ES2327838T3 - Bacteria productora de acido l-glutamico y procedimiento para la preparacion de acido l-glutamico. - Google Patents

Bacteria productora de acido l-glutamico y procedimiento para la preparacion de acido l-glutamico. Download PDF

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Abstract

Microorganismo perteneciente al género Serratia, que presenta una capacidad para la preparación de ácido Lglutámico y que presenta las actividades aumentadas de la totalidad de citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, y glutamato deshidrogenasa en comparación con las cepas sin transformar o sin mutar.

Description

Bacteria productora de ácido L-glutámico y procedimiento para la preparación de ácido L-glutámico.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a una nueva bacteria productora de ácido L-glutámico así como a un procedimiento para la preparación de ácido L-glutámico mediante fermentación utilizando la misma. El ácido L-glutámico es un aminoácido importante como alimento, fármaco y similares.
El ácido L-glutámico se ha producido convencionalmente mediante procedimientos de fermentación utilizando las denominadas bacterias corineformes productoras de ácido L-glutámico, las cuales pertenecen principalmente a los géneros Brevibacterium, Corynebacterium y Microbacterium o variantes de los mismos ("Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center, páginas 195-215, 1986). Como procedimientos para la preparación de ácido L-glutámico mediante fermentación utilizando otras cepas bacterianas, se conocen procedimientos que utilizan microorganismos de los géneros Bacillus, Streptomyces, Penicillium y similares (patente US nº 3.220.929), los procedimientos que utilizan microorganismos de los géneros Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida y similares (patente US nº 3.563.857), los procedimientos que utilizan microorganismos de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Serratia y similares o Aerobacter aerogenes (actualmente conocido como Enterobacter aerogenes) (publicación de patente japonesa (KOKOKU) nº 32-9393 (1957)), el procedimiento que utiliza cepas variantes de Escherichia coli (solicitud de patente japonesa abierta a la inspección pública (KOKAI) nº 5-244970 (1993)), y similares.
Aunque la productividad del ácido L-glutámico ha mejorado considerablemente mediante la mejora genética de los microorganismos mencionados anteriormente o mediante la mejora de los procedimientos de producción, aún se desea desarrollar un procedimiento más económico y eficaz para la preparación de ácido L-glutámico para hacer frente al marcado incremento esperado de futuras demandas del aminoácido.
El documento FR-A-2738014 da a conocer un microorganismo productor de glutamato con actividad aumentada de la citrato sintasa y la fosfoenolpiruvato carboxilasa.
Sumario de la invención
El objetivo de la presente invención consiste en encontrar una bacteria productora de ácido L-glutámico que presente una elevada capacidad para la preparación de ácido L-glutámico, desarrollando así un procedimiento más económico y eficaz para la preparación de ácido L-glutámico.
Para alcanzar el objetivo mencionado anteriormente, los presentes inventores buscaron y estudiaron intensamente microorganismos que presentaran la capacidad para la preparación de ácido L-glutámico y fuesen distintos de los microorganismos mencionados anteriormente. Como resultado, los presentes inventores encontraron que ciertas cepas derivadas de microorganismos pertenecientes al género Enterobacter o Serratia presentaban una elevada capacidad para la preparación de ácido L-glutámico, y han realizado la presente invención.
Así, la presente invención proporciona:
(1)
Un microorganismo perteneciente al género Serratia, que presenta una capacidad para la preparación de ácido L-glutámico y que presenta actividades aumentadas de la totalidad de citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, y glutamato deshidrogenasa cuando es comparado con las cepas no transformadas o no mutadas.
(2)
El microorganismo según (1) anterior, que es Serratia liquefaciens.
(3)
Un procedimiento para la preparación de ácido L-glutámico que comprende el cultivo de un microorganismo tal como se define en cualquiera de los puntos (1) a (2) anteriores en un medio de cultivo líquido para producir y acumular ácido L-glutámico en el medio de cultivo, y recoger el ácido L-glutámico a partir del medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
El microorganismo de la presente invención presenta actividades aumentadas de la totalidad de citrato sintasa (a la que se hace referencia como "CS" a continuación en la presente memoria), fosfoenolpiruvato carboxilasa (a la que se hace referencia como "PEPC" a continuación en la presente memoria), y glutamato deshidrogenasa (a la que se hace referencia como "GDH" a continuación en la presente memoria).
Puesto que el microorganismo de la presente invención presenta una alta capacidad para la preparación de ácido L-glutámico, se considera posible impartir una capacidad de producción aún más elevada al microorganismo mediante la utilización de técnicas de mejora genética conocidas previamente para bacterias corineformes productoras de ácido L-glutámico y similares, y se espera contribuir al desarrollo de un procedimiento más económico y eficaz para la preparación de ácido L-glutámico mediante la selección apropiada de las condiciones de cultivo y similares.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la construcción de un plásmido pMWCPG que presenta un gen gltA, un gen ppc y un gen gdhA.
La figura 2 muestra la construcción de un plásmido pSTVG que presenta el gen gdhA.
La figura 3 muestra la construcción de un plásmido RSF-Tet que presenta un origen de replicación de un plásmido RSF1010 de amplio rango de huésped y un gen de resistencia a tetraciclina.
La figura 4 muestra la construcción de un plásmido RSFCPG que presenta el origen de replicación del plásmido RSF1010 de amplio rango de huésped, el gen de resistencia a tetraciclina, el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA.
