KR20020014459A - 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법 - Google Patents

양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20020014459A
KR20020014459A KR1020000047768A KR20000047768A KR20020014459A KR 20020014459 A KR20020014459 A KR 20020014459A KR 1020000047768 A KR1020000047768 A KR 1020000047768A KR 20000047768 A KR20000047768 A KR 20000047768A KR 20020014459 A KR20020014459 A KR 20020014459A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
fusion protein
enzyme
fusion
refolding
Prior art date
Application number
KR1020000047768A
Other languages
English (en)
Inventor
권대혁
한남수
라찬수
서진호
Original Assignee
서진호
정수련
주식회사 바이오앤진
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서진호, 정수련, 주식회사 바이오앤진 filed Critical 서진호
Priority to KR1020000047768A priority Critical patent/KR20020014459A/ko
Priority to PCT/KR2001/001394 priority patent/WO2002018447A1/en
Priority to KR1020037002004A priority patent/KR20030034136A/ko
Priority to AU2001280223A priority patent/AU2001280223A1/en
Publication of KR20020014459A publication Critical patent/KR20020014459A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/1074—Cyclomaltodextrin glucanotransferase (2.4.1.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif

Abstract

본 발명은 단백질의 정제, 고정화 및 재접힘 공정의 효율을 증대시킬 수 있는 융합단백질 및 이를 이용한 단백질의 정제방법, 단백질 고정화, 재접힘에 관한 것으로, 목적단백질에 양이온성 아미노산인 리신, 아르기닌 또는 이들의 혼합물 8개 이상을 연속적으로 융합시킨 융합단백질을 사용할 경우 단백질의 정제효율, 고정화 및 재접힘 공정효율을 증대시킬 수 있다.

