KR20240043838A - 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 펩타이드 태그를 포함하여 자가 조립체를 형성하는 융합 단백질 및 이를 이용하여 재조합 단백질을 정제하는 방법 - Google Patents
주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 펩타이드 태그를 포함하여 자가 조립체를 형성하는 융합 단백질 및 이를 이용하여 재조합 단백질을 정제하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 펩타이드 태그, 상기 태그와 목적 단백질이 융합된 융합 단백질 및 이를 이용한 목적 단백질 정제 방법에 관한 것으로, 상기 펩타이드 태그는 목적 단백질과 융합하여 자가 조립체 형성 유도능이 있으므로, 이를 이용한 목적 단백질 정제 방법은 원심분리 또는 여과 방법과 같은 매우 간단한 방법만으로 목적 단백질을 분리 정제가 가능하다.
Description
본 발명은 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산(charged and hydrophobic amino acids)으로 구성된 비정형(intrinsically disordered) 펩타이드 태그를 포함하는 융합 단백질, 이를 포함하는 재조합 단백질 정제용 조성물 및 이를 이용한 재조합 단백질 정제 방법에 관한 것이다.
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
1. 한국연구재단 중견연구자지원사업
- 부처명: 과기부
- 연구 책임자: 김대헌(순천대학교 생물학과)
- 연구관리전문기관 및 연구사업명: 한국연구재단/중견연구자지원사업
- 한국연구재단 과제번호: NRF-2019R1A2C1090477
- 과제명: 자가 조립체 유도방식의 차세대 재조합 단백질 정제시스템 개발
- NTIS 과제고유번호: 1711166609 (2022년 과제)
- 과제 기여도: 80%
- 주관기관: 순천대학교
- 연구기간: 2019.03.01. ~ 2023.02.28.
2. 한국연구재단 신진연구자지원사업
- 부처명: 과기부
- 연구 책임자: 김대헌(순천대학교 생물학과)
- 연구관리전문기관 및 연구사업명: 한국연구재단/신진연구자지원사업
- 한국연구재단 과제번호: NRF-2017R1C1B2009362
- 과제명: 기능성 단위체를 포함하는 재조합 유전자의 발현에 의한 초거대 분자 조립체 유도 방식의 새로운 재조합 단백질 정제 시스템 개발
- NTIS 과제고유번호: 1711085848 (2019년 과제)
- 과제 기여도: 20%
- 주관기관: 순천대학교
- 연구기간: 2017.06.01. ~ 2020.02.29.
일반적으로 MBP(maltose-binding protein) 태그, GST(glutathione s-transferase) 태그와 함께 His 태그 (또는 His6 태그) 또는 HAT 태그(natural histidine affinity tag)는 재조합 단백질의 정제에 널리 사용되고 있다. 재조합 단백질의 정제에 His 태그를 이용하는 일반화된 방법은, His 태그를 재조합 단백질에 융합하여 친화 크로마토그래피를 통해 니켈 이온 또는 코발트 이온이 고정화된 Ni2+-NTA 비드(bead or resin) 또는 Co2+-CMA 비드에 결합시킨 후, 과량의 이미다졸(imidazole) 또는 낮은 pH 처리를 통해 비드에 결합된 재조합 단백질을 용출(elution)시키는 방식으로 정제한다. 즉, 아미노산 히스티딘과 구조가 유사한 이미다졸이 His 태그와 경쟁하여 Ni2+-NTA 비드 또는 Co2+-CMA 비드에 결합하려는 원리를 이용하여 His 태그가 융합된 재조합 단백질을 용출하는 것이다(Kerpe K. 2003). 이처럼 의료용 단백질을 포함하는 재조합 단백질의 정제에 가장 널리 사용되고 있는 방법은 친화 태그(affinity tag)를 이용하거나 항체에 대한 결합력을 갖는 protein A를 이용한 흡착(친화성) 크로마토그래피법이다. 그러나, 이러한 정제 방법은 고가의 비드(bead or resin)를 사용하여 많은 시간이 소요되는 복잡한 여러 단계의 정제 과정을 거쳐야 하며, 비드에 대한 비특이적 결합력을 가지는 단백질들의 오염으로 인해 정제 순도가 다소 낮아지고, 정제 후 크기가 큰 태그를 제거하는 과정이 필요하며, 다른 종류의 재조합 단백질 생산에 재활용 비드의 사용이 어려운 점 등의 다양한 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점들은 정제 단계의 scale-up을 제한하고 생산비용을 증가시키는 주요한 요인으로 작용한다.
다른 한편으로, 핵 형성(nucleation) 또는 이량체 등의 다량체 형성이 가능한 모티프, 도메인 또는 펩타이드에 대해 많은 연구가 진행되었다. 코일 구조(coil structure)를 형성하는 루이신 지퍼 펩타이드(isoleucine zipper peptide) 내에 인위적으로 히스티딘 잔기를 도입함으로써 Ni2+, Zn2+, Cu2+의 금속이온 의존적인 삼량체(trimer)를 형성한다는 것이 보고되었다. 그리고 역시 코일 구조를 가지는 TZ1H 펩타이드가 Ag2+ 또는 pH 의존적인 구조 전환을 통해 삼량체를 형성하는 것이 알려져 있다. 뿐만 아니라, 다양한 생물종에서 발견되는 철 저장 단백질 페리틴(ferritin)은 철이온과 결합할 수 있는 능력이 있으며, 24개의 페리틴 단백질이 결합하여 하나의 페리틴 복합체(ferritin complexes)를 형성한다는 것이 보고되었다. 나아가, 알파-나선구조(α-helical) 펩타이드 18A, 베타-병풍구조(β-strand) 펩타이드 ELK16, 양친매성의 계면 활성제 유사 펩타이드 L6KD, 그리고 소수성 펩타이드 GFIL8 등은 세포 내에서 응집체(inclusion bodies)를 형성한다는 것이 알려져 있다. 이외에도, ELPs(Elastin like polypeptides)는 열처리 조건하에서 단백질 응집(aggregation)이 이루어진다는 것이 보고되었으며, 이러한 특성을 이용하여 재조합 단백질의 정제에 응용하고자 하는 연구들이 진행되었고, 칼모듈린(calmodulin)과 M13 펩타이드는 칼슘이온 의존적인 결합이, Atox1과 WD4간의 결합력은 Zn2+, Cu2+, Pt2+ 의존적으로, 그리고 FRB(FKBP12-Rapamycin binding protein)와 FKBP(FK506 binding protein)은 rapamycin이 존재하는 조건하에서 특이적인 결합을 한다는 것이 보고되었다.
전술한 기술적 또는 특정 단백질의 모티프, 도메인 또는 펩타이드의 특성적 배경 하에서, 본 발명자들은 기존의 재조합 단백질 정제 방법의 문제점을 해결하고 기존 방법과는 전혀 다른 개념인 특정 유도제(inducer) 또는 조건 처리를 통해 거대분자 조립체 형성을 유도하여 원심분리 또는 여과와 같은 간단한 방법으로 고순도의 재조합 단백질을 선택적으로 정제할 수 있는 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 기존의 재조합 단백질 정제 방법 즉, 정제 과정에 고가의 비드 또는 레진의 사용, 정제를 위해 구동되는 고가의 장치 또는 설비 필요, 많은 시간 소요 및 여러 단계의 복잡한 과정을 거치는 등의 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 특정 유도제 또는 조건 의존적으로 재조합 단백질에 융합된 태그의 거대분자 자가 조립체 형성을 유도하여 원심분리, 여과 등의 간단한 방법만으로 목적하는 재조합 단백질 분리 정제하는 방법에 관한 것이다. 이를 통해 고가의 비드 또는 레진이 필요하지 않으면서 매우 쉽고, 빠르고, 간편하고, 고순도, 고효율, 저비용으로 재조합 단백질을 정제할 수 있는 경쟁력 있는 차세대 재조합 단백질 정제 방법을 개발하고자 함이다.
본 출원의 일 예는 자가 조립체를 형성하는 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 태그를 제공한다.
본 출원의 다른 예는 서열번호 1로 표시되는 제1 폴리펩타이드 및 주요 아미노산이 전하성 및 소수성으로 구성된 비정형 태그인 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주세포를 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.
본 출원의 다른 예는 서열번호 1로 표시되는 제1 폴리펩타이드 또는 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 정제용 조성물을 제공한다.
본 출원의 다른 예는 서열번호 1로 표시되는 제1 폴리펩타이드 또는 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 자가 조립체를 제공한다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 펩타이드 태그를 제공한다.
상기 자가 조립체를 형성하는 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 펩타이드 태그의 전하성 아미노산은 Lysine(Lys, K), Arginine(Arg, R) 및 Histidine(His, H)의 양전하성 아미노산과 Aspartate(Asp, D) 및 Glutamate(Glu, E)의 음전하성 아미노산 중에서 선택될 수 있고, 소수성 아미노산은 Alanine(Ala, A), Valine(Val, V), Leucine(Leu, L), Isoleucine(Ile, I), Proline(Pro, P), Phenylalanine(Phe, F), Methionine(Met, M) 및 Tryptophan(Trp, W) 중에서 선택될 수 있으며, 힌지 영역 또는 링크 부위를 제외한 비정형 태그 내에서 전하성 및 소수성 아미노산의 함유량이 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 비정형 펩타이드 태그는 PSIAEH 태그, PSIAHEK 태그, PSIHEKIHEK 태그 및 PSIA 태그로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 핵 형성 또는 이량체 등의 다량체 형성이 가능한 펩타이드일 수 있다.
