CN114395543A

CN114395543A - 一种海藻糖合酶突变体及其应用

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Publication number: CN114395543A
Application number: CN202210062141.0A
Authority: CN
Inventors: 张建涛; 张建波; 马春艳; 李志敏; 林玉; 房鸣
Original assignee: Shandong Hengren Trade Co ltd
Current assignee: Shandong Hengren Trade Co ltd
Priority date: 2022-01-19
Filing date: 2022-01-19
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2042-01-19
Also published as: CN114395543B

Abstract

本发明涉及一种海藻糖合酶突变体，属于基因工程技术领域。所述海藻糖合酶突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的海藻糖合酶的第201位和/或第351位的氨基酸进行定点突变获得的。本发明在天然海藻糖合酶的基础上，通过理性设计，结合定点突变生物技术改造海藻糖合酶分子结构，分析了突变后残基对酶热稳定性的影响，并最终获得了稳定性提高的突变菌株S201I、H351A及组合突变株S201I/H351A，本发明的海藻糖合酶突变体在热稳定显著提高的同时酶的活性不受影响，本发明的海藻糖合酶突变体比野生型更适合于催化麦芽糖生成海藻糖的应用，更利于生产工艺的灵活性。

Description

一种海藻糖合酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种海藻糖合酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

海藻糖是近年来新兴的一种功能性甜味剂，在食品、医药等工业中具有广阔的应用前景，而海藻糖合酶是目前生物酶法工业化生产海藻糖最有效的酶，其可以高效异构麦芽糖生成海藻糖，该酶反应流程短，易调控，不需要消耗高能物质，一步反应就能获得海藻糖。因此，海藻糖合酶转化法是工业化生产海藻糖的有效方法，有着良好的应用前景。

目前，已报道的海藻糖合酶在生物催化过程中热稳定性较差，并且多是在非食品安全菌株中表达。因此，对海藻糖合酶进行分子修饰以提高其热稳定性并且在食品安全级菌株中表达具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种热稳定性提高的海藻糖合酶突变体。

技术方案

一种海藻糖合酶突变体，是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的海藻糖合酶的第201位和/或第351位的氨基酸进行定点突变获得的，将第201位的缬氨酸突变为异亮氨酸，命名为S201I；或将第351位的组氨酸突变为丙氨酸，命名为H351A；或是将第201位的缬氨酸突变为异亮氨酸，同时将第351位的组氨酸突变为丙氨酸，命名为S201I/H351A；编码所述海藻糖合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述海藻糖合酶突变体在制备海藻糖中的应用。

一种制备上述海藻糖合酶突变体的方法：

(1)以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，根据理性设计的位点，设计定点突变引物，进行PCR扩增获得含有突变位点的基因，然后构建含有编码突变体基因的载体；

(2)将含有编码突变体的基因载体转化到宿主细胞内；

(3)对步骤(2)构建的重组细胞进行筛选验证，获得阳性克隆，然后通过培养发酵产酶，离心收集细胞，利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，离心获得含有海藻糖合酶突变体的粗酶液。

本发明还提供了一种携带上述基因的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体以pET-28a载体作为原始表达载体。

一种由上述重组表达载体转化得到的基因工程菌。

所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，所述大肠杆菌包括BL21(DE3)。

本发明的有益效果：

1)本发明在天然海藻糖合酶的基础上，通过理性设计，结合定点突变生物技术改造海藻糖合酶分子结构，分析了突变后残基对酶热稳定性的影响，并最终获得了稳定性提高的突变菌株(S201I、H351A及组合突变株S201I/H351A)。

2)天然海藻糖合酶的半衰期为13.2min，本发明提供的海藻糖合酶突变体S201I/H351A在45℃时半衰期达到101.1min，是天然海藻糖合酶的半衰期的7.7倍；海藻糖合酶突变体S201I在45℃时半衰期达到37.4min，是天然海藻糖合酶的半衰期的2.8倍；海藻糖合酶突变体H351A在45℃时半衰期达到32.6min，是天然海藻糖合酶的半衰期的2.5倍。

