DE69432449T2

DE69432449T2 - Verfahren zur Herstellung von hydrophoben Polypeptiden, Proteinen und Peptiden

Info

Publication number: DE69432449T2
Application number: DE69432449T
Authority: DE
Inventors: Heinz Döbeli; Nicholas Draeger; Gerda Huber Trottman; Peter Jakob; Dietrich Stüber
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1993-07-06
Filing date: 1994-06-23
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2014-06-24
Also published as: ZA944686B; EP1304381A3; EP0641861A2; RU94023251A; AU666274B2; EP1304381A2; DK0641861T3; JPH07102000A; CN1916017A; JP2947401B2; EP0641861A3; CN1098416A; CN100439391C; CA2125467A1; CN1057535C; DE69432449D1; ES2194017T3; CN1227846A; JPH1143500A; EP0641861B1

Description

Die Möglichkeiten der Herstellung von Hybridgenen durch Gentechnologie eröffnen neue Wege zur Aufarbeitung von rekombinanten Proteinen. Indem die codierende Gensequenz eines gewünschten Proteins mit der codierenden Gensequenz eines Proteinfragments mit hoher Affinität für einen Liganden (Affinitätspeptid) verbunden wird, ist es möglich, gewünschte rekombinante Proteine in Form von Fusionsproteinen in einem Schritt unter Verwendung des Affinitätspeptids zu reinigen. Durch ortsgerichtete Mutagenese ist es auch möglich, spezifische chemische oder enzymatische Spaltstellen am Verbindungspunkt von Affinitätspeptid und gewünschtem rekombinanten Protein einzuführen, so dass nach der Reinigung des Fusionsproteins mit Hilfe eines geeigneten Affinitätsharzes das gewünschte rekombinante Protein durch chemische oder enzymatische Spaltung gewonnen werden kann.
Die Gewinnung des gewünschten rekombinanten Proteins kann sich jedoch als extrem schwierig herausstellen, wenn das gewünschte rekombinante Protein auch solche chemischen oder enzymatischen Spaltstellen in seiner Aminosäuresequenz enthält. In solchen Fällen endet das gewünschte rekombinante Protein, indem es sehr schnell abgebaut wird.
Um diesen Abbau zu hemmen, liefert die vorliegende Erfindung Fusionsproteine und Verfahren, die die selektive Spaltung an einer spezifischen chemischen oder enzymatischen Spaltstelle zulassen, ohne das gewünschte rekombinante Protein zu beeinflussen. Die Methoden der vorliegenden Erfindung sind spezifisch anwendbar zur Herstellung von hydrophoben Polypeptiden, Proteinen oder Peptiden.
Genauer betrifft die vorliegende Erfindung Fusionsproteine der Formel
A-B-C
worin A ein sperriges hydrophiles Peptid ist, B eine ausgewählte Spaltstelle ist und C ein gewünschtes hydrophobes Polypeptid, Protein oder Peptid ist.
Der Ausdruck "sperriges hydrophiles Peptid", der in Zusammenhang mit den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, betrifft hydrophile Peptide, die durch ihre Größe und den Gehalt an hydrophilen Aminosäuren gekennzeichnet sind, was eine gut strukturierte Domäne entstehen lässt.
Das sperrige hydrophile Peptid A der Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung hat eine Doppelfunktion: a) eine hohe Expression der Fusionsproteine zu erleichtern und b) die Spaltstelle C für die mobile Phase auf einer hydrophoben Matrixsäule freizulegen. Bevorzugte sperrige hydrophile Peptide der Fusionsproteine gemäß der vorliegenden Erfindung sind solche mit der Peptidsequenz der Formel
(NANP)x
worin x 10 bis 40 ist und 19 am meisten bevorzugt ist.
