,JP Yoshihiko Hara,Kanagawa-ken,JP
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.01.2008 WUP 01/08 (74) Pełnomocnik: Jarosław Kulikowski, KULIKOWSKA & KULIKOWSKI, Biuro Znaków Towarowych i Patentów
(57) 1. Mikroorganizm należący do rodzaju Enterobacter wykazujący zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego i posiadający co najmniej jedną z następujących cech:
(c) mikroorganizm wykazuje wzrost aktywności enzymu wybranego z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową; i (d) mikroorganizm wykazuje zmniejszoną aktywność lub brak aktywności dehydrogenazy kwasu α-ketoglutarowego.
PL 196 781 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest mikroorganizm wykazujący zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego oraz sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego z zastosowaniem fermentacji przy wykorzystaniu wymienionego mikroorganizmu.
Kwas L-glutaminowy jest ważnym aminokwasem stanowiącym składnik pożywienia, farmaceutyków i znajdującym inne zastosowania.
Kwas L-glutaminowy wytwarzany jest zwyczajowo sposobami fermentacyjnymi z wykorzystaniem tak zwanych bakterii podobnych do bakterii maczugowatych wytwarzających L-glutaminian i należących zasadniczo do rodzaju Brevibacterium, Corynebacterium i Microbacterium lub ich odmiany („Amino Acids Fermentation”, Gakkai Shuppan Ctr, str. 195-215, 1986). Kwas L-glutaminowy można wytwarzać sposobem fermentacyjnym z wykorzystaniem innych szczepów bakteryjnych, i tak znane są sposoby wykorzystujące mikroorganizmy należące do rodzaju Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida i podobne (Patent USA nr 3,563,857), sposoby wykorzystujące mikroorganizmy z rodzaju Bacillus, Pseudomonas, Serratia i podobne lub Aerobacter aerogenes (obecnie znany pod nazwą Enterobacter aerogenes) (Japońska Publikacja Patentowa (KOKOKU) nr 32-9393 (1957), sposoby wykorzystujące szczepy Escherichia coli (Japońskie Zgłoszenie Patentowe (KOKAI) nr. 5-244970 (1993) i podobne.
Jakkolwiek produktywność L-glutaminianu zwiększono poprzez odpowiednie hodowanie wspomnianych wyżej mikroorganizmów lub ulepszenie sposobów wytwarzania, nadal istnieje potrzeba rozwoju mniej kosztownych i bardziej wydajnych sposobów wytwarzania kwasu L-glutaminowego w celu sprostania oczekiwanemu, znacznemu zwię kszeniu zapotrzebowania na wspomniany aminokwas.
Celem wynalazku jest znalezienie nowej bakterii wytwarzającej kwas L-glutaminowy, posiadającej wysoką produktywność kwasu L-glutaminowego, a zatem wypracowanie bardziej tanich i bardziej efektywnych sposobów wytwarzania L-glutaminianu.
W celu osią gnię cia przedstawionego powyż ej celu poszukiwano intensywnie oraz badano mikroorganizmy obdarzone zdolnością do wytwarzania kwasu L-glutaminowego, inne niż uprzednio znane. W wyniku poszukiwań znaleziono pewne szczepy pochodzące z mikroorganizmów należących do rodzaju Enterobacter, wykazujące wysoką zdolność do wytwarzania L-glutaminianu.
Mikroorganizm według wynalazku należy do rodzaju Enterobacter i wykazuje zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego, oraz posiada co najmniej jedną z następujących cech:
(a) mikroorganizm wykazuje wzrost aktywności enzymu wybranego z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową; i (b) mikroorganizm wykazuje zmniejszoną aktywność lub brak aktywności dehydrogenazy kwasu α-ketoglutarowego.
Korzystnie, mikroorganizm stanowi Enterobacter agglomerans.
W korzystnym wykonaniu, mikroorganizm wykazuje wzrost aktywności wszystkich enzymów z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową, przy czym korzystnie mikroorganizm stanowi Enterobacter agglomerans.
Sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego według wynalazku charakteryzuje się tym, że w płynnej pożywce hodowlanej hoduje się mikroorganizm należący do rodzaju Enterobacter wykazujący zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego i wykazujący co najmniej jedną z następujących cech (a) mikroorganizm wykazuje wzrost aktywności enzymu wybranego z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową, oraz (b) zmniejszoną aktywność lub brak aktywności dehydrogenazy kwasu α-ketoglutarowego, wytwarzając i gromadząc kwas L-glutaminowy w pożywce i następnie zbiera się kwas L-glutaminowy z pożywki hodowlanej.
Korzystnie, jako mikroorganizm stosuje się Enterobacter agglomerans. W korzystnym sposobie według wynalazku mikroorganizm wykazuje wzrost aktywności wszystkich enzymów z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową, przy czym korzystnie jako mikroorganizm stosuje się Enterobacter agglomerans.
Ponieważ mikroorganizm według wynalazku posiada wysoką zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego, uznano że możliwe jest dalsze zwiększenie zdolności wytwórczej mikroorganizmu przez zastosowanie technik hodowlanych opisanych wcześniej dla bakterii maczugowatych wytwarzaPL 196 781 B1 jących L-glutaminian i podobne, w celu zwiększenia wydajności i ekonomiczności sposobu wytwarzania L-glutaminianu poprzez odpowiedni wybór pożywki hodowlanej i podobne.
Przedmiot wynalazku w korzystnym przykładzie wykonania przedstawiony został na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia tworzenie plazmidu pMWCPG z genem gltA, genem ppc i genem gdhA, fig. 2 przedstawia tworzenie plazmidu pSTVG z genem gdhA, fig. 3 przedstawia tworzenie plazmidu RSF-Tet posiadającego miejsce startu replikacji z plazmidu o szerokim zakresie gospodarza RSF1010 i gen opornoś ci na tetracyklinę , fig. 4 przedstawia konstruowanie plazmidu RSFCPG posiadają cego miejsce startu replikacji z plazmidu o szerokim zakresie gospodarza RSF1010 i gen oporności na tetracyklinę, gen gltA, gen ppc i gen gdhA, fig. 5 przedstawia tworzenie plazmidu pMWCB posiadającego gen gltA, fig. 6 obrazuje mapę restrykcyjną fragmentu DNA plazmidu pTWVEK101 pochodzącego z Enterobacter agglomerans, fig. 7 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowej wyprowadzonej z sekwencji nukleotydowej genu sucA pochodzącego z Enterobacter agglomerans z odpowiednim genem pochodzącym z Escherichia coli (W części górnej przedstawiona sekwencja pochodząca z Enterobacter agglomerans; w części dolnej z Escherichia coli (w dalszej części tekstu tak samo)), fig. 8 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowej wyprowadzonej z sekwencji nukleotydowej genu sucB pochodzącego z Enterobacter agglomerans z odpowiednim genem pochodzącym z Escherichia coli, fig. 9 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowej wyprowadzonej z sekwencji nukleotydowej genu sucC pochodzącego z Enterobacter agglomerans z odpowiednim genem pochodzącym z Escherichia coli, a fig. 10 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowej wyprowadzonej z sekwencji nukleotydowej genu sdhB pochodzącego z Enterobacter agglomerans z odpowiednim genem pochodzącym z Escherichia coli.
Mikroorganizm według wynalazku jest mikroorganizmem należącym do rodzaju Enterobacter, i wykazuje co najmniej jedną z wymienionych poniżej właściwości:
(a) mikroorganizm wykazuje wzrost aktywności enzymu wybranego z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową; i (b) mikroorganizm wykazuje zmniejszoną aktywność lub brak aktywności dehydrogenazy kwasu α-ketoglutarowego.
Mikroorganizm taki można otrzymać przez użycie mikroorganizmu wyjściowego, należącego do rodzaju
Enterobacter i nadanie mikroorganizmowi właściwości podanych wyżej (a) i/lub (b). Przykłady mikroorganizmów należących do rodzaju Enterobacter, które można zastosować jako szczep wyjściowy zestawione są poniżej:
Enterobacter agglomerans
Enterobacter aerogenus
Enterobacter amnigenus
Enterobacter asuburiae
Enterobacter cloacae
Enterobacter dissolvens
Enterobacter gerogoviae
Enterobacter hormaechei
Enterobacter intermedius
Enterobacter nimipressuralis
Enterobacter sakazakii
Enterobacter taylorae
Korzystniej wymienić można następujące szczepy bakterii:
Enterobacter agglomerans ATCC 12287
Enterobacter agglomerans AJ 13355.
Enterobacter agglomerans AJ 13355 przekazany został do depozytu w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 19 lutego 1998 i otrzymał numer FERM P-16644, a następnie przekazany został do depozytu międzynarodowego 11,01,1999 zgodnie z Układem Budapesztańskim, i uzyskał numer FERM BP-12287.
Enterobacter agglomerans AJ 13355 jest szczepem wyizolowanym z gleby w Iwata-shi, Shizouka, Japonia.
Fizjologiczne właściwości AJ 13355 są następujące:
(1) Klasyfikacja wg. metody Grama: bakteria Gram ujemna
PL 196 781 B1 (2) Zależ ność od tlenu: fakultatywny beztlenowiec (3) Katalaza: brak (4) Oksydaza: obecna (5) Redukcja azotanu: brak (6) Reakcja Vogesa i Proskauera: tak (7) Test czerwieni metylowej: ujemny (8) Ureaza: brak (9) Wytwarzanie indolu: tak (10) Ruchliwość: tak (11) Wytwarzanie siarkowodoru w podłożu TSI: częściowa aktywność (12) β-Galaktozydaza: obecna (13) Przyswajanie cukru:
arabinoza: tak sacharoza: tak laktoza: tak ksyloza: tak sorbitol: tak inozytol: tak trehaloza: tak maltoza: tak melibioza: tak adonitol: nie rafinoza: tak salicyna: nie melibioza: tak (14) Przyswajanie glicerozy: tak (15) Przyswajanie kwasów organicznych:
kwas cytrynowy: tak kwas winowy: nie kwas glukonowy: tak kwas octowy: tak kwas malonowy: nie (16) Dehydrataza argininowa: brak (17) Dekarboksylaza ornitynowa: brak (18) Dekarboksylaza lizynowa: brak (19) Deaminaza fenyloalaninowa: brak (20) Tworzenie barwnika: barwnik żółty (21) Upłynnianie żelatyny: tak (22) Wzrost przy wartości pH: nie najlepszy przy pH 4, dobry w zakresie od pH 4,5 do 7 (23) Wzrost w temperaturze: dobry przy 25°C, dobry przy 30°C, dobry przy 37°C, wzrost możliwy przy 42°C, brak wzrostu w 45°C
Na podstawie podanych właściwości bakteriologicznych określono, że AJ13355 to Enterobacter agglomerans.