상기 비정형 펩타이드 태그는 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어“비정형 펩타이드 태그”는 일반적인 조건에서 알파-나선 또는 베타-병풍의 2차 구조 또는 3차 구조와 같은 일정한 형태가 정해지지 않은 흐트러진 영역으로 이루어진 펩타이드를 의미할 수 있으며, “비정형 펩타이드 태그”는 “비구조화 펩타이드 태그” 또는“제2 폴리펩타이드”와 혼용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 비정형 펩타이드 태그 또는 상기 비정형 펩타이드 태그와 목적 단백질이 융합된 재조합 융합 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이를 발현하는 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 비정형 태그 또는 상기 비정형 태그와 목적 단백질이 융합된 재조합 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 비정형 태그를 포함하거나, 상기 비정형 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 단백질 정제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 특성을 갖는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 제1 폴리펩타이드는 정제 태그일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 폴리펩타이드는 Ni2+ 또는 Co2+에 결합할 수 있는 His 태그, 이의 오리지널 형태인 HAT 태그, 또는 His 태그의 변형된 HQ 태그(또는 HQ6 태그)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 His 태그는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
상기 제2 폴리펩타이드는 핵 형성 또는 이량체 등의 다량체 형성이 가능한 모티프, 도메인 또는 펩타이드일 수 있다. 구체적으로, 상기 제2 폴리펩타이드는 PSIAEH, PSIAHEK, PSIHEKIHEK 및 PSIA 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제2 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 상기 PSIAEH, PSIAHEK, PSIHEKIHEK 및 PSIA 펩타이드는 각각 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 것일 수 있다.
상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드는 순차적으로 연결되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는 융합된 재조합 융합 단백질을 제공한다.
상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 목적 단백질의 C-말단뿐만 아니라, N-말단 또는 단백질의 기능성에 실질적인 영향을 미치지 않는 한 단백질 내부의 어느 곳에라도 삽입할 수 있다. 여기에서 단백질의 기능성에 실질적인 영향을 미치지 않는다는 것은 상기 융합 폴리펩타이드를 융합시키기 전에 단백질이 갖는 활성을 80% 이상, 바람직하게는 95% 이상 유지한다는 것을 의미한다.
본 발명에서 “재조합 단백질”은 각각의 부분이 별개의 기능을 포함하는 적어도 2개의 부분을 포함하는 아미노산(펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질)의 중합체를 의미한다. 재조합 단백질의 적어도 하나의 제1 부분은 적어도 하나의 본 발명의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하고, 재조합 단백질의 적어도 하나의 제2 부분은 적어도 하나의 목적 단백질(또는 펩타이드)를 포함한다.
본 발명에서 “목적 단백질”은 생산 또는 정제의 목적이 되는 임의의 단백질로서, 펩타이드를 포함하는 의미이고, 본 명세서 내에서 “표적 단백질”의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 목적 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 과립구 콜로니자극인자(rhG-CSF), 인터페론 알파 2(INF-a2) 및 TEV 단백질분해효소(TEV protease)를 예시로서 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 용어 “목적 단백질”은 본 발명에 따른 생명공학적 방법으로 생산하고자 하는 단백질을 말하는 것으로, 특별히 어느 하나에 제한되지 않으며, 바람직하게는 의료용, 산업용, 진단용, 실험용 등의 용도로 사용될 수 있는 단백질이 포함될 수 있다.
상기 융합 단백질은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드와 목적 단백질 사이에 단백질 절단효소의 절단 부위, 면역글로불린의 힌지 영역, 목적 단백질 또는 이들 모두를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 힌지 영역은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 융합 단백질은 재조합 융합 단백질에서 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제거하기 위해 융합 폴리펩타이드와 목적 단백질 사이에 태브(TEV) 단백질분해효소 절단 부위 또는 Ni2+에 의해 절단될 수 있는 스넥 태그(SNAC tag) 등 일반적으로 단백질 정제에 이용되는 절단부위를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 21의 염기서열일 수 있고, 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22 내지 서열번호 25의 염기서열일 수 있다.
본 명세서에 기재된 서열목록의 염기서열은 별도의 표시가 없더라도 5’ 말단으로부터 3’ 말단의 방향으로 기재된 것이다.
또한, 본 발명은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 재조합(recombinant)은 유전자 조작(genetic manipulation)과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝(molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다.
본 발명에서 발현(expression)은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.
본 발명에서 재조합 발현 벡터란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 명세서에서 “작동가능하게 연결된(operably linked)”이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 발현조절서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(pPICZ, YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 pET-28a 벡터를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주세포를 제공한다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫(rat) 세포, 마우스 (mouse) 세포, 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있고, 바람직하게는 대장균 (E. coli)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질전환 할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 융합 단백질을 과발현 또는 대량으로 생산할 수 있다.
또한, 본 발명은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주세포를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.
상기 융합 폴리펩타이드 또는 목적 단백질에 관한 내용은 상기한 바와 같다.
상기 목적 단백질을 정제하는 방법은 상기 배양하는 단계 이후에, 숙주세포로부터 융합 단백질을 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질 추출 단계에서 사용되는 완충 용액은 HEPES, Tris, 또는 phosphate 등 일반적으로(통상적으로) 단백질 추출에 사용하는 완충 용액일 수 있고, 바람직하게는 HEPES 완충 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 융합 단백질 추출 단계에서 세포 파쇄 효율을 높이기 위해 Triton X-100과 같은 계면활성제를, 단백질 분해를 억제하기 위해 다양한 단백질분해효소 억제제가 혼합된 protease inhibitor cocktail을 첨가할 수 있다.
상기 목적 단백질을 정제하는 방법은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주세포로부터 얻은 상기 융합 단백질의 자가 조립체 형성을 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 자가 조립체 형성을 유도하는 단계는 자가 조립체 형성을 촉진하게 위한 특정 조건으로 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 자가 조립체 형성을 유도하기 위한 특정 조건은 유도제의 종류, 유도제의 농도, 염(salt)의 종류, 염의 농도, pH 조건, 완충 용액의 종류, 온도, 반응 시간 등의 물리·화학적 조건일 수 있다.
상기 자가 조립체 형성을 유도하는 단계는 자가 조립체 형성을 촉진하기 위한 유도제를 첨가하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 유도제를 첨가함에 따라 거대분자 자가 조립체 형성 유도가 촉진될 수 있다.
상기 유도제는 양이온성 물질일 수 있고, 구체적으로, Ni2+, Co2+, Zn2+, Cu2+, Ag2+, Fe2+ 및 Ba2+ 등 양이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으며, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 조합에 따라 자가 조립체 형성을 유도하기 위한 적절한 유도제의 종류가 상이할 수 있다.
상기 유도제는 0.1 내지 2.0 mM, 0.1 내지 1.5 mM, 0.1 내지 1.0 mM, 0.1 내지 0.7 mM 0.3 내지 2.0 mM, 0.3 내지 1.5 mM, 0.3 내지 1.0 mM, 0.3 내지 0.7 mM, 0.4 내지 2.0 mM, 0.4 내지 1.5 mM, 0.4 내지 1.0 mM, 0.4 내지 0.7 mM, 0.4 내지 0.6 mM, 또는 0.5 mM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 자가 조립체 형성을 유도하는 단계는 염을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 염은 황산암모늄 또는 염화나트륨 등 일반적으로 단백질 침전에 사용되는 염일 수 있고, 바람직하게는 황산암모늄일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 황산암모늄은 5 내지 30% (w/v), 5 내지 27% (w/v), 5 내지 25% (w/v), 5 내지 23% (w/v), 7 내지 30% (w/v), 7 내지 27% (w/v), 7 내지 25% (w/v), 7 내지 23% (w/v), 10 내지 30% (w/v), 10 내지 27% (w/v), 10 내지 25% (w/v), 10 내지 23% (w/v), 12 내지 30% (w/v), 12 내지 27% (w/v), 12 내지 25% (w/v), 12 내지 23% (w/v), 또는 12 내지 22% (w/v)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 자가 조립체 형성을 유도하는 단계에 사용되는 완충 용액은 HEPES, Tris, 또는 phosphate 등 일반적으로(통상적으로) 단백질 추출에 사용하는 완충 용액일 수 있고, 바람직하게는 HEPES 완충 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 자가 조립체 형성을 유도하는 단계는 pH 6 내지 pH 10에서 수행되는 것일 수 있고, pH 7 내지 pH 10에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 자가 조립체 형성을 유도하는 단계는 유도제 처리 즉시 내지 10분, 10분 이상, 15분 이상, 20분 이상, 10분 내지 120분, 15분 내지 120분, 20분 내지 120분 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적 단백질을 정제하는 방법은 형성된 자가 조립체를 선택적으로 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 분리하는 단계는 원심분리 방법 또는 여과 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질은 거대분자 자가 조립체를 형성하여 크기와 밀도가 증가되므로, 밀도 차이를 이용하여 침전시킬 수 있는 원심분리 방법 또는 일정 크기 이상의 분자를 거를 수 있는 여과 방법을 분리 방법으로 사용할 수 있다.
상기 원심분리 방법 또는 여과 방법의 분리하는 단계 이후 잔존할 수 있는 비특이적 단백질의 오염을 최소화하기 위해 완충 용액을 이용하여 침전 또는 여과된 재조합 단백질 분획을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 특정 유도제 처리 및/또는 조건 처리를 통해 거대 분자 자가 조립체 형성을 유도하여 정제된 재조합 단백질을 가역적으로 단량체로 전환시키기 위한 방법으로, 양이온성의 특정 유도제와 강하게 결합할 수 있는 EDTA 또는 EGTA와 같은 킬레이트(chelator)를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 목적 단백질을 정제하는 방법은 융합 단백질에 포함된 TEV 단백질분해효소 절단 부위 또는 스넥 태그를 절단하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 절단하는 단계는 TEV 단백질분해효소 또는 Ni2+ 처리에 의해 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 특성을 갖는 비정형 펩타이드 태그를 포함하는 단백질 정제용 조성물을 제공한다.
