JPH042236B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH042236B2 JPH042236B2 JP61170459A JP17045986A JPH042236B2 JP H042236 B2 JPH042236 B2 JP H042236B2 JP 61170459 A JP61170459 A JP 61170459A JP 17045986 A JP17045986 A JP 17045986A JP H042236 B2 JPH042236 B2 JP H042236B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- sequence
- coli
- dna
- pbsdhfr1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 31
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 claims description 13
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 20
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 20
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 9
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001931 ampicillin sodium Drugs 0.000 description 2
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000030538 Thecla Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000018690 Trypsinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010027252 Trypsinogen Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- -1 sulfur drugs Chemical compound 0.000 description 1
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、Bacillus subtilis(枯草菌)のジヒ
ドロ葉酸還元酸素を暗号化する遺伝子を含有し、
第1図において示されるDNA配列を有する組換
えプラスミドに関するものである。この特定
DNA配列及び組換えプラスミドの産業上の利用
分野としては、微生物工業、発酵工業、医薬品工
業等の分野に好適である。
ドロ葉酸還元酸素を暗号化する遺伝子を含有し、
第1図において示されるDNA配列を有する組換
えプラスミドに関するものである。この特定
DNA配列及び組換えプラスミドの産業上の利用
分野としては、微生物工業、発酵工業、医薬品工
業等の分野に好適である。
従来の技術
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に
ともなつて、プロモーター・クローニング用ベク
ターなど多機能プラスミドベクターの開発が行な
われるようになつた。このようなプラスミドベク
ターを利用する上で、利用し易さを決める重要な
要因としてプラスミドの選択マーカー及びマーカ
ー遺伝子の構造・機能などの問題が上げられる。
操作技術がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に
ともなつて、プロモーター・クローニング用ベク
ターなど多機能プラスミドベクターの開発が行な
われるようになつた。このようなプラスミドベク
ターを利用する上で、利用し易さを決める重要な
要因としてプラスミドの選択マーカー及びマーカ
ー遺伝子の構造・機能などの問題が上げられる。
ジヒドロ葉酸還元酵素は、ジヒドロ葉酸を還元
しテトラヒドロ葉酸を生成する反応を触媒する酵
素であり、葉酸補酵素生合成系の重要な酵素であ
る。トリメトプリムは、サルフア剤同様葉酸補酵
素生合成系の阻害剤であるが、この薬剤はジヒド
ロ葉酸還元酵素と強力に結合し酵素活性を阻害す
る。このことにより、培地中にトリメトプリムが
存在すると細菌は生長することができなくなる。
ところが、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をプラス
ミド等に組込み遺伝子のコピー数を増大させるな
どして、菌体中のジヒドロ葉酸還元酵素量を高め
ると、細菌はトリメトプリムに対して耐性を獲得
する(M.Iwakura et al.J.Biochemistry vol.91,
pp.1205(1982))。この性質を利用することによ
り、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をプラスミドの
選択マーカー(すなわち、トリメトプリム耐性マ
ーカー)として利用することができる。既に、本
発明者らは、E.coliのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子を組み込んだプラスミドベクターを作製し、こ
れを用いて、実際遺伝子のクローニングを行つて
いる。特開昭58−42621号公報、及びM.
Iwakuraet al.J.Biochemistry,vol.92,pp.615
(1982))。ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を用いた
トリメトプリム耐性マーカーは、遺伝子の大きさ
が約500塩基対と小さいこと、遺伝子中に利用し
やすい制限酵素部位があること、遺伝子の発現量
とトリメトプリム耐性の強さに非常によい相関関
係が存在することから優れた選択マーカーであ
り、広範囲な利用が期待されている(M.
Iwakura,et al.J.Biochemistry,vol.93,pp.92
(1983))。さらに、本発明者らは、E.coliのジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子を効果的に利用できる構
造に構築しなおすことを目的としてジヒドロ葉酸
還元酵素タンパクを暗号化する部分はそのまま
で、かつ、その周辺のDNA配列がもとのE.coli
の遺伝子と異なつた配列を有する遺伝子を構築し
この遺伝子を含有するプラスミドpTP63−21を
作成し特開昭61−271990号公報)、pTP63−21に
適切なプロモーターを導入することによりジヒド
ロ葉酸還元酵素を菌体内タンパクの15%以上に及
ぶまで大量にE.coli細胞内に蓄積させることが可
能な組換えプラスミドpTP64−1を作成してい
る(特開昭62−69990号公報)。
しテトラヒドロ葉酸を生成する反応を触媒する酵
素であり、葉酸補酵素生合成系の重要な酵素であ
る。トリメトプリムは、サルフア剤同様葉酸補酵
素生合成系の阻害剤であるが、この薬剤はジヒド
ロ葉酸還元酵素と強力に結合し酵素活性を阻害す
る。このことにより、培地中にトリメトプリムが
存在すると細菌は生長することができなくなる。
ところが、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をプラス
ミド等に組込み遺伝子のコピー数を増大させるな
どして、菌体中のジヒドロ葉酸還元酵素量を高め
ると、細菌はトリメトプリムに対して耐性を獲得
する(M.Iwakura et al.J.Biochemistry vol.91,
pp.1205(1982))。この性質を利用することによ
り、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をプラスミドの
選択マーカー(すなわち、トリメトプリム耐性マ
ーカー)として利用することができる。既に、本
発明者らは、E.coliのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子を組み込んだプラスミドベクターを作製し、こ
れを用いて、実際遺伝子のクローニングを行つて
いる。特開昭58−42621号公報、及びM.