W przykładach opisanych poniżej Enterobacter agglomerans ATCC12287 i Enterobacter agglomerans AJ13355 wykorzystano jako szczepy wyjściowe do uzyskania szczepów o zwiększonej aktywności enzymu katalizującego reakcję biosyntezy kwasu L-glutaminowego, lub szczepów które cechuje zmniejszenie lub brak aktywności enzymu katalizującego reakcję odgałęziającą się od szlaku biosyntezy L-glutaminianu i prowadzącą do wytwarzania związków innych niż kwas L-glutaminowy. Metabolizm cukrów w komórce bakterii należącej do rodzaju Enterobacter dokonuje się poprzez szlak Embdena i Meyerhofa, i wytwarzany w ten sposób pirogronian utleniany jest w cyklu kwasów trójkarboksylowych w warunkach tlenowych. Kwas L-glutaminowy syntezowany jest z kwasu α-ketoglutarowego, który jest związkiem pośrednim cyklu kwasów trójkarboksylowych w reakcji katalizowanej przez GDH lub syntetazę glutaminową/syntazę glutaminianową. Tak więc mikroorganizmy te posiadają wspólny szlak biosyntezy kwasu L-glutaminowego, wynalazek dotyczy więc w równym stopniu mikroorganizmów należących do rodzaju Enterobacter. Mikroorganizmy należące do rodzaju EnteroPL 196 781 B1 bacter i należące do innych szczepów i gatunków niż podane powyżej również należą do zakresu wynalazku.
Mikroorganizm według wynalazku jest mikroorganizmem należącym do rodzaju Enterobacter i posiadają cy zdolność do wytwarzania L-glutaminianu. Wyraż enie „posiadają cy zdolność do wytwarzania L-glutaminianu” oznacza tu zdolność do gromadzenia L-glutaminianu w pożywce podczas hodowli. Według wynalazku zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego nadana jest poprzez posiadanie jednej lub dwu następujących cech:
(a) mikroorganizm wykazuje wzrost aktywności enzymu wybranego z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową; i (b) mikroorganizm wykazuje zmniejszoną aktywność lub brak aktywności dehydrogenazy kwasu α-ketoglutarowego.
Jako przykłady enzymów katalizujących reakcję biosyntezy L-glutaminianu w mikroorganizmach z rodzaju Enterobacter można wymienić GDH, syntetazę glutaminową, syntazę glutaminianową, dehydrogenazę izocytrynianową, hydratazę kwasu akonitynowego, CS, PEPC, dehydratazę pirogronianową, kinazę pirogronianową, enolazę, fosfogliceromutazę, kinazę fosforoglicerynbianową, dehydrogenazę gliceroaldehydo-3-fosforanową, izomerazę trozofosforanową, aldolazę fruktozo bisfosforanową, fosfofruktokinazę, izomerazę glukozofosforanową i podobne enzymy. Pomiędzy tymi korzystne są jeden, dwa lub trzy enzymy: syntaza cytrynianowa CS, karboksylaza fosfoenolopirogronianowa PEPC i dehydrogenaza glutaminianowa GDH. Dla konkretnego mikroorganizmu według wynalazku jest ponadto korzystne by aktywności wszystkich trzech rodzajów enzymów, CS, PEPC i GDH, były zwiększone. To, czy mikroorganizm charakteryzuje zwiększona aktywność docelowego enzymu oraz stopień zwiększenia aktywności można określić mierząc aktywność enzymu w ekstrakcie komórek bakteryjnych lub w oczyszczonej frakcji, i przyrównując do odpowiedniej aktywności szczepu dzikiego lub szczepu rodzicielskiego.
Mikroorganizm według wynalazku, należący do rodzaju Enterobacter i wykazujący zwiększoną aktywność enzymu katalizującego reakcję biosyntezy kwasu L-glutaminowego, można uzyskać, na przykład, jako odmianę dowolnego z mikroorganizmów wymienionych powyżej, traktowanego jako szczep wyjściowy, wprowadzając mutację do genu kodującego enzym lub poprzez rekombinację genetyczną.
W celu zwiększenia aktywności CS, PEPC lub GDH na przykład można sklonować gen kodujący CS, PEPC lub GDH w użytecznym plazmidzie, a następnie wspomniany powyżej szczep wyjściowy można stransformować uzyskanym plazmidem. Manipulacja ta może zwiększyć liczbę kopii każdego z genów kodujących CS, PEPC i GDH (określanych dalej odpowiednio jako „gen gltA”, „gen ppc” i „gen gdhA”) tak, że w rezultacie prowadzi to do podniesienia aktywności CS, PEPC i GDH.
Jeden lub dwa lub trzy rodzaje genów wybrane z genu gltA, genu ppc i genu gdhA w dowolnej kombinacji wprowadzono do wyjściowych szczepów wspomnianych powyżej. Gdy wprowadzone są dwa lub trzy rodzaje wspomnianych genów, albo dwa lub trzy rodzaje genów sklonowane są w jednym rodzaju plazmidu i wprowadzone do komórki gospodarza, albo są sklonowane oddzielnie w dwu lub trzech rodzajach plazmidów które mogą współistnieć w jednym gospodarzu, i są następnie wprowadzone do komórki gospodarza.
Rodzaj plazmidu nie jest w żaden szczególny sposób ograniczony, o ile jest zdolny do autonomicznej replikacji w mikroorganizmie należącym do rodzaju Enterobacter. Przykłady plazmidu obejmują na przykład pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 i analogiczne. Można wykorzystać w tym celu również inne niż plazmidowe wektory DNA na przykład DNA wektory fagowe.
Transformację można prowadzić na przykład sposobem opisanym przez DM Morrisona (Methods Enzymol 68, 326 (1979)), metodą zwiększania przepuszczalności komórki przyjmującej DNA poprzez działanie CaCl2 (M Handel, A Higa J Mol Biol 53, 159 (1970)) lub metodami pokrewnymi.
Aktywności CS, PEPC i GDH można również zwiększyć stosując wielokrotne kopie genu gltA, genu ppc i/lub genu gdh obecne w chromosomalnym DNA szczepu wyjściowego. W celu wprowadzenia wielu kopii genu gltA, genu ppc i/lub gdhA do chromosomalnego DNA mikroorganizmu należącego do rodzaju Enterobacter, można wykorzystać sekwencje obecne w chromosomalnym DNA w wielu kopiach, takich jak powtarzalny DNA oraz odwrócone sekwencje powtarzalne (IR) obecne na końcach transpozonów. Alternatywnie wielokrotne kopie genów można wprowadzać do chromosomalnego DNA z wykorzystaniem przeniesienia transpozonów niosących gen gltA, gen ppc lub gen gdhA. Wy6
PL 196 781 B1 mienione techniki również zwiększają liczbę kopii genu gltA, genu ppc i genu gdh w komórkach transformanta, prowadząc do wzrostu aktywności CS, PEPC i GDH.
Jako źródło genu gltA, genu ppc i genu gdhA do zwiększania liczby kopii można wykorzystać dowolne organizmy, o ile posiadają one aktywność CS, PEPC i GDH. Korzystnymi organizmami są bakterie (Prokaryota) takie, jak bakterie należące do rodzaju Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium i Bacillus. Jako szczególny przykład wymienić można Eschrichia coli. Gen gltA, gen ppc i gen gdhA można uzyskać z chromosomalnego DNA mikroorganizmów takich, jak podano wyżej.
Gen gltA, gen ppc i gen gdhA można uzyskać z chromosomalnego DNA dowolnego z mikroorganizmów, jak podano wyżej, izolując fragmenty DNA, które w teście komplementacji znoszą auksotrofię szczepów pozbawionych aktywności CS, PEPC lub GDH. Alternatywnie, ponieważ znana jest sekwencja nukleotydowa wymienionych genów należących do bakterii z rodzaju Escherichia lub Corynebacterium (Biochemistry 22, 5243-49, 1983; J Biochem 95, 909-16, 1984; Gene 27, 193-9, 1984; Microbiol 140, 1817-28, 1994; Mol Gen Genet 218, 330-39, 1989; Mol Microbiol 6, 317-26, 1992) wspomniane geny można uzyskać techniką PCR stosując startery zsyntezowane w oparciu o podane sekwencje nukleotydowe oraz chromosomalny DNA jako matrycę.
Aktywność CS, PEPC lub GDH można również zwiększyć sposobami innymi niż wspomniana wyżej amplifikacja genu, poprzez zwiększanie ekspresji genu gltA, genu ppc lub genu gdhA. Na przykład ekspresja ulega zwiększeniu poprzez zastąpienie promotora genu gltA, genu ppc lub genu gdhA innym, silniejszym promotorem. Przykłady takich silnych promotorów obejmują na przykład promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR i PL faga lambda i podobne. Gen gltA, gen ppc lub gen gdhA, których promotor zastąpiono, klonowane są następnie w plazmidzie i wprowadzane do mikroorganizmu gospodarza lub wprowadzane do chromosomalnego DNA mikroorganizmu gospodarza z wykorzystaniem powtarzalnego DNA, elementów IR, transpozonów i podobnych sposobów.
Aktywność CS PEPC lub GDH można również zwiększyć zastępując promotor genu gltA, genu ppc lub genu gdhA w chromosomie silniejszym promotorem (patrz WO87/03006 i Japońskie Zgłoszenie Patentowe (KOKAI) nr. 61-268183 (1986), lub wprowadzając silny promotor w pozycji powyżej od sekwencji kodującej genów (patrz: Gene 29, 231-41, 1984). Konkretnie można cel ten osiągnąć metodą rekombinacji homologicznej pomiędzy genem gltA, genem ppc lub genem gdhA, których promotor został zastąpiony silnym promotorem lub DNA zawierającym część ich sekwencji i odpowiednim genem w chromosomie.
Konkretne przykłady mikroorganizmów należących do rodzajów Enterobacter których aktywność CS, PEPC lub GDH jest zwiększona obejmują na przykład: Enterobacter agglomerans ATCC12287/RSFCPG i Enterobacter agglomerans AJ13355/ RSFCPG.
Przykłady enzymów katalizujących reakcję odgałęziającą się od szlaku biosyntezy L-glutaminianu i prowadzącą do wytwarzania związków innych niż kwas L-glutaminowy obejmuje na przykład aKGDH, liazę izocytrynianową, acetylotransferazę fosforanową, kinazę octanową, syntazę kwasu acetohydroksowego, syntazę acetomleczanową, acetylotransferazę mrówczanową, dehydrogenazę mleczanową, dekarboksylazę glutaminianową, dehydrogenazę 1-pyrolinową i podobne enzymy. Korzystnym enzymem spośród wymienionych jest aKGDH.