Description

양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한 생물공정의 개선방법{FUSION PROTEIN CONTAINING ADDITIONAL CATIONIC AMINO ACIDS AND IMPROVEMENT OF BIO-OPERATION BY USING SAME}
본 발명은 단백질의 정제, 고정화 및 재접힘 효율을 증대시킬 수 있는 양이온성 융합유전자, 이를 코드하는 융합단백질, 상기 융합유전자를 발현하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양액으로부터 양이온성 융합단백질을 정제하는 방법, 상기 융합 단백질의 고정화 및 상기 융합 단백질의 재접힘(refolding)에 관한 것이다.
의약 및 산업적으로 유용한 단백질을 대량으로 생산하기 위한 목적으로 유전자 재조합 기술을 이용한 재조합 미생물이 널리 사용되고 있으며, 숙주세포로는 대장균을 비롯하여 고초균, 효모 등이 사용되고 있다. 단백질의 생산을 위한 발효 공정 후에는 이들의 세포내 단백질로부터 목적 단백질을 회수하는 정제 과정을 거쳐야 하는데 재래적인 정제 방법은 전하, 용해도, 크기, 소수성 그리고 특이 구조에 의한 친화도 등을 이용하였다. 이 때 각각의 단계들은 상황에 따라 알맞게 최적화되어야 하며 정제 수율은 수많은 공정들을 거치며 현격히 떨어지게 된다. 그러나 융합 단백질을 사용할 경우 이미 존재하는 분리 방법에 맞게 목적 산물만을 치환하면 된다. 즉, 친화도 또는 정제 '태그(tag)'를 재조합 단백질에 붙임으로써 융합된 태그의 특성을 분리, 정제에 이용할 수 있다. 또한 융합단백질은 분리정제 목적 외에도 목적단백질의 검출, 목적단백질의 용해도를 향상시켜 가용성 단백질로 생산, 의약용 단백질을 항체와 결합하여 항원이 존재하는 세포에 특이적으로 운반, 목적단백질의 세포내의 위치 및 발현 정도의 간접적인 확인 등에 응용할 수 있다. 결과적으로 단백질의 물리 화학적인 특성을 바꿈으로써 다양한 응용을 할 수 있게 하는 것이다. 단백질의 정제 및 확인 목적으로 사용되는 태그(tag)에는 폴리히스티딘, FLAG 펩티드, 스트렙-태그(strep-tag), 폴리아스파트산, 폴리페닐알라닌, 폴리시트테인, 칼모듈린-결합 펩티드, 녹색 형광 펩티드 등이 사용되고 있으며, 이중 일부는 상업적으로 판매되고 있다. 특히 폴리히스티딘 태그(Novagen, USA)는 실험실 수준에서 널리 이용되고 있으나 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)라는 방법을 사용해야 하므로 고가의 담체를 요구하는 문제점이 있다.
한편, 고정화 효소의 제조방법은 다양하지만 일반적으로 사용되는 방법은 담체와 단백질을 공유결합시키는 방법이다. 이 방법은 운전중 효소가 매우 안정적으로 유지되지만, 효소 고정화 반응시 화학반응기와 기능기를 가진 담체를 사용함으로써 부가적인 재료비가 요구되고, 화학 폐기물의 별도처리가 필요할 뿐만 아니라 고정화를 위한 화학 반응시 효소가 상당 부분 실활된다는 단점을 가지고 있다. 손상을 입지 않은 효소 또한 다양한 방향성을 가지고 고정화되기 때문에 활성부위가 담체에 가려지는 등 부가적으로 효소의 이용효율을 떨어뜨리는 작용이 있어서 전체적으로는 높은 제조원가가 요구된다. 일반적으로 고정화 방법 중 가장 낮은 비용이 요구되는 흡착법은 단백질 자체가 가진 하전을 이용하여 반대되는 하전을 가진 담체에 정전기적으로 흡착시키는 방법인데 이 방법은 효소가 담체로부터 떨어져 용액중으로 흘러나오는 유출이 심하다는 단점을 가지고 있으며 주변 환경의 작은 변화에도 유출이 더욱 커진다는 문제점이 있다.
한편, 미생물을 이용한 재조합 단백질의 대량생산시 가장 큰 문제 중의 하나가 단백질의 3차 구조와 관련된 것이다. 생산된 단백질이 올바른 3차 구조를 가지지 못하고 불활성 응집체를 이루어 침전한 것을 내포체(inclusion body)라 하는데, 이는 많은 재조합 단백질 발현에서 발견되는 현상이다. 대장균은 유전적으로 가장 잘 알려져 있고, 발현벡터가 다양하게 개발되어 있으며, 대량 생산을 위한 고농도 세포배양기술 또한 잘 개발되어 있어서 재조합 단백질 생산시 가장 많이 이용되는 세포이다. 그러나 재조합 대장균은 단백질의 분비 능력이 크게 떨어져서 내포체 생성의 문제가 심각하다. 따라서 내포체 형태로 발현되는 재조합 단백질을 활성을 가진 단백질로 회수하는 재접힘(refolding) 기술이 잘 발전되어 있다. 재접힘 공정은 변성제(denaturant)를 이용한 내포체의 가용화 단계와 단백질의 올바른 접힘 유도를 위한 변성제 제거 공정으로 구성된다. 재접힘 기술은 변성제의 제거 방법에 따라 단순 희석, 단계적 희석, 유가식 희석, 투석, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법이 사용된다. 변성제의 제거 중 단백질의 재침전을 막기 위한 기술로는 역상 미셀을 이용하는 방법, 폴리에틸렌글리콜 등의 첨가제를 사용하는 방법, 아르기닌 등의 작은 분자상 첨가물을 사용하는 방법, 샤페론을 첨가하는 방법 등이 이용되고 있다. 재래의 재접힘 방법의 가장 큰 문제점은 그 효율이 낮을 뿐만 아니라 매우 저농도의 단백질 농도에서만 적용 가능하다는 것이었다. 이는 단백질의 접힘 중간체가 소수성 부위가 노출된 상태로 존재하기 때문이며, 고농도에서는 이 접힘 중간체들간에 소수성 결합을 이루는 빈도가 높아져서 재침전이 일어나게 되는 것이다. 일반적으로 재접힘 공정은 접힘 중간체간의 소수성 결합에 의한 재침전을 줄이기 위해 단백질 농도 100 ㎎/ℓ 이하의 매우 희석된 용액에서 시행한다. 따라서 재래의 재접힘 공정은 그 수율이 낮을 뿐만 아니라 공정에서 처리해야 하는 부피가 매우 크고 농축 공정을 요구하므로 재조합 단백질 생산 및 정제비용의 매우 높은 부분을 차지한다.
전하를 띤 아미노산을 단백질에 융합시킨 융합단백질을 이용한 정제법은 글라츠(Glatz) 교수 등에 의해 이미 보고된 바 있으나 음이온성 아미노산을 융합에 이용하였다. 이들은 정제시 간편한 크로마토그래피법이 아닌 고분자 전해질 침전법을 이용하였는데(Zhao et al.,J. Biotechnol.,147, 273-284(1990)), 이는 크로마토그래피법으로는 높은 정제도를 얻을 수 없었기 때문으로 사료된다. 또한 양이온성인 아르기닌산을 정제에 사용하거나(Brewer, et al.,Trends Biotechnol,3, 119-122(1985)), 아스파트산을 효소의 고정화에 사용하였으며(Heng, et at.,Biotechnology and Bioengineering,44, 745-752(1994); Suominen, et al.,Biotechnol. Prog., 10 , 237-245(1994); 및Enzyme Microb. Technol.,15, 593-600(1993)), 아르기닌산을 고정화효소 및 재접힘에 사용한 바 있다(Stempfer, et al.,Nature Biotehcnology,14, 451-484(1996);Nature Biotechnology,14, 329-334(1996)). 이렇게 시도되어진 각각의 아이디어들은 나름대로의 장점을 가지고 있음에도 불구하고 현재 산업적으로 뿐만 아니라 연구용으로도 이용되고 있지 않다. 이는 첫째, 정제에 있어서 그 방법이 단순하지 않고 이를 통해 얻어진 단백질의 정제도가 기대에 미치지 못하기 때문임을 가장 큰 이유로 들 수 있는데, 본 발명에서는 아미노산의 종류 및 그 중합도가 정제도에 미치는 영향을 면밀히 관찰함으로써 매우 간편하면서도 정제도를 획기적으로 증대시킬 수 있는 방법을 고안할 수 있었다. 둘째, 상기의 일부 실험에서는 헤파린(heparin)이라는 고가의 물질이 결합된 수지를 이용함으로써 비용을 증가시키는 요소가 존재할 뿐만 아니라 일반적인 응용성을 떨어뜨리는 원인이 되었다. 셋째, 생물공정에의 응용성이 한정되어 있었기 때문인데, 본 발명에서는 정제, 고정화, 재접힘 등의 다양한 생물공정에서 모두 사용할 수 있는 시스템을 개발함으로써 그 응용의 폭을 크게 넓힐 수 있었으며, 이로 인한 경제적인 효율성을 제고할 수 있었다. 특히 본 발명을 이용하여서는 여러 가지 생물공정의 재조합을 통하여 그 응용성이 더욱 넓혀질 수 있으므로 그 경제적 효과는 더 커지리라 사료된다.
이에 본 발명자들은 정제, 고정화 및 재접힘 공정이 효율적으로 수행되는 아미노산 융합 시스템을 개발하기 위해 계속 연구 진행한 결과, 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 양이온성 아미노산인 아르기닌, 리신 또는 이들의 혼합물을 코딩하는 유전자를 연속적으로 8개 이상을 융합시킨 융합유전자를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 정제, 고정화 및 재접힘 공정을 효율적으로 수행할 수 있는 융합단백질, 이를 코드하는 유전자, 이 유전자를 포함하는 벡터, 이 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 융합 단백질의 정제, 고정화 및 재접힘 방법을 제공하는 것이다.
도 1A 및 B는 대장균 세포내 단백질의 등전점 분포 및 누적 분포를 나타낸 그래프이다.
도 2는 발현벡터 pTCGTK6, pTCGTK10 및 pTCGTR6의 제조과정을 나타낸 것이다.
도 3A-D는 재조합 대장균 세포추출액으로부터 양이온 교환수지를 사용하여 WT CGTase, CGTK6ase, CGTR6ase 및 CGTK10ase을 크로마토그래피 법으로 분리한 크로마토그램 및 분석 그래프이다.
도 4는 재조합 대장균 세포 추출액을 다양한 염농도로 전세척 후 융합단백질을 용출시킨 크로마토그램 및 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 5는 재조합 대장균 세포추출액의 염농도를 조절하여 이온교환수지에 융합 단백질(CGTK10ase)을 선택적으로 흡착시킴으로써 정제하는 SDS-PAGE의 분석 사진이다.
도 6은 본 발명의 CGTK10ase 단백질의 염농도에 따른 분배계수를 나타낸 것이다.
도 7은 양이온 교환 컬럼으로부터 염농도에 따라 흡착된 효소의 역가를 나타낸 그래프이다.
도 8은 효소의 pH 의존도가 아미노산 융합과 이를 이용한 고정화에 의해 변화하는 양상을 보이는 그래프이다.
도 9는 효소의 pH 안정성이 아미노산 융합과 이를 이용한 고정화에 의해 변화하는 양상을 보이는 그래프이다.
도 10은 효소의 pH 안정성이 아미노산 융합과 이를 이용한 고정화에 의해 변화하는 양상을 보이는 그래프로서 불활성화 상수를 pH에 대하여 보인 그래프이다.
도 11A-C는 본 발명의 융합단백질 및 이를 고정화한 단백질의 열안정성을 나타낸 그래프이다.
도 12A-D는 고정화된 효소에 의한 사이클로덱스트린의 생산성을 나타낸 그래프이다.
도 13은 우레아에 의해 풀어진 효소의 염농도에 따른 분배계수를 나타낸 것이다.
도 14는 Ca++ 농도에 따른 용액상 효소 및 고정화 효소의 재접힘 효율을 비교한 그래프이다.
