FR2679921A1 - Procede d'obtention d'une souche bacterienne permettaant l'expression d'une sequence codante determinee. - Google Patents
Procede d'obtention d'une souche bacterienne permettaant l'expression d'une sequence codante determinee. Download PDFInfo
- Publication number
- FR2679921A1 FR2679921A1 FR9109652A FR9109652A FR2679921A1 FR 2679921 A1 FR2679921 A1 FR 2679921A1 FR 9109652 A FR9109652 A FR 9109652A FR 9109652 A FR9109652 A FR 9109652A FR 2679921 A1 FR2679921 A1 FR 2679921A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- coding sequence
- plasmid
- expression
- sequence
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention concerne un procédé permettant d'obtenir une souche bactérienne assurant l'expression d'une séquence codante déterminée du type mettant en œuvre un plasmide réplicatif ou non comportant les éléments permettant l'expression de ladite séquence dans ladite souche, caractérisé en ce que: - ledit plasmide comporte au moins un gène marqueur sous le contrôle des éléments d'expression de ladite séquence et qui est séparé de ceux-ci par un site de restriction BstXI non palindromique, - en ce que ladite séquence codante déterminée est insérée dans le site BstXI, - en ce que le plasmide ainsi obtenu est utilisé pour transformer ladite souche, et - en ce que l'on sélectionne les souches transformées par le plasmide.
Description
La présente invention concerne un procédé permettant d'obtenir une souche bactérienne assurant l'expression d'une séquence codante déterminée, en particulier dans une bactérie du type corynébactérie.
Parmi les problèmes qui se posent lors de la production de polypeptides et/ou de protéines par des techniques utilisant les ADN recombinants, il faut citer les difficultés liées à la construction des systèmes d'expression, notamment la formation de constructions non conformes - présence de séquences codantes inversées, - présence de séquences dupliquées non souhaitées, - présence de séquences étrangères par exemple.
C'est pourquoi, la présente invention concerne plus particulièrement un procédé permettant d'éviter ce type d'inconvénient et présentant, en outre, des avantages qui seront énoncés dans le cours de la présente description.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé, permettant d'obtenir une souche bactérienne assurant l'expression d'une séquence codante déterminée, du type mettant en oeuvre un plasmide réplicatif ou non comportant les éléments permettant l'expression de ladite séquence dans ladite souche, caractérisé en ce que - ledit plasmide comporte au moins un gène marqueur sous le contrôle
des éléments d'expression de ladite séquence et qui est séparé de
ceux-ci par un site de restriction BstXI non palindromique, - en ce que ladite séquence codante déterminée est insérée dans le site
BstXI, - en ce que le plasmide ainsi obtenu est utilisé pour transformer ladite
souche, et - en ce que l'on sélectionne les souches transformées par le plasmide.
des éléments d'expression de ladite séquence et qui est séparé de
ceux-ci par un site de restriction BstXI non palindromique, - en ce que ladite séquence codante déterminée est insérée dans le site
BstXI, - en ce que le plasmide ainsi obtenu est utilisé pour transformer ladite
souche, et - en ce que l'on sélectionne les souches transformées par le plasmide.
L'élément clé du procédé selon la présente invention est l'utilisation du site de restriction BstXI. Ce site présente la structure suivante
<tb> CCANNNNNNTGG
<tb> les lettres N représentant un nucléotide quelconque.
<tb> les lettres N représentant un nucléotide quelconque.
Cette séquence permet donc le choix d'une séquence nucléotidique intermédiaire de 6 N qui soit non palindromique, c'est-à-dire non identique à sa séquence complémentaire, et, comme cela sera vu dans la suite, permet également la création d'un codon de départ à l'extrémité 5' de la séquence codante et d'un codon ATG à l'extrémité 3' de la séquence codante. Cette séquence permet également de choisir avantageusement la nature du deuxième codon en relation avec la séquence codante choisie et du dernier codon de la séquence codante. Ce dernier codon peut être un codon stop ; dans ce cas, la construction utilisant le gène marqueur est réalisée dans une souche d'E. coli possédant un suppresseur du codon stop correspondant.