Iwakuraet al.J.Biochemistry,vol.92,pp.615
(1982))。ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を用いた
トリメトプリム耐性マーカーは、遺伝子の大きさ
が約500塩基対と小さいこと、遺伝子中に利用し
やすい制限酵素部位があること、遺伝子の発現量
とトリメトプリム耐性の強さに非常によい相関関
係が存在することから優れた選択マーカーであ
り、広範囲な利用が期待されている(M.
Iwakura,et al.J.Biochemistry,vol.93,pp.92
(1983))。さらに、本発明者らは、E.coliのジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子を効果的に利用できる構
造に構築しなおすことを目的としてジヒドロ葉酸
還元酵素タンパクを暗号化する部分はそのまま
で、かつ、その周辺のDNA配列がもとのE.coli
の遺伝子と異なつた配列を有する遺伝子を構築し
この遺伝子を含有するプラスミドpTP63−21を
作成し特開昭61−271990号公報)、pTP63−21に
適切なプロモーターを導入することによりジヒド
ロ葉酸還元酵素を菌体内タンパクの15%以上に及
ぶまで大量にE.coli細胞内に蓄積させることが可
能な組換えプラスミドpTP64−1を作成してい
る(特開昭62−69990号公報)。
問題点
しかしながら、E.coliのジヒドロ葉酸還元酵素
遺伝子に適当なポリペプチド遺伝子を組み込ん
で、ジヒドロ葉酸還元酵素−ポリペプチドの融合
タンパク遺伝子を作製し、その発現を試みたとこ
ろ、遺伝子発現が実際起こり融合タンパクが作ら
れることは明らかにされた(特開昭62−115287号
公報)が、その生産量が予想される量には到底及
ばないことが判明した。さらに、作られた融合タ
ンパクを組換え体より分離精製しようとしたとこ
ろ、融合タンパクの検出方法としては抗体を用い
た免疫化学的手法が唯一であり、且つこの方法が
繁雑であることから、この点に関しての改良が望
まれた。
遺伝子に適当なポリペプチド遺伝子を組み込ん
で、ジヒドロ葉酸還元酵素−ポリペプチドの融合
タンパク遺伝子を作製し、その発現を試みたとこ
ろ、遺伝子発現が実際起こり融合タンパクが作ら
れることは明らかにされた(特開昭62−115287号
公報)が、その生産量が予想される量には到底及
ばないことが判明した。さらに、作られた融合タ
ンパクを組換え体より分離精製しようとしたとこ
ろ、融合タンパクの検出方法としては抗体を用い
た免疫化学的手法が唯一であり、且つこの方法が
繁雑であることから、この点に関しての改良が望
まれた。
発明の目的
本発明者は、上記問題点を解決すべく鋭意研究
を行ない、B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子の塩基配列を明らかにしその解析を行なつ
た。その結果、(1)B.subtilisのジヒドロ葉酸還元
酵素が、168個のアミノ酸より成り立つているこ
と、(2)遺伝子中に存在するEcoRI部位の下流の配
列によつて暗号化されるC−末端側の6アミノ酸
より成るアミノ酸配列を、他のアミノ酸配列と置
き換えてもジヒドロ葉酸還元酵素の生産性及び活
性に関係がないことを明らかにした。この結果を
利用することにより、上記問題点を解消できる可
能性が示峻され、pTP64−1のジヒドロ葉酸還
元酵素遺伝子部分をB.subtilisのジヒドロ葉酸還
元酵素遺伝子に置き換えることにより、プラスミ
ドpBSDHFR1を作成し、発明を完成させるに至
つた。
を行ない、B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子の塩基配列を明らかにしその解析を行なつ
た。その結果、(1)B.subtilisのジヒドロ葉酸還元
酵素が、168個のアミノ酸より成り立つているこ
と、(2)遺伝子中に存在するEcoRI部位の下流の配
列によつて暗号化されるC−末端側の6アミノ酸
より成るアミノ酸配列を、他のアミノ酸配列と置
き換えてもジヒドロ葉酸還元酵素の生産性及び活
性に関係がないことを明らかにした。この結果を
利用することにより、上記問題点を解消できる可
能性が示峻され、pTP64−1のジヒドロ葉酸還
元酵素遺伝子部分をB.subtilisのジヒドロ葉酸還