Als ausgewählte Spaltstellen kommen chemische oder enzymatische Spaltstellen in Betracht. Als geeignete ausgewählte enzymatische Spaltstellen kommen die Aminosäuresequenzen -(Asp)_n-Lys-, worin n 2, 3 oder 4 bedeutet, oder -Ile-Glu-Gly-Arg- in Betracht, die spezifisch von den Proteasen Enterokinase bzw. Koagulationsfaktor X_a erkannt werden können, ein Argininrest oder ein Lysinrest, der durch Trypsin gespalten wird, ein Lysinrest, der durch Lysylendopeptidase gespalten wird, oder ein Glutaminrest, der durch V8-Protease gespalten wird. Als geeignete ausgewählte chemische Spaltstellen kommen in Betracht Tryptophanreste, die durch 3-Brom-3-methyl-2-(2-nitrophenylmercapto)-3H-indol gespalten werden, Cysteinreste, die durch 2-Nitroso-5-thiocyanobenzoesäure gespalten werden, Aminosäuredipeptide Asp-Pro oder Asn-Gly, die durch Säure bzw. Hydroxylamin gespalten werden und bevorzugt ein Methioninrest, der spezifisch durch Cyanogenbromid (CNBr) gespalten wird.
Der Ausdruck "hydrophobes Polypeptid, Protein oder Peptid", der im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Fusionsproteinen verwendet wird, betrifft hydrophobe Polypeptide, Proteine oder Peptide, die von Reverse-Phase-HPLC-Säulen mit Konzentrationen zwischen 30 und 60%, bevorzugt etwa 40% organischer Lösungsmittel in wässrigem Puffer, z. B. bei einer Konzentration von mehr als 40% Ethanol in wässrigem Puffer, eluiert werden.
Als hydrophobe Polypeptide, Proteine oder Peptide kommen z. B. Oberflächenantigene, Lymphokinrezeptoren, HIV-1- und HIV-2-Hüll- und Strukturproteine, Hepatitis-C-Hüll- und Strukturproteine oder jedes Peptid mit Membranankersequenzen in Betracht. Ein bevorzugtes hydrophobes Peptid ist das Peptid mit der Sequenz
Die sperrigen hydrophilen Peptide und die ausgewählten Spaltstellen der Fusionsproteine gemäß der vorliegenden Erfindung können entweder an der aminoterminalen Aminosäure oder der carboxyterminalen Aminosäure des hydrophoben Polypeptids, Proteins oder Peptids gebunden sein.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können gegebenenfalls spezifische Sequenzen enthalten, die bevorzugt an ein Affinitätsträgermaterial binden. Beispiele für solche Sequenzen sind Sequenzen, die mindestens zwei benachbarte Histidinreste enthalten (siehe in dieser Hinsicht Europäische Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 282 042). Solche Sequenzen binden selektiv an Nitrilotriessigsäurenickelchelatharze (Hochuli und Döbeli, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 368, 748 (1987); Euro päisches Patent Nr. 253 303). Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung, die eine solche spezifische Sequenz enthalten, können daher selektiv von den verbleibenden Polypeptiden abgetrennt werden. Die spezifische Sequenz kann entweder an die Aminosäuresequenz des sperrigen hydrophilen Peptids oder die Aminosäuresequenz des hydrophoben Polypeptids, Proteins oder Peptids gebunden sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Gene, die diese Fusionsproteine codieren, Expressionsvektoren, die diese Gene enthalten, Mikroorganismen, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert sind ebenso wie ein Verfahren zur Herstellung solcher Gene, Expressionsvektoren und transformierter Mikroorganismen.
Die Herstellung der Fusionsproteine gemäß der Erfindung kann mit Methoden der rekombinanten Gentechnik bewirkt werden, die in der Literatur beschrieben sind. Bevorzugt wird erst eine Nucleotidsequenz, die das gewünschte hydrophobe Polypeptid, Protein oder Peptid codiert, synthetisiert und dann mit einer Nucleotidsequenz verbunden, die das sperrige hydrophile Peptid und die ausgewählte Spaltstelle codiert.
Der Einbau des so erhaltenen Hybridgens in Expressionsvektoren wird auch in an sich bekannter Weise bewirkt . In diesem Zusammenhang kann Bezug genommen werden auf die Lehrbücher von Maniatis et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Laboratory, 1982) und Sambrook et al. ("Molecular Cloning – A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) .
Die Methoden zur Expression der Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung sind auch an sich bekannt und werden im Detail in den vorher erwähnten Lehrbüchern beschrieben. Sie umfassen die folgenden Verfahren:

a) Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhafterweise E. coli, mit einem Expressionsvektor, in dem ein vorher erwähntes Hybridgen operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist;
b) Kultivierung des so erhaltenen Wirtsorganismus unter geeigneten Wachstumsbedingungen und
c) Extraktion und Isolierung des gewünschten Fusionsproteins aus dem Wirtsorganismus.

Als Wirtsorganismen kommen Gram-negative und Gram-positive Bakterien, z. B. E. coli- und B. subtilis-Stämme in Betracht. E. coli-Stamm M15 ist ein besonders bevorzugter Wirtsorganismus für die vorliegende Erfindung. Außer dem oben erwähnten E. coli-Stamm können jedoch auch andere allgemein zugängliche E. coli-Stämme verwendet werden, z. B. E. coli 294 (ATCC Nr. 3144), E. coli RR1 (ATCC Nr. 31343) und E. coli W3110 (ATCC Nr. 27325) .
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine lassen die ausgewählte Spaltung an einer spezifischen chemischen oder enzymatischen Spaltstelle zu, ohne das gewünschte hydrophobe Polypeptid, Protein oder Peptid zu beeinflussen. Die Diffusion des gewünschten hydrophoben Polypeptids, Proteins oder Peptids in die feste Phase einer hydrophoben Matrixsäule ermöglicht es, die Fusionsproteine gemäß der Erfindung so zu orientieren, dass das gewünschte hydrophobe Polypeptid, Protein oder Peptid verborgen wird. Das sperrige hydrophile Peptid legt andererseits die ausgewählte Spaltstelle für die mobile wässrige Phase frei. Dies lässt es zu, das sperrige hydrophile Peptid durch ausgewählte Spaltung zu entfernen, wobei nur das gewünschte hydrophobe Polypeptid, Protein oder Peptid an die Säule gebunden zurückbleibt. Das gewünschte hydrophobe Polypeptid, Protein oder Peptid kann dann durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln eluiert werden.
Somit liefert die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren, das die Herstellung und Reinigung eines gewünschten hydrophoben Polypeptids, Proteins oder Peptids zulässt, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, dass

a) eine wässrige Lösung, die ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, durch eine hydrophobe Matrixsäule geleitet wird,
b) die Säule mit einer Lösung gespült wird, die ein Spaltreagenz oder ein Enzym enthält und
c) das entstehende gewünschte hydrophobe Polypeptid, Protein oder Peptid mit einem wässrigen mit Wasser mischbaren Lösungsmittel entfernt wird.

Als hydrophobe Matrixsäulen kommen Siliciumdioxidmatrixsäulen mit gebundenen Cyanopropyl-, Cyclohexyl-, Phenyl-, Octyloder Octadecylgruppen in Betracht. Bei der bevorzugten Ausführung der Erfindung wird eine RP-18-(Silicamikroteilchen mit gebundenem Octadecyl)-Säule unter Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie-(HPLC)-Bedingungen verwendet.
Vor der Beladung mit dem Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung wird die hydrophobe Matrixsäule geeigneterweise mit einem wässrigen Puffer equilibriert. Der Equilibrierungspuffer kann ein denaturierendes Mittel oder ein chaotropes Mittel, z. B. Guanidin-HCl, Harnstoff oder ein Detergenz, z. B. Triton, enthalten. Die Zugabe eines solchen denaturierenden Mittels, chaotropen Mittels oder Detergenz lässt den problemfreien Betrieb sogar mit Fusionsproteinen gemäß der vorliegenden Erfindung zu, die extrem schwierig in wässriger Lösung zu solubilisieren sind.
Das erfindungsgemäße Fusionsprotein wird auf die hydrophobe Matrixsäule in wässrigem Puffer aufgetragen, der auch ein denaturierendes Mittel oder ein Detergenz, z. B. Guanidin-HCl, Harnstoff oder Triton enthalten kann.
Die Spaltung wird durchgeführt, indem die Säule mit einem wässrigen Puffer gespült wird, der ein Spaltreagenz oder ein Enzym enthält. Die optimale Pufferzusammensetzung hängt von dem Spaltreagenz oder Enzym, das verwendet wird, ab und wird geeigneterweise von Fall zu Fall bestimmt.
Die Elution der gewünschten hydrophoben Polypeptide, Proteine oder Peptide kann durchgeführt werden unter Verwendung eines Gradienten in einem wässrigen mit Wasser mischbaren Lösungsmittel. Geeignete mit Wasser mischbare Lösungsmittel für diesen Zweck schließen Alkanole, wie n-Propanol, 2-Propanol, Ethanol, Methanol, tert.-Butanol oder cyclische Ether, wie Dioxan, ein. Die optimalen Elutionsbedingungen hängen von dem gewünschten hydrophoben Polypeptid, Protein oder Peptid, das gereinigt werden soll, der hydrophoben Matrix, den Säulendimensionen etc. ab und werden geeigneterweise von Fall zu Fall bestimmt.
Das vorher erwähnte Verfahren lässt die Herstellung und Reinigung eines gewünschten hydrophoben Polypeptids, Proteins oder Peptids zu und kann auch diskontinuierlich durchgeführt werden. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein wird dann an einer hydrophoben Matrix in wässrigem Puffer absorbiert. Die Spaltung wird durchgeführt, indem die hydrophobe Matrix mit einem wässrigen Puffer, der das Spaltreagenz oder das Enzym enthält, inkubiert wird. Das gewünschte hydrophobe Polypeptid kann erhalten werden, indem die hydrophobe Matrix mit dem wässrigen mit Wasser mischbaren Lösungsmittel nach Entfernung des Spaltreagenz oder Enzyms und der sperrigen hydrophilen Peptide inkubiert wird.
Das neue Verfahren lässt die Herstellung und Reinigung eines gewünschten hydrophoben Polypeptids, Proteins oder Peptids zu und wird auch angewendet, um HIV-I-Hüllpeptid mit SEQ ID Nr. 11 bis zur Homogenität zu reinigen unter Verwendung von Be dingungen, analog denen, die in Referenzbeispiel 1 verwendet werden.
Das Peptid mit SEQ ID Nr. 11, das mit dem neuen Verfahren erhalten wird, kann verwendet werden, um HIV-Infektionen zu diagnostizieren.
Diese Beispiele können besser verstanden werden, wenn sie im Zusammenhang mit den beigefügten Figuren gelesen werden. Die folgenden Symbole erscheinen in diesen Figuren:
"N25OPSN25OP29" bedeutet das regulierbare Promotor/Operatorelement N25OPSN25OP29. "RBSII" bedeutet die synthetische ribosomale Bindungsstelle RBSII; "[His]6", "[NANP]19" und "amy" bedeuten die Gene, die die 6xHis-NANP-Amyloidfusionsproteine dieser Erfindung codieren; "bla", "cat", "lacI" und "neo" bedeuten die Gene für β-Lactamase, Chloramphenicol, Acetyltransferase, lac-Repressor bzw. Neomycinphosphotransferase; "to", "TE" und "T1" bedeuten die Transkriptionsterminatoren T₀ des Phagen λ, TE des Phagen T7 und T1 des E. coli rrnB-Operons; "repl." bedeutet die Replikationsregionen der Plasmide pBR322 und pREP4.
1 ist eine schematische Zeichnung des Plasmids pREP4.
2 ist eine schematische Zeichnung des Plasmids p6xHis-NANP-Met-Amy.
3 zeigt den Teil der Nucleotidsequenz des Plasmids p6xHis-NANP-Met-Amy (SEQ ID Nr. 7), der das Fusionsprotein 6xHis-NANP-Met-Amy (SEQ ID Nr. 8) codiert. In dieser Sequenz sind die Erkennungssequenzen einiger in 2 dargestellten Restriktionsenzyme gezeigt. Die gezeigte Aminosäuresequenz zeigt im Dreibuchstaben-Code die Sequenz des Fusionsproteins 6xHis-NANP-Met-Amy, Aminosäuren, die dem bA4-Peptid entsprechen, sind nummeriert.
4 ist eine schematische Zeichnung des Plasmids pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy.