W celu uzyskania ograniczenia aktywności lub braku aktywności wymienionych enzymów w mikroorganizmie należącym do rodzaju Enterobacter, wprowadzić można mutację ograniczającą aktywność lub prowadzącą do braku aktywności, z zastosowaniem standardowych technik mutagenezy lub inżynierii genetycznej.
Przykłady technik mutagenezy obejmują na przykład sposoby wykorzystania naświetlania promieniami X lub UV, sposoby wykorzystujące traktowanie czynnikami mutagennymi typu N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyną lub sposoby pokrewne. Miejscem w obrębie genu do którego wprowadzana jest mutacja może obejmować region kodujący białko enzymatyczne lub region regulatorowy, taki jak promotor.
Przykłady technik inżynierii genetycznej obejmują na przykład rekombinację genetyczną, transdukcję, fuzję komórek i sposoby podobne. Na przykład gen oporności na leki może być wprowadzony do genu docelowego w celu uzyskania funkcjonalnie nieaktywnego genu (genu defektywnego). Następnie defektywny gen wprowadzany jest do komórki mikroorganizmu należącego do rodzaju Enterobacter, i gen docelowy w chromosomie zastępowany jest genem defektywnym w wyniku rekombinacji homologicznej (niszczenie genu).
PL 196 781 B1
To, czy mikroorganizm charakteryzuje zmniejszona aktywność docelowego enzymu oraz stopień zmniejszenia aktywności można określić mierząc aktywność enzymu w ekstrakcie komórek bakteryjnych lub w oczyszczonej frakcji otrzymanej ze szczepu kandydującego, i przyrównując do odpowiedniej aktywności szczepu dzikiego lub szczepu wyjściowego. Aktywność enzymatyczną aKGDH można mierzyć na przykład metodą Reeda i wsp. (LJ Reed, MN Mukherjee Metods Enzymol (1969) 13, 55-61).
W zależności od rodzaju docelowego enzymu, docelowy wariant można wybrać w oparciu o fenotyp szczepu zmienionego. Na przykład wariant charakteryzujący się brakiem lub zmniejszoną aktywnością aKGDH nie wzrasta na podłożu minimalnym uzupełnionym glukozą, lub podłożu minimalnym zawierającym kwas octowy lub kwas L-glutaminowy jako jedyne źródło węgla lub wykazuje zasadniczo zmniejszone tempo wzrostu w warunkach tlenowych. Jednakże nawet w tych samych warunkach może wykazywać normalny wzrost po dodaniu kwasu bursztynowego lub lizyny, metioniny i kwasu diaminopimelinowego do podłoża minimalnego zawierającego glukozę. W oparciu o znajomość tych zjawisk można wyselekcjonować szczep o zmniejszonej lub wygaszonej aktywności aKGDH.
Sposób wytwarzania szczepu Brevibacterium lactofermentum pozbawionego genu aKGDH w oparciu o metodę rekombinacji homologicznej przedstawiono szczegółowo w WO95/34672 i podobne sposoby można zastosować do mikroorganizmów należących do rodzaju Enterobacter.
Ponadto, procedury klonowania, przecinania i ligacji DNA, transformacji i podobnych technik, przedstawione są w Molecular Cloning, wyd. 2, CSH Lab Press (1989) i podobnych publikacjach.
Przykładem szczepu pozbawionego aktywności aKGDH lub o obniżonej jego aktywności uzyskanego jak przedstawiono to powyżej, jest Enterobacter agglomerans AJ13356. Enterobacter agglomerans AJ13356 został przekazany do depozytu w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 19 lutego 1998 i otrzymał numer FERM P-16645, a następnie przekazany został do depozytu międzynarodowego 11,01,1999 zgodnie z Układem Budapesztańskim, i uzyskał numer FERM BP-6615.
Mikroorganizmy należące do rodzaju Enterobacter i wykazujące co najmniej jedną z własności (a) lub (b) oraz zdolność do wytwarzania L-glutaminianu można hodować w pożywce płynnej w celu wytworzenia i gromadzenia kwasu L-glutaminowego w pożywce.
Pożywka hodowlana może być zwykłym podłożem zawierającym źródło węgla, źródło azotu, sole nieorganiczne, jak również organiczne związki śladowe, takie jak aminokwasy, witaminy i substancje podobne, jakie są niezbędne do wzrostu. Pożywka może być sztuczna lub naturalna. W pożywce można zastosować dowolne źródło węgla lub azotu, o ile jest ono wykorzystywane przez hodowane w niej mikroorganizmy.
Źródłem węgla może być cukrowiec, taki jak glukoza, glicerol, fruktoza, sacharoza, maltoza, mannoza, galaktoza, hydrolizat skrobiowy, melasa i podobne. Ponadto kwasy organiczne, takie jak kwas octowy i cytrynowy można stosować również osobno lub w połączeniu z innymi źródłami węgla.
Źródłem azotu może być amoniak, sole amonowe, takie jak siarczan amonowy, węglan amonowy, chlorek amonowy, fosforan amonowy i octan amonowy, azotany i inne.
Organicznymi substancjami śladowymi mogą być witaminy, aminokwasy, kwasy tłuszczowe, kwasy nukleinowe, zawierające je substancje takie jak pepton, kwas kazaminowy, ekstrakt drożdżowy i hydrolizat sojowy i substancje podobne, które są niezbędne do wzrostu szczepów auksotroficznych, wymagających aminokwasu lub substancji podobnych do wzrostu i które są niezbędnym uzupełnieniem pożywki hodowlanej.
Jako sole nieorganiczne, można wykorzystywać fosforany, sole magnezu, sole wapnia, sole żelaza, sole manganu i podobne substancje.
Hodowlę można prowadzić w temperaturze od 20 do 42°C w warunkach tlenowych, przy pH o wartości od 4 do 8. Hodowlę można prowadzić przez okres od 10 godzin do 4 dni w celu zgromadzenia znaczących ilości kwasu L-glutaminowego w płynnym podłożu hodowlanym.
Po ukończeniu hodowli kwas L-glutaminowy zgromadzony w podłożu można zebrać znanymi sposobami. Na przykład można wyizolować L-glutaminian sposobem obejmującym zagęszczanie podłoża po usunięciu z niego komórek w celu wykrystalizowania produktu, chromatografię jonowymienną, i sposoby podobne.
P r z y k ł a d y (1) Tworzenie plazmidu zawierającego gen gltA, gen ppc, I gen gdhA
PL 196 781 B1
Procedura konstruowania plazmidu zawierającego gen gltA, gen ppc, i gen gdhA wyjaśniona jest w odniesieniu do Figur od 1 do 5.
Plazmid pBRGDH niosący gen gdhA pochodzący z Escherichia coli (Japońskie Zgłoszenie Patentowe (KOKAI) nr. 7-203980 (1995) strawiono enzymem Hindlll i Sphl, a lepkie końce uzupełniono do końców tępych działając polimerazą DNA z faga T4. Następnie fragment DNA zawierający gen gdhA oczyszczono i zebrano. Z drugiej strony plazmid pMWCP niosący gen gltA i gen ppc pochodzące z Escherichia coli (WO97/08294) strawiono enzymem Xbal a lepkie końce uzupełniono do końców tępych działając polimerazą DNA z faga T4. Otrzymany fragment DNA zmieszano z fragmentem DNA zawierającym gen gdhA oczyszczonym jak podano powyżej i zligowano działając ligazą z faga T4, uzyskując plazmid pMWCPG, odpowiadający plazmidowi pMWCP niosącemu ponadto gen gdhA (fig. 1).
Fragment DNA niosący gen gdhA uzyskano przez trawienie plazmidu pBRGDH enzymami Hindlll i SalI, następnie oczyszczono i zebrano oraz wprowadzono do miejsca Hindlll-Sall plazmidu pSTV29 (Takara Shuzo) otrzymując plazmid pSTVG (fig. 2).
Równocześnie produkt uzyskany poprzez trawienie plazmidu pVIC40 niosący miejsce startu replikacji z plazmidu RSF1010 o szerokim zakresie gospodarza (Japońskie Zgłoszenie Patentowe (KOKAI) nr. 8-047397 (1996)) strawiono enzymem Notl, poddano działaniu polimerazy z faga T4 oraz strawiono enzymem Pstl, i produkt uzyskany przez strawienie plazmidu pBR322 enzymem EcoT141 poddano działaniu polimerazy z faga T4 oraz strawiono enzymem Pstl, zmieszano i zligowano działając ligazą z faga T4 w celu uzyskania plazmidu RSF-Tet, niosącego miejsce startu replikacji z plazmidu RSF1010 i gen oporności na tetracyklinę (fig. 3).
Następnie plazmid pMWCPG strawiono enzymami EcoRI i Pstl, a fragment niosący gen gltA, gen ppc i gen gdhA oczyszczono i zebrano. Podobnie plazmid RSF-Tet strawiono enzymami EcoRI i Pstl, i fragment DNA niosący miejsce startu replikacji z plazmidu RSF1010 oczyszczono i zebrano. Wymienione fragmenty DNA zmieszano i zligowano działając ligazą z faga T4 otrzymując plazmid RSFCPG składający się z plazmidu RSF-Tet niosącego gen gltA, gen ppc i gen gdhA (fig. 4). Potwierdzono ekspresję genu gltA, genu ppc i genu gdhA z matrycy plazmidu RSFCPG i ekspresję genu gdhA z plazmidu pSTVG metodą komplementacji auksotrofii szczepu Escherichia coli pozbawionego genu gltA, genu ppc oraz genu gdhA oraz mierząc aktywność każdego z enzymów.
Skonstruowano plazmid posiadający gen gltA pochodzący z bakterii Brevibacterium lactofermentum w sposób podany poniżej. Reakcje PCR prowadzono z wykorzystaniem starterów o sekwencji nukleotydowych podanych w Sek. Id. Nr 6 i 7, wybranych w oparciu o znaną sekwencję nukleotydową genu gltA z Corynebacterium glutamicum (Microbiol 140, 1817-28, 1994) i matrycy w postaci chromosomalnego DNA Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, otrzymując fragment DNA zawierający gen gltA o wielkości około 3 kpz. Fragment ten wprowadzono do plazmidu pHSG399 (Takaza Shuzo) strawionego Smal otrzymując plazmid pHSGCB (Figura 5). Następnie plazmid pHSGCB strawiono enzymem Hindlll i wycięty gen gltA o wielkości około 3 kpz wstawiono do plazmidu pMW218 (Nippon Gene) strawionego Hindlll otrzymując plazmid pMWCB (fig. 5). Ekspresję genu gltA z matrycy powstałego plazmidu pMWCB potwierdzono oznaczając aktywność enzymatyczną w szczepie Enterobacter agglomerans AJ13355.
