TWI235179B

TWI235179B - L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid

Info

Publication number: TWI235179B
Application number: TW088104255A
Authority: TW
Inventors: Mika Moriya; Hiroshi Izui; Eiji Ono; Kazuhiko Matsui; Hisao Ito
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1999-03-18
Publication date: 2005-07-01
Also published as: EP1462523A3; DE69921881D1; EP0952221B1; EP1462523B1; ID22246A; KR20060061785A; KR100626102B1; MY126522A; EP0952221A3; AU756507B2; BR9901173B1; CN100402657C; US20030119153A1; BR9901173A; KR19990077973A; PL196781B1; DE69921881T2; US20010019836A1; EP0952221A2; PL332072A1

Description

1235179 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明的背景本發明關於一種新穎之生產L -麩胺酸的細菌及利用此種細菌以發酵法生產L -麩胺酸的方法。L -麩胺酸是一種可做爲食物、藥物及此類物的重要胺基酸。傳統上一直是利用一種稱爲棒狀桿菌之生產麩胺酸的細菌藉著發酵法來生產L -麩胺酸，此種細菌主要是屬於短桿菌屬、棒狀桿菌屬及微桿菌屬或其變種胺基酸發酵〃，嘉凱蘇潘中心，ρ ρ · 1 9 5 - 2 1 5，1 9 8 6 )。至於利用其它菌屬藉著發酵法來生產L一麩胺酸的方法，目前已知的有：利用桿菌屬、鏈黴菌屬、青黴菌屬及此類微生物來生產的方法（美國專利號3，2 2 0， 929)利用假單胞菌屬、節桿菌屬、沙雷菌屬、念珠菌屬及此類微生物來生產的方法（美國專利號3，5 6 3， 8 5 7 )，利用桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷菌屬及此類微生物或產氣性需氧菌（目前稱爲產氣性需氧菌）（日本專利公報（K 〇 K 〇 K U )號 3 2 — 9 3 9 3 ( 1 9 5 7 ) 經濟部智悲財產芍肖工消費合作社印災 )來生產的方法，利用大腸桿菌之變種及此類菌（日本專利公開公報）號5 — 2 4 4 9 7 0 ( 1 9 9 3 ))和此類微生物來生產的方法。雖然，L -麩胺酸的生產可經由培養上述之微生物或上述之製造方法的改良而獲得大大的改進，但事實上仍需要發展出一套更經濟且更有效的方法來生產L -麩胺酸以符合對胺基酸之大量增加的需求。 • * 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X2^7公朵） .4- 1235179 Α7 Β7 五、發明説明（2 ) 本發明的總論本發明的目的是尋找一種新穎之生產L -麩胺酸的細菌’此種細菌生產L -麩胺酸的能力很強，因此，可藉著此細菌再發展出一套更便宜且有效的方法來生產L -麩胺酸。爲了達到前述的目的，本發明者努力尋找並硏究具有生產L -麩胺酸之能力且不同於先前曾報告過之微生物。結果，他們發現某些衍生自屬於陽桿菌屬或沙雷菌屬的菌種具有高度之生產L -麩胺酸的能力，因而完成了本發明〇因此，本發明提供： (1 ) 一種屬於腸桿菌屬或沙雷菌屬的微生物，此種微生物具有生產L -麩胺酸的能力且至少有一種下述之性質： (a )此微生物催化L -麩胺酸之生物合成反應的酶的活性增加；及 (b )在此微生物中，催化自L -麩胺酸生物合成途徑所分支之反應以及生產一種除了 L -麩胺酸以外之化合物的酶的活性降低或缺乏。 (2 ) —種如上述（1 )的微生物，其中該催化L 一麩胺酸生物合成反應之酶至少有一種係選自如下之群體：檸檬酸合成酶（以下縮寫爲），磷酸烯醇丙酮酸羧基酶（以下縮寫法>PEPC〃），及麩胺酸脫氫酶（以下縮寫爲、G D Η 〃）： (3 ) —種如上述（2 )之微生物，其中該催化L 一麩胺 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4%格（210X297公釐) 7^ ' (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 丨裝訂經濟部智慧財/i局貝工消費合作社印災 1235179 A7 ______B7_. 五、發明説明（3 ) 酸生物合成反應的酶包括CS，PEPC及GDH三者全部； (4 ) 一種如上述（1 )至（3 )項之任一項的微生物，其中該催化L -麩胺酸生物合成途徑之分支反應以及生產除了 L -鞋胺酸外之化合物的酶爲α -氧代戊二酸脫氫酶 (以下縮寫爲>aKGDH〃）； (5 ) —種如上述（1 )至（4 )項中之任一項的微生物 ’它是聚團腸桿.菌或液化沙雷菌；及 (6 )—種用來生產L 一麩胺酸的方法，它包括了在一種液體培養介質中培養如上述第（1 )至（5 )項之任一項中所定義的微生物以在該培養介質中生產並累積L -麩胺酸，並自培養介質中收集該L -麩胺酸。因爲本發明之微生物具有高度之生產L -麩胺酸的能力，一般認爲可利用先前已知之培養技術來使生產L -麩胺酸之棒狀桿菌及此類菌的生產能力更好，且藉著選擇合適之培養條件後，便可利用此種能力來協助發展出一套更便宜且有效之生產L -麩胺酸的方法。圖形之簡單說明第1圖顯示出一種具g 1 tA基團，ppc基團和 g d hA基團的質體pMWCPG的構造。第2圖顯示一種具g d hA基因的質體p STVG的構造。第3圖顯示一種質體R S F - T e t的構造，此質體本紙悵尺度適用中國國家標苹（匸^)八4規格（210/ 297公釐） -6- I I--I 丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財/1局a:工消骨合作社印製 1235179 A7 B7 五、發明説明（4 ) 具有廣一宿主一範圍質體RSF1010和四環素抗藥基因之複製源。第4圖顯示一種質體R S F C P G的構造，該質體帶有廣宿主範圍質體RSF 1 0 1 0，四環素抗藥性基因， g 1 t基因，ppc基因和gdhA基因的複製源。第5圖顯示一種具有g1tA基因的質體pMWCB 的構造。第6圖顯示一段衍生自聚團腸桿菌之Ρ τ W V E K 1 0 1的D N A片段的限制圖譜。第7圖所顯示的是由聚團腸桿菌之s u c A基因與由大腸桿菌之s u c A基因的核苷酸序列所導出之胺基酸序列，二者進行比較的內容。上方部分：聚團腸桿菌，下方部分：大腸桿菌（以下也可依此類推）。第8圖所顯示的是由聚團腸桿菌之s u cB基因與由大腸桿菌之s u c B基因的核苷酸序列所導出之胺基酸序列二者進行比較的內容。第9圖所顯示的是由聚團腸桿菌之s d h B基因與由大腸桿團之s d h B基因的核苷酸序列所導出之胺基酸序列，二者進行比較的內容。第1 0圖所顯示的是由聚團腸桿菌之s u c C基因與由大腸桿菌之s u c C基因的核苷酸序列所導出的胺基酸序列，二者進行比較的內容。本發明的詳細說明本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4坭格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

•裝 P ,^ιτ 經濟部智慧財/1场員工>/1骨合作钍印^ 1235179 經濟部智.¾財產^7a:工消骨合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（5 ) 本發明將在下述內容中詳細說明。本發明之微生物是一種屬於腸桿菌屬或沙w菌屬生物，此微生物並具有至少一種下述之性質： (a )此微生物催化L -麩胺酸生物合成反應之活性增加（b )在此微生物中，催化由L -麩胺酸生成途徑所分支之反應並且生產一種除L -麩胺酸外之物的酶的活性降低或缺乏。這種微生物可經由利用一種屬於腸桿菌或沙雷菌微生物來做爲「母菌種」，再將上述（a)及/或（的性質加入此微生物中。屬於該腸桿菌屬或沙雷菌屬做爲「母菌種」之微生物的實施例如下：聚團‘性腸桿菌產氣性腸桿菌安尼基那腸桿菌（Enterobacter amnigenus ) 阿布利亞腸桿菌（Enterobacter asburiae ) 陰溝腸桿菌狄索文斯腸桿菌（Enterobacter dissolvens ) 白勾維腸桿菌荷馬奇腸桿菌（Enterobacter hormaechi ) 因特米德斯腸桿菌（Enterobacter intermedius ) 尼米布舒雷利腸桿菌（Enterobacter nimipressuralis 坡琦氏腸桿菌泰洛雷腸桿菌（Enterobacter taylorae ) 液化沙雷菌的微酶的物合化合屬的 b ) 而可請先閱讀背 ιέ 意事項

