JPH02142479A - 新規組換えプラスミドｐＰＲＬｈ４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ペプチドホルモンの一種であるプロラクチン
（以下、ＰＲＬと略す）をカルボキシ末端側に有するジ
ヒドロ葉酸還元酵素の生産を可能どす、る新規組換えプ
ラスミドｐＰＲＬｈ４に関するものである。

本発明の新規組換えプラスミドｐＰＲＬｈ４は。

第１図に示されるＤＮＡ配列を有する。ｐＰＲＬｈ４お
よびｐ　Ｐ　ＲＬ　ｈ　４を含有する大腸菌は９発酵工
業、医薬品工業等の分野に好適である。

［従来の技術および問題点］ 本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に伴フて興味深い
ポリペプチドを微生物をもちいて生産することが可能に
なフた。ポリペプチドに対応する遺伝子であるＤＮＡを
２例えば生体よりクローニングと呼ばれる方法で分離す
るなどし、その後、これを発現ベクターと呼ばれる適当
なプラスミドなどに組み込み、その結果径られる刊換え
プラスミドを大腸菌などの微生物細胞中に導入し。

目的遺伝子を微生物中で発現させ、微生物から目的ポリ
ペプチドを分離精製することが行われている。このよう
な状況においては、目的ポリペプチド遺伝子を含み、且
つ効率よく発現させる別換えブラスミ・Ｆを・構築する
ことが最も重要な課題である、また、目的ポリペプチド
が異なれば自ずからその方法論が異なフており、この点
が解決しなければならない技術課題である。

ＰＲＬは、乳汁の分泌を促すペプチドホルモンである。

人のＰＲＬは、すでにその遺伝子のクローニングが行わ
れており、遺伝子配列が明らかにされている（Ｎ、Ｅ、
Ｃｏｏｋｅ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、。

ｖｏｌ　、２５６．ｐ、４００７（１９８１）、増田直
樹ら、生化学、ｖｏｌ。

５６、ｐ１０１８（１９８４）、　Ａ、、Ｔ、Ｔｒｕｏ
ｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、。

ｖｏｌ　、３．ｐ、４２９（１９８４）、など）。人の
ＰＲＬは、１９９個のアミノ酸より成る。しかしながら
、クローン化した遺伝子を用いた大腸菌でのＰＲＬの安
定な生産に関しては知られていない。

［発明の目的コ 本発明の目的は、上記の問題点を解決するために、ＰＲ
Ｌの大量生産を可能にする組換えプラスミドを開発する
ことにある。

すてに９本発明者らは、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元
酵素（以下、ＤＨＦＲと略す）遺伝子との融合により、
ペプチド遺伝子の大量発現を行っている（特許　昭６２
−３０２１５３．６３−７９６８１など）。本発明者ら
は、ＰＲＬ遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子との融合遺伝子の作
製およびその発現の結果得られるＤＨＦＲとＰＲＬとの
融合タンパク質（以下、ＤＨＦＲ−ＰＲＬと略す）の作
製を目的に、鋭意研究を行った。その結果、ＤＨＦＲ−
ＰＲＬを大腸菌で効率よく発現できることを明かにし本
発明を完成させた。

［発明の構成］ 第１図は２本発明の組換えプラスミドｐＰＲＬｈ４の全
塩基配列を示している。本発明のｐＰＲＬｈ４は、５２
７Ｂ塩基対の大きさであり、宿主である大腸菌にトリメ
トプリムおよびアンピシリン耐性を付与することができ
る全く新規な組換えプラスミドである。ｐＰＲＬｈ４は
、大腸菌に導入されて安定状態に保たれ、ｐＰＲＬｈ４
を含有する大腸菌は、微工研にＦＥＲＭ　　ＢＰ−２１
５３として寄託されている。

ｐＰＲＬｈ４は、ＤＨＦＲ−ＰＲＬを暗号化する配列を
含む。第１図において、５７番目から１１３３＠目迄の
配列がＤ　ＨＦ　Ｒ−Ｐ　ＲＬを暗号化する配列である
。

ＤＨＦＲ−ＰＲＬを暗号化する配列の上流には。

この遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する（
特願昭６ｌ−３１２８３６）。即ち、４３番目から５０
番目までの配列がＳＤ配列と呼ばれるもので、効率の良
い翻訳に、また、５２３６番目から５２６４番目までが
、コンセンサス転写プロモーターであり、効率の良い転
写に貢献する。

このことから、ｐＰＲＬｈ４は、大腸菌に導入された場
合、多量のＤＨＦＲ−ＰＲＬを作る。作られたＤＨＦＲ
−ＰＲＬは菌体内に多量に蓄積し。

その量は菌体タンパク質の１５〜２０％にいたる。

また、蓄積したＤＨＦＲ−ＰＲＬはジヒドロ葉酸還元酵
素活性を示し、このことによフて、ｐＰＲＬｈ４を保持
する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。

第２図は２本発明の絹換えプラスミドｐＰＲＬｈ４がつ
くる組換えタンパク質であるＤＨＦＲ−ＰＲＬのアミノ
酸配列およびそれを暗号化するＤＮＡ塩基配列を示して
いる。ＤＨＦＲ−ＰＲＬは、３５９アミノ酸よりなるタ
ンパク質であり。

分子ｆｆ１４１，０４２である。このうちアミン末端側
から数えて、１から１５９５９番目の配列が。

大腸菌の野生型ＤＨＦＲに１箇所アミノ酸置換置換が起
こった（Ｃｙｓ−１５２（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）　＋　
Ｇｌｕ−１５２）配列であり、１６０から３６９番目迄
がＰＲＬの配列である。ＤＨＦＲ−ＰＲＬは、可溶性の
タンパク質として大腸菌の菌体内に効率よく発現および
蓄積する。ＤＨＦＲ−ＰＲＬは、ＤＨＦＲ活性を有する
と同時に、ＰＲＬの抗体とも反応する。

次に本発明の実施例を示す。

実施例Ｉ ＰＲＬ遺伝子な絹み込むためのプラスミドベクターの作
製 ＰＲＬ遺伝子を組み込んだプラスミドに関しては公知で
あり、またその遺伝子配列も公知である（Ｎ、Ｅ、Ｃｏ
ｏｋ、ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
、ｖｏｌ、２５６゜９．４００７（１９８１）、増田直
樹ら、生化学Ｊ　Ｖｏｌ　、５６　＋ｐ１０１８（１９
８４）、　Ａ、、Ｔ、Ｔｒｕｏｎｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｅ
ＭＢＯＪ、、ｖｏｌ。

３、ｐ、４２９（１９８４）、など）。その結果を詳細
に検討したところ、ＰＲＬ遺伝子はそのままの形では、
　ＤＨＦＲと容易に結合できないことが考えられた。そ
こで、ＰＲＬ遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子との結合を容易に
する組換えプラスミドの作製を行った。

すでに９本発明者らが開発している組換えプラスミドｐ
ＭＥＫ２（特許　昭６３−７９６８０に記載）を用いる
と、ｐＭＥＫ２のＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位の開に異種
ＤＮＡを挿入し、ＤＨＦＲとの融合タンパク質な容易に
発現することができる。また、ＰＲＬのＮ末端から１３
＠目のアミノ酸を暗号化する部分は、制限酵素ＢｓｔＥ
ｎ部位が存在する（第１図の５７２番目から５７８番目
の配列に相当）ことから、ＰＲＬの１番目から１３番目
までのアミノ酸配列をＤＨＦＲのカルボキシ末端側に結
合した融合タンパク質を発現する組換えプラスミドの作
製を行フた。

ＰＲＬの１番目から１３番目までの部分を暗号化するＤ
ＮＡとして以下のＤＮＡ配列を化学合成した。

１．５　’　−ＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＴＣＣ
ＡＧ−３’２．５ξＧＣＧＧＴＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧ
ＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＴＡＡＣ−３’３．５　’　−Ｔ
ＣＧＡＧＴＴＡＧＧＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣ−３’４
．５ξＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴ
ＣＧＧＣＡＧ−３’の４本のＤＮＡをホスホアミダイト
法に従って化学合成した。

化学合成した４本のＤＮＡの５′末端をリン酸化した後
、アニールし、これをあらかじめＢａｍＨｌおよびＸｈ
ｏ　Ｉで切断した後、アルカリホスファターゼ処理をし
たｐＭＥＫ２と混１合し、　Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを利
用して化学合成りＮＡとベクターの結合を行わせた。こ
のような反応は、いずれも、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ−ｕ
ａｌ”（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ、　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

ｅｄｓ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　（１９Ｂ２）。

以下９文献１と呼ぶ。）に記載している方法に従って行
った。得られた反応物を、形質転換法（ｔｒａｎｓ−ｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ、上記文献１に記載）
に従って。

大腸菌に取り込ませた。この処理をした菌体な。

５０ｍｇ／Ｉのアンピシリンナトリウムおよび２ｍｇ／
ｌのトリメトプリムを含む栄養寒天培地（培地１１中に
＋２ｇのグルコース、１８のリン酸２カリウム。

５ｇのイーストエキス、５ｇのポリペプトン、１５ｇの
寒天を含む。）上に塗布し、３７＠Ｃで２４時間培養す
ることにより、約８０のコロニーを得ることができた。

これらのコロニーから適当に１０個選び、１．５ｍｌの
ＹＴ＋Ａｐ培地（培地ｌｌ中に。

５ｇのＮａＣｌ、５ｇのイーストエキス、８ｇのトリプ
トン、５０ｍｇのアンピシリンナトリウムを含む。

）で、３７°Ｃ，１晩２面体を培養した。培養液を、各
々エッペンドルフ遠心管にとり、　１２，０００回転回
転下１０分間遠心分離し、菌体を沈澱として集めた。こ
れに＋　　０．１ｍｌの電気泳動用サンプルｙＩ製ｔｆ
ｆｌ　（０，０６２５ＭのＴｒｉｓ−ＩＩＣＩ、ｐｉｆ
　６．８．２Ｘのラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、
１０χのグリセリン。

５ｘの２−メルカプトエタノール、　０．００１Ｘのブ
ロムフェノールブルーを含む。）を加え、菌体を懸濁し
、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶かした。この
処理をしたサンプルを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法（Ｕ、に、Ｌａｍｍ１ｉ；　Ｎａｔｕｒｅ。

ｖｏｌ、２２７．　ｐ、６８０−６８５（１９７０））
に従って分析した。分子量マーカーとしてラクトアルブ
ミン（分子ｆｆ１１４．２００）、）リブシンインヒビ
ター（分子ｆｆ１２０，１００）　。

トリプシノーゲン（分子ｆｉ！２４，０００）　、カル
ボニックアンヒドラーゼ（分子ｆｆ１２９，０００）　
、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分
子ｆｆ１３６，０００）、卵アルブミン（分子ｆｉ４５
，０００）　、および牛血清アルブミン（分子ｆｆ１６
６．０００）を含むサンプルをポリアクリルアミド濃度
のｌＯから２０％濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、
１０個のコロニーのうち、８個では分子量が大きくなっ
たタンパク質（分子爪駒２３，０００と推定される。）
を新たに大量に生産していることが明かとなった。デン
シトメーターで分析することにより、新たに現れたタン
パク質の童は菌体タンパク質の約２０％であることが推
定された。分子量の大きい新たなタンパク質を生産する
コロニーのうちから適当に一つ選び、これをＹＴ＝−Ｐ
Ａｐ培地で培養し、ＴａｎａｋａとＷｅｉｓ−ｂｌｕｍ
の方法（Ｔ、Ｔａｎａｋａ、　Ｂ、Ｗｅｉｓｂｌｕｍ；
　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ−Ｉｏｇｙ、　ｖｏｌ、１２１
．ｐ、３５４（１９７５））に従って、プラスミドを調
製した。得られたプラスミドをｐＰＲＬｌ−１３と名づ
けた。

ｐＰＲＬｌ−１３は、ｐＭＥＫ２のＢａｍＨＩとＸｈｏ
１部位の間の配列が合成りＮＡ由来の配列と置き換わっ
ているはずである。ｐＰＲＬｌ−１３をＥｃｏＲＩと５
ａｌｌによる切断によって得られる約４００ヌクレオチ
ド長のＤＮＡについて（この部分はＢａｍＨＩとＸｈｏ
　１部位を含む）、Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ
法（Ｊ、Ｍｅｓｓ−ｉｎｇ；Ｍｅｈｔｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏ！、１０１．ｐ、２０（１
９８３））に従って塩基配列を決定した。その結果、目
的としたプラスミドであることが明らかにされた。

ＰＲＬＩ−１３は、第１図の５７９番目から１１９６１
９６番目だの配列が、５’　−ＴＡＡＣ−３′に置き換
わった配列をしており、４６６４塩基対の大きさの組換
えプラスミドであることが明かとなった。

実施例２ ｐＰＲＬｈ４の作製 ＰＲＬを暗号化する遺伝子として、ｐｈｐＲＬ７８（増
田直樹ら、生化学、ｖｏｌ　、５６．ｐ１０１８（１９
８４））を、ＨｉｎｄｌＩＩで切断したあと、ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて切断部分を平滑化した後、ＢｓｔＥ
■で切断して得られる約０．６キロ塩基対のＤＮＡ断片
（第１図の５７２番目から、１１９６１９６番目に相当
）を用いた。このＤＮＡ断片を組み込むプラスミドとし
ては、ｐＰＲＬｌ−１３をＸｈｏｌて切断した後、ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて切断部分を平滑化した後、Ｂｓ
ｔＥＩＩで切断して得られる約４．６キロ塩基対のＤＮ
Ａ断片を用いた。両者を、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用い
て結合し、実施例と同様にして大腸菌に形質転換し。

組換え体の迅択を行い１分子量約４２，０００の新たな
タンパク質を大量に（菌体タンパク質の約２０％）つく
る組換え体を２個分離した。そのうちから適当に１個選
び、プラスミドを分離し、これをｐＰＲＬｈ４ど名づけ
た。得られたプラスミドを再び大腸菌に導入したところ
、ｐＰＲＬｈ４とまったく同じ性質を有する形質転換株
が、１０５〜１０６／７１ｇプラスミドＤＮＡの頻度で
得られた。このことは、ｐＰＲＬｈ４の性質が安定して
いることを示している。また、ｐＰＲＬｂ４が大腸菌菌
体内で安定に複製されることを示している。

ｐＰＲＬｈ４は、ｐＰＲＬｌ−１３のＢｓ　ｔＥ■とＸ
ｈｏ１部位の開の配列にＰＲＬ遺伝子由来の配列が導入
されているはずである。第１図に示される４７１番目の
ＥｃｏＲ１部位から１５００５００番目Ｉ１部位の間の
約１キロ塩基対のＤＮＡについて２Ｍ１３フアージを用
いたジデオキシ法（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ；Ｍｅｈｔｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１０１゜
ρ、２０（＋９８３））に従って塩基配列を決定した。

その結果、第１図に示す全塩基配列の４７１番目から１
５００５００番目が明らかにされた。ｐＰＲＬｌ−１３
のＥｃｏＲＩとＳａＩ切断によって得られる約４．２キ
ロ塩基対の配列はｐＭＥＫ２のそれと全く同一であり、
またｐＭＥＫ２の全塩基配列は２本発明者らによって明
らかにされている（特許　昭６３−７９６８０に記載）
。ｐＰＲＬｈ４のＥｃ　ｏＲｌ−５ａ　Ｉ　Ｉ切断によ
って得られる約４．２キロ塩基対のＤＮＡは、ＰｓｔＩ
、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ、Ｈｐａｌ、Ａａｔｌｌ、Ｐｖｕｌｌ
、ＢｇｌＩＩ。

およびＣ１ａＩを用いた制限酵素による切断実験の結果
、ｐＭＥＫ２のＥｃｏＲｌ−５ａ　１１切断によって得
られる約４．２キロ塩基対のＤＮＡと全く同一であるこ
とが示された。

以上の結果から、ｐＰＲＬｈ４の全塩基配列が第１図に
示した配列であることが示された。

［発明の効果］ 上記のように、新規組換えプラスミドｐＰＲＬｈ４は、
ＤＨＦＲ−ＰＲＬを暗号化しており、かつ、ｐＰＲＬｈ
４を有する大Ｊｌｉ菌は、ＤＨＦＲ−ＰＲＬを大量に蓄
積生産する。さらに、生成したＤ　ＨＦ　Ｒ−Ｐ　ＲＬ
は、ＤＨＦＲ酵素活性を示し。

精製を容易に行うことができると考えらる。このような
性質を有することから２本発明の新規組換えプラスミド
ｐＰＲＬｈ４とそれを有する大腸菌は、ＤＨＦＲ−ＰＲ
Ｌの生産、および、それを利用したＰＲＬの生産に有益
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＰＲＬｈ４の全塩基配列を示した図であり
、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、５′
末端から３′末端の方向に記述している。図中符号は、
核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇ
はグアニンを、Ｔはチミンを示している。図中番号は、
ｐＰＲＬｈ４に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａｌ切断認
識部位のうちＤＨＦＲ遺伝子の上流に存在する方のＣ１
ａｌ切断認識部位の、５’　−ＡＴＣＧＡＴ　　３’の
最初の”Ａ”を１番として数えた番号を示している。 第２図は、ｐＰＲＬｈ４中に存在するＤＨＦＲ−ＰＲＬ
を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ
酸配列を示す図である。図中符号は、核酸塩基およびア
ミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇは
グアニンを、Ｔはチミンを、Ａｌ　ａはアラニンを、Ａ
ｒｇはアルギニンを、Ａｓｎはアスパラギンを、Ａｓｐ
はアスパラギン酸を、Ｃｙｓはシスティンを、Ｇｌｎは
グルタミンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を、Ｇｌｙはグリ
シンを、１（ｉｓはヒスチジンを、Ｉｌｅはイソロイシ
ンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｍｅｔ
はメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ｐｒｏ
はプロリンを、Ｓｅｔはセリンを、Ｔｈｒはトレオニン
を、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔｙｒはチロシンを、
Ｖａｌはバリンを示している。図中番号は、１番目のア
ミノ酸であるメチオニンを暗合化するＡＴＧコドンのＡ
”を１番として数えた番号を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
   にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
   ことができ、第１図において示されるＤＮＡ配列を有す
   る新規組換えプラスミドｐＰＲＬｈ４。 ２、特許請求範囲第１項記載の新規組換えプラスミドｐ
   ＰＲＬｈ４を含有する大腸菌。