(2) Wprowadzenie plazmidów RSFCPG, pMWCB i pSTVG do komórki Enterobacter agglomerans i oszacowanie produktywności kwasu L-glutaminowego
Enterobacter agglomerans ATCC 12287, Enterobacter agglomerans AJ13355 stransformowano plazmidami RSFCPG, pMWCB i pSTVG metodą elektroporacji (JH Miller „A short course in bacterial genetics: handbook” CSH Pres, 1992) w celu uzyskania transformantów wykazujących oporność na tetracyklinę.
Każdym z uzyskanych transformantów i szczepem wyjściowym zaszczepiano kolbę o pojemności 50 ml zawierającą 5 ml podłoża hodowlanego składającego się z 40 g/l glukozy, 20 g/l siarczanu amonowego, 0,5 g/l sześciowodnego siarczanu magnezowego, 2 g/l diwodorofosforanu potasowego, 0,5 g/l chlorku sodowego, 0,25 g/l sześciowodnego chlorku wapniowego, 0,02 g/l sześciowodnego siarczku żelazowego, 0,02 g/l czterowodnego siarczanu manganowego, 0,72 mg/l dwuwodnego siarczanu cynkowego, 0,64 mg/l pięciowodnego siarczanu miedziowego, 0,72 mg/l sześciowodnego chlorku kobaltowego, 0,4 mg/l kwasu borowego, 1,2 mg/l diwodoromolibdenianu sodowego, 2 g/l ekstraktu drożdżowego i 30 g/l węglanu wapniowego i hodowano w 37°C z wytrząsaniem do czasu zużycia zawartej w pożywce glukozy. W przypadku szczepów AJ13355/pMWCB i AJ13355/pSTVG hodowlę przerywano gdy bakterie zużyły około 10 g/l glukozy tj. hodowano przez około 15 godzin podobnie jak szczep wyjściowy AJ13355, ponieważ zużycie glukozy przez wymienione szczepy jest raczej niPL 196 781 B1 skie. Do pożywki hodowlanej transformantów dodawano 25 mg//l tetracykliny. Po zakończonej hodowli mierzono ilość zgromadzonego w podłożu kwasu L-glutaminowego. Rezultaty przedstawia Tabela 1.
T a b e l a 1 Zgromadzone ilości kwasu L-glutaminowego
szczep bakteryjny zgromadzona ilość kwasu L-glutaminowego (g/l)
ATCC12287 0,0
ATCC1287/RSFCPG 6,1
AJ13355 0,0
AJ13355/RSFCPG 3,3
AJ13355/pMWCB 0,8
AJ13355/pSTVG 0,8
kontrola (podłoże) 0,2
Enterobacter agglomerans ATCC 12287 i Enterobacter agglomerans AJ13355 nie gromadziły L-glutaminianu w podłożu, natomiast szczepy w których aktywność CS, PEPC i GDH została podwyższona przez wprowadzenie plazmidu RSFCPG gromadziły odpowiednio 6,1 g/l, 3,3 g/l i 2,8 g/l kwasu L-glutaminowego. Szczep AJ13355 w którym podwyższono jedynie aktywność CS gromadził 0,8 g/l L-glutaminianu, szczep w którym podwyższono jedynie aktywność GDH gromadził 0,8 g/l L-glutaminianu.
(3) Klonowanie genu aKGDH (dalej oznaczany jako „sucAB”) z Enterobacter agglomerans AJ13355
Gen sucAB z Enterobacter agglomerans AJ13355 sklonowano wybierając fragment DNA komplementujący auksotrofię octanową szczepu Escherichia coli pozbawionego genu podjednostki aKGDH-E1 (oznaczany dalej jako sucA) z chromosomalnego DNA Enterobacter agglomerans AJ13355.
Chromosomalny DNA Enterobacter agglomerans AJ13355 izolowano metodą używaną zazwyczaj do izolowania chromosomalnego DNA z Escherichia coli (Seibutsu Kogaku Jikken-sho (Textboo of Bioengineering Experiments) wyd. Society of Fermentation and Bioengineeing, Japonia, str. 97-98, Baifukan 1992). Plazmid pTWV228 niosący gen oporności na ampicilinę wykorzystany jako wektor pochodził z firmy Takara Shuzo.
Produkty uzyskane przez trawienie chromosomalnego DNA szczepu AJ13355 enzymem EcoT211 i produkt uzyskany przez trawienie plazmidu pTWV228 enzymem Pstl zligowano ligazą z faga T4, a następnie transformowano uzyskanym produktem szczep Escherichia coli JRG466 pozbawiony genu sucA (J Herbert i wsp Mol Gen Genet (1969) 105, 182). Z transformantów uzyskanych jak podano powyżej wybierano szczepy wzrastające na podłożu minimalnym z kwasem octowym i ekstrahowano z nich plazmid oznaczony jako pTWVEK101. Szczep Escherichia coli JRG465 niosący plazmid pTWVEK101 o przywróconej zdolności do wykorzystania kwasu octowego jak również auksotrofii względem kwasu bursztynowego lub L-lizyny i L-metioniny. Sugeruje to, że pTWYEKlOl zawiera gen sucA z Enterobacter agglomerans.
Mapę restrykcyjną fragmentu DNA pochodzącego z Enterobacter agglomerans z plazmidu pTWVEK101 przedstawia fig. 6. Wynik sekwencjonowania zaznaczonej części DNA na fig. 6 przedstawia Sek Id Nr 1. W sekwencji tej zidentyfikowano dwie pełnej długości otwarte ramki odczytu (ORF) dwie sekwencje uznane za częściowe otwarte ramki odczytu. Sekwencje aminokwasowe wyprowadzone z wspomnianych otwartych ramek odczytu i sekwencji częściowych przedstawiają Sek Id Nr od do 5 w kierunku od końca 5'. Wynik analizy homologii tych sekwencji wykazał, że część sekwencji nukleotydowej zawiera część 3' sekwencji genu kodującego białko żelazowo-siarkowe dehydrogenazy bursztynianowej (gen sdhB), pełen gen sucA i gen podjednostki aKGDH-E2, 5' końcową sekwencję genu kodującego podjednostkę β syntetazy bursztynylo-CoA (gen sucC). Porównanie sekwencji aminokwasowych wyprowadzonych z wymienionych sekwencji nukleotydowych z odpowiednimi sekwencjami Escherichia coli (Eur J Biochem 141, 351-59 (1984), Eur J Biochem 141, 361-74 (1984), Biochemistry 24, 6245-52 (1985)) przedstawiają Figury od 7 do 9. Wyniki te wskazują, że sekwencje aminokwasowe wykazują znaczące homologie. Wykazano również, że klaster sdhB-sucA-sucB-sucC obecny jest w chromosomie zarówno Enterobacter agglomerans, jak i Escherichia coli (Eur J Biochem 141, 351-59 (1984), Eur J Biochem 141, 361-74 (1984), Biochemistry 24, 6245-52 (1985)).
PL 196 781 B1 (4) Utworzenie szczepu pozbawionego aKGDH pochodzącego z Enterobacter agglomerans
AJ13355
Metodą rekombinacji homologicznej, wykorzystując gen sucAB z Enterobacter agglomerans uzyskany jak podano wyżej, otrzymano szczep Enterobacter agglomerans pozbawiony aKGDH.
Najpierw plazmid pTWVEK101 strawiono enzymem Bglll w celu usunięcia regionu C-końca, odpowiadającego około połowie genu sucA i pełnemu genowi sucB. W to miejsce wprowadzono gen oporności na chloramfenikol wycięty enzymem AccI z plazmidu pHSG399 (Takara Shuzo). Region sdhB-.-\sucAB::Cm-sucC uzyskany jak podano powyżej wycięto enzymami Aflll i SacI. Uzyskany fragment DNA wykorzystano do transformacji szczepu Enterobacter agglomerans AJ13355 techniką elektroporacji, otrzymując szczep oporny na chloramfenikol, zatem szczep Enterobacter agglomerans AJ13356 pozbawiony genu sucAB, którego gen sucAB w chromosomie został zastąpiony fragmentem sucAB::Cmr.
W celu potwierdzenia, że szczep AJ13356 uzyskany jak podano powyżej nie wykazuje aktywności aKGDH, aktywność enzymatyczną określono metodą Reeda (LJ Reed i BB Mukherjee Methods Enzymol (1969) 13, 55-61). Szczep AJ13356 nie wykazywał aktywności aKGDH (Tabela 2), co potwierdziło że szczep nie posiadał genu sucAB.
T a b e l a 2: Aktywność aKGDH
szczep bakteryjny aktywność aKGDH (AABS/min/mg białka)
AJ13355 0,481
AJ13356 <0,0001
(5) Ocena produktywności L-glutaminianu przez szczep Enterobacter agglomerans pozbawiony aktywności aKGDH
Oboma szczepami AJ13355 i AJ13356 zaszczepiano podłoże w kolbie 500 ml zawierającej 20 ml podłoża hodowlanego składającego się z 40 g/l glukozy, 20 g/l siarczanu amonowego, 0,5 g/l sześciowodnego siarczanu magnezowego, 2 g/l diwodorofosforanu potasowego, 0,5 g/l chlorku sodowego, 0,25 g/l sześciowodnego chlorku wapniowego, 0,02 g/l sześciowodnego siarczku żelazowego, 0,02 g/l czterowodnego siarczanu manganowego, 0,72 mg/l dwuwodnego siarczanu cynkowego, 0,64 mg/l pięciowodnego siarczanu miedziowego, 0,72 mg/l sześciowodnego chlorku kobaltowego, 0,4 mg/l kwasu borowego, 1,2 mg/l diwodoromolibdenianu sodowego, 2 g/l ekstraktu drożdżowego, 200 mg/l chlorowodorku lizynowego, 200 mg/l L-metioniny, 200 mg/l kwasu DL-a^-diaminopimelinowego (DAP) i 30 g/l węglanu wapniowego i hodowano w 37°C z wytrząsaniem do czasu zużycia zawartej w pożywce glukozy. Po zakończonej hodowli mierzono ilość zgromadzonego w podłożu kwasu L-glutaminowego i kwasu a-ketoglutarowego (aKG). Rezultaty przedstawia Tabela 3.