La possibilité d'utiliser un site de restriction non palindromique du type Bst XI permet d'utiliser un ADN double brin contenant la séquence codante déterminée, avec deux extrémités 3' débordantes différentes et, dans ces conditions, d'avoir une insertion de la séquence codante toujours dans le bon sens, ce qui constitue un avantage très important pour la séquence des acides aminés du peptide produit lorsque l'on réalise ce type de construction.
En outre, le site BstXI devra présenter, de préférence, la structure: CCATGXXX3' débordant à l'extrémité 5' de la séquence codante, ladite séquence codante sous forme d'ADN double brin étant alors insérée par l'une de ses extrémités 3' débordantes complémentaire c'est à dire 3'CYYY(X et Y étant des bases complémentaires). Le codon ATG est le codon de départ de la traduction de cette séquence. Il est ainsi possible de contrôler parfaitement la construction du plasmide et d'éviter la présence de séquences indésirables.
Enfin, lors de l'insertion de la séquence codante dans BstXI ce site est détruit, il est alors possible de contrôler facilement les constructions en effectuant une digestion par BstXI, seuls les plasmides non digérés ont intégré la séquence.
Bien que ces constructions puissent être appliquées à d'autres espèces bactériennes, elles seront ci-après plus particulièrement décrites dans le cadre de plasmides destinés à la transformation de corynébactéries.
I1 doit être entendu que par "corynébactérie" on désigne non seulement les Corynebacteriums, mais également les bactéries apparentées telles que Brevibacterium.
Les éléments d'expression de ladite séquence comportent essentiellement un promoteur et un site de fixation des ribosomes. Parmi les éléments d'expression utilisables dans les corynébactéries, on utilisera plus particulièrement le promoteur Ptac qui est un promoteur fort, hybride trp/lac, inductible par IPTG et qui se révèle fonctionnel chez les corynébactéries comme chez E. coli. Mais il est possible d'utiliser d'autres promoteurs, par exemple, comme cela sera décrit ci-après, des promoteurs de gène de structure de corynébactérie, par exemple le promoteur de la gdhA.
Les éléments d'expression peuvent également comporter des séquences d'ADN assurant la régulation de l'expression des gènes en aval.
Parmi les éléments assurant une bonne expression il faut prévoir de pouvoir placer à la fin de la séquence codante un élément d'arrêt de traduction, sous forme d'un ou plusieurs codons stop, la construction est alors sélectionnée dans une souche de E. coli possédant un suppresseur de codon stop correspondant.
On peut également prévoir de placer en aval de BstXI un élément d'arrêt de transcription.
Les séquences codantes utilisées peuvent, bien entendu, être des séquences codant pour l'expression d'amino acides, de peptides, de polypeptides ou de protéines et comporter, en outre, des éléments assurant l'expression et la sécrétion de ces différents produits par les corynébactéries.
La séquence codante pourra être naturelle, synthétique ou mixte.
Dans le cas d'une séquence synthétique, le choix de la séquence codante permet la constitution
- d'une séquence d'acides aminés quelconque
- d'une séquence d'acides aminés répétitive à n répétitions du type (aa 1 ...... aax) n;
- d'une séquence répétitive contenant en position COOHterminale aa x un acide aminé chargé positivement ou négativement.Cet acide aminé peut permettre d'améliorer l'expression génétique mais permet avantageusement (i) d'isoler le polypeptide du fait de son caractère ionique marqué (ii) de cliver par protéase spécifique le polypeptide en unité (aal aal) de base (iii) d'enlever si nécessaire l'acide aminé terminal aax par des carboxy peptidases spécifiques
- d'une séquence répétitive contenant en portion NH2 ou
COOH terminale aal ou axa un acide aminé conférant un avantage désiré.