5 zeigt den Teil der Nucleotidsequenz von Plasmid pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy (SEQ ID Nr. 9), der das Fusionsprotein 6xHis-NANP-Met-huAmy (SEQ ID Nr. 10) codiert. In dieser Sequenz sind die Erkennungssequenzen einiger in 4 dargestellter Restriktionsenzyme angegeben. Die gezeigte Aminosäuresequenz zeigt im Dreibuchstaben-Code die Sequenz des Fusionsproteins 6xHis-NANP-Met-huAmy, Aminosäuren, die dem bA4-Peptid entsprechen, sind nummeriert. Der untere Teil der Figur zeigt die Nucleotidsequenzen und codierten Aminosäuren von Plasmid pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E], die das Fusionsprotein 6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E] codieren, Plasmid pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L], das das Fusionsprotein 6xHis-NANP-Met-huAmy [M35L] codiert, Plasmid pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q], das das Fusionsprotein 6xHis-NANP-MethuAmy[M35Q] codiert und Plasmid pB/E1-6xHis-NANP-MethuAmy[M35S], das das Fusionsprotein 6xHis-NANP-MethuAmy[M35S] codiert, das sich von Plasmid pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy unterscheidet.
6 gibt die Ergebnisse der bA4-Analyse mit nicht denaturierender Agarosegel-Elektrophorese an. Diese Analyse wurde durchgeführt mit "Serum Protein Electrophoresis System Paragon" von Beckman nach den Empfehlungen des Lieferanten. 8 μg (in 2 μl H₂O) Peptid wurden jeweils aufgetragen. Die Anfärbung erfolgte mit Coomassie-Brillantblau 3 Stunden lang und das Entfärben mit 10% Essigsäure, 45% Methanol und 45% Wasser. Die Proben wurden in destilliertem Wasser direkt vor dem Experiment (f) hergestellt oder zwei Tage (a) altern gelassen. Die getesteten Proben sind in der Liste unten angegeben.
Gel c zeigt die Ergebnisse für einen Vergleich der Punktmutanten M35Q bA4 und M35E bA4. Die Punktmutante M35E bA4 enthält eine extra negative Ladung, die zu einer höheren Mobilität auf dem Beckman-Gel führt (Bahn 8: M35E bA4; Bahn 9: M35Q bA4). Wenn M35E bA4 mit M35Q bA4 vermischt wird nach der Spaltung (Bahn 1) oder wenn das Fusionsprotein, das M35Q bA4 enthält, mit dem Fusionsprotein, das M35E bA4 enthält, gemischt wird und gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gespalten wird (Bahnen 3, 4, 5 und 6 (Waschlösungen 1, 2, 3 und 4)) wird eine klare Trennung beobachtet, was die Anwesenheit von monomerem bA4 andeutet.
7 zeigt die Ergebnisse der bA4-Chromatographie auf einer Größenausschlusssäule.
Fraktionen von jeweils 250 ml wurden gesammelt und mit nicht denaturierender Elektrophorese analysiert. Bahn 1: bA4 aufgetragen auf die Säule. Bahnen 2 bis 10: Peakfraktionen.
Die Markerproteine, die verwendet wurden, um die Größe von bA4 zu bestimmen, waren:
Die Retentionszeit von 22,54 Minuten deutet auf ein Monomer mit einem MW von etwa 4500 Dalton. Dies stimmt überein mit den Lichtstreuungsdaten und den Ultrazentrifugationsexperimenten mit der Yphantis-Methode (D. A. Yphantis, Annals of the N. Y. Acad. Sci., 88, 586–601 [1960]).
Beispiel 1
Expressionsplasmid, das für die Herstellung des Fusionsproteins 6xHis-NANP-Met-Amy verwendet wird
Das Expressionsamid p6xHis-NANP-Met-Amy (siehe 2 und 3) wurde zur Herstellung des Fusionsproteins 6xHis-NANP-Met-Amy verwendet. E. coli-M15-Zellen, die mit den Plasmiden pREP4 und p6xHis-NANP-Met-Amy transformiert waren, wurden gemäß dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, BRD, am 18. Mai 1993 unter der Hinterlegungsnummer DSM 8310 hinterlegt.
Beispiel 2
Expressionsplasmid, das zur Herstellung des Fusionsproteins 6xHis-NANP-Met-huAmy verwendet wird
Das Expressionsamid pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy (siehe 4 und 5) wurde zur Herstellung des Fusionsproteins 6xHis-NANP-Met-huAmy verwendet. E. coli-M15-Zellen, die mit den Plasmiden pREP4 und pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy transformiert waren, wurden gemäß dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, BRD, am 18. Mai 1993 mit der Hinterlegungsnummer DSM 8311 hinterlegt.
Beispiel 3
Expressionsplasmide, die zur Herstellung der Fusionsproteine 6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L], 6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q], 6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S] und 6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E] verwendet wurden
Die Expressionsplasmide pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L], pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q], pB/E1-6xHis-NANP-MethuAmy[M35S] und pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E], die sich von Plasmid pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy nur in den Nucleotiden unterscheiden, die die Aminosäure 35 des bA4-Amyloidpeptids codieren (siehe 5), wurden zur Herstellung der Fusionsproteine 6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L], 6xHis-NANP-MethuAmy[M35Q], 6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S] und 6xHis-NANP-MethuAmy[M35E] verwendet. E. coli-M15-Zellen, die mit den Plasmiden pREP4 und pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L], pREP4 und pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q], pREP4 und pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S] und pREP4 und pB/E1-6xHis-NANP-MethuAmy[M35E] transformiert waren, wurden gemäß dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, BRD, am 18. Mai 1993 mit den Hinterlegungsnummer DSM 8313, DSM 8314, DSM 8315 bzw. DSM 8312 hinterlegt.
Beispiel 4
Fermentation und Reinigung der Fusionsproteine Fermentation
Die Plasmide p6xHis-NANP-Met-Amy, pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy, pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L], pB/E1-6xHis-NANP-MethuAmy[M35Q], pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S] bzw. pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E] wurden mit Standardmethoden (Sambrook et al., oben) in E. coli-M15-Zellen transformiert, die bereits das Plasmid pREP4 enthielten. Transformierte Zellen wurden bei 37°C in einem 100-l-Fermenter in Supermedium (Stüber et al., Immunological Methods, Herausgeber Lefkovits und Pernis, Academic Press, Inc., Bd. IV, 121–152 [1990)], das 100 mg/l Ampicillin und 25 mg/l Kanamycin enthielt, gezüchtet. Bei einer optischen Dichte von etwa 1,0 bei 600 nm wurde IPTG auf eine Endkonzentration von 2 mM zugegeben. Nach weiteren 3 Stunden bei 37°C wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Bei einem typischen Fermentationsdurchlauf wurde eine Biomasse von ungefähr 500 g, die mindestens 3 g des rekombinanten Fusionsproteins enthielt, erhalten.
Reinigung
2,5 l 6 M Guanidin-HCl, das 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat, pH 8, enthielt, wurden zu den Zellen zugegeben und 24 Stunden lang gerührt. Rohe Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand wurde dann durch Querstromfiltration unter Verwendung einer 0,3 mm-Membran geklärt. Das Protein, das in dem Filtrat enthalten war, wurde dann an einer Ni-NTA-Säule (5 cm × 24 cm, Durchfluss 20 ml/min) adsorbiert. Kontaminierende E. coli-Proteine wurden zuerst durch Waschen mit 8 M Harnstoff, pH 7,5, entfernt. Die Elution wurde mit 8 M Harnstoff, pH 4, durchgeführt. Das Chromatogramm wurde mit SDS-PAGE überwacht und die Fraktionen, die Fusionsproteine enthielten, wurden gesammelt. Ein kleines Aliquot dieses Pools wurde mit EDTA vermischt und durch Dialyse gegen Wasser entsalzt, lyophilisiert und dann mit Elektrospray-Massenspektrometrie (Tabelle 1) analysiert.