元酵素遺伝子に置き換えることにより、プラスミ
ドpBSDHFR1を作成し、発明を完成させるに至
つた。
発明の構成
本発明のプラスミドpBSDHFR1は、5504塩基
対の大きさを有し、宿主であるE.coliをトリメト
プリムおよびアンピシリン耐性に形質転換するこ
とができ、第1図に示される塩基配列によつて確
定される新規組換えプラスミドである。プラスミ
ドpBSDHFR1は、制限酵素E.coRI,PstI,Bgl
、Pvu,BstEによつて、各々1箇所切断
され、Cla,Hind,Hpaによつて各々2箇
所切断され、Aatによつて3箇所切断される。
対の大きさを有し、宿主であるE.coliをトリメト
プリムおよびアンピシリン耐性に形質転換するこ
とができ、第1図に示される塩基配列によつて確
定される新規組換えプラスミドである。プラスミ
ドpBSDHFR1は、制限酵素E.coRI,PstI,Bgl
、Pvu,BstEによつて、各々1箇所切断
され、Cla,Hind,Hpaによつて各々2箇
所切断され、Aatによつて3箇所切断される。
第1図は、pBSDHFR1の全塩基配列を示す図
であり2本鎖DNAのうち片方の配列だけを示し
ている。第2図は、B.subtilisのDHFRを暗号化
する部分の塩基配列及びDHFRのアミノ酸配列
を示す図である。第3図は、pBSDHFR1の制限
酵素切断部位を示した地図である。さらに、第3
図においては、B.subtili由来のDHFR部分と
pTP64−1由来の部分とを区別して示してある。
B.subtilisのDHFRは、第2図に示されるように
168個のアミノ酸より構成され、その分子量は
19203である。制限酵素EcoRIの認識切断部位は、
第1図においては、675〜681塩基の所に、第2図
においては、480〜485塩基の所に存在する。第3
図に示される様に、pBSDHFR1は、pTP64−1
とB.subtilisのDHFR遺伝子部分とが融合した構
造を有する。第1図の1〜62塩基及び681〜5504
塩基の配列はpTP64−1由来であり、63〜680塩
基の配列はB.subtilisのDHFR遺伝子部分由来の
配列である。pBSDHFR1の197〜748塩基の配列
に184個のアミノ酸配列よりなるタンパクを暗号
化するオープンリーデングフレームが存在する。
このアミノ酸配列の内、アミノ末端より162個ま
での配列は、B.subtilisのDHFRのアミノ酸配列
と全く一致している。pBSDHFR1を含有するE.
coliは、分子量約21000のDHFRを作り、その結
果トリメトプリムに対する耐性を獲得する。これ
は、第2図のB.subtilisのDHFRを暗号化する配
列のうちEcoRI切断部位下流の配列がpTP64−1
の配列に置き換わつた結果生じた配列である。
B.subtilisのDHFR遺伝子のEcoRI部位に結合し
たDNA配列は、E.coliのDHFR遺伝子のEcoRI
部位下流の配列であるが、B.subtilisとE.coliの
DHFR遺伝子とではEcoRI部位における遺伝子の
読み取り枠が異なつていることから、
pBSDHFR1が作るDHFRは、B.subtilisの
DHFRの1〜162番目のアミノ酸配列にE.coliの
DHFRのカルボキシ末端側配列が融合した構造
ではなく、全くアミノ酸配列としては無関係な22
個のアミノ酸よりなる配列がB.subtilisのDHFR
の1〜162番目のアミノ酸配列のカルボキシ末端
側に融合した構造をしている。すなわち、
pBSDHFR1は、唯一存在するEcoRI部位にDNA
配列を導入し融合遺伝子を作成した場合、融合遺
伝子から作られる融合タンパクがDHFR活性を
示すという特徴を有している。従つて、
pBSDHFR1のEcoRI部位に発現させたい遺伝子
を、リーデングフレームが合うように導入するこ
とにより、目的タンパクをDHFRの融合タンパ
クとして発現させることが可能である。目的遺伝
子よりつくられるタンパクの生理活性の測定が困
難もしくは繁雑である場合、宿主菌で目的遺伝子
がたとえ発現したとしても、分離・精製すること
が困難である。しかしながら、pBSDHFR1を用
いることによつて、DHFR活性を示す融合タン
パクを作ることが可能なことから、DHFRを精
製すると同様な手順で融合タンパクを精製するこ
とができる。
であり2本鎖DNAのうち片方の配列だけを示し
