JPH042236B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Bacillus subtilis（枯草菌）のジヒ
ドロ葉酸還元酸素を暗号化する遺伝子を含有し、
第１図において示されるDNA配列を有する組換
えプラスミドに関するものである。この特定
DNA配列及び組換えプラスミドの産業上の利用
分野としては、微生物工業、発酵工業、医薬品工
業等の分野に好適である。

従来の技術 本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に
ともなつて、プロモーター・クローニング用ベク
ターなど多機能プラスミドベクターの開発が行な
われるようになつた。このようなプラスミドベク
ターを利用する上で、利用し易さを決める重要な
要因としてプラスミドの選択マーカー及びマーカ
ー遺伝子の構造・機能などの問題が上げられる。

ジヒドロ葉酸還元酵素は、ジヒドロ葉酸を還元
しテトラヒドロ葉酸を生成する反応を触媒する酵
素であり、葉酸補酵素生合成系の重要な酵素であ
る。トリメトプリムは、サルフア剤同様葉酸補酵
素生合成系の阻害剤であるが、この薬剤はジヒド
ロ葉酸還元酵素と強力に結合し酵素活性を阻害す
る。このことにより、培地中にトリメトプリムが
存在すると細菌は生長することができなくなる。
ところが、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をプラス
ミド等に組込み遺伝子のコピー数を増大させるな
どして、菌体中のジヒドロ葉酸還元酵素量を高め
ると、細菌はトリメトプリムに対して耐性を獲得
する（M.Iwakura et al.J.Biochemistry vol.91，
pp.1205（1982））。この性質を利用することによ
り、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をプラスミドの
選択マーカー（すなわち、トリメトプリム耐性マ
ーカー）として利用することができる。既に、本
発明者らは、E.coliのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子を組み込んだプラスミドベクターを作製し、こ
れを用いて、実際遺伝子のクローニングを行つて
いる。特開昭58−42621号公報、及びM.
Iwakuraet al.J.Biochemistry，vol.92，pp.615
（1982））。ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を用いた
トリメトプリム耐性マーカーは、遺伝子の大きさ
が約500塩基対と小さいこと、遺伝子中に利用し
やすい制限酵素部位があること、遺伝子の発現量
とトリメトプリム耐性の強さに非常によい相関関
係が存在することから優れた選択マーカーであ
り、広範囲な利用が期待されている（M.
Iwakura，et al.J.Biochemistry，vol.93，pp.92
（1983））。さらに、本発明者らは、E.coliのジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子を効果的に利用できる構
造に構築しなおすことを目的としてジヒドロ葉酸
還元酵素タンパクを暗号化する部分はそのまま
で、かつ、その周辺のDNA配列がもとのE.coli
の遺伝子と異なつた配列を有する遺伝子を構築し
この遺伝子を含有するプラスミドpTP63−21を
作成し特開昭61−271990号公報）、pTP63−21に
適切なプロモーターを導入することによりジヒド
ロ葉酸還元酵素を菌体内タンパクの15％以上に及
ぶまで大量にE.coli細胞内に蓄積させることが可
能な組換えプラスミドpTP64−１を作成してい
る（特開昭62−69990号公報）。

問題点 しかしながら、E.coliのジヒドロ葉酸還元酵素
遺伝子に適当なポリペプチド遺伝子を組み込ん
で、ジヒドロ葉酸還元酵素−ポリペプチドの融合
タンパク遺伝子を作製し、その発現を試みたとこ
ろ、遺伝子発現が実際起こり融合タンパクが作ら
れることは明らかにされた（特開昭62−115287号
公報）が、その生産量が予想される量には到底及
ばないことが判明した。さらに、作られた融合タ
ンパクを組換え体より分離精製しようとしたとこ
ろ、融合タンパクの検出方法としては抗体を用い
た免疫化学的手法が唯一であり、且つこの方法が
繁雑であることから、この点に関しての改良が望
まれた。

発明の目的 本発明者は、上記問題点を解決すべく鋭意研究
を行ない、B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子の塩基配列を明らかにしその解析を行なつ
た。その結果、(1)B.subtilisのジヒドロ葉酸還元
酵素が、168個のアミノ酸より成り立つているこ
と、(2)遺伝子中に存在するEcoRI部位の下流の配
列によつて暗号化されるＣ−末端側の６アミノ酸
より成るアミノ酸配列を、他のアミノ酸配列と置
き換えてもジヒドロ葉酸還元酵素の生産性及び活
性に関係がないことを明らかにした。この結果を
利用することにより、上記問題点を解消できる可
能性が示峻され、pTP64−１のジヒドロ葉酸還
元酵素遺伝子部分をB.subtilisのジヒドロ葉酸還
元酵素遺伝子に置き換えることにより、プラスミ
ドpBSDHFR1を作成し、発明を完成させるに至
つた。

発明の構成 本発明のプラスミドpBSDHFR1は、5504塩基
対の大きさを有し、宿主であるE.coliをトリメト
プリムおよびアンピシリン耐性に形質転換するこ
とができ、第１図に示される塩基配列によつて確
定される新規組換えプラスミドである。プラスミ
ドpBSDHFR1は、制限酵素E.coRI，PstI，Bgl
、Pvu，BstEによつて、各々１箇所切断
され、Cla，Hind，Hpaによつて各々２箇
所切断され、Aatによつて３箇所切断される。

第１図は、pBSDHFR1の全塩基配列を示す図
であり２本鎖DNAのうち片方の配列だけを示し
ている。第２図は、B.subtilisのDHFRを暗号化
する部分の塩基配列及びDHFRのアミノ酸配列
を示す図である。第３図は、pBSDHFR1の制限
酵素切断部位を示した地図である。さらに、第３
図においては、B.subtili由来のDHFR部分と
pTP64−１由来の部分とを区別して示してある。
B.subtilisのDHFRは、第２図に示されるように
168個のアミノ酸より構成され、その分子量は
19203である。制限酵素EcoRIの認識切断部位は、
第１図においては、675〜681塩基の所に、第２図
においては、480〜485塩基の所に存在する。第３
図に示される様に、pBSDHFR1は、pTP64−１
とB.subtilisのDHFR遺伝子部分とが融合した構
造を有する。第１図の１〜62塩基及び681〜5504
塩基の配列はpTP64−１由来であり、63〜680塩
基の配列はB.subtilisのDHFR遺伝子部分由来の
配列である。pBSDHFR1の197〜748塩基の配列
に184個のアミノ酸配列よりなるタンパクを暗号
化するオープンリーデングフレームが存在する。
このアミノ酸配列の内、アミノ末端より162個ま
での配列は、B.subtilisのDHFRのアミノ酸配列
と全く一致している。pBSDHFR1を含有するE.
coliは、分子量約21000のDHFRを作り、その結
果トリメトプリムに対する耐性を獲得する。これ
は、第２図のB.subtilisのDHFRを暗号化する配
列のうちEcoRI切断部位下流の配列がpTP64−１
の配列に置き換わつた結果生じた配列である。
B.subtilisのDHFR遺伝子のEcoRI部位に結合し
たDNA配列は、E.coliのDHFR遺伝子のEcoRI
部位下流の配列であるが、B.subtilisとE.coliの
DHFR遺伝子とではEcoRI部位における遺伝子の
読み取り枠が異なつていることから、
pBSDHFR1が作るDHFRは、B.subtilisの
DHFRの１〜162番目のアミノ酸配列にE.coliの
DHFRのカルボキシ末端側配列が融合した構造
ではなく、全くアミノ酸配列としては無関係な22
個のアミノ酸よりなる配列がB.subtilisのDHFR
の１〜162番目のアミノ酸配列のカルボキシ末端
側に融合した構造をしている。すなわち、
pBSDHFR1は、唯一存在するEcoRI部位にDNA
配列を導入し融合遺伝子を作成した場合、融合遺
伝子から作られる融合タンパクがDHFR活性を
示すという特徴を有している。従つて、
pBSDHFR1のEcoRI部位に発現させたい遺伝子
を、リーデングフレームが合うように導入するこ
とにより、目的タンパクをDHFRの融合タンパ
クとして発現させることが可能である。目的遺伝
子よりつくられるタンパクの生理活性の測定が困
難もしくは繁雑である場合、宿主菌で目的遺伝子
がたとえ発現したとしても、分離・精製すること
が困難である。しかしながら、pBSDHFR1を用
いることによつて、DHFR活性を示す融合タン
パクを作ることが可能なことから、DHFRを精
製すると同様な手順で融合タンパクを精製するこ
とができる。

このような特徴は、B.subtilisのDHFR遺伝子
に見いだされたものであり、E.coliのDHFR遺伝
子では行なうことができない。pTP64−１にお
いては、E.coliのDHFR遺伝子があり且つこの遺
伝子中に唯一EcoRI部位が存在する。しかしなが
ら、pTP64−１のEcoRI部位下流の配列を置き換
えた場合、もはやDHFR活性を示すタンパクを
発現することができないのである。

実施例においては、pBSDHFR1で作られる
184個のアミノ酸よりなる融合タンパクの精製例
が述べられているが、導入される遺伝子によつて
本発明が左右されるものではない。

本発明のプラスミドpBSDHFR1は、E.
coliRR1株に導入されて安定状態に保たれ、
pBSDHFR1を含有するE.coliRR1株は微工研に
FERM Ｐ−8850として寄託されている。

発明の効果 次に本発明の実施例を示す。

実施例 １ pBSDHFR1の作成 0.001mgのプラスミドpTP64−１を制限酵素
BclIを用いて切断後、DNAポリメラーゼクレノ
ーフラグメントを用いて、突出した切断断片を平
滑化した。これをEcoRIで切断した後１％アガロ
ースゲル電気泳動法により分離した。大小２本の
DNA断片が得られた。大きい断片を切り出し透
析チユーブに入れ１mlの50ｍＭ Tris−HCl，PH
8.0を加えシールし、電気溶出法（electroelution
法、T.Maniatisら、Molecular Cloning Ａ
Loboratory Manual，pp.164，Cold Spring
Harbor Laboratory（1982）、文献）により、ゲ
ルからDNAを回収し、エタノールでDNAを沈澱
後、減圧下に沈澱を乾燥した（DNA−１と呼
ぶ）。

B.subtilisの遺伝子としては、B.subtilis 168株
の染色体DNAのDHFR遺伝子をクローン化した
プラスミドpER1を用いた。pER1を含有するE.
coliK12C600株は微工研にFERM Ｐ−8849とし
て寄託されている。0.05mgのpER1を制限酵素
EcoR1及びPvuで切断後１％アガロースゲル電
気泳動法により分離した。ラムダフアージDNA
をHindで切断したものを、分子サイズマーカ
ーとして用い、0.5〜１キロ塩基対の合いだに泳
動されるDNA断片を切り出し、電気溶出法によ
り、ゲルからDNAを回収し、エタノールでDNA
を沈澱後、減圧下に沈澱を乾燥した（DNA−２
と呼ぶ）。DNA−１とDNA−２を0.05mlのリガ
ーゼ用反応液（10ｍＭ Tris−HCl，PH7.4、５
ｍＭ MgCl，10ｍＭ ジチオトレイトール、0.5
ｍＭ ATP）に溶解・混合した後、5.0ユニツト
のT4−DNAリガーゼを加え、冷蔵庫中（約４−
10℃）で18時間、DNAの連結反応を行なわせた。
この反応物を、形質転換法（transfoimation
method，上記文献１、pp.250）に従つて、E.
coliRR1株に取り込ませた。この処理をした菌体
を、50mg／のアンピシリンナトリウム及び10
mg／のトリメトプリムを含む栄養寒天培地（１
中に、１ｇのグリコース、１ｇのリン酸２カリ
ウム、５ｇのイーストエキス、５ｇのポリペプト
ン、及び15ｇの寒天を含む寒天培地）上に塗布
し、37℃で24時間培養することにより、21個のコ
ロニーを得ることができた。これらのコロニーか
ら、適当に１個選び、菌体を培養し、Tanakaと
Weisblumの方法（T.Tanaka，B.Weisblum；J.
Bacteriology，vol121、pp.354（1975）にしたが
つてプラスミドを調製した。得られたプラスミ
ド、を制限酵素EcoRI，Pst，Cla，Bgl，
Pvu，Hind，Hpa，Aatによつて切断を
試みたところ、各々１、１、２、１、１、２、
２、３個所切断されることが明らかとなつた。得
られたプラスミドをpBSDHFR1と称した。
pBSDHFR1の全塩基配列を、ジデオキシ法に従
つて決定した。その結果、第１図に示す塩基配列
が明らかとなり、プラスミドpBSDHFR1は5504
塩基対より成り立つていることが明らかとなつ
た。

実施例 ２ pBSDHFR1を含有するE.coliRR1株からのジ
ヒドロ葉酸還元酵素の精製 pBSDHFR1を含有するE.coliRR1株を31の50
mg／のアンピシリンナトリウムを含む栄養培地
（１中に、５ｇのNaCl，８ｇのバクトペプト
ン、５ｇのイーストエキスを含む液体培地、PH
7.4）中で37℃で一晩培養後、菌体を遠心分離に
より集めた。湿重量約12ｇの菌体がえられた。菌
体を24mlの50ｍＭリン酸カリウム緩衝液PH7.0に
懸濁し、超音波破砕により細胞を破砕した後、
20000回転／分、30分の遠心分離により上清28ml
を得た。えられた上清のジヒドロ葉酸還元酵素活
性を測定したところ、2.1ユニツト／mgタンパク
という値であつた。上清に0.56ｇの硫酸ストレプ
トマイシンを加え、20分間撹はん後、20000回
転／分、30分の遠心分離により上清27mlを得た。
これに27mlの飽和硫安液を加え、20分間撹はん
後、20000回転／分、30分の遠心分離により上清
43mlを得た。これに、固体硫安12.9ｇ（90％飽
和）を加え、40分間撹はん後、20000回転／分、
30分の遠心分離により沈澱を集めた。沈澱を５ml
の10ｍＭリン酸カリウム緩衝液、PH7.0、に溶か
し、同緩衝液２に対して透析した。外液は３回
交換した。透析した酵素液を、DEAE−トヨパー
ル650Mカラム（250ｍmx1500mm，約75cm³）に吸
着させ、0Mから50ｍＭのKCl濃度勾配をかけ溶
出した。約１mlづつフラクシヨンを集め、
DHFR活性を測定し、酵素活性を有する画分を
集めた。10mlの酵素液が得られた。これをアミコ
ン限外ろか装置を用いて約１mlにまで濃縮し、こ
れをトヨパールHW55カラムクロマトグラフイー
により分画した。約１mlづつフラクシヨンを集
め、DHFR活性を測定し、酵素活性のピーク画
分を集めた（約３ml）。得られた酵素タンパクを
SDS電気泳動法により分析したところ、均一であ
り、ラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ
ー、トリプシノーゲン、カーボニツクアンヒドラ
ーゼ、グリセロアルデヒド−３リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミンを
分子量マーカーとして精製DHFRの分子量を推
定したところ2.1x10⁴であり、塩基配列から予想
される分子量21151と一致した値であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pBSDHFR1の全塩基配列を示した
図であり、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列
だけを、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。図中符号は、核酸塩基を表わし、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンを、Ｔはチミン
を示している。図中番号はpBSDHFR1に２箇所
存在する制限酵素Cla切断認識部位のうち制限
酵素Hind切断部位に近い方のCla切断認識部
位の、ATCGATの最初の“Ａ”を１番として数
えた番号を示している。第２図は、B.subtilisの
DHFRを暗号化する部分の塩基配列及びそのア
ミノ酸配列を示した図である。図中符号は、核酸
塩基及びアミノ酸を表わし、Ａはアデニン、Ｃは
シトシン、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、Ala
はアラニンを、Argはアルギニンを、Asnはアス
パラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cysはシ
ステインを、Glnはグルタミンを、Gluはグルタ
ミン酸を、Glyはグリシンを、Hisはヒスチジン
を、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシンを、
Lysはリジンを、Metはメチオニンを、Pheはフ
エニルアラニンを、Proはプロニンを、Serはセ
リンを、Thrはトレオニンを、Trpはトリプトフ
アンを、Tyrはチロシンを、Valはバリンを示し
ている。図中番号は、一番目のアミノ酸であるメ
チオニンを暗号化するATGコドンの“Ａ”を１
番として数えた番号を示している。第３図は、
pBSDHFR1の制限酵素切断部位を示した地図で
ある。図中、DHFR（黒く塗りつぶした部分）
は、B.subtilis由来のDHFR遺伝子部分を示し、
pTP64−１由来の部分を白抜きで表している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ E.COliにおいて安定に複製され、宿主であ
   るE.COliにトリメトプリム耐性及びアンピリシ
   ン耐性を与えることができ、トリメトプリム耐性
   を付与する遺伝子がBacillus subtilisのジヒドロ
   葉酸還元酸素遺伝子の3′末端側が一部改変された
   配列であり、5504塩基対の大きさを有し、下記に
   おいて示されるDNA配列を有する新規組換えプ
   ラスミドpBSDHFR1。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 （上記のDNA配列は、環状２本鎖DNAのうち片
   方のDNA鎖配列だけを5′末端から3′末端の方向
   に記述している。符号は、核酸塩基を表し、Ａは
   アデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、
   Ｔはチミンを示している。） ２ E.COliにおいて安定に複製され、宿主であ
   るE.COliにトリメトプリム耐性及びアンピリシ
   ン耐性を与えることができ、トリメトプリム耐性
   を付与する遺伝子がBacillus subtilisのジヒドロ
   葉酸還元酸素遺伝子の3′末端側が一部改変された
   配列であり、5504塩基対の大きさを有し、下記に
   おいて示されるDNA配列を有する新規組換えプ
   ラスミドpBSDHFR1を含有するE.coliRR1株。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 （上記のDNA配列は、環状２本鎖DNAのうち片
   方のDNA鎖配列だけを5′末端から3′末端の方向
   に記述している。符号は、核酸塩基を表し、Ａは
   アデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、
   Ｔはチミンを示している。）