KR100621354B1 - 유비퀴틴을 이용한 아밀로이드-베타 펩티드의 제조방법 - Google Patents

유비퀴틴을 이용한 아밀로이드-베타 펩티드의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유비퀴틴(ubiquitin)을 융합 파트너 단백질로 이용한 아밀로이드-베타(amyloid-β) 펩티드의 신규한 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 1) 아밀로이드-베타 펩티드 유전자를 유비퀴틴 유전자의 3'-말단에 연결시킨 융합유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 3) 상기 형질전환체로부터 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질을 발현시켜 정제하는 단계; 4) 상기 융합단백질에 유비퀴틴 절단효소를 처리하여 융합단백질로부터 아밀로이드-베타 펩티드를 분리하는 단계; 및 5) 상기에서 분리된 아밀로이드 베타 펩티드를 효소 반응액으로부터 정제하는 단계를 포함하는, 아밀로이드-베타 펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법은 유비퀴틴을 융합 파트너 단백질로 이용하여 아밀로이드-베타 펩티드의 화학적 합성시 불용성 및 응집성으로 인한 저수율, 고비용 및 구조적 안정성 저하 등의 문제점을 해결한 것으로 아밀로이드-베타 펩티드를 효율적으로 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유비퀴틴을 이용한 아밀로이드-베타 펩티드의 제조방법{METHOD FOR THE PRODUCTION OF AMYLOID-BETA PEPTIDE USING UBIQUITIN}
도 1a는 본 발명에 따라 합성된 재조합 유비퀴틴의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 유전자의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 1b는 도 1a의 재조합 유비퀴틴 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 과정을 나타낸 것이고,
도 1c는 본 발명에 따라 합성된 재조합 아밀로이드-베타 펩티드의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 유전자의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 1d는 도 1c의 재조합 아밀로이드-베타 유전자를 도 1b의 발현벡터에 클로닝하여 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질을 발현하는 발현벡터를 제조하는 과정을 나타낸 것이고,
도 2a는 도 1d의 발현벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체로부터 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질의 과발현을 전기영동으로 확인한 결과이고,
-: IPTG 무첨가, +: IPTG 첨가
도 2b는 대장균 형질전환체로부터 과발현된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질을 친화성 크로마토그래피로 정제한 결과이고,
도 3a는 정제된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질에 유비퀴틴 절단효소를 처리한 후 효소 반응산물과 이로부터 정제한 아밀로이드 베타 펩티드를 전기영동으로 분석한 결과이고,
도 3b는 도 2b에 따라 정제된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질, 상기 융합단백질에 유비퀴틴 절단효소를 처리한 후의 효소 반응산물 및 이로부터 정제된 아밀로이드 베타 펩티드를 역상 크로마토그래피로 분석한 결과이고,
도 4a 및 4b는 본 발명의 방법에 따라 제조된 재조합 아밀로이드-베타 펩티드가 세포활성에 미치는 효과를 각각 처리농도와 처리시간을 달리하여 측정한 결과이고,
▲: 유전자 재조합 아밀로이드-베타 펩티드(rAβ42)
●: 재조합 유비퀴틴(H6Ub)
■: 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질(H6Ub-Aβ42)
◆: 화학 합성된 아밀로이드-베타 펩티드(Aβ42)
도 4c는 본 발명의 방법에 따라 제조된 재조합 아밀로이드-베타 펩티드가 세포사멸에 미치는 효과를 조사한 결과이다.
본 발명은 유비퀴틴(ubiquitin)을 융합 파트너 단백질로 이용한 아밀로이드-베타(amyloid-β) 펩티드의 신규한 제조방법에 관한 것이다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease) 환자의 뇌에서 공통적으로 발견되는 노인성 반점(senile plaques)의 주성분인 아밀로이드-베타 펩티드(amyloid-β, Aβ)는 40개, 42개 또는 43개 아미노산으로 구성되어 있다. 아밀로이드-베타 펩티드는 아밀로이드 생합성 과정을 통해 아밀로이드 전구대사 단백질(amyloid precursor protein, APP)로부터 만들어지며, 이것이 뇌에 축적되면 신경세포의 퇴행 및 죽음, 신경세포 말단의 시냅스 파괴 등과 같은 독성효과를 나타낸다. 그러나, 아밀로이드-베타 펩티드가 실제로 어떤 경로를 거쳐서 뇌에 축적되고 어떻게 신경세포 주변에 축적되어 신경세포의 퇴행, 죽은 신경세포 말단의 시냅스 파괴, 심한 기억장애를 수반하는 치매 등과 같은 알츠하이머병을 유발하는지에 대해서는 아직까지 명확하게 알려져 있지 않다.
