JP2947401B2 - 疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドの製造方 法 - Google Patents

疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドの製造方 法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、疎水性ポリペプチド、
タンパク質又はペプチドを含有する融合タンパク質、そ
れを用いる疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチ
ドの製造方法、これら融合タンパク質をコードする遺伝
子、これら遺伝子を含有する発現ベクター、これら発現
ベクターで形質転換された微生物、並びに前記遺伝子、
発現ベクター及び形質転換微生物の作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子技術によるハイブリッド遺伝子の
作製の可能性は、組換えタンパク質の作製に新たなルー
トを切り開いている。目的のタンパク質のコーディング
遺伝子配列をあるリガンドに対して高い親和性を有する
タンパク質断片（親和性ペプチド）のコーディング遺伝
子配列と連結することによって、該親和性ペプチドを用
いて１段階で目的の組換えタンパク質を融合タンパク質
の形で精製することが可能である。部位特異的変異誘発
法により、該親和性ペプチドと目的の組換えタンパク質
との連結点に特異的な化学又は酵素開裂部位を導入する
ことも可能であり、その結果、適当な親和性樹脂による
該融合タンパク質の精製後に、目的の組換えタンパク質
を化学又は酵素開裂により回収することができる。しか
しながら、目的の組換えタンパク質の回収は、該目的の
組換えタンパク質もそのアミノ酸配列内にかかる化学又
は酵素開裂部位を含有する場合には、極端に難しいこと
が分かる。かかる場合には、該目的の組換えタンパク質
はついには急速に分解されてしまう。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記分解を阻止するた
め、本発明は、目的の組換えタンパク質を害することな
しに特異的な化学又は酵素開裂部位で選択的に開裂する
融合タンパク質及び方法を提供することを目的とする。
本発明の方法は、とりわけ、疎水性ポリペプチド、タン
パク質又はペプチドの製造に応用できる。
【課題を解決するための手段】より詳しくは、本発明
は、式： Ａ−Ｂ−Ｃ （式中、Ａは嵩高い親水性ペプチドであり、Ｂは選択的
開裂部位であり、そしてＣは目的の疎水性ポリペプチ
ド、タンパク質又はペプチドである。）の融合タンパク
質に関する。本発明による融合タンパク質に関連して用
いられる“嵩高い親水性ペプチド”という用語は、その
サイズと明確に構造化されたドメインのもとになる親水
性アミノ酸の含量とにより特徴付けられる親水性ペプチ
ドをいう。本発明による融合タンパク質の嵩高い親水性
ペプチドＡは、ａ）該融合タンパク質の高発現を促進
し、ｂ）疎水性マトリックスカラムの移動相に開裂部位
Ｃを露出させるという二重の機能を果たす。本発明によ
る融合タンパク質の好ましい嵩高い親水性ペプチドは、
式： （ＮＡＮＰ）x （式中、ｘは１０〜４０であり、１９が最も好まし
い。）のペプチド配列を有するペプチドである。
【０００４】選択的開裂部位としては、化学又は酵素開
裂部位が挙げられる。適する選択的酵素開裂部位として
は、プロテアーゼであるエンテロキナーゼ及び凝固因子
Ｘaによってそれぞれ特異的に認識され得るアミノ酸配
列−（Ａｓｐ）n −Ｌｙｓ−（ｎは２、３又は４を表
す）又は−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、トリプ
シンにより開裂されるアルギニン残基又はリシン残基、
リシルエンドペプチダーゼにより開裂されるリシン残
基、又はＶ８プロテアーゼにより開裂されるグルタミン
残基が挙げられる。適する選択的化学開裂部位として
は、３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニ
ルメルカプト）−３Ｈ−インドールにより開裂されるト
リプトファン残基、２−ニトロソ−５−チオシアノ安息
香酸により開裂されるシステイン残基、それぞれ酸及び
ヒドロキシルアミンにより開裂され得るアミノ酸ジペプ
チドＡｓｐ−Ｐｒｏ又はＡｓｎ−Ｇｌｙが挙げられ、臭
化シアン（ＣＮＢｒ）により特異的に開裂されるメチオ
ニン残基が好ましい。
【０００５】本発明による融合タンパク質に関連して用
いられる“疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチ
ド”という用語は、水性緩衝液中３０〜６０％、好まし
くは約４０％の有機溶媒の濃度で、例えば、水性緩衝液
中４０％より高いエタノール濃度で逆相ＨＰＬＣカラム
から溶出する疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプ
チドをいう。疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプ
チドとしては、例えば、表面抗原、リンフォカインレセ
プター、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のエンベロープ及び
構造タンパク質、Ｃ型肝炎ウィルスのエンベロープ及び
構造タンパク質又は膜アンカー配列を有するあらゆるペ
プチドが挙げられる。好ましい疎水性ポリペプチド、タ
ンパク質又はペプチドは、配列： を有するｂ−アミロイドペプチド（ｂＡ４−アミロイ
ド）、位置３５においてメチオニン又はメチオニンスル
ホキシド残基の代わりにロイシン（配列番号：３）、セ
リン（配列番号：４）、グルタミン（配列番号：５）又
はグルタミン酸（配列番号：６）残基を有するｂＡ４−
ペプチドの点突然変異体、及び配列： を有するＨＩＶ−１エンベロープペプチドである。
【０００６】本発明による融合タンパク質の嵩高い親水
性ペプチド及び選択的開裂部位は、疎水性ポリペプチ
ド、タンパク質又はペプチドのアミノ末端アミノ酸か、
カルボキシ末端アミノ酸のいずれかに連結することがで
きる。本発明による融合タンパク質は、好ましくは親和
性キャリヤー物質に結合する特異的配列を任意に含有し
てもよい。かかる配列の例は、少なくとも２つの隣接す
るヒスチジン残基を含有する配列である（この点に関し
てヨーロッパ特許出願公報第２８２０４２号を参照のこ
と）。かかる配列は、ニトリロトリ酢酸ニッケルキレー
ト樹脂に選択的に結合する（ホチュリ(Hochuli) 及びド
ベリ (Dobeli),Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 748 (1
987) ；ヨーロッパ特許第２５３３０３号）。従って、
かかる特異的配列を含有する本発明の融合タンパク質
は、他のポリペプチドから選択的に分けることができ
る。該特異的配列は、嵩高い親水性ペプチドのアミノ酸
配列か、疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチド
のアミノ酸配列のいずれかに連結することができる。
【０００７】本発明は、これら融合タンパク質をコード
する遺伝子、これら遺伝子を含有する発現ベクター、こ
れら発現ベクターで形質転換された微生物、並びに前記
遺伝子、発現ベクター及び形質転換微生物の作製方法に
も関する。本発明による融合タンパク質の作製は、文献
に記載されている組換えＤＮＡ技術の方法に従って行う
ことができる。好ましくは、まず、目的の疎水性ポリペ
プチド、タンパク質又はペプチドをコードする核酸配列
を合成し、次いでこれを嵩高い親水性ペプチド及び選択
的開裂部位をコードする核酸配列に連結する。こうして
得られたハイブリッド遺伝子の発現ベクター内への組み
込みも、自体公知の方法で行われる。これに関連して、
マニアチス (Maniatis) ら ("Molecular Cloning", Col
d Spring Harbor Laboratory, 1982) 及びサムブルーク
(Sambrook) ら ("Molecular Cloning-A Laboratory Ma
nual", 2nd. ed., Cold SpringHarbor Laboratory, 198
9) のテキストを参考にすることができる。
【０００８】本発明による融合タンパク質の発現方法も
自体公知であり、前記のテキストに詳細に記載されてい
る。それらは次の操作を含む。 ａ）前述のハイブリッド遺伝子を発現制御配列に機能で
きるように結合した発現ベクターで適当な宿主生物（大
腸菌が有利である）を形質転換し； ｂ）こうして得られた宿主生物を適当な成育条件下で培
養し；そして ｃ）該宿主生物から目的の融合タンパク質を抽出して単
離する。 宿主生物としては、グラム陰性及びグラム陽性菌、例え
ば、大腸菌及び枯草菌の菌株が挙げられる。大腸菌株Ｍ
１５が特に好ましい本発明の宿主生物である。しかしな
がら、この大腸菌株に加えて、他の一般に入手し易い大
腸菌株、例えば、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ No.３１４
４）、大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ No.３１３４３）及び大
腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ No.２７３２５）も用いるこ
とができる。本発明による融合タンパク質は、目的の疎
水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドを害するこ
となしに特異的な化学又は酵素開裂部位での選択的な開
裂を可能にする。疎水性マトリックスカラムの固相中に
目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドが
拡散することで、本発明による融合タンパク質を、目的
の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドを隠す
ように配向させることができる。一方、嵩高い親水性ペ
プチドは、選択的開裂部位を移動水性相に露出させる。
これにより、選択的開裂によって嵩高い親水性ペプチド
が除去され、目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又
はペプチドだけがカラムに結合したままになる。次い
で、有機溶媒の添加によって目的の疎水性ポリペプチ
ド、タンパク質又はペプチドを溶出させることができ
る。
【０００９】従って、本発明は、目的の疎水性ポリペプ
チド、タンパク質又はペプチドを製造及び精製する方法
であって、次の工程： ａ）本発明による融合タンパク質を含有する水溶液を疎
水性マトリックスカラムに通し、 ｂ）開裂試薬又は酵素を含有する溶液を該カラムに流
し、そして ｃ）生成した目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又
はペプチドを水性水混和性溶媒で溶離する を含む方法も提供する。疎水性マトリックスカラムとし
ては、シアノプロピル、シクロヘキシル、フェニル、オ
クチル又はオクタデシル基結合シリカマトリックスカラ
ムが挙げられる。本発明の好ましい実施態様において
は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件
下でＲＰ−１８（オクタデシル結合シリカ微粒子カラ
ム）が用いられる。
【００１０】本発明による融合タンパク質を負荷する前
に、疎水性マトリックスカラムを水性緩衝液で平衡化す
るのが好都合である。平衡化緩衝液は、変性剤又はカオ
トロピック剤（例えば、グアニジン−ＨＣｌ、尿素）又
は界面活性剤（例えば、トリトン）を含有してもよい。
かかる変性剤、カオトロピック剤又は界面活性剤を添加
すると、水溶液に溶解させるのが極端に難しい本発明に
よる融合タンパク質であっても、問題なく操作すること
ができる。本発明による融合タンパク質は、やはり変性
剤又は界面活性剤、例えば、グアニジン−ＨＣｌ、尿素
又はトリトンを含有してもよい水性緩衝液中で、疎水性
マトリックスカラムにかける。開裂は、開裂試薬又は酵
素を含有する水性緩衝液をカラムに流すことによって行
われる。最適な緩衝液組成は用いる開裂試薬又は酵素に
依存し、ケースバイケースで決めるのが好都合である。
目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドの
溶出は、水性水混和性溶媒の勾配を用いて行うことがで
きる。この目的に適する水混和性溶媒には、ｎ−プロパ
ノール、２−プロパノール、エタノール、メタノール、
tert−ブタノールの如きアルカノール又はジオキサンの
如き環状エーテルが含まれる。最適な溶出条件は、精製
する目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチ
ド、疎水性マトリックス、カラム寸法等に依存し、ケー
スバイケースで決めるのが好都合である。
【００１１】目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又
はペプチドの製造及び精製を可能にする前述の方法はバ
ッチ式で行うこともできる。その場合、本発明による融
合タンパク質を水性緩衝液中で疎水性マトリックスに吸
着させる。開裂は、開裂試薬又は酵素を含有する水性緩
衝液と共に該疎水性マトリックスをインキュベートする
ことによって行われる。目的の疎水性ポリペプチドは、
開裂試薬又は酵素及び嵩高い親水性ペプチドを除去した
後に、水性水混和性溶媒と共に該疎水性マトリックスを
インキュベートすることによって得ることができる。本
発明の好ましい特定の態様においては、目的の疎水性ポ
リペプチド、タンパク質又はペプチドの製造及び精製を
可能にするこの新規な方法を用いて、単量体形態にある
ｂ−アミロイドペプチドを均一になるまで精製する。単
量体ｂ−アミロイドペプチドを均一なペプチドとして製
造するための特定の方法は、次の工程の組み合わせを含
む。 ａ）目的の疎水性ペプチドがｂ−アミロイドペプチドで
ある本発明による融合タンパク質を含有する水溶液を疎
水性マトリックスカラムに通し、 ｂ）開裂試薬又は酵素を含有する溶液を該カラムに流
し、 ｃ）水性水混和性溶媒で溶出することにより単量体ｂ−
アミロイドペプチドを得、 ｄ）該単量体ｂ−アミロイドペプチドを蒸留水で希釈し
た後に凍結乾燥し、そして ｅ）所望により、凍結乾燥後に該単量体ｂ−アミロイド
ペプチドを精製して最大の均一性を達成する。
【００１２】単量体ｂ−アミロイドペプチドを均一なペ
プチドとして製造するための該特定方法を行うに際して
は、目的の疎水性ペプチドがｂ−アミロイドペプチドで
ある融合タンパク質を含有する、好ましくは変性剤（例
えば、グアニジン−ＨＣｌ又は尿素）を含有する水性緩
衝液中の溶液を疎水性マトリックスカラムに通す。好ま
しい実施態様においては、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）条件下でＲＰ−１８（オクタデシル結
合シリカ微粒子カラム）を用いる。このために適する他
のカラムには、シアノプロピル、シクロヘキシル、フェ
ニル又はオクチルカラム（ビーズサイズ＝５〜３０ｍ
ｍ）が含まれる。これらカラムは、商標バイダック(Vyd
ac) 又はヌクレオシル(Nucleosil) の下でバイダック社
又はマーシャリー・ナーゲル (Macherey-Nagel) 社から
市販されている商品である。開裂は、開裂試薬又は酵素
を含有する水性緩衝液をカラムに流すことによって行わ
れる。好ましい実施態様においては、開裂は、緩衝化し
た水性水混和性溶媒中の臭化シアンをカラムに流すこと
によって行われる。単量体ｂ−アミロイドペプチドの溶
出は、水性水混和性溶媒の勾配、好ましくはエタノール
勾配を用いて行われる。単量体ｂ−アミロイドペプチド
を蒸留水で、例えば、蒸留水を含有する容器の中に溶出
液を落とすことによって即座に希釈してから凍結乾燥す
る。最大の均一性を達成するため、所望により、凍結乾
燥後に単量体ｂ−アミロイドペプチドを既知の方法によ
り、例えば、分取ゲル電気泳動により又はサイズ排除ク
ロマトグラフィーにより精製してもよい。好ましい実施
R>態様においては、（大量の単量体ｂ−アミロイドペプ
チドを単離するためには）分取未変性ゲル電気泳動及び
（少量の単量体ｂ−アミロイドペプチドを単離するため
には）ＨＰＬＣ条件下でのゲル濾過が適用される。
【００１３】本発明は、該新規な方法により得られる純
粋で均一な毒性単量体ｂ−アミロイドペプチドにも関す
る。本発明によるｂ−アミロイドペプチドは、アルツハ
イマー薬品のスクリーニングに用いることができる。目
的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドの製
造及び精製を可能にするこの新規な方法は、単量体ｂ−
アミロイドペプチドの精製に用いられる条件に類似した
条件を用いてＨＩＶ−１エンベロープペプチド（配列番
号：１１）を均一になるまで精製するのにも用いられる
（実施例７）。該新規な方法で得られるＨＩＶ−１エン
ベロープペプチド（配列番号：１１）をＨＩＶ感染を診
断するのに用いることができる。ここまで本発明を一般
的に説明してきたので、次の実施例は本発明を詳細に説
明することを意図したものであり、如何なる意味におい
てもそれによって本発明を限定することを意図したもの
ではない。
【００１４】これら実施例は、添付の図面を参照しなが
ら読めばより充分に理解できる。次の記号がこれら図面
に用いられている：‘Ｎ２５ＯＰＳＮ２５ＯＰ２９’
は、調節可能なプロモーター／オペレーター要素Ｎ２５
ＯＰＳＮ２５ＯＰ２９を表し；‘ＲＢＳII’は、合成リ
ボソーム結合部位ＲＢＳIIを表し；‘〔Ｈｉｓ〕6 ’、
‘〔ＮＡＮＰ〕19’及び‘ａｍｙ’は、本発明の６ｘＨ
ｉｓ−ＮＡＮＰ−アミロイド融合タンパク質をコードす
る遺伝子を表し；‘ｂｌａ’、‘ｃａｔ’、‘ｌａｃ
Ｉ’及び‘ｎｅｏ’は、それぞれβ−ラクタマーゼ、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ｌａ
ｃリプレッサー及びネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼを表し；‘ｔｏ’、‘ＴＥ’及び‘Ｔ１’は、ファ
ージλの転写終結因子ｔｏ、ファージＴ７の転写終結因
子ＴＥ、及び大腸菌ｒｒｎＢオペロンの転写終結因子Ｔ
１を表し；‘ｒｅｐｌ．’は、プラスミドｐＢＲ３２２
及びｐＲＥＰ４の複製領域を表す。
【００１５】図１は、プラスミドｐＲＥＰ４の模式図で
ある。図２は、プラスミドｐ６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍ
ｅｔ−Ａｍｙの模式図である。図３は、融合タンパク質
６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−Ａｍｙ（配列番号：
８）をコードするプラスミドｐ６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−
Ｍｅｔ−Ａｍｙ（配列番号：７）の核酸配列の一部を示
す。この配列には、図２に示した幾つかの制限酵素の認
識配列が示されている。示したアミノ酸配列は、融合タ
ンパク質６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−Ａｍｙの配列
を三文字表記で表しており、ｂＡ４ペプチドに対応する
アミノ酸に番号を付してある。図４は、プラスミドｐＢ
／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙの
模式図である。
【００１６】図５は、融合タンパク質６ｘＨｉｓ−ＮＡ
ＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ（配列番号：１０）をコード
するプラスミドｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍ
ｅｔ−ｈｕＡｍｙ（配列番号：９）の核酸配列の一部を
示す。この配列には、図４に示した幾つかの制限酵素の
認識配列が示されている。示したアミノ酸配列は、融合
タンパク質６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ
の配列を三文字表記で表しており、ｂＡ４ペプチドに対
応するアミノ酸に番号を付してある。該図の下方部分に
は、核酸配列及びそれによりコードされるアミノ酸が示
してあり、これによって融合タンパク質６ｘＨｉｓ−Ｎ
ＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｅ〕をコードする
プラスミドｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ
−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｅ〕、融合タンパク質６ｘＨｉｓ
−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｌ〕をコード
するプラスミドｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍ
ｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｌ〕、融合タンパク質６ｘＨ
ｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｑ〕をコ
ードするプラスミドｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ
−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｑ〕、及び融合タンパク
質６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５
Ｓ〕をコードするプラスミドｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−
ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｓ〕は、プラス
ミドｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕ
Ａｍｙと異なっている。
【００１７】図６は、未変性アガロースゲル電気泳動に
よるｂＡ４分析の結果示す。この分析は、ベックマンか
らの“セラム・プロテイン・エレクトロフォレーシス・
システム・パラゴン (Serum Protein Electrophoresis
System Paragon) ”で、該供給業者の推奨するところに
従って行った。それぞれ８μｇ（２μｌH2Ｏ中）のペプ
チドを加えた。染色はクマシーブリリアントブルーで３
時間行い、脱染色は１０％酢酸、４５％メタノール及び
４５％水で行った。サンプルは、実験の直前に蒸留水で
調製する（ｆ）か又は２日間熟成させた（ａ）。試験し
たサンプルを以下に掲げる。
【００１８】ゲルａ ゲルｂ レーン１ ヒトｂＡ４洗浄１ｆ レーン１ Ｍ３５Ｓ ｂＡ４洗浄１ｆ レーン２ ヒトｂＡ４洗浄２ｆ レーン２ Ｍ３５Ｓ ｂＡ４洗浄２ｆ レーン３ ヒトｂＡ４洗浄３ｆ レーン３ Ｍ３５Ｓ ｂＡ４洗浄３ｆ レーン４ ヒトｂＡ４洗浄４ｆ レーン４ Ｍ３５Ｓ ｂＡ４洗浄４ｆ レーン５ ヒトｂＡ４洗浄４ａ レーン５ Ｍ３５Ｓ ｂＡ４洗浄４ａ レーン６ スタンダードＢＳＡ２mg レーン６ スタンダードＢＳＡ１０mg レーン７ Ｍ３５Ｌ ｂＡ４洗浄１ｆ レーン７ Ｍ３５Ｑ ｂＡ４洗浄１ｆ レーン８ Ｍ３５Ｌ ｂＡ４洗浄２ｆ レーン８ Ｍ３５Ｑ ｂＡ４洗浄２ｆ レーン９ Ｍ３５Ｌ ｂＡ４洗浄３ｆ レーン９ Ｍ３５Ｑ ｂＡ４洗浄３ｆ レーン10 Ｍ３５Ｌ ｂＡ４洗浄３ａ レーン10 ラットｂＡ４
【００１９】ゲルｃは、点突然変異体Ｍ３５ＱｂＡ４と
Ｍ３５ＥｂＡ４を比較した結果を示す。点突然変異体Ｍ
３５ＥｂＡ４は、ベックマンゲル上で高い移動性をもた
らす過剰の負電荷を含有している（レーン８：Ｍ３５Ｅ
ｂＡ４；レーン９：Ｍ３５ＱｂＡ４）。開裂後にＭ３５
ＥｂＡ４をＭ３５ＱｂＡ４と混合する（レーン１）か、
又はＭ３５ＱｂＡ４を含有する融合タンパク質とＭ３５
ＥｂＡ４を含有する融合タンパク質とを混合して本発明
の方法に従って開裂する（レーン：３、４、５及び６
（洗浄１、２、３及び４））と、明確な分離が認めら
れ、単量体ｂＡ４の存在を示している。
【００２０】図７は、サイズ排除カラムでのｂＡ４クロ
マトグラフィーの結果を示す。それぞれ２５０ｍｌの画
分を取り、未変性電気泳動により分析した。レーン１は
該カラムに適用したｂＡ４であり、レーン２〜１０はピ
ーク画分である。ｂＡ４のサイズを確認するために用い
たマーカータンパク質は次の通りである。 血清アルブミン （ＭＷ＝６５０００；保持時間＝１
9.８９分）、 卵白アルブミン （ＭＷ＝４５０００；保持時間＝２
0.１０分）、 ラクトアルブミン （ＭＷ＝１４２００；保持時間＝２
1.４３分）及び インシュリン （ＭＷ＝ ５７３４；保持時間＝２
1.６８分）。 ２2.５４分の保持時間は、約４５００ダルトンのＭＷを
有する単量体を指し示している。これは、光散乱データ
及びイファンチス法（イファンチス (D.A. Yphantis),
Annals of the N.Y. Acad. Sci. 88, 586-601 (1960)）
による超遠心分離実験と一致している。
【００２１】
【実施例】実施例１ 融合タンパク質６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−Ａｍｙ
の作製に用いる発現プラスミド 融合タンパク質６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−Ａｍｙ
の作製のために発現プラスミドｐ６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ
−Ｍｅｔ−Ａｍｙ（図２及び３を参照）を用いた。プラ
スミドｐＲＥＰ４及びｐ６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ
−Ａｍｙで形質転換した大腸菌Ｍ１５細胞を、ブダペス
ト条約に従って、ブラウンシュバイグ，ＢＲＤのドイツ
微生物収集所（the Deutsche Sammlung von Mikroorgan
ismen:ＤＳＭ）に、１９９３年５月１８日に、受託番号
ＤＳＭ８３１０の下に寄託した。
【００２２】実施例２ 融合タンパク質６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡ
ｍｙの作製に用いる発現プラスミド 融合タンパク質６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡ
ｍｙの作製のために発現プラスミドｐＢ／Ｅ１−６ｘＨ
ｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ（図４及び５を参
照）を用いた。プラスミドｐＲＥＰ４及びｐＢ／Ｅ１−
６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙで形質転換
した大腸菌Ｍ１５細胞を、ブダペスト条約に従って、ブ
ラウンシュバイグ，ＢＲＤのドイツ微生物収集所（ＤＳ
Ｍ）に、１９９３年５月１８日に、受託番号ＤＳＭ８３
１１の下に寄託した。
【００２３】実施例３ 融合タンパク質６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡ
ｍｙ〔Ｍ３５Ｌ〕、６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈ
ｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｑ〕、６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ
−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｓ〕、及び６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ
−Ｍｅｔ−ｈｕＡ ｍｙ〔Ｍ３５Ｅ〕の作製に用いる発現
プラスミド 融合タンパク質６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡ
ｍｙ〔Ｍ３５Ｌ〕、６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈ
ｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｑ〕、６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ
−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｓ〕及び６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−
Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｅ〕の作製のために、ｂＡ
４アミロイドペプチドのアミノ酸３５をコードするヌク
レオチドだけがプラスミドｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−Ｎ
ＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙと異なる発現プラスミドｐ
Ｂ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ
〔Ｍ３５Ｌ〕、ｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍ
ｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｑ〕、ｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉ
ｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｓ〕及びｐ
Ｂ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ
〔Ｍ３５Ｅ〕（図５を参照）をそれぞれ用いた。プラス
ミドｐＲＥＰ４とｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−
Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｌ〕、ｐＲＥＰ４とｐＢ／
Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ
３５Ｑ〕、ｐＲＥＰ４とｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡ
ＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｓ〕、及びｐＲＥＰ
４とｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕ
Ａｍｙ〔Ｍ３５Ｅ〕でそれぞれ形質転換した大腸菌Ｍ１
５細胞を、ブダペスト条約に従って、ブラウンシュバイ
グ，ＢＲＤのドイツ微生物収集所（ＤＳＭ）に、１９９
３年５月１８日に、それぞれ受託番号ＤＳＭ８３１３、
ＤＳＭ８３１４、ＤＳＭ８３１５及びＤＳＭ８３１２の
下に寄託した。
【００２４】実施例４ 融合タンパク質の醗酵及び精製 醗酵 ｐ６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−Ａｍｙ、ｐＢ／Ｅ１
−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ、ｐＢ／
Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ
３５Ｌ〕、ｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ
−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｑ〕、ｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−
ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ３５Ｓ〕及びｐＢ／
Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙ〔Ｍ
３５Ｅ〕それぞれを、既にプラスミドｐＲＥＰ４を含有
する大腸菌Ｍ１５細胞の中に標準的方法（サムブルーク
ら，前記文献）により形質転換した。該形質転換細胞
を、１００ｍｇ／ｌアンピシリン及び２５ｍｇ／ｌカナ
マイシンを含有するスーパー(Super) 培地（ストゥバー
(Stuber) ら, Immunological Methods, eds. レフコビ
ッツ(Lefkovits) 及びパーニス (Pernis), Academic Pr
ess, Inc., Vol.IV, 121-152 (1990) ）中、１００Ｌ醗
酵器内で３７℃で成育させた。６００ｎｍにおける光学
密度約1.０で、ＩＰＴＧを２ｍＭの最終濃度になるよう
に添加した。３７℃で更に３時間経過後、遠心分離によ
り細胞を採取した。代表的醗酵実験において、少なくと
も３ｇの組換え融合タンパク質を含有する約５００ｇの
バイオマスを得た。
【００２５】精製 0.１Ｍリン酸水素二ナトリウムを含有する2.５Ｌの６Ｍ
グアニジン・ＨＣｌ（ｐＨ８）を細胞に添加して２４時
間攪拌した。遠心分離により粗細胞破片を除去してか
ら、0.３ｍｍメンブランを用いるクロス−フロー濾過に
より上澄み液を更に澄明にした。次いで、濾液中に含ま
れるタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（５ｃｍ×２４ｃ
ｍ，流速２０ｍｌ／分）に吸着させた。混入している大
腸菌タンパク質を、まず８Ｍ尿素（ｐＨ7.５）で洗浄す
ることによって除去した。溶出は８Ｍ尿素（ｐＨ４）で
行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりクロマトグラムをモニ
ターし、融合タンパク質を含有する画分をプールした。
そのプールの小部分をＥＤＴＡと混合し、水に対して透
析することによって脱塩し、凍結乾燥してから電子スプ
レー式マススペクトルにより分析した（表１）。
【００２６】
【表１】 表１：融合タンパク質の特性 ─────────────────────────────────── 融合タンパク質 １００Ｌ醗酵器当た 理論質量 電子スプレー式ＭＳ りの精製収量（ｇ） による平均質量 ─────────────────────────────────── ヒトＷＴ 3.０ １３８１７ １３８２０ ヒトＭut．Ｍ３５Ｓ 5.５ １３７７３ １３７７６ ヒトＭut．Ｍ３５Ｌ 5.７ １３７９９ １３８０２ ヒトＭut．Ｍ３５Ｑ 4.５ １３８１４ １３８１７ ヒトＭut．Ｍ３５Ｅ 6.０ １３８１３ 試験せず ラットＷＴ 6.０ １３７２４ １３７２８ ─────────────────────────────────── ＷＴ＝野生型、Ｍut＝突然変異体、例えば、Ｍ３５Ｓ
（位置３５におけるＭｅｔがＳｅｒに変異している）
【００２７】実施例５ １〜４２ｂ−アミロイドペプチドを生成する融合タンパ
ク質の開裂 まず、半分取ＲＰ−１８ＨＰＬＣ（バイダック (Vida
c), 仕様２１８ＴＰ１５２０１０、２５０ｍｍ×１０ｍ
ｍ）カラムを８Ｍ尿素（ｐＨ４）で２ｍｌ／分の流速で
平衡化した。次いで、８Ｍ尿素（ｐＨ４）中に４００ｍ
ｇの融合タンパク質を含有するＮＴＡ溶出液の小部分を
１ｍｌ／分の流速でカラムに汲み上げた。次いで、カラ
ムを８Ｍ尿素（ｐＨ４）で２ｍｌ／分の流速で洗浄し
た。カラム出口での吸光度がベースラインに達するま
で、２ｍｌ／分の流速の水で尿素を洗い落とした。２０
％エタノール、４０％ギ酸及び４０％水からなる溶液中
の４５ｍｇ／ｍｌＣＮＢｒを、２２℃で0.５ｍｌ／分の
流速で該カラムに２４時間流すことによって開裂を行っ
た。次いで、0.１Ｍ ＥＤＴＡを２ｍｌ／分の流速で該
カラムに流し、ＣＮＢｒと遊離したＭＲＧＳＨＨＨＨＨ
ＨＧＳ−（ＮＡＮＰ）19−ＲＳＭとを、0.０５％トリフ
ルオロ酢酸で2.０ｍｌ／分の流速で洗い落とした。時間
を区切って設定された次のエタノール勾配を用いて、１
〜４２残基ｂ−アミロイドペプチドを２ｍｌ／分の流速
で溶出させた：（分／エタノール（％））０／０、４０
／４０、４５／５０、５０／６５、５５／１００、６０
／１００、６５／０。
【００２８】ｂ−アミロイドペプチドを含有する幅広い
ピークが４５分から６０分の間に現れている。該ペプチ
ドが単量体であるためには、（例えば、２００ｍｌのH2
Ｏを含有する攪拌したビーカー中に溶出液を落とすこと
により）蒸留水で即座に希釈して即座に凍結乾燥するこ
とが重要であった。得られた粉末をＷ１と命名した。か
なりの量のｂ−アミロイドペプチドがカラム内に残存し
たので、上記の手順を用いて溶出を３回繰り返し、サン
プルＷ２、Ｗ３及びＷ４を得た。これらサンプルを純度
（表２）及び単量体ｂＡ４の量（図６）について試験し
た。該ペプチドの正確な化学構造を、電子スプレー式マ
ススペクトル（表３）、アミノ酸分析及びアミノ末端配
列決定（表３）によって確認した。
【００２９】
【表２】 表２：１〜４２ｂ−アミロイドペプチドの製造 ─────────────────────────────────── ペプチド 試験回数 洗浄回数 生成した質量（ｍｇ） 純度（％） ─────────────────────────────────── ラットＷＴ ４ １ １００±１４ ９０±２ （配列番号：２） ２ ２８±８ ８９±２ ３／４ ９±３ ９０±１ ヒトＷＴ ３ １ ９６±２３ ７９±９ （配列番号：１） ２ ５２±１０ ７３±５ ３ ３２±９ ７８±４ ４ １５±８ ８６±５ ヒトＭ３５Ｓ ３ １ ７１±１３ ８０±８ （配列番号：４） ２ ３１±５ ７４±２ ３ １８±７ ８３±２ ４ ２±７ ８８±２ ヒトＭ３５Ｌ ３ １ ５９±１５ ７２±８ （配列番号：３） ２ ２３±９ ７１±４ ３ ８±３ ７８±３ ヒトＭ３５Ｑ ４ １ ３７±４ ７０±２ （配列番号：５） ２ １０±５ ８２±３ ヒトＭ３５Ｅ １ １ ９５ 試験せず （配列番号：６） ２ ６８ 試験せず ３ ４６ 試験せず ４ ３１ 試験せず ───────────────────────────────────
【００３０】純度はアミノ酸分析に基づくものであり、
融合タンパク質の含量はＧｌｕに対するＡｓｐの比によ
り求めている。純粋な１〜４２ｂ−アミロイドペプチド
は４Ｇｌｕと４Ａｓｐ残基を有し、純粋な融合タンパク
質は４Ｇｌｕに対し４２Ａｓｐの比率を有する。
【００３１】
【表３】 表３：１〜４２ｂ−アミロイドペプチドの同定 ─────────────────────────────────── サンプル マススペクトル エドマン分解 理論値 実測値 １０〜１５サイクル ─────────────────────────────────── ヒトＷＴ ４５１5.１ ４５３１** ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱ ヒトＭ３５Ｓ ４４７1.０ ４４７２ ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ ヒトＭ３５Ｌ ４４９7.１ ４４９８ ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ ヒトＭ３５Ｑ ４５１2.０ ４５１２ 試験せず ヒトＭ３５Ｅ ４５１3.０ ４５１２ 試験せず ラットＷＴ ４４１7.０ ４４３５** ＤＡＥＦＧＨＤＳＧＦ ───────────────────────────────────** ヒトＷＴ及びラットＷＴのメチオニンが、開裂操作の
間にメチオニンスルホキシドに変換した。
【００３２】実施例６ 単量体１〜４２ｂＡ４の精製 小スケール法 １ｍｇのｂ４Ａを含有するサンプルをＬＫＢウルトロパ
ック (UltroPac) ＨＰＬＣカラム（直径：7.５ｍｍ、長
さ：６００ｍｍ、流速0.５ｍｌ／分、緩衝液：２００ｍ
Ｍグリシンを含有する１２ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（ｐＨ7.８））にかけた。ｂ４Ａは鋭
いピークで現れ、該ピーク画分は図７に示すアガロース
電気泳動ゲルでクマシーブルーのバンドを含有した。光
散乱実験からは高分子量型（凝集体又は繊維）の存在は
示されず、同一条件下でクロマトグラフィーにかけた較
正スタンダードから約４５００の分子量であることが示
された。これはｂ４Ａが単量体として存在していること
を示すものである。
【００３３】分取スケール法 バイオラッドからの“連続溶出電気泳動システムモデル
４９１プレプセル (Continuous Elution Electrophores
is system Model 491 Prep Cell)”を用いた。未変性不
連続アクリルアミドゲルは、0.３７５Ｍトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（ｐＨ8.８）中の４％アクリ
ルアミド／2.７％N,N'−メチレンビスアクリルアミド分
離ゲルからなり、長さ３ｃｍ及び直径３７ｍｍを有し、
２０ｍｍ直径の冷却管を備えたものであった。スタッキ
ングゲルは、0.１２５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン（ｐＨ6.８）中の４％アクリルアミド／2.７
％N,N'−メチレンビスアクリルアミドからなり、長さ２
ｃｍを有した。泳動緩衝液は、２５ｍＭトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン／0.２Ｍグリシン（ｐＨ8.
３）であった。溶出には、同じ緩衝液を流速0.７５ｍｌ
／分で用いた。概して洗浄２、３及び４から得られる４
５ｍｇのｂ４Ａペプチドを７ｍｌのＨ2O及び１ｍｌのグ
リセロール中に溶解させた。１２ワット（一定，５００
Ｖ及び４０ｍＡで制限）で電気泳動を行い、代表的な泳
動では４時間を要した。代表的な泳動の結果を図７に示
す。
【００３４】実施例７ １〜３５ＨＩＶ−１ペプチドの精製 単量体１〜４２ｂＡ４を含有する融合タンパク質の調製
及び精製について記載した方法（実施例１〜４）と同じ
方法によって調製及び精製した融合タンパク質ＭＲＧＳ
（Ｈ)6ＧＳ（ＮＡＮＰ）19ＲＳＭＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ
ＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ
（配列番号：１２）４００ｍｇをバイダックＲＰ−１８
カラム（仕様２１８ＴＰ１５２０１０、２５０ｍｍ×１
０ｍｍ）に負荷し、１〜４２ｂＡ４タンパク質の開裂に
ついて記載した条件（実施例５）と同じ条件を用いて開
裂した。約２０〜３０ｍｇの凍結乾燥粉末が得られた。
この粉末を電子スプレー分析法により分析した。１〜３
５ＨＩＶ−１ペプチド（配列番号：１１）に対応する３
９０２±２Ｄａのピークが検出された。
【配列表】
【００３５】配列番号：１ 配列の長さ：４２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ−末端 配列
【００３６】
【化１】
【００３７】配列番号：２ 配列の長さ：４２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ−末端 配列
【００３８】
【化２】
【００３９】配列番号：３ 配列の長さ：４２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ−末端 配列
【００４０】
【化３】
【００４１】配列番号：４ 配列の長さ：４２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ−末端 配列
【００４２】
【化４】
【００４３】配列番号：５ 配列の長さ：４２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ−末端 配列
【００４４】
【化５】
【００４５】配列番号：６ 配列の長さ：４２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ−末端 配列
【００４６】
【化６】
【００４７】配列番号：７ 配列の長さ：５２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：115..516 他の情報：／産物＝“アミロイドタンパク質ＡＡ” 配列
【００４８】
【化７】
【００４９】配列番号：８ 配列の長さ：１３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００５０】
【化８】
【００５１】配列番号：９ 配列の長さ：５２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：115..516 他の情報：／産物＝“アミロイドタンパク質ＡＡ” 配列
【００５２】
【化９】
【００５３】配列番号：１０ 配列の長さ：１３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００５４】
【化１０】
【００５５】配列番号：１１ 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【００５６】
【化１１】
【００５７】配列番号：１２ 配列の長さ：１２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００５８】
【化１２】
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＲＥＰ４の模式図である。
【図２】プラスミドｐ６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−
Ａｍｙの模式図である。
【図３】融合タンパク質６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ
−Ａｍｙ（配列番号：８）をコードするプラスミドｐ６
ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−Ａｍｙ（配列番号：７）
の核酸配列の一部を示す。
【図４】プラスミドｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ
−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙの模式図である。
【図５】融合タンパク質６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ
−ｈｕＡｍｙ（配列番号：１０）をコードするプラスミ
ドｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡ
ｍｙ（配列番号：９）の核酸配列の一部を示す。該図の
下方部分に、プラスミドｐＢ／Ｅ１−６ｘＨｉｓ−ＮＡ
ＮＰ−Ｍｅｔ−ｈｕＡｍｙとは異なる核酸配列及びそれ
によりコードされるアミノ酸を示す。
【図６】未変性アガロースゲル電気泳動によるｂＡ４分
析の結果示す。
【図７】サイズ排除カラムでのｂＡ４クロマトグラフィ
ーの結果を示す。それぞれの画分を未変性電気泳動によ
り分析した。レーン１は該カラムに適用したｂＡ４であ
り、レーン２〜１０はピーク画分である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ゲルダ フーバー トロットマン スイス国 シーエイチ−4247 グリンデ ル ホーレンシュトラーセ 211 (72)発明者 ペーター ヤコブ スイス国 シーエイチ−4153 ライナッ ハ ランデラーシュトラーセ ４ (72)発明者 ディートリッヒ スチューバー ドイツ連邦共和国 ディー−79639 グ レンツァッハ−ヴィーレン，バンドヴェ ーク ９ (56)参考文献 特開 昭63−251095（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｖ ｏｌ．193，Ｎｏ．２ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 19/00 C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式： Ａ−Ｂ−Ｃ 〔式中、Ａは式（ＮＡＮＰ）x （ここで、ｘは１０〜４
    ０、好ましくは１９である）のペプチド配列を有する嵩
    高い親水性ペプチドであり、Ｂは選択的開裂部位であ
    り、そしてＣは目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質
    又はペプチドである〕で表される融合タンパク質。
  2. 【請求項２】 選択的開裂部位が化学開裂部位であり、
    好ましくは臭化シアンにより特異的に開裂されるメチオ
    ニン残基である、請求項１記載の融合タンパク質。
  3. 【請求項３】 目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質
    又はペプチドがｂ−アミロイドペプチド又は位置３５に
    おいてメチオニン又はメチオニンスルホキシド残基の代
    わりにロイシン、セリン、グルタミン又はグルタミン酸
    残基を有するｂ−アミロイドペプチドの点突然変異体で
    ある、請求項１又は２記載の融合タンパク質。
  4. 【請求項４】 目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質
    又はペプチドが１−３５ＨＩＶ−１ペプチドである、請
    求項１又は２記載の融合タンパク質。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の融
    合タンパク質をコードする遺伝子。
  6. 【請求項６】 請求項５記載の遺伝子が機能できるよう
    に発現制御配列に連結された発現ベクター。
  7. 【請求項７】 請求項６記載の発現ベクターで形質転換
    された細菌。
  8. 【請求項８】 大腸菌である請求項７記載の細菌。
  9. 【請求項９】 目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質
    又はペプチドを製造及び精製する方法であって、 ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク
    質を含有する水溶液を疎水性マトリックスカラムに通
    し、 ｂ）開裂試薬又は酵素を含有する溶液を該カラムに流
    し、そして ｃ）生成した目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又
    はペプチドを水性水混和性溶媒で溶離する、 ことを含んでなる方法。
  10. 【請求項１０】 疎水性マトリックスカラムがオクタデ
    シル結合シリカ微粒子カラムである、請求項９記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 開裂試薬が臭化シアンである、請求項
    ９又は１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 単量体ｂ−アミロイドペプチドを均一
    なペプチドとして製造する方法であって、 ａ）請求項３記載の融合タンパク質を含有する溶液を疎
    水性マトリックスカラムに通し、 ｂ）開裂試薬又は酵素を含有する溶液を該カラムに流
    し、 ｃ）水性水混和性溶媒で溶出することにより単量体ｂ−
    アミロイドペプチドを得、 ｄ）該単量体ｂ−アミロイドペプチドを蒸留水で希釈し
    た後に凍結乾燥し、そして ｅ）所望により、凍結乾燥後に該単量体ｂ−アミロイド
    ペプチドを精製して最大の均一性を達成する、 ことを含んでなる方法。
  13. 【請求項１３】 疎水性マトリックスカラムがオクタデ
    シル結合シリカ微粒子カラムである、請求項１２記載の
    方法。
  14. 【請求項１４】 開裂試薬が臭化シアンである、請求項
    １２又は１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 目的の疎水性ポリペプチド、タンパク
    質又はペプチドが１−３５ＨＩＶ−１ペプチドである、
    請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 目的の疎水性ポリペプチド、タンパク
    質又はペプチドを製造及び精製するための、請求項１〜
    ４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  17. 【請求項１７】 目的の疎水性ポリペプチド、タンパク
    質又はペプチドを製造及び精製するための、請求項１〜
    ４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用法。
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