JPH02255697A - 融合タンパク質の分離精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、
ＤＨＦＲと略す。）遺伝子を改変した遺伝子（７）３’
末端側に遺伝暗号の読み取り枠を合うようにして異種遺
伝子を結合し作製した融合遺伝子の大腸菌内での発現の
結果得られる組換え融合タンパク質のうち、大腸菌菌体
内に不溶性タンパク質として発現蓄積する融合タンパク
質の可溶化及び可溶化したタンパク質の高度精製方法に
関するものである。本発明の組換えタンパク質の分離精
製方法の利用分野としては、微生物工業２発酵工業、医
薬品製造の分野に好適である。

［従来の技術および問題点］ 本発明は２組換えＤＮＡ技術により大腸菌菌体内に不溶
化状態で発現したＤＨＦＲをアミノ末端側に有する組換
えタンパク質の分離精製方法に間する。

分子量の小さいポリペプチドとか大腸菌菌体内で安定な
高次構造をとらないタンパク質などの生産を試みる場合
、それ自身を暗号化する遺伝子を効率よく発現するだけ
では、菌体内に存在するタンパク質分解酵素などの働き
により作られると同時に分解がおこり、目的ポリペプチ
ドもしくはタンパク質を大量に菌体内に蓄積・生産させ
ることができない。このことを避けるために、大腸菌で
安定に発現・蓄積するタンパク質との融合タンノ＼り質
として発現・生産することが行われている。

不安定なポリペプチドもしくはタンパク質の安定生産の
ために用いられるタンパク質として、既に。

本発明者らは、枯草菌及び大腸菌由来のＤＨＦＲを利用
する方法を開発している（特開昭６３−８７９８１、特
開昭６３−１０２６９６．特開昭６３−２６７２７６、
特開昭６３−２４５６７９゜特開昭６３−２４５６８０
．特願昭６２−０８５４０６、特開昭６３−２５８５９
７．特願昭６２−３０２１５４．特願昭６２−３０２１
５５．特願昭８２−３０２１５６など）。ＤＨＦＲ以外
のタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ（に。

ｔａｋｕｒａ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　
ｖｏｌ、１９８．１０５６（１９７７））＊トリプトフ
ァン合成酵素（Ｋ、Ｎａｇａｈａｒｉ、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ａｇｒｉｃ、Ｂ　ｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、、ｖｏｌ　
、５１．８４５（１９８７））＋大成長ホルモン（Ｍ、
１ｋｅｈａｒａ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　ｖｏｌ、８３．４６
９５（１９８６戸などの利用が公知テアル。

ＤＨＦＲを利用する異種ポリペプチドもしくはタンパク
質の安定生産方法は、ＤＨＦＲとの融合タンパク質が大
腸菌菌体内でＤＨＰＲ酵素活性を有する可溶性タンパク
質として蓄積・生産することから、ＤＨＦＲ以外のタン
パク質との融合による安定生産方法に比較して、融合タ
ンパク質の分離精製などの点で優れた方法であった。

しかしながら、ＤＨＦＲと融合させるポリペプチドもし
くはタンパク質を種々変化させると、ある種のポリペプ
チドもしくはタンパク質（本明細書では、成長ホルモン
放出因子誘導体と人プロラクチンに関して例示している
。）をカルボキシ末端側に有するＤＨＦＲ融合タンパク
質が不溶化タンパク質として蓄積することが明かになり
、このことが目的融合タンパク質の分離精製の上で大き
な問題として考えられた。

大腸菌で異種タンパク質を発現させた場合の不溶化に間
しては、多くの例が知られており（Ｆ、Ａ。

０、Ｍａｒｓｔｏｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　Ｖｏｌ
、２４０，１（１９８６））？目的タンパク質の分離精
製に関しては、不溶化したタンパク質を尿素などのタン
パク質の変性剤で可溶化し、その後変性剤存在下で精製
する方法が行われている。しかしながら、変性剤存在下
の精製方法は適用できる方法が限定されることラ　また
変性剤存在下では、目的タンパク質の生理活性が不活性
化され精製途中における目的タンパク質の同定。

