JPH0364517B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、オピオイド（モルヒネ用物質）ペプ
チドの一種であるロイシンエンケフアリン（Ｌ−
チロシル−グリシル−グリシル−Ｌ−フエニルア
ラニル−Ｌ−ロイシンのアミノ酸配列よりなるペ
ンタペプタイド）を酸素のカルボキシ末端（Ｃ−
端側）に有するジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシン
エンケフアリン（以下、DHFR−LEKと略す。）
融合タンパクおよびその製造方法に関するもので
ある。本発明のDHFR−LEK融合タンパクは、
第１図において示されるアミノ酸配列を有する。
この新規組換えDFR−LEK融合タンパクの産業
上の利用分野としては、医薬品工場等の分野に好
適である。

従来の技術 ロイシンエンケフアリンは、モルヒネ様鎮痛作
用を示す内因性ペプチドとして知られ、習慣性の
ない鎮痛剤または麻酔薬としての使用が期待され
る興味深いポリペプチドである。本発明の
DHFR−LEK融合タンパクは、これまで、報告
がなく新規な物質である。本発明の技術時背景と
しては、いわゆる遺伝子操作技術がある。
DHFR−LEK融合タンパク暗号化する遺伝子を
含む組換えプラスミドpBSFOLEK1は、既に、
本発明者らにより構築されている（特開昭63−
87981号公報参照）。また、プラスミド
pBSFOLEK1は、E.coliC600株に導入されて安定
状態に保たれ、pBSFOLEK1を含有するE.
coliC600株は微工研にFERM Ｐ−8969として寄
託されている。

問題点 ロイシンエンケフアリンは５個のアミノ酸より
なるペプチドであることから、これに対応する遺
伝子を化学合成し、これを発現ベクターに導入し
組換えプラスミドを作成し、大腸菌等の宿主に発
現生産させることが容易にできるものと考えられ
る。しかしながら、短いペプチド等は、大腸菌等
の宿主自身のタンパク分解酵素により速やかに分
解させることから、遺伝子の発現効率を向上させ
ても宿主内に蓄積させることができない。このこ
とを避けるために、宿主内で安定に生産されるタ
ンパクとの融合タンパクとして発現させることが
行われる。この際、生産された融合タンパクはも
とのタンパクの生理活性を失つてしまうことから
分離精製等の上で問題があつた。既に、本発明者
らはこの問題を解消すべく研究を行い、DHFR
−LEK融合タンパク遺伝地を有する組換えプラ
スミドpBSFOLEK1を構築し、これをE.coli宿主
に導入し発現に成功している（特開昭63−87981
号公報）。しかしながら、DHFR−LEK融合タン
パクに関してはこれまで報告がなく、全く新規な
化合物であつた。

発明の目的 本発明者は、鋭意研究を行い、DHFR−LEK
融合タンパクをプラスミドpBSFOLEK1を含有
するE.coliからの分離精製する方法を確立し、ま
た、得られた融合タンパクが、ジヒドロ葉酸還元
酵素活性及びロイシンエンケフアリンの抗原性
（即ち、免疫学的活性）を保持している多機能タ
ンパクであることを明らかにし、本発明を完成さ
せた。

発明の構成 本発明のDHFR−LEK融合タンパクは、第１
図に示されるように168個のアミノ酸より構成さ
れる。融合タンパクのアミノ末端側から162番目
までは、B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵素の１
〜162番目までのアミノ酸配列と同一であり、164
〜168番目の配列がロイシンエンケフアリンの配
列である。163番目のアミノ酸はメチオニン
（Met）であり、ブロムシアンで融合タンパクを
処理することによりロイシンエンケフアリンを切
り出すことが可能な構造である。融合タンパクの
分子量は19296である。第１図には、DHFR−
LEK融合タンパクを暗号化するDNA配列を同時
に記述している。このDNA配列よりアミノ酸配
列を決定することができた。B.subtilisのジヒド
ロ葉酸還元酵素は、169個のアミノ酸より構成さ
れるが、第１図に示される配列の163〜168番目ま
でのアミノ酸配列がSer−Lys−Val−Gly−Gly
−Pheであり、DHFR−LEK融合タンパクのMet
−Tyr−Gly−Gly−Phe−Leuと全く異なつた配
列をしている。通常、タンパクの一次構造を変化
させた場合その生理活性を失うことが多い。しか
しながら、本発明の場合には、Ｃ端側の配列を置
き換えてもジヒドロ葉酸還元酵素活性には何等影
響が現われなかつたのである。

エンザイムイムノアツセイ法により測定したと
ころ、DHFR−LEK融合タンパクはロイシンエ
ンケフアリンに対する抗体と反応することが明ら
かとなり、また、化学合成により得られたロイシ
ンエンケフアリンによつて抗原−抗体反応が競争
的に阻害されることが明らかとなつた。このこと
から、DHFR−LEK融合タンパクは、免疫学的
にロイシンエンケフアリンの性質を有することが
示されたのである。さらに、ブロムシアンで融合
タンパクを処理することによりロイシンエンケフ
アリンを切り出すことができた。以上のことによ
り、DHFR−LEK融合タンパクは、ジヒドロ葉
酸還元酵素とロイシンエンケフアリンの両方の特
性を有することが示された。

このような特徴を有するDHFR−LEK融合タ
ンパクは、pBSFOLEK1を含有するE.coliC600の
細胞中に生産される。DHFR−LEK融合タンパ
クは、pBSFOLEK1を含有するE.coliC600をYT
＋Ap倍地（倍地１中に５ｇのNaCl、８ｇのバ
クトトリプトン、５ｇのイーストエキス、及び50
mgのアンピシリンナトリウムを含む倍地）で37℃
で培養し、対数増殖期の終わりもしくは定常期に
菌体を集め、これを破砕し上清（無細胞抽出液）
を得て、この上清をイオン交換カラムクロマトグ
ラフイー及びそれに引き続くゲルろ過クロマトグ
ラフイーにかけることにより高度に精製すること
ができるのである。これらカラムクロマトグラフ
イーによる分離の際、溶出液を各フラクシヨンに
分け、目的をDHFR−LEK融合タンパクが何処
のフラクシヨンに溶出されてくるかを調べなけれ
ばならない。本発明では、目的のDHFR−LEK
融合タンパクがジヒドロ葉酸還元酵素活性を有す
ることから、この酵素活性を測定することによつ
て溶出位置を知ることができるのである。ジヒド
ロ葉酸還元酵素活性は、0.05ｍＭのジヒドロ葉
酸、0.06ｍＭのNADPH（還元型ニコチンアミド
ジヌクレチドホスフエート）、12ｍＭの２−メル
カプトエタノール、50ｍＭリン酸カリウム緩衝
液、PH7.0を含む反応液に酸素を加えて、37℃で
酵素反応に伴つて減少するジヒドロ葉酸と
NADPHを、340nｍの吸光度の減少の時間変化
を測定することによつて行うことができる。この
測定は、分光光度分計を用いて容易に行うことが
できるのである。実施例においてはイオン交換カ
ラムクロマトグラフイーの担体としてDEAE−ト
ヨパール650Mゲルを、またゲルろ過クロマトグ
ラフイーの担体としてトヨパールHW55ゲルを用
いているが、本発明の精製法の特徴は、ジヒドロ
葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリン融合タン
パクのクロマトグラフイーにおける溶出をモニタ
ーするためにジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定す
ることにあり、用いた担体によつて本発明が制限
されるものではない。

本発明のジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエン
ケフアリン融合タンパクの製造に用いられるプラ
スミドpBSFOLEK1は、第２図に示すDNNA配
列をもつもので、その675〜681塩基の所に制限酵
素EcoRIの認識切断部位が存在する。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 １ フラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coliC600
株からのDHFR−LEK融合タンパクの精製及び
タンパクの性質。

プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coliC600
株（FERM Ｐ−8969として微工研に寄託）を３
の50mg／のアンピシリンナトリウムを含む栄
養倍地（１中に、５ｇのNaCl、８ｇのバクト
ペプトン、５ｇのイーストエキスを含む液体倍
地、PH7.4）中で37℃で一晩培養後、菌体を遠心
分離により集めた。湿重量約13ｇの菌体がえられ
た。菌体を20mlの0.1ｍＭのジチオトレイトール
（DTT）及び0.1ｍＭのエチレンジアミン４酢酸
２ナトリウム（EDTA）を含む10ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液PH7.0に懸濁し、超音波破砕により
細胞を破砕した後、20000回転／分、１時間の遠
心分離により上清25mlを得た。えられた上清のジ
ヒドロ葉酸還元酵素活性を測定したところ、144
ユニツト／mlという値であつた。上清を、DEAE
−トヨパール650Mカラム（25cmx150cm、約75
cm）に吸着させ、０から100ｍＭのKC₁濃度勾配
をかけ溶出した。約１mlずつフラクシヨンを集
め、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定し、酵素活
性を有する画分を集めた。25mlの酵素液が得られ
た。これをアミコン限外ろか装置を用いて約１ml
にまで濃縮し、これをトヨパールHW55カラムク
ロマトグラフイーにより分画した。約１mlずつフ
ラクシヨンを集め、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を
測定し、酵素活性のピーク画分を集めた（約3.7
ml、4.8mg）。得られた酵素タンパクをSDS電気泳
動法により分析したところ、均一であり、ラクト
アルブミン、トリプシンインヒビター、トリプシ
ノーゲン、カーボニツクアンヒドラー、グリセロ
アルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ、卵アル
ブミン、及び牛血清アルブミンを分子量マーカー
として精製DHFR−LEK融合タンパクの分子量
を推定したところ19000であり、塩基配列から予
想される分子量19296と一致した値であつた。

精製したDHFR−LEK融合タンパクをエンザ
イムイムノアツセイにより測定したところ、ロイ
シンエンケフアリンに対する抗体と反応し、化学
合成したロイシンエンケフアリンによつて抗原−
抗体反応が競争的に阻害されることが明らかとな
つた。さらに、精製したDHFR−LEK融合タン
パク約1.2mgを0.5mlの70％ぎ酸中でブロムシアン
で37℃、24時間処理した後、凍結乾燥しこれを
0.2mlの70％ぎ酸に溶かし、高速液体クロマトグ
ラフイーにより分析したところ約0.013mgのロイ
シンエンケフアリンが検出された。カルボキシペ
プチダーゼＹを用いて精製したDHFR−LEK融
合タンパクのカルボキシ末端を検討したところ、
最初に遊離するアミノ酸がロイシンであつた。こ
のことからカルボキシ末端がロイシンであること
が示された。

実施例 ２ DHFR−LEK融合タンパクのアミノ酸配列 DHFR−LEK融合タンパクを含有するプラス
ミドpBSFOLEK1の全塩基配列は既に明らかに
した（昭和61年９月30日出願：新規組換えプラス
ミドpBSFOLEK1。）得られた塩基配列より
DHFR−LEK融合タンパクを暗号化する部分を
取り出し、それをトリプレツトコドン表を用いて
アミノ酸に翻訳した。その結果、第１図に示す結
果が得られた。第１図は、DHFR−LEK融合タ
ンパクを暗号化する部分のDNA配列及びそれに
対応するアミノ酸配列を示している。この結果、
(1)DHFR−LEK融合タンパクは、168個のアミノ
酸より構成され、164〜168番目の配列がロイシン
エンケフアリンの配列であること、(2)163番目の
アミノ酸はメチオニン（Met）であり、ブロムシ
アンで融合タンパクを処理することによりロイシ
ンエンケフアリンを切り出すことが可能な構造で
あること、(3)融合タンパクの分子量は19296であ
ること、が明らかとなつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、DHFR−LEK融合タンパクを暗号
化する部分の塩基配列及びタンパクのアミノ酸配
列を示す図、第２図は、pBSFOLEK1の全塩基
配列の、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だ
けを5′末端から3′末端の方向に示した図である。
図中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表わし、Ａ
はアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニン
を、Ｔはチミンを、Alaはアラニンを、Argはア
ルギニンを、Asnはアスパラギンを、Aspはアス
パラギン酸を、Cyaはシステインを、Glnはグル
タミンを、Gluはグルタミン酸を、Glyはグリシ
ンを、Hisはヒスチジンを、Ileはイソロイシン
を、Leuはロイシンを、Lysはリジンを、Metは
メチオニンを、Pheはフエニルアラニンを、Pro
はプロリンを、Serはセリンを、Thrはトレオニ
ンを、Trpはトリプトフアンを、Tyrはチロシン
を、Valはバリンを示している。図中番号は、第
１図については１番目のアミノ酸であるメチオニ
ンを暗号化するATGコドンの“Ａ”を１番とし
て数えた番号を、また第２図については
pBSFOLEK1に２箇所存在する制限酵素ClaI切断
認識部位のうち制限酵素Hind切断部位に近い
方のClaI切断認識部位の、ATCGATの最初の
“Ａ”を１番として数えた番号を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プラミスドpBSFOLEK1を含有するE.coliに
   よつて生産され、下記に示すアミノ酸配列を有す
   るジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリ
   ン融合タンパク。 【表】 【表】 ２ プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coliを
   培養し、DHFR酸素活性を目安にして、目的タ
   ンパクを培養菌体の無細胞抽出液からイオン交換
   カラムクロマトグラフイー及びそれに引き続くゲ
   ルろ過カラムクロマトグラフイーを用いて精製す
   ることを特徴とするジヒドロ葉酸還元酵素−ロイ
   シンエンケフアリン融合タンパクの製造方法。