상기 비정형 폴리펩타이드 태그는 PSIAEH 태그, PSIAHEK 태그, PSIHEKIHEK 태그 및 PSIA 태그로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 핵 형성 또는 이량체 등의 다량체 형성이 가능한 펩타이드일 수 있다.
상기 비정형 폴리펩타이드 태그는 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
또한, 본 발명은 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 특성을 갖는 비정형 펩타이드 태그를 포함하는 자가 조립체를 제공한다.
상기 비정형 폴리펩타이드 태그는 PSIAEH 태그, PSIAHEK 태그, PSIHEKIHEK 태그 및 PSIA 태그로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 핵 형성 또는 이량체 등의 다량체 형성이 가능한 펩타이드일 수 있다.
상기 비정형 폴리펩타이드 태그는 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본 발명은 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 펩타이드 태그, 상기 태그와 목적 단백질이 융합된 융합 단백질 및 이를 이용한 목적 단백질 정제 방법에 관한 것으로, 상기 펩타이드 단독 또는 융합 단백질은 특정 유도제 또는 처리 조건 의존적으로 거대분자 자가 조립체 형성을 유도함으로써 기존의 친화 크로마토그래피법에서 주로 사용되는 고가의 비드 또는 레진이 충진되어 있는 정제 컬럼 및 이를 구동하는 고가의 장치나 설비의 필요 없이 원심분리 또는 여과와 같은 매우 간단한 방법만으로 재조합 단백질을 분리 정제하는 것이 가능하다. 뿐만 아니라, 본 발명은 단백질 추출용액에 염 처리 및 특정 유도제 또는 조건 처리를 통해 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되기 때문에, 처리 과정이 매우 간단하고, 쉬우며, 정제에 소요되는 시간이 매우 짧고, 고효율 및 고순도로 재조합 단백질을 정제하는 것이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 본 발명은 정제된 재조합 단백질을 킬레이트 처리를 통해 수용성의 단위체로 쉽게 전환할 수 있으며, 필요에 따라 목적 단백질에 융합된 태그를 자른 후 이들 태그를 자가 조립체 재형성을 유도하여 쉽게 제거하는 것이 가능하다.
도 1A는 융합된 정제 태그와 자가 조립 태그에 작용하는 특정 유도제에 의해 거대분자 자가 조립체 형성을 유도하는 개념을 나타내는 도이다.
도 1B는 His6 태그와 자가 조립 태그를 암호화하는 유전자 부위를 포함하고, 목적 단백질을 암호화하는 유전자 부위를 포함하는 목적 단백질 발현을 위한 벡터의 구성을 나타내는 모식도이다.
도 1C는 특정 유도제 또는 특정 조건 처리를 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유도 후 원심분리 또는 여과 등의 방법으로 재조합 단백질을 선택적으로 정제하는 방법을 나타내는 도이다.
도 2A는 목적 단백질인 GFP에 정제 태그로서 His 태그를 단독으로 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2B는 GFP에 핵 형성 또는 이량체 등의 다량체 형성이 가능할 수 있도록 인위적으로 설계된(de novo designed) PSIAEH 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그를 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2D는 GFP에 정제 태그로서 핵 형성 또는 이량체 등의 다량체 형성이 가능할 수 있도록 인위적으로 설계된 PSIAHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2E는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그를 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2F는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2G는 GFP에 정제 태그로서 핵 형성 또는 이량체 등의 다량체 형성이 가능할 수 있도록 인위적으로 설계된 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2H는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 3A는 목적 단백질로 모델 단백질의 하나인 GFP에 정제 태그로서 His 또는 PSIAEH 펩타이드 태그를 단독으로 융합하거나 이 두 태그를 모두 융합하여 양이온 Ni2+을 다양한 농도로 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 3B는 GFP에 정제 태그로서 His 또는 PSIAHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하거나 이 두 태그를 모두 융합하여 양이온 Ni2+을 다양한 농도로 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 3C는 GFP에 정제 태그로서 His 혹은 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하거나 이 두 태그를 모두 융합하여 양이온 Ni2+을 다양한 농도로 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 3D는 GFP에 정제 태그로서 His 혹은 PSIAHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하거나 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여 양이온 Ni2+을 다양한 농도로 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 4A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그를 단독으로 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4B는 GFP에 정제 태그로서 PSIAEH 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그를 모두 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4D는 GFP에 정제 태그로서 PSIAHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4E는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그를 모두 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4F는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4G는 GFP에 정제 태그로서 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4H는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 5A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 염화나트륨이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 5B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 염화나트륨이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 5C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 염화나트륨이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 5D는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 염화나트륨이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 6A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 다양한 완충용액(buffer)에 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 6B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 다양한 완충용액에 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 6C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 다양한 완충용액에 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 6D는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 다양한 완충용액에 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 7A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 농도에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 7B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 농도에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 7C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 농도에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 7D는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 농도에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 8A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 완충용액의 다양한 pH 조건에서 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 미처리 혹은 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 8B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 완충용액의 다양한 pH 조건에서 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 미처리 혹은 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 8C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 완충용액의 다양한 pH 조건에서 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 미처리 혹은 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 8D는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 완충용액의 다양한 pH 조건에서 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 미처리 혹은 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 9A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시간에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 9B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시간에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 9C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시간에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 9D는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시간에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 10은 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 각 PSIAEH, PSIAHEK, PSIHEKIHEK 및 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시간에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 통해 각 정제 태그별 회수율과 순도를 분석한 도이다.
도 11A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그를 단독으로 또는 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그의 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시 필터를 이용한 여과 및 재조합 단백질의 회수 가능성을 UV의 조사를 통해 분석한 도이다.
도 11B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그의 조합, His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드의 조합, His 태그와 PSIA 펩타이드의 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시 필터를 이용한 여과 및 재조합 단백질의 회수 가능성을 UV의 조사를 통해 분석한 도이다.
도 11C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그를 단독으로 또는 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그의 조합, His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드의 조합, His 태그와 PSIA 펩타이드의 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시 필터의 pore size가 5.0, 10 ㎛로 증가된 필터를 이용한 여과 및 재조합 단백질의 회수 가능성을 UV의 조사를 통해 분석한 도이다.
도 12A는 형광 현미경을 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유무 및 그 크기를 분석하기 위해, His6:GFP에 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 이 처리된 조건하에서 획득한 이미지이다.
도 12B는 형광 현미경을 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유무 및 그 크기를 분석하기 위해, His6:PSIAEH:GFP에 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 이 처리된 조건하에서 획득한 이미지이다.
도 12C는 형광 현미경을 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유무 및 그 크기를 분석하기 위해, His6:PSIAHEK:GFP에 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 이 처리된 조건하에서 획득한 이미지이다.
도 12D는 형광 현미경을 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유무 및 그 크기를 분석하기 위해, His6:PSIHEKIHEK:GFP에 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 이 처리된 조건하에서 획득한 이미지이다.
도 12E는 형광 현미경을 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유무 및 그 크기를 분석하기 위해, His6:PSIA:GFP에 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 이 처리된 조건하에서 획득한 이미지이다.
도 13A는 TEV 단백질분해효소에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.
도 13B는 인터페론 알파 2에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.
도 13C는 과립구 콜로니자극인자에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.
도 13D는 TEV 단백질분해효소에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.도 13E는 TEV 단백질분해효소에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.
도 13F는 인터페론 알파 2에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.
도 1B는 His6 태그와 자가 조립 태그를 암호화하는 유전자 부위를 포함하고, 목적 단백질을 암호화하는 유전자 부위를 포함하는 목적 단백질 발현을 위한 벡터의 구성을 나타내는 모식도이다.
도 1C는 특정 유도제 또는 특정 조건 처리를 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유도 후 원심분리 또는 여과 등의 방법으로 재조합 단백질을 선택적으로 정제하는 방법을 나타내는 도이다.
도 2A는 목적 단백질인 GFP에 정제 태그로서 His 태그를 단독으로 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2B는 GFP에 핵 형성 또는 이량체 등의 다량체 형성이 가능할 수 있도록 인위적으로 설계된(de novo designed) PSIAEH 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그를 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2D는 GFP에 정제 태그로서 핵 형성 또는 이량체 등의 다량체 형성이 가능할 수 있도록 인위적으로 설계된 PSIAHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2E는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그를 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2F는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2G는 GFP에 정제 태그로서 핵 형성 또는 이량체 등의 다량체 형성이 가능할 수 있도록 인위적으로 설계된 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 2H는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 다양한 양이온 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 3A는 목적 단백질로 모델 단백질의 하나인 GFP에 정제 태그로서 His 또는 PSIAEH 펩타이드 태그를 단독으로 융합하거나 이 두 태그를 모두 융합하여 양이온 Ni2+을 다양한 농도로 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 3B는 GFP에 정제 태그로서 His 또는 PSIAHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하거나 이 두 태그를 모두 융합하여 양이온 Ni2+을 다양한 농도로 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 3C는 GFP에 정제 태그로서 His 혹은 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하거나 이 두 태그를 모두 융합하여 양이온 Ni2+을 다양한 농도로 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 3D는 GFP에 정제 태그로서 His 혹은 PSIAHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하거나 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여 양이온 Ni2+을 다양한 농도로 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되는지 여부를 확인한 도이다.
도 4A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그를 단독으로 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4B는 GFP에 정제 태그로서 PSIAEH 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그를 모두 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4D는 GFP에 정제 태그로서 PSIAHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4E는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그를 모두 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4F는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4G는 GFP에 정제 태그로서 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그를 단독으로 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 4H는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 5A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 염화나트륨이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 5B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 염화나트륨이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 5C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 염화나트륨이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 5D는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 염화나트륨이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 촉진되는지를 분석한 도이다.
도 6A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 다양한 완충용액(buffer)에 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 6B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 다양한 완충용액에 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 6C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 다양한 완충용액에 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 6D는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 다양한 완충용액에 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 7A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 농도에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 7B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 농도에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 7C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 농도에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 7D는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그의 조합을 융합하여 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 농도에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 8A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 완충용액의 다양한 pH 조건에서 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 미처리 혹은 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 8B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 완충용액의 다양한 pH 조건에서 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 미처리 혹은 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 8C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 완충용액의 다양한 pH 조건에서 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 미처리 혹은 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 8D는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 완충용액의 다양한 pH 조건에서 염으로서 황산암모늄 처리 및 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 미처리 혹은 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 9A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시간에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 9B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시간에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 9C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시간에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 9D는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시간에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 분석한 도이다.
도 10은 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 각 PSIAEH, PSIAHEK, PSIHEKIHEK 및 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시간에 따른 거대분자 자가 조립체 형성 정도를 통해 각 정제 태그별 회수율과 순도를 분석한 도이다.
도 11A는 GFP에 정제 태그로서 His 태그를 단독으로 또는 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그의 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시 필터를 이용한 여과 및 재조합 단백질의 회수 가능성을 UV의 조사를 통해 분석한 도이다.
도 11B는 GFP에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그의 조합, His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드의 조합, His 태그와 PSIA 펩타이드의 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시 필터를 이용한 여과 및 재조합 단백질의 회수 가능성을 UV의 조사를 통해 분석한 도이다.
도 11C는 GFP에 정제 태그로서 His 태그를 단독으로 또는 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그의 조합, His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드의 조합, His 태그와 PSIA 펩타이드의 조합을 융합하여, 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+의 처리 시 필터의 pore size가 5.0, 10 ㎛로 증가된 필터를 이용한 여과 및 재조합 단백질의 회수 가능성을 UV의 조사를 통해 분석한 도이다.
도 12A는 형광 현미경을 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유무 및 그 크기를 분석하기 위해, His6:GFP에 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 이 처리된 조건하에서 획득한 이미지이다.
도 12B는 형광 현미경을 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유무 및 그 크기를 분석하기 위해, His6:PSIAEH:GFP에 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 이 처리된 조건하에서 획득한 이미지이다.
도 12C는 형광 현미경을 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유무 및 그 크기를 분석하기 위해, His6:PSIAHEK:GFP에 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 이 처리된 조건하에서 획득한 이미지이다.
도 12D는 형광 현미경을 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유무 및 그 크기를 분석하기 위해, His6:PSIHEKIHEK:GFP에 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 이 처리된 조건하에서 획득한 이미지이다.
도 12E는 형광 현미경을 통해 거대분자 자가 조립체 형성 유무 및 그 크기를 분석하기 위해, His6:PSIA:GFP에 염으로서 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 이 처리된 조건하에서 획득한 이미지이다.
도 13A는 TEV 단백질분해효소에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.
도 13B는 인터페론 알파 2에 정제 태그로서 His 태그와 PSIAEH 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.
도 13C는 과립구 콜로니자극인자에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.
도 13D는 TEV 단백질분해효소에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.도 13E는 TEV 단백질분해효소에 정제 태그로서 His 태그와 PSIA 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.
도 13F는 인터페론 알파 2에 정제 태그로서 His 태그와 PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 조합을 융합하여, 염으로서 다양한 농도의 황산암모늄이 존재하는 조건에서 특정 유도제로 선택된 양이온 Ni2+ 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성 정도 및 GFP 외 재조합 단백질에 적용 가능성을 분석한 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 개념 및 기술의 범위에 포함되는 모든 응용과 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[실험 재료 및 방법]
<실험의 재료>
황산암모늄((NH4)2SO4, CAT NO. A4915)과 염화니켈(NiCl2, CAT NO. 339350)은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 각 ACS reagent 등급과 98% 이상의 시약을 구입하여 사용하였고, EDTA disodium salt dihydrate (C10H14N2Na2O8·2H2O, CAT NO. 0105)는 VWR Life Science (Radnor, PA, USA)에서 Biotechnology 등급을 구입하여 사용하였다.
실시예 1. 단백질 발현용 벡터 제작
bead-free형 자가 조립체 유도방식의 재조합 단백질 정제시스템 구축을 위한 GFP를 활용한 모델시스템을 확립하기 위하여, F-Kpn I-Hinge-Bgl II-TEV cleavage site:GFP/R-Xho I,Hind III:GFP 프라이머를 이용하여 GFP 유전자를 증폭하여 제한효소로 절단 후 pET 28a 벡터에 Kpn I/Xho I 부위에 삽입하여 pET 28a-GFP 부분 벡터를 구축하였다. 추가적으로, F-Nco I, BamH I-His6/R-Kpn I-His6 프라이머를 이용하여 overlapping PCR 수행 후 제한효소로 절단하여 pET 28a-GFP 부분 벡터의 Nco I/Kpn I 부위에 삽입하여 기본 벡터 pET 28a-His6:GFP 벡터를 완성하였다. 이후 F-Nco I,BamH I-His6:PSIAEH/R-Kpn I-PSIAEH; F-Nco I,BamH I-His6:PSIAHEK/R-Kpn I-PSIAHEK; F-Nco I,BamH I-His6:PSIHEKIHEK/R-Kpn I-PSIHEKIHEK; F-Nco I,BamH I-His6:PSIA/R-Kpn I-PSIA의 프라이머 조합을 기반으로 각각 pET 28a-His6:PSIAEH:GFP, pET 28a-His6:PSIAHEK:GFP, pET 28a-His6:PSIHEKIHEK:GFP, pET 28a-His6:PSIA:GFP 벡터를 제작하였다. 그리고 His6 태그가 제외된 벡터를 구축하기 위하여, F-Nco I,BamH I-PSIAEH/R-Kpn I-PSIAEH; F-Nco I,BamH I-PSIAHEK/R-Kpn I-PSIAHEK; F-Nco I,BamH I-PSIHEKIHEK/R-Kpn I-PSIHEKIHEK의 프라이머 조합을 기반으로 각각 pET 28a-PSIAEH:GFP, pET 28a-PSIAHEK:GFP, pET 28a-PSIHEKIHEK:GFP 벡터를 완성하였다. GFP 외 다양한 단백질 의약품에 대한 정제 확장성을 평가하기 위하여, F-Bgl II-rhG-CSF/R-Hind III-rhG-CSF; F-Bgl II-INF-a2/R-Hind III-INF-a2; F-Bgl II-TEV protease/R-Hind III-TEV protease의 프라이머 조합으로 PCR 수행 후 Bgl II/Hind III 제한효소로 절단하여 pET 28a-His6:PSIAEH:GFP, pET 28a-His6:PSIAHEK:GFP, pET 28a-His6:PSIHEKIHEK:GFP, pET 28a-His6:PSIA:GFP 벡터의 GFP 위치에 각각 삽입하여 최종적으로 pET 28a-His6:PSIAHEK:TEV protease, pET 28a-His6:PSIAEH:INF-a2, pET 28a-His6:PSIHEKIHEK:rhG-CSF, pET 28a-His6:PSIHEKIHEK:TEV protease, pET 28a-His6:PSIA:TEV protease, pET 28a-His6:PSIHEKIHEK:INF-a2의 대표 벡터를 완성하였다. 각 태그와 설계된 재조합 단백질의 구체적인 서열정보는 하기 표 1 내지 표 3과 같다.
| 태그 명칭 | 아미노산 서열 (N → C) | 서열번호 | 핵산 서열 (5’ → 3’) | 서열번호 |
| His6 | HHHHHH | 1 | CATCACCATCACCACCAT | 21 |
| 태그 명칭 | 아미노산 서열 (N → C) | 서열번호 | 핵산 서열 (5’ → 3’) | 서열번호 |
| PSIAEH | PSIAEHPSIAEHPSIAEH | 2 | CCAAGTATTGCTGAGCATCCTAGCATAGCAGAACACCCAAGTATAGCAGAGCAT | 22 |
| PSIAHEK | PSIAHEKPSIAHEKPSIAHEK | 3 | CCAAGTATTGCTCATGAAAAGCCTAGCATAGCACACGAGAAGCCAAGTATAGCACATGAGAAA | 23 |
| PSIHEKIHEK | PSIHEKIHEKPSIHEKIHEKPSIHEKIHEK | 4 | CCAAGTATTCATGAAAAGATCCACGAGAAGCCTAGCATCCACGAGAAGATTCATGAGAAGCCGAGTATACACGAAAAGATTCACGAGAAG | 24 |
| PSIA | PSIAPSIAPSIA | 5 | CCAAGTATTGCTCCTAGCATAGCACCAAGTATAGCA | 25 |
| 클론 명칭 | 아미노산 서열 (N → C) | 서열번호 | 핵산 서열 (5’ → 3’) | 서열번호 |
| His6: PSIAEH | MDPMHHHHHHPSIAEHPSIAEHPSIAEH | 6 | ATGGATCCAATGCATCACCATCACCACCATCCAAGTATTGCTGAGCATCCTAGCATAGCAGAACACCCAAGTATAGCAGAGCAT | 26 |
| His6: PSIAHEK | MDPMHHHHHHPSIAHEKPSIAHEKPSIAHEK | 7 | ATGGATCCAATGCATCACCATCACCACCATCCAAGTATTGCTCATGAAAAGCCTAGCATAGCACACGAGAAGCCAAGTATAGCACATGAGAAA | 27 |
| His6: PSIHEKIHEK | MDPMHHHHHHPSIHEKIHEKPSIHEKIHEKPSIHEKIHEK | 8 | ATGGATCCAATGCATCACCATCACCACCATCCAAGTATTCATGAAAAGATCCACGAGAAGCCTAGCATCCACGAGAAGATTCATGAGAAGCCGAGTATACACGAAAAGATTCACGAGAAG | 28 |
| His6: PSIA | MDPMHHHHHHPSIAPSIAPSIA | 9 | ATGGATCCAATGCATCACCATCACCACCATCCAAGTATTGCTCCTAGCATAGCACCAAGTATAGCA | 29 |
| PSIAEH | MDPMPSIAEHPSIAEHPSIAEH | 10 | ATGGATCCAATGCCAAGTATTGCTGAGCATCCTAGCATAGCAGAACACCCAAGTATAGCAGAGCAT | 30 |
| PSIAHEK | MDPMPSIAHEKPSIAHEKPSIAHEK | 11 | ATGGATCCAATGCCAAGTATTGCTCATGAAAAGCCTAGCATAGCACACGAGAAGCCAAGTATAGCACATGAGAAA | 31 |
| PSIHEKIHEK | MDPMPSIHEKIHEKPSIHEKIHEKPSIHEKIHEK | 12 | ATGGATCCAATGCCAAGTATTCATGAAAAGATCCACGAGAAGCCTAGCATCCACGAGAAGATTCATGAGAAGCCGAGTATACACGAAAAGATTCACGAGAAG | 32 |
| His6:PSIAHEK:TEV protease | MDPMHHHHHHPSIAHEKPSIAHEKPSIAHEKGTGSPPVPSTPPTPSPSCRSGESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN | 13 | ATGGATCCAATGCATCACCATCACCACCATCCAAGTATTGCTCATGAAAAGCCTAGCATAGCACACGAGAAGCCAAGTATAGCACATGAGAAAGGTACCGGTTCTCCACCAGTACCAAGCACACCTCCAACTCCGAGTCCGAGTTGTAGATCTGGAGAAAGCTTGTTTAAGGGGCCGCGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTCTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGCGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTGAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTTATGAATTAA | 33 |
| His6:PSIAEH:INF-a2 | MDPMHHHHHHPSIAEHPSIAEHPSIAEHGTGSPPVPSTPPTPSPSCRSENLYFQGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE | 14 | ATGGATCCAATGCATCACCATCACCACCATCCAAGTATTGCTGAGCATCCTAGCATAGCAGAACACCCAAGTATAGCAGAGCATGGTACCGGTTCTCCACCAGTACCAAGCACACCTCCAACTCCGAGTCCGAGTTGTAGATCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCTGCGATCTCCCACAAACCCACTCCTTAGGTTCTCGACGTACTCTAATGCTTCTCGCTCAGATGAGGAGGATTTCACTTTTCAGTTGTTTGAAGGATCGTCACGACTTCGGATTTCCCCAAGAAGAGTTTGGAAACCAATTCCAAAAGGCTGAGACAATTCCAGTTTTGCACGAAATGATTCAACAAATCTTTAATCTGTTTAGCACTAAGGATAGCAGCGCAGCATGGGATGAAACACTCCTTGATAAATTTTATACAGAATTATATCAGCAACTGAATGACCTTGAGGCATGCGTCATACAGGGTGTTGGGGTAACAGAGACTCCTCTCATGAAAGAAGACAGTATTTTAGCCGTTCGTAAATATTTTCAGCGTATTACTCTTTATCTTAAAGAAAAAAAATACTCCCCTTGCGCATGGGAGGTTGTCCGAGCAGAAATTATGAGGAGCTTCTCCCTCTCTACAAATCTGCAAGAGTCTTTGAGAAGTAAAGAATGA | 34 |
| His6:PSIHEKIHEK:rhG-CSF | MDPMHHHHHHPSIHEKIHEKPSIHEKIHEKPSIHEKIHEKGTGSPPVPSTPPTPSPSCRSAAAENLYFQGTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP | 15 | ATGGATCCAATGCATCACCATCACCACCATCCAAGTATTCATGAAAAGATCCACGAGAAGCCTAGCATCCACGAGAAGATTCATGAGAAGCCGAGTATACACGAAAAGATTCACGAGAAGGGTACCGGTTCTCCACCAGTACCAAGCACACCTCCAACTCCGAGTCCGAGTTGTAGATCTGCGGCCGCAGAAAACCTGTATTTTCAGGGCACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAGTGCTTAGAGCAAGTGAGGAAGATCCAGGGCGATGGCGCAGCGCTCCAGGAGAAGCTGTGTGCCACCTACAAGCTGTGCCACCCCGAGGAGCTGGTGCTGCTCGGACACTCTCTGGGCATCCCCTGGGCTCCCCTGAGCAGCTGCCCCAGCCAGGCCCTACAGCTGGCAGGCTGCTTGAGCCAACTCCATAGCGGCCTTTTCCTCTACCAGGGGCTCCTACAGGCCCTGGAAGGGATCTCCCCCGAGTTGGGTCCCACCTTGGACACACTACAGCTGGACGTCGCCGACTTTGCCACCACCATCTGGCAGCAGATGGAAGAACTGGGAATGGCCCCTGCCCTACAGCCCACCCAGGGTGCCATGCCGGCCTTCGCCTCTGCTTTCCAGCGCCGGGCAGGAGGGGTCCTAGTTGCCTCCCATCTACAGAGCTTCCTGGAGGTGTCGTACCGCGTTCTACGCCACCTTGCCCAGCCCTGA | 35 |
| His6:PSIHEKIHEK:TEV protease | MDPMHHHHHHPSIHEKIHEKPSIHEKIHEKPSIHEKIHEKGTGSPPVPSTPPTPSPSCRSGESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN | 16 | ATGGATCCAATGCATCACCATCACCACCATCCAAGTATTCATGAAAAGATCCACGAGAAGCCTAGCATCCACGAGAAGATTCATGAGAAGCCGAGTATACACGAAAAGATTCACGAGAAGGGTACCGGTTCTCCACCAGTACCAAGCACACCTCCAACTCCGAGTCCGAGTTGTAGATCTGGAGAAAGCTTGTTTAAGGGGCCGCGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTCTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGCGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTGAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTTATGAATTGA | 36 |
| His6:PSIA:TEV protease | MDPMHHHHHHPSIAPSIAPSIAGTGSPPVPSTPPTPSPSCRSGESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN | 17 | ATGGATCCAATGCATCACCATCACCACCATCCAAGTATTGCTCCTAGCATAGCACCAAGTATAGCAGGTACCGGTTCTCCACCAGTACCAAGCACACCTCCAACTCCGAGTCCGAGTTGTAGATCTGGAGAAAGCTTGTTTAAGGGGCCGCGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTCTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGCGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTGAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTTATGAATTGA | 37 |
| His6:PSIHEKIHEK:INF-a2 | MDPMHHHHHHPSIHEKIHEKPSIHEKIHEKPSIHEKIHEKGTGSPPVPSTPPTPSPSCRSENLYFQGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE | 18 | ATGGATCCAATGCATCACCATCACCACCATCCAAGTATTCATGAAAAGATCCACGAGAAGCCTAGCATCCACGAGAAGATTCATGAGAAGCCGAGTATACACGAAAAGATTCACGAGAAGGGTACCGGTTCTCCACCAGTACCAAGCACACCTCCAACTCCGAGTCCGAGTTGTAGATCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCTGCGATCTCCCACAAACCCACTCCTTAGGTTCTCGACGTACTCTAATGCTTCTCGCTCAGATGAGGAGGATTTCACTTTTCAGTTGTTTGAAGGATCGTCACGACTTCGGATTTCCCCAAGAAGAGTTTGGAAACCAATTCCAAAAGGCTGAGACAATTCCAGTTTTGCACGAAATGATTCAACAAATCTTTAATCTGTTTAGCACTAAGGATAGCAGCGCAGCATGGGATGAAACACTCCTTGATAAATTTTATACAGAATTATATCAGCAACTGAATGACCTTGAGGCATGCGTCATACAGGGTGTTGGGGTAACAGAGACTCCTCTCATGAAAGAAGACAGTATTTTAGCCGTTCGTAAATATTTTCAGCGTATTACTCTTTATCTTAAAGAAAAAAAATACTCCCCTTGCGCATGGGAGGTTGTCCGAGCAGAAATTATGAGGAGCTTCTCCCTCTCTACAAATCTGCAAGAGTCTTTGAGAAGTAAAGAATGA | 38 |
| GFP | SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKANFKTRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK | 19 | AGTAAAGGAGAGGAGTTGTTTACTGGTGTTGTCCCGATTTTAGTTGAACTTGACGGTGATGTTAATGGGCACAAGTTCTCTGTCAGTGGAGAAGGGGAAGGCGATGCAACATATGGTAAGCTCACGTTGAAGTTTATTTGCACTACTGGAAAACTCCCTGTTCCGTGGCCAACACTTGTGACTACGTTTTCTTACGGTGTTCAGTGTTTTTCAAGATACCCTGATCATATGAAGCGGCACGATTTCTTTAAGAGCGCGATGCCTGAGGGATACGTGCAGGAAAGAACCATCTTCTTCAAGGACGACGGTAATTATAAGACACGTGCTGAAGTTAAGTTCGAGGGAGACACCTTGGTGAATCGAATAGAACTTAAAGGAATCGATTTTAAGGAAGATGGAAACATTCTCGGCCACAAGTTGGAGTACAACTACAACTCACATAACGTATACATAATGGCAGATAAGCAAAAGAACGGCATCAAGGCAAACTTCAAGACCAGGCACAATATCGAGGATGGGGGTGTGCAACTAGCTGATCATTATCAGCAAAATACTCCAATTGGTGATGGACCTGTCCTCTTACCAGATAATCATTATCTGTCCACGCAATCTGCCCTGTCGAAGGACCCCAACGAAAAGAGAGACCATATGGTGCTTCTTGAGTTCGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGTATGGACGAGCTATATAAGTGA | 39 |
| Hinge | GSPPVPSTPPTPSPSC | 20 | GGTTCTCCACCAGTACCAAGCACACCTCCAACTCCGAGTCCGAGTTGT | 40 |
실시예 2. 융합 단백질의 발현 유도 및 추출
상기 실시예 1에서 제작한 융합 단백질 발현용 벡터는 BL21 (DE3) 대장균에 형질전환하여 37℃ LB 배지(카나마이신 50 ㎍/㎖ 포함)에서 배양하였다. 단백질의 과발현을 유도하기 위해 O.D600값 0.6에서 1.0 mM IPTG (isopropyl-β)를 첨가하고 18℃에서 18시간 추가 배양하였다. 배양된 대장균은 4,000 rpm에서 15분간 4℃에서 원심분리하여 펠렛으로 얻었다. 과발현된 융합 단백질 추출에는 HEPES 버퍼(HEPES; 50 mM HEPES buffer (pH 7.5), Triton X-100, protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, GEU) 포함)로 sonication 후 13,000 rpm에서 15분간 4℃에서 원심분리하여 융합 단백질을 포함하는 상층액을 얻었다.
실시예 3. 거대분자 자가 조립체 형성 유도 및 최적화
실시예 3-1. 염으로서 황산암모늄 농도의 최적화
황산암모늄 농도의 최적화를 위해 12~22% [w/v] 범위의 황산암모늄을 2% 간격으로 처리하여 원심분리 한 후 얻어진 상층액에 0.5 mM 농도의 Ni2+를 처리하였다.
실시예 3-2. 염으로서 염화나트륨 농도의 최적화
염으로서 염화나트륨 처리 농도에 따른 효과를 분석하기 위해 0~3 M 범위의 NaCl 처리 조건에서 0.5 mM 농도의 Ni2+를 처리하였다.
실시예 3-3. 완충 용액의 최적화
완충용액 최적화를 위해 pH 7.4 HEPES buffer (HEPES; 50 mM HEPES buffer (pH 7.4)), pH 7.4 PBS buffer (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 (pH 7.4)), pH 7.4 PB buffer (PB; 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 pH 7.4)), pH 7.4 Tris buffer (Tris; 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4))를 사용하였으며, 모두 1% [v/v] TritonX-100과 1X [v/v] Protease inhibitor cocktail tablets (Roche)을 첨가하여 사용하였다. 각 완충용액 조건에서 황산암모늄 처리 후 원심분리하여 얻은 상층액에 0.5 mM 농도의 Ni2+를 처리하였다.
실시예 3-4. Ni
2+
농도의 최적화
Ni2+ 농도의 최적화를 위해 황산암모늄 처리 후 원심분리하여 얻은 상층액에 0~2 mM 범위의 Ni2+를 처리하였다.
실시예 3-5. 완충용액 pH 최적화
Buffer pH 최적화를 위해 황산암모늄을 처리하여 원심분리한 후 얻어진 상층액에 HCl과 NaOH를 사용해 pH 5 내지 10 범위로 조절하여 사용하였다. 각 pH 조건에서 황산암모늄 처리 후 원심분리하여 얻은 상층액에 0.5 mM 농도의 Ni2+를 처리하였다.
실시예 3-6. 자가 조립체 형성 반응 시간의 최적화
거대분자 자가 조립체 형성 시간의 최적화를 위해 황산암모늄 처리 후 원심분리하여 얻은 상층액에 0.5 mM 농도의 Ni2+ 처리 즉시부터 처리 후 60분까지 10분 간격으로 측정하였으며, 추가적으로 120분까지 측정하였다.
실시예 4. 거대분자 자가 조립체 재조합 단백질의 회수 및 단량체로의 전환
상기 실시예 3에서 특정 유도제 또는 조건 의존적으로 거대분자 자가 조립체가 형성된 재조합 단백질을 원심분리와 여과 등의 방법을 통해 회수하였다.
구체적으로, 원심분리를 통한 정제방법에서는 3000 rpm 이상에서 10분간 4℃에서 원심분리 진행하였고, 거대분자 조립체 재조합 단백질을 펠렛으로 얻었으며, 거대분자 조립체 유도반응에 사용한 동일 버퍼에 5 mM EDTA를 첨가하여 단량체의 재조합 단백질을 얻었다. 여과를 통한 방법에서는 0.2 및 5.0 μm syringe filter (Satorius, Goettingen, GEU), 10 μm syringe filter (Tisch, Ohio, USA) 를 사용하였으며, 거대분자 자가 조립체 형성된 재조합 단백질을 여과한 후 거대분자 조립체 유도반응에 사용한 동일 완충용액을 이용하여 세척과정을 진행하였다. 그리고 EDTA와 같은 킬레이트를 첨가한 동일 완충용액을 이용하여 거대분자 조립체를 단량체로서 전환시키거나 용출하였다. 이를 가시적으로 확인하기 위해서 필터를 360 nm UV 파장으로 조사하여 가시적으로 확인하였다.
실시예 5. SDS-PAGE를 통한 정제된 단백질의 확인
원심분리 및 여과를 통해 회수한 단량체의 재조합 단백질을 일정량 취해 SDS 샘플버퍼(glycerol, 2M Tris-HCl(pH 6.8), 30% SDS, 2-mercaptoethanol)를 넣고 가열하여 분석에 사용하였으며, 일반적인 SDS-PAGE법을 통해 정제 단백질의 거대분자 자가 조립체 유도 최적화 조건 탐색, 정제 회수율 및 순도 등을 평가하였다.
실시예 6. 형광현미경을 통한 거대분자 자가 조립체 형성 확인
거대분자 자가 조립체 형성 유무 및 대략적인 크기 등을 분석하기 위하여 형광현미경을 활용하였으며, GFP 형광신호를 검출하기 위하여 exitation: 488 nm, emission: 520 nm 필터를 사용하였다.
[실험 결과]
실험예 1. His 태그와 비정형 펩타이드 태그 융합 단백질의 자가 조립체 형성 유도에 적합한 유도제 확인
특정 유도제 또는 조건 의존적으로 거대분자 자가 조립체 형성 유도능을 확인하기 위해 GFP를 모델 단백질로 선택하여, 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법으로 정제 태그로서 His 태그와 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 유닛(unit)인 PSIAEH 펩타이드 태그, PSIAHEK 펩타이드 태그, PSIHEKIHEK 펩타이드 태그 및 PSIA 펩타이드 태그를 조합하여 His6:PSIAEH:GFP, His6:PSIAHEK:GFP, His6:PSIHEKIHEK:GFP 및 His6:PSIA:GFP 융합 단백질을 제조하였다. 대조군 실험을 위해서 정제 태그로서 His 태그를 단독으로 융합한 His6:GFP, 각 비정형 또는 비구조화 기반 유닛을 단독으로 융합한 PSIAEH:GFP, PSIAHEK:GFP 및 PSIHEKIHEK:GFP 융합 단백질을 제조하였다(도 1B 참조). 그런 다음, 융합 단백질을 포함한 단백질 추출액에 다양한 양이온 유도제를 처리하여 거대분자 자가 조립체 형성을 유도하였다. 양이온 유도제에 의해 거대분자 자가 조립체 형성이 유도된 단백질은 원심분리를 통해 회수하여 단백질 용출 시 사용한 동일 완충용액에 녹였고, SDS 샘플 버퍼를 넣고 가열하여 SDS-PAGE를 통해 확인하여 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, His6:PSIAEH:GFP 융합 단백질은 Ni2+, Co2+, Cu2+, Fe2+ 에 의해 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되었으며(도 2C 참조), His6:PSIAHEK:GFP 융합 단백질은 Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+ 에 의해 거대분자 자가 조립체 형성 유도가 우수함을 확인하였다(도 2E 참조). His6:PSIHEKIHEK:GFP 융합 단백질은 Ni2+, Co2+, Cu2+, Ag2+, Zn2+, Fe2+ 에 의해 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되었으며(도 2H 참조), His6:PSIA:GFP 융합 단백질의 경우 Cu2+, Zn2+, Fe2+ 에 의해 거대분자 자가 조립체 형성이 다소 약하게 유도되었다(도 2F 참조).
반면, His 태그 단독(His6:GFP) 또는 펩타이드 태그 단독(PSIAEH:GFP, PSIAHEK:GFP 및 PSIHEKIHEK:GFP)을 사용한 대조군의 경우 Ni2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+ 등과 같은 양이온 유도제 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되지 않거나 매우 약하게 유도되었다(도 2A, 도 2B, 도 2D 및 도 2G 참조). 상기 결과를 종합하면, His 태그와 펩타이드 태그의 조합이 다양한 양이온 유도제에 의해 거대분자 자가 조립체 형성의 유도가 현저하게 증가함을 확인하였다. His 태그와 모든 펩타이드 태그의 조합에서 공통적으로 유도제 Ni2+에 대한 반응성이 매우 우수하였으며, 이후 실험에서는 특정 유도제로서 Ni2+을 사용하여 실험을 진행하였다.