検出に大きな問題が生じている。

［発明の目的コ このような背景に鑑み９本発明者は、不溶化タンパク質
として大腸菌菌体内に発現・蓄積したＤＨＦＲ融合タン
パク質の可溶化及び高度精製方法を確立することを目的
に、鋭意研究を行い、　ＤＨＦＲ融合タンパク質の不溶
化発現条件を明らかにすると共に、不溶化したタンパク
質の可溶化条件。

活性化方法、及びＤＨＦＲの特異的阻害剤であるメソト
リキセートを結合したアフイニイテイ力ラムの利用条件
を明かにし本発明を完成させた。

［発明の構成コ 本発明の組換えタンパク質の分離精製方法は。

ＤＨＦＲのカルボキシ末端側にポリペプチドもしくはタ
ンパク質を結合させた融合タンパク質を暗号化する遺伝
子の発現により２Ｍ体内に不溶性のタンパク質として蓄
積した融合タンパク質の分離精製方法に限定される。Ｄ
ＨＦＲ融合タ融合タンパ土質化タンパク質として発現生
産する菌体としては２本発明者らが既に発明している２
組換えプラスミドｐｓＧ１−１２を含有する大腸菌（微
工研にＦＥＲＭＢＰ−２１４９として寄託、特願昭６３
−２９３３８９に記載）、絹換えプラスミドｐＧＲＦ４
４−２２を含有する大腸菌（微工研にＦＥＲＭＢＰ−２
１５２として寄託、特願昭６３−２９４２０３に記載）
２組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４−６を含有する大腸
菌（微工研にＦＥＲＭＢＰ−２１５１として寄託、特願
昭６３−２９４２０４に記載）、Ｍ換えプラスミドｐＰ
ＲＬｈ４を含有する大ＩＩＩ菌（微工研にＦ　Ｅ　ＲＭ
Ｂ　Ｐ　−２１５３として寄託９．特願昭６３−２９６
９１３に記載）などがあるが９本発明はこれらの菌体に
限定されるものではない。

本発明は、■菌体の培養方法、■菌体からの不溶化タン
パク質の分離方法、■不溶化タンパク質の可溶化の方法
、■可溶化したタンパク質の高度精製方法より構成され
る。以下、順に構成内容を説明する。

■菌体の培養方法 ＤＨ，ＦＲ融融合タンパクジ不溶性のタンパク質として
発現蓄積する場合、培養温度により不溶化状態で蓄積す
るタンパク質と不溶化しないタンパク質との割合が変化
する。不溶化の割合は、培養温度を高めるにしたがって
高まる。従って、培養温度としては、菌体が生育できる
温度のうち最も高温側（通常３７℃から４２℃）が望ま
しい。不溶化タンパク質の割合は、培養菌体を、破砕後
。

５０００から１０，０００回転回転下１０から２０分間
の遠心分離により沈澱と上溝画分に分け。

これと全菌体タンパク質とをそれぞれ５ＤＳ−ポリアク
リルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）後、ク
マジーブリリアントブルーでの染色パターンから目的タ
ンパク質バンドの染色度をデンシトメーターにより求め
比較することにより測定することができる。

ＤＨＦＲ融合タ融合タンパ土質化タンパク質（以下、不
溶化融合タンパク質と略す）を発現生産する菌体の培養
は、ＹＴ＋Ａｐ培地（培地ｌｌ中に、５ｇのＮａＣ１，
５ｇの酵母エキス、８ｇのトリプトン、及び５０　ｍ　
ｇのアンピシリンナトリウムを含む液体培地）で培養す
ることができる。

培地としては、この他にＳＴ＋Ａｐ培地（培地ｌｌ中に
、２ｇのグルコースｔ１ｇのリン酸２カリウム、５ｇの
ポリペプトン、５ｇのイーストエキスおよび５０　ｍ　
ｇのアンピシリンナトリウムを含む液体培地。）など、
菌体が成長する培地であれば、どの様な培地でも用いる
ことができるが、調べた限りでは、ＤＨＦＲ融合タ融合
タンパ土質にはＹＴ＋Ａｐ培地が最適であった。