T a b e l a 3 Zgromadzone w podłożu ilości L-glutaminianu oraz aKG
szczep bakteryjny zgromadzona ilość L-glutaminianu (g/l) zgromadzona ilość aKG (g/l)
AJ13355 0,0 0,0
AJ13356 1,5 3,2
Szczep AJ13356 pozbawiony aktywności aKGDH zgromadził 1,5 g/l kwasu L-glutaminowego oraz jednocześnie zgromadził 3,2 g/l aKG.
(6) Wprowadzenie RSFCPG do szczepu Enterobacter agglomerans pozbawionego aktywności aKGDH i ocena produktywności kwasu L-glutaminowego
Szczep AJ1356 stransformowano plazmidem RSFCPG i otrzymanym szczepem z wprowadzonym plazmidem RSFCPG, AJ13356/RSFCPG, zaszczepiano podłoże w kolbie 500 ml zawierającej 20 ml podłoża hodowlanego składającego się z 40 g/l glukozy, 20 g/l siarczanu amonowego, 0,5 g/l sześciowodnego siarczanu magnezowego, 2 g/l diwodorofosforanu potasowego, 0,5 g/l chlorku sodowego, 0,25 g/l sześciowodnego chlorku wapniowego, 0,02 g/l sześciowodnego siarczku żelazowego, 0,02 g/l czterowodnego siarczanu manganowego, 0,72 mg/l dwuwodnego siarczanu cynkowego, 0,64 mg/l pięciowodnego siarczanu miedziowego, 0,72 mg/l sześciowodnego chlorku kobaltowego, 0,4 mg/l kwasu borowego, 1,2 mg/l diwodoromolibdenianu sodowego, 2 g/l ekstraktu drożdżowego, 25 mg/l tetracykliny, 200 mg/l chlorowodorku lizynowego, 200 mg/l L-metioniny, 200 mg/l kwasu
PL 196 781 B1
DL -α,ε-diaminopimelinowego (DAP) i 30 g/l węglanu wapniowego i hodowano w 37°C z wytrząsaniem, do czasu zużycia zawartej w pożywce glukozy. Po zakończonej hodowli mierzono ilość zgromadzonego w podłożu kwasu L-glutaminowego i aKG. Rezultaty przedstawia Tabela 4.
szczep bakteryjny zgromadzona ilość L-glutaminianu (g/l) zgromadzona ilość aKG (g/l)
AJ13356 1,4 2,9
AJ13356/RSFCPG 5,1 0,0
W przypadku szczepu w którym zwielokrotniono aktywności CS, PEPC i GDH poprzez wprowadzenie plazmidu RSFCPG, zgromadzone w podłożu hodowlanym, ilości aKG zostały zmniejszone, a zgromadzone ilości kwasu L-glutaminowego zwiększone.
Zestawienie sekwencji <110> Ajinomoto Co Inc <120> Bakteria wytwarzająca kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego <130>
<150> JP 10-69068 <151> 1998-03-18 <15> JP 10-297129 <151> 1988-10-19 <160> 7 <170> Patentln ver. 2,0 <210> 1 <211> 4556 <212> DNA <213> Enterobacter agglomerans <220>
<221> sekwencja kodująca <222> (2) ... (121) <220>
<221> sekwencja kodująca <222> (322) ... (3129) <220>
<221> sekwencja kodująca <222> (3145) ... (4368) <220>
<221> sekwencja kodująca <222> (4437) ... (4556) <400> 1 t gca ttc agc gtt ttc cgc tgt cac agc atc atg aac tgt gta agt gtt 49 Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val
10 15
tgt cct aaa ggg eta aac ccg acg cgc get atc ggc cac att aag teg 97
Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser
20 25 30
atg ctg ctg caa cgc agc gcg tagttatacc accgggaacc tcaggttccc 148
Met Leu Leu Gin Arg Ser Ala
35
ggtattttac ggaagcctct gtaaacgcgg tcccaaccac gtttacaaag gttcccttac 208 gggccgggcg cgcgctgcgc acagtgctcg tatcgctgaa ctcactacgg caaaccgcga 268 aagcggcaac aaatgaaacc tcaaaaaagc ataacattgc ttaagggatc aca atg 324
Met cag aac agc gcg atg aag ccc tgg ctg gac tcc tcc tgg ctg gcc ggc 372
Gin Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala Gly
10 15
PL 196 781 B1
gcg aat cag tct tac ata gag caa ctc tat gag gat ttc ctg acc gat 420
Ala Asn Gin Ser Tyr Ile Glu Gin Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr Asp
20 25 30
cct gac tct gtg gat gca gtg tgg cgc tcg atg ttc caa cag tta cca 468
Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gin Gin Leu Pro
35 40 45
ggc acg gga gtg aaa cct gag cag ttc cac tcc gca act cgc gaa tat 516
Gly Thr Gly Va1 Lys Pro Glu Gin Phe His Ser Ala Thr Arg Glu Tyr
50 55 60 65
ttc cgt cgc ctg gcg aaa gac gca tct cgt tac acc tcc tca gtt acc 564
Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val Thr
70 75 80
gat ccg gca acc aac tcc aaa caa gtg aaa gtg ctg cag ctg att aac 612
Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gin Val Lys Val Leu Gin Leu Ile Asn
85 90 95
gcg ttt cgt ttc cgc gga cat cag gaa gca aat ctc gat ccg ctt ggc 660
Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gin Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu Gly
100 105 110
ctg tgg aaa cag gac cgc gtt gcc gat ctc gat cct gcc ttt cac gat 708
Leu Trp Lys Gin Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His Asp
115 120 125
ctg acc gac gcc gat ttt cag gaa agc ttt aac gta ggt tct ttt gcc 756
Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gin Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe Ala
130 135 140 145
att ggc aaa gaa acc atg aag ctg gcc gat ctg ttc gac gcg ctg aag 804
Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu Lys
150 155 160
cag acc tac tgt ggc tcg att ggt gca 9ag tat atg cac atc aat aac 852
Gin Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn Asn
165 170 175
acc gaa gag aaa cgc tgg atc cag cag cgt atc gaa tcc ggt gcg agc 900
Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gin Gin Arg Ile Glu Ser Gly Ala Ser
180 185 190
cag acg tca ttc agt ggc gaa gag aaa aaa ggt ttc ctg aaa gag ctg 948
Gin Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu Leu
195 200 205
acc gcg gca gaa ggg ctg gaa aaa tat ctg ggc gcg aaa ttc ccg ggt 996
Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly
210 215 220 225
gca aaa cgt ttc tcg ctg gaa ggc ggt gat 9cg ctg gtg ccg atg ctg 104
Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met Leu
230 235 240
cgc gag atg att cgt cat gcg ggc aaa agc ggc aca cgt gaa gtg gta 109
Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val Val
245 250 255
ctg ggg atg gcg cac cgt ggc cgt ctt aac gta ctg att aac gta ctg 114
Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val Leu
PL 196 781 B1
260 265 270
ggt aaa aag cca cag gat ctg ttc gac gaa ttc tcc ggt aaa cac aaa 1188
Gly Lys Lys Pro Gin Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His Lys
275 280 285
gag cat ctg ggc acc ggt gat gtg aag tat cac atg ggc ttc tct tcg 1236
Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser
290 295 300 305
gat att gaa acc gaa ggt ggt ctg gtg cat ctg gcg ctg gcg ttt aac 1284
Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn
310 315 320
ccg tct cac ctg gaa att gtc agc ccg gtg gtc atg gga tcg gta cgt 1332
Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val Arg
325 330 335
gca cgt ctc gat cgt ctg gcc gaa ccg gtc agc aat aaa gtg ttg cct 1380
Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser A$n Lys Val Leu Pro
340 345 350
atc acc att cac ggt gat gcg gcg gtg att ggt cag ggc gtg gtt cag 1428
Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gin Gly Vai Val Gin
355 360 365
gaa acc ctg aac atg tct cag gcg cgc ggc tac gaa gtg ggc ggc acg 1476
Glu Thr Leu Asn Met Ser Gin Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr
370 375 380 385
gta cgt atc gtc att aac aac cag gtt ggt ttt acc acc tcc aac ccg 1524
Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gin Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro
390 395 400
aaa gat gcg cgt tca acc ccg tac tgt act gac atc ggc aag atg gtg 1572
Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Vai
405 410 415
ctg gca ccg att ttc cac gtc aat gct gac gat ccg gaa gcg gtg gcc 1620
Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala
420 425 430
+++ Ο+/Ί nnn Γ'+π nar + + Λ· aai na+ IfiGfi
b b b a υ b aw by bi by UU L· vyb» 9b*b> b bV gu b 1 νυν
Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp
435 440 445
gtg ttt atc gat ctg gtg tgc tat cgc cgt cat ggt cac aac gag gcg 1716
Va1 Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala
450 455 460 465
gat gag cca agt gct acc cag ccg ttg atg tac cag aaa atc aaa aag 1764
Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gin Pro Leu Met Tyr Gin Lys Ile Lys Lys
470 475 480
cat ccg acg ccg cgt aaa att tac gcc gat cgt ctg gaa ggc gaa ggt 1812
His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu Gly
485 490 495
gtc gcg tcg cag gaa gat gcc acc gag atg gtg aac ctg tac cgc gat 1860
Val Ala Ser Gin Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp
500 505 510
gcg ctc gat gcg 99C gaa tgc gtg gtg ccg gaa tgg cgt ccg atg agc 1908
PL 196 781 B1
Ala Leu 515 Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met Ser
520 525
ctg cac tcc ttc acg tgg tcg cct tat ctg aac cac gaa tgg gat gag 1956
Leu His 530 Ser Phe Thr Trp 535 Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu 540 545
cct tat ccg gca cag gtt gac atg aaa cgc ctg aag gaa ctg gca ttg 2004
Pro Tyr Pro Ala Gin Val 550 Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu 555 560
cgt atc agc cag gtc cct gag cag att gaa gtg cag tcg cgc gtg gcc 2052
Arg Ile Ser Gin 565 Val Pro Glu Gin Ile Glu Val Gin Ser Arg Val Ala 570 575
aag atc tat aac gat cgc aag ctg atg gcc gaa ggc gag aaa gcg ttc 2100
Lys Ile Tyr Asn 580 Asp Arg Lys Leu 585 Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala Phe 590
gac tgg ggc ggt gcc gag aat ctg gcg tac gcc acg ctg gtg gat gaa 2148
Asp Trp Gly Gly 595 Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu 600 605
ggt att ccg gtt cgc ctc tcg ggt gaa gac tcc ggt cgt gga acc ttc 2196
Gly Ile 610 Pro Val Arg Leu 615 Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe 620 625
ttc cat cgc cac gcg gtc gtg cac aac cag gct aac ggt tca acc tat 2244
Phe His Arg His Ala Val 630 Val His Asn Gin Ala Asn Gly Ser Thr Tyr 635 640
acg ccg ctg cac cat att cat aac agc cag ggc gag ttc aaa gtc tgg 2292
Thr Pro Leu His 645 His Ile His Asn Ser Gin Gly Glu Phe Lys Val Trp 650 655
gat tcg gtg ctg tct gaa gaa gcg gtg ctg gcg ttt gaa tac ggt tac 2340
Asp Ser Val Leu 660 Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr 665 670
gcc acg gct gag ccg C9C gtg ctg acc atc tgg gaa gcg cag ttt ggt 2388
Ala Thr 675 Ala Glu Pro Arg Val Leu oou Thr Ile Trp Glu Ala Gin Phe Gly παρ 000
gac ttt gcc aac ggt gct cag gtg gtg att gac cag ttc atc agc tct 2436
Asp Phe 690 Ala Asn Gly Ala 695 Gin Val Val Ile Asp Gin Phe Ile Ser Ser 700 705
ggc gaa cag aag tgg ggc cgt atg tgt ggc ctg gtg atg ttg ctg ccg 2484
Gly Glu Gin Lys Trp Gly 710 Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro 715 720
cat ggc tac gaa ggt cag gga ccg gaa cac tcc tct gcc cgt ctg gaa 2532
His Gly Tyr Glu Gly Gin 725 Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu 730 735
cgc tat ctg caa ctt tgc gcc gag cag aac atg cag gtt tgc gtc ccg 2580
Arg Tyr Leu Gin 740 Leu Cys Ala Glu 745 Gin Asn Met Gin Val Cys Val Pro 750
tcg acg ccg gct cag gtg tat cac atg ctg cgc cgt cag gcg ctg cgc 2628
Ser Thr Pro Ala Gin Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gin Ala Leu Arg
755 760 765
PL 196 781 B1
999 atg cgc cgt ccg ctg gtg gtg atg teg ccg aag teg ctg tta cgc 2676
Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg
770 775 780 785
cat cca ctg gcg atc teg teg ctg gat gaa ctg gca aac ggc agt ttc 2724
His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser Phe
790 795 800
cag ceg gcc att ggt gag atc gac gat ctg gat ccg cag ggc gtg aaa 2772
Gin Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gin Gly Val Lys
805 810 815
cgc gtc gtg ctg tgc tcc ggt aag gtt tac tac gat ctg ctg gaa cag 2820
Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gin
820 825 830
cgt cgt aaa gac gag aaa acc gat gtt gcc atc gtg cgc atc gaa cag 2868
Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gin
835 840 845
ctt tac ccg ttc ccg cat cag gcg gta cag gaa gca ttg aaa gcc tat 2916
Leu Tyr Pro Phe Pro His Gin Ala Val Gin Glu Ala Leu Lys Ala Tyr
850 855 860 865
tct cac gta cag gac ttt gtc tgg tgc cag gaa gag cct ctg aac cag 2964
Ser His Val Gin Asp Phe Val Trp Cys Gin Glu Glu Pro Leu Asn Gin
870 875 880
ggc gcc tgg tac tgt age cag cat cat ttc cgt gat gtc gtg ccg ttt 3012
Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gin His His Phe Arg Asp Val Val Pro Phe
885 890 895
ggt gcc acc ctg cgt tat gca ggt cgc ccg gca teg get tct ccg gcc 3060
Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala
900 905 910
gtg 9St tat atg tcc gta cac caa caa cag cag caa gac ctg gtt aat 3108
Val Gly Tyr Met Ser Val His Gin Gin Gin Gin Gin Asp Leu Val Asn
915 920 925
gac gca ctg aac gtc aat taattaaaag gaaagata atg agt age gta gat 3159
Aen Al o t ΩΙ1 Aen Ual * Vk 1 Aen Mn+ w ww Va1 Aen
n i φ r i t ’V( 1 » bt ·
930 935 1 5
att etc gtt CCC gac ctg cct gaa teg gtt gca gat gcc aca gta gca 3207
Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala Asp Ala Thr Val Ala
10 15 20
acc tgg cac aag aaa cca ggc gat gca gtc age cgc gat gaa gtc atc 3255
Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser Arg Asp Glu Val Ile
25 30 35
gtc gaa att gaa act gac aaa gtc gtg ctg gaa gtg ccg gca tct gcc 3303
Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu Val Pro Ala Ser Ala
40 45 50
gat 99C gtg ctg gaa gcc gtg ctg gaa gac gaa ggg gca acc gtt acg 3351
Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu Gly Ala Thr Val Thr
55 60 65
tcc cgc cag atc ctg ggt cgc ctg aaa gaa ggc aac agt gcg ggt aaa 3399
Ser Arg Gin Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly Asn Ser Ala Gly Lys
PL 196 781 B1
70 75 80 85
gaa agc agt gcc aaa gcg gaa agc aat gac acc acg cca gcc cag cgt 3447
Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr Thr Pro Ala Gin Arg
90 95 100
cag aca gcg tcg ctt gaa gaa gag agc agc gat gcg ctc agc ccg gcg 3495
Gin Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp Ala Leu Ser Pro Ala
105 110 115
atc cgt cgc ctg att gcg gag cat aat ctt gac gct gcg cag atc aaa 3543
Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp Ala Ala Gin Ile Lys
120 125 130
ggc acc ggc gta ggc gga cgt tta acg cgt gaa gac gtt gaa aaa cat 3591
Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu Asp Val Glu Lys His
135 140 145
ctg gcg aac aaa ccg cag gct gag aaa gcc gcc gcg cca gcg gcg ggt 3639
Leu Ala Asn Lys Pro Gin Ala Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly
150 155 160 165
gca gca acg gct cag cag cct gtt gcc aac cgc agc gaa aaa cgt gtt 3687
Ala Ala Thr Ala Gin Gin Pro Val Ala Asn Arg Ser Glu Lys Arg Val
170 175 180
ccg atg acg cgt tta cgt aag cgc gtc gcg gag cgt ctg ctg gaa gcc 3735
Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Va1 Ala Glu Arg Leu Leu Glu Ala
185 190 195
aag aac agc acc gcc atg ttg acg acc ttc aac gaa atc aac atg aag 3783
Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu Ile Asn Met Lys
200 205 210
ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggc gat gcg ttc gag aag cgt 3831
Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gin Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Lys Arg
215 220 225 cac ggt gtg cgt ctg ggc ttt atg tct ttc tac atc aag gcc gtg gtc 3879
His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr Ile Lys Ala Val Val
230 235 240 245 _______X___ X X_X — ΧΛ Χ..Χ -X- .«1 - — ^(*10*7 gaa yuy ucy aay uyu ναν uua yaa yuu aau yuu νυν <avu yav yyu yaa aati
Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser Ile Asp Gly Glu
250 255 260
gac gtg gtg tac cac aac tat ttc gat gtg agt att gcc gtc tct acg 3975
Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser Ile Ala Val Ser Thr
265 270 275
cca cgc gga ctg gtg acg cct gtc ctg cgt gac gtt gat gcg ctg agc 4023
Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Ala Leu Ser
280 285 290
atg gct gac atc gag aag aaa att aaa gaa ctg gca gtg aaa ggc cgt 4071
Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val Lys Gly Arg
295 300 305
gac ggc aag ctg acg gtt gac gat ctg acg ggc ggt aac ttt acc atc 4119
Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly Gly Asn Phe Thr Ile
310 315 320 325
acc aac ggt ggt gtg ttc ggt tcg ctg atg tct acg cca atc atc aac 4167
PL 196 781 B1 <212> białko <213> Enterobacter agglomerans <400> 3
Met Gin Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10 15
Gly Ala Asn °ł0 Ser Tyr Tle Glu % Leu Tyr Gly Asp % Leu Thr
Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gin Gin Leu
35 40 45
Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gin Phe His Ser Ala Thr Arg Glu
50 55 60
Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val
65 70 75 80
Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gin Val Lys Val Leu Gin Leu Ile
85 90 95
Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gin Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu
100 105 110
Gly Leu Trp Lys Gin Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His
115 120 125
Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gin Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe
130 135 140
Ala Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu
145 150 155 160
Lys Gin Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn
165 170 175
Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gin Gin Arg Ile Glu Ser Gly Ala
180 185 190
Ser Gin Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu
195 200 205
Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro
210 215 220
Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met
225 230 235 240
Leu Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val
245 250 255
Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val
260 265 270
Leu Gly Lys Lys Pro Gin Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His
275 280 285
Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser
290 295 300
Ser Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe
305 310 315 320
Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val
325 330 335
Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu
340 345 350
Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gin Gly Val Val
355 360 365
Gin Glu Thr Leu Asn Met Ser Gin Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly
370 375 380
Thr Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gin Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn
PL 196 781 B1
Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met
405 410 415
Val Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val
420 425 430
Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg
435 440 445
Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu
450 455 460
Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gin Pro Leu Met Tyr Gin Lys Ile Lys
465 470 475 480
Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu
485 490 495
Gly Val Ala Ser Gin Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg
500 505 510
Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met
515 520 525
Ser Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp
530 535 540
Glu Pro Tyr Pro Ala Gin Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala
545 550 555 560
Leu Arg Ile Ser Gin Val Pro Glu Gin Ile Glu Val Gin Ser Arg Val
565 570 575
Ala Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala
580 585 590
Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp
595 600 605
Glu Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr
610 615 620
Phe Rhe His Arg His Ala Val Val His Asn Gin Ala Asn Gly Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gin Gly Glu Phe Lys Val
Trp Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly 660 665 670
Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gin Phe 675 680 685
Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gin Val Val Ile Asp Gin Phe Ile Ser
690 695 700
Ser Gly Glu Gin Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu
705 710 715 720
Pro His Gly Tyr Glu Gly Gin Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu
725 730 735
Glu Arg Tyr Leu Gin Leu Cys Ala Glu Gin Asn Met Gin Va1 Cys Val
740 745 750
Pro Ser Thr Pro Ala Gin Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gin Ala Leu
755 760 765
Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu
PL 196 781 B1
770 775 780
Arg His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser
785 790 795 800
Phe Gin Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gin Gly Val
805 810 815
Lys Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu
820 825 830
Gin Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu
835 840 845
Gin Leu Tyr Pro Phe Pro His Gin Ala Val Gin Glu Ala Leu Lys Ala
850 855 860
Tyr Ser His Val Gin Asp Phe Val Trp Cys Gin Glu Glu Pro Leu Asn
865 870 875 880
Gin Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gin His His Phe Arg Asp Val Val Pro
885 890 895
Phe Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro
900 905 910
Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gin Gin Gin Gin Gin Asp Leu Val
915 920 925
Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn
930 935
<210> 4
<211> 407
<212> białko
<213> Enterobacter agglomerans
<400> 4
Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala
1 5 10 15
Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser
20 25 30
Arg Asp Glu Va1 Ile Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu
40 45
Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Va1 Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu 50 55 60
Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gin Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly
70 75 80
Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr 85 90 95
Thr Pro Ala Gin Arg Gin Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp 100 105 110
Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp 115 120 125
Ala Ala Gin Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu 130 135 140
Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gin Ala Glu Lys Ala Ala 145 150 155 160
PL 196 781 B1
Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gin Gin Pro Val Ala Asn Arg
165 170 175
Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu
180 185 190
Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn
195 200 205
Glu Ile Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gin Tyr Gly Asp
210 215 220
Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr
225 230 235 240
Ile Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Ile ASP Gly Glu Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser
260 265 270
Ile Ala Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu val Thr Pro Va1 Leu Arg Asp
275 280 285
Val Asp Ala Leu Ser Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu
290 295 300
Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly
305 310 315 320
Gly Asn Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser
325 330 335
Thr Pro Ile ile Asn Pro Pro Gin Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala
340 345 350
Ile Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gin Va1 Val Ile Leu Pro
355 360 365
Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg
370 375 380
Glu Ser Val Gly Tyr Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro
385 390 395 400
Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val 405
<210> 5
<211> 40
<212> białko
<213> Enterobacter
<400> 5
agglomerans
Met Asn Leu His Glu Tyr Gin Ala Lys Gin Leu Phe Ala Arg Tyr Gly
1 5 10 15
Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu
20 25 30
Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala
35 40
PL 196 781 B1 <210> 6 <21> 30 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter <400> 6 gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter <400> 7 aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt

Claims (8)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Mikroorganizm należący do rodzaju Enterobacter wykazujący zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego i posiadający co najmniej jedną z następujących cech:
    (c) mikroorganizm wykazuje wzrost aktywności enzymu wybranego z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową; i (d) mikroorganizm wykazuje zmniejszoną aktywność lub brak aktywności dehydrogenazy kwasu α-ketoglutarowego.
  2. 2. Mikroorganizm według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizm stanowi Enterobacter agglomerans.
  3. 3. Mikroorganizm według zastrz. 1, znamienny tym, że wykazuje wzrost aktywności wszystkich enzymów z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową.
  4. 4. Mikroorganizm według zastrz. 3, znamienny tym, że mikroorganizm stanowi Enterobacter agglomerans.
  5. 5. Sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego, znamienny tym, że w płynnej pożywce hodowlanej hoduje się mikroorganizm należący do rodzaju Enterobacter wykazujący zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego i wykazujący co najmniej jedną z następujących cech (a) mikroorganizm wykazuje wzrost aktywności enzymu wybranego z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową, oraz (b) zmniejszoną aktywność lub brak aktywności dehydrogenazy kwasu α-ketoglutarowego, wytwarzając i gromadząc kwas L-glutaminowy w pożywce i następnie zbiera się kwas L-glutaminowy z pożywki hodowlanej.
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako mikroorganizm stosuje się Enterobacter agglomerans.
  7. 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że mikroorganizm wykazuje wzrost aktywności wszystkich enzymów z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako mikroorganizm stosuje się Enterobacter agglomerans.
PL332072A 1998-03-18 1999-03-18 Mikroorganizm wytwarzający kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego PL196781B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP6906898 1998-03-18
JP29712998 1998-10-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL332072A1 PL332072A1 (en) 1999-09-27
PL196781B1 true PL196781B1 (pl) 2008-01-31

Family

ID=26410250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL332072A PL196781B1 (pl) 1998-03-18 1999-03-18 Mikroorganizm wytwarzający kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego

Country Status (13)

Country Link
US (4) US6331419B1 (pl)
EP (2) EP1462523B1 (pl)
KR (2) KR100626102B1 (pl)
CN (1) CN100402657C (pl)
AU (1) AU756507B2 (pl)
BR (1) BR9901173B1 (pl)
DE (2) DE69941137D1 (pl)
ES (2) ES2327838T3 (pl)
ID (1) ID22246A (pl)
MY (1) MY126522A (pl)
PE (1) PE20000342A1 (pl)
PL (1) PL196781B1 (pl)
TW (1) TWI235179B (pl)

Families Citing this family (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU756507B2 (en) * 1998-03-18 2003-01-16 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
US7247459B1 (en) 1998-10-19 2007-07-24 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid producing bacterium and process for producing L-glutamic acid
JP4427878B2 (ja) * 1999-08-20 2010-03-10 味の素株式会社 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
AU2005200716B2 (en) * 1999-08-20 2008-02-14 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-glutamic acid by fermentation accompanied by precipitation
JP4560998B2 (ja) * 2001-02-05 2010-10-13 味の素株式会社 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法及びｌ−グルタミン生産菌
JP2002238592A (ja) * 2001-02-20 2002-08-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸の製造法
JP4599726B2 (ja) * 2001-02-20 2010-12-15 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
JP4292724B2 (ja) 2001-02-20 2009-07-08 味の素株式会社 有機態窒素含有組成物及びそれを含む肥料
JP4599725B2 (ja) * 2001-02-20 2010-12-15 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
DE10116518A1 (de) * 2001-04-03 2002-10-17 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
US7052883B2 (en) 2001-04-03 2006-05-30 Degussa Ag Process for the production of L-amino acids using strains of the family Enterobacteriaceae that contain an attenuated fruR gene
WO2003008605A2 (en) * 2001-07-18 2003-01-30 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an enhanced male gene
US20050130256A1 (en) * 2001-09-26 2005-06-16 Northeastern University Isolation and cultivation of microorganisms from natural environments and drug discovery based thereon
US7011957B2 (en) * 2001-09-26 2006-03-14 Northeastern University Isolation and cultivation of microorganisms from natural environments and drug discovery based thereon
US20030059866A1 (en) * 2001-09-26 2003-03-27 Kim Lewis Isolation and cultivation of microorganisms from natural environments and drug discovery based thereon
JP3932945B2 (ja) 2002-03-27 2007-06-20 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
KR20060015582A (ko) 2003-05-07 2006-02-17 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-글루탐산의 제조법
JPWO2004111258A1 (ja) * 2003-06-10 2006-07-27 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
US7344874B2 (en) 2004-03-04 2008-03-18 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7501282B2 (en) * 2005-02-25 2009-03-10 Ajinomoto Co., Inc. Plasmid autonomously replicable in Enterobacteriaceae family
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2351830B1 (en) 2006-03-23 2014-04-23 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
WO2007119890A1 (en) 2006-04-18 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2054500B1 (en) 2006-08-18 2016-11-23 Ajinomoto Co., Inc. An l-glutamic acid producing bacterium and a method for producing l-glutamic acid
JP2010017082A (ja) 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
BRPI0806790B1 (pt) 2007-01-22 2017-02-14 Ajinomoto Kk microorganismo, e, método para produzir um l-aminoácido
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010130899A (ja) 2007-03-14 2010-06-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
EP2149608A4 (en) 2007-04-16 2013-02-20 Ajinomoto Kk PROCESS FOR PRODUCING AN ORGANIC ACID
EP2147970B1 (en) 2007-04-17 2014-12-31 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an acidic substance having a carboxyl group
BRPI0816429A2 (pt) 2007-09-04 2019-09-24 Ajinomoto Kk microorganismo, e, método para a produção de um l-aminoácido.
EP2241630B1 (en) 2007-12-06 2016-06-01 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an organic acid
US7953493B2 (en) 2007-12-27 2011-05-31 Ebr Systems, Inc. Optimizing size of implantable medical devices by isolating the power source
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
BRPI0906795A2 (pt) 2008-01-23 2015-08-18 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
EP2246420B1 (en) 2008-02-21 2014-12-31 Ajinomoto Co., Inc. L-cysteine-producing bacterium, and method for production of l-cysteine
JP5332237B2 (ja) 2008-03-06 2013-11-06 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
KR100955884B1 (ko) 2008-04-07 2010-05-06 고려대학교 산학협력단 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 이를이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지
EP2343371B1 (en) 2008-09-05 2015-10-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid
ES2624913T3 (es) * 2008-09-08 2017-07-18 Ajinomoto Co., Inc. Microorganismo que produce un L-aminoácido y procedimiento para producir un L-aminoácido
RU2411289C2 (ru) * 2008-09-30 2011-02-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Бактерия, принадлежащая к роду pantoea, - продуцент l-аспартата или метаболита, являющегося производным l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболита, являющегося производным l-аспартата
JP2010142200A (ja) 2008-12-22 2010-07-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
BRPI1007069A2 (pt) 2009-01-23 2015-08-25 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido.