ている。第2図は、B.subtilisのDHFRを暗号化
する部分の塩基配列及びDHFRのアミノ酸配列
を示す図である。第3図は、pBSDHFR1の制限
酵素切断部位を示した地図である。さらに、第3
図においては、B.subtili由来のDHFR部分と
pTP64−1由来の部分とを区別して示してある。
B.subtilisのDHFRは、第2図に示されるように
168個のアミノ酸より構成され、その分子量は
19203である。制限酵素EcoRIの認識切断部位は、
第1図においては、675〜681塩基の所に、第2図
においては、480〜485塩基の所に存在する。第3
図に示される様に、pBSDHFR1は、pTP64−1
とB.subtilisのDHFR遺伝子部分とが融合した構
造を有する。第1図の1〜62塩基及び681〜5504
塩基の配列はpTP64−1由来であり、63〜680塩
基の配列はB.subtilisのDHFR遺伝子部分由来の
配列である。pBSDHFR1の197〜748塩基の配列
に184個のアミノ酸配列よりなるタンパクを暗号
化するオープンリーデングフレームが存在する。
このアミノ酸配列の内、アミノ末端より162個ま
での配列は、B.subtilisのDHFRのアミノ酸配列
と全く一致している。pBSDHFR1を含有するE.
coliは、分子量約21000のDHFRを作り、その結
果トリメトプリムに対する耐性を獲得する。これ
は、第2図のB.subtilisのDHFRを暗号化する配
列のうちEcoRI切断部位下流の配列がpTP64−1
の配列に置き換わつた結果生じた配列である。
B.subtilisのDHFR遺伝子のEcoRI部位に結合し
たDNA配列は、E.coliのDHFR遺伝子のEcoRI
部位下流の配列であるが、B.subtilisとE.coliの
DHFR遺伝子とではEcoRI部位における遺伝子の
読み取り枠が異なつていることから、
pBSDHFR1が作るDHFRは、B.subtilisの
DHFRの1〜162番目のアミノ酸配列にE.coliの
DHFRのカルボキシ末端側配列が融合した構造
ではなく、全くアミノ酸配列としては無関係な22
個のアミノ酸よりなる配列がB.subtilisのDHFR
の1〜162番目のアミノ酸配列のカルボキシ末端
側に融合した構造をしている。すなわち、
pBSDHFR1は、唯一存在するEcoRI部位にDNA
配列を導入し融合遺伝子を作成した場合、融合遺
伝子から作られる融合タンパクがDHFR活性を
示すという特徴を有している。従つて、
pBSDHFR1のEcoRI部位に発現させたい遺伝子
を、リーデングフレームが合うように導入するこ
とにより、目的タンパクをDHFRの融合タンパ
クとして発現させることが可能である。目的遺伝
子よりつくられるタンパクの生理活性の測定が困
難もしくは繁雑である場合、宿主菌で目的遺伝子
がたとえ発現したとしても、分離・精製すること
が困難である。しかしながら、pBSDHFR1を用
いることによつて、DHFR活性を示す融合タン
パクを作ることが可能なことから、DHFRを精
製すると同様な手順で融合タンパクを精製するこ
とができる。
このような特徴は、B.subtilisのDHFR遺伝子
に見いだされたものであり、E.coliのDHFR遺伝
子では行なうことができない。pTP64−1にお
いては、E.coliのDHFR遺伝子があり且つこの遺
伝子中に唯一EcoRI部位が存在する。しかしなが
ら、pTP64−1のEcoRI部位下流の配列を置き換
えた場合、もはやDHFR活性を示すタンパクを
発現することができないのである。
に見いだされたものであり、E.coliのDHFR遺伝
子では行なうことができない。pTP64−1にお
いては、E.coliのDHFR遺伝子があり且つこの遺
伝子中に唯一EcoRI部位が存在する。しかしなが
ら、pTP64−1のEcoRI部位下流の配列を置き換
えた場合、もはやDHFR活性を示すタンパクを
発現することができないのである。
実施例においては、pBSDHFR1で作られる
184個のアミノ酸よりなる融合タンパクの精製例
が述べられているが、導入される遺伝子によつて
本発明が左右されるものではない。
184個のアミノ酸よりなる融合タンパクの精製例
が述べられているが、導入される遺伝子によつて
本発明が左右されるものではない。
本発明のプラスミドpBSDHFR1は、E.
coliRR1株に導入されて安定状態に保たれ、
pBSDHFR1を含有するE.coliRR1株は微工研に
FERM P−8850として寄託されている。
coliRR1株に導入されて安定状態に保たれ、
pBSDHFR1を含有するE.coliRR1株は微工研に
FERM P−8850として寄託されている。
発明の効果
次に本発明の実施例を示す。
実施例 1
pBSDHFR1の作成
0.001mgのプラスミドpTP64−1を制限酵素
BclIを用いて切断後、DNAポリメラーゼクレノ
ーフラグメントを用いて、突出した切断断片を平
滑化した。これをEcoRIで切断した後1%アガロ
ースゲル電気泳動法により分離した。大小2本の
DNA断片が得られた。大きい断片を切り出し透
析チユーブに入れ1mlの50mM Tris−HCl,PH
8.0を加えシールし、電気溶出法(electroelution
法、T.Maniatisら、Molecular Cloning A
Loboratory Manual,pp.164,Cold Spring
Harbor Laboratory(1982)、文献)により、ゲ
ルからDNAを回収し、エタノールでDNAを沈澱
後、減圧下に沈澱を乾燥した(DNA−1と呼
ぶ)。
BclIを用いて切断後、DNAポリメラーゼクレノ
ーフラグメントを用いて、突出した切断断片を平
滑化した。これをEcoRIで切断した後1%アガロ
ースゲル電気泳動法により分離した。大小2本の
DNA断片が得られた。大きい断片を切り出し透
析チユーブに入れ1mlの50mM Tris−HCl,PH
8.0を加えシールし、電気溶出法(electroelution
法、T.Maniatisら、Molecular Cloning A
Loboratory Manual,pp.164,Cold Spring
Harbor Laboratory(1982)、文献)により、ゲ
ルからDNAを回収し、エタノールでDNAを沈澱
後、減圧下に沈澱を乾燥した(DNA−1と呼
ぶ)。
B.subtilisの遺伝子としては、B.subtilis 168株
の染色体DNAのDHFR遺伝子をクローン化した
プラスミドpER1を用いた。pER1を含有するE.
coliK12C600株は微工研にFERM P−8849とし
て寄託されている。0.05mgのpER1を制限酵素
EcoR1及びPvuで切断後1%アガロースゲル電
気泳動法により分離した。ラムダフアージDNA
をHindで切断したものを、分子サイズマーカ
ーとして用い、0.5〜1キロ塩基対の合いだに泳
動されるDNA断片を切り出し、電気溶出法によ
り、ゲルからDNAを回収し、エタノールでDNA
を沈澱後、減圧下に沈澱を乾燥した(DNA−2
と呼ぶ)。DNA−1とDNA−2を0.05mlのリガ
ーゼ用反応液(10mM Tris−HCl,PH7.4、5
mM MgCl,10mM ジチオトレイトール、0.5
mM ATP)に溶解・混合した後、5.0ユニツト
のT4−DNAリガーゼを加え、冷蔵庫中(約4−
10℃)で18時間、DNAの連結反応を行なわせた。
この反応物を、形質転換法(transfoimation
method,上記文献1、pp.250)に従つて、E.
coliRR1株に取り込ませた。この処理をした菌体
を、50mg/のアンピシリンナトリウム及び10
mg/のトリメトプリムを含む栄養寒天培地(1
中に、1gのグリコース、1gのリン酸2カリ
ウム、5gのイーストエキス、5gのポリペプト
ン、及び15gの寒天を含む寒天培地)上に塗布
し、37℃で24時間培養することにより、21個のコ
ロニーを得ることができた。これらのコロニーか
ら、適当に1個選び、菌体を培養し、Tanakaと
Weisblumの方法(T.Tanaka,B.Weisblum;J.
Bacteriology,vol121、pp.354(1975)にしたが
つてプラスミドを調製した。得られたプラスミ
ド、を制限酵素EcoRI,Pst,Cla,Bgl,
Pvu,Hind,Hpa,Aatによつて切断を
試みたところ、各々1、1、2、1、1、2、
2、3個所切断されることが明らかとなつた。得
られたプラスミドをpBSDHFR1と称した。
pBSDHFR1の全塩基配列を、ジデオキシ法に従
つて決定した。その結果、第1図に示す塩基配列
が明らかとなり、プラスミドpBSDHFR1は5504
塩基対より成り立つていることが明らかとなつ
た。
の染色体DNAのDHFR遺伝子をクローン化した
プラスミドpER1を用いた。pER1を含有するE.
coliK12C600株は微工研にFERM P−8849とし
て寄託されている。0.05mgのpER1を制限酵素
EcoR1及びPvuで切断後1%アガロースゲル電
気泳動法により分離した。ラムダフアージDNA
をHindで切断したものを、分子サイズマーカ
ーとして用い、0.5〜1キロ塩基対の合いだに泳
動されるDNA断片を切り出し、電気溶出法によ
り、ゲルからDNAを回収し、エタノールでDNA
を沈澱後、減圧下に沈澱を乾燥した(DNA−2
と呼ぶ)。DNA−1とDNA−2を0.05mlのリガ
ーゼ用反応液(10mM Tris−HCl,PH7.4、5
mM MgCl,10mM ジチオトレイトール、0.5
mM ATP)に溶解・混合した後、5.0ユニツト
のT4−DNAリガーゼを加え、冷蔵庫中(約4−
10℃)で18時間、DNAの連結反応を行なわせた。
この反応物を、形質転換法(transfoimation
method,上記文献1、pp.250)に従つて、E.
coliRR1株に取り込ませた。この処理をした菌体
を、50mg/のアンピシリンナトリウム及び10
mg/のトリメトプリムを含む栄養寒天培地(1
中に、1gのグリコース、1gのリン酸2カリ
ウム、5gのイーストエキス、5gのポリペプト
ン、及び15gの寒天を含む寒天培地)上に塗布
し、37℃で24時間培養することにより、21個のコ
ロニーを得ることができた。これらのコロニーか
ら、適当に1個選び、菌体を培養し、Tanakaと
Weisblumの方法(T.Tanaka,B.Weisblum;J.
Bacteriology,vol121、pp.354(1975)にしたが
つてプラスミドを調製した。得られたプラスミ
ド、を制限酵素EcoRI,Pst,Cla,Bgl,
Pvu,Hind,Hpa,Aatによつて切断を
試みたところ、各々1、1、2、1、1、2、
2、3個所切断されることが明らかとなつた。得
られたプラスミドをpBSDHFR1と称した。
pBSDHFR1の全塩基配列を、ジデオキシ法に従
つて決定した。その結果、第1図に示す塩基配列
が明らかとなり、プラスミドpBSDHFR1は5504
塩基対より成り立つていることが明らかとなつ
た。
実施例 2
pBSDHFR1を含有するE.coliRR1株からのジ
ヒドロ葉酸還元酵素の精製 pBSDHFR1を含有するE.coliRR1株を31の50
mg/のアンピシリンナトリウムを含む栄養培地
(1中に、5gのNaCl,8gのバクトペプト
ン、5gのイーストエキスを含む液体培地、PH
7.4)中で37℃で一晩培養後、菌体を遠心分離に
より集めた。湿重量約12gの菌体がえられた。菌
体を24mlの50mMリン酸カリウム緩衝液PH7.0に
懸濁し、超音波破砕により細胞を破砕した後、
20000回転/分、30分の遠心分離により上清28ml
を得た。えられた上清のジヒドロ葉酸還元酵素活
性を測定したところ、2.1ユニツト/mgタンパク
という値であつた。上清に0.56gの硫酸ストレプ
トマイシンを加え、20分間撹はん後、20000回
転/分、30分の遠心分離により上清27mlを得た。
これに27mlの飽和硫安液を加え、20分間撹はん
後、20000回転/分、30分の遠心分離により上清
43mlを得た。これに、固体硫安12.9g(90%飽
和)を加え、40分間撹はん後、20000回転/分、
30分の遠心分離により沈澱を集めた。沈澱を5ml
の10mMリン酸カリウム緩衝液、PH7.0、に溶か
し、同緩衝液2に対して透析した。外液は3回
交換した。透析した酵素液を、DEAE−トヨパー
ル650Mカラム(250mmx1500mm,約75cm3)に吸
着させ、0Mから50mMのKCl濃度勾配をかけ溶
出した。約1mlづつフラクシヨンを集め、
DHFR活性を測定し、酵素活性を有する画分を
集めた。10mlの酵素液が得られた。これをアミコ
ン限外ろか装置を用いて約1mlにまで濃縮し、こ
れをトヨパールHW55カラムクロマトグラフイー
により分画した。約1mlづつフラクシヨンを集
め、DHFR活性を測定し、酵素活性のピーク画
分を集めた(約3ml)。得られた酵素タンパクを
SDS電気泳動法により分析したところ、均一であ
り、ラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ
ー、トリプシノーゲン、カーボニツクアンヒドラ
ーゼ、グリセロアルデヒド−3リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミンを
分子量マーカーとして精製DHFRの分子量を推
定したところ2.1x104であり、塩基配列から予想
される分子量21151と一致した値であつた。
ヒドロ葉酸還元酵素の精製 pBSDHFR1を含有するE.coliRR1株を31の50
mg/のアンピシリンナトリウムを含む栄養培地
(1中に、5gのNaCl,8gのバクトペプト
ン、5gのイーストエキスを含む液体培地、PH
7.4)中で37℃で一晩培養後、菌体を遠心分離に
より集めた。湿重量約12gの菌体がえられた。菌
体を24mlの50mMリン酸カリウム緩衝液PH7.0に
懸濁し、超音波破砕により細胞を破砕した後、
20000回転/分、30分の遠心分離により上清28ml
を得た。えられた上清のジヒドロ葉酸還元酵素活
性を測定したところ、2.1ユニツト/mgタンパク
という値であつた。上清に0.56gの硫酸ストレプ
トマイシンを加え、20分間撹はん後、20000回
転/分、30分の遠心分離により上清27mlを得た。
これに27mlの飽和硫安液を加え、20分間撹はん
後、20000回転/分、30分の遠心分離により上清
43mlを得た。これに、固体硫安12.9g(90%飽
和)を加え、40分間撹はん後、20000回転/分、