La figura 5 muestra la construcción de un plásmido pMWCB que presenta el gen gltA.
La figura 6 muestra un mapa de restricción de un fragmento de ADN de pTWVEK101 derivado a partir de Enterobacter agglomerans.
La figura 7 muestra la comparación de una secuencia aminoacídica deducida a partir de una secuencia nucleotídica de un gen sucA derivado a partir de Enterobacter agglomerans con la de un gen sucA derivado a partir de Escherichia coli. Las secciones superiores: Enterobacter agglomerans, las secciones inferiores: Escherichia coli (lo mismo es válido en lo sucesivo).
La figura 8 muestra la comparación de una secuencia aminoacídica deducida a partir de una secuencia nucleotídica de un gen sucB derivado a partir de Enterobacter agglomerans con la del derivado a partir de Escherichia coli.
La figura 9 muestra la comparación de una secuencia aminoacídica deducida a partir de una secuencia nucleotídica de un gen sucC derivado a partir de Enterobacter agglomerans con la del derivado a partir de Escherichia coli.
La figura 10 muestra la comparación de una secuencia aminoacídica deducida a partir de una secuencia nucleotídica de un gen sdhB derivado de Enterobacter agglomerans con la del derivado a partir de Escherichia coli.
Descripción detallada de la invención
A continuación se explicará detalladamente la invención.
El microorganismo de la presente invención es un microorganismo que pertenece al género Serratia y que presenta las propiedades como se ha definido en la reivindicación 1.
Dicho microorganismo se puede obtener utilizando un microorganismo perteneciente al género Serratia como cepa parental, e impartiendo las propiedades como se ha definido en la reivindicación 1 al microorganismo. A continuación se proporciona una lista con ejemplos de microorganismos pertenecientes al género Serratia que se pueden utilizar como cepa parental:
Serratia liquefaciens Serratia entomophila Serratia ficaria Serratia fonticola Serratia grimesii Serratia proteamaculans Serratia odorifera Serratia plymuthica Serratia rubidae 
\vskip1.000000\baselineskip
Más preferentemente, se puede mencionar la Serratia liquefaciens ATCC 14460.
El Enterobacter agglomerans AJ13355 se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio Internacional e Industria, el día 19 de febrero de 1998, y recibió el número de acceso FERM P-16644, y seguidamente se transfirió a un depósito internacional bajo el tratado de Budapest el día 11 de Enero de 1999, y recibió el número de acceso FERM BP-6614. El Enterobacter agglomerans ATCC 12287, y la Serratia liquefaciens ATCC 14460 se encuentran disponibles a partir de ATCC.
El Enterobacter agglomerans AJ13355 es una cepa aislada a partir del suelo en Iwata-shi, Shizuoka, Japón.
Las características fisiológicas de AJ13355 son las siguientes:
(1)
Tinción Gram: negativa
(2)
Comportamiento para el oxígeno: anaerobio facultativo
(3)
Catalasa: negativa
(4)
Oxidasa: positiva
(5)
Reducción de nitrato: negativa
(6)
Reacción de Voges-Proskauer: positiva
(7)
Prueba del rojo de metilo: negativa
(8)
Ureasa: negativa
(9)
Producción de indol: positiva
(10)
Mobilidad: presente
(11)
Producción de sulfuro de hidrógeno en medio de cultivo TSI: ligeramente activa
(12)
\beta-galactosidasa: positiva
(13)
Capacidad de asimilación de azúcares:
\quad
Arabinosa: positiva
\quad
Sacarosa: positiva
\quad
Lactosa: positiva
\quad
Xilosa: positiva
\quad
Sorbitol: positiva
\quad
Inositol: positiva
\quad
Trehalosa: positiva
\quad
Maltosa: positiva
\quad
Melibiosa: positiva
\quad
Adonitol: negativa
\quad
Rafinosa: positiva
\quad
Salicina: negativa
\quad
Melibiosa: positiva
(14)
Capacidad de asimilación de glicerosa: positiva
(15)
Capacidad de asimilación de ácidos orgánicos:
\quad
ácido cítrico: positiva
\quad
ácido tartárico: negativa
\quad
ácido glucónico: positiva
\quad
ácido acético: positiva
\quad
ácido malónico: negativa
(16)
Arginina deshidratasa: negativa
(17)
Ornitina descarboxilasa: negativa
(18)
Lisina descarboxilasa: negativa
(19)
Fenilalanina desaminasa: negativa
(20)
Formación de pigmento: amarillo
(21)
Licuefacción de gelatina: positiva
(22)
pH de crecimiento: mal crecimiento a pH 4, buen crecimiento a pH entre 4,5 y 7.
(23)
Temperatura de crecimiento: buen crecimiento a 25ºC, buen crecimiento a 30ºC, buen crecimiento a 37ºC, crecimiento posible a 42ºC, sin crecimiento a 45ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estas propiedades bacteriológicas, se determina que AJ13355 es Enterobacter agglomerans.
En los ejemplos de trabajo descritos posteriormente se utilizaron Enterobacter agglomerans ATCC12287 (para comparación), Enterobacter agglomerans AJ13355 (para comparación) y Serratia liquefaciens ATCC14460 como cepas parentales de partida para obtener cepas que presentan un incremento en la actividad del enzima que cataliza las reacciones para la biosíntesis de ácido L-glutámico, o cepas que presentan una disminución o son deficientes en la actividad del enzima que cataliza la reacción que se ramificada a partir de la ruta de biosíntesis del ácido L-glutámico y que produce el compuesto distinto del ácido L-glutámico. Sin embargo, el metabolismo de azúcares de cualquiera de las bacterias que pertenecen al género Enterobacter y Serratia se realiza por la ruta de Embden-Meyerhof, y el piruvato producido en la ruta se oxida en el ciclo del ácido tricarboxílico bajo condiciones aeróbicas. El ácido L-glutámico se biosintetiza a partir de ácido \alpha-cetoglutárico, el cual es un intermediario del ciclo del ácido tricarboxílico, mediante la GDH o glutamina sintetasa/glutamato sintasa. Así, estos microorganismos comparten la misma ruta biosintética para el ácido L-glutámico, y los microorganismos pertenecientes al género Serratia están comprendidos en un concepto único de acuerdo con la presente invención. Por consiguiente, los microorganismos pertenecientes al género Serratia distintos de las especies y cepas mencionadas específicamente anteriormente también se encuentran comprendidos en el alcance de la presente invención.
El microorganismo de la presente invención es un microorganismo que pertenece al género Serratia y presenta una capacidad para la preparación de ácido L-glutámico. La expresión "que presenta una capacidad para la preparación de ácido L-glutámico" tal como se utiliza en la presente memoria significa que presenta una capacidad de acumular ácido L-glutámico en un medio de cultivo durante el periodo de cultivo. La capacidad para la preparación de ácido L-glutámico se imparte proporcionando una o ambas de las características siguientes:
(a)
el microorganismo presenta un incremento en la actividad del enzima que cataliza la reacción para la biosíntesis de ácido L-glutámico; y
(b)
el microorganismo presenta un descenso o es deficiente en la actividad del enzima que cataliza la reacción que se ramifica a partir de la ruta de biosíntesis del ácido L-glutámico y produce un compuesto distinto del ácido L-glutámico.
Como ejemplos del enzima que cataliza la reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico de microorganismos del género Enterobacter o Serratia, se pueden mencionar la GDH, glutamina sintetasa, glutamato sintasa, isocitrato deshidrogenasa, aconitato hidratasa, CS, PEPC, piruvato deshidrogenasa, piruvato quinasa, enolasa, fosfogliceromutasa, fosfoglicerato quinasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, triosafosfato isomerasa, fructosa bisfosfato aldolasa, fosfofructoquinasa, glucosa fosfato isomerasa y similares. De entre estos enzimas, son utilizados la totalidad de CS, PEPC y GDH. Para el microorganismo de la presente invención, las actividades de los tres tipos de enzimas, CS, PEPC y GDH, se encuentren incrementadas. El que un microorganismo presente un incremento en la actividad de un enzima diana, y el grado de incremento de la actividad, se pueden determinar midiendo la actividad enzimática de un extracto celular bacteriano o de una fracción purificada, y comparándola con la de una cepa salvaje o con la de una cepa parental.
El microorganismo de la presente invención, que pertenece al género Serratia y presenta un incremento en la actividad del enzima que cataliza la reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico, se puede obtener, por ejemplo, como una variante en la que se ha realizado una mutación en un gen que codifica para el enzima o como una cepa recombinante, utilizando cualquiera de los microorganismos mencionados anteriormente como cepa parental de partida.
Por ejemplo, para potenciar la actividad de CS, PEPC o GDH, se puede clonar un gen que codifica para CS, PEPC o GDH en un plásmido apropiado, y la cepa parental de partida mencionada anteriormente como huésped puede ser transformada con el plásmido resultante. Lo anterior puede incrementar el número de copias de cada uno de los genes que codifican para CS, PEPC y GDH (en lo sucesivo abreviados como "gen gltA", "gen ppc", y "gen gdhA", respectivamente), y en consecuencia, pueden incrementar las actividades de CS, PEPC y GDH.
Uno o dos o tres tipos seleccionados de entre los genes clonados gltA, ppc y gdhA en cualquier combinación se introducen en la cepa parental de partida mencionada anteriormente. Cuando se introducen dos o tres tipos de genes, o bien los dos o los tres tipos de genes se clonan en un tipo de plásmido y se introducen en el huésped, o bien se clonan independientemente en dos o tres tipos de plásmidos que puedan existir en el mismo huésped y se introducen en el huésped.
El plásmido no se encuentra particularmente limitado siempre y cuando se pueda replicar de forma autónoma en un microorganismo perteneciente al género Serratia. Entre los ejemplos del plásmido se incluyen, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 y similares. A parte de estos plásmidos, también se pueden utilizar vectores de ADN de fagos.
La transformación se puede realizar mediante, por ejemplo, el procedimiento de D.M. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)), el procedimiento de incrementar la permeabilidad al ADN de las células receptoras con cloruro cálcico (Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), o similares.
Las actividades de CS, PEPC y GDH también se pueden incrementar utilizando múltiples copias del gen gltA, el gen ppc y/o el gen gdh presentes en el ADN cromosómico de la cepa parental de partida utilizada como huésped. Para introducir múltiples copias del gen gltA, el gen ppc y/o el gen gdhA en un ADN cromosómico de un microorganismo perteneciente al género Enterobacter o Serratia, se pueden utilizar secuencias presentes en el ADN cromosómico en copias múltiples tales como ADN repetitivo, y repeticiones invertidas presentes en un extremo de los factores de transposición. Alternativamente, también se pueden introducir múltiples copias de los genes en un ADN cromosómico utilizando la transposición de transposones que llevan el gen gltA, el gen ppc o el gen gdhA. Estas técnicas pueden incrementar el número de copias del gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA en las células transformantes, y en consecuencia incrementar las actividades de CS, PEPC y GDH.
Se puede utilizar cualquier organismo como fuente del gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA utilizado para incrementar el número de copias, siempre y cuando los organismos presenten las actividades CS, PEPC y GDH. De entre tales organismos, se prefieren las bacterias, es decir procariotas, tales como las bacterias pertenecientes a los géneros Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, y Bacillus. Como ejemplo específico se puede mencionar Escherichia coli. Los genes gltA, ppc y gdhA se pueden obtener a partir del ADN cromosómico de los microorganismos mencionados anteriormente.
Cada uno de los genes gltA, ppc y gdhA se puede obtener a partir del ADN cromosómico de cualquiera de los microorganismos mencionados anteriormente aislando un fragmento de ADN que complemente la auxotrofia de una cepa variante que no presente la actividad CS, PEPC o GDH. Alternativamente, puesto que ya han sido desveladas las secuencias nucleotídicas de estos genes de bacterias del género Escherichia o Corynebacterium (Biochemistry, vol.. 22, páginas 5243-5249, 1983; J. Biochem. vol. 95, páginas 909-916, 1984; Gene, vol.. 27, páginas 193-199, 1984; Microbiology, vol. 140, páginas 1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet. vol. 218, páginas 330-339, 1989; y Molecular Microbiology, vol. 6, páginas 317-326, 1992), los genes se pueden obtener por PCR utilizando cebadores sintetizados en base a cada una de las secuencias desveladas, y el ADN cromosómico como molde.
Aparte de la amplificación de gen mencionada anteriormente, la actividad de CS, PEPC o GDH también se puede incrementar potenciando la expresión del gen gltA, el gen ppc o el gen gdhA. Por ejemplo, la expresión se puede potenciar sustituyendo el promotor del gen gltA, el gen ppc o el gen gdhA por otro promotor más fuerte. Entre los ejemplos de tales promotores más fuertes se incluyen un promotor lac, un promotor trp, un promotor trc, un promotor tac, un promotor P_{R} y un promotor P_{L} del fago lambda y similares. El gen gltA, el gen ppc o el gen gdhA cuyo promotor ha sido sustituido se clona en un plásmido y se introduce en un microorganismo huésped, o se introduce en el ADN cromosómico de un microorganismo huésped utilizando ADN repetitivo, repeticiones invertidas, transposones o similares.
La actividad de CS, PEPC o GDH también se puede incrementar sustituyendo el promotor del gen gltA, el gen ppc o el gen gdhA en un cromosoma por otro promotor más fuerte (ver documento WO87/03006, y solicitud de patente japonesa abierta a la inspección pública (KOKAI) nº 61-268183 (1986)), o insertando un promotor fuerte delante de cada secuencia codificante de los genes (ver Gene, 29, páginas 231-241, 1984). Específicamente, lo anterior se consigue mediante recombinación homóloga entre el gen gltA, el gen ppc o el gen gdhA cuyo promotor ha sido sustituido por un promotor más fuerte o el ADN que contiene parte de ellos, y el gen correspondiente en el
cromosoma.
Entre los ejemplos específicos del microorganismo perteneciente al género Enterobacter o Serratia cuya actividad CS, PEPC o GDH se encuentra incrementada, se incluyen Enterobacter agglomerans ATCC12287/RSFCPG, Enterobacter agglomerans AJ13355/RSFCPG y Serratia liquefaciens ATCC14460/RSFCPG.
Entre los ejemplos del enzima que cataliza la reacción que se ramifica a partir de la ruta de biosíntesis del ácido L-glutámico y que produce un compuesto distinto del ácido L-glutámico se incluyen la \alphaKGDH, isocitrato liasa, fosfato acetiltransferasa, acetato quinasa, ácido acetohidroxi sintasa, acetolactato sintasa, formato acetiltransferasa, lactato deshidrogenasa, glutamato descarboxilasa, 1-pirrolina deshidrogenasa y similares. De entre estos enzimas se prefiere la \alphaKGDH.
Para obtener tal descenso o deficiencia de la actividad enzimática tal como se menciona anteriormente en un microorganismo perteneciente al género Enterobacter o Serratia, se puede introducir una mutación que cause el descenso o deficiencia de la actividad enzimática en un gen que codifique para el enzima mediante técnicas convencionales de mutagénesis o mediante técnicas de ingeniería genética.
Entre los ejemplos de técnicas de mutagénesis se incluyen el procedimiento que utiliza la irradiación de rayos X o luz ultravioleta, el procedimiento que utiliza el tratamiento con un agente mutágenico tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina y similares. El sitio del gen donde se introduce la mutación puede ser una región codificante que codifica para una proteína enzimática, o una región reguladora de la expresión tal como un promotor.
Entre los ejemplos de técnicas de ingeniería genética se incluyen la recombinación genética, transducción genética, fusión celular y similares. Por ejemplo, se inserta un gen de resistencia a un fármaco en un gen diana para la preparación de un gen funcionalmente inactivo (gen defectuoso). Seguidamente, este gen defectuoso se introduce en una célula o microorganismo perteneciente al género Enterobacter o Serratia y el gen diana en el cromosoma se sustituye por el gen defectuoso mediante recombinación homóloga (disrupción genética).