도 15는 염의 농도에 따른 용액상 효소의 재접힘 효율을 비교한 그래프이다.
도 16은 pH에 따른 용액상 효소의 재접힘 효율을 비교한 그래프이다.
도 17는 염의 농도에 따른 고정화 효소의 재접힘 효율을 비교한 그래프이다.
도 18은 pH에 따른 고정화 효소의 재접힘 효율을 비교한 그래프이다.
도 19는 단백질 농도에 따른 용액상 효소의 재접힘 효율을 비교한 그래프이다.
도 20은 단백질 농도에 따른 고정화 효소의 재접힘 효율을 비교한 그래프이다.
도 21은 내포체 형태로 발현된 융합단백질 CGTK10ase, LPK10ase를 양이온 교환수지를 이용하여 선택적으로 결합시켜 정제한 크로마토그램이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 양이온성 아미노산이 융합된 융합단백질, 이를 코드하는 융합유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 적절한 조건에서 배양하고 흡착방법으로 목적단백질을 정제하는 방법, 융합 단백질의 고정화 방법 및 융합 단백질의 재접힘 방법 등을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
재조합 대장균의 세포내 단백질 대부분의 pI는 pH 7.0 이하이므로 pH 7.0 이상에서 양이온 교환수지를 이용하면 목적 단백질의 정제도를 높일 수 있다. 도 1의 a는E. coliK12 세포주 W3110(기탁번호: ATCC 27325)의 2차원 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동의 자이모그램(zymogram)을 단백질의 등전점 분포에 대해 분석한 그래프로서, 90 % 이상의 세포 단백질의 pI는 pH 7.0 이하에서 존재한다. 즉, 세포내 단백질의 대부분은 약산성 pH에 등전점이 존재함을 알 수 있다. 도 1의 b는 이러한 등전점 분포의 누적 곡선이다. pH 7.0에서 90 % 이상의 세포내 단백질들은 음으로 하전된다. 따라서 음으로 하전되어 있는 양이온 교환수지를 사용함으로써 세포내 단백질들을 배제하고 목적단백질만을 선택적으로 회수할 수 있다. 또한 세포 추출물에 들어 있는 핵산류는 음으로 하전되어 있어서 양이온 교환 수지에 결합하지 않으므로 정제된 목적 단백질 내에 포함되지 않는다.
본 발명에서는 목적 단백질에 양이온성 아미노산, 바람직하게는 리신, 아르기닌 또는 이들의 혼합물을 8개 이상, 바람직하게는 10개 내지 15개 융합시킨 융합단백질을 제조한다. 본 발명에서 사용되는 목적단백질로는 바실러스 마서란스(Bacillus mascerans) 유래의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 (cyclodextrin glycosyltransferase, CGTase), 아캐오글로부스 풀지더스 (Archaeoglobus fulgidus) 유래의 라이페이즈(lipase) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, CGTase를 포함하는 양이온성 융합단백질은 야생형(wild-type, WT) CGTase의 C-말단에 리신 10개가 연속적으로 융합된 단백질인 CGTK10ase의 형태일 수 있고, 라이페이즈를 포함하는 양이온성 융합 단백질은 야생형 라이페이즈의 C-말단에 리신 10개 및 12개가 연속적으로 융합된 LPK10 및 LPK12일 수 있다. 본 발명의 융합단백질의 제조에 있어서, 양이온성 아미노산은 단백질의 C-말단 뿐만 아니라, N-말단 또는 단백질의 기능성에 영향을 미치지 않는한 단백질 내부의 어떤곳에라도 삽입할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 융합단백질을 코드하는 유전자를 제공한다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 역시 포함한다.
본 발명의 융합단백질은 이를 코드하는 유전자를 합성한 후 이를 적절한 벡터에 삽입하여 제조한 발현벡터로 적절한 숙주, 예를 들어, 효모, 대장균 등을 형질전환시켜 수득한 형질전환체를 적절한 배양조건에서 배양하여 얻을 수 있다. 예를 들어, CGTase 융합단백질의 경우, WT CGTase 유전자를 포함하는 벡터 pTCGT1(입수처: Lee, K. C. P. and B. Y. Tao.,Starch, 46, 67-74(1994))를 이용하여 WT CGTase 유전자의 3'-말단에 10개의 리신 코돈이 각각 연결된 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTCGTK10을 제조하고, 이들을 이용하여 대장균, 예를 들어, 대장균(E. coliBL21(DE3))을 형질전환시킨 후 이들을 배양하여 얻을 수 있다.
WT CGTase는 이론적인 pI가 약 5.0이어서 pH 7.4의 양이온 교환수지에 흡착되지 않는다. 그러나 양이온성 아미노산이 융합된 융합단백질인 본 발명의 CGTK10ase는 양이온 교환수지에 의해 흡착되며 이를 이용하여 목적단백질의 정제가 가능하다. 따라서 융합단백질의 흡착은 양이온성 아미노산 꼬리에 의해 부여된 성질에 의한 것임을 확인할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 단백질의정제 도중 최대의 활성을 보이는 지점의 NaCl 농도를 Emax라 정의하였을 때 CGTK10ase의 Emax는 580 mM인 반면, 리신 및 아르기닌 코돈이 각각 6개씩 융합된 CGTK6ase 및 CGTR6ase의 Emax는 각각 345 mM 및 430 mM이다. Emax는 그 단백질의 흡착세기를 나타내는데 높은 Emax를 보이는 것은 양이온 교환수지에 강하게 흡착한다는 것을 의미한다. 따라서 높은 Emax를 가진 융합단백질은 높은 염농도에 의해서도 탈착되지 않으며, 이를 이용하면 상대적으로 낮은 염농도에서 탈착되는 다른 세포내 단백질들로부터 목적 단백질을 분리해 낼 수 있다. 융합단백질의 Emax는 목적 단백질에 융합된 아미노산의 종류와 그 길이에 따라 달라지는데, 같은 길이에서는 아르기닌을 융합한 것이 리신을 융합한 것보다 높으며, 같은 종에서는 길이가 긴 것이 짧은 것보다 높다. WT CGTase는 양이온 교환수지에 전혀 흡착하지 않으므로 Emax를 0이라 할 수 있다. 높은 Emax를 가진 융합단백질은 더 늦게 해리된다. 세포내 단백질의 대부분은 낮은 염농도에서 해리되지만, 상당히 높은 염농도, 예들 들어 100 ~ 300 mM에서도 흡착되어 있는 단백질들이 있는데, 이들은 최종 정제액의 불순물이 되어 정제도를 떨어뜨린다. 이와 같이,E max 가 클수록 정제배수가 크며, CGTK6ase, CGTR6ase 및 CGTK10ase의 정제배수는 각각 2.38, 4.97 및 9.88이다. 특히 고순도로 정제하기 위해서는 매우 높은 Emax가 요구되는데, 이는 강하게 흡착되어 있는 여타 단백질을 높은 염농도를 이용하여 제거할 수 있기 때문이며, CGTK10ase 5 ㎖의Emax분획의 비효소 역가는 96.4 U/㎎이다.
또한 양이온 교환 크로마토그래피시 100 내지 500 mM의 염이 첨가된 완충액으로 목적 단백질이 흡착된 컬럼의 전세척을 행함으로써 목적단백질의 정제도를 더욱 높일 수 있는데, 이는 약하게 흡착된 세포내 단백질을 해리시키는 과정이다. CGTK10ase를 400 mM의 염농도를 이용하여 전세척을 행한 후 SDS-PAGE와 덴시토미터(densitometer)를 이용하여 분석한 경우 95 % 이상의 정제도를 나타내며, 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한 순수단백질과 비효소역가를 비교하였을 때 약 98 %의 정제도를 나타낸다. 이 방법을 통하여 매우 높은 정제도의 목적단백질을 얻을 수 있는데, 일반적으로 산업적으로 사용되는 효소의 정제도가 90 % 정도의 수준임을 감안하면 본 발명에서는 간단한 정제법을 이용함으로써 부가적인 정제 공정 없이 바로 사용할 수 있는 효소를 생산할 수 있다.
융합단백질의 정제는 해리 단계 뿐만 아니라 흡착 단계에서도 조절할 수 있는데, 본 발명자들은 이를 '선택적 결합'이라 하였으며 이를 이용하여 목적단백질의 회수도를 높였으며 정제도 또한 향상시킬 수 있다. 세포내 단백질은 이온교환수지에 목적단백질과 경쟁적으로 결합하는데, 염을 100 mM 내지 500 mM 농도로 첨가한 후 흡착을 실시한 경우에는 세포내 단백질의 결합을 방지할 뿐만 아니라 목적단백질의 흡착 수율 및 정제도를 획기적으로 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 목적 단백질이 효소인 경우 양이온 교환 수지에 대한 정전기적인 흡착을 이용하여 고정화 효소의 제조에 이용될 수 있다.CGTase의 경우, 양이온성 아미노산이 융합되더라도 효소의 역가는 90 % 이상을 유지하며, 고정화에 의해서도 동일한 효소의 역가가 나타난다. 본 발명의 고정화 효소는 기존의 방법들에 비하여 매우 간편하게 제조할 수 있을 뿐만 아니라 고정화 과정 중 단백질이 손상되거나 유출되지 않고 안정하게 유지되며, 고정화 효소 반응기에 이용될 수 있다.
융합효소 및 이들의 고정화 효소는 야생의 효소와 pH 의존도를 나타낸다. 또한 용액상의 융합효소는 야생형과 동일한 pH 안정성을 나타내지만, 고정화를 통하여 pH 안정성이 매우 높아진다.
열안정성의 면에 있어서는, 융합효소가 야생형에 비해서 낮았으나 이를 고정화시키면 열안정성이 크게 개선된다. 따라서 본 발명의 고정화 효소를 이용한 효소 반응기를 운전하여 효소의 기질로부터 목적 산물을 효율적으로 생산할 수 있다.
본 발명의 융합단백질을 이용하면 부가된 양이온성 아미노산으로 인해 단백질의 활성화 공정 중 재접힘의 수율 및 공정의 성능을 획기적으로 증대시킬 수 있는데, 이는 양이온 교환 수지에 변성제에 의해 풀어진 단백질을 고정화시킨 후 변성제를 제거하거나 농도를 낮추어 재접힘을 유도함으로써 이루어진다. 우레아(urea) 등의 변성제에 의하여 변성된(denatured) 단백질의 재접힘을 유도하기 위하여 변성제를 투석, 희석 등의 방법을 이용하여 제거하거나 농도를 낮추었을 때 일반적으로 단백질은 올바른 3차 구조를 갖추지 못하고 소수성 결합에 의하여 분자간 응집하여 침전된다. 그러나, 본 발명에서 고정화된 융합단백질은 수지에 결합되어 있는 상태에서 재접힘을 실시하므로 이러한 침전이 일어나지 않으며 따라서 재접힘의 수율을 극대화할 수 있다. 또한 재래의 재접힘 공정은 침전을 방지하기 위해 매우 낮은 농도에서 실시되었으나 본 발명에서는 고농도에서도 단백질의 침전을 방지하면서 성공적으로 재접힘시킬 수 있었다. 효소의 회수 또한 단순히 수지를 회수함으로써 가능하므로 희석된 효소의 농축에 소요되는 시간과 경비를 절감할 수 있었다.
따라서 본 발명에 의하면, 재접힘 공정을 매우 높은 수율로 실시할 수 있으며, 고농도의 단백질의 재접힘을 가능하게 함으로써 공정의 부피를 줄일 수 있고 농축에 소요되는 노력을 절감할 수 있다. 부가적으로는, 투석이나 첨가제의 사용 또는 부대 시설 등이 요구되지 않는 단순 희석 공정을 채택하는 것을 가능하게 함으로써 추가적인 비용, 시간, 노력의 절감을 얻을 수 있다.
융합단백질은 부여된 전하로 인하여 야생 효소와 비교하였을 때 용액 상태에서도 높은 재접힘 효율을 나타낸다.
이하 하기 실시예에 의하여 본 발명을 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 양이온성 아미노산이 융합된 융합단백질의 발현벡터 제조
(1) CGTase 융합단백질의 발현벡터의 제조
서열번호 1의 염기서열을 갖는 5'-프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 3'-프라이머를 이용하고 WT GCTase 유전자가 포함된 벡터 pTCGT1(Lee, K. C. P. and B. Y. Tao.,Starch, 46, 67-74(1994))을 주형으로 하여중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 대조군으로서는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 갖는 3'-프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다. 1 mM의 MgCl2를 사용하여 변성반응은 95 ℃에서 1 분, 어닐링 반응은 48 ℃에서 2 분 및 중합반응은 72 ℃에서 3 분의 싸이클을 30회 실시하고, 72 ℃에서 5분 동안 더 중합반응을 실시하였다. 최초의 변성반응은 95 ℃에서 5 분 실시하였다. 이렇게 수득한 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하여 크기를 확인한 후 제한효소BamHI(NEB, England) 및SalI(NEB, England)으로 처리하였다.
한편, 벡터 pET21a(Novagen, USA)를 상기와 동일한 제한효소로 처리하고 상기 제한효소 처리된 단편과 연결(ligation)하여 10개의 리신을 코드하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pTCGTK10(서열번호 5 및 6), 대조군으로서 연속된 6개의 리신 및 아르기닌을 각각 코드하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pTCGTK6(서열번호 7 및 8) 및 pTCGTR6(서열번호 9 및 10)를 수득하였다. 도 2는 발현벡터 pTCGTK6, pTCGTR6 및 pTCGTK10의 제조과정을 나타낸 것이다.
(2) 라이페이즈 융합단백질의 발현벡터 제조
서열번호 11의 염기서열을 갖는 5'-프라이머 및 서열번호 12 또는 13의 염기서열을 갖는 3'-프라이머를 이용하고 pELP-1을 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. pELP-1은 pET3a 벡터(Novagen, U.S.A.)의 제한효소NdeI과BamHI 부위에 아캐오글로부스 풀지더스(Archaeoglobus fulgidus)의 라이페이즈 유전자(ATCC 49558D)를 삽입한 발현벡터이다. 상기 (1)과 동일한방법으로 중합효소 연쇄반응을 실시하고, 수득된 DNA 단편을 제한효소NdeI(NEB, England) 및BamHI(NEB, England)로 처리하였다. 벡터 pET3a(Novagen, USA)를 상기와 동일한 제한효소로 처리하고 상기 제한효소 처리된 단편과 연결하여 연속된 10개 및 12개의 리신을 코드하는 유전자를 각각 포함하는 플라스미드 pLPK10 및 pLPK12를 수득하였다.
실시예 2: 이온 교환 크로마토그래피를 이용한 CGTase 융합단백질의 정제
상기 실시예 1의 (1)에서 제조된 발현벡터 pTCGTK10으로E. coliBL21(DE3):pLysE(Novagen, U.S.A.)을 형질전환시킨 후 암피실린이 들어 있는 플레이트에서 형질전환된 콜로니를 선별하여 형질전환된 세포주E. coliBL21(DE3):pLysE:pTCGTK10를 수득하였다. 이를 생명공학연구소 유전자은행에 2000 년 7 월 24 일자로 기탁번호 제 KCTC 0842BP 호로서 기탁하였다.
상기 형질전환체 및 대조군으로서 WT GCTase를 생산하는E. coliBL21(DE3):pLysE:pTCGT1 및 상기 실시예 1의 (1)에서 수득한 발현벡터 pTCGTK6 및 pTCGTR6로 형질전환된E. coliBL21(DE3):pLysE:pTCGTK6 및E. coliBL21(DE3):pLysE:pTCGTR6를 각각 LB 배지(암피실린 50 mg/ℓ포함) 5 ㎖에 접종하고 37 ℃에서 밤새 배양한 다음 그 중 1 ㎖을 2 g/ℓ의 포도당이 포함된 100 ㎖의 LB 배지에 다시 접종하여 30 ℃에서 배양하였다. 포도당이 소모되는 시점인 배양 6 시간 후에 IPTG 0.5 mM과 CaCl25 mM을 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다. 원심분리하여 수확한 세포를 50 mM 인산염 완충액(pH 7.4)에 현탁하여 프렌치프레서(French pressure, Aminco, U.S.A.)를 사용하여 분쇄하였다.
원심분리기를 이용하여 가용성 세포추출액만인 상층액을 회수한 다음 이온교환 크로마토그래피(Acta, Pharmacia, Sweden)로 분석하였다. 즉, XK16 컬럼(Pharmacia, Sweden) 내부에 5㎖의 SP-세파로즈(Pharmacia, Sweden) 양이온 교환수지를 충전한 다음 상층액을 로딩(loading)하고 이동상으로서 인산염 완충액(pH 7.4)을 20분(수지의 4부피)동안 유속 1 ㎖/분으로 흘려주었다. 그 후 동일한 이동상에 1 M NaCl이 첨가된 용액을 사용하여 20분에 걸쳐서 그래디언트(gradient)를 걸었다. 이후 20분 동안 1 M NaCl을 계속해서 흘려주었다. 운전중 280 nm에서의 흡광도, 전도성, 효소의 역가(참조: Makela MJ and Korpela T.,J. Biochem. & Biophys. Methods,15. 307-318(1988))를 관찰하였다.
도 3은 재조합 대장균 세포추출액으로부터 양이온 교환수지를 사용하여 크로마토그래피 법으로 분리한 크로마토그램 및 분석 그래프로서, a, b, c 및 d는 각각 WT CGTase, CGTK6ase, CGTR6ase 및 CGTK10ase에 대한 크로마토그램이고, 실선(----)은 280 nm UV 곡선, (--·--)은 그래디언트, (--‥--)은 전도도이며 막대는 효소의 역가를 나타낸다. 여기에서 보듯이, pH 7.4의 완충액을 사용하였을 경우 대부분의 단백질들은 수지에 흡착되지 않았으며, WT CGTase 또한 등전점이 약 5.0이므로 지정된 pH에서 음으로 하전되어 있어 양이온 교환수지에 흡착되지 않았다(도 3a). 도 3b, 3c 및 3d는 효소의 역가를 제외한 대부분의 분리 특성은 거의 유사한 경향을 나타내었다. 리신의 pKa는 10.0이고 아르기닌의 pKa는 12.0이다. 같은 길이의 리신 꼬리와 아르기닌 꼬리를 비교할 때 아르기닌 꼬리를 가진 융합단백질의흡착 세기가 더 큼을 확인할 수 있었다. CGTK10ase의 결합의 세기는 대조군 CGTR6ase 및 CGTK6ase에 비해 월등히 높았다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
CGTase CGTK6ase CGTK10ase CGTR6ase
투입된 단백질(mg) 1.04 1.18 1.00 1.00
투입된 효소 역가(U) 17.26 5.02 9.76 7.48
투입된 단백질의 비효소 역가(U/mg) 17.26 5.92 9.76 7.48
회수된 총 역가(U) 0 2.22 4.92 1.45
총 회수된 역가 수율(%) 0 44.2 50.0 19.4
E max 에서의 회수된 단백질의 비효소역가(U/mL) 0 14.1 96.4 37.2
E max 에서의 정제 배수 0 2.38 9.88 4.97
실시예 3: 전세척을 통한 융합단백질의 정제도 향상
실시예 2와 같이 WT CGTase, CGTK6ase, CGTR6ase 및 CGTK10ase를 포함하는 재조합 대장균 세포 추출액을 얻고 이를 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 실시하되, 세포 추출액을 컬럼에 로딩하여 흡착시킨 다음 염(NaCl)농도가 각각 0, 150, 200, 300 및 400 mM인 인산염 완충액으로 전세척을 먼저 행하고 나서 용출액을 흘려주었다. 용출액을 이용하여 12% SDS-PAGE를 실시하고, 젤을 쿠마시(Coomassie) 염색하였다. 도 4는 재조합 대장균 세포 추출액을 전세척한 결과를 나타내는 용출 그래프 및 SDS-PAGE 분석결과로서, A는 CGTKase를 150 mM NaCl로, B는 WT CGTase를 200 mM NaCl로, C는 CGTR6ase를 200 mM NaCl로, D는 CGTK10ase를 400 mM NaCl로 전세척한 것이고, S는 표준 분자량 단백질이다. WT CGTase는 염농도 0인 완충액에서도 흡착하지 않았다. 이 때 상당량의 세포내 단백질이 세척되지 않고 흡착된 상태로 남아 있음을 확인할 수 있었으며, 염농도를 200mM로 높였을 때에도 그 양은 줄어들었지만 세포내 단백질들이 완전히 제거되지 않고 남아 있었다(도 4B). 한편 CGTK6ase의 경우에는 완충액만으로 전세척을 행하였을 때는 CGTK6ase가 흡착된 상태로 남아 있었으나, 염농도 150 mM로 전세척을 했을 때에는 탈착되었으며, 이 때에도 여전히 강하게 흡착되어 해리되지 않은 세포내 단백질들이 존재함을 알 수 있었다(도 4A). 양이온 교환수지와 상대적으로 강한 결합을 이루는 CGTR6ase는 비록 300 mM의 염농도에서는 모두 탈착되었으나, 200 mM에서는 흡착된 상태로 존재하였고, 이 때도 상당 부분의 세포내 단백질이 제거되지 않고 남아 있음을 확인할 수 있다(도 4C). 본 발명의 CGTK10ase의 경우에는 400 mM의 염농도로 전세척을 행하였을 경우에도 탈착되지 않고 남아 있었으며, 이 때 대부분의 융합단백질 이외의 세포내 단백질들은 제거되었다(도 4D). 강하게 흡착된 일부 세포내 단백질들은 300 mM의 전세척을 통해서도 제거할 수 없었으나 400 mM 염농도로 세척하면 대부분 제거할 수 있었다. 이러한 관찰은 280 nm에서의 흡광도 측정을 통한 단백질 곡선에서도 같은 경향을 보이는데, 전세척하는 염의 농도가 높아지면 높아질수록 1 M 염농도로 탈착되어 최종 회수된 단백질의 농도가 점점 낮아짐을 볼 수 있는데, 이는 세포내 단백질이 전세척을 통해서 제거되었기 때문이다.
실시예 4: 선택적 흡착을 통한 정제도 및 정제 수율 향상
실시예 2에서 수득한 CGTK10ase를 포함하는 재조합 대장균 세포 추출액에 염농도를 0, 100, 200, 300 및 400 mM로 첨가한 다음 Poly-prep 컬럼(Biorad, USA)에 충진된 SP-세파로즈 양이온 교환수지에 흡착시킨 후 동일 농도의 염용액으로 세척하였다. 1 M 염용액으로 (용출시킨?)흡착시킨 단백질을 SDS-PAGE로 분석하여 도 5와 같은 자이모그램을 얻었다. 도 5는 재조합 대장균에서 발현된 CGTK10ase의 정제시 세포 추출액의 이온교환반응을 흡착단계에서 선택적으로 선별한 SDS-PAGE 분석 사진으로서, S는 표준 분자량 단백질이며 A는 친화성 크로마토그래피(Sundberg, L. 및 Porath J.,J. of Chromatogr.,90, 87-98(1974))로 정제된 단백질이며, B는 실시예 3의 방법에 따라 400 mM 염용액 전세척 및 양이온 교환 크로마토그래피를 통하여 정제된 단백질이며, C, D, E, F 및 G는 각각 0, 100, 200, 300 및 400 mM의 염용액이 첨가된 세포 추출 상층액을 양이온 교환수지에 흡착시킨 후 1 M 염용액으로 정제한 단백질이다. 여기에서 보듯이, 흡착 염농도가 0에서 300 mM까지 높아지면 세포내 단백질의 흡착이 점점 줄어들며, 세포내 단백질은 이온교환수지에 대하여 융합단백질과 경쟁적인 관계에 있으므로 이들의 흡착방지는 융합단백질 회수율을 높아지게 하여 D, E, F 및 G 같이 더 많은 융합단백질을 회수할 수 있고 정제효율 또한 높일 수 있다.
실시예 5: 양이온성 아미노산 융합을 통한 효소 고정화
(단계 1)
다양한 염농도에서 하기와 같은 방법으로 분배계수(α, partition coefficient)를 측정하였다. 순수 정제된 CGTK10ase 용액을 0 ~ 500 mM의 이온농도로 평형(20 mM 인산염완충액, pH 7.0)을 이루게 한 뒤 동일한 염농도에서 평형을 이룬 수지(SP-Sepharose, Pharmacia, Sweden)를 혼합하여 융합효소 CGTK10ase를 고정화하였다. 흡착된 단백질의 양과 용액 중의 단백질의 양을 측정하여 흡착된 단백질의 농도를 q라 하고 용액 중의 단백질의 농도를 p라 하여 하기 수학식 1과 같이 분배계수를 계산하였다.
도 6은 본 발명의 CGTK10ase 단백질의 염농도에 따른 분배계수를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 0 내지 300 mM의 염농도에서 분배계수는 약 0.95으로 매우 잘 고정화되었으며, 융합효소 CGTK10ase가 공유결합이 아닌 비공유적인 방법으로 고정화됨을 확인할 수 있었다.
(단계 2)
상기 단계 1에서와 같이 CGTK10ase는 비공유적인 방법으로 매우 잘 고정화되었으나, 일반적으로 비공유적인 흡착 방법으로 제조된 고정화 효소는 유출의 문제가 심하다고 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 양이온 교환수지에 고정화된 CGTK10ase가 0~1 M 염농도의 완충액(20 mM 인산염완충액, pH 7.0) 중에서 얼마나 유출되어 나오는지를 조사하기 위해, 평형을 이룬 후 유출되어 나온 용액 중의 효소의 역가를 측정하였다. 융합 효소를 양이온 교환수지에 결합시킨 다음 결합하지 않은 융합 효소를 세척하여 제거한 후 10 부피의 주어진 농도의 염용액에서 4시간 동안 가볍게 섞어주면서 배양하였다. 일반적으로 단백질의 흡착 및 탈착 반응은 몇 십분 내에 평형에 도달하는 것으로 알려져 있으므로 4시간의 배양은 충분히 평형을 이룰 수 있는 시간으로 판단되었다. 배양 중 용액 중으로 유출되어 나온 효소의 역가와 1 M NaCl로 탈착시킨 후의 효소의 역가를 합한 값을 100으로 보았을 때 염농도에 따른 융합 효소의 유출 곡선은 도 7과 같다. 도 7에서 검은 점은 유출되지 않은 효소이고 흰점은 유출된 효소의 역가이다. 그래프에서 보듯이, 100 mM 이하의 염농도에서는 고정화된 효소의 유출이 전혀 없었으며, 무려 300 mM의 염농도에서도 90 % 이상의 효소는 고정화되어 유출되지 않았음을 알 수 있다.
실시예 6: 융합효소 및 이의 고정화 효소의 pH에 대한 의존도 및 안정성 측정
융합효소 및 이의 고정화 효소의 pH에 대한 의존도를 측정하기 위해, pH 4 내지 9로 조절된 1.45 ㎖의 인산염 완충액에 0.05 ㎖의 WT CGTase, 고정화되지 않은 CGTK10ase 및 고정화된 CGTK10ase를 각각 넣고 효소의 역가를 측정한 후 최고의 역가를 나타낸 지점을 100으로 하고 상대적인 값을 표시하였다. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이 액상의 효소는 WT CGTase와 CGTK10ase가 거의 동일한 양상을 보였으며 고정화 효소 또한 pH 6 이상에서는 거의 동일한 효소 의존도 곡선을 보였는데, pH 6 이하에서 낮은 효소 역가를 보인 것은 융합 효소의 정전기적인 결합력이 약해져 유출이 일어났기 때문으로 사료된다. 따라서 CGTase의 C-말단에 양이온성 아미노산을 융합한 효소와 이를 이용한 고정화 효소는 pH에 대한 의존도가 야생 효소에 비하여 달라지지 않음을 확인할 수 있다.
한편, 융합 효소 및 이의 고정화 효소의 pH에 대한 안정성을 측정하기 위해, WT CGTase, 고정화되지 않은 CGTK10ase 및 고정화된 CGTK10ase를 pH 4 내지 10으로 조절된 인산완충액에 넣고, 50 ℃에서 1 시간 동안 방치한 후 효소의 역가를 측정하였다. 최고의 역가를 나타낸 점을 100으로 하고 나머지는 그에 대한 상대적인비로 표현하였다. 도 9에서 볼 수 있듯이, WT CGTase와 CGTK10ase는 pH 안정성에 있어서 거의 동일한 프로파일을 보였으며, 고정화 효소는 더 넓은 pH 범위에서 안정적으로 유지됨을 확인할 수 있었다.
효소의 불활성화가 지수적으로 이루어진다면 하기 수학식 2와 같이 표현될 수 있다. 이 때 A는 남아 있는 효소의 역가, t는 시간, k는 불활성화 상수이다.
액상의 WT CGTase와 CGTK10ase는 적용한 pH 구간에 대해서 거의 동일한 값을 보였으나 고정화된 CGTK10ase는 더욱 감소된 불활성화 상수 값을 보였다. 도 9에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 효소를 배양하면서 시간 간격을 두고 남아 있는 효소의 역가를 측정함으로써 효소의 불활성 속도를 구할 수 있다. 효소는 상기 주어진 식과 같이 지수적으로 불활성화되었으며 이 때의 속도 상수를 도 10에 표시하였다. 이로써 양이온성 아미노산의 융합 자체는 효소의 pH 안정성에 영향을 미치지 않으며 융합된 효소의 고정화를 통하여 pH에 대하여 더욱 더 안정한 효소를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8: 고정화 효소의 열안정성 측정
온도에 따른 효소의 안정성을 조사하기 위해, 20 mM 인산염 완충액(pH 7.0)에서 온도를 50 ℃ 및 25 ℃로 조절하여 시간에 따른 효소의 역가 감소 정도를 측정하여 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11a 및 11b는 각각 50 ℃ 및 25 ℃에서본 발명의 융합단백질 및 이를 고정화한 단백질의 열안정성을 나타낸 그래프로서, 여기에서 보듯이, 용액상의 WT CGTase에 비해 CGTK10ase의 열안정성은 약간 감소하였으나, 고정화된 CGTK10ase는 WT CGTase와 동일하거나 약간 개선된 열안정성을 나타내었다.
또한, CGTase는 그 구조를 유지함에 있어서 Ca 염을 필요로 한다. 따라서 CaCl2를 5 mM로 첨가한 후 완충액은 20 mM MOPS(3-[N-Morpholino]propanesulfonic acid, Sigma, U.S.A.)(pH 7.0)을 사용하여 온도 50 ℃에서 효소의 열안정성을 측정하여 도 11c에 나타내었다. 여기에서 보듯이, 전체적으로 효소의 열안정성이 크게 증가하였으며 이 때에도 고정화에 의해 효소의 열안정성이 상당히 개선됨을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 고정화 효소의 운전 안정성 측정
10 mM 인산염 완충액(pH 6.0)과 평형을 이룬 CGTK10ase 용액을 동일한 완충액으로 평형을 이룬 SP-세파로즈와 섞어서 고정화 효소를 만들었다. 고정화되지 않은 효소는 세척을 통해서 씻어낸 후 XK16 컬럼(Pharmacia, Sweden)에 넣어 충진형 반응기를 만들었다. 컬럼은 물 자켓(water jacket)을 이용하여 25 ℃로 유지하였으며, CaCl2가 5 mM로 첨가된 인산염 완충액에 10 g/ℓ의 수용성 전분을 넣은 반응액을 0.5 ㎖/분의 유속으로 연동 펌프를 이용하여 연속적으로 컬럼에 주입하였다. 15일간 시료를 하루에 한 번 취하여 -20 ℃에 두었으며 생산된 사이클로덱스트린(CD)은 박막 액체 크로마토그래피(TLC)를 이용하여 다음과 같이 분석하였다.사이클로덱스트린(CD)에는 글루코스(glucose) 6분자로 이루어진 α-CD와 각각 글루코스 7분자 및 8분자로 이루어진 β-CD 및 γ-CD가 있는데, 이들은 박막 액체 크로마토그래피를 이용하여 잘 분별되어 분석될 수 있었다. 바실러스 마세란스(Bacillus macerans) 유래의 CGTase는 액상 전분을 기질로 하여 α-CD를 주로 생산한다고 알려져 있다.
TLC 플레이트(KF5, Whatman, USA)를 사용전에 110 ℃ 오븐에서 1~2시간 동안 활성화시킨 후, 시료를 표준물질의 농도 범위에 포함되도록 희석하여 1~2 ㎕를 스포팅(spotting)하였다. 표준물질은 0.005~0.05 %의 글루코스, 말토스, 말토트리오스와 각 CD를 시료분석시 함께 스포팅하여 각 플레이트마다 환산할 표준 그래프를 얻었다. 시료를 적용한 플레이트를 건조기로 충분히 말리고, 용매(nitromethane: water:n-propanol, 2:1.5:4, v/v)가 있는 쳄버(chamber)에서 두 번 전개하였다. 각 전개 후 용매 냄새가 나지 않을 때까지 오븐에서 10 분간 두어 발색하였다. 전개된 플레이트에 메탄올:H2SO4(95:5, v/v, 3g/L a-나프톨 포함) 용액을 적용하고 잘 말린 후 110 ℃ 오븐에서 10 분간 두어 발색시켰다. 발색된 스팟(spot)은 덴시토미터(GS-700, Biorad, USA)와 정량계산 프로그램(Molecular Analyst, Biorad, USA)을 사용하여 농도로 환산하였다. 도 12는 고정화된 효소에 의한 사이클로덱스트린(CD)의 생산성을 나타낸 그래프로서, A, B, C 및 D는 각각 α-CD, β-CD, γ-CD 및 총 CD를 나타낸다. 여기에서 보듯이, 고정화 효소를 이용하여 사이클로덱스트린이 안정적으로 생산됨을 확인할 수 있었으며 각종의 CD 함량에도 변화가 없음을 확인할 수 있었다.
실시예 5 내지 9에서 보듯이 양이온성 아미노산을 효소에 융합시킴으로써 간편하고 효율적으로 고정화 효소를 제조할 수 있었으며, 이에 의해 제조된 고정화 효소를 이용하여 성공적으로 목적 산물을 생산할 수 있었다.
실시예 10: 변성 단백질의 고정화
우레아에 의해 변성된(풀린) 단백질이 양이온 교환 수지에 고정화되는지를 다음과 같은 방법으로 조사하였다. 9 M 우레아가 녹아 있는 20 mM MOPS(3-[N-Morpholino]propanesulfonic acid, Sigma, U.S.A.) 완충액(pH 7.0)에 NaCl을 0~400 mM로 첨가한 용액에 CGTK10ase를 혼합하고 4 시간 동안 변성시킨 뒤 동일한 용액에 평형을 이룬 SP-세파로즈에 고정화시켰다. 수지의 부피와 단백질 용액의 부피의 비는 1:2이었으며, 혼합용액을 2시간 동안 실온에서 가볍게 섞어 주면서 반응시켜 고정화시켰다. 수지를 가라앉힌 후의 용액을 회수하여 단백질 농도를 측정하였으며 이 농도를 p라 하였다. 가라앉은 수지는 동일한 용액으로 충분히 세척한 다음 수지 부피의 약 17배의 1 M NaCl 및 9 M 우레아 함유 20 mM 인산염용액(pH 7.0)을 첨가하여 붙어 있는 단백질을 모두 해리시켰다. 이 때 용액 중의 단백질의 농도를 측정하여, 수지에 고정화되었던 단백질 농도를 계산하여 이를 q라 하고, 상기 실시예 5에 제시된 수학식 1에 따라 분배계수를 측정하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었으며, 여기에서 보듯이 0~100 mM의 염농도에서는 분배계수가 거의 일정하여 0.9 이상이었으며 그 이상에서는 급격히 감소하기 시작하여 400 mM 염농도에서는 0에 가까웠다. 즉, 변성된 융합효소 또한 천연 효소와 같이 잘 고정화 됨을 확인할수 있었다.
실시예 11: 풀린 단백질의 재접힘(refolding)
(1) 재접힘 공정
9 M 우레아를 포함하는 20 mM MOPS(3-[N-Morpholino]propanesulfonic acid, Sigma, U.S.A.) 완충액(pH 7.0)중에 상온에서 4시간 이상 방치하여 변성시킨 CGTK10ase를 동일한 조건에서 평형을 이룬 SP-세파로즈와 혼합하여 고정화시키고, 고정화되지 않은 단백질을 모두 세척하여 제거하였다. 용액 상태의 CGTK10ase 및 상기 고정화된 효소를 재접힘 완충액(20 mM MOPS 완충액, pH 7.0)에 50 ㎎/㎖ 및 1㎎/㎖ 농도로 넣었다. 희석 이후 우레아의 농도는 모두 0.45 M 이었으며, 이렇게 희석된 용액을 15 ℃에서 약 16시간 동안 방치한 후 효소의 역가를 측정하였다. 고정화 효소는 1 M NaCl로 탈착한 후 단백질의 농도를 측정하였다. 효소의 역가를 단백질 농도로 나눈 것을 비효소 역가(specific enzyme activity)라 하였으며, 천연 효소의 비효소 역가(100%)와 비교하여 재접힘 수율을 계산하였다.
(2) Ca 염의 농도에 따른 CGTase의 재접힘 수율
CaCl2를 재접힘 완충액에 다양한 농도로 첨가하여 상기 (1)과 같은 방법으로 재접힘을 실시하였다. 도 14에서 보듯이 Ca 염의 첨가로 재접힘 수율이 상승함을 알 수 있으며 CGTase의 3차 구조의 형성에 Ca 염이 필수적이라는 것을 알 수 있다.
(3) 이온강도 및 pH에 따른 CGTase의 재접힘 수율
일반적으로 이온강도는 단백질의 재접힘에 크게 영향을 미치지 않는다고 알려져 있으나 본 발명은 이온교환수지를 고정화 매체로 사용하므로 단백질과 수지간의 정전기적 상호 작용이 재접힘에 큰 영향을 미칠 것으로 예상되었다. 단백질과 이온교환수지의 정전기적 상호 작용은 이온강도 및 pH를 변화시킴으로써 그 정도를 조절할 수 있다.
고정화되지 않은 용액 상태의 WT CGTase, CGTK10ase 및 SP-세파로즈 수지와 WT CGTase의 혼합물을 사용하고, 재접힘 완충액에 0 내지 400mM의 NaCl을 첨가하여 (1)과 같이 재접힘을 실시하였다. WT CGTase는 수지가 첨가되어도 수지와 결합하여 고정화되지 않기 때문에 리신 융합 부위 이외의 CGTase 내부의 다른 단백질 부위로 인한 수지의 재접힘에 대한 영향을 살펴보기 위한 대조구로 사용되었다. 도 15에서 볼 수 있는 바와 같이, WT CGTase는 전구간에 걸쳐서 NaCl 농도에 큰 영향을 받지 않았으며, 수지가 첨가된 경우에도 약간의 수율 감소가 있었으나 그 효과는 미미하였다. CGTK10ase의 경우에는 WT CGTase의 경우보다 재접힘 수율이 높았으며, NaCl 농도에 큰 영향을 받았다. NaCl 농도가 커질수록 재접힘 수율은 높아졌으며, 400 mM NaCl에서 재접힘 수율은 약 40 % 정도로 WT CGTase의 약 20 %에 비해서 약 2배 증가된 것이다. 용액상 CGTK10ase의 재접힘 수율이 향상된 것은 융합 단백질에 주어진 강력한 전하로 인해서 융합 단백질 분자간 척력이 발생하여 침전이 줄어들었기 때문으로 사료된다. 결과적으로 야생 효소와 융합 효소를 용액상에서 재접힘시켰을 때 융합효소의 재접힘 수율이 향상되었다.
한편, 용액상 WT CGTase, CGTK10ase 및 수지와 WT CGTase의 혼합물을 사용하고 재접힘 완충액의 pH를 6 내지 8.5로 조절하여 (1)과 같이 재접힘을 실시하였다.CGTase의 등전점(pI)은 약 5.0으로서 알짜전하(net charge)는 pH 가 높아질수록 더 크게 음으로 하전된다. 수지가 동시에 첨가된 WT CGTase의 재접힘 수율을 관찰함으로써, CGTase 내부의 하전이 수지와 상호 작용을 통하여 재접힘 수율에 미치는 영향을 알 수 있는데, 도 16에서 보듯이 pH에 따른 차이는 있었지만 수지가 WT CGTase의 재접힘에 큰 영향을 미치지는 않았다. CGTK10ase는 역시 WT CGTase보다 높은 재접힘 수율을 보였다.
(4) 이온강도 및 pH에 따른 고정화된 CGTK10ase의 재접힘 수율
고정화된 CGTK10ase를 사용하고, 재접힘 완충액에 10 내지 400mM의 NaCl을 첨가하여 (1)과 같이 재접힘을 실시하였다.
도 17에서는 고정화된 CGTK10ase의 재접힘 수율을 NaCl 농도에 따라 도시하였는데, 재접힘 효소의 비효소역가로 본 재접힘 수율은 전 NaCl 농도에서 모두 100 % 였다. 그러나 도 17의 검은 점에서 볼 수 있듯이 염의 농도가 높아질수록 단백질은 일정 정도 해리되어 전체적인 회수도도 낮아졌다.
또한, 고정화된 CGTK10ase를 사용하고, 재접힘 완충액의 pH를 6 내지 8.5로 조절하여 (1)과 같이 재접힘을 실시하였다. 도 18은 고정화된 CGTK10ase의 재접힘 수율을 pH에 대하여 도시한 그래프로서, 전반적인 재접힘 수율은 (2)의 WT CGTase 및 용액상 CGTK10ase에 비해 훨씬 높았다. 잔존 단백질의 양은 pH 6.0~8.5 사이에서 거의 일정하였으나, 재접힘 수율의 경우에는 pH에 의해 큰 영향을 받았는데, 단백질 내에 양으로 하전된 부위가 많아지는 pH 7.0 이하에서는 재접힘 수율이 떨어졌다. 이로써 음전하를 강하게 띄고 있는 양이온 교환수지 상에서 재접힘을 실시할 경우 단백질 내부의 양전하의 양을 최소한으로 만들어 수지와 단백질 내부의 하전 부위와의 인력을 최소화시켜주는 것이 중요하다는 사실을 알 수 있다.
(5) 단백질 농도에 따른 효소의 재접힘 효율
WT CGTase, 용액상 CGTK10ase 및 고정화된 CGTK10ase의 재접힘 완충액내의 농도를 0.004 내지 8 ㎎/㎖로 조절하여 (1)과 같이 재접힘을 실시하였다.
도 19 및 도 20은 각각 용액상 효소 및 고정화 효소의 단백질 농도에 따른 효소의 재접힘 효율을 나타낸 그래프로서 도 19a는 회수된 효소의 활성을 나타내는 그래프이고, 도 19b는 비효소 역가의 회수율을 나타내는 그래프이다. 여기에서 보듯이, 용액상의 효소는 재접힘을 실시하는 농도가 높아질수록 기하급수적으로 그 수율이 감소하였다. 이는 재접힘 중간체 또는 변성 단백질 상호간에 재응집이 일어나기 때문이며 그 농도가 높을수록 재응집되는 부분도 커진다. 단백질 농도 0.1 ㎎/㎖ 이상에서는 WT CGTase는 약 4%, CGTK10ase는 약 7 % 정도밖에 재접힘되지 않았다. 그러나 도 20에서 보듯이 리신 융합 부위에 의해 고정화된 융합 효소는 단백질 농도 8 ㎎/㎖에서도 100 % 재접힘이 이루어졌다. 0.1 ㎎/㎖의 WT CGTase가 약 4%의 재접힘 수율을 보인 것과 비교하면 리신 융합 부위를 이용한 고정화 재접힘을 통하여 단백질 농도 80 배에서도 25배의 재접힘 수율을 보임으로써 전체적인 공정 성능은 약 2,000배 정도가 향상되었다고 할 수 있겠다.
이상에서 보듯이, 용액상의 효소는 매우 낮은 단백질 농도에서 재접힘을 실시하였음에도 불구하고 그 수율이 좋지 않았으나 고정화시킨 효소는 매우 높은 단백질 농도임에도 불구하고 그 수율이 매우 높았다. 이는 용액상의 효소는 재접힘과정에서 상당 부분의 단백질이 재접힘 중간체끼리 재응집해서 올바른 접힘을 이룰 수 없으나 고정화 효소의 경우에는 재접힘 중간체 간의 재응집이 방지되었기 때문이다.
실시예 12: 리신이 융합된 라이페이즈 및 내포체 형태로 발현된 CGTK10ase의 정제
상기 실시예 1의 (2)에서 제조된 발현벡터 pLPK10, pLPK12으로E. coliBL21(DE3):pLysE(입수처: Novagen, U.S.A.)을 각각 형질전환시킨 후 암피실린이 들어 있는 플레이트에서 형질전환된 콜로니를 선별하였다.
CGTK10ase를 생산하는E. coliBL21(DE3):pLysE:pTCGTK10과 WT 라이페이즈를 생산하는 세포주E. coliBL21(DE3):pLysE:pELP-1 및 상기 형질전환된 세포주E. coliBL21(DE3):pLysE:pLPK10,E. coliBL21(DE3):pLysE:pLPK12을 LB 배지(암피실린 50 mg/ℓ포함) 5 ㎖에 접종하였다. 이를 37 ℃에서 밤새 배양한 다음 그 중 1 ㎖을 2 g/ℓ의 포도당이 포함된 100 ㎖의 LB 배지에 다시 접종하여 37 ℃에서 배양하였다. 포도당이 소모되는 시점인 배양 4 시간에 IPTG 1 mM을 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다. 원심분리하여 수확한 세포를 50 mM 인산염 완충액(pH 7.4)에 현탁하여 프렌치 프레서(French pressure, Aminco, U.S.A.)를 사용하여 분쇄하였다. 발현된 라이페이즈는 대부분 내포체(inclusion body)로 만들어지므로 원심분리기를 이용하여 가용성 세포추출액인 상층액을 제거하고 침전물을 9 M 우레아(20 mM MOPS 완충액, pH 7.0)로 녹였다. 가용화된 단백질을 실시예 4에 설명된 선택적 결합방법으로 정제하여 SDS-PAGE로 분석한 그림을 도 21에 나타내었다. 도 21에서 S는 표준 분자량 단백질이며 레인 1과 5는 각각E. coliBL21(DE3):pLysE:pTCGTK10와E. coliBL21(DE3):pLysE:pLPK10에서 상기와 같은 방법으로 회수한 내포체로부터 얻은 시료이다. 레인 2, 3, 4와 레인 6, 7, 8은E. coliBL21(DE3):pLysE:pTCGTK10와E. coliBL21(DE3):pLysE:pLPK10의 내포체를 각각 300, 350, 400 mM NaCl에서 선택적으로 결합시킨 후 동일 농도의 염용액으로 세척하고 1 M NaCl로 탈착하여 정제한 효소 용액이다. 이로써 우레아에 의해 변성된 단백질 또한 리신 융합 부위를 이용하여 성공적으로 정제될 수 있으며, 그 정제도 또한 매우 높음을 알 수 있다.
본 발명의 양이온성 아미노산이 융합된 융합단백질은 매우 간편하고 효율적으로 정제할 수 있으며 고정화가 용이하고 재접힘의 효율 및 공정의 성능이 획기적으로 증가한다.

Claims (17)

  1. 리신, 아르기닌 또는 이들의 혼합물이 목적 단백질에 8개 이상 연속적으로 융합된 융합단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 리신 또는 아르기닌 잔기의 수가 10 내지 15개인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 리신 또는 아르기닌이 목적 단백질의 C-말단, N-말단 또는 단백질의 기능에 큰 영향을 미치지 않는 부위에 존재하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 목적 단백질이 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈(cyclodextrin glycosyltransferase) 또는 라이페이즈(lipase)인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코드하는 유전자.
  6. 제 5 항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
  7. 제 6 항에 있어서,
    발현벡터 pTCGTK10, pLPK10 또는 pLPK12.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
  9. 제 8 항에 있어서,
    형질전환체E. coliBL21(DE3):pLysE:pTCGTK10(기탁번호: KCTC 0842BP),E. coliBL21(DE3):pLysE:pLPK10 및E. coliBL21(DE3):pLysE:pLPK12.
  10. 제 8 항의 형질전환체를 배양하고 융합단백질의 발현을 유도시킨 배양액으로부터 세포 추출액을 얻고, 이를 양이온 교환 크로마토그래피로 분리하여 융합단백질을 정제하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피시 100 내지 500 mM의 염농도를 갖는 완충액으로 전세척하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포 추출액에 염을 가하여 염농도를 100 내지 500 mM으로 조절하고 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 8 항의 형질전환체를 배양하고 융합 단백질의 발현을 유도시킨 후, 가용화한 내포체(inclusion body)로부터 양이온 교환수지를 이용하여 융합단백질을 정제하는 방법.
  14. 양이온 교환수지에 리신, 아르기닌 또는 이들의 혼합물이 효소에 8개 이상 연속적으로 융합된 융합효소를 결합시키는 것을 특징으로 하는 고정화 효소의 제조방법.
  15. 제 14 항의 방법으로 제조된 고정화 효소.
  16. 제 15 항의 고정화 효소를 기질과 반응시킴을 특징으로 하는 효소 반응방법.
  17. 변성되어 풀어진(unfolded) 제 1 항의 융합단백질을 양이온 교환수지에 흡착시킨 후 재접힘 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 풀린 단백질의 재접힘 방법.
KR1020000047768A 2000-08-18 2000-08-18 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법 KR20020014459A (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020000047768A KR20020014459A (ko) 2000-08-18 2000-08-18 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법
PCT/KR2001/001394 WO2002018447A1 (en) 2000-08-18 2001-08-17 Fusion protein containing additional cationic amino acids and improvement of bio-operation by using same
KR1020037002004A KR20030034136A (ko) 2000-08-18 2001-08-17 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법
AU2001280223A AU2001280223A1 (en) 2000-08-18 2001-08-17 Fusion protein containing additional cationic amino acids and improvement of bio-operation by using same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020000047768A KR20020014459A (ko) 2000-08-18 2000-08-18 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20020014459A true KR20020014459A (ko) 2002-02-25

Family

ID=19683744

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020000047768A KR20020014459A (ko) 2000-08-18 2000-08-18 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법
KR1020037002004A KR20030034136A (ko) 2000-08-18 2001-08-17 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020037002004A KR20030034136A (ko) 2000-08-18 2001-08-17 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법

Country Status (3)

Country Link
KR (2) KR20020014459A (ko)
AU (1) AU2001280223A1 (ko)
WO (1) WO2002018447A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100494644B1 (ko) * 2002-07-25 2005-06-13 (주)바이오버드 단백질의 산업적인 리폴딩방법
KR100735738B1 (ko) * 2003-12-05 2007-07-06 학교법인 인하학원 Ｓｍｂ 크로마토그래피를 이용하여 단백질을 재접힘시키는방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006108826A1 (en) 2005-04-15 2006-10-19 Novo Nordisk A/S Basic protein purification tags from thermophilic bacteria
WO2008043847A1 (en) 2006-10-13 2008-04-17 Novo Nordisk Health Care Ag Processing enzymes fused to basic protein tags
KR102042741B1 (ko) 2017-09-14 2019-11-08 (주)바이오액츠 영상화용 링커 화합물

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4532207A (en) * 1982-03-19 1985-07-30 G. D. Searle & Co. Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase
US4880911A (en) * 1982-03-19 1989-11-14 G. D. Searle & Co. Fused polypeptides and methods for their detection
WO1997030721A1 (de) * 1996-02-24 1997-08-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung für die immunmodulation beruhend auf peptiden und adjuvantien
KR20020010446A (ko) * 2000-07-26 2002-02-04 최수영 올리고라이신 수송 도메인, 올리고라이신-화물분자 복합체및 그 용도

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4284537A (en) * 1980-07-03 1981-08-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Conjugate of streptococcal M protein peptide vaccine
FR2764988B1 (fr) * 1997-06-20 1999-07-23 Bio Merieux Compose conjugue, reactif et kit le contenant, et utilisations dans un procede de fixation d'un materiel biologique

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4532207A (en) * 1982-03-19 1985-07-30 G. D. Searle & Co. Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase
US4880911A (en) * 1982-03-19 1989-11-14 G. D. Searle & Co. Fused polypeptides and methods for their detection
WO1997030721A1 (de) * 1996-02-24 1997-08-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung für die immunmodulation beruhend auf peptiden und adjuvantien
KR20020010446A (ko) * 2000-07-26 2002-02-04 최수영 올리고라이신 수송 도메인, 올리고라이신-화물분자 복합체및 그 용도

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FEBS Lett 1997 Sep 8;414(2):233-8 *
Nat Biotechnol 1996 Apr;14(4):481-4 *
Nat Biotechnol 1996 Mar;14(3):329-34 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100494644B1 (ko) * 2002-07-25 2005-06-13 (주)바이오버드 단백질의 산업적인 리폴딩방법
KR100735738B1 (ko) * 2003-12-05 2007-07-06 학교법인 인하학원 Ｓｍｂ 크로마토그래피를 이용하여 단백질을 재접힘시키는방법

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001280223A1 (en) 2002-03-13
WO2002018447A1 (en) 2002-03-07
KR20030034136A (ko) 2003-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sassenfeld et al. A polypeptide fusion designed for the purification of recombinant proteins
US6852834B2 (en) Fusion peptides isolatable by phase transition
CN104619726B (zh) 由超折叠绿色荧光蛋白构成的融合蛋白及其用途
US5013653A (en) Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
JP4791436B2 (ja) タンパク質の産生方法
JP6950957B2 (ja) イムノグロブリン結合ポリペプチド
JPH02500876A (ja) 組換えポリペプチドの製品およびその製造、単離および精製方法
JPH06166698A (ja) ハイブリッドポリペプチド
US7462701B2 (en) Non-denaturing process to purify recombinant proteins from plants
CN108179149B (zh) S100b突变体及其应用
US20220402995A1 (en) Improved adeno-associated virus-binding protein, method for producing same, and adeno-associated virus adsorbent using same
KR20020014459A (ko) 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법
CN109942700B (zh) 一种重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体以及胰蛋白酶亲和材料
EP1417237A1 (en) Process for preparation of polypeptides of interest from fusion peolypeptides
US8822640B2 (en) Tetrameric streptavidin mutein with reversible biotin binding capability
WO1991015502A1 (en) Process for purifying polypeptide
Sandgathe et al. Production of a human calcitonin precursor with Staphylococcus carnosus: secretory expression and single-step recovery by expanded bed adsorption
WO2007096899A2 (en) Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins
CN104945488B (zh) 一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽
WO2022138718A1 (ja) イムノグロブリン結合ポリペプチド
WO2022241831A1 (zh) 多肽的制备方法
WO1998038290A1 (en) Aminopeptidase derived from bacillus licheniformis and process for preparation of natural type proteins
Fassina et al. High yield expression and purification of human endothelin-1
JP4086179B2 (ja) 封入体からの多重ｔ細胞エピトープポリペプチドの精製法。
Panov Purification of bacilli ribonucleases by reversed-phase high-performance liquid chromatography

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination