JPH0653758B2 - 新規ジヒドロ葉酸還元酵素一成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、成長ホルモン分泌調節活性を有することが知
られている牛成長ホルモン放出因子（44個のアミノ酸か
らなり、その配列はアミノ酸末端側からTyr-Ala-Asp-Al
a-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-
Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asp-Ar
g-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gly-Ala-Lys-Val-
Arg-Leuであり、カルボキシル末端がアミド化されてい
る（以下、ＧＲＦと略す）の１番目から29番目までの配
列を有する誘導体（以下、ＧＲＦ29と略す）、ＧＲＦの
カルボキシル末端がアミド化されていない誘導体（以下
ＧＲＦ44と略す）、ＧＲＦ29の27番目のアミノ酸である
メチオニンをイソロイシンに転換した誘導体（以下、Ｇ
ＲＦＭ29と略す）、及びＧＲＦ44の27番目のアミノ酸で
あるメチオニンをイソロイシンに転換した誘導体（以
下、ＧＲＦＭと略す）をそれぞれ酵素タンパク質のカル
ボキシル末端側に有するジヒドロ葉酸還元酵素に関する
ものである。本発明の酵素タンパクは、発酵工業、医薬
品工業、畜産分野等に好適に用いられる。

［従来の技術及び問題点］ ＧＲＦは成長ホルモンの分泌を促すペプチドであり、牛
の視床下部に存在するが、その含量は少なく、牛500頭
からせいぜい数mg程度分離精製できればよい方であり、
効率のよい生産方法の開発が強く要望されている。

ＧＲＦのアミノ酸配列とその生理活性との関係について
は種々の研究成果が報告されている〔N.Ling,et al.Ann
u.Rev.Biocem.，第54巻，第403ページ（1985年）〕。

また、ＧＲＦの27番目のアミノ酸であるメチオニンは生
理活性発現には重要な役割を果たしておらず、このアミ
ノ酸をイソロイシンやロイシンに変換しても問題がない
ことが報告されている〔G.M.Clore,et al.，J.Mol.Bio
l.，第191巻，第553ページ（1986年）〕。

ところで、近年、遺伝子工学の進歩に伴い、興味深いポ
リペプチドを微生物を用いて生産しうるようになった。
すなわち、ポリペプチドに対応する遺伝子であるＤＮＡ
を、例えば生体よりクローニングと呼ばれる方法で分離
するなどして調製したのち、これを発現ベクターと呼ば
れる適当なプラスミドなどに組み込み、得られた組換え
プラスミドを大腸菌などの微生物細胞中に導入し、目的
遺伝子を微生物中で発現させ、微生物から目的ポリペプ
チドを分離精製することが行われている。

このような状況においては、目的ポリペプチド遺伝子を
含み、かつ効率よく発現させる組換えプラスミドを構築
し、これを微生物宿主で効率よく発現させるとともに、
発現した目的ポリペプチドを微生物から効率よく分離精
製することが要望される。また、目的ポリペプチドが異
なれば自ずから上記要望に応える方法も異なってくる。

一般に、分子量１万以下のポリプペチドは、大腸菌など
の宿主中で生産させても菌体中のプロテアーゼなどによ
って分解されるため安定に細胞内に蓄積されることがな
い。これは、分子として小さいために安定なコンホメー
ションをとれないためであると考えられている。したが
って、遺伝子操作を利用してＧＲＦなどの短いポリペプ
チドを生産しようとした場合、融合遺伝子を作製し、融
合タンパク質として発現させることが必要であると考え
られる。

既に、本発明者らは、ＧＲＦ誘導体を安定に発現生産す
ることを目的に、ＤＨＦＲとの融合タンパク質として発
現・生産することを試み、ＤＨＦＲのカルボキシル末端
側に種々のＧＲＦ誘導体を結合させた融合タンパク質を
暗号化する遺伝子を含有する組換えプラスミドを構築し
ている。そのような組換えプラスミドとして、本発明者
らが開発したＤＨＦＲ−ＧＲＦ29融合タンパク質の遺伝
子を組み込んだｐＧＲＦ２−15（特許第1677382号）、
ＤＨＦＲ−ＧＲＦＭ29融合タンパク質の遺伝子を組み込
んだｐＳＧ１−12（特許第1654052号）、ＤＨＦＲ−Ｇ
ＲＦ44融合タンパク質の遺伝子を組み込んだｐＧＲＦ44
−22（特許第1654053号）、及びＤＨＦＲ−ＧＲＦＭ融
合タンパク質の遺伝子を組み込んだｐＧＲＦＭ44−６
（特許第1654054号）などがある。

しかしながら、このような組換えプラスミドが暗号化す
るＧＲＦ誘導体を含んだ組換えタンパク質は新規なアミ
ノ酸配列を有しているが、上記組換えプラスミドを含有
する大腸菌から、目的の融合タンパク質を安定に分離精
製しうるか否かは全く知られておらず、ＧＲＦ誘導体の
組換えＤＮＡ技術を用いた生産を試みる場合大きな障害
であった。

〔発明の目的〕

本発明は、このような事情の下、ＤＨＦＲのカルボキシ
ル末端側に特定のアミノ酸配列構造をもつにもかかわら
ず、ＤＨＦＲ酵素活性を有し、しかも安定に効率よく生
産でき、かつ分離精製も容易に行える新規ジヒドロ葉酸
還元酵素−融合タンパク質を提供することを目的とする
ものである。

［発明の構成］ 本発明者らは、ＧＲＦ誘導体をカルボキシル末端側に有
するＤＨＦＲ融合タンパク質の利用について鋭意研究を
行い、既に本発明者らが作製しているＤＨＦＲ−ＧＲＦ
誘導体融合タンパク質を暗号化するＤＮＡを組み込んだ
プラスミドを含有する大腸菌から新規な融合タンパク質
を安定に分離しうること、及びさらに精製したＤＨＦＲ
−ＧＲＦ誘導体融合タンパク質を原材料として新規な融
合タンパク質を調製しうることを見出し、この知見に基
づいて本発明をなすに至った。