따라서, 아밀로이드-베타 펩티드에 의한 세포독성 작용기전 및 알츠하이머병의 발병 연관성 등을 규명하기 위한 연구가 시급한 실정이며, 이를 위해서는 아밀로이드-베타 펩티드가 대량으로 공급될 필요가 있다. 현재 생산되어 시판되고 있는 대부분의 아밀로이드-베타 펩티드는 화학적 합성법, 예를 들면 고체상 합성법(solid-phase synthesis)의 의해 생산된 것으로, 합성과정 단계의 최적화와 생산수율 증가를 위한 많은 노력들이 이루어지고는 있으나 아밀로이드-베타 펩티드의 고유한 특성인 불용성 및 응집성으로 인하여 생산수율은 저하되고 그에 따른 생산비 용은 증가하는 등의 문제점을 안고 있다. 최근 들어 유전공학적으로 유전자 재조합 기술을 접목하여 아밀로이드-베타 펩티드를 생산하는 방법이 시도되고 있으나, 아밀로이드-베타 펩티드의 효율적인 생산 및 생산된 재조합 단백질의 안정화 등이 해결해야 할 과제로 남아있다.
이에 본 발명자들은 재조합 아밀로이드-베타 펩티드를 생산할 수 있는 새로운 유전공학적 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 아밀로이드-베타 펩티드를 유비퀴틴의 카복시 말단에 융합시켜 미생물에서 발현시킨 후 이를 융합단백질 형태로 정제하고, 유비퀴틴과 아밀로이드-베타 펩티드 사이의 결합을 유비퀴틴 절단효소를 이용하여 절단하여 아밀로이드-베타 펩티드만을 분리하고 정제해냄으로써 화학 합성시 아밀로이드-베타의 불용성 및 응집성으로 인한 저수율, 고비용 및 구조적 안정성 저하 문제를 해결하면서 아밀로이드-베타를 대량으로 생산할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 아밀로이드-베타 펩티드를 유전자 재조합 방법에 의해 고수율로 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아밀로이드-베타 펩티드를 유비퀴틴과의 융합단백질 형태로 미생물에서 발현·정제한 후 유비퀴틴 특이적인 절단효 소를 이용하여 아밀로이드-베타 펩티드만을 효율적으로 분리하고 이를 순수하게 정제하는 단계를 포함하는, 아밀로이드-베타 펩티드의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 제조방법은 응집력이 강한 생화학적인 특성으로 인해 야기되는 정제과정에서의 문제점을 극복하고 아미노산 서열의 변화 없이 아밀로이드-베타 펩티드만을 순수하게 대량 생산할 수 있는 방법으로, 구체적으로는 하기 단계를 포함한다:
1) 아밀로이드-베타 펩티드 유전자를 유비퀴틴 유전자의 3'-말단에 연결시킨 융합유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
3) 상기 형질전환체로부터 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질을 발현시켜 정제하는 단계;
4) 상기 융합단백질에 유비퀴틴 절단효소를 처리하여 융합단백질로부터 아밀로이드-베타 펩티드를 분리하는 단계; 및
5) 상기에서 분리된 아밀로이드 베타 펩티드를 효소 반응액으로부터 정제하는 단계.
상기 제조방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.
단계 1)은 아밀로이드-베타 펩티드를 유비퀴틴과의 융합단백질 형태로 발현 시키기 위하여 아밀로이드-베타 펩티드 유전자를 유비퀴틴 유전자의 3'-말단에 연결시킨 융합유전자를 제조한 후 이를 발현용 벡터에 클로닝하는 단계이다.
본 발명에서 아밀로이드-베타 펩티드의 융합 파트너 단백질로 사용한 유비퀴틴(ubiquitin)은 76개의 아미노산으로 구성된 비교적 작은 단백질로서, 모든 진핵세포에 존재한다. 유비퀴틴은 합성될 때 단독으로 만들어지지 않고 여러 개의 유비퀴틴이 일렬로 연결된 형태 혹은 유비퀴틴의 카복시 말단에 다른 단백질들이 연결된 형태로 만들어진 후, 유비퀴틴 절단효소(ubiquitin C-terminal hydrolase)에 의해 유비퀴틴과 유비퀴틴 사이 혹은 유비퀴틴과 다른 단백질 사이의 펩티드 결합이 정확하게 절단됨으로써 세포내 여러 가지 과정에 관여하는 유비퀴틴 단량체가 생성되게 된다. 이와 같이 유비퀴틴의 생성에 필수불가결한 유비퀴틴 절단효소는 유비퀴틴 뒤에 연결되는 단백질의 아미노산 서열이나 구조에 상관없이 유비퀴틴과 연결 단백질 사이의 펩티드 결합을 정확하게 절단한다.
한편, 유비퀴틴과 유비퀴틴 절단효소를 비롯한 유비퀴틴 관련 효소들은 모든 진핵세포에는 존재하지만 박테리아와 같은 원핵세포에는 존재하지 않기 때문에, 유비퀴틴에 목적 단백질을 연결시킨 융합단백질을 암호화하는 유전자를 원핵세포에서 발현시키면 유비퀴틴이 연결되어 있는 상태의 융합단백질을 얻을 수 있고, 이를 세포 밖에서 유비퀴틴 절단효소로 절단하면 목적하는 단백질만을 유비퀴틴 융합단백질로부터 분리·정제할 수 있으므로 유비퀴틴은 박테리아 등의 미생물을 이용한 단백질의 유전공학적 생산에 매우 효과적이다. 이러한 방법은 특히 세포내 단독으로 발현될 경우 불안정하여 쉽게 분해되는 짧은 펩티드들의 유전공학적 생산을 가능하 게 할 뿐만 아니라 유비퀴틴이 펩티드의 응집을 저해하는 역할도 수행하여 본 발명의 아밀로이드-베타 펩티드와 같이 불용성 및 응집성을 나타내는 단백질의 대량생산에 유용하게 이용될 수 있다.
먼저, 유비퀴틴 유전자의 3'-말단에 아밀로이드-베타 펩티드 유전자가 연결된 융합유전자를 제조하기 위하여, 유비퀴틴 유전자를 박테리아에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하고 양 말단에 벡터로의 클로닝을 용이하게 하기 위한 제한효소 인식부위를 삽입하여 서열번호: 9로 기재되는 염기서열을 갖는 재조합 유비퀴틴 유전자를 제조한다(도 1a 참조). 상기 재조합 유비퀴틴 유전자로부터 코딩되는 유비퀴틴 단백질은 서열번호: 10으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다. 이와 같이 제조된 재조합 유비퀴틴 유전자를 그의 양 말단에 도입된 제한효소 인식부위를 이용하여 동일한 제한효소로 처리된 단백질 발현용 벡터에 클로닝한다(도 1b 참조). 이때, 발현벡터로는 단백질 발현에 유용한 것으로 당해 분야에 공지된 벡터를 어느 것이든 사용할 수 있으나 유비퀴틴이 융합된 상태의 융합단백질을 얻기 위해서는 유비퀴틴 절단효소가 없는 원핵세포에서 상기 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터, 특히 대장균 발현벡터가 바람직하다. 또한, 발현된 융합단백질을 보다 쉽게 분리·정제하기 위하여 유비퀴틴 유전자의 아미노 말단에 6개의 히스티딘-태그(histidine-tag)를 도입할 수 있는 발현벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 발현벡터에 유전자를 클로닝하는 공정은 당해 분야에 공지된 DNA 조작방법, 예를 들면 제한효소를 사용한 절단, 연결효소를 사용한 연결, 중합효소를 사용한 합성 등의 여러 방법을 적절히 조합하여 수행할 수 있다.
아밀로이드-베타 펩티드 유전자를 상기와 동일하게 박테리아에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 합성하는데, 서열번호: 11의 아미노산 서열에서 1∼40번, 1∼42번 혹은 1∼43번 아미노산으로 구성된 아밀로이드-베타 펩티드가 모두 적용될 수 있다. 이때, 아밀로이드-베타 펩티드 유전자의 5'-아미노 말단 부분은 특정 제한효소에 의해 절단된 모양을 가지는 유비퀴틴 유전자의 3'-말단의 염기서열을 포함하고 3'-말단은 종결코돈(TAA)과 다른 특정 제한효소에 의해 절단된 모양을 가지도록 합성한다(도 1c 참조). 이로부터 합성된 재조합 아밀로이드-베타 펩티드 유전자는 서열번호: 18로 기재되는 염기서열을 가지며 이로부터 서열번호: 19로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 아밀로이드-베타 펩티드가 코딩된다. 상기 재조합 아밀로이드 베타 펩티드 유전자를 양 말단에 도입된 제한효소 인식부위에 해당하는 제한효소로 절단한 후 동일한 제한효소로 처리된 재조합 유비퀴틴 발현벡터에 클로닝하여 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한다(도 1d 참조). 상기 발현벡터에 클로닝된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합유전자는 서열번호: 20으로 기재되는 염기서열을 갖는다.
단계 2)는 단계 1)에서 제조된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합유전자를 포함하는 발현벡터를 적절한 숙주세포에 도입시켜 형질전환체를 제조하는 단계로, 숙주세포는 상기 발현벡터를 작동 가능하게 하는 것을 선택하고 형질전환 방법 및 형질전환체의 선별방법은 숙주세포와 발현벡터의 종류와 특성에 따라 공지된 방법 중 적절한 것을 선택하여 사용할 수 있다. 이때, 유비퀴틴과 아밀로이드-베타 펩티드를 융합단백질 형태로 얻기 위해서는 유비퀴틴 절단효소가 존재하지 않는 원 핵세포, 예를 들면 대장균을 숙주세포로 이용하는 것이 바람직하다.
단계 3)은 단계 2)에서 선발된 형질전환체로부터 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질을 발현시켜 정제하는 단계로, 상기 형질전환체를 융합유전자의 발현을 가능하게 하는 조건에서 배양하면서 유도인자, 예를 들면 IPTG를 첨가하여 아밀로이드-베타 펩티드가 유비퀴틴과 융합된 형태로 발현되도록 한다. 전기영동 후 쿠마시 염색(coomassie staining)으로 상기 형질전환체로부터 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질이 과발현됨을 확인한다(도 2a 참조).
이와 같이 형질전환체로부터 과발현된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질을 정제하기 위하여, 형질전환체 배양액을 수확하고 파쇄한 후 원심분리하여 수용성 단백질을 포함하는 상등액을 제거한 나머지 침전물 분획을 회수한다. 침전물 분획에 4 내지 8 M 우레아가 포함되어 있는 완충용액을 가하여 불용성 단백질을 용해시킨 후 원심분리하여 상등액을 회수한다.
본 발명에 따라 형질전환체로부터 발현된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질은 아미노 말단에 6개의 히스티딘-태그를 가지므로, 상기에서 회수된 상등액을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 걸어 융합단백질을 Ni-NTA 수지에 흡착시키고, 흡착시킨 상태에서 우레아를 제거한 후 융합단백질을 정제하고, 정제된 융합단백질을 전기영동에 걸어 쿠마시 염색을 통해 확인한다(도 2b 참조).
단계 4)는 단계 3)에서 정제된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질로부터 유비퀴틴 절단효소를 이용하여 아밀로이드-베타 펩티드를 분리하는 단계이 다.
전술한 바와 같이, 유비퀴틴 절단효소는 대장균과 같은 원핵세포에는 결여되어 있기 때문에 본 발명에 따라 형질전환체로부터 발현된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드는 융합단백질 형태로 정제된다. 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드간의 결합을 절단하기 위하여 유비퀴틴 절단효소의 하나인 효모 유비퀴틴 가수분해효소-1(YUH: yeast ubiquitin hydrolase-1)을 단계 3)에서 정제된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 융합단백질에 3 ㎍/㎎의 농도로 처리한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 이 효소 반응액을 전기영동한 후 쿠마시 염색으로 관찰하여 유비퀴틴 절단효소에 의해 융합단백질에서 유비퀴틴과 아밀로이드-베타 펩티드간의 연결부위가 절단되어 유비퀴틴 단편과 아밀로이드-베타 펩티드 단편으로 분리됨을 확인한다(도 3a 참조).
단계 5)는 단계 4)에서 얻은 반응산물을 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography)에 걸어 아밀로이드-베타 펩티드의 용출시간에 해당하는 분획을 수집한 후 모든 용액성분을 기화시킴으로써 융합단백질로부터 분리된 아밀로이드-베타 펩티드만을 정제하는 단계이다(도 3b 참조). 상기 과정에 의해 본 발명의 제조방법은 약 1 ℓ 배양액으로부터 얻은 3 g의 형질전환 대장균으로부터 약 3 ㎎의 아밀로이드-베타 펩티드를 회수할 수 있다. 이때, 수율은 12％ 이상이다.
본 발명에 따라 제조된 유전자 재조합 아밀로이드-베타 펩티드는 화학적 합성법에 의해 생산된 아밀로이드-베타 펩티드와 동등한 수준으로 세포활성을 감소시키고 세포사멸을 유도한다(도 4a 내지 4c 참조).
따라서, 본 발명의 제조방법은 불용성 및 응집력이 강한 아밀로이드-베타 펩티드의 생화학적인 특성으로 인해 야기되는 저수율, 고비용 및 구조적 안정성 저하 등과 같은 화학적 합성시의 문제점을 해결한 것으로, 아밀로이드-베타 펩티드를 유비퀴틴과의 융합단백질 형태로 미생물에서 발현·정제한 후 특이적인 유비퀴틴 절단효소를 이용하여 융합단백질로부터 유비퀴틴을 제거함으로써 여분의 아미노산 첨가없이 아밀로이드-베타 펩티드만을 순수하게 분리할 수 있으므로, 아밀로이드-베타 펩티드의 대량 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합유전자의 클로닝
유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하기 위해서, 먼저 재조합 유비퀴틴 유전자를 포함하는 단백질 발현벡터를 제작하였다. 우선, 유비퀴틴 유전자를 박테리아에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하기 위하여 서열번호: 1 내지 8로 기재되는 염기서열을 갖는 4쌍의 8개 올리고뉴클레오티드(fUb1, fUb2, fUb3, fUb4, rUb1, rUb2, rUb3 및 rUb4)를 합성하였다. 서로 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(fUb1+rUb1, fUb2+rUb2, fUb3+rUb3 및 fUb4+rUb4)들끼리 결합시켜 4개의 이중가닥 절편 Ub1, Ub2, Ub3 및 Ub4를 생성시켰 다. 이어, Ub1과 Ub2을, Ub3과 Ub4를 각각 라이게이션시킨 후 생성된 2개의 이중가닥 절편을 다시 라이게이션시킴으로써 전장의 유비퀴틴 유전자를 제조하였다. 이때, 각각의 라이게이션 반응은 20 ㎕의 라이게이션 완충용액에 500 ng의 각 올리고뉴클레오티드와 5 단위의 T4 DNA 리가아제를 첨가한 후 이를 16℃에서 16시간 동안 수행하였다. 상기 재조합 유비퀴틴 유전자는 서열번호: 9로 기재되는 염기서열을 가지며, 도 1a에 나타낸 바와 같이 유비퀴틴의 카복시 말단은 제한효소 XhoI에 의해 절단된 모양인 5'-C-3'의 3'-말단을 가지고, 5'-말단은 제한효소 BamHI에 의해 절단된 모양인 5'-GATCC-3'을 갖도록 합성되었다. 이와 같이 양 말단에 BamHI 및 XhoI 절단부위를 갖는 재조합 유비퀴틴 유전자를 BamHI 및 XhoI으로 절단된 pET28a 벡터(Novagen사)에 직접 클로닝하여 재조합 유비퀴틴 발현벡터 pET/H6Ub를 제조하였다(도 1b). 상기 발현벡터 pET/H6Ub는 유비퀴틴의 아미노 말단에 여섯 개의 히스티딘-태그가 연결된 형태로 발현시킬 수 있으며, 이로부터 발현된 재조합 유비퀴틴은 서열번호: 10으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 유비퀴틴의 카복시 말단부위(215-220 bp)는 제한효소 AflⅡ의 인식부위(CTTAAG)를 포함하도록 고안하여 이후의 클로닝 과정에서 사용하였다.
한편, 서열번호: 11로 기재되는 아미노산 서열에서 1∼42번의 아미노산으로 구성된 아밀로이드-베타42 펩티드를 코딩하는 유전자를 상기와 동일한 방법에 따라 서열번호: 12 내지 17로 기재되는 염기서열을 갖는 3쌍의 6개 올리고뉴클레오티드(fAβ1, fAβ2, fAβ3, rAβ1, rAβ2 및 rAβ3)를 이용하여 합성하였다(도 1c). 서로 상보적인 올리고뉴클레오티드들이 짝을 이루어(fAβ1+rAβ1, fAβ2+rAβ2, fAβ3+rAβ3) 3개의 이중가닥 절편 Aβ1, Aβ2 및 Aβ3을 형성한 후 이들을 순차적으로 라이게이션시켜 완성된 재조합 아밀로이드-베타 펩티드 유전자는 서열번호: 18로 기재되는 염기서열을 가지며, 이로부터 서열번호: 19로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 재조합 아밀로이드 베타 펩티드가 코딩된다. 도 1c에 나타난 바와 같이, 재조합 아밀로이드-베타 펩티드 유전자의 5'-말단부분은 AflⅡ에 의해 절단된 모양인 5'-TTAAG-3'와 도 1a의 잔여 유비퀴틴 카복시 말단의 염기서열인 5'-ACTGCGTGGCGGC-3'을 함께 포함하고, 3'-말단은 종결코돈(TAA)과 XhoI에 의해 절단된 모양인 5'-C-3'을 가지므로, 이를 AflⅡ와 XhoI에 의해 절단된 유비퀴틴 단백질 발현벡터 pET/H6Ub에 삽입하여 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 발현벡터 pET/H6Ub-Aβ42를 제조하였다(도 1d). 염기서열 분석 결과, 상기 발현벡터에 클로닝된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합유전자는 서열번호: 20으로 기재되는 염기서열을 갖는다.
<실시예 2> 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질의 발현 및 정제
상기 실시예 1에서 제조된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pET/H6Ub-Aβ42로 대장균 BL21(DE3) 균주(Novagen사)를 형질전환시킨 후 1 ㎖의 LB 액체배지를 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 이를 가나마이신(30 ㎍/㎖)을 포함하는 LB 고체배지에 도말하여 유비퀴틴-아밀로이 드-베타 펩티드 융합유전자가 클로닝된 형질전환체를 선별하였다. 이와 같이 선별된 형질전환체를 다시 가나마이신(30 ㎍/㎖)을 포함하는 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 4시간 동안 진탕 배양한 후 1 mM의 ITPG를 첨가하고 동일한 온도에서 3시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양액을 5,000 ×g에서 20분간 원심분리하여 여분의 배양액을 제거하고 세포 침전물만을 수득하였다. 이때, 재조합 유비퀴틴 유전자를 포함하는 발현벡터 pET/H6Ub가 형질전환된 대장균을 대조군으로 사용하였다.
상기 형질전환체로부터 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질의 과발현 여부를 확인하기 위하여, 회수된 세포 침전물을 4％ SDS에 용해시켜 전기영동을 수행한 후 쿠마시 염색으로 확인하였다. 그 결과, IPTG 유도인자를 첨가하여 단백질 발현을 유도한 경우(+)에 약 17 kDa 위치에서 두꺼운 단백질 밴드가 검출되어 본 발명의 형질전환체로부터 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질이 과발현되었음을 알 수 있었다(도 2a). 도 2a에서 약 10 kDa 위치에서 검출된 단백질 밴드는 대조군 형질전환체로부터 과발현된 유비퀴틴을 의미한다.
상기와 같이 대장균 형질전환체로부터 과발현된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질을 배양액으로부터 정제하기 위하여, 3 g의 세포 침전물을 15 ㎖의 완충용액 A(50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0)에 현탁한 후 초음파 분쇄기로 세포를 분쇄하여 세포 균질액을 얻었다. 상기 세포 균질액을 10,000 ×g에서 30분간 원심분리하여 수용성 단백질을 포함하는 상등액과 불용성 침전물로 분리하였다. 과발현된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질은 불용성으로 침전물 분획 에 존재하므로 원심분리 후 상등액은 제거하고 침전물 분획만을 수거하였다. 수거한 불용성 침전물을 완충용액 A에 8 M 우레아를 첨가한 15 ㎖의 완충용액 B에 현탁시키고 상온에서 1시간 동안 교반한 후 10,000 ×g에서 30분간 원심분리하여 용해되지 않은 침전물을 제거하고 상등액만을 얻었다.
상기 상등액을 Ni-NTA 컬럼(Novagen사)에 넣고 4℃에서 3시간 동안 지속적으로 섞어주면서 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질의 아미노 말단에 부착된 6개의 히스티딘-태그가 Ni-NTA 수지에 흡착하도록 반응시켰다. 여기에 10 ㎖의 완충용액 A를 넣고 세척한 후 Ni-NTA 수지가 가라앉도록 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하였으며, 이러한 과정을 3회 반복하였다. 융합단백질이 결합된 Ni-NTA 수지를 완충용액 A에 50 mM의 이미다졸(imidazole)이 첨가된 2 ㎖의 완충용액 C로 세척하여 잔존하는 우레아 성분을 제거한 후 완충용액 A에 400 mM 이미다졸이 첨가된 완충용액 D를 이용하여 Ni-NTA 수지로부터 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질을 용출하였다. 이로부터 용출된 분획을 전기영동한 후 쿠마시 염색으로 관찰한 결과, 형질전환체 배양액으로부터 약 17 kDa의 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질이 순수하게 정제되었음을 확인하였다(도 2b).
<실시예 3> 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질로부터 아밀로이드-베타 펩티드의 분리 및 정제
대장균과 같은 원핵세포는 유비퀴틴 절단효소를 가지고 있지 않기 때문에 상기 실시예 2에서 대장균 형질전환체로부터 발현된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티 드는 융합단백질 형태로 정제되었다. 이로부터 아밀로이드-베타 펩티드만을 분리하기 위하여 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드간의 결합을 특이적으로 절단할 수 있는 효모 유래 유비퀴틴 절단효소 YUH-1을 공지된 재조합 단백질 기법으로 정제하여 사용하였다(Protein Expression and Purification 40: 183-189, 2005). 상기 실시예 2에서 정제된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 융합단백질에 YUH-1을 3 ㎍/㎎의 농도로 처리하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 융합단백질로부터 유비퀴틴과 아밀로이드-베타 펩티드간의 연결부위를 절단하였다. 상기 반응 혼합물로부터 아밀로이드-베타 펩티드만을 분리하기 위하여 C8 수지로 된 POROS R2 컬럼(Applied Biosystems사)을 이용한 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography)를 수행하였다. 이때, 크로마토그래피에 걸기 전에 반응 혼합물을 10％ 아세트산 용액으로 산성화시켰으며, 용출용액으로는 용액 A(0.05％ 트라이플루오로아세트산) 및 용액 B(0.05％ 트라이플루오로아세트산, 90％ 아세토나이트릴)를 용액 B의 농도를 점증시키면서 사용하였다. 그 결과, 아밀로이드-베타 펩티드는 용액 B의 농도가 33％되는 지점에서 용출되기 시작하였고, 이때의 컬럼으로부터 아밀로이드-베타 펩티드의 용출시간은 7.5 분이었으며, 이 부분의 분획을 수집한 후 모든 용액성분을 기화시켜 아밀로이드-베타 펩티드만을 분리하였다.
도 3a는 유비퀴틴 절단효소 처리에 의해 융합단백질로부터 아밀로이드-베타 펩티드만을 분리하는 각각의 단계에서 얻은 시료를 전기영동한 후 쿠마시 염색으로 관찰한 것으로, 레인 1은 정제된 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질을, 레인 2는 유비퀴틴 절단효소 처리 반응 혼합물을, 레인 3은 상기 반응 혼합물로부 터 분리하여 정제된 아밀로이드-베타 펩티드를 나타낸다.
도 3b는 상기 도 3a의 각 단계 시료의 역상 크로마토그래피 결과로, 아밀로이드-베타 펩티드가 7.5분에서 용출됨을 알 수 있다. 상기와 같은 분리과정에 의해 약 1 ℓ의 배양액으로부터 수거한 3 g의 형질전환 대장균으로부터 약 3 ㎎ 이상의 아밀로이드-베타 펩티드를 회수하였고, 이때의 수율은 12％ 이상인 것으로 나타났다.
<실시예 4> 유전자 재조합 아밀로이드-베타 펩티드의 생리활성 측정
본 발명에 따라 생산된 유전자 재조합 아밀로이드-베타 펩티드의 생리활성을 화학적 합성법에 의해 생산된 아밀로이드-베타 펩티드와 비교하기 위하여 이들의 진핵세포 내 미토콘드리아 활성을 하기와 같이 조사하였다.
먼저, 본 발명에서 생산된 아밀로이드-베타 펩티드 0.45 ㎎을 20 ㎕의 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후 980 ㎕의 DMEM 배지를 첨가하여 최종 농도 100 μM의 아밀로이드-베타 펩티드 용액을 제조하였다. 상기 용액을 4℃에서 24시간 동안 보관한 후 원심분리하여 침전물을 제거하였고 상등액만을 수거하여 50 ㎕씩 에펜도르프 튜브에 분주하고 -80℃에 보관하였다.
인간 뇌종양 세포주 SH-SY5Y(ATCC CRL-2266)를 DMEM/10％ FBS의 배지를 이용하여 7×103 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 분주한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기에서 준비된 유전자 재조합 아밀로이드-베타 펩티드 용액을 최종 농도가 1, 2 또는 4 μM이 되도록 각 웰에 첨가하고 웰 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포활성은 세포내 미토콘드리아 활성을 측정하는 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석법을 이용하여 분석하였다. 상기 웰 플레이트에 MTT를 0.8 ㎎/㎖의 농도로 첨가한 후 37℃에서 5시간 동안 세포내 미토콘드리아의 탈수소효소 작용이 일어나도록 반응시켰다. 이로부터 형성된 포르마잔 결정을 다이메틸 설폭사이드를 이용해 용해시킨 후 550 ㎚의 파장에서 형광도를 측정하여 도 4a에 그래프로 나타내었다.
도 4a에서 농도별로 감소하는 그래프는 유전자 재조합 아밀로이드-베타 펩티드(rAβ42: ▲)가 세포활성을 감소시킴을 나타내는 것으로, 동일한 정제과정을 거친 유전자 재조합 유비퀴틴(H6Ub: ●)을 대조군으로, 유비퀴틴-아밀로이드 융합단백질(H6Ub-Aβ42: ■) 및 화학 합성법에 의해 합성된 아밀로이드-베타 펩티드(Aβ42: ◆)를 비교군으로 사용하였다. 이로부터, 본 발명에 따른 유전자 재조합 아밀로이드-베타 펩티드가 기존의 화학 합성법에 의한 아밀로이드-베타 펩티드와 동일한 수준으로 농도가 증가함에 따라 세포활성을 저해함을 알 수 있다.
도 4b는 본 발명에 따른 유전자 재조합 아밀로이드-베타 펩티드의 처리 시간에 따른 세포활성의 변화를 측정한 결과로, 5 μM의 아밀로이드-베타 펩티드를 상기와 동일한 세포에 12, 24 및 48시간 동안 처리한 경우에 처리시간이 길어질수록 세포활성이 감소됨을 알 수 있다.
도 4c는 본 발명에 따른 유전자 재조합 아밀로이드-베타 펩티드에 의한 세포 사멸 정도를 트립판 블루(trypan blue) 염색을 이용하여 측정한 결과로, 5 μM의 아밀로이드-베타 펩티드를 상기와 동일한 세포에 36시간 동안 처리한 후 트립판 블루에 의해 검은 색으로 염색된 세포 수를 조사하여 상대적인 세포사멸 정도를 계산하였다. 이로부터 유전자 재조합 아밀로이드-베타 펩티드(rAβ42)가 유전자 재조합 유비퀴틴(H6Ub)이나 유비퀴틴-아밀로이드 융합단백질(H6Ub-Aβ42) 보다는 현저하게 높고, 화학 합성법에 의해 합성된 아밀로이드-베타 펩티드(Aβ42)와는 동등하거나 약간 높은 수준의 세포사멸 활성을 나타냄을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제조방법은 유비퀴틴을 융합 파트너 단백질로 사용하여 미생물로부터 아밀로이드-베타 펩티드를 융합단백질 형태로 대량 생산한 후 유비퀴틴 절단효소를 이용하여 아밀로이드-베타 펩티드만을 용이하게 분리하고 이를 정제함으로써 불용성 및 응집성으로 인한 화학적 합성시 야기되는 고비용, 저수율 및 구조적 안정성 저하 등의 문제점을 극복하고 여분의 아미노산의 첨가없이 아밀로이드-베타 펩티드만을 순수하게 생산할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

1) 아밀로이드-베타 펩티드 유전자를 유비퀴틴 유전자의 3'-말단에 연결시킨 융합유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
3) 상기 형질전환체로부터 유비퀴틴-아밀로이드-베타 펩티드 융합단백질을 발현시켜 정제하는 단계;
4) 상기 융합단백질에 유비퀴틴 절단효소를 처리하여 융합단백질로부터 아밀로이드-베타 펩티드를 분리하는 단계; 및
5) 상기에서 분리된 아밀로이드 베타 펩티드를 효소 반응액으로부터 정제하는 단계를 포함하는, 아밀로이드-베타 펩티드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
단계 1)의 아밀로이드-베타 펩티드가 서열번호: 11로 기재되는 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 28개 내지 43개의 아미노산으로 구성된 것임을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서,
단계 1)의 발현벡터가 원핵세포에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서,
단계 2)의 숙주세포가 원핵세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서,
단계 3)에서 융합단백질이 유비퀴틴의 카복시 말단에는 아밀로이드-베타 펩티드가, 아미노 말단에는 6개의 히스티딘-태그가 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서,
단계 3)에서 융합단백질의 정제가
1) 형질전환체 배양액을 수확하고 파쇄한 후 원심분리하여 침전물 분획을 회수하는 단계;
2) 상기 침전물 분획에 4 내지 8 M 우레아가 포함되어 있는 완충용액을 가하여 불용성 단백질을 용해시킨 후 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계;
3) 상기 상등액을 우레아 함유 완충용액을 이용한 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 걸어 융합단백질을 Ni-NTA 수지에 흡착시키는 단계;
4) 융합단백질이 Ni-NTA 수지에 흡착된 상태에서 우레아를 제거하는 단계; 및
5) Ni-NTA 수지로부터 이미다졸 함유 완충용액을 이용하여 흡착된 융합단백질을 용출하는 단계에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서,
단계 5)에서는 단계 4)에서 유비퀴틴 절단효소로 절단된 융합단백질의 효소 반응액을 역상 크로마토그래피에 걸어 아밀로이드-베타 펩티드만을 정제하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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