- d'une séquence d'acides aminés quelconque
- d'une séquence d'acides aminés répétitive à n répétitions du type (aa 1 ...... aax) n;
- d'une séquence répétitive contenant en position COOHterminale aa x un acide aminé chargé positivement ou négativement.Cet acide aminé peut permettre d'améliorer l'expression génétique mais permet avantageusement (i) d'isoler le polypeptide du fait de son caractère ionique marqué (ii) de cliver par protéase spécifique le polypeptide en unité (aal aal) de base (iii) d'enlever si nécessaire l'acide aminé terminal aax par des carboxy peptidases spécifiques
- d'une séquence répétitive contenant en portion NH2 ou
COOH terminale aal ou axa un acide aminé conférant un avantage désiré.
Dans l'exemple, la séquence exprimée code pour un polypeptide de structure (ala-gln)20. La séquence ala gln peut être libérée par traitement enzymatique ultérieur. On peut prévoir d'autres polymères de ce type tels que Ala-Gln-Tyr ou Ala-Gln-Lys ou Ala-Gln-Met qui peuvent être libérés par traitement enzymatique ou chimique.
Le choix des codons de la séquence codante peut influencer l'expression dans les corynébactéries, il convient de préférence de prévoir une séquence ayant une richesse en GC de l'ordre de 50 à 60 %.
Dans le cas de l'exemple la séquence codant pour (AQ)20 est CCX CAG avec X = A ou T ou C ou G, en effet si aucun des codons n'est préféré pour l'alanine, par contre le codon CAG est très nettement préféré pour la glutamine. Dans ce cas, le pourcentage de CC est de l'ordre de 75 %, ce qui peut constituer une limitation, c'est pourquoi on envisage l'utilisation de polymères comportant 3 amino-acides dont le troisième est riche en A et T pour ramener le pourcentage à 55 %.
Tyr et Lys ou Met possèdent deux A ou T dans les deux premières bases de leur codon et permettent donc de faire descendre le pourcentage en GC de 75 % à environ 60 %, ce qui devient plus proche du pourcentage en GC trouvé chez les corynébactéries. D'autres part, bien sûr, l'intérêt industriel pour ces deux acides aminés en position COOH-terminal de Glutamine (Q) a été considéré et existe.
Dans le cadre de la présente invention, il faut citer également l'expression de gènes tels que la gdhA tel qu'il est représenté à la figure 1, du codon de départ au codon stop. Les signaux d'expression de ce gene tels que représentés peuvent être également utilisés pour la réalisation de cassettes d'expression, notamment du type décrit précédemment.
Les plasmides mis en oeuvre peuvent être des plasmides réplicatifs, c'est-à-dire comporter une origine de réplication dans les corynébactéries, par exemple l'origine de réplication pBLl. Ils pourront également comporter des origines de réplication fonctionnelles dans d'autres bactéries, notamment dans E. coli, afin de faciliter la construction des plasmides en cause.
I1 est également possible de prévoir des plasmides non réplicatifs chez corynébactéries mais comportant des séquences homologues chromosomiques permettant l'intégration de ces séquences dans le chromosome de corynébactéries.
Le gène marqueur peut être, bien entendu, de type très varié pour autant qu'il soit fonctionnel chez corynébactérie, il pourrait s'agir d'un gène de sélection positif ou négatif tel qu'une résistance spécifique, néanmoins dans l'état actuel des recherches ces gènes ne sont pas aisément disponibles. On utilisera donc de préférence le gène EGA de la cellulase de
C. thermocellum (celA) qui confère le phénotype Cmc+, mais il est possible d'utiliser d'autres gènes marqueurs, notamment lacZ.
C. thermocellum (celA) qui confère le phénotype Cmc+, mais il est possible d'utiliser d'autres gènes marqueurs, notamment lacZ.