JP5359409B2 (ja) 2009-03-12 2013-12-04 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
EP2460883A4 (en) 2009-07-29 2013-01-16 Ajinomoto Kk PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID
WO2011021717A2 (en) 2009-08-21 2011-02-24 Ajinomoto Co.,Inc. Method for producing hydroxylated amino acids
WO2011065469A1 (ja) 2009-11-30 2011-06-03 味の素株式会社 Ｌ－システイン生産菌及びｌ－システインの製造法
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
RU2010101135A (ru) 2010-01-15 2011-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Бактерия семейства enterobacteriaceae - продуцент l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
CN103119154B (zh) 2010-09-14 2015-11-25 味之素株式会社 含硫氨基酸生产菌以及含硫氨基酸的制造方法
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2014087259A (ja) 2011-02-22 2014-05-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
BR112013023465B1 (pt) 2011-04-01 2020-10-27 Ajinomoto Co., Inc método para produzir l-cisteína
JP2014131487A (ja) 2011-04-18 2014-07-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システインの製造法
RU2496867C2 (ru) 2011-04-25 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии
EP2711013A4 (en) 2011-05-18 2015-03-04 Ajinomoto Kk IMMUNSTIMULANDS FOR ANIMALS, FEED THEREFOR AND MANUFACTURING PROCESS THEREFOR
WO2013018734A1 (ja) 2011-07-29 2013-02-07 三井化学株式会社 二酸化炭素固定経路を導入した微生物
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
WO2013069634A1 (ja) 2011-11-11 2013-05-16 味の素株式会社 発酵法による目的物質の製造法
CN104379742A (zh) 2012-05-29 2015-02-25 味之素株式会社 生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸的方法
WO2013179722A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 株式会社ブリヂストン イソプレンシンターゼおよびそれをコードするポリヌクレオチド、ならびにイソプレンモノマーの製造方法
WO2014115896A1 (en) 2013-01-24 2014-07-31 Mitsui Chemicals, Inc. Microorganism for production of chemicals derived from acetyl-coa
EP2949751B1 (en) 2013-01-24 2022-08-03 Mitsui Chemicals, Inc. Microorganism having carbon dioxide fixation cycle introduced thereinto
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
WO2015050234A1 (ja) 2013-10-02 2015-04-09 味の素株式会社 アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法
CN104736707B (zh) 2013-10-21 2017-08-25 味之素株式会社 生产l‑氨基酸的方法
JPWO2015076392A1 (ja) 2013-11-22 2017-03-16 味の素株式会社 改変イソプレンシンターゼ
BR112016011677A2 (pt) 2013-11-28 2017-09-26 Ajinomoto Kk micro-organismo que expressa isopreno sintase, métodos para produzir um monômero de isopreno e um polímero de isopreno, polímero derivado de um monômero de isopreno, composição de borracha, e, pneu
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2014112066A (ru) 2014-03-28 2015-10-10 Адзиномото Ко., Инк. Способ получения мономерного изопрена
JP2017216881A (ja) 2014-12-26 2017-12-14 味の素株式会社 ジカルボン酸の製造方法
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
EP3420096A1 (en) 2016-02-25 2019-01-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
US11248207B2 (en) * 2016-05-31 2022-02-15 Toray Industries, Inc. Method for producing alpha-hydromuconic acid
US11078503B2 (en) * 2016-05-31 2021-08-03 Toray Industries, Inc. Method for producing 3-hydroxyadipic acid
WO2018079683A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
JP2019536449A (ja) 2016-10-26 2019-12-19 味の素株式会社 目的物質の製造方法
WO2018079685A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
EP3532631A1 (en) 2016-10-26 2019-09-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-methionine or metabolites requiring s-adenosylmethionine for synthesis
CN109952380B (zh) 2016-10-26 2023-07-14 味之素株式会社 用于生产目标物质的方法
CN109890960B (zh) 2016-10-27 2023-02-17 味之素株式会社 用于生产醛的方法
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
US10858676B2 (en) 2017-05-22 2020-12-08 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
US11680279B2 (en) 2017-11-29 2023-06-20 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
EP3756466A4 (en) 2018-02-20 2021-11-24 Ajinomoto Co., Inc. RNA SILENCING INDUCTION PROCESS
WO2020027251A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
WO2020171227A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE
JP7533448B2 (ja) 2019-03-29 2024-08-14 味の素株式会社 アロラクトースの製造法
BR112021017870A2 (pt) 2019-04-05 2021-12-07 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
CN113811524A (zh) 2019-05-08 2021-12-17 味之素株式会社 香兰素的制造方法
JP2022550349A (ja) 2019-09-25 2022-12-01 味の素株式会社 細菌の発酵による２－メチル酪酸の製造方法
JP2022550084A (ja) 2019-09-25 2022-11-30 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
US20240117393A1 (en) 2022-09-30 2024-04-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS329393B1 (pl) 1954-12-25 1957-11-07
GB864562A (en) 1957-08-16 1961-04-06 Ajinomoto Kk A process for the production of glutamic acid or a salt thereof
US3220929A (en) 1964-02-10 1965-11-30 Kyowa Hakko Kogyo Kk Microbiological production of amino acid by reductive amination
US3563857A (en) * 1967-03-20 1971-02-16 Sanraku Ocean Co Process for producing l-glutamic acid by fermentation
JPH0321160B2 (pl) * 1979-05-02 1991-03-22 Nat Res Dev
GB2076853B (en) * 1980-04-17 1983-12-21 Ajinomoto Kk L-glutamic acid producing microorganisms
JPS589693A (ja) * 1981-07-03 1983-01-20 Tanabe Seiyaku Co Ltd 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製法
JPH0783714B2 (ja) 1983-08-29 1995-09-13 味の素株式会社 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法
JPH0746994B2 (ja) 1984-10-04 1995-05-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JPS61268185A (ja) 1984-12-27 1986-11-27 Asahi Chem Ind Co Ltd グルタミン酸デヒドロゲナ−ゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片
FR2581653B1 (fr) 1985-05-10 1989-06-30 Asahi Chemical Ind Fragment d'adn contenant un gene codant pour la phosphoenolpyruvate carboxylase, adn recombinant le contenant et micro-organisme contenant ce dernier
JPS62201585A (ja) 1985-11-26 1987-09-05 Asahi Chem Ind Co Ltd クエン酸合成酵素産生遺伝子を含むｄｎａ断片
JPH07121228B2 (ja) 1986-11-07 1995-12-25 協和醗酵工業株式会社 Ｌ−グルタミン酸およびｌ−プロリンの製造法
JP2520895B2 (ja) * 1987-03-04 1996-07-31 旭化成工業株式会社 Ｌ―グルタミン酸の製造方法
BR9203053A (pt) 1991-08-07 1993-03-30 Ajinomoto Kk Processo para produzir acido l-glutamico pro fermentacao
SK283369B6 (sk) * 1993-08-24 2003-06-03 Ajinomoto Co., Inc. Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza, mikroorganizmus, rekombinantná DNA a spôsob výroby aminokyseliny
AU687458B2 (en) 1993-10-28 1998-02-26 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing substance
JP3880636B2 (ja) * 1994-01-10 2007-02-14 味の素株式会社 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
RU2084520C1 (ru) 1994-01-19 1997-07-20 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штамм бактерий brevibacterium flavum - продуцент l-глутамина (варианты)
JP2781954B2 (ja) 1994-03-04 1998-07-30 メック株式会社 銅および銅合金の表面処理剤
US5821351A (en) 1994-06-10 1998-10-13 Dnx Biotherapeutics Production of hemoglobin having a delta-like globin
WO1995034672A1 (fr) * 1994-06-14 1995-12-21 Ajinomoto Co., Inc. GENE A DESHYDROGENASE α-CETOGLUTARIQUE
CA2153561A1 (en) * 1994-07-11 1996-01-12 Ryoichi Katsumata Process for producing an optically active .gamma.-hydroxy-l-glutamic acid
WO1996006180A1 (fr) 1994-08-19 1996-02-29 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine et d'acide l-glutamique par fermentation
WO1997008294A1 (fr) * 1995-08-23 1997-03-06 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production d'acide l-glutamique par fermentation
JPH09285294A (ja) * 1996-04-23 1997-11-04 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
AU746542B2 (en) * 1998-03-18 2002-05-02 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
AU756507B2 (en) 1998-03-18 2003-01-16 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
US7247459B1 (en) 1998-10-19 2007-07-24 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid producing bacterium and process for producing L-glutamic acid
JP4427878B2 (ja) * 1999-08-20 2010-03-10 味の素株式会社 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
TW200734460A (en) 1999-10-04 2007-09-16 Ajinomoto Kk Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria
JP4304837B2 (ja) 2000-07-05 2009-07-29 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法
JP4560998B2 (ja) * 2001-02-05 2010-10-13 味の素株式会社 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法及びｌ−グルタミン生産菌
JP4292724B2 (ja) 2001-02-20 2009-07-08 味の素株式会社 有機態窒素含有組成物及びそれを含む肥料
JP4599725B2 (ja) * 2001-02-20 2010-12-15 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
JP4599726B2 (ja) 2001-02-20 2010-12-15 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
JP2002238592A (ja) * 2001-02-20 2002-08-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸の製造法
RU2230114C2 (ru) 2001-11-30 2004-06-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Мутантная глутаминсинтетаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli - продуцент l-глутамина и способ получения l-аминокислот
JP3932945B2 (ja) 2002-03-27 2007-06-20 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
US7344874B2 (en) 2004-03-04 2008-03-18 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7205132B2 (en) 2004-09-10 2007-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7794989B2 (en) 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7501282B2 (en) 2005-02-25 2009-03-10 Ajinomoto Co., Inc. Plasmid autonomously replicable in Enterobacteriaceae family
JP5011675B2 (ja) 2005-08-09 2012-08-29 味の素株式会社 物質の生産プロセスのシミュレーション方法
EP1930409B1 (en) 2005-08-26 2012-02-08 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for production of l-glutamic acid
JP2007117082A (ja) 2005-09-27 2007-05-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2054500B1 (en) 2006-08-18 2016-11-23 Ajinomoto Co., Inc. An l-glutamic acid producing bacterium and a method for producing l-glutamic acid

Also Published As

Publication number Publication date
DE69921881D1 (de) 2004-12-23
PL332072A1 (en) 1999-09-27
US20030119153A1 (en) 2003-06-26
MY126522A (en) 2006-10-31
EP0952221A2 (en) 1999-10-27
AU2122399A (en) 1999-09-30
US20010019836A1 (en) 2001-09-06
DE69941137D1 (de) 2009-08-27
EP0952221B1 (en) 2004-11-17
US8129151B2 (en) 2012-03-06
US20090263874A1 (en) 2009-10-22
CN100402657C (zh) 2008-07-16
EP1462523A2 (en) 2004-09-29
CN1233660A (zh) 1999-11-03
BR9901173B1 (pt) 2010-11-30
DE69921881T2 (de) 2005-07-21
ES2232984T3 (es) 2005-06-01
PE20000342A1 (es) 2000-04-24
ES2327838T3 (es) 2009-11-04
AU756507B2 (en) 2003-01-16
TWI235179B (en) 2005-07-01
ID22246A (id) 1999-09-23
KR100626102B1 (ko) 2006-09-20
EP1462523A3 (en) 2004-11-17
KR100626568B1 (ko) 2006-09-25
KR19990077973A (ko) 1999-10-25
EP1462523B1 (en) 2009-07-15
EP0952221A3 (en) 2001-09-12
US6331419B1 (en) 2001-12-18
KR20060061785A (ko) 2006-06-08
BR9901173A (pt) 2000-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL196781B1 (pl) Mikroorganizm wytwarzający kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego
EP0955368B1 (en) L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing l-glutamic acid
US6596517B2 (en) Method for producing L-glutamic acid
KR100866479B1 (ko) 침전을 수반하는 발효에 의한 ｌ-글루타민산의 생산 방법
KR100674401B1 (ko) Ｌ-글루탐산-생성 세균 및 ｌ-글루탐산 제조 방법
RU2282662C2 (ru) Способ получения l-глутаминовой кислоты
JP4292724B2 (ja) 有機態窒素含有組成物及びそれを含む肥料
JP3921866B2 (ja) Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法
JP4144098B2 (ja) Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法
JP2000189175A (ja) Ｌ―グルタミン酸生産菌及びｌ―グルタミン酸の製造法
WO2001002543A1 (fr) Procede de production d&#39;acide l-amine
JP2000232890A (ja) 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法