JPH0364114B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、
DHFRと略す）が２分子つながつたタンパク質
（以下、DHFRダイマーと称する）およびその生
産を可能とする新規組換えプラスミドpDDM1に
関するものである。 本発明の新規組換えプラスミドpDDM1は、第
１図において示されるDNA配列を有する。
DHFRダイマーは、第２図において示されるア
ミノ酸配列を有する。pDDM1、pDDM1を含有
する大腸菌、およびDHFRダイマーは、発酵工
業、医薬品工業等の分野に好適である。 ［従来の技術および問題点］ 大腸菌が生産するDHFRは、アミノ酸159個よ
りなる一本のポリペプチド鎖中に一つの酵素活性
単位を有するモノメリツクな酵素である。すで
に、本発明者らは、組換えDNA技術を駆使した
大腸菌のDHFRの大量発現および生産方法を確
立している（特開昭59−135889号公報、特開昭62
−69990号公報、特開平１−144974号公報）。本発
明のDHFRダイマーは、上記モノメリツクな
DHFRと異なり、一本のポリペプチド鎖中に２
つの酵素活性単位を有するまつたく新規なタンパ
ク質であり、本発明が完成するまでには知られて
いなかつた物質である。またDHFRダイマーを
暗号化するプラスミドpDDM1も同様に新規な組
換えプラスミドである。 本発明のDHFRダイマーを開発するための基
礎となる技術としては、本発明者が発明した融合
タンパク質の作製方法がある（特開平１−144992
号公報）。 ［発明の目的］ 本発明のDHFRダイマーは、一本のポリペプ
チド鎖中にDHFR酵素活性を発現する２つの酵
素活性単位を有するタンパク質であり、本発明が
なされるまではまつたく未知の物質であつた。 本発明者らは、新規なタンパク質である
DHFRダイマーの作製を目的に鋭意研究した結
果、本発明者が開発した融合タンパク質の作製方
法を利用して、DHFR遺伝子を結合することに
よりDHFRを２分子結合することを考案し、そ
れに基づき組換えプラスミドpDDM1の作製およ
びpDDM1の大腸菌での発現を行い、pDDM1を
有する大腸菌からのDHFRダイマーの分離精製
に成功し本発明を完成させるに至つた。 ［発明の構成］ 本発明は、(1)新規組換えプラスミドpDDM1、
(2)pDDM1を含有する大腸菌、(3)pDDM1が暗号
化する新規な酵素タンパク質であるDHFRダイ
マー、および(4)pDDM1を含有する大腸菌からの
DHFRダイマーの分離精製方法から構成される。 (1) 新規組換えプラスミドpDDM1 第１図は、本発明のpDDM1の全塩基配列を
示している。図は、２本鎖環状DNAのうち片
方のDNA鎖配列だけを、プラスミド中に２箇
所存在する制限酵素Cla部位のうち制限酵素
Hind部位に近い方の切断認識部位、5′−
ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”を１番として
数えて、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。図中符号、核酸塩基を表わし、はアデニン
を、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチ
ミンをそれぞれ示している。図中番号は、
pDDM1に唯一存在する制限酵素Cla切断認
識部位、5′−ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”
を１番として数えた番号である。また、第３図
にpDDM1を構成する各ユニツトの位置関係を
示す。本発明のpDDM1は、新規な組換えプラ
スミドである。pDDM1は、5779塩基対の大き
さであり、宿主である大腸菌にトリメトプリム
およびアンピシリン耐性を付与することができ
る。pDDM1は、実施例において示すように、
すでに本発明者らが作製しているpTP64−１
（特開昭62−69990号公報参照）の制限酵素Bgl
とBcl部位の間に、すでに本発明者らが開
発しているpTP70−１（特開昭63−46193号公
報参照）の制限酵素Bgl切断によつて得られ
る約500塩基対のDNA断片を挿入することによ
つて作製することができる。しかしながら、一