Dans le cas où le gène marqueur est celA, les bactéries transformées sont sélectionnées pour le caractère Cmc+ et après insertion de la séquence codante dans BstXI par analyse de restriction avec BstXI comme indiqué précédemment.
Dans le procédé selon l'invention, on prévoiera que le gène marqueur puisse être facilement éliminé après vérification de la construction notamment en plaçant des sites de restriction entre le gène marqueur et la séquence codante.
La présente invention concerne également des cassettes d'expression comportant tout ou partie des signaux d'expression de la gdhA, ou tout ou partie de la gdhA telle que représentée à la figure 1, ainsi que les souches exprimant ce type de cassettes, notamment les souches de corynébactéries.
Les souches bactériennes, notamment de corynébactéries, obtenues font également partie de la présente invention et pourront être utilisées dans le cadre de procédés permettant l'expression et la sécrétion des peptides, des polypeptides et/ou des protéines par des procédés de fermentation qui sont connus et sans qu'il soit nécessaire de revenir en détail sur les conditions de ces différentes étapes.
La transformation des corynébactéries par des plasmides est réalisée de préférence par électroporation (Bonamy C., Guyonvarch A.,
Reyes O., David F. and Leblon G. (1990) FEMS Microbiology Letters 66 263-270) ou par tout autre procédé approprié.
Reyes O., David F. and Leblon G. (1990) FEMS Microbiology Letters 66 263-270) ou par tout autre procédé approprié.
Les conditions de fermentation permettant la préparation d'amino acides, peptides et/ou protéines dépendent évidemment du type de produit obtenu ainsi que de la souche spécifique mise en oeuvre, il s'agit là d'éléments qui doivent être déterminés spécifiquement pour chaque souche en fonction des connaissances de l'homme de métier.
Les exemples ci-après permettront de mieux mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention et sont décrits en se référant aux figures suivantes
Figure 1 : séquence de gène de structure de la gdhA de Corynebacterium melassecola,
Figure 2 : différents adaptateurs utilisés dans les exemples,
Figure 3 : structures de pPROKcelA et pPROK(AQ)20celA
Figure 4 : détail de la fusion du polypeptide AQ avec EGA,
Figure 5 : structure de pCGL125AQcelA.
Figure 1 : séquence de gène de structure de la gdhA de Corynebacterium melassecola,
Figure 2 : différents adaptateurs utilisés dans les exemples,
Figure 3 : structures de pPROKcelA et pPROK(AQ)20celA
Figure 4 : détail de la fusion du polypeptide AQ avec EGA,
Figure 5 : structure de pCGL125AQcelA.
EXEMPLE I
Construction d'un plasmide permettant le clonage de peptides (figure 3)
Pour cette construction, une étape de sous-clonage de celA a été réalisée. Le gène celA disponible sous forme d'un fragment HindIII de 3,5kb contenant la région promotrice, le gène et le début d'un autre gène non identifié, a été sous-cloné sous forme d'un fragment HindlII-EcoRI de 2,6kb délété du morceau de gène inconnu, dans un vecteur réplicatif d'E. coli, le pMTL23.
Construction d'un plasmide permettant le clonage de peptides (figure 3)
Pour cette construction, une étape de sous-clonage de celA a été réalisée. Le gène celA disponible sous forme d'un fragment HindIII de 3,5kb contenant la région promotrice, le gène et le début d'un autre gène non identifié, a été sous-cloné sous forme d'un fragment HindlII-EcoRI de 2,6kb délété du morceau de gène inconnu, dans un vecteur réplicatif d'E. coli, le pMTL23.
Le site EcoRI a été introduit par mutagénèse dirigée (P.