すなわち、本発明は、次のような新規ジヒドロ葉酸還元
酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質；式
（Ｉ） Met-Ile-Ser-Leu-Ile-Ala-Ala-Leu-Ala-Val-Asp-Arg-Va
l-Ile-Gly-Met-Glu-Asn-Ala-Met-Pro-Trp-Asn-Leu-Pro-
Ala-Asp-Leu-Ala-Trp-Phe-Lys-Arg-Asp-Thr-Leu-Asn-Ly
s-Pro-Val-Ile-Met-Gly-Arg-His-Thr-Trp-Glu-Ser-Ile-
Gly-Arg-Pro-Leu-Pro-Gly-Arg-Lys-Asn-Ile-Ile-Leu-Se
r-Ser-Gln-Pro-Gly-Thr-Asp-Asp-Arg-Val-Thr-Trp-Val-
Lys-Ser-Val-Asp-Glu-Ala-Ile-Ala-Ala-Gys-Gly-Asp-Va
l-Pro-Glu-Ile-Met-Val-Ile-Gly-Gly-Gly-Arg-Val-Tyr-
Glu-Gln-Phe-Leu-Pro-Lys-Ala-Gln-Lys-Leu-Tyr-Leu-Th
r-His-Ile-Asp-Ala-Glu-Val-Glu-Gly-Asp-Thr-His-Phe-
Pro-Asp-Tyr-Glu-Pro-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Val-Phe-Se
r-Glu-Phe-His-Asp-Ala-Asp-Ala-Gln-Asn-Ser-His-Ser-
Tyr-Glu-Phe-Glu-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg-Ile-Ile-Gle-Gl
u-Gly-Arg-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-
Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gl
n-Asp-Ile-Met-Asn-Arg
…（Ｉ）、 式（II） Met-Ile-Ser-Leu-Ile-Ala-Ala-Leu-Ala-Val-Asp-Arg-Va
l-Ile-Gly-Met-Glu-Asn-Ala-Met-Pro-Trp-Asn-Leu-Pro-
Ala-Asp-Leu-Ala-Trp-Phe-Lys-Arg-Asp-Thr-Leu-Asn-Ly
s-Pro-Val-Ile-Met-Gly-Arg-His-Thr-Trp-Glu-Ser-Ile-
Gly-Arg-Pro-Leu-Pro-Gly-Arg-Lys-Asn-Ile-Ile-Leu-Se
r-Ser-Gln-Pro-Gly-Thr-Asp-Asp-Arg-Val-Thr-Trp-Val-
Lys-Ser-Val-Asp-Glu-Ala-Ile-Ala-Ala-Gys-Gly-Asp-Va
l-Pro-Glu-Ile-Met-Val-Ile-Gly-Gly-Gly-Arg-Val-Tyr-
Glu-Gln-Phe-Leu-Pro-Lys-Ala-Gln-Lys-Leu-Tyr-Leu-Th
r-His-Ile-Asp-Ala-Glu-Val-Glu-Gly-Asp-Thr-His-Phe-
Pro-Asp-Tyr-Glu-Pro-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Val-Phe-Se
r-Glu-Phe-His-Asp-Ala-Asp-Ala-Gln-Asn-Ser-His-Ser-
Tyr-Glu-Phe-Glu-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg-Ile-Leu-Met-Ty
r-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Il
e-Ile-Asn-Arg …（II）、 式（III） Met-Ile-Ser-Leu-Ile-Ala-Ala-Leu-Ala-Val-Asp-Arg-Va
l-Ile-Gly-Met-Glu-Asn-Ala-Met-Pro-Trp-Asn-Leu-Pro-
Ala-Asp-Leu-Ala-Trp-Phe-Lys-Arg-Asp-Thr-Leu-Asn-Ly
s-Pro-Val-Ile-Met-Gly-Arg-His-Thr-Trp-Glu-Ser-Ile-
Gly-Arg-Pro-Leu-Pro-Gly-Arg-Lys-Asn-Ile-Ile-Leu-Se
r-Ser-Gln-Pro-Gly-Thr-Asp-Asp-Arg-Val-Thr-Trp-Val-
Lys-Ser-Val-Asp-Glu-Ala-Ile-Ala-Ala-Cys-Gly-Asp-Va
l-Pro-Glu-Ile-Met-Val-Ile-Gly-Gly-Gly-Arg-Val-Tyr-
Glu-Gln-Phe-Leu-Pro-Lys-Ala-Gln-Lys-Leu-Tyr-Leu-Th
r-His-Ile-Asp-Ala-Glu-Val-Glu-Gly-Asp-Thr-His-Phe-
Pro-Asp-Tyr-Glu-Pro-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Val-Phe-Se
r-Glu-Phe-His-Asp-Ala-Asp-Ala-Gln-Asn-Ser-His-Ser-
Tyr-Glu-Phe-Glu-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg-Ile-Ile-Glu-Gl
y-Arg-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-
Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gl
n-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-
Gln-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu …（III） 及び式（IV） Met-Ile-Ser-Leu-Ile-Ala-Ala-Leu-Ala-Val-Asp-Arg-Va
l-Ile-Gly-Met-Glu-Asn-Ala-Met-Pro-Trp-Asn-Leu-Pro-
Ala-Asp-Leu-Ala-Trp-Phe-Lys-Arg-Asp-Thr-Leu-Asn-Ly
s-Pro-Val-Ile-Met-Gly-Arg-His-Thr-Trp-Glu-Ser-Ile-
Gly-Arg-Pro-Leu-Pro-Gly-Arg-Lys-Asn-Ile-Ile-Leu-Se
r-Ser-Gln-Pro-Gly-Thr-Asp-Asp-Arg-Val-Thr-Trp-Val-
Lys-Ser-Val-Asp-Glu-Ala-Ile-Ala-Ala-Cys-Gly-Asp-Va
l-Pro-Glu-Ile-Met-Val-Ile-Gly-Gly-Gly-Arg-Val-Tyr-
Glu-Gln-Phe-Leu-Pro-Lys-Ala-Gln-Lys-Leu-Tyr-Leu-Th
r-His-Ile-Asp-Ala-Glu-Val-Glu-Gly-Asp-Thr-His-Phe-
Pro-Asp-Tyr-Glu-Pro-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Val-Phe-Se
r-Glu-Phe-His-Asp-Ala-Asp-Ala-Gln-Asn-Ser-His-Ser-
Tyr-Glu-Phe-Glu-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg-Ile-Leu-Met-Ty
r-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Il
e-Ile-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-
Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu …（IV） （式中のAlaはアラニン、Argはアルギニン、Asnはアス
パラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイン、Gl
nはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリシン、H
isはヒスチジン、Ileはイソロイシン、Leuはロイシン、
Lysはリジン、Metはメチオニン、Pheはフェニルアラニ
ン、Proはプロリン、Serはセリン、Thrはスレオニン、T
rpはトリプトファン、Tyrはチロシン、Valはバリンのア
ミノ酸単位を示し、またアミノ酸配列における番号は、
ジヒドロ葉酸還元酵素１番目のアミノ酸であるメチオニ
ンから起算したものである） で示されるアミノ酸配列を有する、新規ジヒドロ葉酸還
元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質を
提供するものである。

本発明の式（Ｉ）の融合タンパク質（以下、ＤＨＦＲ−
ＧＲＦ29又はタンパク質１という）において、159番目
までが大腸菌の野性型ＤＨＦＲに１ケ所アミノ酸置換が
起こった〔Cys-152(wild type）→Glu-152〕変異ＤＨＦ
Ｒのアミノ酸配列であり、165番目から193番目までがＧ
ＲＦ29のアミノ酸配列である。また、160番目から164番
目まではＤＨＦＲとＧＲＦ29とを結び付け、安定に発現
するのを助けると同時に、最終的に牛血液凝固因子Ｘａ
を作用させることによりＧＲＦ29を切り出すことを可能
とするアミノ酸配列である。第１図は、ＤＨＦＲ−ＧＲ
Ｆ29を暗号化するＤＮＡ配列とそれが暗号化するアミノ
酸配列を示している。図中番号は１番目のアミノ酸であ
るメチオニンを暗号化するＡＴＧコドンの“Ａ”を一番
として数えた番号を示している。ＤＨＦＲ−ＧＲＦ29
は、193個のアミノ酸よりなり、分子量が21,741ダルト
ンである。この融合タンパク質はＤＨＦＲのカルボキシ
ル末端側にＧＲＦ29が結合した構造を有しているにもか
かわらず、ＤＨＦＲ酵素活性を有する。

本発明の式（II）の融合タンパク質（以下、ＤＨＦＲ−
ＧＲＦＭ29又はタンパク質２という）において、159番
目までが大腸菌の野性型ＤＨＦＲに１ケ所アミノ酸置換
が起こった〔Cys-152(wild type）→Glu-152〕変異ＤＨ
ＦＲのアミノ酸配列であり、163番目から191番目までが
ＧＲＦＭ29のアミノ酸配列である。また、160番目から1
62番目まではＤＨＦＲとＧＲＦＭ29とを結び付け、安定
に発現するのを助けると同時に、ブロムシアンで処理す
ることにより、融合タンパク質からＧＲＦＭ29の配列を
切り出すことを可能とするアミノ酸配列である。第２図
は、ＤＨＦＲ−ＧＲＦＭ29を暗号化するＤＮＡ配列とそ
れが暗号化するアミノ酸配列を示している。図中番号は
１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化するＡＴＧ
コドンの“Ａ”を一番として数えた番号を示している。
ＤＨＦＲ−ＧＲＦＭ29は、191個のアミノ酸よりなり、
分子量が21,732ダルトンである。この融合タンパク質は
ＤＨＦＲのカルボキシル末端側にＧＲＦＭ29が結合した
構造を有しているにもかかわらず、ＤＨＦＲ酵素活性を
有する。