Tabelle 1: Charakterisierung der Fusionsproteine
Referenzbeispiel 1
Spaltung der Fusionsproteine, was 1-42b-Amyloidpeptide liefert
Eine semipräparative RP-18-HPLC-(Vidac, Spezifikation 218TP 152010, 250 mm × 10 mm)-Säule wurde zuerst mit 8 M Harnstoff, pH 4, mit einer Durchflussrate von 2 ml/min equilibriert. Dann wurde ein Aliquot des NTA-Eluats, das 400 mg Fusionsprotein in 8 M Harnstoff, pH 4, enthielt, auf die Säule mit einer Durchflussrate von 1 ml/min gepumpt. Dann wurde die Säule mit 8 M Harnstoff, pH 4, mit einer Durchflussrate von 2 ml/min gewaschen. Der Harnstoff wurde mit Wasser bei einer Durchflussrate von 2 ml/min ausgewaschen, bis die Basislinienabsorption am Säulenauslass erreicht war. Die Spaltung wurde durchgeführt, indem die Säule 24 Stunden bei 22°C mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min mit 45 mg/ml CNBr gespült wurde in einer Lösung, die aus 20% Ethanol, 40% Ameisensäure und 40% Wasser zusammengesetzt war. Die Säule wurde dann mit 0,1 M EDTA mit einer Durchflussrate von 2 ml/min gespült und CNBr wurde zusammen mit freigesetztem MRGSHHHHHHGS-(NANP)_19- RSM mit 0,05% Trifluoressigsäure mit einer Durchflussrate von 2,0 ml/min ausgewaschen. b-Amyloidpeptid mit 1–42 Resten wurde mit einer Durchflussrate von 2 ml/min eluiert unter Verwendung des folgenden Ethanolgradienten, der pro Zeitpunkt angegeben ist: (min/% Ethanol) 0/0, 40/40, 45/50, 50/65, 55/100, 60/100, 65/0.
Ein breiter Peak, der b-Amyloidpeptid enthält, tritt nach 45 bis 60 Minuten auf. Kritisch dafür, dass das Peptid monomer ist, war die sofortige Verdünnung mit destilliertem Wasser (z. B. indem das Eluat in einen gerührten Becher getropft wurde, der 200 ml H₂O enthielt) und sofortige Lyophilisierung. Das entstehende Pulver wurde W1 genannt. Da eine erhebliche Menge an b-Amyloidpeptid auf der Säule blieb, wurde die Elution dreimal wiederholt unter Verwendung des oben angegebenen Protokolls, was die Proben W2, W3 und W4 ergab. Diese Proben wurden auf Reinheit (Tabelle 2) und die Menge an monomerem bA4 [6] getestet. Die korrekte chemische Struktur der Peptide wurde mit Elektrospray-Massenspektrometrie (Tabelle 3), Aminosäureanalyse und aminoterminale Sequenzierung (Tabelle 3) verifiziert.
Tabelle 2: Herstellung von 1-42-b-Amyloidpeptiden
Die Reinheit basiert auf der Aminosäureanalyse, der Gehalt des Fusionsproteins wird bestimmt durch den Quotienten von Asp zu Glu. Reines 1-42-b-Amyloidpeptid hat 4 Glu- und 4 Asp-Reste, reines Fusionsprotein hat ein Verhältnis von 42 Asp zu 4 Glu.
Tabelle 3: Identifizierung von 1-42-b-Amyloidpeptiden
Referenzbeispiel 2
Reinigung von monomerem 1-42-bA4
Methode in kleinem Maßstab
Proben, die 1 mg bA4 enthielten, wurden auf eine LKB Ultro-Pac-HPLC-Säule (Durchmesser: 7,5 mm, Länge: 600 mm, Durchfluss 0,5 ml/min, Puffer: 12 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, der 200 mM Glycin enthält, pH 7,8). bA4 trat als scharfer Peak aus und die Peakfraktionen enthielten die Coo-auf dem Agaroseelektrophoresegel, das in 7 gezeigt ist. Lichtstreuungsversuche ergaben keinen Hinweis auf Formen mit hohem Molekulargewicht (Aggregate oder Fasern) und Kalibrierungsstandards, die unter identischen Bedingungen chromatographiert wurden, deuteten auf ein Molekulargewicht von etwa 4500, was darauf hindeutet, dass bA4 als Monomer vorhanden war.
Methode im präparativen Maßstab
Die "Continuous Elution Electrophoresis system Model 491 Prep Cell" von BioRad wurde verwendet. Das nicht denaturierende diskontinuierliche Acrylamidgel war aus 4% Acrylamid/2,7% N,N'-Methylenbisacrylamid-Trenngel in 0,375 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan (pH 8,8) mit einer Länge von 3 cm und einem Durchmesser von 37 mm aufgebaut und mit einem Kühlrohr von 20 mm Durchmesser ausgestattet.
Das Stapelgel war aus 4% Acrylamid/2,7% N,N'-Methylenbisacrylamid in 0,125 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan (pH 6,8) aufgebaut und hatte eine Länge von 2 cm. Der Durchlaufpuffer war 25 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan/0,2 M Glycin, pH 8,3. Für die Elution wurde der gleiche Puffer mit einer Durchflussrate von 0,75 ml/min verwendet. 45 mg bA4-Peptid, allgemein aus den Waschlösungen 2, 3 oder 4, wurden in 7 ml H₂O und 1 ml Glycerin gelöst. Die Elektrophorese wurde bei 12 Watt (konstant, Grenzen bei 500 V und 40 mA) durchgeführt, ein typischer Durchlauf erforderte 4 Stunden. Die Ergebnisse eines typischen Durchlaufs sind in 7 gezeigt.
Beispiel 5
Reinigung von HIV-1-Hüllpeptid
400 mg Fusionsprotein MRGS(H)₆GS(NANP)₁₉RSM RILA VERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS (SEQ ID Nr. 12), das mit den gleichen Methoden, wie oben für die Herstellung und Reinigung der Fusionsproteine, die monomeres 1-42-bA4 (Beispiele 1 bis 4) enthielten, beschrieben, hergestellt und gereinigt worden waren, wurden auf eine Vydac-RP-18-Säule (Spezifikation 218 TP 152010, 250 mm × 10 mm) aufgegeben und unter den gleichen Bedingungen gespalten, wie für die Spaltung der 1-42-bA4-Fusionsproteine (Referenzbeispiel 1) beschrieben. Ungefähr 20 bis 30 mg lyophilisiertes Pulver wurden erhalten. Dieses Pulver wurde mit Elektrosprayanalyse analysiert. Ein Peak von 3902 ± 2 Da, der dem HIV-1-Hüllpeptid (SEQ ID Nr. 11) entsprach, wurde nachgewiesen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Fusionsprotein der Formel A-B-C, worin A ein sperriges hydrophiles Peptid ist, wobei das sperrige hydrophile Peptid eine Peptidsequenz der Formel (NANP)_x hat, worin x 10 bis 40, bevorzugt 19 ist, B eine ausgewählte Schnittstelle ist und C ein gewünschtes hydrophobes Polypeptid, Protein oder Peptid ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die ausgewählte Schnittstelle eine chemische Schnittstelle ist, bevorzugt ein Methioninrest, die spezifisch durch Bromcyan gespalten wird.
Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das gewünschte hydrophobe Peptid das HIV-1-Envelope-Peptid mit [SEQ ID Nr. 11] ist.
Gene, die ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codieren.
Expressionsvektoren, bei denen ein Gen gemäß Anspruch 4 operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist.
Bakterium, das mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert ist.
Bakterium nach Anspruch 6, das E. coli ist.
Verfahren zur Herstellung und Reinigung eines gewünschten hydrophoben Polypeptids, Proteins oder Peptids, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, dass: a) eine wässrige Lösung, die ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält, über eine Säule mit einer hydrophoben Matrix geleitet wird, b) die Säule mit einer Lösung gespült wird, die ein Spaltreagenz oder ein Enzym enthält und c) das entstehende gewünschte hydrophobe Polypeptid, Protein oder Peptid mit einem wässrigen wassermischbaren Lösungsmittel entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Säule mit hydrophober Matrix eine Siliciumdioxidmikroteilchensäule mit gebundenen Octadecylgruppen ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei das Spaltreagenz Bromcyan ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das gewünschte hydrophobe Peptid HIV-1-Envelope-Peptid mit [SEQ ID Nr. 11) ist.
Verwendung eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung und Reinigung des gewünschten hydrophoben Polypeptids, Proteins oder Peptids C.