Scarmato, Organibio) immédiatement derrière le terminateur de transcription du gène. Ce sous-clonage intermédiaire, compte tenu des sites de restriction introduits est nécessaire à l'étape suivante de clonage ; en particulier le clonage dans le polylinker de pMTL23 permet l'introduction d'un site de restriction NcoI juste derrière le site EcoRI, ce qui permet de sortir le fragment contenant la région codante de celA sous forme d'un fragment NaeI-NcoI. Cette étape permet également de disposer d'un gène celA dépourvu de séquences non identifiées en 3'.
Le clonage de celA sous forme d'un fragment HindIII-EcoRI a été réalisé dans le plasmide pMTL23 en utilisant la souche réceptrice d'E. coli TG1. La souche d'E. coli possédant ce plasmide est bien dotée du phénotype CMC+ associé à l'expression de 1'EGO ; l'analyse des fragments de restriction obtenus est conforme à ce qui est attendu.
La construction de pPROK-celA est la suivante
On utilise le plasmide pPROK-l de 4,6kb disponible chez
Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA, USA).
On utilise le plasmide pPROK-l de 4,6kb disponible chez
Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA, USA).
Ce plasmide réplicatif chez E. coli contenant le promoteur tac (Brossius et coll. Gene 27:161, 1984) est hydrolysé par EcoRI-NcoI.
On introduit ensuite dans cette restriction les adaptateurs
DGFI/DGF2 de la figure 2 sous forme EcoRI-Blunt, ces adaptateurs créent le site BstXI. Puis on introduit celA sous forme NaeI(blunt)-NcoI à partir de la construction précédente.
DGFI/DGF2 de la figure 2 sous forme EcoRI-Blunt, ces adaptateurs créent le site BstXI. Puis on introduit celA sous forme NaeI(blunt)-NcoI à partir de la construction précédente.
Le plasmide ainsi obtenu est dénommé pPROK-celA. I1 comporte le gène EGA de celA sous le contrôle du promoteur tac séparé par un site BstXI introduit grâce aux adaptateurs DGF1/DGF2.
EXEMPLE 2
Construction d'un plasmide permettant l'expression de séquences AQ multiples
Pour réaliser l'insertion d'une séquence codant pour 20 unités Ala-Gln (AQ) on utilise un deuxième couple d'oligonucléotides de synthèse dénommés DGF5/DGF6 (figure 2) qui correspondent au gène synthétique
5' CAG[AQ]20CAGGCA 3'
3' CCGTGTC[AQ]20GT 5' [AQ] représentant la séquence codant pour Ala-Gln.
Construction d'un plasmide permettant l'expression de séquences AQ multiples
Pour réaliser l'insertion d'une séquence codant pour 20 unités Ala-Gln (AQ) on utilise un deuxième couple d'oligonucléotides de synthèse dénommés DGF5/DGF6 (figure 2) qui correspondent au gène synthétique
5' CAG[AQ]20CAGGCA 3'
3' CCGTGTC[AQ]20GT 5' [AQ] représentant la séquence codant pour Ala-Gln.
Les extrémités des séquences de DGF5 et DGF6 sont compatibles avec le site BstXI et la séquence peut donc être clonée dans ce site.
Les séquences d'extrémités de DGF5 et DGF6 sont telles que, d'une part, elles orientent la direction du clonage, et, d'autre part, elles détruisent le site BstXl à la suite du clonage.
L'utilisation d'adaptateurs non phosphorylés évite d'introduire plusieurs gènes synthétiques en tandem.
Après digestion du pPROK-celA par BstXI et ligation du gène synthétique, on obtient : pPROK(AQ)20celA ayant la structure représentée figure 3.
La figure 4 détaille plus particulièrement la structure du site de fusion AQ/EGA et montre l'intérêt du site BstXI utilisé. Ce site est de structure
CCATGGCAATGG
On constate qu'il comporte un codon de départ ATG ainsi que le codon codant pour l'alanine, GCA et un 2ème codon ATG pour l'insertion d'une methionine après la séquence codante déterminée.
CCATGGCAATGG
On constate qu'il comporte un codon de départ ATG ainsi que le codon codant pour l'alanine, GCA et un 2ème codon ATG pour l'insertion d'une methionine après la séquence codante déterminée.