ί 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4坭格（210X 297公釐） -8- 1235179 A7 B7 五、發明説明（7 ) (2)對氧氣的需求：兼性厭氧菌 (3 )過氧化氫酶：陰性 (4 )氧化酶：陽性 (5 )硝酸還原反應：陰性 (6 )二氏試驗反應：陽性 (7 )甲基紅試驗：陰性 ’ (8 )尿素酶：陰性 (9 )吲哚的產生：陽性 (1 0 )運動性：存在 .(1 1 )在T S I培養介質中硫化氫的產生情形：有點活躍 (1 2 ) /3 -半乳糖苷酶：陽性 (1 3 )糖類的可同化力：阿拉伯糖：陽性蔗糖：陽性乳糖=陽性木糖：陽性山梨糖醇：陽性肌醇：陽性海藻糖：陽性麥芽糖：陽性蜜二糖：陽性核糖醇：陰性棉子糖：陽性 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂觚經濟部智.^財產^7":3:工消^合作社印^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4現格（210X297公釐） -10- 1235179 A7 B7 五、發明説明（8 ) 柳醇：陰性密二糖：陽性 (1 4 )甘油糖之可同化力：陽性 (15)有機酸之可同化力：檸檬酸：陽性酒石：陰性葡糖酸：陽性醋糖酸：陽性丙二酸：陰性 (1 6 )精胺酸脫水酶：陰性 (1 7 )鳥胺酸脫羧酶：陰性 (1 8 )賴胺酸脫羧酶：陰性 (1 9 )苯基丙氨酸脫胺酶：陰性 (20)色素形成：黃色 (2 1 )明膠液化作用：陽性經濟部智^財產^技工消贫合作钍印% (2 2 )生長的pH値：在pH4處長得不好，在PH 4 . 5至7時長得好。 (2 3 )生長溫度：在2 5°C時長得好，在3 0°C時也好，在3 7°C時更好，在4 2°C時可以生長，在超過4 5°C 時不長。從這些細菌學的性質來看，可測定出A J 1 3 3 5 5 爲聚團腸桿囷。

在下述之操作實施例中，聚團腸桿菌A T C C 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） .. 1235179 A7 B7 五、發明説明（9 ) 請先閱讀背面之 f 挛 Μ 1 2 2 8 7，聚團腸桿菌A J 1 3 3 5 5及液化沙雷菌 ATCC 14460可用來做爲母菌種以取得下列二種菌種：①其中用來催化L -麩胺酸之生物合成反應的酶活性增加，②其中用來催化L -麩胺酸之生物合成途徑的分支反應並且產生除了 L -麩胺酸外之化合物的酶，其活性不足或降低。然而，屬於腸桿菌屬及沙雷菌屬中之任何細菌的糖類氏的是經由恩布登一梅爾霍夫（Embden-Meyerhof )途徑，且途徑·中所產生的丙酮酸鹽是在有氧的狀況下於三羧酸循環中被氧化的。L -麩胺酸是從α -氧代戊二酸藉著G D Η或麩胺合成酶/麩胺酸合成的酶經生物合成的，此α -氧代戊二酸是一種三羧酸循環的中間產物。因此，這些微生物都有相同之L -麩胺酸生物合成途徑，且屬於腸桿菌和沙雷菌的微生物都包含在一個根據本發明的單一槪念內。因此，除了·上述特別提到之菌種外，其它屬於腸桿菌和沙雷菌的微生物也都在本發明的範圍內。經濟部智慧財1场肖工消Φ合作社印災本發明的微生物是一種屬於腸桿菌屬或沙雷菌屬的微生物並且有生產麩胺酸的能力。此處所使用之 ''具有生產麩胺酸的能力"是指具有於培養期間，在培養介質中累積 L -麩胺酸的能力。根據本發明，產生L -麩胺酸的能力是藉著下列一或二種特徵而得知的： (a )該微生物催化L -麩胺酸生物合成反應的酶的活性增加；及 (b )該微生物催化由L -麩胺酸生物生成途徑所分支的反應並生產除了 L -麩胺酸外之化合物的酶，其活性降低本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4現格（210Χ297公趁） 12· 1235179 經濟部智慧时產^㈢工消^合作让印¾ A7 B7五、發明説明（10 ) 或缺乏。可做爲在腸桿菌屬或沙雷菌屬之微生物中催化L -麩胺酸生物合成反應的酶的實施例有：G D Η，麩胺合成酶 ’麩胺酸合成酶，異檸檬酸脫氫酶，烏頭酸水合酶，CS ’ PEPC，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸激酶，烯醇化酶，磷酸甘油變位酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸- 3 -甘油醛脫氫酶’磷酸丙糖異構酶，雙磷酸果糖醛縮酶，磷酸果糖激酶，磷酸葡糖異構酶及此類酶。在這些酶中，C S， P E P C及GDH三者中之一或二種或三種爲較佳的酶。做爲本發明的微生物，更佳的爲那些三種酶（C S， P E P C及G D Η )的活性都增加的微生物。一種微生物其 ''標的酶"的活性是否增加可以藉著測量細菌細胞萃取物或純化的分液中酶活性並將它與野生種或母菌種進行比較來測知。屬於腸桿菌或沙雷菌之本發明的微生物，且其催化L -麩胺酸之生物合成反應的酶的活性增加者，可藉下述步驟來取得’例如··在上述任一種用來做爲起始母菌種的微生物中’將編碼該種酶的基因進行基因重組，或者，在編碼該酶的基因中發生了突變因而產生了變種。例如：爲了加強C S，P E P C或G D Η的活性，可將編碼CS，PEPC或GDH的基因植入一種合適的質體中’而前述之做爲宿主的起始母菌種可以用所產生之質體進行轉形。這種方法可增加各個編碼c s，p E P C及 GDH之莛因（以下各縮寫爲、基因〃，^ (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