El que un microorganismo presente un descenso en la actividad de un enzima diana o su actividad es deficiente, y el grado de descenso de la actividad, se pueden determinar midiendo la actividad enzimática de un extracto celular bacteriano o de una fracción purificada de una cepa candidata, y comparándola con la de una cepa salvaje o con la de una cepa parental. La actividad enzimática \alphaKGDH se puede medir, por ejemplo, mediante el procedimiento de Reed et al. (L.J. Reed y B.B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p. 55-61).
Dependiendo del enzima diana, se puede seleccionar una variante diana en base a un fenotipo de la variante. Por ejemplo, una variante que sea deficiente en la actividad \alphaKGDH o que presente un descenso de la actividad no puede crecer en un medio mínimo que contenga glucosa, o en un medio mínimo que contenga ácido acético o ácido L-glutámico como fuente exclusiva de carbono, o muestra una velocidad de crecimiento marcadamente reducida en dichos medios bajo condiciones aeróbicas. Sin embargo, incluso bajo las mismas condiciones, dicha variante puede exhibir un crecimiento normal si se añade ácido succínico o lisina, metionina y diaminopimelato al medio mínimo que contiene glucosa. En base a este fenómeno, se puede seleccionar una variante que sea deficiente en la actividad \alphaKGDH o que presente un descenso de la actividad.
En el documento WO95/34672 se detalla un procedimiento basado en la recombinación homóloga para preparar una cepa de Brevibacterium lactofermentum que no presenta el gen \alphaKGDH, y se puede utilizar un procedimiento similar para microorganismos pertenecientes al género Enterobacter y Serratia.
Además, los procedimientos para el clonaje genético, corte y ligación de ADN, transformación y similares se detallan en Molecular Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press (1989) y similares.
Un ejemplo de una cepa variante que es deficiente en la actividad \alphaKGDH o que presenta un descenso de la actividad obtenida tal como se describe anteriormente es Enterobacter agglomerans AJ13356. El Enterobacter agglomerans AJ13356 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, el día 19 de febrero de 1998, recibió el número de acceso FERM P-16645, y seguidamente se transfirió a un depósito internacional bajo el tratado de Budapest el día 11 de Enero de 1999, y recibió el número de acceso FERM BP-6615.
El microorganismo perteneciente al género Serratia y que presenta las propiedades como se han definido en la reivindicación 1 se puede cultivar en un medio de cultivo líquido para producir y acumular de ácido L-glutámico en el medio.
El medio de cultivo puede ser cualquier medio ordinario con nutrientes que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales inorgánicas, así como también nutrientes orgánicos traza tales como aminoácidos, vitaminas y similares, según lo requerido. Puede tratarse de un medio sintético o un medio natural. Se puede utilizar cualquier fuente de carbono y de nitrógeno para el medio de cultivo siempre y cuando puedan ser utilizadas por el microorganismo a cultivar.
La fuente de carbono puede ser un sacárido tal como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa, galactosa, hidrolizados de almidón, molasas y similares. Además, también se puede utilizar un ácido orgánico tal como el ácido acético y el ácido cítrico, sólo o en combinación con otras fuentes de carbono.
La fuente de nitrógeno puede ser amonio, sales de amonio tales como sulfato de amonio, carbonato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio y acetato de amonio, nitratos y similares.
Como nutrientes orgánicos traza se utilizan aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos, materiales que los contienen tales como peptona, ácido casamino, extracto de levadura, y productos de descomposición de la proteína de soja y similares, y cuando se utiliza una variante auxotrófica que requiere de un aminoácido o similar para su crecimiento, resulta necesario complementar el nutriente requerido.
Como sales inorgánicas se utilizan fosfatos, sales de magnesio, sales de calcio, sales de hierro, sales de manganeso y similares.
Por lo que se refiere a las condiciones de cultivo, el cultivo se debe realizar bajo condiciones aeróbicas a una temperatura comprendida entre 20 y 42ºC y un pH comprendido entre 4 y 8. El periodo de cultivo puede durar desde 10 horas hasta 4 días para acumular una cantidad considerable de ácido L-glutámico en el medio de cultivo líquido.
Al finalizar el periodo de cultivo, el ácido L-glutámico acumulado en el medio de cultivo puede ser recogido mediante un procedimiento conocido. Por ejemplo, se puede aislar mediante un procedimiento que comprende la concentración del medio después de eliminar las células para cristalizar el producto, cromatografía de intercambio iónico o similares.
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Ejemplos
La presente invención se describirá más detalladamente haciendo referencia a los ejemplos siguientes.
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(1) Construcción de un plásmido que presenta el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA
El procedimiento para la construcción de un plásmido que presenta el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA se explicará haciendo referencia a las figuras 1 a 5.
Un plásmido pBRGDH que contenía el gen gdhA derivado a partir de Escherichia coli (solicitud de patente japonesa abierta a la inspección pública (KOKAI) nº 7-203980 (1995)) se digirió con HindIII y SphI, y ambos extremos se hicieron romos mediante un tratamiento con T4 ADN polimerasa. Seguidamente, se purificó y se recuperó un fragmento de ADN que contenía el gen gdhA. Por otra parte, un plásmido pMWCP que contenía el gen gltA y el gen ppc derivados a partir de Escherichia coli (documento WO97/08294) se digirió con XbaI, y ambos extremos se hicieron romos mediante un tratamiento con T4 ADN polimerasa. Este plásmido se mezcló con el fragmento de ADN que contenía el gen gdhA purificado anteriormente y se ligó con T4 ligasa, dando un plásmido pMWCPG, el cual corresponde al pMWCP que lleva además el gen gdhA (figura 1).
Un fragmento de ADN que contenía el gen gdhA obtenido por digestión del pBRGDH con HindIII y SalI se purificó y se recogió, y se introdujo en el sitio HindIII-SalI de un plásmido pSTV29 (comprado a Takara Shuzo) para obtener un plásmido pSTVG (figura 2).
Al mismo tiempo, un producto obtenido por digestión de un plásmido pVIC40 que presentaba un origen de replicación de un plásmido RSF1010 de amplio rango de huésped (solicitud de patente japonesa abierta a la inspección pública (KOKAI) nº 8-047397 (1996)) con NotI, seguida de un tratamiento con T4 ADN polimerasa y una digestión con PstI, y un producto obtenido por digestión de pBR322 con EcoT141, seguida de un tratamiento con T4 ADN polimerasa y una digestión con PstI, se mezclaron y se ligaron con T4 ligasa para obtener un plásmido RSF-Tet que contenía el origen de replicación de RSF1010 y un gen de resistencia a tetraciclina (figura 3).
Seguidamente, el pMWCPG se digirió con EcoRI y PstI, y se purificó y recogió un fragmento de ADN que contenía el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA. De manera similar, el RSF-Tet se digirió con EcoRI y PstI, y se purificó y recogió un fragmento de ADN que contenía el origen de replicación de RSF1010. Los fragmentos de ADN anteriores se mezclaron y se ligaron con T4 ligasa para obtener un plásmido RSFCPG compuesto de RSF-Tet que llevaba el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA (figura 4). La expresión del gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA por parte del plásmido RSFCPG resultante, y la expresión del gen gdhA por parte de pSTVG se confirmaron en base a la complementación de la auxotrofia de las cepas de Escherichia coli que no presentan el gen gltA, el gen ppc o el gen gdhA, y a la medición de la actividad de cada enzima.
Se construyó un plásmido que contenía el gen gltA derivado a partir de Brevibacterium lactofermentum de la siguiente manera. Se realizó PCR utilizando cebadores que presentaban las secuencias nucleotídicas representadas en SEC ID n^{os}: 6 y 7, seleccionadas en base a la secuencia nucleotídica del gen gltA de Corynebacterium glutamicum (Microbiology, 140, 1817-1828, 1994), y un ADN cromosómico de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 como molde para obtener un fragmento del gen gltA de aproximadamente 3 kb. Este fragmento se insertó en un plásmido pHSG399 (comprado a Takara Shuzo) digerido con SmaI para obtener un plásmido pHSGCB (figura 5). Seguidamente, el pHSGCB se digirió con HindIII, y un fragmento escindido del gen gltA de aproximadamente 3 kb se insertó en un plásmido pMW218 (comprado a Nippon Gene) digerido con HindIII para obtener un plásmido pMWCB (figura 5). La expresión del gen gltA por parte del plásmido pMWCB resultante se confirmó mediante la determinación de la actividad enzimática en Enterobacter agglomerans AJ13355.
(2) Introducción de RSFCPG, pMWCB y pSTVG en Enterobacter agglomerans (para comparación) o Serratia liquefaciens y evaluación de la productividad de ácido L-glutámico
El Enterobacter agglomerans ATCC 12287, el Enterobacter agglomerans AJ13355 y la Serratia liquefaciens ATCC 14460 se transformaron con el RSFCPG, pMWCB y pSTVG mediante electroporación (Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook" Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1992) para obtener transformantes que exhibían resistencia a la tetraciclina.
Cada uno de los transformantes resultantes y las cepas parentales se inocularon en tubos de ensayo grandes de 50 ml de volumen que contenían 5 ml de un medio de cultivo que contenía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato de amonio, 0,5 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado, 2 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l de cloruro cálcico heptahidratado, 0,02 g/l de sulfato ferroso heptahidratado, 0,02 g/l de sulfato de manganeso tetrahidratado, 0,72 mg/l de sulfato de zinc dihidratado, 0,64 mg/l de sulfato de cobre pentahidratado, 0,72 mg/l de cloruro de cobalto hexahidratado, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de molibdato de sodio dihidratado, 2 g/l de extracto de levadura y 30 g/l de carbonato cálcico y se cultivaron a 37ºC con agitación hasta que se consumió la glucosa contenida en el medio de cultivo. Sin embargo, en el caso de la cepa AJ13355/pMWCB y la cepa AJ13355/pSTVG, el cultivo se paró cuando se habían consumido aproximadamente 10 g/l de glucosa, es decir, se cultivaron durante 15 horas como la cepa parental AJ13355, ya que sus velocidades de consumo de glucosa eran bajas. Al medio de cultivo de los transformantes se le añadieron 25 mg/l de tetraciclina. Al finalizar el periodo de cultivo se midió el ácido L-glutámico acumulado en el medio de cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1 Cantidad acumulada de ácido L-glutámico
1
Mientras que Enterobacter agglomerans ATCC12287, Enterobacter agglomerans AJ13355 y la Serratia liquefaciens ATCC14460 no acumularon ácido L-glutámico, las cepas en las que se habían amplificado las actividades CS, PEPC y GDH mediante la introducción de RSFCPG acumularon 6,1 g/l, 3,3 g/l y 2,8 g/l de ácido L-glutámico respectivamente. La cepa AJ13355 en la que solo se había amplificado la actividad CS acumuló 0,8 g/l de ácido L-glutámico, y la cepa en la que solo se había amplificado la actividad GDH también acumuló 0,8 g/l de ácido L-glutámico.
(3) Clonaje del gen \alphaKGDH (en lo sucesivo referido como "sucAB") de Enterobacter agglomerans AJ13355 (únicamente como referencia)
El gen sucAB de Enterobacter agglomerans AJ13355 se clonó seleccionando un fragmento de ADN que complementara la no asimilación de acetato de una cepa de Escherichia coli que no poseía el gen de la subunidad \alphaKGDH-E1 (en lo sucesivo referido como "sucA") a partir del ADN cromosómico de Enterobacter agglomerans AJ13355.
El ADN cromosómico de Enterobacter agglomerans AJ13355 se aisló mediante el mismo procedimiento utilizado convencionalmente para la extracción de ADN cromosómico a partir de Escherichia coli (Seibutsu Kogaku Jikken-sho (Textbook of Bioengineering Experiments), editado por la Society of Fermentation and Bioengineering, Japón, p. 97-98, Baifukan, 1992). El pTWV228 utilizado como vector (resistente a ampicilina) era un producto comercializado por Takara Shuzo.
Productos obtenidos por digestión del ADN cromosómico de la cepa AJ13355 con EcoT221 y productos obtenidos por digestión de pTWV228 con PstI se ligaron con T4 ligasa y la Escherichia coli JRG465 que no presentaba sucA (Herbert J. et al., Mol. Gen. Genetics, 1969, 105, p. 182) se transformó con lo anterior. Las cepas que crecían en el medio mínimo con ácido acético se seleccionaron a partir de los transformantes obtenidos tal se describe anteriormente y el plásmido extraído de ellas se denominó pTWVEK101. La Escherichia coli JRG465 que llevaba el pTWVEK101 recuperó las características de no capacidad de asimilación de acetato así como también la auxotrofia para ácido succínico o L-lisina y L-metionina. Esto sugiere que pTWVEK101 contiene el gen sucA de Enterobacter agglomerans.
En la figura 6 se muestra un mapa de restricción del fragmento de ADN derivado a partir de Enterobacter agglomerans de pTWVEK101. El resultado de la secuenciación nucleotídica de la porción sombreada de la figura 6 se muestra en SEC ID nº: 1. En esta secuencia, se encontraron dos pautas abiertas de lectura ORFs completas y dos secuencias nucleotídicas consideradas como secuencias parciales de ORFs. Las secuencias aminoacídicas que pueden estar codificadas por estos ORFs y las secuencias parciales de los mismos se muestran en SEC ID n^{os}: 2 a 5 ordenadas desde el extremo 5'. Como resultado del análisis de homología de estas secuencias se encontró que la porción de la que se había determinado la secuencia nucleótidica contenía la secuencia parcial 3' del gen de la proteína hierro-azufre de la succinato deshidrogenasa (sdhB), la secuencia completa de sucA y del gen de la subunidad \alphaKGDH-E2 (gen sucB) y la secuencia parcial 5' del gen de la subunidad \beta de la succinil-CoA sintetasa (gen sucC). La comparación de las secuencias aminoacídicas deducidas a partir de estas secuencias nucleotídicas con las de Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, 351-359 (1984), Eur. J. Biochem., 141, 361-374 (1984) y Biochemistry, 24, 6245-6252 (1985)) se muestra en las figuras de 7 a 9. Tal como muestran estos resultados, las secuencias aminoacídicas exhibían una elevada homología. También se constató que se forma un cluster de sdhB-sucA-sucB-sucC en el cromosoma de Enterobacter agglomerans como en Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, 351-359 (1984), Eur. J. Biochem., 141, 361-374 (1984) y Biochemistry, 24, 6245-6252 (1985)).
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(4) Adquisición de una cepa deficiente en \alphaKGDH derivada a partir de Enterobacter agglomerans AJ13355 (únicamente como referencia)
Utilizando el gen sucAB de Enterobacter agglomerans obtenido tal como se describe anteriormente, se obtuvo una cepa de Enterobacter agglomerans que no presentaba \alphaKGDH mediante recombinación homóloga.
En primer lugar, el pTWVEK101 se digirió con BglII para eliminar la región C-terminal correspondiente a aproximadamente la mitad del gen sucA y la secuencia completa del gen sucB. A este sitio se le insertó un fragmento del gen de resistencia a cloramfenicol obtenido por digestión de pHSG399 (Takara Shuzo) con AccI. La región de sdhB-\DeltasucAB::Cm^{x}-sucC obtenida anteriormente se extrajo mediante digestión con AflII y SacI. El fragmento de ADN resultante se utilizó para transformar la cepa de Enterobacter agglomerans AJ13355 mediante electroporación para obtener una cepa resistente a cloramfenicol, y así se obtuvo una cepa de Enterobacter agglomerans AJ13356 que no presentaba el gen sucAB en la que el gen sucAB del cromosoma estaba sustituido por sucAB: :Cm^{x}.
Para confirmar que la cepa AJ13356 obtenida anteriormente era deficiente en la actividad \alphaKGDH, se determinó su actividad enzimática mediante el procedimiento de Reed (L.J. Reed y B.B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, páginas 55-61). Como resultado, no se pudo detectar la actividad \alphaKGDH en la cepa AJ13356 tal como se muestra en la Tabla 2, y así se confirmó que la cepa no presentaba el gen sucAB, tal como se deseaba.
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TABLA 2 Actividad \alphaKGDH
2 
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(5) Evaluación de la productividad de ácido L-glutámico de la cepa de Enterobacter agglomerans deficiente en \alphaKGDH (únicamente como referencia)
Cada una de las cepas AJ13355 y AJ13356 se inoculó en matraces de 500 ml de volumen que contenían 20 ml de un medio de cultivo que comprendía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato de amonio, 0,5 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado, 2 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l de cloruro cálcico heptahidratado, 0,02 g/l de sulfato ferroso heptahidratado, 0,02 g/l de sulfato de manganeso tetrahidratado, 0,72 mg/l de sulfato de zinc dihidratado, 0,64 mg/l de sulfato de cobre pentahidratado, 0,72 mg/l de cloruro de cobalto hexahidratado, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de molibdato de sodio dihidratado, 2 g/l de extracto de levadura, 30 g/l de carbonato cálcico, 200 mg/l de monohidrocloruro de L-lisina, 200 mg/l de L-metionina y 200 mg/l de ácido DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico (DAP) y se cultivó a 37ºC con agitación hasta que se consumió la glucosa contenida en el medio de cultivo. Al finalizar el periodo de cultivo, se midieron el ácido L-glutámico y el ácido \alpha-cetoglutárico (en lo sucesivo abreviado como "\alphaKG") acumulados en el medio de cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3 Cantidades acumuladas de ácido L-glutámico y \alphaKG
3 
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La cepa AJ13356 deficiente en la actividad \alphaKGDH acumuló 1,5 g/l de ácido L-glutámico, y simultáneamente acumuló 3,2 g/l de \alphaKG.
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(6) Introducción de RSFCPG en la cepa de Enterobacter agglomerans que no presenta actividad \alphaKGDH y evaluación de la productividad de ácido L-glutámico (únicamente como referencia)
La cepa AJ13356 se transformó con RSFCPG, y la cepa resultante en la que se había introducido el RSFCPG, AJ13356/RSFCPG, se inoculó en un matraz de 500 ml de volumen que contenía 20 ml de un medio de cultivo que comprendía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato de amonio, 0,5 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado, 2 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l de cloruro cálcico heptahidratado, 0,02 g/l de sulfato ferroso heptahidratado, 0,02 g/l de sulfato de manganeso tetrahidratado, 0,72 mg/l de sulfato de zinc dihidratado, 0,64 mg/l de sulfato de cobre pentahidratado, 0,72 mg/l de cloruro de cobalto hexahidratado, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de molibdato de sodio dihidratado, 2 g/l de extracto de levadura, 25 mg/l de tetraciclina, 30 g/l de carbonato cálcico, 200 mg/l de monohidrocloruro de L-lisina, 200 mg/l de L-metionina y 200 mg/l de ácido D L-\alpha,\varepsilon-DAP y se cultivó a 37ºC con agitación hasta que se consumió la glucosa contenida en el medio de cultivo. Al finalizar el periodo de cultivo, se midieron el ácido L-glutámico y el \alphaKG acumulados en el medio de cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
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TABLA 4 Cantidades acumuladas de ácido L-glutámico y \alphaKG
4 
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En la cepa en la que se amplificaron las actividades CS, PEPC y GDH mediante la introducción de RSFCPG, la cantidad acumulada de \alphaKG se redujo, y la cantidad acumulada de ácido L-glutámico mejoró adicionalmente.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
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<120> Bacteria productora de ácido L-glutámico y procedimiento para la preparación de ácido L-glutámico.
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<130> EPA-63475
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<150> JP 10-69068
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<151> 1998-03-18
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<150> JP 10-297129
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<151> 1998-10-19
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<160> 7
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 4556
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<212> ADN
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<213> Enterobacter agglomerans 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (2)...(121)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (322)...(3129)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (3145)...(4368)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (4437)...(4556)
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<400> 1
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5
6
7
8
9
10 
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<210> 2
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<211> 39
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<212> PRT
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<213> Enterobacter agglomerans 
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<400> 2
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11 
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<210> 3
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<211> 935
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<212> PRT
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<213> Enterobacter agglomerans 
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<400> 3
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12
13
14 
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<210> 4
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<211> 407
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<212> PRT
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<213> Enterobacter agglomerans 
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<400> 4
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15 
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<210> 5
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<211> 40
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<212> PRT
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<213> Enterobacter agglomerans 
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<400> 5
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16 
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<210> 6
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskip
gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg 
\hfill
30 
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<210> 7
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskip
aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt 
\hfill
30

Claims (3)

1. Microorganismo perteneciente al género Serratia, que presenta una capacidad para la preparación de ácido L-glutámico y que presenta las actividades aumentadas de la totalidad de citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, y glutamato deshidrogenasa en comparación con las cepas sin transformar o sin mutar.
2. Microorganismo según la reivindicación 1, que es Serratia liquefaciens.
3. Procedimiento para la preparación de ácido L-glutámico que comprende el cultivo del microorganismo según la reivindicación 1 ó 2 en un medio de cultivo líquido para producir y acumular ácido L-glutámico en el medio de cultivo, y recoger el ácido L-glutámico a partir del medio de cultivo.
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