실험예 2. 유도제로 양이온 Ni
2+
처리 시 자가 조립체 형성 여부 확인
상기 실험예 1에서 Ni2+이 유도제로서 자가 조립체 형성에 적합함을 확인하였으므로, 이를 이용하여 Ni2+ 처리 시 각각의 His6:PSIAEH:GFP, His6:PSIAHEK:GFP, His6:PSIHEKIHEK:GFP 및 His6:PSIA:GFP 융합 단백질의 자가 조립체 형성 여부를 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 수득한 His6:PSIAEH:GFP, His6:PSIAHEK:GFP, His6:PSIHEKIHEK:GFP 및 His6:PSIA:GFP 융합 단백질, His 태그를 단독으로 융합한 His6:GFP, 각 비정형 태그를 단독으로 융합한 PSIAEH:GFP, PSIAHEK:GFP 및 PSIHEKIHEK:GFP 융합 단백질을 포함하는 각각의 단백질 추출액에 양이온 유도제로 Ni2+를 0 내지 2 mM 농도로 각각 처리하여 거대분자 자가 조립체 형성을 유도하였다. 거대분자 자가 조립체 형성이 유도된 단백질은 원심분리를 통해 회수하여 단백질 용출 시 사용한 동일 완충용액에 녹였고, SDS 샘플버퍼를 넣고 가열하여 SDS-PAGE를 통해 확인하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, His6:PSIAEH:GFP 융합 단백질, His6:PSIAHEK:GFP 융합 단백질, His6:PSIHEKIHEK:GFP 융합 단백질 및 His6:PSIA:GFP 융합 단백질은 Ni2+에 의해 거대분자 자가 조립체 형성이 유도됨이 확인된 반면, His 태그를 단독으로 융합한 His6:GFP, 각 비정형 태그를 단독으로 융합한 PSIAEH:GFP, PSIAHEK:GFP 및 PSIHEKIHEK:GFP 융합 단백질의 경우 Ni2+ 유도제 처리 시 거대분자 자가 조립체 형성이 유도되지 않음을 확인하였다(도 3A 내지 3D 참조).
실험예 3. 거대분자 자가 조립체 형성을 위한 최적 조건 확립
정제 태그로서 His 태그와 비정형 태그를 융합한 융합 단백질의 거대분자 자가 조립체 형성 유도 극대화 및 목적 단백질 이외의 비선택적 단백질 제거 및 결합 최소화를 통한 고순도 정제조건 최적화를 위하여, 완충 용액, 염 처리, Ni2+ 처리 농도, pH 변화, 처리 시간 등 다양한 조건에 대한 자가 조립체 형성 유도 효과를 분석하였다.
실험예 3-1. 염으로서 황산암모늄 농도 조건의 최적화
정제 태그로서 His 태그와 주요 아미노산 구성이 전하성 및 소수성 아미노산의 비정형 태그를 융합한 융합 단백질의 거대분자 자가 조립체 형성에 적합한 황산암모늄 농도 조건을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 수득한 His6:PSIAEH:GFP, His6:PSIAHEK:GFP, His6:PSIHEKIHEK:GFP 및 His6:PSIA:GFP 융합 단백질, His 태그를 단독으로 융합한 His6:GFP, 각 비정형 태그를 단독으로 융합한 PSIAEH:GFP, PSIAHEK:GFP 및 PSIHEKIHEK:GFP 융합 단백질을 포함하는 각각의 단백질 추출액에 실시예 3-1에 기재된 방법으로 거대분자 자가 조립체 형성을 유도하였다. 거대분자 자가 조립체 형성이 유도된 단백질은 원심분리를 통해 회수하여 단백질 용출 시 사용한 동일 완충용액에 녹였고, SDS 샘플 버퍼를 넣고 가열하여 SDS-PAGE를 통해 확인하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, His6:PSIAEH:GFP 융합 단백질은 14~22% (w/v), His6:PSIAHEK:GFP 융합 단백질은 16~22% (w/v), His6:PSIHEKIHEK:GFP 융합 단백질은 12~22% (w/v), His6:PSIA:GFP는 18~22% (w/v) 범위에서 거대분자 자가 조립체 형성이 유도됨을 확인하였다.
실험예 3-2. 염으로서 염화나트륨 농도 조건의 최적화
정제 태그로서 His 태그와 주요 아미노산 구성이 전하성 및 소수성 아미노산의 비정형 태그를 융합한 융합 단백질의 거대분자 자가 조립체 형성에 적합한 염화나트륨 농도 조건을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 염으로써 0~3 M 농도 범위의 NaCl 처리 조건에서 실시예 3-2에 기재된 방법으로 자가 조립체를 유도한 후, SDS-PAGE를 통해 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, His6:PSIAEH:GFP 융합 단백질과 His6:PSIA:GFP 융합 단백질은 모든 NaCl 농도에서 거대분자 자가 조립체가 형성되지 않았으며, His6:PSIAHEK:GFP 는 100 mM, His6:PSIHEKIHEK:GFP는 150 mM NaCl를 첨가 시 거대분자 자가 조립체 형성이 약하게 유도되는 것을 확인하였다.
상기 실험예 3-1 및 3-2의 결과를 통해 염화나트륨에 비해 황산암모늄을 처리한 경우 자가 조립체 유도가 상대적으로 우수함을 확인하였는 바, 이후 실험에서는 염으로서 황산암모늄을 사용하여 실험을 진행하였다.
실험예 3-3. 완충 용액 조건의 최적화
정제 태그로서 His 태그와 주요 아미노산 구성이 전하성 및 소수성 아미노산의 비정형 태그를 융합한 융합 단백질의 거대분자 자가 조립체 형성에 적합한 완충용액을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 각각의 융합 단백질 추출액에 pH 7.4 HEPES buffer (HEPES; 50 mM HEPES buffer (pH 7.4)), pH 7.4 PBS buffer (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 (pH 7.4)), pH 7.4 PB buffer (PB; 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 pH 7.4)), pH 7.4 Tris buffer (Tris; 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4))를 각각의 완충용액으로 사용하고, 모두 1% [v/v] Triton X-100과 1X [v/v] Protease inhibitor cocktail tablets (Roche)을 첨가하였다. 그런 다음, 염으로서 황산암모늄을 처리하고, 0.5 mM 농도의 Ni2+ 을 처리하여 자가 조립체를 유도하였다. SDS-PAGE를 통해 HEPES, Tris, phosphate 등 완충용액의 종류에 따른 자가 조립체 유도 효과를 분석한 결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 모든 융합 단백질은 HEPES (pH 7,4) 완충 용액 사용시 거대분자 자가 조립체 형성 유도 효과가 가장 우수함을 확인하였다.
실험예 3-4. Ni
2+
농도의 최적화
정제 태그로서 His 태그와 주요 아미노산 구성이 전하성 및 소수성 아미노산의 비정형 태그를 융합한 융합 단백질의 거대분자 자가 조립체 형성에 적합한 Ni2+ 농도 조건을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 각각의 융합 단백질을 포함하는 단백질 상층액에 염으로서 황산암모늄을 처리하고, 유도제인 Ni2+ 양이온을 0 내지 2 mM 농도의 다양한 범위로 각각 처리하여 실시예 3-4에 기재된 방법으로 자가 조립체를 유도한 후, SDS-PAGE를 통해 자가 조립체 유도 효과를 확인하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, His6:PSIAEH:GFP, His6:PSIAHEK:GFP, His6:PSIHEKIHEK:GFP 및 His6:PSIA:GFP 융합 단백질은 황산암모늄 처리 후 양이온 유도제 Ni2+를 0.5 mM 농도로 처리하였을 때, 20분 내에 단백질 추출액에 존재하는 거의 모든 단량체가 거대분자 자가 조립체를 형성하는 것을 확인하였다.
실험예 3-5. 완충용액 pH 최적화
정제 태그로서 His 태그와 주요 아미노산 구성이 전하성 및 소수성 아미노산의 비정형 태그를 융합한 융합 단백질의 거대분자 자가 조립체 형성에 적합한 완충용액의 pH 조건을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 황산암모늄을 처리하여 원심분리한 후 얻어진 상층액에 HCl과 NaOH를 사용해 pH 5 내지 10 범위로 각각 조절하고, 실시예 3-5에 기재된 방법으로 자가 조립체를 유도한 후, SDS-PAGE를 통해 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, His6:PSIA:GFP 융합 단백질은 pH 7~8에서 거대분자 자가 조립체 형성 유도가 정상적으로 일어났지만, 그 이상의 염기 조건에서는 거대분자 자가 조립체 형성 유도가 감소하는 경향을 나타냈다. 이외 다른 융합 단백질은 pH 7 내지 pH 10의 염기 조건에서 거대분자 자가 조립체 형성 유도가 정상적으로 일어났으며, pH 5 이하의 산성 조건에서는 비특이적인 단백질들의 침전이 일어남을 확인하였다.
실험예 3-6. His 태그와 비정형 태그 융합 단백질의 자가 조립체 형성 반응 시간의 최적화
정제 태그로서 His 태그와 주요 아미노산 구성이 전하성 및 소수성 아미노산의 비정형 태그를 융합한 융합 단백질의 거대분자 자가 조립체 형성에 적합한 반응 시간 조건을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 각각의 융합 단백질을 포함하는 단백질 상층액에 염으로서 황산암모늄을 처리하고, 유도제인 Ni2+ 양이온을 0.5 mM 농도로 처리하였다. Ni2+ 양이온 처리 후 60분까지 10분 간격으로 실시예 3-6에 기재된 방법으로 자가 조립체를 유도하고, 추가적으로 120분까지 유도한 후, SDS-PAGE를 통해 자가 조립체 유도 효과를 확인하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, His 태그에 주요 아미노산 구성이 전하성 및 소수성 아미노산의 비정형 기반 유닛이 결합된 각 융합 단백질은 모두 20분 내에 거대분자 자가 조립체를 형성함을 확인하였다.
실험예 4. 거대분자 자가 조립체 형성이 유도된 재조합 단백질의 회수 확인
실험예 4-1. His 태그와 비정형 태그 융합 단백질의 회수율 및 순도 확인
상기 실험예 3에서 확인한 자가 조립체 형성에 최적화된 조건으로 His 태그와 비정형 태그 융합 단백질의 자가 조립체 형성을 유도한 후, 원심분리 방법으로 회수하였다.
구체적으로, 원심분리 방법은 최적조건 및 양성자 유도제로 거대분자 자가 조립체 형성 유도 후 3,000 rpm 이상에서 4℃, 10분간 원심분리를 하여 펠렛의 형태로 재조합 단백질을 회수하고 EDTA를 처리함으로써 다량체에서 단량체로 전환시켰다. 전환된 단량체는 SDS-PAGE를 통해 확인하였고, Bio-Rad 사의 Image Lab 프로그램을 이용하여 회수율과 순도를 측정하였다. 회수율은 황산암모늄과 Ni2+를 이용해 자가 조립체를 유도한 후 아래의 공식에 의해 구하였다.
회수율 = 회수된 목적 밴드의 단백질 세기 / (회수되지 않은 목적 단백질 밴드의세기 + 회수된 목적 단백질 밴드의 세기) × 100
순도는 전체 단백질 중 정제된 단백질 밴드가 차지하는 비율을 측정하여 백분율로 나타내었다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 황산암모늄 처리 후 양이온 유도제 Ni2+을 0.5 mM 처리 시, His 태그와 알파 나선 기반 태그 융합 단백질 별 최대 회수율과 최대 순도는 각각 His6:PSIAEH:GFP 융합 단백질은 83%, 99%, His6:PSIAHEK:GFP 융합 단백질은 98%, 98%, His6:PSIHEKIHEK:GFP 융합 단백질은 90%, 97%, His6:PSIA:GFP 융합 단백질은 83%, 97%로 분석되었다.
실험예 4-2. His 태그와 비정형 태그 융합 단백질의 필터를 이용한 정제 확인
필터를 이용하는 방법은 단백질 추출액에 최적 조건 및 양성자 유도제로 거대분자 자가 조립체 형성된 재조합 단백질을 0.2 및 5.0 μm syringe filter (Satorius, Goettingen, GEU), 10 μm syringe filter (Tisch, Ohio, USA)를 사용하여 여과한 후 거대분자 조립체 유도반응에 사용한 동일 완충용액을 이용하여 세척과정을 진행하였다. 그리고 EDTA와 같은 킬레이트를 첨가한 동일 완충용액을 이용하여 거대분자 조립체를 단량체로서 전환시키거나 용출하였다. 이를 가시적으로 확인하기 위해서 필터를 360 nm UV 파장으로 조사하여 가시적으로 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 거대분자 형태의 자가 조립체는 필터에 여과되어 황산암모늄과 Ni2+이 처리된 단백질 용액의 필터는 UV를 조사하여 형광을 관찰할 수 있었다. 그 후 EDTA가 첨가된 완충용액을 필터에 통과시켜주면 EDTA에 의해 재조합 단백질 다량체가 단량체로 전환이 되어 용출되기 때문에 필터는 UV를 조사하더라도 형광을 띄지 않았다. 이처럼 EDTA에 의해 일어나는 다량체에서 단량체로의 전환은 가역적이며 수초 내에 일어나는 매우 신속한 반응이다. 추가적으로 정제 후 태그를 제거하는 과정 역시 특정 유도제 또는 조건하에서 쉽게 제거할 수 있다. 따라서 본 정제방법을 이용하면 누구나 흔하게 구할 수 있는 기기와 재료로 손쉽게 그리고 간편하고 빠르게 재조합 단백질을 회수할 수 있었으며, 추후 재조합 단백질 생산과정에 적용하여 어려움 없이 scale-up을 진행할 수 있을 것으로 기대된다.
실험예 4-3. 형광현미경을 통한 거대분자 자가 조립체 형성 확인
거대분자 자가 조립체를 저속원심분리를 통한 침강 또는 ㎛ scale의 여과 필터를 통해 여과하여 회수하기 위해서는 박테리아 크기 이상으로 조립체가 형성되어야만 가능하다. 이러한 거대분자 자가 조립체의 형성 유무, 크기를 시각적으로 분석하기 위하여 형광현미경 하에서 관찰하였다. 분석에는 His6:PSIAEH:GFP, His6:PSIAHEK:GFP, His6:PSIHEKIHEK:GFP 및 His6:PSIA:GFP를 사용하였으며, 대조군으로 His6:GFP를 사용하였다. 구체적인 실험 조건은 상기 실험예 3 및 실험예 4의 최적화된 정제조건을 적용하였다.
우선, 거대분자 조립체 형성 유무를 관찰한 결과, His6:GFP의 경우 매우 작은 크기의 조립체가 부분적으로 관찰되었으나 His6:PSIAEH:GFP, His6:PSIAHEK:GFP, His6:PSIHEKIHEK:GFP 및 His6:PSIA:GFP의 경우 거대분자 자가 조립체가 전체적으로 형성되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 거대분자 자가 조립체의 형성은 3차원적으로 형성되어 정확한 크기를 측정하는 것이 매우 어려우나, 하나의 초점면을 기준으로 평면적 이미지를 바탕으로 거대분자 자가 조립체의 크기를 분석한 결과, 수백 ㎛ ~ ㎜ 크기로 형성됨을 확인할 수 있었다 (도12 A~E). 이러한 크기는 일반적인 박테리아 크기의 수배~수십배에 달하는 거대한 크기이며, 진핵세포에서 크기가 큰 것으로 분류되는 식물세포의 평균 크기와 동일하거나 더 큰 것으로 평가된다.
실험예 5. 다양한 목적 단백질 정제 가능 여부 확인
항체신약, 백신, 단백질 신약 등을 포함하는 바이오 의약품 시장 규모는 가파르게 성장하고 있으며, 이러한 바이오 의약품을 포함한 재조합 단백질을 쉽고 빠르게 고순도로 정제한다면, 의약품 시장에서 가격 경쟁력을 확보할 수 있을 것이다. 즉, 정제방법을 다양한 목적 단백질에 적용하여 범용성을 확대하는 것은 상당히 중요하다. 따라서 본 발명의 특정 유도제 또는 조건 의존적 자가 조립체 유도 방식의 재조합 단백질 정제 방법이 의료용 단백질, 효소, 항체와 같이 다양한 목적 단백질에 적용 가능 여부를 확인하였다. 목적 단백질로써 과립구 콜로니자극인자, 인터페론 알파 2 및 TEV 단백질분해효소를 다양한 종류의 목적 단백질의 정제를 위한 대표 단백질로 사용하여 진행하였으며, 상기 실험예 3 및 실험예 4에서 최적화된 정제방법을 이용하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 목적 단백질에 따라 거대분자 자가 조립체가 가장 잘 형성되는 융합 단백질을 확인하였으며, 본 발명에서 탐색한 목적 단백질의 최대 회수율과 최대 순도는 His6:PSIAHEK:TEV protease는 86%, 93%, His6:PSIAEH:INF-a2는 95%, 95%, His6:PSIHEKIHEK:rhG-CSF는 83%, 98%, His6:PSIHEKIHEK:TEV protease는 80%, 98%, His6:PSIA:TEV protease는 74%, 95%, His6:PSIHEKIHEK:INF-a2는 83%, 97%로 분석되었다. 즉, 본 발명에서 탐색한 목적 단백질 이외의 수많은 목적 단백질을 정제함에 있어 본 발명에서 제시하는 다양한 유닛들 중 선별하여 최적의 회수율과 순도로 정제할 수 있음을 확인하였다.
Claims (22)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 제1 폴리펩타이드 및 주요 아미노산 구성이 전하성 및 소수성으로 구성된 비정형 태그인 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것인, 융합 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드는 순차적으로 연결된 것인, 융합 폴리펩타이드.
- 제1항의 융합 폴리펩타이드 또는 제2항의 단독 폴리펩타이드 및 목적 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
- 제4항에 있어서, 상기 목적 단백질은 상기 융합 폴리펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 것인, 융합 단백질.
- 제5항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드와 목적 단백질 사이에 단백질 절단효소의 절단부위, 면역글로불린의 힌지 영역, 또는 이들 모두를 추가로 포함하는, 융합 단백질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
- 제8항의 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주세포.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 정제하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 배양하는 단계 이후에,
상기 세포에서 생산된 융합 단백질의 자가 조립체 형성을 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 목적 단백질 정제 방법. - 제11항에 있어서, 상기 자가 조립체 형성을 유도하는 단계는 유도제를 첨가하는 단계를 포함하는, 목적 단백질 정제 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 유도제는 양이온인 것인, 목적 단백질 정제 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 유도제는 0.1 내지 2.0 mM 농도인 것인, 목적 단백질 정제 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 자가 조립체 형성을 유도하는 단계는 황산암모늄을 포함하는 염을 첨가하는 단계를 포함하는, 목적 단백질 정제 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 황산암모늄은 10 내지 25% (w/v) 농도인, 목적 단백질 정제 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 자가 조립체 형성을 유도하는 단계는 pH 6 내지 pH 10의 조건에서 수행되는 것인, 목적 단백질 정제 방법.
- 제11항에 있어서,
상기 형성된 자가 조립체를 선택적으로 분리하는 단계를 더 포함하는, 목적 단백질 정제 방법. - 제18항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 원심분리 방법 또는 여과 방법으로 수행되는 것인, 목적 단백질 정제 방법.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 제1 폴리펩타이드 또는 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 정제용 조성물.
- 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 자가 조립체 형성능을 갖는 비정형 펩타이드.
- 제21항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것인, 펩타이드.
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