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木紙悵尺度適州中國囤家標準（CNS ) Λ#見格（2丨〇乂 297公釐） -13- 1235179 Α7 Β7 五、發明説明（11 ) ppc基因"及、gdhA"基因）的複製數目而使得 C S，P E P C及G D Η的活性增加。將任何組合之一或二或三種選自、純系"的g 1 t A 基因，ppc基因，及gdhA基因引入上述之起始母菌種中。當引入二或三種基因時，該二種基因或者是三種基因便被 >選殖"在一種質體中，此質體再被引入宿主中，或者是它們各自 >被選殖"在二或三種質體中（這些質體可存在於同一種宿主中）然後再將它們引入宿主中。只要質體能在一種屬於腸桿菌屬或沙雷菌屬的微生物中自動進行複製，該質體的種類就不特別侷限在那些種類中。質體的實施例包括，例如：p U C 1 9，P U C 1 8 ，PBR322，PHSG299，PHSG298， PHSG399，PHSG398，RSF1〇10， pMW119，PMW118，PMW219， pMW2 1 8及此類物。除了這些質體外，也可使用噬菌體D N A媒介。經濟部智慧財l^s工消赍合作社印^ 轉形可經由，例如，D · Μ .莫里生的方法（酶學的方法68，326 (1979))來進行，此方法是以氯化鈣增加受體細胞對D Ν Α的滲透性來進行（曼德爾， Μ ·及海嘉，A ·，分子生物學期刊，5 3，1 5 9 ( 1 9 7 0 ))或者也可依類似方法進行。 CS，PEPC及GDH的活性也可藉著將存在於起始母菌種（做爲宿主）的染色體DNA上的g 1 t A基因，P P c基因及/或g d h基因經過多次複製而增加。爲 ϋ张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐) -14: 1235179 A7 B7 五、發明説明（12) 了將g丨tA基因，ppc基因及/或gdhA基因之多次複製體引入屬於腸桿菌屬或沙雷菌屬之微生物的染色體 DNA中，可以利用染色體DNA上之多次複製的序列，如：重覆的D N A及存在於轉位因子尾端上的逆轉重覆體來進行。或者是，該基因的多次複製體也可利用帶著 g 1 t A基因，p p c基因或g d h A基因的轉位子經轉位而引入一個染色體D N A中。這些技術可使轉化株細胞中之g 1 tA基因，ppc基因及gdhA基因的複製數目增加，因而增加了 C S，P E P C及G D Η的活性。經濟部智.¾財產局員工消赍合作社印災任何有機體只要是具有CS，PEPC及GDH的活性，此有機體便可用來做爲增加複製數目用之g 1 t Α基因、Ppc基因及gdhA基因的來源。在這類有機體中，細菌（即：原核生物），如：那些屬於腸桿菌屬、克列伯菌屬，歐文氏菌屬潘朵菌屬，沙雷菌屬，埃希氏菌屬，棒狀桿菌屬，短桿菌屬及芽胞桿菌屬的菌種是較佳者。大腸桿菌可爲一種特殊實施例。g 1 tA基因，ppc基因及g d h A基因可以從上述之微生物的染色體DNA中取得。 · g 1 tA基因，ppc基因及gdhA基因可藉著下述方法各自從前述之任何一種微生物的染色體D N A中取得：將一種缺少C S，P E P C或G D Η活性的營養缺陷型變種菌種的互補D Ν Α片段分離出。或者，由於埃希氏菌或棒狀桿菌類的這些基因的核苷酸序列爲已知序列（生化，第22冊，5243〜5249頁，1983 ;生物 -15· 本纸浪尺度通用中國國家標準（CNS ) Λ4坭格（210X 297公釐） 1235179 Α7 Β7 五、發明説明（13 ) 化學期刊，第95冊，909〜916頁，1984 ·，基因，第27冊，193〜199頁，1984;微生物學，第 140 冊，1817 〜1828 頁，1994;分子基因遺傳學，第218冊，330〜339頁，1989 ;及分子微生物，第6冊，317〜326頁，1992 )，這些基因也可利用根據各個已知之核苷酸序列所合成的引物以染色體D N A爲模板，經由P C R的方法來取得〇除了上述之基因擴增的方法外，CS、 PEPC或 GDH的活性也可藉著加強g 1 t A基因、p p c基因或 g d h A基因的表現而增加。例如：可以另一種較強之啓動基因來代替g1tA基因、ppc基因、或gdhA基因的啓動基因以加強這些基因的表現。這類強力的啓動基因的實施例包括，如：λ噬菌體的1 a c起動基因、 trp啓動基因，trc起動基因，tac起動基因，Pr 起動基因及P l起動基因及此類物。其啓動基因已經經過取代之g 1 tA基因，ppc基因，或gdhA基因被選殖入質體後可利用一段重複的DN A，逆轉重覆體轉位子或此類物引入一種宿主微生物或宿主微生物之染色體D N A 中〇 CS，PEPC或GDH的活性也可藉著置換染色體上之gltA基因、PPC基因，或gdhA基因的啓動基團，以另一種更強之啓動基因來取代（見WO 87/ 03006，及日本專利公開公報申請書（ΚΟΚΑ I ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（2丨0X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂經濟部智慧財1局員工消費合作钍印災 -16- 1235179 A7 B7 五、發明説明（14) 請先閱讀背面 % 事項再填寫本頁 61—268183 (1986))，或是在各個基因編碼序列的上流插入一個強力的啓動基因。（見基因，2 9 ，PP · 231 — 241 ，1984)。特別是，這些是經由在gltA基因、ppc基因或gdhA基因之間的同源重組而取得的，這些基因的啓動基因被染色體上之一種較強的啓動基因或者是含有它們中之一部分的D N A及相對應的基因所取代。屬於腸桿菌或沙雪菌屬，且其C S，PEP C或 G D Η活性有增加之微生物的特殊實施例包括，如：團聚腸桿菌ATCC 12287/RSFCPG，團聚腸桿菌 AJ 13355/RSFCPG及液化沙雷菌 ATCC14460/RSFCPG。可催化從L -麩胺酸生物合成途徑分支出來的反應及製造除了 L -麩胺酸以外之化合物的反應的酶包括，如： aKGDH，異檸檬酸裂解酶，磷酸轉乙醯酶，醋酸激酶，乙醯羥基酸合成酶，乙醯乳酸合成酶，甲酸轉乙醯酶，乳酸脫氫酶麩胺酸脫羧酶，1 -吡咯啉脫氫酶及此類物。在這些酶之中，aKGDH是較佳者。經濟部皙慧財產苟資工消Φ合作社印％爲了得到屬於腸桿菌屬或沙雷菌屬且其中所含之上述的酶活性降低或缺乏的微生物，可以利用傳統的產生突變的技術或基因工程技術來將一種可引起酶活性降低或缺乏的突變引入編碼該種酶的基因中。產生突變的技術的實施例包括，如：利用X光或紫外線照射的方法，以一種產生突變的試劑（如：N —甲基- -17- 本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4現格（210X 297公釐） 1235179 Α7 Β7 五、發明説明（15) Ν’一硝基一 N —亞硝基胍及此類物）來處理的方法。引入突變的基因部位可以是編碼一種酶蛋白質的編碼區域或是一種表現的調節區，如：啓動基因。基因工程技術的實施例包括，如：基因重組，基因轉移細胞融合及此類方法。例如：可將一種抗藥基因嵌入一個標的基因中以製造一種功能上未被活化的基因（缺損基因）。然後，此缺損基因被引入一個屬於腸桿菌屬或沙雷菌屬的微生物細.胞中，而在染色體上的標的基因再經由同源重組法（基因破壞）由該缺損基因所取代。無論微生物之標的酶的活性是降低了或是缺乏，此活性的降低程度可以藉著測量推薦菌種之細菌細胞萃取物或純化分液的酶活性並將它與野生種或母菌種的活性進行比較後來決定。α K G D Η的酶活性可以利用，如： '' 利得〃（Reed )等人所著的方法（L · J ·利得及Β · Β · 慕赫吉，酶的方法1 9 6 9，1 3，p 5 5〜6 1 )來測量。經濟部智.¾財產场貨工消骨合作社印災根據標的酶，可以由變種的表現型來選擇標的變種。例如：α K G D Η活性不足或降低的變種在有氧情況下無法生長在含葡萄糖的最低介質中，或者是以醋酸或L -麩胺酸爲主要碳源之最低介質中，或者是，在這些介質中的生長速度明顯降低。然而，即使在相同情況中，如果將琥珀酸或賴胺酸，蛋胺酸及二胺基庚二酸鹽加入該含葡萄糖的最低介質中，則變種仍可顯出正常的生長狀況。根據這些現象，便可選出缺少^ K G D Η活性或此種活性降低的 -18- 本纸伕尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（：!丨0X 297公釐） 1235179 A7 B7 五、發明説明（17 ) 利用。一種糖，如：葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖及此類物。還有，有機酸，如：醋酸獨使用或與其它碳來源一同使用。氨、銨鹽（如：硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、硝酸銨和此類物）。營養素，胺基酸、維他命、脂肪酸、核些東西的物質，如：腺，卡斯胺基酸（酵母萃取物，和黃豆類蛋白質的分解產當使用的是一種需要某種胺基酸或此類種時，一定要補充該介質所需之營養。磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽及此，培養可在20至42 °C，pH値是4 進行。培養可在液體培養液中培養1 0 液體培養介質中累積相當量的L -麩胺經濟部智慧財/i局a:工消費合作社印災要培養之微生物所碳來源可以是糖、麥芽糖、甘露、檸檬酸，可以單氮來源可以是銨、磷酸銨及醋酸關於有機微量酸等可使用含有這 casamino acid )，物以及此類物，且物的營養缺陷型變關於無機鹽，類物都可使用。關於培養條件至8的有氧條件下小時至4天，以在酸。培養完成後，已知方法來收集。胞後，將介質加以析法或此類技術。請先閱讀背面之意審再填 .¾ 本頁在培養介質中累積的L -麩胺酸可以用例如，可以下述方法來分離：在移除細濃縮，使產物結晶化，進行離子交換層實施例本發明將以下列實施例爲參考資料解釋得更爲淸楚 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X2^7公釐） 1235179 A7 _B7 五、發明説明（18) (1)建構具有g 1 tA基因，PPC基因和gdhA基因的質體建構帶有一個gl t基因、ppc基因和gdhA基因的質體的步驟可以經由第1圖至第5圖來解釋。將從大腸桿菌衍生而來之帶有g d h A基因的質體 p B R G D Η (曰本專利公開公報（K〇Κ Α Γ )第7 -203980 號（1995))以 Hindi I I 和 S p h I分解後再以丁4 DNA聚合酶處理切斷二端。然後，將此含有g d h A基因的D N A片斷加以純化、收集。另一方面，從大腸桿菌衍生而來之帶有g 1 t A基因和 ppc基因的質體PMWCP(W〇 97/08294) 以Xbal分解後，再以T4 DNA聚合酶處理切斷二端。將所得之質體與上述經純化後所得之帶有g d h Α基因的片段混合，再以T 4接合酶進行接合以得到質體 pMWC P G，這種質體爲進一步帶有g d hA基因的質體pMWCP (第1圖）。將以H i n d I I I和S a 1 I分解p B R G D Η後所得的帶有g d h Α基因的D Ν ·Α片段加以純化、收集後，再將它引入質體pSTV29(從”塔卡拉舒如〃（