L'insertion de l'adaptateur DGF5/DGF6 ne peut se faire que dans un sens et n'introduit aucune base étrangère à l'objet visé.
Ce plasmide est traité par BamHI et traité par ligation avec le produit de restriction du plasmide pCGL125 traité par la même enzyme.
Le plasmide pCGL125 (figure 5) est un plasmide fonctionnel de Brevibacterium lactofermentum CGL/2005 (B1 15) comportant une origine de réplication pBL1.
Par transformation de ladite souche par le plasmide pCGL125-(AQ)20-celA et sélection des souches transformées on obtient une souche selon la présente invention.
Dans toutes les fusions qui sont réalisées, la traduction commence par une méthionine immédiatement suivie par (AQ)20 ; on a également pris la précaution de border (AQ)20 par une méthionine en
COOH-terminal ; la détection du polypeptide AQ fusionné ou non à la
protéine CelA peut se faire grâce à des anticorps spécifiques ou par détection analytique après purification sommaire de la protéine de fusion et hydrolyse au bromure de cyanogène ou inversement. Les propriétés particulières des peptides répétés permettent une séparation aisée.
COOH-terminal ; la détection du polypeptide AQ fusionné ou non à la
protéine CelA peut se faire grâce à des anticorps spécifiques ou par détection analytique après purification sommaire de la protéine de fusion et hydrolyse au bromure de cyanogène ou inversement. Les propriétés particulières des peptides répétés permettent une séparation aisée.
Claims (21)
1) Procédé permettant d'obtenir une souche bactérienne assurant l'expression d'une séquence codante déterminée du type mettant en oeuvre un plasmide réplicatif ou non comportant les éléments permettant l'expression de ladite séquence dans ladite souche, caractérisé en ce que -ledit plasmide comporte au moins un gène marqueur sous le contrôle des
éléments d'expression de ladite séquence et qui est séparé de ceux-ci par
un site de restriction BstXI non palindromique, -ladite séquence codante déterminée est insérée dans le site BstXI, -le plasmide ainsi obtenu est utilisé pour transformer ladite souche, et -on sélectionne les souches transformées par le plasmide.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène marqueur est séparé de la séquence codante par au moins un site de restriction.
3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le site BstXI présente la CCATGXXX3' à l'extrémité 5' de la séquence codante et en ce que la séquence codante est insérée sous forme d'une ADN double brin à extrémité 3' débordante complémentaire 3'CYYY (X et Y étant des bases complémentaires), le codon ATG étant le codon de départ de la traduction de cette séquence.
4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la bactérie est une corynébactérie.
5) Procédé selon l'une des revendications I à 4, caractérisé en ce que les éléments d'expression comportent le promoteur Ptac.
6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la séquence codante code pour l'expression d'un polypeptide ou d'une protéine.
7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence codante comporte des éléments assurant la sécrétion de ladite protéine ou dudit polypeptide.
8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le plasmide comporte une origine de réplication fonctionnelle dans ladite bactérie.
9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit plasmide comporte une séquence choisie parmi
- un élément d'arrêt de traduction à la fin de la séquenc codante
- un élément d'arrêt de transcription en aval du site BstX1.
10) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le plasmide comporte des éléments permettant son intégration chromosomique.
11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la séquence codante est une séquence codante pour un polymère d'un ou plusieurs amino acides répétés.
12) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'unité répétée dans la séquence répétitive contient en position
COOH terminale un acide aminé chargé positivement ou négativement.
13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le caractère ionique du polypeptide permet son isolement.
14) Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'acide aminé chargé permet le clivage par une protéase spécifique du polypeptide à son niveau.
15) Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'acide aminé chargé peut être enlevé par une carboxypeptidase spécifique.
16) Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le gène marqueur est le gène ECA.
17) Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que la séquence codante comporte tout ou partie du gène gdha correspondant à la figure 1.
18) Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le plasmide comporte tout ou partie des éléments d'expression de la gdhA de la figure 1.
19) Procédé mettant en oeuvre un plasmide comportant tout ou partie du gène de la gdhA de la figure 1.
20) Souche bactérienne obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 19.
21) Procédé de production d'amino acides, de polypeptides et/ou de protéines mettant en oeuvre une souche selon la revendication 20.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9109652A FR2679921B1 (fr) | 1991-07-30 | 1991-07-30 | Procede d'obtention d'une souche bacterienne permettaant l'expression d'une sequence codante determinee. |
| JP5503324A JPH06502548A (ja) | 1991-07-30 | 1992-07-29 | 特にコリネバクテリア中で用いることのできる蛋白質の発現および分泌系 |
| PCT/FR1992/000744 WO1993003158A1 (fr) | 1991-07-30 | 1992-07-29 | Systeme d'expression et de secretion de proteines utilisables en particulier chez les corynebacteries |
| EP92917803A EP0551506A1 (fr) | 1991-07-30 | 1992-07-29 | Systeme d'expression et de secretion de proteines utilisables en particulier chez les corynebacteries |
| US08/508,761 US6027920A (en) | 1991-07-30 | 1995-07-31 | System for protein expression and secretion especially in corynebacteria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9109652A FR2679921B1 (fr) | 1991-07-30 | 1991-07-30 | Procede d'obtention d'une souche bacterienne permettaant l'expression d'une sequence codante determinee. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2679921A1 true FR2679921A1 (fr) | 1993-02-05 |
| FR2679921B1 FR2679921B1 (fr) | 1995-03-03 |
Family
ID=9415705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9109652A Expired - Lifetime FR2679921B1 (fr) | 1991-07-30 | 1991-07-30 | Procede d'obtention d'une souche bacterienne permettaant l'expression d'une sequence codante determinee. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2679921B1 (fr) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2575492A1 (fr) * | 1984-12-27 | 1986-07-04 | Asahi Chemical Ind | Fragment d'adn contenant un gene codant pour la glutamate deshydrogenase, adn recombinant le contenant, et microorganisme contenant l'adn recombinant |
| JPS63214189A (ja) * | 1987-03-04 | 1988-09-06 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Ｌ―グルタミン酸の製造方法 |
| WO1988009821A1 (fr) * | 1987-06-12 | 1988-12-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Systeme d'expression et de secretion coryneforme |
-
1991
- 1991-07-30 FR FR9109652A patent/FR2679921B1/fr not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2575492A1 (fr) * | 1984-12-27 | 1986-07-04 | Asahi Chemical Ind | Fragment d'adn contenant un gene codant pour la glutamate deshydrogenase, adn recombinant le contenant, et microorganisme contenant l'adn recombinant |
| JPS63214189A (ja) * | 1987-03-04 | 1988-09-06 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Ｌ―グルタミン酸の製造方法 |
| WO1988009821A1 (fr) * | 1987-06-12 | 1988-12-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Systeme d'expression et de secretion coryneforme |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| BIO/TECHNOLOGY vol. 8, no. 6, Juin 1990, NATURE AMERICA, INC., NEW YORK, US pages 559 - 563; M.-A. PETIT ET AL.: 'Hypersecretion of a cellulase from clostridium thermocellum in bacillus subtilis by induction of chromosomal dna amplification' * |
| Database WPIL, Derwent publications Ltd., London, GB; acession no. 91-310282, DW9142 * |
| JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY vol. 5, no. 4, 5 Mai 1987, ELSEVIER, AMSTERDAM, THE NETHERLANDS pages 305 - 312; Y. MORINAGA ET AL.: 'Expression of Escherichia coli promoters in Brevibacterium lactofermentum using the shuttle vector pEB003' * |
| pages 72-73, 76-77 * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 13, no. 3 (C-557)(3351) 6 Janvier 1989 & JP-A-63 214 189 ( ASAHI CHEM IND CO LTD ) * |
| PROMEGA product catalogue 1990/91 Published by PROMEGA Corporation, Madison, Wis., USA; Copyright 1990, pages 10, Fig.2A; 11, Tableau 2A; * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2679921B1 (fr) | 1995-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pontius et al. | Renaturation of complementary DNA strands mediated by purified mammalian heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 protein: implications for a mechanism for rapid molecular assembly. | |
| CA1341203C (fr) | Proteines de fusion eucaryotiques contenant des sequences d'interleukin-2 | |
| EP0012494A1 (fr) | Vecteur de transfert d'ADN, microorganisme modifié par ce vecteur et synthèse d'une protéine eucariotique par ce microorganisme modifié | |
| EP0551506A1 (fr) | Systeme d'expression et de secretion de proteines utilisables en particulier chez les corynebacteries | |
| Groarke et al. | The amino acid sequence of D-ribose-binding protein from Escherichia coli K12. | |
| DE3584053D1 (de) | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudinen und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens. | |
| WO2001042306A3 (fr) | Peptides chimeriques comme immunogenes, anticorps contre ces immunogenes et techniques d'immunisation utilisant ces peptides chimeriques ou ces anticorps | |
| RU2001110120A (ru) | Модифицированный сигнальный пептид энтеротоксина-ii e. coli и микроорганизм, экспрессирующий белок слияния упомянутого пептида с гетерологичным белком | |
| AU607973B2 (en) | Process for production of physiologically active peptide containing cysteine residue | |
| DE69432449T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von hydrophoben Polypeptiden, Proteinen und Peptiden | |
| EP1688430A3 (fr) | Polypeptides sécrétés et transmembranaires ainsi que les acides nucléiques codant pour ceux-ci | |
| Ehresmann et al. | Studies of the binding of E. coli ribosomal protein S4 to 16S rRNA after UV irradiation of the S4—16S rRNA complex | |
| FR2478125A1 (fr) | Procedes et materiel genetique pour la production optimale de proteines | |
| Gabbay et al. | The interaction specificity of peptides with DNA. Evidence of peptide β-sheet-DNA binding | |
| FR2679921A1 (fr) | Procede d'obtention d'une souche bacterienne permettaant l'expression d'une sequence codante determinee. | |
| Zemel-Dreasen et al. | Secretion and processing of an immunoglobulin light chain in Escherichia coli | |
| AU1959001A (en) | Histone deacetylase-8 proteins, nucleic acids, and methods of use | |
| Golinska et al. | Identification of a 16‐S RNA fragment crosslinked to protein S1 within Escherichia coli ribosomal 30‐S subunits by the use of a crosslinking reagent: ethyl 4‐azidobenzoylaminoacetimidate | |
| JPH0775581A (ja) | バチルス・ズブチリスの発現及び分泌組換えベクター | |
| Hall et al. | Purification of eukaryotic MutL homologs from Saccharomyces cerevisiae using self-cleaving affinity technology | |
| AU600891B2 (en) | Expression in E. coli of hybrid polypeptides containing the growth hormone releasing factor sequence | |
| HUT50494A (en) | Process for producing peptide analogs in large numbers, as well as new type peptide analogs | |
| WO1997016549A3 (fr) | Clonage moleculaire et caracterisation de molecules liees a la relaxine et a la famille insulinique de ligands | |
| EP0146416A1 (fr) | Vecteur modifié par une partie au moins, sinon la totalité, du gène lam B et micro-organismes transformés par ce vecteur, et rendus aptes à synthétiser une protéine de membrane externe déterminée, codée par un insérat également contenu dans ledit vecteur | |
| EP0797672A1 (fr) | Utilisation d'un systeme de secretion sec-dependant pour secreter des proteines normalement secretees par un systeme de secretion sec-independant |