本発明の式（III）の融合タンパク質（以下、ＤＨＦＲ
−ＧＲＦ44又はタンパク質３という）において、159番
目までが大腸菌の野性型ＤＨＦＲに１ケ所アミノ酸置換
が起こった〔Cys-152(wild type）→Glu-152〕変異ＤＨ
ＦＲのアミノ酸配列であり、165番目から208番目までが
ＧＲＦ44のアミノ酸配列である。また、160番目から164
番目まではＤＨＦＲとＧＲＦ44とを結び付け、安定に発
現するのを助けると同時に、最終的に牛血液凝固因子Ｘ
ａを作用させることによりＧＲＦ44を切り出すことを可
能とするアミノ酸配列である。第３図は、ＤＨＦＲ−Ｇ
ＲＦ44を暗号化するＤＮＡ配列とそれが暗号化するアミ
ノ酸配列を示している。図中番号は１番目のアミノ酸で
あるメチオニンを暗号化するＡＴＧコドンの“Ａ”を一
番として数えた番号を示している。ＤＨＦＲ−ＧＲＦ44
は、208個のアミノ酸よりなり、分子量が23,625ダルト
ンである。この融合タンパク質はＤＨＦＲのカルボキシ
ル末端側にＧＲＦ44が結合した構造を有しているにもか
かわらず、ＤＨＦＲ酵素活性を有する。本発明の式（I
V）の融合タンパク質（以下、ＤＨＦＲ−ＧＲＦＭ又は
タンパク質４という）において、159番目までが大腸菌
の野性型ＤＨＦＲに１ケ所アミノ酸置換が起こった〔Cy
s-152(wild type）→Glu-152〕変異ＤＨＦＲのアミノ酸
配列であり、163番目から206番目までがＧＲＦＭのアミ
ノ酸配列である。また、160番目から162番目まではＤＨ
ＦＲとＧＲＦＭとを結び付け、安定に発現するのを助け
ると同時に、ブロムシアンで処理することにより，融合
タンパク質からＧＲＦＭの配合を切り出すことを可能と
するアミノ酸配列である。第４図は、ＤＨＦＲ−ＧＲＦ
Ｍを暗号化するＤＮＡ配列とそれが暗号化するアミノ酸
配列を示している。図中番号は１番目のアミノ酸である
メチオニンを暗号化するＡＴＧコドンの“Ａ”を一番と
して数えた番号を示している。ＤＨＦＲ−ＧＲＦＭは、
206個のアミノ酸よりなり、分子量が23,414ダルトンで
ある。この融合タンパク質はＤＨＦＲのカルボキシル末
端側にＧＲＦＭが結合した構造を有しているにもかかわ
らず、ＤＨＦＲ酵素活性を有する。

本発明の新規ジヒドロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出
因子誘導体融合タンパク質は、本発明者らが生命工学工
業技術研究所（旧、微生物工業技術研究所）に既に寄託
している組換え菌体を用いて後述するように分離精製す
ることにより製造される。すなわち、ＤＨＦＲ−ＧＲＦ
29は寄託番号ＦＥＲＭＢＰ1578の大腸菌（以下、大腸菌
１という）で、ＤＨＦＲ−ＧＲＦＭ29は寄託番号ＦＥＲ
ＭＢＰ2149の大腸菌（以下、大腸菌２という）で、ＤＨ
ＦＲ−ＧＲＦ44は寄託番号ＦＥＲＭＢＰ2152の大腸菌
（以下、大腸菌３という）で、ＤＨＦＲ−ＧＲＦＭは寄
託番号ＦＥＲＭＢＰ2151の大腸菌（以下、大腸菌４とい
う）で、それぞれ大量発現している。

（II）大腸菌１，２，３，及び４からの融合タンパク質
１，２，３，４の分離精製方法 大腸菌１，２，３，及び４は，それぞれ融合タンパク質
１，２，３，及び４を菌体内に大量に発現・蓄積する
が、その存在状態（可溶性タンパク質で蓄積するのか，
また不溶性タンパク質となるのかなど）培養温度により
異なる。各タンパク質の菌体内での存在状態に依存し
て，以下の分離精製方法を適用する。

融合タンパク質１は，不溶性タンパク質として蓄積する
割合が少なく，大半が可溶性タンパク質として蓄積す
る，が融合タンパク質２，３，及び４は，培養温度を高
温にすると，発現する各融合タンパク質のほとんどが，
不溶性タンパク質として，菌体内に蓄積する。融合タン
パク質１の分離精製は，大腸菌菌体の破砕液の可溶性タ
ンパク質画分を出発材料として，また，融合タンパク質
２，３，及び４は大腸菌菌体の破砕液の不溶性タンパク
質画分を出発材料として行うことが好都合であり，以下
にその分離精製方法を記す。

（II−１）大腸菌１からの融合タンパク質１の分離精製
方法 大腸菌１の培養は，ＹＴ＋Ａｐ培地（培地１ｌ中に、５
ｇのＮａＣｌ，８ｇのトリプトン，５ｇのイーストエキ
スおよび５０mgのアンピシリンナトリウムを含む液体培
地。）で培養することができる。培地としては，この他
にＳＴ＋Ａｐ培地（培地１ｌ中に，２ｇのグリコース，
１ｇのリン酸２カリウム，５ｇのポリペプトン，５ｇの
イーストエキスおよび５０mgのアンピシリンナトリウム
を含む液体培地。）など，菌体が成長する培地であれ
ば，どの様な培地でも用いることができるが，調べた限
りでは，ＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合融合タンパク質１
の菌体内蓄積量が最大であった。また，ＹＴ＋Ａｐ培地
を用いて培養した場合，培養温度を３７℃にすると発現
する融合タンパク質１の一部（２０〜５０％）が不溶性
タンパク質として蓄積するが，３０℃以下で培養した場
合，ほとんど全てが可溶性タンパク質として回収でき
る。従って，培養温度としては，３０℃もしくは，それ
以下が望ましい。

大腸菌１を，培地に接種し、３０℃で対数成長期の後期
もしくは定常期まで培養する。培養した菌体は，５，０
００回転／分の遠心分離により集める。培地１ｌより湿
重量２から５ｇの菌体が得られる。

集菌およびこれ以後の操作は，特に断わらない限り低温
（０から１０℃の間，４℃が望ましい）で行う。なお，
融合タンパク質１の回収は，各処理をして得られる融合
タンパク質１溶液中のＤＨＦＲ酵素活性を測定すること
により求めることができる。

培養して得られた菌体を，湿重量の３倍の緩衝液１
（０．１ｍＭ エチレンジアミン４酢酸ナトリウム（Ｅ
ＤＴＡ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，pH７．
０）に懸濁し，フレンチプレスを用いて菌体を破砕す
る。菌体破砕液を，１５，０００回転，２０分間遠心分
離し、上清を得る（無細胞抽出液）。無細胞抽出液に，
最終濃度１．９％になるように硫酸ストレプトマイシン
を加え，２０分攪はんする。その後，１５，０００回
転，２０分間遠心分離することにより生じた沈澱を除き
上清を得る（ストレプトマイシン処理上清）。この処理
は，混在する核酸成分を除去することが目的であり，用
いられるストレプトマイシン硫酸の濃度は，融合タンパ
ク質１の回収率が減少しない限り増減しても以下の操作
には問題がない（例えば，２．５％を越えると回収率は
極端に減少する）。

