JPH0414958B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ペプチドホルモンの一種であるプロ
ラクチン（以下、PRLと略す）をカルボキシ末
端側に有するジヒドロ葉酸還元酵素の生産を可能
とする新規組換えプラスミドpPRL4に関するも
のである。

本発明の新規組換えプラスミドpPRLh4は、第
１図に示されるDNA配列を有する。pPRLh4お
よびpPRLh4を含有する大腸菌は、醗酵工業、医
薬品工業等の分野に好適である。

［従来の技術および問題点］ 本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に
伴つて興味深いポリペプチドを微生物をもちいて
生産することが可能になつた。ポリペプチドに対
応する遺伝子であるDNAを、例えば生体よりク
ローニングと呼ばれる方法で分離するなどし、そ
の後、これを発現ベクターと呼ばれる適当なプラ
スミドなどに組み込み、その結果得られる組換え
プラスミドを大腸菌などの微生物細胞中に導入
し、目的遺伝子を微生物中で発現させ、微生物か
ら目的ポリペプチドを分離精製することが行われ
ている。このような状況においては、目的ポリペ
プチド遺伝子を含み、且つ効率よく発現させる組
換えプラスミドを構築することが最も重要な課題
である。また、目的ポリペプチドが異なれば自ず
からその方法論が異なつており、この点が解決し
なければならない技術課題である。

PRLは、乳汁の分泌を促すペプチドホルモン
である。人のPRLは、すでにその遺伝子のクロ
ーニングが行われており、遺伝子配列が明らかに
される（N.E.Cooke、et al.、L.Biol.Chem.、
vol.256、p.4007（1981）、増田直樹ら、生化学、
vol.56、p1018（1984）、A..T.Truong、et al.、
EMBO J.、vol.3.p.429（1984）、など）。人のPRL
は、199個のアミノ酸より成る。しかしながら、
クローン化した遺伝子を用いた大腸菌でのPRL
の安定な生産に関しては知られていない。

［発明の目的］ 本発明の目的は、上記の問題点を解決するため
に、PRLの大量生産を可能にする組換えプラス
ミドを開発することにある。

すでに、本発明者らは、大腸菌由来のジヒドロ
葉酸還元酵素（以下、DHFRと略す）遺伝子と
の融合により、ペプチド遺伝子の大量発現を行つ
ている（特開平１−144992号公報、特開平１−
252290号公報など）。本発明者らは、PRL遺伝子
とDHFR遺伝子との融合遺伝子の作製およびそ
の発現の結果得られるDHFRとPRLとの融合タ
ンパク質（以下、DHFR−PRLと略す）の作製
を目的に、鋭意研究を行つた。その結果、
DHFR−PRLを大腸菌で効率よく発現できるこ
とを明かにし本発明を完成させた。

［発明の構成］ 第１図は、本発明の組換えプラスミドpPRLh4
の全塩基配列を示している。本発明のpPRLh4
は、5278塩基対の大きさであり、宿主である大腸
菌にトリメトプリムおよびアンピシリン耐性を付
与することができる全く新規な組換えプラスミド
である。pPRLh4は、大腸菌に導入されて安定状
態に保たれ、pPRLh4を含有する大腸菌は、微工
研にFERM BP−2153として寄託されている。

pPRLh4は、DHFR−PRLを暗号化する配列を
含む。第１図において、57番目から133番目迄の
配列がDHFR−PRLを暗号化する配列である。

DHFR−PRLを暗号化する配列の上流には、
この遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在
する（特開昭63−267276号公報）。即ち、43番目
から50番目までの配列がSD配列と呼ばれるもの
で、効率の良い翻訳に、また、5236番目から5264
番目までが、コンセンサス転写プロモーターであ
り、効率の良い転写に貢献する。このことから、
pPRLh4は、大腸菌に導入された場合、多量の
DHFR−PRLを作る。作られたDHFR−PRLは
菌体内に多量に蓄積し、その量は菌体タンパク質
の15〜20％にいたる。また、蓄積したDHFR−
PRLはジヒドロ葉酸還元酵素活性を示し、この
ことによつて、pPRLh4を保持する大腸菌はトリ
メトプリム耐性を示すようになる。

第２図は、本発明の組換えプラスミドpPRLh4
がつくる組換えタンパク質であるDHFR−PRL
のアミノ酸配列およびそれを暗号化するDNA塩
基配列を示している。DHFR−PRLは、359アミ
ノ酸よりなるタンパク質であり、分子量41042で
ある。このうちアミノ末端側から数えて、１から
159番目までの配列が、大腸菌の野生型DHFRに
１箇所アミノ酸置換置換が起こつた（Cys−152
（wild type）→Glu−152）配列であり、160から
359番目迄がPRLの配列である。DHFR−PRL
は、可溶性のタンパク質として大腸菌の菌体内に
効率よく発現および蓄積する。DHFR−PRLは、
DHFR活性を有すると同時に、PRLの抗体とも
反応する。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 １ PRL遺伝子を組み込むためのプラスミドベク
ターの作製 PRL遺伝子を組み込んだプラスミドに関して
は公知であり、またその遺伝子配列も公知である
（N.E.Cooke、et al.、J.Biol.Chem.、vol.256、
p.4007（1981）、増田直樹ら、生化学、vol.56、
p1018（1984）、A..T.Truong、et al.、EMBO J.、
vol.3.p.429（1984）、など）。その結果を詳細に検
討したところ、PRL遺伝子はそのままの形では、
DHFRと容易に結合できないことが考えられた。
そこで、PRL遺伝子とDHFR遺伝子との結合を
容易にする組換えプラスミドの作製を行つた。

すでに、本発明者らが開発している組換えプラ
スミドpMEK２（特開平１−252289号公報に記
載）を用いると、pMEK2のBamHIとXhoI部位
の間に異種DNAを挿入し、DHFRとの融合タン
パク質を容易に発現することができる。また、
PRLのＮ末端から13番目のアミノ酸を暗号化す
る部分は、制限酵素BstE部位が存在する（第
１図の572番目から587番目の配列に相当）ことか
ら、PRLの１番目から13番目までのアミノ酸配
列をDHFRのカルボキシ末端側に結合した融合
タンパク質を発現する組換えプラスミドの作製を
行つた。

PRLの１番目の13番目までの部分を暗号化す
るDNAとして以下のDNA配列を化学合成した。

1.5′−GATCCTGCCGATCTGTCCAG−3′ 2.5′−
GCGGTGCTGCACGCTGCCAGGTGACCTAA
Ｃ−3′ 3.5′−TCGAGTTAGGTCACCTGGCAGC−
3′ 4.5′−
GTGCAGCACCGCCTGGACAGATCGGCAG
−3′ の４本のDNAをホスホアミダイト法に従つて化
学合成した。

化学合成した４本のDNAの5′末満をリン酸化
した後、アニールし、これをあらかじめBamHI
およびXhoIで切断した後、アルカリホスフアタ
ーゼ処理をしたpMEK２と混合し、T4−DNAリ
ガーゼを利用して化学合成DANとベクターの結
合を行わせた。このような反応は、いずれも、
“Molecular Cloning Ａ Loboratory Man−
ual”（T.Maniatis.E.F.Fritsch.J.Sambrook、
eds.Cold Spring Harbor Labora−tory（1982）、
以下、文献１と呼ぶ。）に記載している方法に従
つて行つた。得られた反応物を、形質転換法
（trans−formation method.上記文献１に記載）
に従つて、大腸菌に取り込ませた。この処理をし
た菌体を、50mg／のアンピシリンナトリウムお
よび２mg／のトリメトプリムを含む栄養寒天培
地（培地11中に、２ｇのグルコース、１ｇのリン
酸２カリウム、５ｇのイーストエキス、５ｇのポ
リペプトン、15ｇの寒天を含む。）上に塗布し、
37℃で24時間培養することにより、約80のコロニ
ーを得ることができた。これらのコロニーから最
適に10個選び、1.5mlのYT＋Ap培地（培地11中
に、５ｇのNaCl、５ｇのイーストエキス、８ｇ
のトリプトン、50mgのアンピシリンナトリウムを
含む。）で、37℃、１晩、菌体を培養した。培養
液を、各々エツペンドルフ遠心管にとり、12000
回転／分で10分間遠心分離し、菌体を沈澱として
集めた。これに、0.1mlの電気泳動用サンプル調
製液（0.0625MのTris−HCl、PH6.8、２％のラウ
リル硫酸ナトリウム（SDS）、10％のグリセリン、
５％の２−メルカプトエタノール、0.001％のブ
ロムフエノールブルーを含む。）を加え、菌体を
懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶
かした。この処理をしたサンプルをSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（U.K.Lammli；
Nature、vol.227、p.680−685（1970））に従つて
分析した。分子量マーカーとしてラクトンアルブ
ミン（分子量14200）、トリプシンインヒビター
（分子量20100）、トリプシノーゲン（分子量
24000）、カルボニツクアンヒドラーゼ（分子量
29000）、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（分子量36000）、卵アルブミン（分子量
45000）、および牛血清アルブミン（分子量66000）
を含むサンプルをポリアクリルアミド濃度の10か
ら20％濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、10個
のコロニーのうち、８個では分子量が大きくなつ
たタンパク質（分子量約23000と推定される。）を
新たな大量に生産していることが明らかとなつ
た。デンシトメーターで分析することにより、新
たに現れたタンパク質の量は菌体タンパク質の約
20％であることが推定された。分子量の大きい新
たなタンパク質を生産するコロニーのうちから適
当に一つ選び、これをYA＋Ap培血で培養し、
TanakaとWeis−blumの方法（T.Tanaka、B.
Weisblum；J.Bacterio−logy、vol.121、p.354
（1975））に従つて、プラスミドを調製した。得ら
れたプラスミドをpPRLh1−13と名づけた。

pPRLh1−13は、pMEK２のBamHIとXhoI部
位の間の配列が合成DNA由来の配列と置き換わ
つているはずである。pPRLh1−13をEcoRIと
SalIによる切断によつて得られる400ヌクレオチ
ド長のDNAについて（この部分はBaHIとXhoI
部位を含む）、M13フアージを用いたジデオキシ
法（L.MeSSing；Methtods in Enzymology、
vol.10p.20（1983））に従つて塩基配列を決定し
た。この結果、目的としたプラスミドであること
が明らかにされた。

PRL1−13は、第１図の579番目から1196番目
のあいだの配列が、5′−TAAC−3′に置き換わつ
た配列をしており、4664塩基対の大きさの組換え
プラスミドであることが明かとなつた。

実施例 ２ pPRLh4の作製 PRLを暗号化する遺伝子として、phpRL78（増
田直樹ら、生化学、vol.56、p1018（1984））を、
Hindで切断したあと、DNAポリメラーゼを用
いて切断部分を平滑化した後、BstEで切断し
て得られる約0.6キロ塩基対のDNA断片（第１図
の572番目から、1196番目の配列に相当）を用い
た。このDNA断片を組み込むプラスミドとして
は、pPRL1−13をXhoIで切断した後、DNAポリ
メラーゼを用いて切断部分を平滑化した後、
BstEで切断して得られる約4.6キロ塩基対の
DNA断片を用いた。両者を、T4−DNAリガー
ゼを用いて結合し、実施例と同様にして大腸菌に
形質転換し、組換え体の選択を行い、分子量約
42000の新たなタンパク質を大量に（菌体タンパ
ク質の約20％）つくる組換え体を２個分離した。
そのうちから適当に１個選び、プラスミドを分離
し、これをpPRLh4と名づけた。得られたプラス
ミドを再び大腸菌に導入したところ、pPRLh4と
まつたく同じ性質を有する形質転換株が、10⁵〜
10⁶／μｇプラスミドDNAの頻度で得られた。こ
のことは、pPRLh4の性質が安定していることを
示している。また、pPRLh4が大腸菌菌体内で安
定に複製されることを示している。

pPRLh4は、pPRLh1−13のBstEとXhoI部
位の間の配列にPRL遺伝子由来の配列が導入さ
れているはずである。第１図に示される471番目
のEcoRI部位から1500番目のSalI部位の間の約１
キロ塩基対のDNAについ、M13フアージを用い
たジデオキシ法（J.Messing；Mehtods in
Enzymology、vol.101、p.20（1983））に従つて塩
基配列を決定した。その結果、第１図に示す全塩
基配列の471番目から1500番目の配列が明らかに
された。pPRLh1−13のEcoRIとSaI切断によつ
て得られる約4.2キロ塩基対の配列はpMEK2のそ
れぞれと全く同一であり、またpMEK2の全塩基
配列は、本発明者らによつて明らかにされている
（特開平１−252289号公報に記載）。pPRLh4の
EcoRI−SalI切断によつて得られる約4.2キロ塩
基対のDNAは、PstI、Hind、HpaI、Aat、
Pvu、Bgl、およびClaIを用いた制限酵素に
よる切断実験の結果、pMEK2のEcoRI−SalI切
断によつて得られる約4.2キロ塩基対のDNAと全
く同一であることが示された。

以上の結果から、pPRLh4の全塩基配列が第１
図に示した配列であることが示された。

［発明の効果］ 上記のように、新規組換えプラスミドpPRLh4
は、DHFR−PRLを暗号化しており、かつ、
pPRLh4を有する大腸菌は、DHFR−PRLを大量
に蓄積生産する。さらに、生成したDHFR−
PRLは、DHFR酵素活性を示し、精製を容易に
行うことができると考える。このような性質を有
することから、本発明の新規組換えプラスミド
pPRLh4とそれを有する大腸菌は、DHFR−PRL
の生産、および、それを利用したPRLの生産に
有益である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pPRLh4の全塩基配列を示した図で
あり、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけ
を、5′末端から3′末端の方向に記述している。図
中符号は、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃ
はシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示
している。図中番号は、pPRLh4に２個所存在す
る制限酵素ClaI切断認識部位のうちDHFR遺伝
子の上流に存在する方のClaI切断認識部位の、
5′−ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”を１番とし
て数えた番号を示している。 第２図は、pPRLh4中に存在するDHFR−PRL
を暗号化する部分を塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸
塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃ
はシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、
Alaはアラニンを、Argはアルギニンを、Asnは
アスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cys
はシステインを、Glnはグルタミンを、Gluはグ
ルタミン酸を、Glyはグリシンを、Hisはヒスチ
ジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシン
を、Lysはリジンを、Metはメチオニンを、Phe
はフエニルアラニンを、Proはプロリンを、Ser
はセリンを、Thrはトレオニンを、Trpはトリブ
トフアンを、Tyrはチロシンを、Valはバリンを
示している。図中番号は、１番目のアミノ酸であ
るメチオニンを暗合化するATGコドンの“Ａ”
を１番として数えた番号を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 大腸菌において安定に複製され、宿主である
   大腸菌にトリメトプリム耐性及びアンピシリン耐
   性を与えることができ、下記において示される
   DNA配列を有する新規組換えプラスミド
   pPRLh4。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 ２ 大腸菌において安定に複製され、宿主である
   大腸菌にトリメトプリム耐性及びアンピシリン耐
   性を与えることができ、下記において示される
   DNA配列を有する新規組換えプラスミド
   pPRLh4を含有する大腸菌。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】