Takara Shuzo )買得的）的 H i n d I I I — S a ί I 端，如此便可得到質體P S T V G (第2圖）。同時以No t. I分解帶有、廣一宿主一範圆"的質體 .RSF1010之複製源的質體pVIC40(日本專利公開公報第8 — 0 4 7 3 9 7號（1 9 9 6 )) ’所得之 -21 - 本紙悵尺度適用中國S家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ297公釐） 1235179 A7 __B7 五、發明説明（19) 產物再以T .1 D N A聚合酶處理，並以P s t I分解；另外，以Eco T141分解pBR322，再以 T4DNA聚合酶處理並以Ps t I分解而得到另一種產物。然後，將上述二種產物混合，並且以T 4接合酶進行接合而得到RSF - Te t質體。這種質體具有 RSF 1 〇 1 0的複製源和一種對四環素有抗性的基因（第3圖）。接下來，甩EcoRI和Ps t I來分解 pMWCPG，然後再純化、收集此帶有g 1 tA基因、經濟部智慧財/i^a (工消费合作Tl印¾ P P c基因和g d hA基因的DNA片段。類似地，先以 EcoRI和Ps t I將RSF - Te t進行分解。然後，將上述D N A片段混合，以T 4接合酶進行接合，可得到由含有g 1 tA基因，ppc基因和gdhA基因的 RSF-Tet所組成的RSFCPG質體（第4圖）。經上述方法所製得的質體R S F C P G所表現出的 g 1 tA基因，ppc基因和gdhA基因以及由質體 p STVG所表現的g cl hA基因，可以藉由缺乏 g 1 tA基因，ppc基因或者gdhA基因的大腸桿菌種之營養缺陷型的互補作用，以及各種酶之活性測量來確認。從發酵乳短桿菌衍生而來之帶有g 1 t A基因的質體可經由下述方法製得：使用帶有由SEQ ID Nos：

6和7所代表的核苷酸序列的引物來進行P C R，S E Q ID N o s ·· 6和7的選擇是以麩胺酸棒桿菌的g 1 t A -22· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 1235179 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 基因的核苷酸序列爲根據（微生物學，140，18 17 〜1828，1994)，並以發酵乳短桿菌A TCC 1 3 8 6 9的染色體D N A做爲模板以製得約3 K b的 g 1 t A基因片段。然後，將此基因片段插入以s m a I 分解的質體PHSG3 9 9 (從'Takara Shuzo 〃塔卡拉舒如購得）以得到質體p H S G C B (第5圖）。然後，以 Hi nd I I I來分解pHSGCB再把約3Kb之被切開的g 1 tA基因片段插入以Hi nd I I I分解的質體 p M W 2 1 8 (從日本基因公司購得）而得到質體 p M W C Β (第5圖）。經由上述步驟所得的質體 p M W C Β所表現出的g 1 t Α基因性質可以經由測量聚團腸桿菌A J 1 3 3 5 5的酶活性來再確認。 (2)將 RSFCPG 口1^\^〇3和口3丁7 0引入聚團腸桿菌或液化沙雷菌中並評估L -麩胺酸的產量。經濟部智慧財ι/^a;工消骨合作社印製以RSFCPG，pMWCB和pSTVG藉著電穿孔法將聚團腸桿菌ATCC 12287，聚團腸桿菌 A J 1 3 3 5 5和液化沙雷菌A T C C 1 4 4 6 0進行轉形而得到具四環素抗性的變體（米勒j . Η .:細菌基因學的簡短課程；手冊Α冷泉港實驗室出版，USA， 1 9 9 2 )。將所得到的變形菌種和母菌種種入容積爲5 0毫升的大型試管內。試管內有5毫升的培養介質，此介質中含有 :40克/升葡萄糖，20克/升硫酸銨，0 · 5克/升硫酸鎂七化合物，2克/升磷酸二氫鉀，0 · 5克/升氯本纸張尺度適用中國國家標準（〇^)/\4坭格（210/ 297公釐）〇3- 1235179 A7 _______B7 五、發明説明（21 ) 化鈉，0 · 25克/升氯化鈣七水合物，〇克/升硫酸鐵七水合物，〇 · 〇 2克/升硫酸鎂四水合物’ 〇 · 7 2笔克/升硫酸鋅一水合物，0 · 6 4毫克/升硫酸銅五水合物，〇 · 7 2毫克/升氯化鈷六水合物，〇 · 4毫克/升硼酸，丨· 2毫克/升鉬酸鈉二水合物， 2克/升酵母萃取物和3 〇克/升碳酸鈣。將菌種在3 7 C下’一邊搖動一邊培養直到培養介質內的葡萄糖完全殆盡爲止。但是，.在大約消耗1 〇克/升葡萄糖後便停止培養囷種AJ13355/pMWCB和AJ13355/ PSTVG，也就是如同其母菌種AJ 13355 —樣，將之培養1 5小時。這是因爲它們的葡萄糖消化速率較慢。在變種菌種的培養介質中加入2 5毫.克/升四環素。當完成培養時，測量培養介質內累積的L -麩胺酸所得結果列於表1。 (請先閱請背面之注意事' 項續本頁) 訂經濟部智总財產馬3:工消^合作钍印踅 -24· 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1235179 A7 B7 五、發明説明（22 ) 表1 : L 一麩胺酸的累積量細菌菌種 L -魅胺酸的累稽量 ATCC12287 〇·〇克/升 ATCC12287/RSFCPG 6.1 AJ13355 0.0 AJ13355/RSFCPG 3.3 AJ 1 3 3 5 5/PmwcB 0.8 AJ 1 335 5/pSTVG 0.8 ATCC14460 0.0 ATCC 14460/RSFCPG 2.8 只有培養介質 0.2 (請先閲讀背面之注意亨項頁) ——裝· 、-口經濟部智慧財1局3:工消骨合作ti印^ •聚團腸桿菌ATCC 12287，聚團腸桿菌 AJ 13355和液化沙雷菌ATCC 14460都沒有累積L 一麩胺酸，而引入RSFCPG來加強CS， P E P C和G D Η活性的這些菌種則各累積了 6 · 1克/ 升’ 3· 3克/升和2 . 8克/升的L 一麩胺酸。僅加強 C S活性之A J 1 3 3 5 5菌種可以累積0 . 8克/升的 L 一麩胺酸。僅加強G D Η活性的菌種也累積了〇 . 8克 /升的L 一麩胺酸。 3)聚團腸桿菌AJ13355的aKGDH基因本紙張尺度適州中國國家標準（〇化）/\4現格（210><297公釐） -25- 1235179 Α7 Β7 五、發明説明（23 ) (以下稱爲A s u c A B 〃）的選殖自聚團腸桿菌A J 1 3 3 5 5之染色體DN A中選出一段DNA片段（此片段DNA可補助缺少aKGDH -E 1次單位基因之大腸桿菌的醋酸鹽非同化作用）。依傳統用來自大腸桿菌中萃取染色體DNA的方法（塞巴蘇·高嘉古·金肯-修（生物工程實驗的教科書），曰本，發酵和生物工程協會所編輯，97〜98頁， Baifukan ，1 9 9 2 )。用來做爲媒介的 P T W V 2 2 8 (抗氨苄青黴素）是由塔卡拉舒如所生產的標識產品。以EcoT221分解AJ 13355的染色體 DNA並以Ps t I分解PTWV228，這二種產品再以丁 4接合酶進行接合，然後以此將缺少s u c A的大腸桿菌JRG465 (赫伯特等人著，分子基因遺傳學， 1 9 6 9，1 0 5，ρ · 1 8 2 )進行轉形。將可在醋酸最低介質上生長的菌種自上述所得的變種中選出來，並將從它們所萃取出之質體定爲pTWVEK 1 〇 1。帶著 PTWVEK101的大腸桿菌JRG 4 65，可恢復醋酸鹽非同化作用及琥珀酸或L -賴胺酸及L -蛋胺酸的營養缺陷型。這結果告訴我們P TW VEK 101含有聚團腸桿菌的sucA基團。第6圖所顯示的是一種自聚團腸桿菌衍生之D N A片段pTWVEKl 〇 1的限制圖譜。在第6圖中之孕育部分的核苷酸的結果顯示於SEQ ID NO:1。在此序列中，可找到二段完整的0 R F s及二段被認爲是請先閱讀背面意 Μ

經濟部智慧財1局8工消骨合作社印災本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ 297公釐） -26· 1235179 A7 B7 五、發明説明（24 ) 〇RF s之部分序列的核苷酸序列。可由這些〇rf s及其部分序列所編碼的胺基酸序列顯示於S E Q ID N〇s : 2至5，其順序是從5 ’端開始的。由這些序列之同源性分析的結果發現：所測的核苷酸序列部分含有如下群體的3 ’部分序列：琥珀酸鹽脫氫酶鐵-硫蛋白質基因（sdhB)，完整長度的sucA及aKGDH — E2次單位基因（sucB基因），及下述基因的5’部分序列：琥珀醯=C ο A合成酶/3次單位基因（s u c C 基因）。將由這些核苷酸序列所導出的胺基酸序列與由大腸桿菌之核苷酸序列所導出者進行比較（歐洲生化期刊， 1 4 1，3 5 1 — 3 5 9 ( 1 9 8 4 )，歐洲生化期刊， 141，361 〜374(1984)，及生化，24, 6245 - 6252 (1985) )，結果顯示於第7圖至第9圖。由這些結果顯示出，該胺基酸序列具有相當的同源性。同時也發現，在聚團腸桿菌的染色體上形成了一串如大腸桿菌之s dhB — s u cA — s u c B — s u c C (歐洲生化期刊，1 4 1，3 5 1 - 3 5 9 ( 1 9 8 4 )，歐洲生化期刊，1 ·4 1 ，3 6 1 — 3 7 4 ( 1984)，及生化，24，6245-6252( 1 9 8 5 ))° (4)衍生自聚團腸捍菌AJ 13355之aKGDH活性缺乏的菌種的取得方法利用依上述方法所取得之聚團腸桿菌s u c A B基因 -27- 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（21〇Χ 297公釐） 1235179 A7 __ B7_ ___ 五、發明説明（25 ) ，經由同源重組法來取得缺乏聚團腸桿菌之^ κ G D Η活性的菌種。首先，以B g 1 I I分解P T W V Ε Κ 1 0 1以去除相對應於約s u c A基因之一半以及整段s u c B基因長度的C端區域。以A c c I將一段抗氯黴素基因片段自 PHSG399塔卡拉·蘇如（Takara Shuzo )切下再將此片段插入前述之部位。以Af 1 I I及s a c I切下上述所得之 sdhB— △sucAB: :CmT—sucC 區域。將所產生之D N A片段以電穿孔的方法將聚團腸桿菌 A J 1 3 3 5 5菌種加以轉形成一種抗氯黴素的菌種，如此可得到一種缺乏s u cAB基因（其染色體上之 s u cAB基因被s u cAB ·· · CmUf取代）的聚團腸桿菌種AJ 13356。爲了確定依上述法所得之A J 1 3 3 5 6菌種缺少 a K G D Η活性’可以用利得（Re e d )的方法來決定它的酶活性（L · J ·利得及B · E ·暴赫吉，酷的卞· 請先閲讀背意享

頁經濟部智.¾財產苟肖工消赍合作社印製中活種 2 Η 菌表 D 的如 G Β , K A 果ac 結得 U 〇測 S } 法乏 1 無缺 6 中之 ~ 種要 5 菌需。 5.6 所 • 5 是 Ρ 3 種， 3 菌 3 1 此 1 J 定，Α 確 9 可 6 的此 9 示因 1 顯，法所性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 28 1235179 A7 _____B7 五、發明説明（26 ) 表2 : α K G D Η活性細菌菌種 a KGDH活性 ____ (△ ABS/分/毫克蛋白質） AJ13355 · 0.481 _ AJ 1 3356_ <0.0001 (5 ) α K G D Η活性缺乏之聚團腸桿菌種的L 一麩胺酸生產量的評估將A J 13355及AJ 13356菌種各種入一個 5 0 0毫升大的三角錐瓶中，此三角錐瓶內含有2 0毫升之培養介質’介質內含有：40克/升葡萄糖，20克/ 升硫酸銨，0 · 5克/升硫酸鎂七水合物，2克/升磷酸二氫鉀，0 · 5克/升氯化鈉，〇 . 2 5克/升氯化鈣七水合物’ 0 · 02克/升硫酸鐵七水合物，〇 · 〇2克/ 升硫酸鎂四水合物，0 · 7 2毫克/升硫酸鋅二水合物， 0 · 64毫克/升硫酸銅五水合物，〇 · 72毫克/升氯化鈷六水合物，0 · 4毫克/升硼酸，1 · 2毫克/升鉬酸鈉二水合物，2克/升酵母萃取物，3 0克/升碳酸鈣，2 0 0毫克/升一鹽酸L 一賴胺酸，2 0 0毫克/升L 一蛋胺酸及2 0 0毫克/升DL - α，ε -二胺基庚二酸 (DAP)。將此錐瓶在3 7 °C下培養並且一邊搖動直至培養介質中所含的葡萄糖消耗完畢。當培養完成後，測量培養介質中所累積的L -麩胺酸及α -氧代戊二酸（以下本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（21〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 Ρ 本頁) 經濟部智Μ)財1局只工消骨合作fi印％ -29- 1235179 Λ： ____Η7__五、發明說明（27 ) 縮寫爲、aKG〃）。結果顯示於表3。表3:累積的L一麩胺酸及aKG的量細菌菌種累積的L 一麩胺酸量累積的a KG量 AJ13355 AJ13356 〇.〇克/升 1.5 〇.〇克/升 3.2 缺乏α K G D Η活性之A J 1 3 3 5 6菌種累積了 • 5克/升之L 一麩胺酸並同時累積了 3 · 2克/升之 K G 。二八二-7♦ (6 )將 R S F C 桿菌種中並評估L 將 A J 1 3 3 將所產生之A J 1 5 0 0毫升大小的介質，而介質中含銨，0 · 5克/升 ’ 〇 · 5克/升氯 ’ 〇 · 〇 2克/升鎂四水合物，〇 . 0 · 6 4毫克/升化鈷六水合物，〇 P G引入缺少α K G D Η活性之聚團腸麩胺酸的產量 5 6菌種以 3 3 5 6 / 三角錐瓶內有4 0克/ 硫酸錶七水化鈉，0 . 硫酸鐵七水 7 2毫克/ 硫酸銅五水 • 4毫克/ R S F R S F ，其中升葡萄合物， 2 5克合物，升硫酸合物，升硼酸 C P G進行轉形，並 C P G菌種種入一個含有2 0毫升之培養糖、2 0克/升硫酸 2克/升磷酸二氫鉀 /升氯化耗七水合物〇 · 0 2克/升硫酸鋅‘二水合物，〇 · 72_克/升氯，1 · 2毫克/升鉬 (請先間磺背面之注意事項 ^^衣i 本頁

— — — — — — 一 =°J· ϋ n ϋ n n n ϋ I 今 1235179 A7 B7 五、發明説明（28 ) 酸鈉二水合物，2克/升酵母萃取物，2 5毫克/升四環素，30克/升碳酸鈣，2 00毫克/升一鹽酸L 一麩胺酸，2 0 0毫克/升L 一蛋胺酸及2 0 0毫克/升DL -αε — DAP。將此錐瓶在37 °C下培養並且一邊搖動直至培養介質中所含有的葡萄糖被用盡。當培養完成後，測量在培養介質中所累積的L -麩胺酸及α K G。結果顯示於表4。表4 : L 一麩胺酸及aKG的累積量請先閱讀背面之萆

細菌菌種 L-麩胺酸的累積量 a KG的累積量 AJ13356 1.4克/升 2.9克/升 AJ13356/RSFCPG 5.1 0.0 在經由引入R SFCPG後使其CS， ’ P E P C 及 G D Η活性放大的菌種內，其中所累積的c L -麩胺酸的累積量則增加了。 κ K G量降低但經濟部智^財/l^H工消赍合作Ti印鉍本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） -31 · 經濟部智慧財產局β工消Φ合作社印^ 1235179 A7 B7 五、發明説明（29) 序列表 <110>阿吉諾莫托公司 <120>生產L -鞋胺酸的細囷以及生產^-魅胺酸的方法 <130〉 <150> JP 10-69068 <151〉 1998-03-18 <150> JP 10-297129 <151〉1998-1 CM 9 <160> 7 <170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 <211> 4556 <212〉 DNA <213>聚團腸桿菌 <220〉 <221> CDS <222〉（2)..(121) <220〉

<221> CDS <222〉（322)..(3129) <220〉

<221〉 CDS <222〉（3145)..(4368) <220>

<221〉 CDS <222〉（4437)..(4556) <400> 1 t gca ttc age gtt ttc ege tgt cac age ate atg aac tgt gta agt gtt 49 Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser lie Met Asn Cys Val Ser Val 15 1〇 15 tgt cct aaa ggg eta aac ccg aeg ege get ate ggc cac att aag teg 97

Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala lie Gly His He Lys Ser 20 25 30 atg ctg ctg caa ege age geg tagttatacc accgggaacc tcaggttccc 148 Met Leu Leu Gin Arg Ser Ala 35 ggtattttac ggaagcctct gtaaacgcgg tcccaaccac gtttacaaag gttcccttac 208 gggccgggcg cgcgctgcgc acagtgctcg tatcgctgaa ctcactacgg caaaccgcga 268 aagcggcaac aaatgaaacc tcaaaaaagc ataacattgc ttaagggatc aca atg 324

Met 1 cag aac age geg atg aag ccc tgg ctg gac tee tee tgg ctg gee ggc 372

Gin Asn Ser Ala Met Lys Pro T「p Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala Gly 5 10 15 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 太、11 本紙悵尺度適;Π中國囤家標苹（CNS ) Λ4坭格（210X 297公釐） -32 - 1235179 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) gcg aat cag tct tac ata gag caa etc tat gag gat ttc ctg acc gat 420

Ala Asn Gin Ser Tyr lie Glu Gin Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr Asp 20 25 30 ect gac tct gtg gat gca gtg tgg ege teg atg ttc caa cag tta cca 468

Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gin Gin Leu Pro 35 40 45 ggc aeg gga gtg aaa cct gag cag ttc cac tee gca act ege gaa tat 516 G*iy Thr Gly Val Lys Pro Glu Gin Phe His Ser Ala Thr Arg Glu Ty「 50 55 60 65 ttc cgt ege ctg gcg aaa gac gca tct cgt tac acc tee tea gtt acc 564

Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser A「g Tyr Thr Se「 Ser Val Th「 70 75 80 gat ccg gca acc aac tee aaa caa gtg aaa gtg ctg cag ctg att aac 612

Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gin Val Lys Val Leu Gin Leu He Asn 85 90 95 gcg ttt cgt ttc ege gga cat cag gaa gca aat etc gat ccg ett ggc 660

Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gin Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu Gly 100 105 110 ctg tgg aaa cag gac ege gtt gee gat etc gat cct gee ttt cac gat 708

Leu Trp Lys Gin Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His Asp 115 120 125 ctg acc gac gee gat ttt cag gaa age ttt aac gta ggt tct ttt gee 756

Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gin Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe Ala 130 135 140 145 att ggc aaa gaa acc atg aag ctg gee gat ctg ttc gac gcg ctg aag 804 lie Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu Lys 150 155 160 cag acc tac tgt ggc teg att ggt gca gag tat atg cac ate aat aac 852

Gin Thr Tyr Cys Gly Ser He Gly Ala Glu Tyr Met His He Asn Asn 165 170 175 acc gaa gag aaa ege tgg ate cag cag cgt ate gaa tee ggt gcg age 900

Thr Glu Glu Lys Arg Trp He Gin Gin Arg He Glu Ser Gly Ala Ser 180 185 190 cag aeg tea ttc agt ggc gaa gag aaa aaa ggt ttc ctg aaa gag ctg 948 經濟部智慧財/i^7a〔工消赀合作fl印％

Gin Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lyg Gly Phe Leu Lys Glu Leu 195 200 205 acc gcg gca gaa ggg ctg gaa aaa tat ctg ggc gcg aaa ttc ccg ggt 996

Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly 210 215 220 225 gca aaa cgt ttc teg ctg gaa ggc ggt gat gcg ctg gtg ccg atg ctg 1044

Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met Leu 230 '235 240 ege gag atg att cgt cat gcg ggc aaa age ggc aca cgt gaa gtg gta 1092

Arg Glu Met He Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val Val 245 250 255 ctg ggg atg gcg cac cgt ggc cgt ett aac gta ctg att aac gta ctg 1140

Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu He Asn Val Leu -33- 本紙張尺度適用中因國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公总） 1235179 A7 B7 五、發明説明（31) 260 265 270 ggt aaa aag cca cag gat ctg ttc gac gaa ttc tcc ggt aaa cac aaa 1188

Gly Lys Lys Pro Gin Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His Lys • 275 280 285 gag cat ctg ggc acc ggt gat gtg aag tat cac atg ggc ttc tct teg 1236

Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser 290 295 300 305 gat att gaa acc gaa ggt ggt ctg gtg cat ctg geg ctg geg ttt aac 1284

Asp lie Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn 310 315 320 ccg tct cac ctg gaa att gtc age ccg gtg gtc atg gga teg gta cgt 1332

Pro Ser His Leu Glu lie Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val Arg 325 330 335 gca cgt etc gat cgt ctg gcc gaa ccg gtc age aat aaa gtg ttg cct 1380

Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu Pro 340 345 350 ate acc att cac ggt gat geg geg gtg att ggt cag ggc gtg gtt cag 1428

He Thr lie His Gly Asp Ala Ala Val lie Gly Gin Gly Val Val Gin 355 360 365 gaa acc ctg aac atg tct cag geg ege ggc tac gaa gtg ggc ggc aeg U76

Glu Thr Leu Asn Met Ser Gin Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr 370 375 380 385 gta cgt ate gtc att aac aac cag gtt ggt ttt acc acc tcc aac ccg 1524.

Val Arg lie Val He Asn Asn Gin Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro 390 395 400 • aaa gat geg cgt tea acc ccg tac tgt act gac ate ggc aag atg gtg 1572

Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp lie Gly Lys Met Val 405 410 415 ctg gca ccg att ttc cac gtc aat get gac gat ccg gaa geg gtg gcc 1620

Leu Ala Pro lie Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala 420 425 430 ttt gtt acc ege ctg geg ctg gac tat ege aac acc ttc aaa ege gat 1668

Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp 435 440 * 445 gtg ttt ate gat ctg gtg tgc tat ege cgt cat ggt cac aac gag geg 1716

Val Phe He Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala 450 455 460 465 gat gag cca agt get acc cag ccg ttg atg tac cag aaa ate aaa aag 1764

Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gin Pro Leu Met Tyr Gin Lys lie Lys Lys 470 475 480 cat ccg aeg ccg cgt aaa att tac gcc gat cgt ctg gaa ggc gaa ggt 1812

His Pro Thr Pro Arg Lys He Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu Gly 485 490 495 gtc geg teg cag gaa gat gcc acc gag atg gtg aac ctg tac ege gat 1860

Val Ala Ser Gin Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp 500 505 510 geg etc gat geg ggc gaa tgc gtg gtg ccg gaa tgg cgt ccg atg age 1908 帽_縣（CNS )赠格 (210X 297^^1 :34 - (請先閱讀背面之注意事項本頁) 木

，1T 經濟部智慧时/i芍：H工消費合作fl印¾ 1235179 A7 B7 五、發明説明（32 )

Sla Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu T「p Arg Pro Met Se「 515 520 - 525 ctg cac tcc ttc acg tgg teg cct tat ctg aac cac gaa tgg gat gag 1956

Leu His Ser Phe Thr T卬 Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu 530 535 540 545 cct tat ccg gca cag gtt gac atg aaa ege ctg aag gaa ctg gca ttg 2004

Pro Tyr Pro Ala Gin Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu 550 555 560 cgt ate age cag gtc cct gag cag att gaa gtg cag teg ege gtg g*cc 2052 A「g lie Ser Gin Val Pro Glu Gin .lie Glu Val Gin Ser Arg Val Ala 565 570 575 aag ate tat aac gat ege aag ctg atg gee gaa ggc gag aaa geg ttc 2100

Lys lie Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala Phe 580 585 590 gac tgg ggc ggt gee gag aat ctg geg tac gee acg ctg gtg gat gaa 2148

Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu 595 600 605 ggt att ccg gtt ege etc teg ggt gaa gac tec ggt cgt gga acc ttc 2196

Gly He Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe 610 615 620 625 ttc cat ege cac geg gtc gtg cac aac cag get aac ggt tea acc tat 2244

Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gin Ala Asn Gly Ser Thr Tyr 630 635 640 acg ccg ctg cac cat att cat aac age cag ggc gag ttc aaa gtc tgg 2292

Thr Pro Leu His His lie His Asn Ser Gin Gly Glu Phe Lys Val Trp 645 650 655 gat teg gtg ctg tet gaa gaa geg gtg ctg geg ttt gaa 'tac ggt tac 2340

Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr 660 665 670 gee acg get gag ccg ege gtg ctg acc ate tgg gaa geg cag ttt ggt 2388

Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr He Trp Glu Ala Gin Phe Gly 675 680 685 gac ttt gee aac ggt get cag gtg gtg att gac cag ttc ate age tet 2436

Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gin Val Val lie Asp Gin Phe lie Ser Ser 經濟部智慧財/i^7H工消骨合作社印％ 690 695 700 705 ggc gaa cag aag tgg ggc cgt atg tgt ggc ctg gtg atg ttg ctg ccg 2484

Gly Glu Gin Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro 710 715 720 cat ggc tac gaa ggt cag gga ccg gaa cac tec tet gee cgt ctg gaa 2532

His Gly Tyr Glu Gly Gin Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu 725 730 735 ege tat ctg caa ett tgc gee gag cag aac atg cag gtt tgc gtc ccg 2580

Arg Tyr Leu Gin Leu Cys Ala Glu Gin Asn Met Gin Val Cys Val Pro 740 745 750 teg acg ccg get cag gtg tat cac atg ctg ege cgt cag geg ctg ege 2628

Ser Thr Pro Ala Gin Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gin Ala Leu Arg 755 760 765 35 - 本紙張尺度適州中國國家標羊（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 1235179 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消^合作社印焚五、發明説明（ ggg atg cgc Gly Met Arg 770 cat cca ctg His Pro Leu cag ccg gcc Gin Pro Ala cgc gtc gtg Arg Val Val 820 cgt cgt aaa Arg Arg Lys 835 ctt tac ccg Leu Tyr Pro 850 tct cac gta Ser His Val ggc gcc tgg Gly Ala Trp ggt gcc acc Gly Ala Thr 900 gtg ggt tat Val Gly Tyr 915 gac gca ctg Asp Ala Leu 930 att etc gtt lie Leu Val acc tgg cac Thr Trp His gtc gaa att Val Glu lie 40 gat ggc gtg Asp Gly Val 55 tcc cgc cag Ser Arg Gin 33 ) cgt ccg Arg Pro geg ate Ala lie 790 att ggt He Gly 805 ctg tgc Leu Cys gac gag Asp Glu ttc ccg Phe Pro cag gac Gin Asp 870 tac tgt Tyr Cys 885 ctg cgt Leu Arg atg tcc Met Ser aac gtc Asn Val ccc gac Pro Asp 10 aag aaa Lys Lys 25 gaa act Glu Thr ctg gaa Leu Glu ctg gtg gtg atg teg ccg aag teg ctg tta cgc Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg 775 780 785 teg teg ctg gat gaa ctg gca aac ggc agt ttc Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Se「 Phe 795 800 gag ate gac gat ctg gat ccg cag ggc gtg aaa Glu He Asp Asp Leu Asp Pro Gin Gly Val Lys 810 815 tcc ggt aag gtt tac tac gat ctg ctg gaa cag Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gin 825 830 aaa acc gat gtt gcc ate gtg cgc ate gaa cag Lys Thr Asp Val Ala He Val Arg He Glu Gin 840 845 cat cag geg gta cag gaa gca ttg aaa gcc tat His Gin Ala Val Gin Glu Ala Leu Lys Ala Tyr 855 860 865 ttt gtc tgg tgc cag gaa gag cct ctg aac cag Phe Val Trp Cys Gin Glu Glu Pro Leu Asn Gin 875 880 age cag cat cat ttc cgt gat gtc gtg ccg ttt Ser Gin His His Phe Arg Asp Val Val Pro Phe 890 895 tat gca ggt cgc ccg gca teg get tct ccg gcc Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala 905 910 gta cac caa caa cag cag· caa gac ctg gtt aat Val His Gin Gin Gin Gin Gin Asp Leu Val Asn 920 925 aat taattaaaag gaaagata atg agt age gta gat Asn Met Ser Ser Val Asp 935 1 5 ctg cct gaa -teg gtt gca gat gcc aca gta gca Leu Pro Glu Ser Val Ala Asp Ala Thr Val Ala 15 20 cca ggc gat gca gtc age cgc gat gaa gtc ate Pro Gly Asp Ala Val Ser Arg Asp Glu Val lie 30 35 gac aaa gtc gtg ctg gaa gtg ccg gca tct gcc Asp Lys Val Val Leu Glu Val Pro Ala Ser Ala 45 50 gcc gtg ctg gaa gac gaa ggg gca acc gtt aeg Ala Val Leu Glu Asp Glu Gly Ala Thr Val Thr 60 65 ggt cgc ctg aaa gaa ggc aac agt geg ggt aaa Gly Arg Leu Lys Glu Gly Asn Ser Ala Gly Lys 2676 2724 2772 2820 2868 2916 2964 3012 3060 3108 3159 3207 3255 3303 3351 3399 ate ctg lie Leu

本紙伕尺度適用中國囡家標準（CNS ) A4坭格（21〇x 297公釐 -36 -

A7 B7 1235179 五、發明説明（34) 客:7〇 75 80 85 gaa age agt gcc aaa gcg gaa age aat gac acc acg cca gcc cag cgt 3447

Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr Thr Pro Ala Gin Arg 90 95 100 cag aca geg teg ett gaa gaa gag age age gat geg etc age ccg geg 3495

Gin Th「 Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp Ala Leu Ser Pro Ala 105 110 115 ate cgt ege ctg att geg gag cat aat ett gac get geg cag ate aaa 3543 lie A「g Arg Leu lie Ala Glu His Asn Leu Asp Aia Ala Gin lie Lys 120 125 130 ggc acc ggc gta ggc gga cgt tta aeg cgt gaa gac gtt gaa aaa cat 3591

Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu Asp Val Glu Lys His 135 140 145 ctg geg aac aaa ccg cag get gag aaa gee gee geg cca geg geg ggt 3639

Leu Ala Asn Lys Pro Gin Ala Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly 150 155 160 165 gca gca aeg get cag cag cct gtt gee aac ege age gaa aaa cgt gtt 3687

Ala Ala Thr Ala Gin Gin Pro Val Ala Asn Arg Ser Glu Lys Arg Val 170 175 180 ccg atg aeg cgt tta cgt aag ege gtc geg gag cgt ctg ctg gaa gee 3735

Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys A「g Val Ala Glu Arg Leu Leu Glu Ala 185 190 195 aag aac age acc gee atg ttg aeg acc ttc aac gaa ate aac atg aag 3783

Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu lie Asn Met Lys 200 205 210 ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggc gat geg ttc gag aag cgt 3831

Pro He Met Asp Leu Arg Lys Gin Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Lys Arg 215 220 225 cac ggt gtg cgt ctg ggc ttt atg tet ttc tac ate aag gee gtg gtc 3879

His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr He Lys Ala Val Val 230 235 240 245 gaa geg ctg aag cgt tat cca gaa gtc aac gee tet ate gat ggc gaa 3927

Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser He Asp Gly Glu 250 255 260 經濟部智.¾时1¾¾工消^合作fi印¾ gac gtg gtg tac cac aac tat ttc gat gtg agt att gee gtc tet aeg 3975

Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser lie Ala Val Ser Thr 265 270 275 cca ege gga ctg gtg aeg cct gtc ctg cgt gac gtt gat geg ctg age 4023

Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Ala Leu Ser 280 285 290 atg get gac ate gag aag aaa att aaa gaa ctg gca gtg aaa ggc cgt 4071

Met Ala Asp He Glu Lys Lys lie Lys Glu Leu Ala Val Lys Gly Arg 295 300 305 gac ggc aag ctg aeg gtt gac gat ctg aeg ggc ggt aac ttt acc ate 4119

Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly Gly Asn Phe Thr lie 310 315 320 325 4167 acc aac ggt ggt gtg ttc ggt teg ctg atg tet aeg cca ate ate aac 本紙悵尺度適用中國囤家標準（CNS ) Λ4現格（210X 297公；II ) 1235179 A7 B7 五、發明説明（35 )

Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Th「Pro lie lie Asn 330 335 340 ccg cca cag age gegatt ctg ggc atg cac gcc att aaa gat cgt cct 4215

Pro Pro Gin Ser Ala lie Leu Gly Met His Ala lie Lys Asp Arg Pro 345 350 355 atg geg gtc aat ggt cag gtt gtg ate ctg cca atg atg tac ctg get 4263

Met Ala Val Asn Gly Gin Val Val lie Leu Pro Met Met Tyr Leu Ala 360 365 370 etc tcc tac gat cac cgt tta ate gat ggt cgt gaatet gtc ggc tat 4311

Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu He Asp Gly Arg Glu Ser Val Gly Tyr 375 380 385 ctg gtc geg gtg aaa gag atg ctg gaa gat ccg geg cgt ctg ctg ctg 4359

Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro Ala Arg Leu Leu Leu 390 395 400 405 gat gtc tgattcatca ctgggcacgc gttgcgtgcc caatctcaat actcttttca 4415 Asp Val gatctgaatg gatagaacat c atg aac tta cac gaa tac.cag get aaa cag 4466

Met Asn Leu His Glu Tyr Gin Ala Lys Gin 1 δ 10 ctg ttt gca egg tat ggc atg cca gca ccg acc ggc tac gcc tgt act 4514

Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Th「 15 20 25 aca cca cgt gaa gca gaa gaa geg gca teg aaa ate ggt gca 4556

Thr Pro Arg Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Lys lie Gly Ala 30 35 40

<210〉 2 <211> 39 <212> PRT <213>聚團腸桿菌 <400> 2 *

Ala Phe Ser Val Phe A「g Cys His Ser lie Met Asn Cys Val Ser Val 15 10 15

Cys P「o Lys Gly Leu Asn Pro Thr A「g Ala lie Gly His lie Lys Ser 20 25 30

Met Leu Leu Gin Arg Ser Ala 35

<210> 3 <211> 935 <212> PRT <213>聚團腸桿菌 <400> 3

Met Gin Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala 15 10 15

Gly Ala Asn Gin Ser Tyr lie Glu Gin Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr -38- 本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 1235179 A7 B7 五、發明説明（36) 20 25 30 Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gin Gin Leu 35 40 45

Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gin Phe His Ser Ala Thr Arg Glu 50 55 60

Tyr Phe Arg A「g Leu Ala Lys Asp Ala Se「 A「g Ty「 Thr Ser Ser Val 65 70 75 80

Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gin Val Lys Val Leu Gin Leu lie 85 90 95

Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gin Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu 100 105 110

Gly Leu Trp Lys Gin Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His 115 120 125

Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gin Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe 130 135 140

Ala lie Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu U5 150 155 160

Lys Gin Thr Tyr Cys Gly Ser He Gly Ala Glu Tyr Met His He Asn 165 170 175

Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp lie Gin Gin Arg lie Glu Se「Gly Ala 180 185 190

Ser Gin Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu 195 200 205

Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro 210 215 220

Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met 225 230 235 240

Leu Arg Glu Met He Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val 245 250 255

Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu lie Asn Val 260 265 270

Leu Gly Lys Lys Pro Gin Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His 275 280 285

Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser 290 295 300 經濟部智慧財/i^a (工消Φ合作fi印¾

Ser Asp lie Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe 305 310 315 320

Asn Pro Ser His Leu Glu He Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val 325 330 335

Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu 340 345 350

Pro lie Thr lie His Gly Asp Ala Ala Val He Gly Gin Gly Val Val 355 360 365

Gin Glu Thr Leu Asn Met Ser Gin Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly 370 375 380

Thr Val Arg lie Val lie Asn Asn Gin Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn 385 390 395 4〇n -39- 本紙張尺度適用中國囤家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） 1235179 A7 B7 經濟部智慧財1^7肖工消％u7合作社印焚

Pro Tyr Cys Thr Asp He Gly Lys Met 410 415 Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val 425 430 Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg 440 445 Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu 460 Gin Pro Leu Met Tyr Gin Lys lie Lys 475 480 He Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu 490 495 Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg 505 510 Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met 520 525 Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp 540 Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala 555 560 Glu Gin lie Glu Val Gin Ser Arg Val 570 575 Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala 585 590 Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp 600 605 Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr 620 Val His Asn Gin Ala Asn Gly Ser Thr 635 640 His Asn Ser Gin Gly Glu Phe Lys Val 650 655 Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly 665 670 Val Leu Thr lie Trp Glu Ala Gin Phe 680 685 Gin Val Val He Asp Gin Phe lie Ser 700 Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu 715 720 Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu 730 735 Ala Glu Gin Asn Met Gin Val Cys Val 745 750 Tyr His Met Leu Arg Arg Gin Ala Leu 760 765 Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu 五、發明説明（37)

Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr 405

Val Leu Ala Pro He Phe His 420

Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala 435

Asp Val Phe He Asp Leu Val 450 455

Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr 465 470

Lys His Pro Thr Pro Arg Lys 485

Gly Val Ala Ser Gin Glu Asp 500

Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu 515

Ser Leu His Ser Phe Thr Trp 530 535

Glu Pro Tyr Pro Ala Gin Val 545 550

Leu Arg lie Ser Gin Val Pro 565

Ala Lys lie Tyr Asn Asp Arg 580

Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu 595

Glu Gly lie Pro Val Arg Leu 610 615

Phe Phe His Arg His Ala Val 625 630

Tyr Thr Pro Leu His His He 645

Trp Asp Ser Val Leu Ser Glu 660

Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg 675

Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala 690 695

Ser Gly Glu Gin Lys Trp Gly 705 710

Pro His Gly Tyr Glu Gly Gin 725

Glu Arg Tyr Leu Gin Leu Cys 740

Pro Ser Thr Pro Ala Gin Val 755

Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -40- 1235179 A7 B7 經濟部智洛財產局3:工消費合作社印災五、發明说明（38 ) 770 775 780 Arg His Pro Leu Ala He Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser 785 790 795 800 Phe Gin Pro Ala He Gly Glu He Asp Asp Leu Asp Pro Gin Gly Val 805 810 815 Lys Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu 820 825 830 Gin Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala lie Val Arg lie Glu 835 840 845 Gin Leu Tyr Pro Phe Pro His Gin Ala Val Gin Glu Ala Leu Lys Ala 850 855 860 Tyr Ser His Val Gin Asp Phe Val Trp Cys Gin Glu Glu Pro Leu Asn 865 870 875 880 Gin Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gin His His Phe Arg Asp Val Val Pro 885 890 895 Phe Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro 900 905 910 Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gin Gin Gin Gin Gin Asp Leu Val 915 920 925 Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn 930 935 <210〉4 <211> 407 <212〉 PRT <213> Enterobacter agglomerans <400〉 4 Met Ser Ser Val Asp He Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala 1 5 10 15 Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser 20 25 30 Arg Asp Glu Val He Val Glu He Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu 35 40 45 Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu 50 55 60 Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gin He Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly 65 70 75 80 Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr 85 90 95 Th「 Pro Ala Gin Arg Gin Th「 Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Se「 Asp 100 105 110 Ala Leu Ser Pro Ala lie Arg Arg Leu lie Ala Glu His Asn Leu Asp 115 120 125 Ala Ala Gin lie Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu 130 135 140 Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gin Ala Glu Lys Ala Ala 145 150 155 160 (請先閱讀背面之注意事項 $-- 的本I)

1T 線本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） -41 - 1235179 A7 B7 經濟部智慧財1局員工消費合作社印製五、發明説明（39 ) Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gin Gin Pro Val Ala Asn Arg 165 170 175 Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu 180 185 190 Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn 195 200 205 Glu He Asn Met Lys Pro lie Met Asp Leu Arg Lys Gin Tyr Gly Asp 210 215 220· Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr 225 230 235 240 He Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala 245 250 255 Ser lie Asp Gly Glu Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser 260 265 270 lie Ala Val Ser Th「Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp 275 280 285 Val Asp Ala Leu Ser Met Ala Asp He Glu Lys Lys lie Lys Glu Leu 290 295 300 Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly 305 310 315 320 Gly Asn Phe Thr He Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser 325 330 335 Thr Pro lie lie Asn Pro Pro Gin Ser Ala lie Leu Gly Met His Ala 340 345 350 He Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gin Val Val He Leu Pro 355 3B0 365 Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu lie Asp Gly Arg 370 375 380 · ^ Glu Ser Val Gly Tyr Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro 385 390 395 400 Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val 405 <210〉 5 <211> 40 <212> PRT <213>聚團腸桿菌 <400> 5 Met Asn Leu His Glu Tyr Gin Ala Lys Gin Leu Phe Ala Arg Tyr Gly 15 10 15 Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu 20 25 . 30 Glu Ala Ala Ser Lys He Gly Ala 35 40 <210> 6 <211〉 30 (請先閱讀背面之注意事項 --裝本頁)

*1T 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X297公釐） -42- 1235179 A7 B7 五、發明説明（4〇 )

<212>DNA <213>人工合成的序列 <220> <223>人工合成序列的說明：引物 < 4 0 0 > 6 gtcgacatta gccygaatct gttctggtcg

<210>7 <211>30 <212>DNA <213>人工合成的序列 <220〉 <223>人工合成序列的說明：引物 <400>7 aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt 經濟部智.¾財是局a:工消费合作社印製本紙悵尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） -43-

Claims

告太: Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍第8 8 1 0425 5號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國9 3年8月13日修正 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 · 一種製造L -麩胺酸之方法，其包含於液體培養基中培養微生物以產製並於該培養基中累積L -麩胺酸，及自該培養基收集L -魅胺酸，其中該微生物具有產製 L-魅fl女酸之目b力’且係衍生自聚團腸桿菌屬（Enterobacter agglomerans )或液化沙雷菌屬（Serratia liquefacience ) ，且亦具有至少1種下述之性質： (a )該微生物係經修飾以增加至少1種催化l -麩胺酸之生合成反應的酶之活性，該酶係選自選自檸檬酸合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及麩胺酸脫氫酶中；及 (b )該微生物係經修飾以降低或缺乏α -酮基戊二酸脫氫酶之活性。 2 · —種具有產製L-麩胺酸之能力的微生物，其爲衍生自聚團腸桿菌（Enterobacter agglomerans )或液化沙雷菌（Serratia liquefacience )，且具有至少1種下述之性質經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (a )該微生物係經修飾以增加至少1種催化l 一麩胺酸之生合成反應的酶之活性，該酶係選自選自檸檬酸合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及麩胺酸脫氫酶中；及 (b )該微生物係經修飾以降低或缺乏α -酮基戊二酸脫氫酶之活性。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）