30分の遠心分離により沈澱を集めた。沈澱を5ml
の10mMリン酸カリウム緩衝液、PH7.0、に溶か
し、同緩衝液2に対して透析した。外液は3回
交換した。透析した酵素液を、DEAE−トヨパー
ル650Mカラム(250mmx1500mm,約75cm3)に吸
着させ、0Mから50mMのKCl濃度勾配をかけ溶
出した。約1mlづつフラクシヨンを集め、
DHFR活性を測定し、酵素活性を有する画分を
集めた。10mlの酵素液が得られた。これをアミコ
ン限外ろか装置を用いて約1mlにまで濃縮し、こ
れをトヨパールHW55カラムクロマトグラフイー
により分画した。約1mlづつフラクシヨンを集
め、DHFR活性を測定し、酵素活性のピーク画
分を集めた(約3ml)。得られた酵素タンパクを
SDS電気泳動法により分析したところ、均一であ
り、ラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ
ー、トリプシノーゲン、カーボニツクアンヒドラ
ーゼ、グリセロアルデヒド−3リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミンを
分子量マーカーとして精製DHFRの分子量を推
定したところ2.1x104であり、塩基配列から予想
される分子量21151と一致した値であつた。
第1図は、pBSDHFR1の全塩基配列を示した
図であり、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列
だけを、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。図中符号は、核酸塩基を表わし、Aはアデニ
ン、Cはシトシン、Gはグアニンを、Tはチミン
を示している。図中番号はpBSDHFR1に2箇所
存在する制限酵素Cla切断認識部位のうち制限
酵素Hind切断部位に近い方のCla切断認識部
位の、ATCGATの最初の“A”を1番として数
えた番号を示している。第2図は、B.subtilisの
DHFRを暗号化する部分の塩基配列及びそのア
ミノ酸配列を示した図である。図中符号は、核酸
塩基及びアミノ酸を表わし、Aはアデニン、Cは
シトシン、Gはグアニンを、Tはチミンを、Ala
はアラニンを、Argはアルギニンを、Asnはアス
パラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cysはシ
ステインを、Glnはグルタミンを、Gluはグルタ
ミン酸を、Glyはグリシンを、Hisはヒスチジン
を、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシンを、
Lysはリジンを、Metはメチオニンを、Pheはフ
エニルアラニンを、Proはプロニンを、Serはセ
リンを、Thrはトレオニンを、Trpはトリプトフ
アンを、Tyrはチロシンを、Valはバリンを示し
ている。図中番号は、一番目のアミノ酸であるメ
チオニンを暗号化するATGコドンの“A”を1
番として数えた番号を示している。第3図は、
pBSDHFR1の制限酵素切断部位を示した地図で
ある。図中、DHFR(黒く塗りつぶした部分)
は、B.subtilis由来のDHFR遺伝子部分を示し、
pTP64−1由来の部分を白抜きで表している。
図であり、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列
だけを、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。図中符号は、核酸塩基を表わし、Aはアデニ
ン、Cはシトシン、Gはグアニンを、Tはチミン
を示している。図中番号はpBSDHFR1に2箇所
存在する制限酵素Cla切断認識部位のうち制限
酵素Hind切断部位に近い方のCla切断認識部
位の、ATCGATの最初の“A”を1番として数
えた番号を示している。第2図は、B.subtilisの
DHFRを暗号化する部分の塩基配列及びそのア
ミノ酸配列を示した図である。図中符号は、核酸
塩基及びアミノ酸を表わし、Aはアデニン、Cは
シトシン、Gはグアニンを、Tはチミンを、Ala
はアラニンを、Argはアルギニンを、Asnはアス
パラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cysはシ
ステインを、Glnはグルタミンを、Gluはグルタ
ミン酸を、Glyはグリシンを、Hisはヒスチジン
を、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシンを、
Lysはリジンを、Metはメチオニンを、Pheはフ
エニルアラニンを、Proはプロニンを、Serはセ
リンを、Thrはトレオニンを、Trpはトリプトフ
アンを、Tyrはチロシンを、Valはバリンを示し
ている。図中番号は、一番目のアミノ酸であるメ
チオニンを暗号化するATGコドンの“A”を1
番として数えた番号を示している。第3図は、
pBSDHFR1の制限酵素切断部位を示した地図で
ある。図中、DHFR(黒く塗りつぶした部分)
は、B.subtilis由来のDHFR遺伝子部分を示し、
pTP64−1由来の部分を白抜きで表している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 E.COliにおいて安定に複製され、宿主であ
るE.COliにトリメトプリム耐性及びアンピリシ
ン耐性を与えることができ、トリメトプリム耐性
を付与する遺伝子がBacillus subtilisのジヒドロ
葉酸還元酸素遺伝子の3′末端側が一部改変された
配列であり、5504塩基対の大きさを有し、下記に
おいて示されるDNA配列を有する新規組換えプ
