JPH0370480B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ペプチドホルモンの一種であるロイ
シンエンケフアリン（Ｌ−チロシル（Tyr）−グ
リシル（Gly）−グリシル（Gly）−Ｌ−フエニル
アラニル（Phe）−Ｌ−ロイシン（Leu）のアミノ
酸配列よりなるペンタペプタイド）の製造方法に
関するものである。本発明のロイシンエンケフア
リンの製造方法の産業上の利用分野としては、医
薬品工業等の分野に好適である。

従来の技術 ロイシンエンケフアリンは、モルヒネ様鎮痛作
用を示す内因性ペプチドとして知られ、習慣性の
ない鎮痛剤または麻酔薬としての利用が期待され
る興味深いポリペプチドである。本発明の技術的
背景としては、いわゆる遺伝子操作技術がある。
遺伝子操作技術を利用したロイシンエンケフアリ
ンの製造方法は、これまで報告がなく、本発明は
全く新規な方法である。ロイシンエンケフアリン
は５個のアミノ酸よりなるペプチドであることか
ら、これに対応する遺伝子を化学合成し、これを
発現ベクターに導入し組換えプラスミドを作成
し、大腸菌等の宿主に発現生産させることが容易
にできるものと考えられる。しかしながら、短い
ペプチド等は、大腸菌等の宿主自身のタンパク分
解酵素により速やかに分解されることから、遺伝
子の発現効率を向上させても宿主内に蓄積させる
ことができない。このことを避けるために、宿主
内で安定に生産されるタンパクとの融合タンパク
として発現させることが行われる。この際、生産
された融合タンパクはもとのタンパクの生理活性
を失つてしまうことから分離精製等の上で問題が
あつた。既に、本発明者らはこの問題を解消すべ
く研究を行い、ジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシン
エンケフアリン（以下、DHFR−LEKと略す。）
融合タンパク遺伝子を有する組換えプラスミド
pBSFOLEK1を構築し、これをE.coli宿主に導入
しその発現に成功している（特開昭63−87981号
公報参照）。また、プラスミドpBSFOLEK1中
は、E.coli C600株に導入されて安定状態に保た
れ、pBSFOLEK1を含有するE.coli C600株は微
工研にFERM Ｐ−8969として寄託されている。

問題点及び発明の目的 しかしながら、プラスミドpBSFOLEK1を含
有するE.coliは本発明者らが開発したものであ
り、当該菌体を用いるロイシンエンケフアリンの
製造方法に関しては全く未知であり、このことが
問題であつた。本発明者は、プラスミド
pBSFOLEK1を含有するE.coliを用いることによ
り、ロイシンエンケフアリンを効率的に製造する
ことを目的として、鋭意研究を行い、プラスミド
pBSFOLEK1を含有するE.coliからまずDHFR−
LEK融合タンパクを分離精製し、次いで、精製
して得られたDHFR−LEK融合タンパクをブロ
ムシアンで処理し、高速液体クロマトグラフイー
によりロイシンエンケフアリンを容易に分離精製
できることを明らかにし本発明を完成させた。

発明の構成 本発明に係わるDHFR−LEK融合タンパクは、
第１図にに示されるように168個のアミノ酸より
構成される。融合タンパクのアミノ末端側から
162番目までは、B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵
素の１〜162番目までのアミノ酸配列と同一であ
り、164〜168番目の配列がロイシンエンケフアリ
ンの配列である。163番目のアミノ酸はメチオニ
ン（Met）であり、ブロムシアンで融合タンパク
を処理することによりロイシンエンケフアリンを
切り出すことが可能な構造である。融合タンパク
の分子量は19296である。第１図には、DHFR−
LEK融合タンパクを暗号化するDNA配列も記述
している。このDNA配列よりアミノ酸配列を決
定することができた。

DHFR−LEK融合タンパクは、pBSFOLEK1
を含有するE.coli C600の細胞中に生産される。
DHFR−LEK融合タンパクは、pBSFOLEK1を
含有するE.coli C600をYT＋Ap培地（培地１
中に５ｇのNaCl，８ｇのバクトトリプトン、５
ｇのイーストエキス、及び50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む培地）で37℃で培養し、対数増殖
期の終わりもしくは定常期に菌体を集め、これを
破砕し上清（無細胞抽出液）を得て、この上清を
イオン交換カラムクロマトグラフイー及びそれに
引き続くゲルろ過クロマトグラフイーにかけるこ
とにより高度に精製することができる。これらカ
ラムクロマトグラフイーによる分離の際、溶出液
を各フラクシヨンに分け、目的のDHFR−LEK
融合タンパクが何処のフラクシヨンに溶出されて
くるかを調べなければならないが、目的の
DHFR−LEK融合タンパクがジヒドロ葉酸還元
酵素活性を有することから、この酵素活性を測定
することによつて溶出位置を知ることができる。
ジヒドロ葉酸還元酵素活性は、0.05mMのジヒド
ロ葉酸、0.06mMのNADPH（還元型ニコチンア
ミドジヌクレオチドホスフエート）、12mMの２
−メルカプトエタノール、50mMリン酸カリウム
緩衝液、PH7.0を含む反応液に酵素を加えて、37
℃で酵素反応に伴つて減少するジヒドロ葉酸と
NADPHを、340nmの吸光度の減少の時間変化を
測定することによつて行うことができる。上記の
精製過程によりDHFR−LEK融合タンパクを均
一に精製することができる。

精製したDHFR−LEK融合タンパクを凍結乾
燥し、これを１〜10mgタンパク／mlとなるように
70％蟻酸を加え、溶かした後、タンパクの約20倍
量の結晶ブロムシアンを加え密栓し、室温（実施
例では37℃）で24時間反応させる。反応液を凍結
乾燥し過剰の試薬を除く。乾燥試料を１〜10mgタ
ンパク／mlとなるように70％蟻酸に溶かす。溶か
した試料を逆相高速液体クロマトグラフイー装置
（島津LC−6A）、を用いて、ヌクレオシル5C18カ
ラム（４×150mm）にかけ、17.5％アセトニトリ
ルを含む0.2Mリン酸トリエチルアンモニウム緩
衝液（PH3.0）で１ml／minの流速で溶出し、分
離することができる。溶出物は220nmにおける吸
光度測定することにより検出することができ、こ
の条件においてロイシンエンケフアリンは試料注
入10分後に単一なピークで溶出される。ロイシン
エンケフアリンを融合していないもとのジヒドロ
葉酸還元酵素を同様の処理をして、上記逆相高速
液体クロマトグラフイーで分析したところロイシ
ンエンケフアリンの溶出位置には何等の溶出物も
検出されない。本発明の実施例では、31の培地か
ら湿重量約13ｇの菌体が得られ、この菌体（計算
上約28.6mgのDHFR−LEK融合タンパク、約0.83
mgのロイシンエンケフアリンを含む）から約4.8
mgのDHFR−LEK融合タンパク（収率16.8％）
を精製して得ることができ、4.8mgの精製DHFR
−LEK融合タンパクをブロムシアンで分解し、
これを逆相高速液体クロマトグラフイーで精製す
ることにより約0.045mgのロイシンエンケフアリ
ン（収率5.4％）を分離することができた。

本発明方法で用いられるプラスミド
pBSFOLEK1は、第２図に示すDNA配列をもつ
もので、その675〜681塩基の所に制限酵素EcoRl
の認識切断部位が存在する。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coli
C600株からのDHFR−LEK融合タンパクの精製
及びタンパクの性質。

プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coli
C600株（FEPM Ｐ−8969として微工研に寄託）
を３の50mg／のアンピシリンナトリウムを含
む栄養培地（１中に、５ｇのNaCl、８ｇのバ
クトペプトン、５ｇのイーストエキスを含む液体
培地、PH7.4）中で37℃で一晩培養後、菌体を遠
心分離により集めた。湿重量約13ｇの菌体が得ら
れた。菌体を20mlの0.1mMのジチオトレイトー
ル（DTT）及び0.1mMのエチレンジアミン４酢
酸２ナトリウム（EDTA）を含む10mMリン酸カ
リウム緩衝液PH7.0に懸濁し、超音波破砕により
細胞を破砕した後、20000回転／分、１時間の遠
心分離により上清25mlを得た。得られた上清のジ
ヒドロ葉酸還元酵素活性を測定したところ、144
ユニツト／ml（全活性3600ユニツト）という値で
あつた。上清を、DEAE−トヨパール650Mカラ
ム（25cm ｘ 150cm、約75cm）に吸着させ、０
から100mMのKCl濃度勾配をかけ溶出した。約
１mlずつフラクシヨンを集め、ジヒドロ葉酸還元
酵素活性を測定し、酵素活性を有する画分を集め
た。25mlの酵素液が得られた（回収活性1837ユニ
ツト、収率51％）。これをアミコン限外ろ過装置
を用いて約１mlにまで濃縮し、トヨパールHW55
カラムクロマトグラフイーにより分画した。約１
mlずつフラクシヨンを集め、ジヒドロ葉酸還元酵
素活性を測定し、酵素活性のピーク画分を集めた
（約3.7ml、回収活性605ユニツト、収率16.8％、
回収タンパク4.8mg）。得られた酵素タンパクを
SDS電気泳動法により分析したところ、均一であ
り、ラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ
ー、トリプシノーゲン、カーボニツクアンヒドラ
ーゼ、グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミンを
分子量マーカーとして精製DHFR−LEK融合タ
ンパクの分子量を推定したところ19000であり、
塩基配列から予想される分子量19296と一致した
値であつた。

精製したDHFR−LEK融合タンパクをエンザ
イムイムノアツセイにより測定したところ、ロイ
シンエンケフアリンに対する抗体と反応し、化学
合成したロイシンエンケフアリンによつて抗原−
抗体反応が競争的に阻害されることが明らかとな
つた。

精製したDHFR−LEK融合タンパク約4.8mgを
凍結乾燥した後、2.0mlの70％蟻酸に溶かした。
これに100mgの結晶ブロムシアンを加え密封して
37℃で、24時間振とうし反応させた。反応液を凍
結乾燥し、これを1.45mlの70％蟻酸に溶解した。
この溶液を0.05mlとり、逆相高速液体クロマトグ
ラフイー装置（島津LC−6A）を用い、ヌクレオ
シル5C18カラム（４ ｘ 150mm）にかけ、17.5
％アセトニトリルを含む0.2Mリン酸トリエチル
アンモニウム緩衝液（PH3.0）で１ml／minの流
速で溶出し、溶出物を220nmにおける吸光度を測
定することにより行つたところ、第２図に示すよ
うな溶出曲線が得られた。化学合成したロイシン
エンケフアリンを同様に分析したところ、約10分
の所に溶出することが示された。さらに、ブロム
シアン処理したDHFR−LEK融合タンパクと化
学合成したロイシンエンケフアリンを混合して、
同様に逆相高速液体クロマトグラフイーで分析し
たところ、第３図と同様の溶出曲線で且つ約10分
の所の溶出ピークが高くなつた溶出曲線が得られ
た。また、ロイシンエンケフアリンを融合してい
ないものとのジヒドロ葉酸還元酵素を同様の処理
をして、上記逆相高速液体クロマトグラフイーで
分析したところロイシンエンケフアリンの溶出位
置（約10分の位置）には溶出物ピークが現われな
かつた。以上の結果、ブロムシアン処理した
DHFR−LEK融合タンパク溶液中に、ロイシン
エンケフアリンが含まれていることが示された。

ブロムシアン処理したDHFR−LEK融合タン
パク溶液中のロイシンエンケフアリン含量を測定
するために、既知の量（それぞれ0.167μg、
0.33μg、1.67μg、2.4μg）の化学合成したロイシ
ンエンケフアリンを量を変えて上記逆相高速液体
クロマトグラフイーにかけ、約10分の位置の溶出
物ピークの高さを測定し、検量線を作成した。検
量線を用いて、第３図のロイシンエンケフアリン
の溶出位置（約10分の位置）のピークの高さか
ら、ロイシンエンケフアリン含量を測定したとこ
ろ、0.05mlの試料あたり1.55μgのロイシンエンケ
フアリンが含まれていることが明らかとなつた。

この結果より、計算すると、最終的に得られた
ブロムシアン処理したDHFR−LEK融合タンパ
ク溶液が1.45mlであることから、この試料中に
0.045mgのロイシンエンケフアリンが含まれてい
ることが推定された。DHFR−LEK融合タンパ
クの精製過程における収率が16.8％であり、収量
が4.8mgであることから、出発E.coli菌体、湿重量
13ｇ中にはDHFR−LEK融合タンパクが約28.6
mg含まれていた計算になる。DHFR−LEK融合
タンパクの分子量が約19000、ロイシンエンケフ
アリンの分子量が約550であることから、E.coli
菌体、湿重量13ｇ中には、ロイシンエンケフアリ
ンに換算して約0.83mgが含まれている計算にな
る。この値を利用すると、最終的に0.045mgがロ
イシンエンケフアリンとして得られたことから、
収率を5.4％と推定することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、DHFR−LEK融合タンパクを暗号
化する部分の塩基配列及びタンパクのアミノ酸配
列を示す図、第２図は、pBSFOLEK1の全塩基
配列の、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だ
けを5′末端から３未端の方向に示す図である。図
中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表わし、Ａは
アデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、
Ｔはチミンを、Alaはアラニンを、Argはアルギ
ニンを、Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラ
ギン酸を、Cysはシステインを、Glnはグルタミ
ンを、Gluはグルタミン酸を、Glyはグリシンを、
Hisはヒスチジンを、Ileはイソロイシンを、Leu
はロイシンを、Lysはリジンを、Metはメチオニ
ンを、Pheはフエニルアラニンを、Proはプロリ
ンを、Serはセリンを、Thrはトレオニンを、
Trpはトリプトフアンを、Tyrはチロシンを、
Valはバリンを示している。図中番号は、第１図
については１番目のアミノ酸であるメチオニンを
暗号化するATGコドンの“Ａ”を１番として数
えた番号を、また第２図については
pBSFOLEK1に２箇所存在する制限酵素Cla切
断認識部位のうち制限酵素Hind切断部位に近
い方のCla切断認識部位の、ATCGATの最初
の“Ａ”を１番として数えた番号を示している。
第３図は、ブロムシアン処理したDHFR−LEK
融合タンパクの逆相高速液体クロマトグラフイー
での溶出曲線を示す図である。横軸は時間を分単
位で、縦軸は220nm吸光度を相対的値で示してい
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coliの
   生産するジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケ
   フアリン融合タンパクを分離精製し、これをブロ
   ムシアン分解法により分解したのちロイシンエン
   ケフアリンを分離精製することを特徴とするロイ
   シンエンケフアリンの製造方法。