본 발명은 하기에서 상세하게 설명된다.
본 발명의 미생물은 엔테로박터와 세라티아 속에 속하고, 다음 성질중 하나 이상을 갖는 미생물이다:
(a) L-글루탐산 생합성 반응을 촉매하는 효소 활성이 증가된 미생물; 및
(b) L-글루탐산 생합성 경로로부터 분지되어 L-글루탐산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소 활성이 감소된 또는 결핍된 미생물.
모균주로써 엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하는 미생물을 이용하여, 당해 미생물에 상기 (a) 및/또는 (b) 성질을 부여함으로써 상기와 같은 미생물을 얻을 수 있다. 모균주로서 사용될 수 있는 엔테로박터와 세라티아 속에 속하는 미생물을 예로 들면 다음과 같다:
엔테로박터 아글로메란스[Enterobacter agglomerans]
엔테로박터 에어로겐스[Enterobacter aerogenes]
엔테로박터 아미니게누스[Enterobacter amnigenus]
엔테로박터 아스부리에[Enterobacter asburiae]
엔테로박터 클로아케이[Enterobacter cloacae]
엔테로박터 디졸벤스[Enterobacter dissolvens]
엔테로박터 게르고비에[Enterobacter gergoviae]
엔테로박터 호르메케이[Enterobacter hormaechei]
엔테로박터 인터메디우스[Enterobacter intermedius]
엔테로박터 니미프레슈라리스[Enterobacter nimipressuralis]
엔테로박터 사카자키[Enterobacter sakazakii]
엔테로박터 타일로레[Enterobacter taylorae]
세라티아 리퀘파시엔스[Serratia liquefaciences]
세라티아 엔토모필라[Serratia entomophila]
세라티아 휘카리아[Serratia ficaria]
세라티아 혼티콜라[Serratia fonticola]
세라티아 그리메시[Serratia grimesii]
세라티아 오도리훼라[Serratia odorifera]
세라티아 플리무티카[Serratia plymuthica]
세라티아 루비데아[Serratia rubidaea]
더욱 바람직하게는, 하기 박테리아 균주가 적절하다:
엔테로박터 아글로메란스 ATCC 12287
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355
세라티아 리퀘파시엔스 ATCC 14460
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355는 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry]에 1998년 2월 19일자로 기탁되어, 수탁번호 FERM P-16644를 수여 받았고, 이는 부다페스트 조약에 의해 1999년 1월 11자로 국제 기탁기관으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-6614를 수여받았다. 엔테로박터 아글로메란스 ATCC 12287과 세라티아 리퀘파시엔스 ATCC 14460는 ATCC로 부터 입수할 수 있다.
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355는 일본 시즈오카 이와타시의 토양에서 분리한 균주이다.
AJ13355의 생리학적 특징은 다음과 같다:
(1) 그램 염색성 ; 음성
(2) 산소에 대한 거동 ; 통성 혐기성균
(3) 카탈라제 ; 음성
(4) 옥시다제 ; 양성
(5) 질산염 환원능 ; 음성
(6) 보게스-프로스카워(Voges-Proskauer) 반응 ; 양성
(7) 메틸 레드 시험 ; 음성
(8) 우레아제 ; 음성
(9) 인돌 생성 ; 양성
(10) 운동성 ; 유(有)
(11) TSI 배지에서 황화수소 생성 ; 미약한 활성
(12) β-갈락토시다제 ; 양성
(13) 당 동화능:
아라비노즈: 양성
슈크로즈: 양성
락토즈: 양성
크실로즈: 양성
소르비톨: 양성
이노시톨: 양성
트레할로즈: 양성
말토즈: 양성
멜리비오즈: 양성
아도니톨: 음성
라피노즈: 양성
살리신: 음성
멜리비오즈: 양성
(14) 글리세로즈 동화성 ; 양성
(15) 유기산 동화성:
시트르산: 양성
타르타르산: 음성
글루코닌산: 양성
아세트산: 양성
말론산: 음성
(16) 아르기닌 데하이드라타제 : 음성
(17) 오르니틴 데카복실라제 : 음성
(18) 리신 데카복실라제 : 음성
(19) 페닐알라닌 데아미나제 : 음성
(20) 색소 형성 : 황색
(21) 젤라틴 액화능 : 양성
(22) 생장 pH : pH 4에서는 생장이 불량하고, pH 4.5 내지 7에서는 생장이 양호하다.
(23) 생장 온도 ; 25℃에서는 생장 양호, 30℃에서는 생장 양호, 37℃에서는 생장 양호, 42℃에서는 생장 가능, 45℃에서는 생장이 불가능함
이와 같은 세균학적 성질을 기초로 AJ13355는 엔테로박터 아글로메란스로 판결되었다.
하기에서 설명하는 실시예에서, 엔테로박터 아글로메란스 ATCC12287, 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 및 세라티아 리퀘파시엔스 ATCC 14460을 출발 모균주로서 이용하여, L-글루탐산 생합성 반응을 촉매하는 효소 활성이 증가된 균주 또는 L-글루탐산 생합성 경로로부터 분지되어 L-글루탐산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소 활성이 감소된 또는 결핍된 미생물 균주를 수득한다. 그러나, 엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하는 임의의 박테리아에 의한 당 대사는 엠브덴-마이어로프(Embden-Meyerhof) 경로를 통하여 이루어지고, 당해 경로에서 생산되는 피루베이트는 호기성 상태하의 테트라사이클린 산 사이클에서 산화된다. GDH 또는 글루타민 신테타제/글루타메이트 신타제에 의해 트리카르복실산 사이클의 중간생성물질인 α-케토글루타르산으로부터 L-글루탐산이 생합성된다. 따라서, 이들 미생물은 동일한 L-글루탐산 생합성 경로를 공유하고, 엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하는 미생물은 본 발명에 따른 단일 개념내에 포함된다. 따라서, 상기 언급한 종 및 균주 이외의 엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하는 미생물도 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 미생물은 엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하고, L-글루탐산을 생산하는 능력을 갖는 미생물이다. 본원에서 사용하고 있는 "L-글루탐산을 생산하는 능력이 있는"이란 배양하는 동안에 배지내에 L-글루탐산을 축적하는 능력을 갖 는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, L-글루탐산을 생산하는 능력은 다음 특징중 하나 또는 둘 다를 갖춤으로써 수득된다;
(a) L-글루탐산 생합성 반응을 촉매하는 효소 활성이 증가된 미생물; 및
(b) L-글루탐산 생합성 경로로부터 분지되어 L-글루탐산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소 활성이 감소된 또는 결핍된 미생물.
엔테로박터 또는 세라티아 속의 미생물에서 L-글루탐산 생합성 반응을 촉매하는 효소의 예로는 GDH, 글루타민 신테타제, 글루타메이트 신타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, CS, PEPC, 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 에놀라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오세포스페이트 이소메라제, 푸락토즈 비스포스페이트 알돌라제, 포스포푸락토키나제 및 글루코즈 포스페이트 이소메라제 등이 언급될 수 있다. 이들 효소중에서, CS, PEPE, GDH 세 종류중 하나, 두 개 또는 세 가지 모두 바람직하다. 본 발명의 미생물로는, CS, PEPE 및 GDH 세 종류 효소 모두의 활성이 증가된 것이 더욱 바람직하다. 미생물의 표적 효소 활성이 증가되었는지 여부 및 당해 활성의 증가 정도는 박테리아 세포 추출물 또는 정제된 분획에서 효소 활성을 측정하고, 야생형 또는 모균주의 효소 활성과 비교하면 알 수 있다.
엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하고, L-글루탐산 생합성 반응을 촉매하는 효소 활성이 증가된 본 발명의 미생물은, 예를 들면 출발 모균주로서 상기 언급된 미생물 중 하나를 이용함으로써 당해 효소를 암호화하는 유전자에 돌연변이가 생성 된 변이체 또는 유전자 재조합 균주로서 수득될 수 있다.
예를 들면 CS, PEPC 또는 GDH 활성을 증가시키기 위해, CS, PEPC 또는 GDH을 암호화하는 유전자를 적절한 플라스미드에 클로닝시키고, 숙주인 상기 언급한 출발 모균주를 생성된 플라스미드로 형질전환시킨다. 이로써 CS, PEPC 및 GDH을 암호화하는 각 유전자(이하 각각 "gltA 유전자", "ppc 유전자" 및 "gdhA 유전자"의 약어로 사용함)의 복제수가 증가되고, 이 결과 CS, PEPC 및 GDH 활성이 증가된다.
클로닝된 gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자 중에서 임의 조합으로 선택된 하나 또는 두 가지 또는 세 가지 종류를 상기 언급한 출발 모균주에 도입시킨다. 두 가지 또는 세 가지 종류의 유전자를 도입시키는 경우에, 두 가지 또는 세 가지 유전자를 한 종류의 플라스미드에 클로닝시켜, 숙주에 도입시키거나, 이들을 동일한 숙주에서 존재할 수 있는 두 가지 또는 세 가지 종류의 플라스미드에 별도로 클로닝을 시켜, 숙주로 도입시킨다.
엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하는 미생물에서 플라스미드가 자가 복제할 수 있다면, 당해 플라스미드는 특별히 제한받지 않는다. 플라스미드를 예로 들면, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 및 pMW218 등이 포함된다. 이들 플라스미드 이외에도 파아지 DNA 벡터를 이용할 수도 있다.
디 엠 모리슨(D.M. Morrison)의 방법[Methods in Enzymology 68, 326 (1979)], 염화칼슘으로 DNA에 대한 수령 세포의 투과성을 증가시키는 방법[Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)] 등으로 형질전환을 달성할 수 있다.
숙주인 출발 모균주의 염색체 DNA 상에 존재하는 gltA 유전자, ppc 유전자 및/또는 gdh 유전자의 다중 복사체를 이용하여, CS, PEPC 및 GDH의 활성을 또한 증가시킬 수 있다. 엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하는 미생물의 염색체 DNA에 gltA 유전자, ppc 유전자 및/또는 gdhA 유전자의 다중 복사체를 도입시키기 위해, 반복 DNA와 같은 다중 복제수로 염색체 DNA상에 존재하는 서열, 및 전위 인자의 말단에 존재하는 역위 반복체를 이용할 수 있다. 또는 gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자를 운반하는 트랜스포존의 전위를 이용하여, 염색체 DNA 내로 당해 유전자의 다중 복사체를 도입할 수 있다. 이와 같은 기술을 이용하면, 형질전환된 세포에 gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자 복제수를 증가시킬 수 있고, 이 결과 CS, PEPC 및 GDH의 활성이 증가된다.
생물체가 CS, PEPC 및 GDH 활성을 갖는 한, 복제수를 증가시키기 위해 사용된 gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자의 공급원으로서 어떠한 생물체라도 이용될 수 있다. 이와 같은 생물체중에서, 세균, 즉 엔테로박터[Enterobacter], 클렙시엘라[Klebsiella], 에르위니아[Erwinia], 판토아[Pantoea], 세라티아[Serratia], 에스케리치아[Escherichia], 코리네박테리움[Corynebacterium], 브레비박테리움[Brevibacterium], 및 바실러스[Bacillus]에 속하는 세균과 같은 원핵세포가 바람직하다. 구체적인 예로서 에스케리치아 콜리를 언급할 수 있다. gltA 유전자 및 ppc 유전자, gdhA 유전자는 상기 언급한 미생물의 염색체 DNA에서 구할 수 있다.
gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자는 CS, PEPC 또는 GDH 활성이 결여된 변이체 균주의 영양요구성을 보충하는 DNA 단편을 분리함으로써, 전술한 임의 미생물의 염색체 DNA에서 수득할 수 있다. 또는, 에스케리치아 또는 코리네박테리움 속의 세균 유전자의 뉴클레오티드 서열이 이미 알려져 있기 때문에(Biochemistry, Vol. 22, pp. 5243-5249, 1983; J. Biochem. Vol. 95, pp. 909-916, 1984; Gene, Vol. 27, pp. 193-199, 1984; Microbiology, Vol. 140, pp. 1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet. Vol. 218, pp. 330-339, 1989; and Molecular Microbiology, Vol. 6, pp. 317-326, 1992), 밝혀진 각각의 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 합성된 프라이머를 이용하고, 주형으로서 염색체 DNA을 이용하여, PCR을 통하여 당해 유전자를 얻을 수 있다.
상기 언급한 유전자 증폭보다는 gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자의 발현을 증강시킴으로써, CS, PEPC 또는 GDH 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자의 프로모터를 또 다른 강력한 프로모터로 대체시킴으로써, 발현을 증강시킬 수 있다. 이와 같은 강력한 프로모터의 예로는 lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, λ파아지의 PR 프로모터와 PL 프로모터 등이 포함된다. 프로모터가 치환된, gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자를 플라스미드내에 클로닝시키고, 이를 숙주세포로 도입시키거나, 또는 반복 DNA, 역위 반복체, 트랜스포존 등을 이용하여 숙주 미생물의 염색체 DNA에 도입시킨다.
염색체상의 gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자의 프로모터를 또 다른 강력한 프로모터로 대체시키거나[WO87/03006 및 일본 공개특허공보(KOKAI) 제61-268183호(1986) 참고], 또는 당해 유전자의 각 암호 서열의 상부에 강력한 프로모터를 삽입[Gene, 29, pp. 231-241, 1984]함으로써 CS, PEPC, GDH 활성을 증가시킬 수 있다. 구체적으로, 이들은, 프로모터가 강력한 프로모터 또는 이의 일부를 포함하는 DNA로 대체된 gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자와 염색체상의 상응하는 유전자를 상동 재조합시킴으로써 얻을 수 있다.
CS, PEPC 또는 GDH 활성이 증가된 엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하는 미생물의 구체적인 예로는, 엔테로박터 아글로메란스 ATCC12287/RSFCPG, 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355/RSFCPG, 세라티아 리퀘파시엔스 ATCC14460/RSFCPG이 포함된다.
L-글루탐산 생합성 경로로부터 분지되어 L-글루탐산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소의 예로는, αKGDH, 이소시트레이트 리아제, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, 아세테이트 키나제, 아세토하이드록시산 신타제, 아세토락테이트 신타제, 포르메이트 아세틸트랜스퍼라제, 락테이트 데하이드로게나제, 글루타메이트 데카복실라제, 1-피롤린 데하이드로게나제 등이 포함된다. 이들 효소중 αKGDH가 바람직하다.
엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하는 미생물에서 상기 언급한 바와 같이 효소 활성을 감소 또는 결핍시키기 위해서, 통상의 돌연변이 유발 기술 또는 유전자 조작 기술을 이용하여 당해 효소를 암호화하는 유전자내에 당해 효소 활성의 감 소 또는 결핍을 일으키는 돌연변이를 도입시킬 수 있다.
돌연변이 유발 기술의 예로는 X-선 또는 자외선의 조사 및 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘와 같은 돌연변이 유발제로 처리하는 방법 등이 포함된다. 돌연변이가 도입되는 유전자의 위치는 효소 단백질을 암호화하는 암호 영역 또는 프로모터와 같은 발현 조절 영역 일것이다.
유전자 조작 기술의 예로는 유전자 재조합, 유전자 형질도입 및 세포 융합 등이 포함된다. 예를 들면, 약물 내성 유전자를 표적 유전자에 삽입시켜, 기능상 불활성화된 유전자(결핍 유전자)를 제조한다. 따라서, 이와 같은 결핍 유전자는 엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하는 미생물의 세포내에 도입되어, 염색체 상의 표적 유전자가 상동 재조합에 의해 결손 유전자로 대체된다(유전자 파괴).
미생물에서 표적 유전자의 활성이 감소했는지는 여부 및 당해 활성의 감소 정도는 후보 균주 박테리아 세포 추출액 또는 정제된 분획의 효소 활성을 측정하고, 야생형 균주 또는 모균주의 것과 비교함으로써 평가될 수 있다. αKGDH 효소 활성은, 예를 들면 리드 등의 방법(L.J. Reed and B.B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61)으로 측정될 수 있다.
표적 효소에 따라, 표적 변이체를 변이체의 표현형에 기초하여 선택할 수 있다. 예를 들면, αKGDH 활성이 결핍되거나 활성이 감소된 변이체는 글루코즈를 포함하는 최소 배지 또는 유일한 탄소원으로서, L-글루탐산 또는 아세트산을 포함하는 최소 배지에서는 생장할 수 없거나, 또는 호기성 상태에서 생장 속도가 상당히 감소되는 것으로 나타난다. 그러나 동일한 조건에서, 글루코즈를 포함하는 최소 배지에 숙신산 또는 리신, 메티오닌 및 디아미노피멜레이트를 첨가하면 정상적인 생장 속도를 가질 수 있다. 이와 같은 현상을 기초로 하여, αKGDH 활성이 결핍되거나 활성이 감소된 변이체를 선택한다.
상동 재조합에 기초하여, αKGDH 활성이 결핍된 브레비박테리움 락토페르멘툼[Brevibacterium lactofermentum]을 생산하는 방법은 WO95/34672에 상세히 설명되어 있고, 엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하는 미생물의 경우에도 유사한 방법을 이용할 수 있다.
또한, 유전자 클로닝, DNA 절단 및 결합, 형질전환 등의 과정은 문헌[Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989)]에 상세히 설명되어 있다.
상기에서 수득한 αKGDH 활성이 결핍되거나 당해 활성이 감소된 변이체 균주의 예는 엔테로박터 아글로메란스 AJ13356이다. 엔테로박터 아글로메란스 AJ13356은 1998년 2월 19일자로 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry]에 기탁되어, 수탁번호 FERM P-16645를 수여 받았고, 부다페스트 조약에 따라 1999년 1월 11일자로 국제 기탁기관에 이관되어 수탁번호 FERM BP-6615를 수여 받았다.
엔테로박터 또는 세라티아 속에 속하고, (a)와 (b)성질중 하나 이상을 가지고, L-글루탐산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을, 액체 배지에서 배양하여, 액체 배지내에 L-글루탐산이 생성 및 축적되도록 한다.
배지는 탄소원, 질소원 및 무기염 뿐만 아니라 아미노산 및 비타민등과 같은 유기 미량 영양소를 포함하는 통상의 영양 배지일 수 있다. 이는 합성 배지 또는 천연 배지일 수 있다. 배양하고자 하는 미생물에 의해 이용될 수 있기만 하다면, 어떠한 탄소원 및 질소원도 이용할 수 있다.
탄소원은 글루코즈, 글리세롤, 푸락토즈, 수크로즈, 말토즈, 만노즈, 갈락토즈, 전분 가수분해물 및 당밀 등과 같은 당류일 수 있다. 또한, 아세트산 및 시트르산과 같은 유기산을 단독으로 또는 다른 탄소원과 함께 이용할 수 있다.
질소원은 암모니아; 황산 암모늄, 탄산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄, 암모늄 아세테이트와 같은 암모늄 염; 질산염 등일 수 있다.
유기 미량 영양소로서, 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산; 펩톤, 카사미노산, 효모 추출물, 콩 단백질 분해산물을 포함하는 물질 등을 이용할 수 있으며, 생장을 위해 아미노산 등을 요구하는 영양요구성 변이체를 이용하는 경우에 요구하는 영양소를 보충해줄 필요가 있다.
무기염으로서, 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등을 이용한다.
배양 조건으로는 20 내지 42℃의 온도, pH 4 내지 8, 호기성 상태하에서 배양할 수 있다. 10시간 내지 4일간 배양을 지속하면, 액체 배양 배지에 상당량의 L-글루탐산이 축적된다.
배양이 완료된 후에, 배지에 축적된 L-글루탐산은 공지의 방법을 이용하여 수집한다. 예를 들면, 세포를 제거한 후에 배지를 농축시켜, 생성물을 결정화시키는 방법, 이온 크로마토그래피 등을 이용하여 분리할 수 있다.
실시예
본 발명은 다음의 실시예를 참고로 하여 보다 상세히 설명을 한다.
(1)
gltA
유전자,
ppc
유전자 및
gdhA
유전자를 갖는 플라스미드의
작제
gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자를 갖는 플라스미드를 작제하는 과정은 도 1 내지 도 5를 참조하여 설명한다.
gdhA 유전자를 갖는, 에스케리치아 콜리에서 유래된 플라스미드 pBRGDH[일본 공개특허공보(KOKAI)제7-203980호(1995)]를 HindIII와 S phI로 분해하고, 양 말단을 T4 DNA 폴리머라제를 이용하여 평활 말단으로 만든다. 그 다음 gdhA 유전자를 포함하는 DNA 단편을 정제하여 수집한다. 한편, gltA 유전자와 ppc 유전자를 갖는, 에스케리치아 콜리에서 유래된 플라스미드 pMWCP(WO97/08294)를 XbaI으로 분해하고, 양 말단을 T4 DNA 폴리머라제를 이용하여 평활 말단으로 만든다. 이들을 상기 정제된 gdhA 유전자를 갖는 DNA 단편과 혼합하고, T4 리가제로 결합시키면 플라스미드 pMWCPG가 생성되는데, 이 플라스미드는 gdhA 유전자를 추가로 포함하는 플라스미드 pMWCP에 상응한다(도 1).
pBRGDH를 HindIII와 SalI으로 분해하여 수득된, gdhA 유전자를 갖는 DNA 단편을 정제하고, 수집하여, pSTV29(Takara Shuzo에서 구입)의 HindIII-SalI 부위에 도입시켜, 플라스미드 pSTVG를 수득한다(도 2).
동시에, 숙주 범위가 넓은 플라스미드 RSF1010의 복제 기점을 갖는 플라스미 드 pVIC40[일본 공개특허공보(KOKAI)제8-047397호(1996)]를 NotI로 분해하고, 이어서 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고, PstI로 분해하여 수득한 생성물과, pBR322를 EcoT141로 분해하고, 이어서 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고, PstI로 분해하여 수득한 생성물을 혼합시키고, T4 DNA 리가제로 결합시켜, RSF1010의 복제 기점 및 테트라사이클린 내성 유전자를 갖는 플라스미드 RSF-Tet를 수득한다(도 3).
그 다음, pMWCPG를 EcoRI와 PstI로 분해하고, gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자를 갖는 DNA 단편을 정제 및 수집한다. 유사하게, RSF-Tet를 EcoRI와 PstI로 분해하고, RSF1010의 복제 기점을 갖는 DNA 단편을 정제 및 수집한다. 이들 DNA 단편을 혼합하고, T4 리가제로 결합시킴으로써, 플라스미드 RSFCPG가 수득되는데, 이는 gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자를 수반하는 RSF-Tet로 구성된다(도 4). 생성된 플라스미드 RSFCPG에 의한 gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자의 발현 및 pSTVG에 의한 gdhA 유전자의 발현을 gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자가 결손된 에스케리치아 콜리의 영양요구성의 상보성 및 각 효소 활성의 측정을 기초로 하여 확인할 수 있다.
gltA 유전자를 갖는, 브레비박테리움 락토페르멘툼에서 유래된 플라스미드는 다음과 같이 작제된다. 코리네박테리움 글루타미쿰[Corynebacterium glutamicum](Microbiology, 140, 1817-1828, 1994)의 gltA 유전자 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 선택된 서열 6과 서열 7의 뉴클레오티드 서열을 프라이머로서 이용하고, 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC 13869의 염색체 DNA를 주형으로서 이용하여, PCR을 실행하여 약 3 kb gltA 유전자 단편을 수득한다. 이 단편을 SmaI으로 분해된 플라스미드 pHSG399(Takara Shuzo에서 구입)에 삽입시켜, 플라스미드 pHSGCB를 수득한다(도 5). 그 다음 pHSGCB를 HindIII로 분해하고, 약 3kb의 잘라낸 gltA 유전자 단편을 HindIII으로 분해한 플라스미드 pMW218(Nippon Gene에서 구입)에 삽입시켜, 플라스미드 pMWCB를 수득한다(도 5). 생성된 플라스미드 pMWCB에 의한 gltA 유전자 발현을 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355에서의 효소 활성을 측정하여 확인할 수 있다.
(2) 엔테로박터 아글로메란스 또는 세라티아 리퀘파시엔스 내로의 RSFCPG , pMWCB 및 pSTVG의 도입 및 L-글루탐산 생산성의 평가
엔테로박터 아글로메란스 ATCC 12287, 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 및 세라티아 리퀘파시엔스 ATCC 14460을 전기천공방법(Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook" Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1992)을 이용하여, 플라스미드 RSFCPG, pMWCB, pSTVG로 형질전환시켜, 테트라사이클린 내성을 나타내는 형질전환체를 수득한다.
각각 생성된 형질전환체와 모균주를 5㎖ 배지[40g/ℓ글루코즈, 20g/ℓ황산 암모늄, 0.5g/ℓ황산마그네슘 7수화물, 2g/ℓ인산이수소칼륨, 0.5g/ℓ염화나트륨, 0.25g/ℓ염화칼슘 7수화물, 0.02g/ℓ황화철 7수화물, 0.02g/ℓ황화망간 4수화물, 0.72㎎/ℓ황화아연 2수화물, 0.64㎎/ℓ황화구리 5수화물, 0.72㎎/ℓ염화코발트 6수화물, 0.4㎎/ℓ붕산, 1.2㎎/ℓ몰리브덴산나트륨 2수화물, 2g/ℓ효모 추출물, 30g/ℓ탄산칼슘을 포함]를 포함하는 50㎖ 용적의 시험관에 접종시키고, 배지에 포함된 글루코즈가 모두 소비될 때까지 37℃에서 진탕시키면서 배양한다. 그러나, AJ13355/pMWCB 균주 및 AJ13355/pSTVG 균주의 경우에는, 약 10g/ℓ글루코즈가 소비될 때, 즉 모균주 AJ13355와 마찬가지로, 약 15시간 배양 후에 배양을 종료하는데, 그 이유는 이들의 글루코즈 소비 속도가 느리기 때문이다. 당해 형질전환체의 배지에 25㎎/ℓ테트라사이클린을 첨가한다. 배양이 종료된 후에, 배지내에 축적된 L-글루탐산을 측정한다. 그 결과는 표 1에 나타낸다.
축적된 L-글루탐산의 양
세균 균주 |
L-글루탐산 축적량 |
ATCC12287 |
0.0 g/ℓ |
ATCC12287/RSFCPG |
6.1 |
AJ13355 |
0.0 |
AJ13355/RSFCPG |
3.3 |
AJ13355/pMWCB |
0.8 |
AJ13355/pSTVG |
0.8 |
ATCC14460 |
0.0 |
ATCC14460/RSFCPG |
2.8 |
배지 단독 |
0.2 |
엔테로박터 아글로메란스 ATCC 12287, 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 및 세라티아 리퀘파시엔스 ATCC 14460은 L-글루탐산을 축적하지 않지만, RSFCPG을 도입시켜, CS, PEPC 및 GDH 활성이 증폭된 균주는 각각 6.1g/ℓ, 3.3 g/ℓ 및 2.8 g/ℓ의 L-글루탐산을 축적시킨다. CS 활성만이 증폭된 AJ13355 균주는 0.8 g/ℓL-글루탐산을 축적하고, GDH 활성만이 증폭된 균주는 0.8g/ℓL-글루탐산을 축적시킨다.
(3) 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 의 α KGDH 유전자(이하의 " sucAB " 유전자로 칭함)의 클로닝
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355의 염색체 DNA으로부터의 αKGDH-E1 소단위 유전자(이하 "sucB"라고 칭함)가 없는 에스케리치아 콜리 균주의 아세테이트 비-동화성을 보충하는 DNA 단편을 선택하여, 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355의 sucAB 유전자를 클로닝시킨다.
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주의 염색체 DNA를 에스케리치아 콜리로부터 염색체 DNA을 추출하는데 통상적으로 이용되는 방법과 동일한 방법으로 분리한다[Seibutsu Kogaku Jikken-sho(Textbook of Bioengineering Experiments), Ed. by the Society of Fermentation and Bioengineering, Japan, p.97-98, Baifukan, 1992]. 벡터로 이용된 pTWV228(암피실린 내성)은 Takara Shuzo에서 시판된다.
AJ13355 균주의 염색체 DNA를 EcoT221으로 분해시켜 수득한 생성물과 pTWV228를 PstI으로 분해하여 수득한 생성물을 T4 리가제로 결합시키고, 이를 이용하여 sucA 유전자가 결손된 에스케리치아 콜리 JRG465를 형질전환시킨다(Herbert J. et al., Mol. Gen. Genetics, 1969, 105, p.182). 아세트산 최소 배지에서 생장된 균주를 상기한 바와 같이 수득한 형질전환체로부터 선별하고, 이로부터 추출한 플라스미드를 pTWVEK101로 지정한다. pTWVEK101을 수반하는 에스케리치아 콜리 JRG465은 아세테이트 비-동화성 및 L-리신 및 L-메티오닌에 대한 영양요구성을 회복한다. 이로써 pTWVEK101는 엔테로박터 아글로메란스의 sucA 유전자를 포함한다는 것을 알 수 있다.
엔테로박터 아글로메란스 유래된 pTWVEK101의 DNA 단편의 제한효소 지도를 도 6에 나타낸다. 도 6에서 빗금친 부분을 서열화한 뉴클레오티드를 서열 1에 나타낸다. 이 서열에서, 두 개의 전체 길이의 ORF와 ORF의 부분적 서열로 간주되는 두 개의 뉴클레오티드 서열이 발견된다. 이들 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열과 이의 부분적인 서열을 5' 말단으로부터 순서대로 서열 2 내지 5에 나타낸다. 이들 서열의 상동성을 분석 한 결과, 결정된 뉴클레오티드 서열의 부분에는 숙시네이트 데하이드로게나제 철-황 단백질 유전자(sdhB)의 3' 부분 서열, 전체 길이의 sucA와 αKGDH-E2 소단위 유전자(sucB 유전자) 및 숙시닐-CoA 신테타제 β소단위 유전자(sucC 유전자)의 5'부분 서열이 포함됨을 알 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열에서 유추된 아미노산 서열과 에스케리치아 콜리 서열을 비교한 것[Eur. J. Biochem., 141, 351-359 (1984), Eur. J. Biochem., 141, 361-374 (1984), and Biochemistry, 24, 6245-6252 (1985)]은 도 7 내지 9에 나타낸다. 이들 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 당해 아미노산 서열은 매우 높은 상동성을 나타냈다. 또한, 에스케리치아 콜리와 마찬가지로, 엔테로박터 아글로메란스 염색체상에 sdhB-sucA-sucB-sucC의 집합체가 형성됨을 알 수 있다[Eur. J. Biochem., 141, 351-359 (1984), Eur. J. Biochem., 141, 361-374 (1984), and Biochemistry, 24, 6245-6252 (1985)].
(4) 엔테로박터
아글로메란스
AJ13355
에서
유래된
, α
KGDH
이 결핍된 균주 획득
상기와 같이 수득된 엔테로박터 아글로메란스의 sucAB 유전자를 이용하여, 엔테로박터 아글로메란스의 αKGDH가 결핍된 균주를 상동 재조합에 의해 수득할 수 있다.
우선, pTWVEK101을 BglII로 분해하여, sucA 유전자의 약 절반 부분과 sucB 유전자의 전체 길이에 상응하는 C-말단을 제거한다. 이 부위에, AccI을 이용하여 pHSG399(Takara Shuzo)로부터 잘라낸 클로람페니콜 내성 유전자를 삽입한다. 상기에서 수득된 sdhB-△sucAB::Cmr-sucC 영역을 AflII와 SacI로 잘라낸다. 생성된 DNA 단편을 이용하여 전기천공 방법에 의해 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주를 형질전환시킴으로써 클로람페니콜 내성 균주가 수득되므로, 염색체상의 sucAB 유전자가 sucAB::Cmr로 대체된 sucAB 유전자-결손 엔테로박터 아글로메란스 AJ13356가 수득된다.
상기한 바와 같이 수득된 AJ13356 균주가 αKGDH 활성이 결핍되었는지를 확인하기 위해, 이의 효소 활성을 리드 방법(L.J. Reed and B.B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61)으로 측정한다. 이 결과에 따르면, 표 2에서 볼 수 있는 것과 같이, αKGDH 활성이 AJ13356에서는 검출될 수 없으므로, 당해 균주가 원하는 바와 같이 sucAB가 결손되었음이 확인된다.
αKGDH 활성
박테리아 균주 |
αKGDH 활성 (△ABS/분/㎎ 단백질) |
AJ13355 |
0.481 |
AJ13356 |
<0.0001 |
(5) α
KGDH
이 결핍된 엔테로박터
아글로메란스의
L-글루탐산 생산성의 평가
AJ13355와 AJ13356 각 균주를 20㎖ 배지[40g/ℓ글루코즈, 20g/ℓ황산 암모늄, 0.5g/ℓ황산마그네슘 7수화물, 2g/ℓ인산이수소칼륨, 0.5g/ℓ염화나트륨, 0.25g/ℓ염화칼슘 7수화물, 0.02g/ℓ황화철 7수화물, 0.02g/ℓ황화망간 4수화물, 0.72㎎/ℓ황화아연 2수화물, 0.64㎎/ℓ황화구리 5수화물, 0.72㎎/ℓ염화코발트 6수화물, 0.4㎎/ℓ붕산, 1.2㎎/ℓ몰리브덴산나트륨 2수화물, 2g/ℓ효모 추출물, 30g/ℓ탄산칼슘, 200㎎/ℓL-리신 모노하이드로클로라이드, 200㎎/ℓL-메티오닌, 200㎎/ℓDL-α,ε-디아미노피멜산(DAP)을 포함]를 포함하는 500㎖ 용적의 플라스크에 접종시키고, 배지에 포함된 글루코즈가 소비될 때까지 37℃에서 진탕시키면서 배양한다. 배양을 완료한 후에, 배지에 축적된 L-글루탐산과 α-케토글루타르산(이하 "αKG"로 약칭함)을 측정한다. 이 결과는 표 3에 나타낸다.
L-글루탐산과 αKG 축적량
박테리아 균주 |
L-글루탐산 축적량 |
αKG 축적량 |
AJ13355 |
0.0 g/ℓ |
0.0 g/ℓ |
AJ13356 |
1.5 |
3.2 |
αKGDH 활성이 결핍된 AJ13356 균주는 1.5g/ℓL-글루탐산을 축적하고 동시에 3.2g/ℓαKG을 축적한다.
(6) α KGDH 가 결핍된 엔테로박터 아글로메란스 내로의 RSFCPG 의 도입 및 L-글루탐산 생산성의 평가
AJ13356 균주를 플라스미드 RSFCPG로 형질전환시키고, RSFCPG가 도입된 생성된 균주, AJ13356/RSFCPG를 20㎖ 배지[40g/ℓ글루코즈, 20g/ℓ황산 암모늄, 0.5g/ℓ황산마그네슘 7수화물, 2g/ℓ인산이수소칼륨, 0.5g/ℓ염화나트륨, 0.25g/ℓ염화칼슘 7수화물, 0.02g/ℓ황화철 7수화물, 0.02g/ℓ테트라하이드레이트 황화망간, 0.72㎎/ℓ황화아연 2수화물, 0.64㎎/ℓ펜타하이드레이트 황화구리, 0.72㎎/ℓ염화코발트 6수화물, 0.4㎎/ℓ붕산, 1.2㎎/ℓ몰리브덴산나트륨 2수화물, 2g/ℓ효모 추출물, 25㎎/ℓ테트라사이클린, 30g/ℓ탄산칼슘, 200㎎/ℓL-리신 모노하이드로클로라이드, 200㎎/ℓL-메티오닌 및 200㎎/ℓDL-α,ε-DAP을 포함]를 포함하는 500㎖ 용적의 플라스크에 접종시키고, 배지에 포함된 글루코즈가 소비될 때까지 37℃에서 진탕시키면서 배양한다. 배양을 완료한 후에, 배지에 축적된 L-글루탐산과 αKG을 측정한다. 이 결과는 표 4에 나타낸다.
L-글루탐산과 αKG의 축적량
세균 균주 |
L-글루탐산 축적량 |
αKG 축적량 |
AJ13356 |
1.4 g/ℓ |
2.9 g/ℓ |
AJ13356/RSFCPG |
5.1 |
0.0 |
RSFCPG의 도입에 의해, CS, PEPC 및 GDH 활성이 증폭된 균주의 경우에, αKG 축적 양이 감소하였고, L-글루탐산 축적량은 더 개선되었다.