旦配列が明らかにされた組換えプラスミドの作
製方法としては、種々の方法が可能であり、従
つて、組換えプラスミドの作製方法によつて本
発明が制限されるものではない。 DHFRダイマーを暗号化する配列は、第１
図の57番目から1013番目までの配列である。
DHFRダイマーを暗号化する配列の上流には、
遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在す
る（特開昭62−69990号公報）。即ち、43番目か
ら50番目までの配列がSD配列と呼ばれるもの
で、効率の良い翻訳に、また、5737番目から
5765番目までが、コンセンサス転写プロモータ
ーであり、効率の良い転写に貢献する。このこ
とから、pDDM1は、大腸菌に導入された場
合、多量のDHFRダイマーを作らせることが
できる。作られたDHFRダイマーは、菌体内
に可溶性の状態で、菌体タンパク質の約20％程
度蓄積する。ことことによつて、pDDM1を含
有する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すよう
になる。また、pDDM1は、pTP64−１由来
の、アンピシリン耐性遺伝子を有している。こ
のことから、pDDM1が導入された大腸菌は、
アンピシリン耐性をも示す。pDDM1は、大腸
菌に導入されて安定状態に保たれ、pDDM1を
含有する大腸菌は、微工研にFERM BP−
2150として寄託されている。 (2) pDDM1を含有する大腸菌 pDDM1を含有する大腸菌は、トリメトプリ
ム及びアンピシリンに対して耐性を示す。
pDDM1を含有する大腸菌は、DHFRダイマー
遺伝子の効率のよい発現の結果、DHFRダイ
マーを菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積す
る。pDDM1を含有する大腸菌をYT＋Ap培地
（培地１中に、５ｇのNaCl、８ｇのトリプト
ン、５ｇのイーストエキス、及び50mgのアンピ
シリンナトリウムを含む液体培地）を用いて、
37℃で定常期まで培養した場合、蓄積する
DHFRダイマーは、菌体タンパク質の約20％
に達する。培養菌体を、リン酸緩衝液などの適
当な緩衝液に懸濁し、フレンチプレス法もしく
は音波破砕法で破砕し、これを遠心分離法によ
り上清と沈澱に分離した場合、全てのDHFR
ダイマーは上清中に回収される。pDDM1を含
有する大腸菌は、微工研にFERM BP−2150
として寄託されている。 (3) DHFRダイマー 第２図は、DHFRダイマーを暗号化する部
分のDNA配列とそれから作られるタンパク質
のアミノ酸配列を示している。図中符号は、核
酸塩基およびアミノ酸を表わし、Ａはアデニン
を、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチ
ミンを、Alaはアラニンを、Argはアルギニン
を、Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラギ
ン酸を、Cysはシステインを、Glnはグルタミ
ンを、Gluはグルタミン酸を、Glyはグリシン
を、Hisはヒスチジンを、Ileはイソロイシン
を、Leuはロイシンを、Lysはリジンを、Met
はメチオニンを、Pheはフエニルアラニンを、
Proはプロリンを、Serはセリンを、Thrはト
レオニンを、Trpはトリプロフアンを、Tyrは
チロシンを、Valはバリンをそれぞれ示し、図
中番号は、１番目のアミノ酸であるメチオニン
を暗号化するATGコドンの“Ａ”を１番とし
て数えた番号を示している。DHFRダイマー
は、319アミノ酸よりなる新規なタンパク質で
ある。DHFRダイマーの分子量は、それぞれ
36、116である。DHFRダイマーは、まつたく
新規なタンパク質である。DHFRダイマーは、
pTP70−１由来のDHFR（第２図の１番目から
162番目までのアミノ酸配列）と、pTP64−１
由来のDHFRからＮ末端のメチオニン−イソ
ロイシンが取り除かれたタンパク質（第２図の
163番目から319番目までのアミノ酸配列）と
が、２分子直列に結合した構造である
（pTP70−１由来のDHFRは、162個のアミノ
酸よりなり、またpTP64−１由来のDHFRは、
159個のアミノ酸よりなる）このような構造に
もかかわらず、DHFRダイマーは、DHFR酵
素活性を有する。DHFRダイマーの１分子当
りの酵素活性は、DHFRの１分子当りの活性
の２倍である。また、ダイマー１分子当り、阻
害剤であるメソトリキセートが２分子結合した
ときにDHFRダイマーが完全に阻害される。
このように、本発明のDHFRダイマーは、一
本のポリペプチド鎖中にDHFR酵素活性を発
現する２つの酵素活性単位を有するタンパク質
である。 また、大腸菌がDHFRダイマーを多量につ
くると、DHFRの阻害剤であり抗細菌剤であ
るトリメトプリムに対して、耐性を示すように
なる。 (4) DHFRダイマーの分離精製 本発明の融合タンパク質の分離精製法は、
菌体の培養、菌体の破砕、DEAE−トヨパ
ールカラムクロマトグラフイー、トヨパール
HW55カラムクロマトグラフイー、および
DEAE−トヨパールカラムクロマトグラフイー
の過程より成り立つている。 菌体の培養 pDDM1を含有する大腸菌の培養は、YT
＋Ap培地（培地１中に、５ｇのNaCl、８
ｇのトリプトン、５ｇのイーストエキスおよ
び50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体
培地。）で培養することができる。培地とし
ては、この他にST＋Ap培地（培地１中
に、２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリ
ウム、５ｇのポリペプトン、５ｇのイースト
エキスおよび50mgのアンピシリンナトリウム
を含む液体培地。）など、菌体が成長する培
地であれば、どの様な培地でも用いることが
できるが、調べた限りでは、YT＋Ap培地
が最適であつた。 pDDM1を含有する大腸菌を、培地に接種
し、37℃で対数成長期の後期もしくは定常期
まで培養する。培養した菌体は、5000回転／
分の遠心分離により集める。培地１より湿
重量２から５ｇの菌体が得られる。 集菌およびこれ以後の操作は、特に断わら
ない限り低温（０から10℃の間、４℃が望ま
しい）で行う。 菌体の破砕 培養して得られた菌体を、湿重量の２倍の
緩衝液１（0.1ｍＭ エチレンジアミン４酢酸
ナトリウム（EDTA）を含む10ｍＭリン酸
カリウム緩衝液、PH7.0）に懸濁し、フレン
チプレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕
液を、35000回転、１時間超遠心分離し、上
静を得る（無細胞抽出液）。 DEAE−トヨパールカラムクロマトグラフ
イー 無細胞抽出液を、あらかじめ50ｍＭのKCl
を含む緩衝液１で平衡化したDEAEトヨパー
ルカラムにかけ、カラム容量と同容量の50ｍ
ＭのKClを含む緩衝液１でカラムを洗う。酵
素の溶出は、緩衝液１を用いて0.1Mから
0.3MのKClの直線濃度勾配を用いて行い、
溶出液を一定量ずつフラクシヨンコレクター
を用いて分画する。分画した溶出液について
DHFR活性を測定し、酵素活性が含まれる
画分を集める。 トヨパールHW55カラムクロマトグラフイ
ー 上記の操作により得られた酵素液を、限外
濾過膜を用いて１〜４mlにまで濃縮し、あら
かじめ緩衝液１で平衡化したトヨパール
HW55カラムにかけ、同緩衝液を用いて酵素
を溶出する。溶出液を一定量ずつフラクシヨ
ンンコレクターを用いて分画する。分画した
溶出液についてDHFR活性を測定し、酵素
活性が含まれる画分を集める。 DEAE−トヨパールカラムクロマトグラフ
イー 上記の操作により得られた酵素液を、あら
かじめ緩衝液１で平衡化したDEAE−トヨパ
ールカラムに吸着させる。吸着後、50ｍ
MKClを含む緩衝液１で洗う。酵素の溶出
は、緩衝液１を用いて50ｍＭから0.3Mの
KClの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を
一定量ずつフラクシヨンコレクターを用いて
分画する。分画した溶出液について280nｍ
の吸光度とDHFR活性とを測定する。酵素
活性／280nｍの吸光度の値が、一定な画分
を集める。 以上の操作により、融合タンパク質の高度精製
均一化を、再現性良く行うことができる。 本発明に従うと、融合タンパク質の精製は、菌
体の培養を含めて一週間以内に行うことができ、
回収率35％以上で、均一な酵素標品を得ることが
できる。 DHFR酵素活性は、反応液（0.05ｍＭのジヒド
ロ葉酸、0.06ｍＭのNADPH、12ｍＭの２−メル
カプトエタノール、50ｍＭのリン酸緩衝液（PH
7.0））を、１mlのキユベツトとり、これに酵素液
を加え、340nｍの吸光度の時間変化を測定する
ことにより行う。酵素１ユニツトは、上記反応条
件において、１分間に１マイクロモルのジヒドロ
葉酸を還元するのに必要な酵素量として定義す
る。この測定は、分光光度計を用いて容易に行う
ことができる。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ pDDM1の作成 DHFRを２分子直列に結合したタンパク質を
暗号化するDNA配列を作製するために、pTP64
−１（特開昭62−69990号公報参照）の制限酵素
Bgl（第１図の12番目から18番目のに相当する
配列）とBcl部位（第１図の538番目から543番
目に相当する配列）の間に、pTP70−１（特開昭
63−46193号公報参照）の制限酵素Bgl切断に
よつて得られる約500塩基対のDNA断片（第１図
の14番目から538番目の間の配列に相当する）を
挿入することを考えた。 約1μｇのpTP64−１の制限酵素Bclおよび
Bglで切断した後、アルカリホスフアターゼ処
理をした。アルカリホスフアターゼ処理した
DNAのフエノール処理することにより、共存す
る酵素タンパク質を変性除去し、その後エタノー
ルでDNAを沈澱させた。沈澱したDNAを70％エ
タノールで洗つた後、エタノールを除き、減圧下
に沈澱を乾燥させた。制限酵素によるDNAの切
断、アルカリホスフアターゼ処理、フエノ―ル処
理、およびエタノール沈澱の各操作は、いずれ
も、“Molecular Cloning Ａ Loboratory
Manual”（T.Maniatis、E.F.Fritsch、J.
Sambrook、eds.Cold Spring Harbor
Laboratory（1982）、以下、文献１と呼ぶ）に記
載している方法に従つて行つた。約1μｇの
pTP70−１の制限酵素Bglで切断した後、フエ
ノール処理することにより、共存する酵素タンパ
ク質を変性除去し、その後エタノールでDNAを
沈澱させた。沈澱したDNAを70％エタノールで
洗つた後、エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾
燥させた。このように処理した２種類のDNAを
それぞれ25μのリガーゼ用反応液（10ｍＭ
Tris−HCl、PH7.4、５ｍＭ MgCl₂、10ｍＭジ
チオトレイトール、５ｍＭ ATP）に溶解し、
両者を混ぜ合わせ、これに１ユニツトのT4−
DNAリガーゼを加えて、10℃で、12時間DNAの
連結反応を行わせた。この反応物を、形質転換法
（trans−formation method、上記文献１に記載）
に従つて、大腸菌HB101株に取り込ませた。こ
の処理をした菌体を、50mg／mlのアンピシリンナ
トリウムおよび10mg／mlのトリメトプリムを含む
栄養寒天培地（培地１中に、２ｇのグルコー
ス、１ｇのリン酸２カリウム、５ｇのイーストエ
キス、５ｇのポリペプトン、１５ｇの寒天を含
む。）上に塗布し、37℃で24時間培養することに
より、100個以上のコロニーを得ることができた。
これらのコロニーから適当に40個選び、それぞれ
を1.5mlのYT＋Ap培地（培地１中に、５ｇの
NaCl、５ｇのイーストエキス、８ｇのトリプト
ン、50mgのアンピシリンナトリウムを含む。）で、
37℃、１晩、菌体を培養した。培養液を、各々エ
ツペンドルフ遠心管にとり、12000回転／分で10
分間遠心分離し、菌体を沈澱として集めた。これ
に、0.1mlの電気泳動用サンプル調製液
（0.0625MのTris−HCl、PH6.8、２％のラウリル
硫酸ナトリウム（SDS）、10％のグリセリン、５
％の２−メルカプトエタノール、0.001％のブロ
ムフエノールブルーを含む。）を加え、菌体を懸
濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶か
した。この処理をしたサンプルをSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（U.K.Laemmli；
Nature、vol、227、p.680（1970））に従つて分析
した。標準サンプルとしてpTP64−１および
pTP70−１をそれぞれ含有する大腸菌に同様な
処理をしたもの、および分子量マーカーとしてラ
クトアルブミン（分子量14200）、トリプシンイン
ヒビター（分子量20100）、トリプシノーゲン（分
子量24000）、カルボニツクアンヒドラーゼ（分子
量29000）、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（分子量36000）、卵アルブミン（分子
量45000）、および牛血清アルブミン（分子量
66000）を含むサンプルをポリアクリルアミド濃
度の10から20％濃度勾配ゲルで泳動した。その結
果、40個のうち、２個のコロニーにおいては、分
子量約37000と推定されるタンパク質を大量に生
産することが明らかとなつた。得られた２個のコ
ロニーから適当に一株を選び、これをYT＋Ap
培地で培養し、TanakaとWisblumの方法（T.
Tanaka、B.Weis−blum；J.Bacteriology、
vol.121、p.345（1975））に従つて、プラスミドを
調製した。得られたプラスミドをpDDM1と名づ
けた。 pDDM1は、pTP64−１にpTP70−１由来の配
列が挿入している構造をとるはずであるので、こ
のことを確かめるために、第１図の4954番目から
4959番目に位置するPst1部位から第１図の951番
目から956番目に位置するEcoR部位に至る、約
1.7キロ塩基対のDNA部分についてM13フアージ
を用いたジデオキシ法（J.Messing；Mehtods in
Enzymology、vol.101、p.20（1983））に従つて、
塩基配列を決定した。その結果、第１図に示す配
列の4954番目から5780番目迄の配列および１番目
から956番目までの配列が確かめられた。また、
すでに、pTP64−１の全塩基配列は明かであり
（（特開昭62−69990号公報参照）、また、残りの部
分は、制限酵素Aat、Pvu、およびTaqに
よる切断実験の結果、pTP64−１を制限酵素
EcoRおよびPst切断によつて得られる約４キ
ロ塩基対のDNA断片と全く同一であることが示
された。 以上の結果から、pDDM1の全塩基配列が第１
図に示した配列であることが決められた。 実施例 ２ pDDM1を含有する大腸菌が作るDHFRダイマ
ー pDDM1を含有する大腸菌が作るDHFR融合タ
ンパク質のアミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列か
ら予想することができる。第１図の57番目から
1013番目の配列が融合タンパク質を暗号化してい
ることから、トリプレツト暗号表を用いて、アミ
ノ酸配列を推定した。その結果第２図に示すアミ
ノ酸配列が得られ、DHFRダイマーは、319個の
アミノ酸よりなり、分子量が36、116ダルトンで
あつた。 pDDM1を含有する大腸菌から、DHFRダイマ
ーを分離精製し、タンパク質の性質を調べた。 ［DHFRダイマーの精製］ Ａ 用いた菌体量：湿重量 10ｇ Ｂ 酵素精製表 表における精製過程は無細胞抽出液、DEAE
−トヨパールカラムカラムクロマトグラフイー、
トヨパールHW55カラムクロマトグラフイー、
およびDEAE−トヨパールカラムクロマトグラ
フイーを表す。

【表】 得られた酵素タンパク質をSDS電気泳動法（上
記実施例に記載の方法）により分析したところ、
分子量約37000の単一なタンパク質バンドが示さ
れ、得られた酵素標品が均一であることが示され
た。 ［分離精製したDHFRダイマーの性質］ 精製したDHFRダイマーの活性およびその際
に用いた酵素ののタンパク質濃度をそれぞれ測定
し、タンパク質１mg当りの活性（比活性）を求め
たところ、35.2ユニツト／mgタンパク質の値であ
つた。同様にして、野生型のDHFR（pTP64−１
を含有する大腸菌がつくるDHFR）の比活性を
求めたところ、34.8ユニツト／mgタンパク質の値
であり、DHFRダイマーと野生型DHFRの酵素
活性の比活性は同じ値を示した。DHFRダイマ
ーの分子量は、野生型DHFRの分子量の約２倍
であることから、この結果は、DHFRダイマー
１分子当りの酵素活性が、野生型DHFRの２倍
であることを示している。また、DHFRダイマ
ー0.74μMおよび野生型DHFR1.02μMの酵素に、
DHFRの阻害剤であるメソトリキセートを種々
の濃度加えて酵素活性に及ぼす影響を調べたとこ
ろ、それぞれDHFRダイマーでは、0.145μMのメ
ソトリキセートおよび野生DHFRでは1.19μMの
メソトリキセートによつて完全に阻害されること
が明かとなつた。この結果はDHFRダイマー１
分子に２分子のメソトリキセートが、また野生型
DHFR1分子に１分子のメソトリキセートが結合
することを示している。以上の結果により、
DHFRダイマーは、一本のポリペプチド鎖中に
DHFR酵素活性を発現する２つの酵素活性単位
を有するタンパク質であることが示された。 ［発明の効果］ 上記のように、新規組換えプラスミドpDDM1
は、新規な酵素タンパク質であるDHFRダイマ
ーを暗号化しており、かつpDDM1を有する大腸
菌は、DHFRダイマーを大量に蓄積生産する。
さらに、生成したDHFRダイマー一本のポリペ
プチド鎖中に２個の酵素活性単位を有し、新規な
DHFR酵素タンパク質である。このような、物
質は本発明がなされるまでは、存在しなかつたも
のであり、これからの用途開発が期待される。 また、DHFRは、葉酸補酵素合成のための重
要な酵素であり、また、この酵素活性を用いるこ
とにより、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸の定
量化も可能であり、少なくともこのような分野で
の利用に貢献することは明かである。

【図面の簡単な説明】

第１図はpDDM1の全塩基配列を示した図、第
２図はpDDM1中に存在するDHFRダイマーを暗
号化する部分の塩基配列及びタンパク質のアミノ
酸配列を示す図、第３図はpDDM1を構成する各
ユニツトの位置関係を示す地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 以下に示すDNA配列を有する新規組換えプ
   ラスミドpDDM1。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 （ただし、この配列は２本鎖DNAのうち片方
   のDNA鎖配列だけを5′末端から3′末端の方向に
   示したもので、図中符号Ａはアデニン、Ｃはシト
   シン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを意味し、図中
   番号は、唯一存在する制限酵素ClaI切断認識部位
   5′−ATCGAT−3′の最初のＡを１番として数え
   た番号を示す。） ２ 請求項１記載の新規組換えプラスミド
   pDDM1を含有する大腸菌。 ３ 以下に示すアミノ酸配列を有するジヒドロ葉
   酸還元酵素。 【表】 【表】 （ただし、図中符号Ａはアデニン、Ｃはシトシ
   ン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Alaはアラニ
   ン、Argはアルギニン、Asnはアスパラギン、
   Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイン、Gln
   はグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリ
   シン、Hisはヒスチジン、Ileはイソロイシン、
   Leuはロイシン、Lysはリジン、Metはメチオニ
   ン、Pheはフエニルアラニン、Proはプロリン、
   Serはセリン、Thrはトレオニン、Trpはトリプ
   トフアン、Tyrはチロシン、Valはバリンを示
   し、図中番号は、１番目のアミノ酸であるメチオ
   ニンを暗号化するATGコドンのＡを１番として
   数えた番号を示す。） ４ 請求項２記載の大腸菌を培養し、得られた菌
   体を破砕し、次いでカラムクロマトグラフイによ
   り分画し、酵素活性を有する画分を捕集すること
   を特徴とするジヒドロ葉酸還元酵素の分離精製方
   法。