ストレプトマイシン処理上清１溶に，飽和硫安溶液０．
９溶を攪はんしながら静かに加え，更に２０分攪はんす
る。その後，１５，０００回転，２０分間遠心分離し，
沈澱を除き上清を得る（硫安処理上清）。この操作は，
４０〜５０％程度の飽和硫安で沈澱するタンパク質及び
核酸等を除去することが目的であり，加える飽和硫安の
量は，融合タンパク質１の回収率が減少しない限り増減
しても問題がない（例えば，加える飽和硫安の量が１．
５容を越えると回収率が極端に減少する）。

硫安処理上清を．あらかじめ緩衝液１で平衡化したＭＴ
Ｘ結合アガロース−アフィニティカラムに吸着させる。
吸着後，１ＭのＫＣｌを含む緩衝液２（０．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，pH８．
５）で洗う。洗いは，カラムからの溶出液の２８０nmの
吸光度を測定し、吸光度が０．１以下になるまで同緩衝
液を流し続ける。酵素の溶出は，１ＭのＫＣｌと３ｍＭ
の葉酸を含む緩衝液２を用いて行い，溶出液を一定量ず
つフラクションコレクターを用いて分画する。分画した
溶出液についてＤＨＦＲ活性を測定し，酵素活性が含ま
れる画分を集める。得られた酵素液を，緩衝液１に対し
て，３回透析する。この段階で，高純度の融合タンパク
質１が得られる。用いられるＭＴＸを結合したアガロー
スゲル担体は，市販品（例えば，シグマ社で販売）を利
用することができる。

（II−２）大腸菌２からの融合タンパク質２の分離精製
方法 大腸菌２を３７℃で培養することにより、融合タンパク
質２のほとんどが菌体内に不溶性タンパク質として発現
蓄積し，また，培養温度を４２℃に上げると菌体の成長
は停止するが，融合タンパク質の含量が増大する。この
ことを利用して，大腸菌２の培養は，ＹＴ＋Ａｐ培地
（培地１ｌ中に，５ｇのＮａＣｌ，５ｇの酵母エキス，
８ｇのトリプトン，及び５０mgのアンピシリンナトリウ
ムを含む液体培地）を用いておこなう。培地としては，
この他にＳＴ＋Ａｐ培地（培地１ｌ中に，２ｇのグリコ
ース，１ｇのリン酸２カリウム，５ｇのポリペプトン，
５ｇのイーストエキスおよび５０mgのアンピシリンナト
リウムを含む液体培地。）など，菌体が成長する培地で
あれば，どの様な培地でも用いることができるが，調べ
た限りでは，ＤＨＦＲ融合タンパク質の生産にはＹＴ＋
Ａｐ培地が最適であった。

大腸菌２を培地に接種し，通常３７℃対数成長期の後期
もしくは定常期まで培養する。培養した菌体は，５００
０回転／分の遠心分離により集める。培地１ｌより湿重
量２から５ｇの菌体が得られる。

集菌およびこれ以後の操作は，特に断わらない限り低温
（０から１０℃の間，４℃が望ましい）で行う。

培養して得られた菌体を，湿重量の２倍の緩衝液１
（０．１ｍＭ エチレンジアミン４酢酸ナトリウムを含
む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，pH７．０）に懸濁
し，フレンチプレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕
液を，５，０００から１０，０００回転で１０分間遠心
分離し沈澱を得る。得られた沈澱を洗浄する目的で、緩
衝液１に懸濁し，５，０００から１０，０００回転／分
で１０分間遠心分離し沈澱を得る（沈澱の洗浄）。この
洗浄の操作を２ないし３回繰り返す。得られたタンパク
質画分を不溶化画分と称する。この操作により，不溶化
融合タンパク質の純度が約５０から９０％程度になる。

得られた不溶化画分を用いた菌体の湿重量のグラム数と
同量の尿素水溶液に溶解する。尿素に不溶の物質を遠心
分離により取り除く。得られた上清を尿素可溶化画分と
称する。用いる尿素の濃度は４Ｍ以上が効果的である。
この操作により，目的融合タンパク質の純度が，約８０
％以上に高まる。

尿素可能化画分に，１０倍容の緩衝液１を加え尿素を希
釈することにより，変性状態で可溶化した融合タンパク
質２を再活性化することができる。

希釈により再活性化された融合タンパク質２の高度精製
は，ＤＨＦＲ活性を目安に，メソトリキセート（以下，
ＭＴＸと略す）を結合したアフィニティクロマトグフィ
を用いて達成される。

再活性化された融合タンパク質１溶液を，あかじめ緩衝
液１で平衡化したＭＴＸ−アガロースアフィニティカラ
ムに吸着させる。吸着後，１ＭのＫＣｌを含む緩衝液１
で洗う。洗いは，カラムからの溶出液の２８０nmの吸光
度を測定し，吸光度が０．１以下になるまで同緩衝液を
流し続ける。酵素の溶出は，１ＭのＫＣｌと３ｍＭの葉
酸を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，pH9.0を用い
て行い，溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを
用いて分画する。分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性
を測定し，酵素活性が含まれる画分を集める。得られた
酵素液を，緩衝液１に対して，３回透析する。この操作
により，目的融合タンパク質は，完全に純化することが
できる。

なお，透析して得られる酵素液中には，透析が不完全な
場合には，葉酸が含まれており，このため，２８０nmの
吸光度を利用したタンパク質量の検定等の障害となるこ
とが考えられる。そのために，ここでは，ＤＥＡＥ−ト
ヨパールカラムクロマトグラフィーの利用方法を記載す
るが，本方法の使用は，融合タンパク質の分離及び高純
度精製方法を限定しない。

透析した酵素液を，あらかじめ緩衝液１で平衡化したＤ
ＥＡＥ−トヨパールカラムに吸着させる。吸着後，０．
１ＭのＫＣｌを含む緩衝液１で洗う。洗いは，カラムか
らの溶出液の２８０nmの吸光度を測定し，吸光度が０．
０１以下になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出
は，緩衝液１を用いて０．１Ｍから０．３ＭのＫＣｌの
直接濃度勾配を用いて行い，溶出液を一定量ずつフラク
ションコレクターを用いて分画する。分画した溶出液に
ついて２８０nmの吸光度とＤＨＦＲ活性を測定する。酵
素活性／２８０nmの吸光度の値が，一定な画分を集め
る。この操作により，再現性良く、葉酸を取り除くこと
ができる。

ＤＨＦＲ酵素活性は，反応液（０．０５ｍＭのジヒドロ
葉酸，０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ，１２ｍＭの２−メル
カプトエタノール，５０ｍＭのリン酸緩衝液（pH７．
０））を，１mlのキュベットとり，これに酵素液を加
え，３４０nmの吸光度の時間変化を３０℃で測定するこ
とにより行う。酵素１ユニットは，上記反応条件におい
て，１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元する
のに必要な酵素量として定義する。この測定は，分光光
度計を用いて容易に行うことができる。

（II−３）大腸菌３からの融合タンパク質３の分離精製
方法 融合タンパク質３は，菌体として大腸菌３を用いる以外
は，融合タンパク質２の分離精製方法と全く同様に行
う。

（II−４）大腸菌４からの融合タンパク質４の分離精製
方法 融合タンパク質４は，菌体として大腸菌４を用いる以外
は，融合タンパク質２の分離精製方法と全く同様に行
う。