3)本发明提供的海藻糖合酶突变体在热稳定显著提高的同时酶的活性不受影响。其中，在50℃热处理20min后，突变体S201I/H351A、S201I、H351A分别保留95.4％、70.1％、48.3％的相对酶活，对照组则仅仅保留18.6％的相对酶活。

4)本发明所得的海藻糖合酶突变体比野生型更适合于催化麦芽糖生成海藻糖的应用，更利于生产工艺的灵活性。

附图说明

图1为纯酶液经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析；

图2为野生型海藻糖合酶及海藻糖合酶突变体S201I、H351A、S201I/H351A在50℃条件下的半衰期测试结果；

图3为野生型海藻糖合酶及海藻糖合酶突变体S201I、H351A、S201I/H351A在不同pH下的酶活测试结果；

图4为野生型海藻糖合酶及海藻糖合酶突变体S201I、H351A、S201I/H351A在不同温度下的酶活测试结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。下述实施例中，涉及的培养基及配方如下：

LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl。

LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加2％琼脂。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

海藻糖合酶酶活测定方法：取100μL浓度为300μg/mL的纯酶加入到含有300g/L的麦芽糖的50mM pH 7.5磷酸氢二钠-磷酸氢二钠缓冲液的900μL反应体系中；于40℃水浴条件下反应10min，然后100℃沸水浴10min终止酶促反应，离心取上清，稀释到10mg/mL，利用HPLC检测反应溶液中海藻糖的含量。

酶活定义：定义在35℃、pH 7.0的条件下，每分钟催化麦芽糖生成lμmol海藻糖所需的酶量，为一个酶活单位U。

比酶活：定义为单位蛋白的酶活U/mg。

实施例1

构建含海藻糖合酶突变体的重组质粒：

(1)含有野生型的海藻糖合酶pse的重组质粒的构建

化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型的海藻糖合酶pse，与pET-28a载体采用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶酶切后连接，制备得到重组载体pET-28a-pse。

(2)含有突变体的重组载体的获得：

利用全质粒PCR技术，将步骤(1)制备得到的重组载体pET-28a-pse为模板进行定点突变，获得含有突变体基因的重组质粒pET-28a-pseS201I、pET-28a-pseL174T、pET-28a-pseH351A，pET-28a-pseR560S、pET-28a-pseL316S、pET-28a-pseLS201I/H351AE。

设计的引物序列如下：

S201I_F：AAAATCTCATTCCGCTGCAGGTCGACGTG

S201I_R：GCAGCGGAATGAGATTTTGCGCATCACGGCC

L174T_F:CCGGGCACCTACCACATGGTCGAAATCCGCG

L174T_R:TGGTAGGTGCCCGGATAGTCTTCATAGGC

H351A_F:ATGTCCGCGGGCGGCGCCGACCTTTC

H351A_R:CCGCCCGCGGACATGTTGGCGATGTCGTC

R560S_F:ATGCCATCGCCGAAAACTTTGTACGGCAGCC

R560S_R:TTCGGCGATGGCATTTGCCCTGCGGAC

L316S_F:CCACCCGTCGTCGATCACCGGTAACCAGCTG

L316S_R:GATCGACGACGGGTGGCTTTCAGACCAG

其中，PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变形5min；然后进入30个循环；95℃变性30s，72℃退火40s，58℃延伸3.5min,4℃保温。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

将最终扩增片段用Dpn I酶在37℃水浴锅中作用1h用于去除模板，然后将PCR混合物化学转化到E.coliBL21感受态细胞中，转化液涂布含卡那霉素(50μg/mL)LB固体培养基上，提取质粒并测序，测序工作由苏州金唯智完成。

实施例2

产α-葡萄糖转苷酶突变体重组大肠杆菌工程菌的构建及α-葡萄糖转苷酶的表达、分离、纯化，具体步骤如下：

(1)分别将实施例1得到的重组质粒pET-28a-pseS201I、pET-28a-pseL174T、pET-28a-pseH351A，pET-28a-pseR560S、pET-28a-pseL316S、pET-28a-pseLS201I/H351A，转化到E.coliBL21感受态细胞中，分别制备得到基因工程菌：E.coli/pET-28a-pseS201I、E.coli/pET-28a-pseL174T、E.coli/pET-28a-pseH351A、E.coli/pET-28a-pseR560S、E.coli/pET-28a-pseL316S、E.coli/pET-28a-pseS201I/H351A。

(2)分别将步骤(1)制备得到的基因工程菌接种至10mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养过夜，制备得到种子液；

将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量转接至100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm下培养至OD₆₀₀为1.0时，加入终浓度为1mM的IPTG，在30℃条件下继续培养20h，得到发酵液；将制备得到的发酵液在8000rpm、4℃条件下离心处理5min得到细胞菌体，并将细胞在洗涤3次后，用10mLPB缓冲液(pH 7..5)重新悬浮。用超声破碎仪在冰浴条件下处理重悬后的细胞30min，离心30min(8000×g，4℃)，取上清液，得到粗酶液；

通过0.22μm过滤器过滤上清液部分，然后进一步加载到1mLNi亲和柱上，该亲和柱用50mM洗涤缓冲液(20mM Tris和500mMNaCl，pH 7.4)预平衡，然后洗脱缓冲液(20mM Tris、500mMNaCl和500mM咪唑，pH 7.4)用线性梯度洗脱未结合蛋白和海藻糖合酶；分别制备得到含有野生型pse的纯酶液，含有S201I的纯酶液的纯酶液，含有H351A的纯酶液，含有S201I/H351A的纯酶液，含有L316S的纯酶液，含有R560S的纯酶液，含有L174T的纯酶液；

分别将上述纯酶液经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，如图1所示。结果显示：在76.81kDa处有明显的条带，证明海藻糖合酶得到表达。

1.为了测试定点突变对热稳定性的影响，对步骤(2)制备得到的纯酶进行热稳定性实验，进行初步筛选，方法如下：

分别将步骤(2)制备得到的纯酶在50℃水浴锅中孵育处理20min后，取1mL，根据海藻糖合酶酶活测定方法测定剩余酶的残余酶活，以未经过高温处理的纯酶液的酶活为空白对照，得到残余酶活的百分比。测试结果见表1：

表1

由表1可以看出，突变体S201I、H351A、S201I/H351A分别保留70.1％、48.3％、95.4％的相对酶活，野生型和其他突变体则仅仅保留18.6％左右的相对酶活；S201I、H351A、S201I/H351A的热稳定性显著高于野生型。

2.对步骤(2)制备得到的纯酶液进行比酶活测定

分别检测步骤(2)制备得到的含有野生型pse、S201I、H351A、S201I/H351A的纯酶液，结果如表2所示：

表2

实施例3

海藻糖合酶突变体酶学性质测试：

1、热稳定性

分别取实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型pse的纯酶液，含有S201I的纯酶液，含有H351A的纯酶液，含有S201I/H351A的纯酶液，置于50℃恒温水浴中，每隔20min取样一次，根据海藻糖合酶酶活测定方法测其残留酶活，比较其热稳定性，测试结果见图2和表3所示。

表3

由图2可以看出酶的活力随时间增长不断下降，单突变和双突变的酶活全程高于未突变的酶活。

由表3可以看出，单突变的两组热稳定半衰期都有了明显的提高，双突变的半衰期在单突变的基础上又进一步提高。

2、最适pH

将实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型pse的纯酶液，含有S201I的纯酶液,含有H351A的纯酶液，含有S201I/H351A的纯酶液液置于含有磷酸二氢钠/磷酸氢二钠(pH4.0～8.0)的50mM缓冲液中，以未孵育的初始酶活为100％，测定酶活性。结果见图3。

由图3可以看出，突变体的最适pH为7.5，与野生型类似。

3、最适温度

将实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型pse的纯酶液，含有S201I的纯酶液,含有H351A的纯酶液，含有S201I/H351A的纯酶液置于含有磷酸二氢钠/磷酸氢二钠(pH7.0)的50mM缓冲液中，设置反应温度为20～50℃，以未孵育的初始酶活为100％，测定酶活性。结果见图4。

由图4可以看出，突变体的最适温度为40℃，与野生型类似。

序列表

SEQ ID NO.1

海藻糖合酶的氨基酸序列

MTAADKNHVTWLVEQSMLHAARQRAKLYSGQGRLWQQPYAHTRPRDASALASVWFTAYPASIVTREDGSVLEALGDETLWHALSKIGIQGIHNGPLKMSGGLTGTQRTPTIDGNFDRVSFEIDPELGTEAQLQALVRMAAAHNAVIIDDVIPSHTGKGADFRLAEMAYEDYPGLYHMVEIREEDWPLLPDIADGRDAQNLSPLQVDVLRDKHYIVGQLQRVIFFEPGVKETDWSATPIVIGVDGKPRRWVYLHYFKEGQPSLNWLDPTFAAQQMIIGDALHAIDVMGAKILRLDANGFLGVERKLDGTAWSESHPLSITGNQLLAGAIRKAGGFSFQELNLTVDDIANMSHGGADLSYDFITRPAYQHALLMGDTEFLRLMLRQMHTLGIDPGSLIHALQNHDELTLELVHFWTLHAHDTYLYQGQSFPGNILREHIREQMYERLAGEHAPYNLKFVTNGVSCTTASIITAALGIRDLDAITEADIQQIRQVHLLLVMYNAMQPGVFALSGWDLVGALPLPAEQVEHLMGDGDTRWIHRGAYDLVDLNPDAPLSAGQMPRPKTLYGSLPSQLKDSDSFVSQLKRILAARRAYDIAASRQILIPDVQHPGLLVMVHELPAGKGTQITALNFGSTPITETLHLPNIAPGPVVDIINERVEGDLTPEGDFTITLDAYEGLALRVVSSSPMI

SEQ ID NO.2

海藻糖合酶的核苷酸序列

atgaccgcggctgacaaaaaccatgtgacctggctggttgaacaatcgatgctgcatgccgccaggcagcgggccaagctctattcggggcaaggtcgactgtggcaacagccttacgcccatacccggccccgtgatgcttccgccttggcctcggtgtggttcaccgcctacccggcgtccatcgtcacccgcgaagacggcagcgtgctggaagccctgggcgacgaaaccttatggcatgccctgtcgaaaatcggcatccagggcattcacaacgggccgctgaaaatgtcgggcggcctgacaggcactcaacgcacgccgaccattgacggcaattttgaccgcgtcagtttcgagatcgacccggaactgggcaccgaggcgcagctccaggcgctggtgcgcatggccgccgcgcacaatgcggtgatcatcgatgacgtgatcccttcgcacaccggcaaaggcgcagacttccgcctggccgagatggcctatgaagactatccgggcctctaccacatggtcgaaatccgcgaagaggactggccgttgctgccggacatcgccgatggccgtgatgcgcaaaatctcagtccgctgcaggtcgacgtgctccgggacaagcactacatcgtcggccagttgcaacgggtgattttcttcgaacccggggtcaaggagaccgactggagcgcgacgccaatcgtgatcggcgtcgatggcaagccgcgacgctgggtctatctgcattacttcaaggaagggcagccgtcgctgaactggctggacccgaccttcgccgcgcagcagatgatcatcggcgatgcactgcacgccattgacgtcatgggcgcgaaaatcctgcgcctggacgccaacggattcctcggcgtggagcgcaagctcgacggtacggcctggtctgaaagccacccgttatcgatcaccggtaaccagctgctggccggggcgatccgcaaggccggcggtttcagtttccaggagctcaacctgaccgtcgacgacatcgccaacatgtcccacggcggcgccgacctttcctatgacttcatcacccgaccggcctaccagcacgcgttgctgatgggcgacaccgagttcctgcgcttgatgctgcggcagatgcacaccctcggcatcgacccgggatcgctgatccatgccttgcaaaaccacgacgagctgaccctggagctggtgcatttctggacgctgcacgcccatgacacctacctctatcagggccagagcttcccgggcaacatcctgcgtgaacacattcgcgagcagatgtacgaacgtctggcgggcgagcacgcgccctacaaccttaaatttgtcaccaacggcgtgtcttgcaccaccgccagcatcatcacggcagcgctgggaattcgtgatctcgacgcaatcaccgaggcggacatccaacagattcgccaggtgcatttgctgttggtgatgtacaacgccatgcaaccgggcgtgtttgcgctgtccggctgggacctggtcggcgcgctgccgttgccggcggaacaggttgagcatttgatgggtgacggcgacacgcgctggattcatcgtggcgcctacgacctggtggacctcaatccggacgcaccgctgtccgcagggcaaatgccacggccgaaaactttgtacggcagcctgcccagccagttgaaggactccgattcgttcgtctcgcaactcaagaggatcctcgccgcgcgccgcgcttacgatatcgccgccagtcggcagatcttgattcccgatgtccagcatccggggctgttggtcatggtccacgaattgccggccggtaaaggcacgcaaatcactgcgctgaacttcggctcgacgccgatcaccgaaaccttgcacctgcccaatattgcgccgggcccggtggtcgacatcatcaacgagcgagtcgaaggtgatctcacgcctgagggtgatttcaccattaccctggatgcctacgaagggttggcactgcgcgtggtgagcagttcgccgatgatttga

序列表

<110> 山东恒仁工贸有限公司

<120> 一种海藻糖合酶突变体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 688

<212> PRT

<213> 海藻糖合酶(Trehalose synthase)

<400> 1

Met Thr Ala Ala Asp Lys Asn His Val Thr Trp Leu Val Glu Gln Ser

1 5 10 15

Met Leu His Ala Ala Arg Gln Arg Ala Lys Leu Tyr Ser Gly Gln Gly

20 25 30

Arg Leu Trp Gln Gln Pro Tyr Ala His Thr Arg Pro Arg Asp Ala Ser

35 40 45

Ala Leu Ala Ser Val Trp Phe Thr Ala Tyr Pro Ala Ser Ile Val Thr

50 55 60

Arg Glu Asp Gly Ser Val Leu Glu Ala Leu Gly Asp Glu Thr Leu Trp

65 70 75 80

His Ala Leu Ser Lys Ile Gly Ile Gln Gly Ile His Asn Gly Pro Leu

85 90 95

Lys Met Ser Gly Gly Leu Thr Gly Thr Gln Arg Thr Pro Thr Ile Asp

100 105 110

Gly Asn Phe Asp Arg Val Ser Phe Glu Ile Asp Pro Glu Leu Gly Thr

115 120 125

Glu Ala Gln Leu Gln Ala Leu Val Arg Met Ala Ala Ala His Asn Ala

130 135 140

Val Ile Ile Asp Asp Val Ile Pro Ser His Thr Gly Lys Gly Ala Asp

145 150 155 160

Phe Arg Leu Ala Glu Met Ala Tyr Glu Asp Tyr Pro Gly Leu Tyr His

165 170 175

Met Val Glu Ile Arg Glu Glu Asp Trp Pro Leu Leu Pro Asp Ile Ala

180 185 190

Asp Gly Arg Asp Ala Gln Asn Leu Ser Pro Leu Gln Val Asp Val Leu

195 200 205

Arg Asp Lys His Tyr Ile Val Gly Gln Leu Gln Arg Val Ile Phe Phe

210 215 220

Glu Pro Gly Val Lys Glu Thr Asp Trp Ser Ala Thr Pro Ile Val Ile

225 230 235 240

Gly Val Asp Gly Lys Pro Arg Arg Trp Val Tyr Leu His Tyr Phe Lys

245 250 255

Glu Gly Gln Pro Ser Leu Asn Trp Leu Asp Pro Thr Phe Ala Ala Gln

260 265 270

Gln Met Ile Ile Gly Asp Ala Leu His Ala Ile Asp Val Met Gly Ala

275 280 285

Lys Ile Leu Arg Leu Asp Ala Asn Gly Phe Leu Gly Val Glu Arg Lys

290 295 300

Leu Asp Gly Thr Ala Trp Ser Glu Ser His Pro Leu Ser Ile Thr Gly

305 310 315 320

Asn Gln Leu Leu Ala Gly Ala Ile Arg Lys Ala Gly Gly Phe Ser Phe

325 330 335

Gln Glu Leu Asn Leu Thr Val Asp Asp Ile Ala Asn Met Ser His Gly

340 345 350

Gly Ala Asp Leu Ser Tyr Asp Phe Ile Thr Arg Pro Ala Tyr Gln His

355 360 365

Ala Leu Leu Met Gly Asp Thr Glu Phe Leu Arg Leu Met Leu Arg Gln

370 375 380

Met His Thr Leu Gly Ile Asp Pro Gly Ser Leu Ile His Ala Leu Gln

385 390 395 400

Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Leu Val His Phe Trp Thr Leu His

405 410 415

Ala His Asp Thr Tyr Leu Tyr Gln Gly Gln Ser Phe Pro Gly Asn Ile

420 425 430

Leu Arg Glu His Ile Arg Glu Gln Met Tyr Glu Arg Leu Ala Gly Glu

435 440 445

His Ala Pro Tyr Asn Leu Lys Phe Val Thr Asn Gly Val Ser Cys Thr

450 455 460

Thr Ala Ser Ile Ile Thr Ala Ala Leu Gly Ile Arg Asp Leu Asp Ala

465 470 475 480

Ile Thr Glu Ala Asp Ile Gln Gln Ile Arg Gln Val His Leu Leu Leu

485 490 495

Val Met Tyr Asn Ala Met Gln Pro Gly Val Phe Ala Leu Ser Gly Trp

500 505 510

Asp Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu Pro Ala Glu Gln Val Glu His Leu

515 520 525

Met Gly Asp Gly Asp Thr Arg Trp Ile His Arg Gly Ala Tyr Asp Leu

530 535 540

Val Asp Leu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Ser Ala Gly Gln Met Pro Arg

545 550 555 560

Pro Lys Thr Leu Tyr Gly Ser Leu Pro Ser Gln Leu Lys Asp Ser Asp

565 570 575

Ser Phe Val Ser Gln Leu Lys Arg Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Tyr

580 585 590

Asp Ile Ala Ala Ser Arg Gln Ile Leu Ile Pro Asp Val Gln His Pro

595 600 605

Gly Leu Leu Val Met Val His Glu Leu Pro Ala Gly Lys Gly Thr Gln

610 615 620

Ile Thr Ala Leu Asn Phe Gly Ser Thr Pro Ile Thr Glu Thr Leu His

625 630 635 640

Leu Pro Asn Ile Ala Pro Gly Pro Val Val Asp Ile Ile Asn Glu Arg

645 650 655

Val Glu Gly Asp Leu Thr Pro Glu Gly Asp Phe Thr Ile Thr Leu Asp

660 665 670

Ala Tyr Glu Gly Leu Ala Leu Arg Val Val Ser Ser Ser Pro Met Ile

675 680 685

<210> 2

<211> 2067

<212> DNA

<213> 海藻糖合酶(Trehalose synthase)

<400> 2

atgaccgcgg ctgacaaaaa ccatgtgacc tggctggttg aacaatcgat gctgcatgcc 60

gccaggcagc gggccaagct ctattcgggg caaggtcgac tgtggcaaca gccttacgcc 120

catacccggc cccgtgatgc ttccgccttg gcctcggtgt ggttcaccgc ctacccggcg 180

tccatcgtca cccgcgaaga cggcagcgtg ctggaagccc tgggcgacga aaccttatgg 240

catgccctgt cgaaaatcgg catccagggc attcacaacg ggccgctgaa aatgtcgggc 300

ggcctgacag gcactcaacg cacgccgacc attgacggca attttgaccg cgtcagtttc 360

gagatcgacc cggaactggg caccgaggcg cagctccagg cgctggtgcg catggccgcc 420

gcgcacaatg cggtgatcat cgatgacgtg atcccttcgc acaccggcaa aggcgcagac 480

ttccgcctgg ccgagatggc ctatgaagac tatccgggcc tctaccacat ggtcgaaatc 540

cgcgaagagg actggccgtt gctgccggac atcgccgatg gccgtgatgc gcaaaatctc 600

agtccgctgc aggtcgacgt gctccgggac aagcactaca tcgtcggcca gttgcaacgg 660

gtgattttct tcgaacccgg ggtcaaggag accgactgga gcgcgacgcc aatcgtgatc 720

ggcgtcgatg gcaagccgcg acgctgggtc tatctgcatt acttcaagga agggcagccg 780

tcgctgaact ggctggaccc gaccttcgcc gcgcagcaga tgatcatcgg cgatgcactg 840

cacgccattg acgtcatggg cgcgaaaatc ctgcgcctgg acgccaacgg attcctcggc 900

gtggagcgca agctcgacgg tacggcctgg tctgaaagcc acccgttatc gatcaccggt 960

aaccagctgc tggccggggc gatccgcaag gccggcggtt tcagtttcca ggagctcaac 1020

ctgaccgtcg acgacatcgc caacatgtcc cacggcggcg ccgacctttc ctatgacttc 1080

atcacccgac cggcctacca gcacgcgttg ctgatgggcg acaccgagtt cctgcgcttg 1140

atgctgcggc agatgcacac cctcggcatc gacccgggat cgctgatcca tgccttgcaa 1200

aaccacgacg agctgaccct ggagctggtg catttctgga cgctgcacgc ccatgacacc 1260

tacctctatc agggccagag cttcccgggc aacatcctgc gtgaacacat tcgcgagcag 1320

atgtacgaac gtctggcggg cgagcacgcg ccctacaacc ttaaatttgt caccaacggc 1380

gtgtcttgca ccaccgccag catcatcacg gcagcgctgg gaattcgtga tctcgacgca 1440

atcaccgagg cggacatcca acagattcgc caggtgcatt tgctgttggt gatgtacaac 1500

gccatgcaac cgggcgtgtt tgcgctgtcc ggctgggacc tggtcggcgc gctgccgttg 1560

ccggcggaac aggttgagca tttgatgggt gacggcgaca cgcgctggat tcatcgtggc 1620

gcctacgacc tggtggacct caatccggac gcaccgctgt ccgcagggca aatgccacgg 1680

ccgaaaactt tgtacggcag cctgcccagc cagttgaagg actccgattc gttcgtctcg 1740

caactcaaga ggatcctcgc cgcgcgccgc gcttacgata tcgccgccag tcggcagatc 1800

ttgattcccg atgtccagca tccggggctg ttggtcatgg tccacgaatt gccggccggt 1860

aaaggcacgc aaatcactgc gctgaacttc ggctcgacgc cgatcaccga aaccttgcac 1920

ctgcccaata ttgcgccggg cccggtggtc gacatcatca acgagcgagt cgaaggtgat 1980

ctcacgcctg agggtgattt caccattacc ctggatgcct acgaagggtt ggcactgcgc 2040

gtggtgagca gttcgccgat gatttga 2067

Claims

1.一种海藻糖合酶突变体，其特征在于，所述海藻糖合酶突变体是对氨基酸序列如SEQID NO.1所示的海藻糖合酶的第201位和/或第351位的氨基酸进行定点突变获得的，将第201位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或将第351位的组氨酸突变为丙氨酸；或是将第201位的缬氨酸突变为异亮氨酸，同时将第351位的组氨酸突变为丙氨酸；编码所述海藻糖合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述海藻糖合酶突变体在制备海藻糖中的应用。

3.一种编码权利要求1所述海藻糖合酶突变体的基因。

4.一种携带权利要求3所述基因的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pET-28a载体作为原始表达载体。

6.一种由权利要求3或4所述重组表达载体转化得到的基因工程菌。

7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。

8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括BL21(DE3)。