不溶化タンパク質を発現生産するを含有する大腸菌を、
培地に接種し９通常３７℃で対数成長期の後期もしくは
定常期まで培養する。培養した面体は、５０００回転／
回転速心分離により集める。

培地１１より湿重量２から５ｇの菌体が得られる。

集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
（０から１０℃の間、４℃が望ましい）で行う。

■菌体からの不溶化融合タンパク質の分離培養して得ら
れた菌体の破砕は、フレンチプレスを用いる方法、音波
破砕法、ガラスピーズを用いる法等２Ｍ体を破砕するこ
とができる方法であればどの様な方法でも適用できる。

ここでは、フレンチプレスを用いる方法を記載するが本
発明は菌体の破砕方法には限定されない。

湿重量の２倍の緩衝液１　（０，１ｍ、Ｍ　　エチレン
ジアミン４酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液、ｐＨ７，０）に懸濁し、フレンチプレスを用
いて菌体を破砕する。菌体破砕液を、５，０００から１
０，０００回転で１０分間遠心分離し沈澱を得る。得ら
れた沈澱を洗浄する目的で、緩衝液１に懸濁し、５，０
００から１０゜０００回転回転下１０分間遠心分離し沈
澱を得る（沈澱の洗浄）、この洗浄の操作を２ないし３
回繰り返す。得られたタンパク質画分を不溶化画分と称
する。

この操作により、不溶化融合タンパク質の純度が約５０
から９０％程度になる。

■不溶化融合タンパク質の可溶化の方法。

不溶化タンパク質の可溶化の方法としては、（１）酢酸
を用いる方法、（■）タンパク質の変性剤を用いる方法
が有効である。

（Ｉ）酢酸を用いる方法 不溶化画分を、用いた面体の湿重量のグラム数と同容量
（ｍｌ）の酢酸水溶液に溶解する。酢酸に不溶の物質を
遠心分離により取り除く。得られた上溝を酢酸可溶化画
分と称する。用いる酢酸水溶液の濃度は、１５から３０
％の間が効果的である。この操作により、目的融合タン
パク質の純度が、約９０％以上に高まる。

（ｎ）タンパク質の変性剤を用いる方法タンパク質の変
性剤としては、尿素もしくは塩酸グアニジンについて記
載するが、不溶化融合タンパク質を可溶化することがで
きる変性剤で且つタンパク質のアミノ酸残基に２例えば
、側鎖の修飾などの悪影響を及ぼさない物であれば利用
可能であり２本発明は、用いられるタンパク質の変性剤
には限定されない。

不溶化画分を用いた菌体の湿重量のグラム数と同量の尿
素水溶液もしくは塩酸グアニジン水溶液に溶解する。尿
素もしくは塩酸グアニジンに不溶の物質を遠心分離によ
り取り除く。得られた上清をそれぞれ尿素可溶化画分お
よび塩酸グアニジン可溶化画分と称する。用いる尿素の
濃度は４Ｍ以上、また塩酸グアニジンは３Ｍ以上が効果
的である。この操作により、目的融合タンパク質の純度
が、約８０％以上に高まる。

■可溶化した融合タンパク質の高度精製方法（Ｉ）酢酸
を用いて可溶化した融合タンパク質酢酸可溶化画分を、
逆相系の担体を用いて高速液体クロマトグラフィー（以
下、ＨＰＬＣと略す）で分離精製する。逆相系の担体と
しては、オクチル基を導入したシリカゲル担体が効果的
であり。

０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡと略す）中。

アセトニトリルの１５％から５０％の濃度勾配をかける
ことにより溶出させ、２８０ｎｍの吸収を調べることに
より溶出位置を知ることができる。

このような条件でも、可溶化した融合タンパク質は２部
分的にＤＨＦＲ活性を有し、溶出画分中の目的融合タン
パク質を確認することができる。目的融合タンパク質は
、アセトニトリルの濃度４５から４８％の間に溶出され
る。この操作により。

目的融合タンパク質は、完全に純化することができる。

この操作で用いられるＨＰＬＣ装置としては２種々の物
が利用できる。実施例では、高滓ＬＣ−４Ａ型ＨＰＬＣ
装置を用いているが２本発明は、用いられるＨＰＬＣ装
置には限定されない。

また、逆相系の担体として、ガスクロ工業製の１ｎｅｒ
ｔｓｉ　ｌ−０ＤＳカラムを用いているが、オクチル基
を導入したシリカゲル担体としては９種々のものが利用
でき、従って２本発明は、用いられる担体には限定され
ない。

（ＩＩ）タンパク質の変性剤を用いて可溶化した融合タ
ンパク質 変性剤を用いて可溶化したタンパク質画分を。

緩衝液１を用いて、１０倍以上希釈することにより、変
性状態で可溶化した融合タンパク質を再活性化すること
ができる。希釈する緩衝液としては。

緩衝液ｌについて記載しているが−ｐＨ５から８の間に
おいては、この範囲で緩衝能を有する緩衝液（リン酸緩
衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、グツド緩衝液
など）に関しては、調べた限り効果的に再活性化が達成
できた。従って２本発明は、希釈に用いられる緩衝液に
は、制限されない。

緩衝液１の希釈により再活性化された目的融合タンパク
質の高度精製は、ＤＨＰＲ活性を目安に。

メソトリキセート（以下、ＭＴＸと略す）を結合したア
フィニティクロマトグフィを用いて達成される。用いら
れるＭＴＸを結合したアガロースゲル担体は、市販品（
例えば、シグマ社で販売）を利用することができる。

緩衝液ｌの希釈により再活性化された目的融合タンパク
質溶液を、あらかじめ緩衝液１で平衡化したＭＴＸ−ア
ガロースアフィニティ力ラムに吸着させる。吸着後、Ｉ
ＭのＫＣＩを含む緩衝液１で洗う。洗いは、カラムから
の溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度が０．
１以下になるまで同ｌｌ衝液を流し続ける。酵素の溶出
は、ＩＭのｉ＜ｃｉと３ｍＭの葉酸を含む１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液、ｐＨ９，０を用いて行い、溶出液を
一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画する。

分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性を測定し、酵素活
性が含まれる画分を集める。得られた酵素液を、緩衝液
ｌに対して、３回透析する。

この操作により、目的融合タンパク質は、完全に純化す
ることができる。

なお、透析して得られる酵素液中には、透析が不完全な
場合には２葉酸が含まれており、このため、２８０ｎｍ
の吸光度を利用したタンパク質量の検定等の障害となる
ことが考えられる。そのために、ここでは、ＤＥＡＥ−
）ヨバール力ラムクロマトグラフィーの利用方法を記載
するが２本方法の使用は、融合タンパク質の分離及び高
度精製方法を限定しない。

透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液ｌで平衡化したＤ
ＥＡＥ−）ヨバール力ラムに吸着させる。

吸着後、０．１ＭのＫＣＩを含む緩衝液１で洗う。

洗いは、カラムからの溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測
定し、吸光度が０．０１以下になるまで同緩衝液を流し
続ける。酵素の溶出は、緩衝液１を用いて０．１Ｍから
０．３ＭのＫＣＩの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液
を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画する
。分画した溶出液について２８０ｎｍの吸光度とＤＨＦ
Ｒ活性を測定する。酵素活性／　２８０　ｎ　ｍの吸光
度の値が。

一定な画分を集める。この操作により、再現性良く２葉
酸を取り除くことができる。

ＤＨＰＲ酵素活性は２反応液　（０，０５ｍＭのジヒド
ロ葉酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ，１２ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ−Ｈ
７，０））を、１ｍｌのキュベツトとり、これに酵素液
を加え、３４０ｎｍの吸光度の時間変化を３０℃で測定
することにより行う。酵素１ユニツトは、上記反応条件
において。

１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに
必要な酵素量として定義する。この測定は。

分光光度計を用いて容易に行うことができる。

本発明に用いられる試薬、装置等は、特に限定して記載
した以外は９通常の市販品を利用することができる。ま
た、ここに記載した種々の操作は。

この分野の当業者であれば、なんの問題もなく再現よく
行うことができる。なお、用いられる市販の試薬品は、
特級以上の品質が要求される。

次に本発明の実施例を示す。

実施例Ｉ ＤＨＦＲ−中成長ホルモン放出因子フラグメント融合タ
ンパク質 ＤＨＦＲ−中成長ホルモン放出因子フラグメント融合タ
ンパク質は２Ｍｉ換えプラスミドｐｓＧ１−１２上に暗
号化されており、微工研寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−２１４
９の大腸菌（以下、ＢＰ−２１４９株と略す）が生産す
る融合タンパク質である。

ＢＰ−２１４９株は、ＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合、３
７℃では９０％が、また３０℃では約５０％の融合タン
パク質が不溶化するが、２０℃ではほとんど１００％が
可溶性タンパク質として菌体内に蓄積する。従って、Ｙ
Ｔ＋Ａｐ培地３１を用いて、３７℃で１６時間培養した
後、４２℃で更に１時間培養を行った。培養後、５，０
００回転７分、１０分間の遠心分離により菌体を集め。

面体を３００　ｍ　ｌの緩衝液ｌに懸濁し、再び５゜Ｏ
ＯＯ回転／分、１０分間の遠心分離を行い菌体を集めた
。その結果、湿重量１１ｇの面体が得ろれた。得られた
面体を２２ｍ１の緩衝液１に懸濁し、フレンチプレスを
用いて菌体を破砕し、得られた面体破砕液を、５，００
０回転／分、１０分間の遠心分離し、沈澱を集めた。沈
澱は、白色をしており、これを３０　ｍ　ｌの緩衝液ｌ
に懸濁し。

再び５，０００回転／分、１０分間の遠心分離を行い沈
澱を集めた。この操作を、３回繰り返した。

得られた沈澱を、１１ｍ１の１５％酢酸に溶解し。

不溶性部分を、１５，０００回転／分、１５分間の遠心
分離により沈澱として取り除き、上清を得たく約１４ｍ
１）。得られた上清を逆相ＨＰＬＣにより分離した。上
清０．５ｍ１ｔｔＨＰＬＣ装置（高滓Ｌ　Ｃ−４Ａ　、
　１ｎｅｒｔｓｉ　！−００５カラム）を用いて、０．
１％トリフルオロ酢酸中、１５％から５０％のアセトニ
トリルの濃度勾配を用いて溶出・分離することができる
。溶出物はｐ　２８０％ｍにおける吸光度を測定するこ
とにより検出することができる。試料注入後３４分に目
的の融合タンパク質のピークが得られ、そのピーク画分
を分離した。

このピーク画分はＤＨＦＲ活性を保有し、その活性はタ
ンパク質１ｍｇ当り約０．７ユニツトであった。分離し
た溶出液をエバボレーターで乾燥後。

少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除き、融合タンパク質
を得ることができた。１回のＨＰＬＣの操作により、約
０．９ｍｇの融合タンパク質が回収された（すなわち、
この操作を繰り返すことにより１９．８ｍｇの融合タン
パク質が分離できる計算になる）。得られた標品は、５
ＤＳ−ＰＡＧＥにより均一なタンパク質標品であること
が示され。

また、ブロムシアン処理することにより成長ホルモン放
出因子ペプチドフラグメントを生成することから、成長
ホルモン放出因子ペプチドフラグメント生成の原料とし
て有用であった（特許出願中）実施例２ ＤＨＦＲ−中成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク
質 ＤＨＦＲ−中成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク
質は２組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４＝６上に暗号化
されており、微工研寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−２１５１の
大腸菌（以下、ＢＰ−２１５１株と略す）が生産する融
合タンパク質である。

ＢＰ−２１５１株は、ＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合、３
７℃でほとんど全ての融合タンパク質が不溶化するが、
３０℃では約６５％が不溶化し。

２０℃ではほとんど１００％が可溶性タンパク質として
菌体内に蓄積する。従って、ＹＴ＋Ａｌ培地３１を用い
て、３７℃で１６時間培養を行った。

培養後、５，０００回転／分、ｌＯ分間の遠心分離によ
り菌体を集め、菌体を３００ｍ１の緩衝液ｌに懸濁し、
再び５，０００回転／分、１０分間の遠心分離を行い菌
体を集めた。その結果、湿重量１３ｇの面体が得られた
。得られた菌体を２６ｍ１の緩衝液１に懸濁し、フレン
チプレスを用いて菌体を破砕し、得られた菌体破砕液を
、５．ＯＯＯ回転／分、１０分間の遠心分離し、沈澱を
集めた。沈澱は、白色をしており、これを３０ｍ１の緩
衝液１に懸濁し、再びδ、０００回転／分。

１０分間の遠心分離を行い沈澱を集めた。この操作を、
３回繰り返した。得られた沈澱を、１４ｍ１の４Ｍ尿素
を含む緩衝液１に溶解し、不溶性部分を、１５，０００
回転／分、１５分間の遠心分離により沈澱として取り除
き、上清を得た（約１４ｍ１）、上清に、１０倍量（１
４０ｍｌ）の緩衝液１を加え希釈した。希釈した溶液中
には、９３０ユニツトのＤＨＦＲ活性が含まれていた。

これに１０ｇのあらかじめ緩衝液１で平衡化したＭＴＸ
−アガロースゲルを加え、−晩緩やかに攪はんしながら
一晩放置し、！に合タンパク質をＭＴＸアガロースゲル
に吸着させた。この操作をしたゲルをカラムにつめ、上
澄み液をカラムに通した後。

１ＭのＫＣＩを含む緩衝液ｌで洗った。洗いは。

カラムからの溶出液の２８０．ｎｍの吸光度を測定し、
吸光度が０．１以下になるまで同緩衝液を流し続けた（
約１５０ｍ１）。酵素の溶出は、ＩＭのＫＣＩと３ｍＭ
の葉酸を含む１０ｍＭリン酸力、リウム緩衝液、ｐＨ９
，０を用いて行い、溶出液を一定量（約５　ｍ　ｌ　）
をフラクションコレクターを用いて分画した。分画した
溶出液についてＤＨＰＲ活性を測定し、酵素活性が含ま
れる画分を集めた（約２５ｍ１）。得られた酵素液を、
緩衝液ｌに対して、３回透析した。透析した標品を、５
ＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ、均一なタンパク質標品
であることが示された。この標品は、５０２ユニツトの
ＤＨＦＲ活性（回収率５４％）、また約２０　ｍ　ｇの
融合タンパク質を含んでいた。

実施例３ ＤＨＦＲ−プロラクチン融合タンパク質ＤＨＦＲ−プロ
ラクチン融合タンパク質は２組換えプラスミドｐＰＲＬ
ｈ４上に暗号化されており、＠工研寄託番号ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２１５３の大腸菌（以下、ＢＰ−２１５３株と略す
）が生産する融合タンパク質である。

ＢＰ−２１５３株は、ＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合、３
７℃で約７０％が不溶化し、３０℃では約９０％以上が
可溶性タンパク質として菌体内に３７℃で１６時間培養
した後、４２℃で更に２時間培養を行った。培養後、５
，０００回転／分。

１０分間の遠心分離により菌体を集め、菌体を３００　
ｍ　ｌの緩衝液１に懸濁し、再び５，０００回転／分、
１０分間の遠心分離を行い菌体を集めた。

その結果、湿重量１０ｇの面体が得られた。得られた面
体を２０ｍ１の緩衝液１に！！！！濁し、フレンチプレ
スを用いて菌体を破砕し、得られた面体破砕液を、５，
０００回転／分、１０分間の遠心分離し、沈澱を集めた
。沈澱は、白色をしており。

これを３０ｍ１の緩衝液ｌに懸濁し、再び５，０００回
転７分、１０分間の遠心分離を行い沈澱を集めた。この
操作を、３回繰り返した。得られた沈澱を、１０ｍ１の
３Ｍ塩酸グアニジンを含む緩衝液ｌに溶解し、不溶性部
分を、１５，０００回転／分、１５分間の遠心分離によ
り沈澱として取り除き、上清を得た（約１０ｍ１）。上
溝に、１０倍量（１００ｍｌ）の緩衝液１を加え希釈し
た。

希釈した溶液中には、６８０ユニツトのＤＨＦＲ活性が
含まれていた。これに１０ｇのあらかじめ緩衝液ｌで平
衡化したＭＴＸ−アガロースゲルを加え、−晩緩やかに
攪はんしながら一晩放置し。

融合タンパク質をＭＴＸアガロースゲルに吸着させた。

この操作をしたゲルをカラムにつめ、上澄み液をカラム
に通した後、ＩＭのＫＣＩを含む緩衝液１で洗った。洗
いは、カラムからの溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定
し、吸光度が０．１以下になるまで同瑳衝液を流し続け
たく約１５０ｍ１）。酵素の溶出は、ＩＭのＫＣＩと３
ｍＭの葉酸を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、　ｐ
Ｈ９゜０を用いて行い、溶出液を一定量（約５　ｍ　ｌ
　）をフラクションコレクターを用いて分画した。分画
した溶出液についてＤＨＦＲ活性を測定し、酵素活性が
含まれる画分を集めたく約２５　ｍ　ｌ　）。得られた
酵素液を、緩衝液１に対して、３回透析した。透析した
標品を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ’ｔ’調べたところ、均一な
タンパク賀標品であることが示された。この標品は、４
５０ユニツトのＤＨＦＲ活性（回収率６６％）、また約
２３　ｍ　ｇの融合タンパク質を含んでいた。

［発明の効果］ 本発明に従えば、不溶性となったＤＨＦＲとの融合タン
パク質の可溶化が達成されるだけでなく。

融合タンパク質のアミノ末端領域のＤＨＦＲ酵素部分の
活性化が達成され、可溶化したタンパク質の高度精製均
一化が容易となった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素のカルボキシ末端側
   に異種タンパク質を結合させた融合タンパク質を暗号化
   する遺伝子の発現により、大腸菌の細胞内に不溶性のタ
   ンパク質として蓄積した融合タンパク質の分離精製方法
   において、不溶性タンパク質を発現生産する大腸菌菌体
   を破砕後、遠心分離して得られる沈澱画分を酢酸で可溶
   化し、可溶化した融合タンパク質を逆相高速液体クロマ
   トグラフィーにより高度に精製することを特徴とするタ
   ンパク質の分離精製方法。 ２、大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素のカルボキシ末端側
   に異種タンパク質を結合させた融合タンパク質を暗号化
   する遺伝子の発現により、大腸菌の細胞内に不溶性のタ
   ンパク質として蓄積した融合タンパク質の分離精製方法
   において、不溶性タンパク質を発現生産する大腸菌菌体
   を破砕後、遠心分離して得られる沈澱画分をタンパク質
   の変性剤で可溶化し、可溶化した融合タンパク質を緩衝
   液で希釈することによりジヒドロ葉酸還元酵素を活性化
   し、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を目安にメソトリキセー
   ト結合アフィニティクロマトグラフィにより融合タンパ
   ク質を高度に精製することを特徴とするタンパク質の分
   離精製方法。 ３、特許請求の範囲第２項記載のタンパク質の分離精製
   方法において、変性剤として尿素を用いることを特徴と
   するタンパク質の分離精製方法。 ４、特許請求の範囲第２項記載のタンパク質の分離精製
   方法において、変性剤として塩酸グアニジンを用いるこ
   とを特徴とするタンパク質の分離精製方法。