（III）融合タンパク質２を用いたＧＲＦＭ２９の製造
方法 精製して得られた融合タンパク質２を凍結乾燥し，これ
に１から１０mgタンパク質／mlとなるように７０％蟻酸
を加え，溶かした後，タンパク質量の約２０倍量の結晶
ブロムシアンを加え密栓し，窒素雰囲気下，１０〜室温
で攪拌しながら２４時間反応させる。反応液を１０倍の
水で希釈した後，凍結乾燥し過剰の試薬を除く。乾燥資
料を１から１０mgタンパク質／mlとなるように３０％酢
酸に溶かす。溶かした試料をＨＰＬＣ装置（島津ＬＣ−
４Ａ，inertsil-ODSカラム）を用いて，０．１％トリフ
ルオロ酢酸中，２７．５％から４２．５％のアセトニト
リルの直線濃度勾配を用いて溶出・分離することができ
る。溶出物は，２２０nmにおける吸光度を測定すること
により検出することができる。第５図は，ブロムシアン
処理したタンパク質２試料の高速液体クロマトグラムを
示している。試料注入後約４７分のピークがＧＲＦＭ２
９である。このピーク画分を分離する。分離した溶出液
をエバホレーターで乾燥後，少量の水を加え凍結乾燥し
溶媒を除き，ＧＲＦＭ２９を得ることができる。また，
得られたペプチドを酸加水分解後，アミノ酸分析するこ
とによりアミノ酸組成を確かめることができる。

（IV）融合タンパク質４を用いたＧＲＦＭの製造方法 精製して得られた融合タンパク質４を凍結乾燥し，これ
に１から１０mgタンパク質／mlとなるように７０％蟻酸
を加え，溶かした後，タンパク質量の約２０倍量の結晶
ブロムシアンを加え密栓し，窒素雰囲気下，１０〜室温
で攪拌しながら２４時間反応させる。反応液を１０倍の
水で希釈した後，凍結乾燥し過剰の試薬を除く。乾燥試
料を１から１０mgタンパク質／mlとなるように３０％酢
酸に溶かす。溶かした試料をＨＰＬＣ装置（島津ＬＣ−
４Ａ，inertsil-ODSカラム）を用いて，0.1％トリフル
オロ酢酸中，２７．５％から４２．５％のアセトニトリ
ルの直線濃度勾配を用いて溶出・分離することができ
る。溶出物は，２２０nmにおける吸光度を測定すること
により検出することができる。第６図は，ブロムシアン
処理したタンパク質２試料の高速液体クロマトグラムを
示している。試料注入後約２１分のピークがＧＲＦＭで
ある。このピーク画分を分離する。分離した溶出液をエ
バホレーターで乾燥後，少量の水を加え凍結乾燥し溶媒
を除き，ＧＲＦＭを得ることができる。また，得られた
ペプチドを酸加水分解後，アミノ酸分析することにより
アミノ酸組成を確かめることができる。

本発明に用いられる試薬，装置等は，特に限定して記載
した以外は，通常の市販品を利用することができる，ま
た，ここに記載した種々の操作は，この分野の当業者で
あれば，なんの問題もなく再現よく行うことができる。
なお，用いられる市販の試薬品は，特級以上の品質が要
求される。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ 融合タンパク質１の分離精製 融合タンパク質１は，組換えプラスミドｐＧＲＦ２−１
５上に暗号化されており，微工研寄託番号ＦＥＲＭＢＰ
−１５７８の大腸菌（以下，ＢＰ−１５７８株と略す）
が生産する融合タンパク質である。

ＢＰ−１５７８株は，ＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合，３
７℃では融合タンパク質１の４０％が不溶性タンパク質
として蓄積するが，３０％ではほとんど１００％が可溶
性タンパク質として菌体内に蓄積する。従って，ＹＴ＋
Ａｐ培地３ｌを用いて，３０℃で１８時間培養した。培
養後，１５，０００回転／分，１０分間の遠心分離によ
り菌体を集め，菌体を３００mlの緩衝液１に懸濁し，再
び５，０００回転／分，１０分間の遠心分離を行い菌体
を集めた。その結果，湿重量約１３ｇの菌体が得られ
た。得られた菌体を約２６mlの緩衝液１に懸濁し，フレ
ンチプレスを用いて菌体を破砕し，得られた菌体破砕液
を，１５，０００回転／分，２０分間の遠心分離し，上
清を集めた（約３０ml，回収生活 １６９３ユニット
（１０％））。上清に，０．５７ｇのストレプトマイト
ン硫酸を加え，２０分間攪拌し，１５，０００回転／
分，２０分間の遠心分離し，上清を集めた（約２８ml，
回収活性 １６０８ユニット（９５％））。これに，２
５mlの飽和硫安溶液を攪拌しながら徐々に加え，２０分
間攪拌し，１５，０００回転／分，２０分間の遠心分離
し，上清を集めた（約５０ml，回収生活 １４４８ユニ
ット８６％））。これに約１０ｇのあらかじめ緩衝液１
で平衡化したＭＴＸ−アガロースゲルを加え，緩やかに
攪はんしながら１時間放置し，融合タンパク質をＭＴＸ
アガロースゲルに吸着させた。この操作をしたゲルをカ
ラムにつめ，上澄み液をカラムに通した後，１ＭのＫＣ
ｌを含む緩衝液１で洗った。洗いは，カラムからの溶出
液の２８０nmの吸光度を測定し，吸光度が０．１以下に
なるまで同緩衝液を流し続けた（約１５０ml）。酵素の
溶出は，１ＭのＫＣｌと３ｍＭの葉酸を含む１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液，pH９．０を用いて行い，溶出液を
一定量（約５ml）をフラクションコレクターを用いて分
画した。分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性を測定
し，酵素活性が含まれる画分を集めた（約２５ml）。得
られた酵素液を，緩衝液１に対して，３回透析した。透
析した標品を，ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ，均一
なタンパク質標品であることが示された。この標品は，
８６９ユニットのＤＨＦＲ活性（回収率５１％），また
約２２mgの融合タンパク質を含んでいた。

実施例２ 融合タンパク質２の分離精製 ＤＨＦＲ−牛成長ホルモン放出因子フラグメント融合タ
ンパク質は，組換えプラスミドｐＳＧ１−１２上に暗号
化されており，微工研寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−２１４９
の大腸菌（以下，ＢＰ−２１４９株と略す）が生産する
融合タンパク質である。

ＢＰ−２１４９株は，ＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合，３
７℃では９０％が，また３０℃では約５０％の融合タン
パク質２が不溶化するが，２０℃ではほとんど１００％
が可溶性タンパク質として菌体内に蓄積する。従って，
ＹＴ＋Ａｐ培地３ｌを用いて，３０℃で１６時間培養し
た後，４２℃で更に１時間培養を行った。培養後，５，
０００回転／分，１０分間の遠心分離により菌体を集
め，菌体を３００mlの緩衝液１に懸濁し，再び５，００
０回転／分，１０分間の遠心分離を行い菌体を集めた。
その結果，湿重量約１１ｇの菌体が得られた。得られた
菌体を約２２mlの緩衝液１に懸濁し，フレンチプレスを
用いて菌体を破砕し，得られた菌体破砕液を，５，００
０回転／分，１０分間の遠心分離し，沈澱を集めた。沈
澱は，白色をしており，これを３０mlの緩衝液１に懸濁
し，再び５，０００回転／分，１０分間の遠心分離を行
い沈澱を集めた。得られた沈澱を，１１mlの４Ｍ尿素を
含む緩衝液１に溶解し，不溶性部分を，１５，０００回
転／分，１５分間の遠心分離により沈澱として取り除
き，上清を得た（約１１ml）。上清に，１０倍量（１１
０ml）の緩衝液１を加え希釈した。希釈した溶液中に
は，３２２２ユニットのＤＨＦＲ活性が含まれていた。
これに約１０ｇのあらかじめ緩衝液１で平衡化したＭＴ
Ｘ−アガロースゲルを加え，緩やかに攪はんしながら一
晩放置し，融合タンパク質をＭＴＸアガロースゲルに吸
着させた。この操作をしたゲルをカラムにつめ，上澄み
液をカラムに通した後，１ＭのＫＣｌを含む緩衝液１で
洗った。洗いは，カラムからの溶出液の２８０nmの吸光
度を測定し，吸光度が０．１以下になるまで同緩衝液を
流し続けた（約１５０ml）。酵素の溶出は，１ＭのＫＣ
ｌと３ｍＭの葉酸を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液，pH９．０を用いて行い，溶出液を一定量（約５ml）
をフラクションコレクターを用いて分画した。分画した
溶出液についてＤＨＦＲ活性を測定し，酵素活性が含ま
れる画分を集めた（約２５ml）。得られた酵素液を，緩
衝液１に対して，３回透析した。透析した標品を，ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで調べたところ，均一なタンパク質標品で
あることが示された。この標品は，１５７９ユニットの
ＤＨＦＲ活性（回収率４９％），また約４４mgの融合タ
ンパク質を含んでいた。

実施例３ 融合タンパク質３ 融合タンパク質３は，組換えプラスミドｐＧＲＦ４４−
２２上に暗号化されており，微工研寄託番号ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２１５２の大腸菌（以下，ＢＰ−２１５２株と略
す）が生産する融合タンパク質である。

培地としてＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合，３７℃では９
０％が，３０℃では約４０％が不溶性タンパク質として
蓄積するが，２０℃ではほとんど１００％が可溶性タン
パク質として菌体内に蓄積する。従って，ＹＴ＋Ａｐ培
地３ｌを用いて，３７℃で１６時間培養を行った後，４
２℃で更に２時間培養を行った。培養後，５，０００回
転／分，１０分間の遠心分離により菌体を集め，菌体を
３００mlの緩衝液１に懸濁し，再び５，０００回転／
分，１０分間の遠心分離を行い菌体を集めた。その結
果，湿重量約１３ｇの菌体が得られた。得られた菌体を
２６mlの緩衝液１に懸濁し，フレンチプレスを用いて菌
体を破砕し，得られた菌体破砕液を，５，０００回転／
分，１０分間の遠心分離し，沈澱を集めた。沈澱は，白
色をしており，これを３０mlの緩衝液１に懸濁し，再び
５，０００回転／分，１０分間の遠心分離を行い沈澱を
集めた。この操作を，３回繰り返した。得られた沈澱
を，１３mlの４Ｍ尿素を含む緩衝液１に溶解し，不溶性
部分を，１５，０００回転／分，１５分間の遠心分離に
より沈澱として取り除き，上清を得た（約１３ml）。上
清に，１０倍量（１３０ml）の緩衝液１を加え希釈し
た。希釈した溶液中には，９２７ユニットのＤＨＦＲ活
性が含まれていた。これに１０ｇのあらかじめ緩衝液１
で平衡化したＭＴＸアガロースゲルを加え，緩やかに攪
はんしながら一晩放置し，融合タンパク質をＭＴＸアガ
ロースゲルに吸着させた。この操作をしたゲルをカラム
につめ，上澄み液をカラムに通した後，１ＭのＫＣｌを
含む緩衝液１で洗った。洗いは，カラムからの溶出液の
２８０nmの吸光度を測定し，吸光度が０．１以下になる
まで同緩衝液を流し続けた（約１５０ml）。酵素の溶出
は，１ＭのＫＣｌと３ｍＭの葉酸を含む１０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液，pH９．０を用いて行い，溶出液を一定
量（約５ml）をフラクションコレクターを用いて分画し
た。分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性を測定し，酵
素活性が含まれる画分を集めた（約２５ml）。得られた
酵素液を，緩衝液１に対して，３回透析した。透析した
標品を，ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ，均一なタン
パク質標品であることが示された。この標品は，４４５
ユニットのＤＨＦＲ活性（回収率４８％），また約１２
mgの融合タンパク質を含んでいた。

実施例４ 融合タンパク質４ 融合タンパク質４は，組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４
−６上に暗号化されており，微工研寄託番号ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２１５１の大腸菌（以下，ＢＰ−２１５１株と略
す）が生産する融合タンパク質である。

ＢＰ−２１５１株，ＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合，３７
℃ではほどんど全ての融合タンパク質が不溶化するが，
３０℃では約６５％が不溶化し，２０℃ではほとんど１
００％が可溶性タンパク質として菌体内に蓄積する。従
って，ＹＴ＋Ａｐ培地３ｌを用いて，３７℃で１６時間
培養を行った。培養後，５，０００回転／分，１０分間
の遠心分離により菌体を集め，菌体を３００mlの緩衝液
１に懸濁し，再び５，０００回転／分，１０分間の遠心
分離を行い菌体を集めた。その結果，湿重量１３ｇの菌
体が得られた。得られた菌体を２６mlの緩衝液１に懸濁
し，フレンチプレスを用いて菌体を破砕し，得られた菌
体破砕液を，５，０００回転／分，１０分間の遠心分離
し，沈澱を集めた。沈澱は，白色をしており，これを３
０mlの緩衝液１に懸濁し，再び５，０００回転／分，１
０分間の遠心分離を行い沈澱を集めた。この操作を，３
回繰り返した。得られた沈澱を，１３mlの４Ｍ尿素を含
む緩衝液１に溶解し，不溶性部分を，１５，０００回転
／分，１５分間の遠心分離により沈澱として取り除き，
上清を得た（約１４ml）。上清に，１０倍量（１４０m
l）の緩衝液１を加え希釈した。希釈した溶液中には，
９３７ユニットのＤＨＦＲ活性が含まれていた。これに
１０ｇのあらかじめ緩衝液１で平衡化したＭＴＸ−アガ
ロースゲルを加え，緩やかに攪はんしながら一晩放置
し，融合タンパク質をＭＴＸアガロースゲルに吸着させ
た。この操作をしたゲルをカラムにつめ，上澄み液をカ
ラムに通した後，１ＭのＫＣｌを含む緩衝液１で洗っ
た。洗いは，カラムからの溶出液の２８０nmの吸光度を
測定し，吸光度が０．１以下になるまで同緩衝液を流し
続けた（約１５０ml）。酵素の溶出は，１ＭのＫＣｌと
３ｍＭの葉酸を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，pH
９．０を用いて行い，溶出液を一定量（約５ml）をフラ
クションコレクターを用いて分画した。分画した溶出液
についてＤＨＦＲ活性を測定し，酵素活性が含まれる画
分を集めた（約２５ml）。得られた酵素液を，緩衝液１
に対して，３回透析した。透析した標品を，ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで調べたところ，均一なタンパク質標品であるこ
とが示された。この標品は，４７３ユニットのＤＨＦＲ
活性（回収率５１％），また約２０mgの融合タンパク質
を含んでいた。

実施例５ 融合タンパク質２からのＧＦＲＭ２９の分離 上記実施例２で得られた高度精製融合タンパク質２（５
mg）を，凍結乾燥し，これを約２mlの７０％蟻酸に溶か
し，これに約１００mgのブロムシアンを加え溶かした
後，窒素雰囲気下に密栓し，１０℃で２４時間反応させ
た。反応後，２０mlの水を加え，その後凍結乾燥した。
凍結乾燥して得られた標品を，１mlの３０％酢酸に溶か
した。そのうちの，０．５mlをとり，高速液体クロマト
グラフィー装置（島津ＬＣ−６Ａ）を用いlnertsil-ODS
５μｍ（7.6×50mm）カラムで分離した。溶出は，流速
２ml／minで０．１％トリフルオロ酢酸中，アセトニト
リルの濃度勾配（２７．５％から４２．５％）をかける
ことにより行った。０から５分までは，２７．５％のア
セニトリルを用い，５分から８０分までは，２７．５％
から４２．５％のアセトニトリルの直線濃度勾配をかけ
た。８０分から１００分の間は，５０％の濃度を用い，
その後は２７．５％のアセトニトリル濃度を用いた。溶
出物は，２２０nmの吸光度を測定することにより行っ
た。その結果，第５図に示すような溶出曲線が得られ
た。試料注入後約４７分後のピーク画分を分離し，分離
した溶出液をエバホレーターで乾燥後，少量の水を加え
凍結乾燥し溶媒を除き，ペプチドを得た。得られたペプ
チドを酸加水分解後，その４分の１をアミノ酸分析に用
いた。

その結果，得られたアミノ酸組成は，ＧＲＦＭ２９の配
列から予想される組成と一致することが示された。ま
た，アミノ酸分析に用いた試料中には１９nmoleのＧＲ
ＦＭ（６６μｇ，０．４１mgの融合タンパク質２に相
当）が含まれていることが明かとなった。この結果か
ら，精製均一化した融合タンパク質２用いて，ブロムシ
アン処理した標品をＨＰＬＣを用いて分離することによ
り収率約６６％でＧＲＦＭ２９を回収できた。

実施例６ 融合タンパク質４からのＧＦＲＭの分離 上記実施例２で得られた高度精製融合タンパク質２（１
０mg）を，凍結乾燥し，これを約２mlの７０％蟻酸に溶
かし，これに約２００mgのブロムシアンを加え溶かした
後，窒素雰囲気下に密栓し，１０℃で２４時間反応させ
た。反応後，２０mlの水を加え，その後凍結乾燥した。
凍結乾燥して得られた標品を，１mlの３０％酢酸に溶か
した。そのうちの，０．１mlをとり，高速液体クロマト
グラフィー装置（島津ＬＣ−６Ａ）を用いlnertsil-ODS
５μｍ（4.6×150mm）カラムで分離した。溶出は，流速
１ml／minで０．１％トリフルオロ酢酸中，アセトニリ
ルの濃度勾配（２７．５％から４２．５％）をかけるこ
とにより行った。０から２分までは，２７．５％のアセ
ニトリルを用い，２分から３２分までは，２７．５％か
ら４２．５％のアセトニトリルの直線濃度勾配をかけ
た。３２分から３５分の間は，５０％の濃度を用い，そ
の後は２７．５％のアセトニトリル濃度を用いた。溶出
物は，２２０nmの吸光度を測定することにより行った。
その結果、第６図に示すような溶出曲線が得られた。試
料注入後約２１分後のピーク画分を分離し，分離した溶
出液をエバホレーターで乾燥後，少量の水を加え凍結乾
燥し溶媒を除き，ペプチドを得た。得られたペプチドを
酸加水分解後，その８分の１をアミノ酸分析に用いた。

その結果，得られたアミノ酸組成は，ＧＲＦＭ２９の配
列から予想される組成と一致することが示された。ま
た，アミノ酸分析に用いた試料中には２．２nmoleのＧ
ＲＦＭ（１１μｇ，５１μｇの融合タンパク質２に相
当）が含まれていることが明かとなった。この結果か
ら，精製均一化した融合タンパク質２用いて，ブロムシ
アン処理した標品をＨＰＬＣを用いて分離することによ
り収率約４１％でＧＲＦＭを回収できた。

［発明の効果］ 本発明の新規ジヒドロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出
因子誘導体融合タンパク質は、ＤＨＦＲのカルボキシル
末端側にＧＲＦ29、ＧＲＦＭ29、ＧＲＦ44あるいはＧＲ
ＦＭが結合した構造をもつにもかかわらず、ＤＨＦＲ酵
素活性を有する。また、この酵素−タンパク質は遺伝子
切換え操作により安定に効率よく、しかも分離精製も容
易に工業的に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は，ｐＧＲＦ２−１５中に存在する融合タンパク
質１を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のア
ミノ酸配列を示す図である。図中符号は，核酸塩基およ
びアミノ酸を表し，Ａはアデニンを，Ｃはシトシンを，
Ｇはグアニンを，Ｔはチミンを，Ａｌａはアラニンを，
Ａｒｇはアルギニンを，Ａｓｎはアスパラギンを，Ａｓ
ｐはアスパラギン酸を，Ｃｙｓはシスティンを，Ｇｌｎ
はグルタミンを，Ｇｌｕはグルタミン酸を，Ｇｌｙはグ
リシンを，Ｈｉｓはヒスチジンを，Ｉｌｅはイソロイシ
ンを，Ｌｅｕはロイシンを，Ｌｙｓはリジンを，Ｍｅｔ
はメチオニンを，Ｐｈｅはフェニルアラニンを，Ｐｒｏ
はプロリンを，Ｓｅｒはセリンを，Ｔｈｒはトレオニン
を，Ｔｒｐはトリプトファンを，Ｔｙｒはチロシンを，
Ｖａｌはバリンを示している。図中番号は，１番目のア
ミノ酸であるメチオニンを暗号化するＡＴＧコドンの
“Ａ”を１番として数えた番号を示している。 第２図は，ｐＳＧ１−１２中に存在する融合タンパク質
２を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミ
ノ酸配列を示す図である。図中符号は，第１図と同様で
ある。 第３図は，ｐＧＲＦ４４−２２中に存在する融合タンパ
ク質３を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は，第１図と同
様である。 第４図は，ｐＧＲＦＭ４４−６中に存在する融合タンパ
ク質４を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は，第１図と同
様である。 第５図は，ブロムシアン処理した融合タンパク質２試料
の高速液体クロマトグラムを示している。横軸は試料注
入後の時間を分単位で，縦軸は，２２０nmの吸光度を任
意単位で表現している。矢印で示したピークがＧＲＦＭ
２９の溶出ピークである。 第６図は，ブロムシアン処理した融合タンパク質４試料
の高速液体クロマトグラムを示している。横軸は試料注
入後の時間を分単位で，縦軸は，２２０nmの吸光度を任
意単位で表現している。矢印で示したピークがＧＲＦＭ
の溶出ピークである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭63−102698（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−500996（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，1986〔191〕 Ｐ．553−562 Ｐ ｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．, 1988〔10〕Ｐ．331−338

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 Met-Ile-Ser-Leu-Ile-Ala-Ala-Leu-Ala-Val-Asp-Arg-Va
   l-Ile-Gly-Met-Glu-Asn-Ala-Met-Pro-Trp-Asn-Leu-Pro-
   Ala-Asp-Leu-Ala-Trp-Phe-Lys-Arg-Asp-Thr-Leu-Asn-Ly
   s-Pro-Val-Ile-Met-Gly-Arg-His-Thr-Trp-Glu-Ser-Ile-
   Gly-Arg-Pro-Leu-Pro-Gly-Arg-Lys-Asn-Ile-Ile-Leu-Se
   r-Ser-Gln-Pro-Gly-Thr-Asp-Asp-Arg-Val-Thr-Trp-Val-
   Lys-Ser-Val-Asp-Glu-Ala-Ile-Ala-Ala-Gys-Gly-Asp-Va
   l-Pro-Glu-Ile-Met-Val-Ile-Gly-Gly-Gly-Arg-Val-Tyr-
   Glu-Gln-Phe-Leu-Pro-Lys-Ala-Gln-Lys-leu-Tyr-Leu-Th
   r-His-Ile-Asp-Ala-Glu-Val-Glu-Gly-Asp-Thr-His-Phe-
   Pro-Asp-Tyr-Glu-Pro-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Val-Phe-Se
   r-Glu-Phe-His-Asp-Ala-Asp-Ala-Gln-Asn-Ser-His-Ser-
   Tyr-Glu-Phe-Glu-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg-Ile-Ile-Glu-Gl
   y-Arg-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-
   Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gl
   n-Asp-Ile-Met-Asn-Arg （式中のAlaはアラニン、Argはアルギニン、Asnはアス
   パラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイン、Gl
   nはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリシン、H
   isはヒスチジン、Ileはイソロイシン、Leuはロイシン、
   Lysはリジン、Metはメチオニン、Pheはフェニルアラニ
   ン、Proはプロリン、Serはセリン、Thrはスレオニン、T
   rpはトリプトファン、Tyrはチロシン、Valはバリンのア
   ミノ酸単位を示し、またアミノ酸配列における番号は、
   ジヒドロ葉酸還元酵素１番目のアミノ酸であるメチオニ
   ンから起算したものである） で示されるアミノ酸配列を有する、新規ジヒドロ葉酸還
   元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質。
2. 【請求項２】式 Met-Ile-Ser-Leu-Ile-Ala-Ala-Leu-Ala-Val-Asp-Arg-Va
   l-Ile-Gly-Met-Glu-Asn-Ala-Met-Pro-Trp-Asn-Leu-Pro-
   Ala-Asp-Leu-Ala-Trp-Phe-Lys-Arg-Asp-Thr-Leu-Asn-Ly
   s-Pro-Val-Ile-Met-Gly-Arg-His-Thr-Trp-Glu-Ser-Ile-
   Gly-Arg-Pro-Leu-Pro-Gly-Arg-Lys-Asn-Ile-Ile-Leu-Se
   r-Ser-Gln-Pro-Gly-Thr-Asp-Asp-Arg-Val-Thr-Trp-Val-
   Lys-Ser-Val-Asp-Glu-Ala-Ile-Ala-Ala-Gys-Gly-Asp-Va
   l-Pro-Glu-Ile-Met-Val-Ile-Gly-Gly-Gly-Arg-Val-Tyr-
   Glu-Gln-Phe-Leu-Pro-Lys-Ala-Gln-Lys-leu-Tyr-Leu-Th
   r-His-Ile-Asp-Ala-Glu-Val-Glu-Gly-Asp-Thr-His-Phe-
   Pro-Asp-Tyr-Glu-Pro-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Val-Phe-Se
   r-Glu-Phe-His-Asp-Ala-Asp-Ala-Gln-Asn-Ser-His-Ser-
   Tyr-Glu-Phe-Glu-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg-Ile-Leu-Met-Ty
   r-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
   Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Il
   e-Ile-Asn-Arg （式中のAlaはアラニン、Argはアルギニン、Asnはアス
   パラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイン、Gl
   nはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリシン、H
   isはヒスチジン、Ileはイソロイシン、Leuはロイシン、
   Lysはリジン、Metはメチオニン、Pheはフェニルアラニ
   ン、Proはプロリン、Serはセリン、Thrはスレオニン、T
   rpはトリプトファン、Tyrはチロシン、Valはバリンのア
   ミノ酸単位を示し、またアミノ酸配列における番号は、
   ジヒドロ葉酸還元酵素１番目のアミノ酸であるメチオニ
   ンから起算したものである） で示されるアミノ酸配列を有する、新規ジヒドロ葉酸還
   元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質。
3. 【請求項３】式 Met-Ile-Ser-Leu-Ile-Ala-Ala-Leu-Ala-Val-Asp-Arg-Va
   l-Ile-Gly-Met-Glu-Asn-Ala-Met-Pro-Trp-Asn-Leu-Pro-
   Ala-Asp-Leu-Ala-Trp-Phe-Lys-Arg-Asp-Thr-Leu-Asn-Ly
   s-Pro-Val-Ile-Met-Gly-Arg-His-Thr-Trp-Glu-Ser-Ile-
   Gly-Arg-Pro-Leu-Pro-Gly-Arg-Lys-Asn-Ile-Ile-Leu-Se
   r-Ser-Gln-Pro-Gly-Thr-Asp-Asp-Arg-Val-Thr-Trp-Val-
   Lys-Ser-Val-Asp-Glu-Ala-Ile-Ala-Ala-Cys-Gly-Asp-Va
   l-Pro-Glu-Ile-Met-Val-Ile-Gly-Gly-Gly-Arg-Val-Tyr-
   Glu-Gln-Phe-Leu-Pro-Lys-Ala-Gln-Lys-Leu-Tyr-Leu-Th
   r-His-Ile-Asp-Ala-Glu-Val-Glu-Gly-Asp-Thr-His-Phe-
   Pro-Asp-Tyr-Glu-Pro-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Val-Phe-Se
   r-Glu-Phe-His-Asp-Ala-Asp-Ala-Gln-Asn-Ser-His-Ser-
   Tyr-Glu-Phe-Glu-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg-Ile-Ile-Glu-Gl
   y-Arg-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-
   Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gl
   n-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-
   Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu （式中のAlaはアラニン、Argはアルギニン、Asnはアス
   パラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイン、Gl
   nはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリシン、H
   isはヒスチジン、Ileはイソロイシン、Leuはロイシン、
   Lysはリジン、Metはメチオニン、Pheはフェニルアラニ
   ン、Proはプロリン、Serはセリン、Thrはスレオニン、T
   rpはトリプトファン、Tyrはチロシン、Valはバリンのア
   ミノ酸単位を示し、またアミノ酸配列における番号は、
   ジヒドロ葉酸還元酵素１番目のアミノ酸であるメチオニ
   ンから起算したものである）で示されるアミノ酸配列を
   有する、新規ジヒドロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出
   因子誘導体融合タンパク質。
4. 【請求項４】式 Met-Ile-Ser-Leu-Ile-Ala-Ala-Leu-Ala-Val-Asp-Arg-Va
   l-Ile-Gly-Met-Glu-Asn-Ala-Met-Pro-Trp-Asn-Leu-Pro-
   Ala-Asp-Leu-Ala-Trp-Phe-Lys-Arg-Asp-Thr-Leu-Asn-Ly
   s-Pro-Val-Ile-Met-Gly-Arg-His-Thr-Trp-Glu-Ser-Ile-
   Gly-Arg-Pro-Leu-Pro-Gly-Arg-Lys-Asn-Ile-Ile-Leu-Se
   r-Ser-Gln-Pro-Gly-Thr-Asp-Asp-Arg-Val-Thr-Trp-Val-
   Lys-Ser-Val-Asp-Glu-Ala-Ile-Ala-Ala-Cys-Gly-Asp-Va
   l-Pro-Glu-Ile-Met-Val-Ile-Gly-Gly-Gly-Arg-Val-Tyr-
   Glu-Gln-Phe-Leu-Pro-Lys-Ala-Gln-Lys-Leu-Tyr-Leu-Th
   r-His-Ile-Asp-Ala-Glu-Val-Glu-Gly-Asp-Thr-His-Phe-
   Pro-Asp-Tyr-Glu-Pro-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Val-Phe-Se
   r-Glu-Phe-His-Asp-Ala-Asp-Ala-Gln-Asn-Ser-His-Ser-
   Tyr-Glu-Phe-Glu-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg-Ile-Leu-Met-Ty
   r-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
   Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Il
   e-Ile-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-
   Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu （式中のAlaはアラニン、Argはアルギニン、Asnはアス
   パラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイン、Gl
   nはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリシン、H
   isはヒスチジン、Ileはイソロイシン、Leuはロイシン、
   Lysはリジン、Metはメチオニン、Pheはフェニルアラニ
   ン、Proはプロリン、Serはセリン、Thrはスレオニン、T
   rpはトリプトファン、Tyrはチロシン、Valはバリンのア
   ミノ酸単位を示し、またアミノ酸配列における番号は、
   ジヒドロ葉酸還元酵素１番目のアミノ酸であるメチオニ
   ンから起算したものである）で示されるアミノ酸配列を
   有する、新規ジヒドロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出
   因子誘導体融合タンパク質。