ラスミドpBSDHFR1。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 (上記のDNA配列は、環状2本鎖DNAのうち片
方のDNA鎖配列だけを5′末端から3′末端の方向
に記述している。符号は、核酸塩基を表し、Aは
アデニンを、Cはシトシンを、Gはグアニンを、
Tはチミンを示している。) 2 E.COliにおいて安定に複製され、宿主であ
るE.COliにトリメトプリム耐性及びアンピリシ
ン耐性を与えることができ、トリメトプリム耐性
を付与する遺伝子がBacillus subtilisのジヒドロ
葉酸還元酸素遺伝子の3′末端側が一部改変された
配列であり、5504塩基対の大きさを有し、下記に
おいて示されるDNA配列を有する新規組換えプ
ラスミドpBSDHFR1を含有するE.coliRR1株。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 (上記のDNA配列は、環状2本鎖DNAのうち片
方のDNA鎖配列だけを5′末端から3′末端の方向
に記述している。符号は、核酸塩基を表し、Aは
アデニンを、Cはシトシンを、Gはグアニンを、
Tはチミンを示している。)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61170459A JPS6328394A (ja) | 1986-07-19 | 1986-07-19 | 新規組換えプラスミドpBSDHFR1 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61170459A JPS6328394A (ja) | 1986-07-19 | 1986-07-19 | 新規組換えプラスミドpBSDHFR1 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6328394A JPS6328394A (ja) | 1988-02-06 |
JPH042236B2 true JPH042236B2 (ja) | 1992-01-16 |
Family
ID=15905326
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61170459A Granted JPS6328394A (ja) | 1986-07-19 | 1986-07-19 | 新規組換えプラスミドpBSDHFR1 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6328394A (ja) |
-
1986
- 1986-07-19 JP JP61170459A patent/JPS6328394A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6328394A (ja) | 1988-02-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3592326B2 (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
KR930008093B1 (ko) | 신규 폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 하는 의약조성물 | |
US4828988A (en) | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine | |
JPH0371112B2 (ja) | ||
JPH042236B2 (ja) | ||
JPH0349559B2 (ja) | ||
JPH05192163A (ja) | イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子 | |
JPH0371111B2 (ja) | ||
JPH0364111B2 (ja) | ||
JPH0364114B2 (ja) | ||
JPH0364517B2 (ja) | ||
JP3007919B2 (ja) | ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド多量体の融合タンパク質(▲ii▼) | |
JPH0371110B2 (ja) | ||
JPH0370480B2 (ja) | ||
JPH042234B2 (ja) | ||
JP3012908B2 (ja) | ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド多量体の融合タンパク質(▲i▼) | |
JPH0355109B2 (ja) | ||
JP2829368B2 (ja) | ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質 | |
JPH0355111B2 (ja) | ||
JPH0355112B2 (ja) | ||
Iwakura et al. | Dihydrofolate reductase from Bacillus subtilis and its artificial derivatives: expression, purification, and characterization | |
JPH0355110B2 (ja) | ||
JPH0414958B2 (ja) | ||
JPH0355113B2 (ja) | ||
JPH0354555B2 (ja) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |