KR100980378B1

KR100980378B1 - 고농도 우레아하에서 안정된 활성을 갖는 디유비퀴틸레이팅효소를 이용한 펩티드의 제조방법

Info

Publication number: KR100980378B1
Application number: KR1020070124901A
Authority: KR
Inventors: 박일선
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2007-12-04
Filing date: 2007-12-04
Publication date: 2010-09-07
Also published as: KR20090058219A

Abstract

본 발명은 고농도의 우레아에서 안정된 활성을 갖는 디유비퀴틸레이팅 효소(deubiquitylating enzyme; 이하, Usp2-cc)를 이용한 응집되기 쉬운 외래펩티드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 단백질 절단효소 부위로서 유비퀴틴 및 외래펩티드의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하고, 상기 발현벡터로부터 발현되어 응집된 융합 단백질을 고농도의 우레아로 녹인 후, 우레아 제거 과정 없이 우레아가 존재하는 상태에서 상기 융합 단백질을 Usp2-cc를 이용하여 절단함으로써 원래 형태의 수용성 외래펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 응집되기 쉽고 화학 합성이 힘든 펩티드의 생산을 쉽고 빠르게, 효과적으로 개선할 수 있다.

디유비퀴틸레이팅 효소, 유비퀴틴, 원래 형태의 외래펩티드, 재조합 단백질

Description

고농도 우레아하에서 안정된 활성을 갖는 디유비퀴틸레이팅 효소를 이용한 펩티드의 제조방법{METHOD FOR PREPARATION OF PEPTIDES BY USING DEUBIQUITYLATING ENZYME WHICH IS STABLE IN PRESENCE OF HIGH CONCENTRATION OF UREA}

본 발명은 고농도의 우레아에서 안정된 활성을 갖는 디유비퀴틸레이팅 효소(deubiquitylating enzyme; 이하, Usp2-cc)를 이용한 응집되기 쉬운 외래펩티드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 단백질 절단효소 부위로서 유비퀴틴 및 외래펩티드의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하고, 상기 발현벡터로부터 발현되어 응집된 융합 단백질을 고농도의 우레아로 녹인 후, 우레아 제거 과정 없이 우레아가 존재하는 상태에서 상기 융합 단백질을 Usp2-cc를 이용하여 절단함으로써 원래 형태의 수용성 외래펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

응집되기 쉬운 펩티드의 화학적 생합성은 주요한 과제로 남아있다. 펩티드의 화학적 합성을 제한하는 주요 인자 중의 하나는 낮은 수율, 화학적 및 물리적 불균질성의 결과를 발생시키는 on-레진 응집현상이다. 단백질 분해효소 절단 인식부위 및 표적 펩티드로 구성된 융합 단백질을 이용한 생물학적 방법은 이러한 장해물을 해결하도록 하였다. 그러나 여전히 낮은 수율, 절단된 펩티드의 응집물, 정제의 어려움 등과 같은 한계점들이 남아 있다. 이때, 봉입체(inclusion body) 형태의 재조합 융합 단백질은 고수율 및 고순도로 축적될 수 있는 이점을 가진다. 응집된 불용성 융합 단백질은 우레아(Urea)와 같은 강한 변성제(denaturant)에서 가용성으로 된다. 그러나 융합 단백질로부터의 표적 펩티드의 절단을 위해 선택된 단백질 분해효소의 최대 활성의 달성을 위해서는 우레아(Urea)의 제거가 필요하고, 상기 제거는 펩티드의 응집과 같은 해로운 효과를 초래한다. 이미 상기의 해로운 문제들을 해결하기 위해 여러 전략이 실행되어 왔다(Lopes DH et al ., J Biol Chem 279:42803-42810, 2004). 그 중의 하나가 on-컬럼 절단(Dobeli H et al ., Biotechnology ( NY ) 13:988-993, 1995; Lopes DH et al ., J Biol Chem 279:42803-42810, 2004) 방법으로, 상기 방법은 시간이 오래 걸리고, 비용이 비싸며 추가 정제 과정을 필요로 하기도 한다.

우레아를 제거한 후, 융합 단백질로부터의 융합 파트너의 제거는 펩티드 응집을 유발할 수 있기 때문에, 우레아가 존재하는 상태에서 융합 파트너를 제거하면 상기 응집 반응을 억제할 수 있다. 이에 우레아가 존재하는 상황에서 융합 파트너 제거를 위한 절단 반응을 수행할 수 있다면 상기 응집에 관한 문제점을 해결할 수 있을 것이다. 특이적이고 강한 효소인 디유비퀴틸레이팅 효소(deubiquitylating enzyme; 이하, Usp2-cc)는 유비퀴틴을 절단할 수 있는 효소로서, 넓은 범위의 pH 및 NaCl 농도에서 고유의 활성을 유지하는 것으로 보고되었다(Baker RT et al ., Methods Enzymol 398:540-554, 2005; Baker RT et al ., Curr Opin Biotechnol 7:541-546, 1996).

이에 본 발명자들은 융합파트너, 단백질 절단효소 인식부위로서 우레아가 존재하더라도 활성을 나타낼 수 있는 Usp2-cc가 절단할 수 있는 유비퀴틴 및 외래펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현한 후, 상기 융합 단백질을 우레아가 존재하는 조건에서 상기 Usp2-cc로 처리한 결과, 상기 방법으로 수득한 원래 형태의 외래펩티드에서 응집 현상이 발생하지 않았을 뿐만 아니라 효소 활성도 유지하는 것을 확인하였고, 어떠한 추가 단계 없이 응집되기 쉬운 펩티드가 정제될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 화학적 합성 및 생물학적 정제가 어려운 응집되기 쉬운 펩티드의 정제방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 융합파트너, 유비퀴틴 및 외래펩티드의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트가 작동가능하게 포함된 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

2) 단계 1)의 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계;

3) 단계 2)의 재조합 융합 단백질을 2 내지 4 M 우레아를 포함하는 용해액에 현탁하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 현탁액에 디유비퀴틸레이팅 효소(deubiquitylating enzyme; 이하, Usp2-cc)를 처리하여 상기 융합 단백질을 절단하고 상기 외래펩티드를 수득하는 단계를 포함하는 원래 형태의 수용성 외래펩티드 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 원래 형태의 수용성 외래펩티드를 제공한다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

"외래펩티드(heterologous peptide)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 폴리펩티드로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.

"재조합 단백질(recombinant protein) 또는 융합단백질(fusion protien)"은 원래의 외래펩티드의 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다. 본 발명의 융합파트너와 외래펩티드가 연결된 재조합 융합 단백질 형태 또는 단백질 절단효소에 의해 융합파트너가 재조합 융합단백질로부터 제거된 외래펩티드의 재조합 단백질을 의미한다.

"발현벡터"는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 표적 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 융합파트너, 유비퀴틴 및 외래펩티드의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다.

유비퀴틴(ubiquitin)은 디유비퀴틸레이팅 효소(deubiquitylating enzyme; 이하, Usp2-cc)에 의해 절단되는 것을 특징으로 한다. 상기 융합파트너는 이에 한정되는 것은 아니나, 말토오즈 결합 단백질(Maltose binding protein; MBP), 글루타치온-S-전이효소(Glutathione-S-transferase; GST), 티오레독신(Thioredoxin; Trx), NusA 및 GroES등이 있으며, 바람직하게는 GroES이다. E. coli의 공동-샤페론(co-chaperone)인 GroES는 그 자체의 고발현 및 안정성에 기인하여 융합 파트너로서 적합하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 GroES를 유비퀴틴을 사이에 두고 표적 펩티드과 연결하여 사용하였다(도 1a 참조). 상기 유비퀴틴 단독으로 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 효과적인 융합 파트너일 수 있으나(Jonnalagadda S et al ., J Biol Chem 262:17750-17756, 1987), GroES를 융합파트너로 사용한 것보다 효율적이진 않았다(데이타 없음). 상기 외래펩티드는 당업자가 원하는 모든 펩티드가 가능하며, 상기 외래펩티드는 바람직하게는 응집되기 쉬운 단백질이며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Aβ_1-42, Aβ_1-40 및 Tat-휴마닌을 대상으로 하였다. Aβ_1-42는 이전의 연구에서 E. coli 발현시 봉입체를 형성하는 것으로 알려져 있고(Dobeli H et al ., Biotechnology ( NY ) 13:988-993, 1995; Lee EK et al ., Protein Expr Purif 40:183-189, 2005), 화학적 생합성도 어려운 것으로 알려져 있다(Tickler AK et al ., J Pept Sci 7:488-494, 2001). 또한, 아폽토시스-억제 휴마닌 펩티드의 세포 투과성 버전인 33 아미노산 길이의 Tat-휴마닌(Tat-Humanin)은 응집하는 경향이 높아 이의 정제가 어려웠다.

본 발명의 유전자 컨스트럭트는 골격 벡터에 제한효소 부위를 통해 클로닝되어 포함되며, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 골격 벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, pET21a, pET28a, pET/Rb, pGEX, pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 상기 발현벡터는 pET28b 골격 벡터에 상기 유전자 컨스트럭트를 작동가능하게 포함함으로써 상기 재조합 융합 단백질을 발현할 수 있었다.

본 발명은 1) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

우레아 존재하는 상태에서의 융합 단백질의 절단 활성은 두 가지 이점이 있다. 첫 번째는 별도의 우레아 제거 과정이 필요 없기 때문에, 절단 반응 수행 전의 융합 단백질의 응집을 억제할 수 있다. 두 번째는 응집되기 쉬운 펩티드의 경우에서 일반적으로 발생하는 절단된 펩티드의 응집을 막을 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 세포 배양액 1 ℓ당 순수(>95%) 펩티드 10 ㎎ 이상을 추가적인 용해 및 정제 단계 없이 수득할 수 있었다(도 3b).

단계 3)의 우레아는 용해액에 2 내지 4 M의 농도로 포함되며, 바람직하게는 2.5 내지 3.5 M, 가장 바람직하게는 3 M의 농도로 포함된다. 단계 2)의 재조합 융합 단백질은 디유비퀴틸레이팅 효소(deubiquitylating enzyme; 이하, Usp2-cc)에 의해 절단될 수 있는데, 이는 Usp2-cc가 상기 재조합 융합 단백질에 단백질 절단효소 인식부위로 포함된 유비퀴틴을 절단할 수 있기 때문이다. 상기 Usp2-cc는 활성을 유지하는 pH 범위가 넓고 고염농도에서도 활성을 유지할 수 있는 것으로 보고되었다(Baker RT, Curr Opin Biotechnol 7:541-546, 1996). 본 발명의 실시예에서 상기 Usp2-cc는 도 1a에서 나타난 바와 같은 구조를 갖는 GroES, 유비퀴틴 및 Aβ_1-42를 포함하는 융합 단백질을 Usp2-cc:기질(융합 단백질) = 1:100의 몰라 비에서 3 M 우레아 이하에서 2 시간 안에 펩티드를 효과적으로 절단하였다. 4 M 우레아 존 재시에는 상기 효과와 비슷한 효과를 갖기 위해서는 더 많은 효소(4 배 이하)가 필요하였고(도 2a 참조), 우레아가 고농도로 포함되었을 때는 절단반응은 효과적이지 않았다(데이타 없음). 시각 관찰 또는 원심분리 방법에 기반해서 3 M 또는 4 M 우레아 존재하에서 절단 반응이 수행되었을 때, 펩티드의 응집은 발견되지 않았다. 반대로 <2 M 우레아에서 수행되었을 때에는 뚜렷한 절단 산물의 응집이 발견되었다(데이타 없음). 또한, 상기 Usp2-cc의 절단 효과는 pH7 내지 10에서 거의 변하지 않았다(도 2b 참조). 이전의 보고에서 우레아가 없을 경우, 넓은 범위의 pH에서 안정한 활성을 유지하는 것으로 보고되었다. 참고로, 상기 융합 단백질은 E. coli에서의 발현량이 많았으나, 대부분이 봉입체를 형성한 것으로 확인되었고(도 1b 참조), 6 M 우레아에 용해시킨 후 시리얼 희석하여 수용성을 유지하는 지를 확인한 결과, 2 M 우레아 이하에서 응집물이 확인되었다(데이타 없음). 상기 Usp2-cc 이용의 추가적인 장점은 펩티드의 N-말단의 변형 없이 유비퀴틴을 포함하는 원형 그대로의 융합 단백질로부터 펩티드의 절단을 용이하게 할 수 있다는 것이다. 이와 비교하여, TEV(tobaccos etch virus protease; CaErrington JC et al ., EMBO J 8:365-370, 1989) 및 factor Xa(Jenny RJ et al ., Protein Expr Purif 31:1-11, 2003) 등은 비-자연상태의 N-말단 아미노산을 생성하고, 절단에 오류가 발생할 수 있는 것으로 보고되었다.

단계 4)의 외래펩티드 수득 방법은 컬럼 크로마토그래피 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 컬럼 크로마토그래피 방법은 구체적으로 친화도 크로마토그래피 또는 액체 크로마토그래피 방법일 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 원래 형태의 단백질은 크로마토그래피의 한 단계만으로 정제될 수 있고(도 3b 참조), 수율은 세포 배양액 1ℓ 당 10 ㎎에 달했다. 이것은 다른 시스템들(Lee EK et al ., Protein Expr Purif 40:183-189, 2005)에 비해 효율적인 것을 나타낸다. Aβ_1-40은 동일한 방법에 의해 정제되었을 때 그 수율이 훨씬 높았다(세포 배양액 1ℓ 당 15 ㎎). 아폽토시스-억제 휴마닌 펩티드의 세포 투과성 버전인 33 아미노산 길이의 Tat-휴마닌(Tat-Humanin)은 응집하는 경향이 높아 이의 정제가 어려웠었다. 그러나, 이 또한 본 발명의 방법에 의해 성공적으로 정제되었다(수율: 세포 배양액 1ℓ 당 12 ㎎; 도 3a). 정제된 펩티드를 MALDI-TOF MS에 의해 질량 분석한 결과, Aβ_1-42 및 Aβ_1-40은 각각 4514.6 Da(기대치; 4513.8 Da) 및 4330.8 Da(기대치; 4329.86 Da)인 것으로 나타났고, Tat-휴마닌은 완충용액에서의 불용성 때문에 질량 분석하지 않았다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 Aβ_1-42 펩티드는 생물 물리학적 및 생물학적 성질이 변하지 않았다. ThT 검사(도 4a), CD 분광학에 의해 측정된 β-시트의 형성(도 4b) 및 SH-SY5Y 세포에 대한 세포독성(도 4c)에 의해 시험 된 원섬유형성(Fibrillogenesis) 동역학(kinetics)이 이전의 보고와 일치하였다(Lee EK et al ., Protein Expr Purif 40:183-189, 2005; Naiki H et al ., Lab Invest 74:374- 38, 1996; Kirkitadze MD et al ., J Mol Biol 312:1103-1119, 2001). Aβ_1-40도 생물학적 활성을 나타냈으나, Tat-휴마닌의 활성은 세포 배양액에 첨가시 응집되는 현상때문에 생물학적으로 실험되지 않았다(데이타 없음).

여러 인간의 질환, 특히 알츠하이머, 헌팅턴 및 제 2형 당뇨병 등은 펩티드의 응집 작용과 관련되어 있다(Stefani M et al ., J Mol Med 81:678-699, 2003). 펩티드의 응집이 어떻게 세포 독성을 유도하는 지에 대한 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 본 발명의 방법에 의해 대량으로 제조된 응집되기 쉬운 펩티드는 상기 펩티드의 응집 작용과 관련한 질환의 기작을 밝히는 데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 응집되기 쉬운 펩티드의 생산을 쉽고 빠르게, 효과적으로 개선할 수 있고, 펩티드의 응집 작용과 관련한 기작을 밝히는 데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 융합 단백질 발현용 벡터

<1-1> 융합 파트너를 포함하는 벡터

공동-샤페론(co-chaperone) GroES를 암호화하는 유전자는 서열번호 1(안티센스 프라이머; 5'-AAGTCCGCTCTATTCTTGATGCGGATCCCG-3') 및 서열번호 2(센스 프라이머 5'-GGAATTCCATATGAATATTCGTCCATTGCA-3')로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 대장균 DH5α의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, 200 μM의 주형 DNA, 1.5 mM MgCl₂, Hepes 완충용액과 함께 95℃ 1분, 45℃ 1분, 72℃ 1분, 30회 반복의 조건으로 PCR을 수행하여 수득하였다. NdeI 및 BamHI 제한효소를 이용하여 PCR 산물을 처리한 후, 상기 제한효소 인식부위를 포함하는 pET28b 발현 시스템(Novagen, USA)에 삽입하여 pET28b-GroES 벡터를 수득하였다.

<1-2> 융합 파트너, 유비퀴틴 인식 부위 및 Aβ _1-42 를 포함하는 벡터

서열번호 3(안티센스 프라이머; CCGCTCGAGTCACGCTATGACAACACCGCC) 및 서열번호 4(센스 프라이머; CGCGGATCCCAGATCTTTGTGAAGA)로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 유비퀴틴 유전자(Baker RT, Curr Opin Biotechnol 7:541-546, 1996; Gene bank no.: AF073344)를 주형으로 한 후, 95℃ 1분, 45℃ 1분, 72℃ 1분, 30회 반복의 조건으로 PCR을 수행하였다. NdeI 및 BamHI 제한효소를 이용하여 PCR 산물을 처리한 후, 상기 제한효소 인식부위를 포함하고 아밀로이드(amyloid) β_1-42 (Aβ_1-42)을 포함하는 벡터의 NdeI/BamHI 제한효소 인식부위에 서브클로닝 하였다. 그 후 에, 유비퀴틴 및 Aβ_1-42 사이의 BamHI 제한효소 인식부위는 앞으로 진행될 클로닝을 용이하게 하기 위해, 지정부위돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 제거되었다. 구체적으로 상기 Aβ_1-42을 포함하는 벡터를 주형 DNA로 하여 서열번호 5(센스 프라이머; CTCCGCGGTGGAGATGCAGGATTC) 및 서열번호 6(안티센스 프라이머; GGATCCTGCATCTCCACCGCGGAG)으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 95℃ 1분, 45℃ 1분, 72℃ 1분, 30회 반복의 조건으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 산물을 BamHI과 XhoI 제한효소로 절단한 후 상기 벡터에 재삽입하였다. 유비퀴틴-Aβ_1-42 유전자는 상기 벡터를 주형 DNA로 하여 서열번호 7(센스 프라이머; 5'-CGCGGATCCCAGATCTTTGTGAAGAC-3') 및 서열번호 8(안티센스 프라이머; 5'-CCGCTCGAGTCACGCTATGACAACACCGCC-3')로 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 95℃ 1분, 45℃ 1분, 72℃ 1분, 30회 반복의 조건으로 증폭되었다. BamHI 및 XhoI 제한효소를 이용하여 PCR 산물을 처리한 후, 상기 제한효소 인식부위를 포함하는 상기 pET28b-GroES 벡터에 삽입하여 pET28b-GroES-유비퀴틴-Aβ_1-42 벡터를 수득하였다(도 1a).

<1-3> 융합 파트너, 유비퀴틴 인식 부위 및 Aβ _1-40 을 포함하는 벡터

Aβ_1-40은 실시예 1-2의 방법으로 제작한 pET28b-GroES-유비퀴틴-Aβ_1-42 벡터를 주형 DNA로 하여 지정부위돌연변이를 통해 Aβ_1-42 서열의 마지막 두 개의 아미노산 앞에 정지 코돈을 삽입함으로써 수득하였다. 구체적으로 상기 PCR 산물을 주형 DNA로 하여 서열번호 9(센스 프라이머; GGGGGAGTATGAATCGCCCTC) 및 서열번호 10(안티센스 프라이머; GAGGCCGATTCATACTCCCCC)으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 95℃ 1분, 45℃ 1분, 72℃ 1분, 30회 반복의 조건으로 PCR을 수행하였다. 유비퀴틴-Aβ_1-40 유전자는 상기 벡터를 주형 DNA로 하여 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 상기 실시예 1-2에 기재된 유비퀴틴-Aβ_1-42 유전자의 PCR 조건과 동일한 조건으로 증폭되었다. BamHI 및 XhoI 제한효소를 이용하여 PCR 산물을 처리한 후, 상기 제한효소 인식부위를 포함하는 상기 pET28b-GroES 벡터에 삽입하여 pET28b-GroES-유비퀴틴-Aβ_1-40 벡터를 수득하였다.

<1-4> 융합 파트너, 유비퀴틴 인식 부위 및 Tat - 휴마닌을 포함하는 벡터

Tat-휴마닌(Tat-humanin) 유전자는 유비퀴틴 유전자(Baker RT, Curr Opin Biotechnol 7:541-546, 1996)을 주형 DNA로하여 세 개의 오버랩되는 안티센스 프라이머(서열번호 11 내지 13; 서열번호 11: 5'-AAAACCACGCGGCGCCATACGACGACGCTGACGACGTTTTTTACGTCCACCGCGGAGGCGCAA-3'; 서열번호 12: 5'-ATCAATTTCACCGGTCAGCAGCAGCAGGCAGCTAAAACCACGCGGCGCCAT-3'; 서열번호 13: 5'-CCGCTCCAGTCACGCACGACGTTTCACCGGCAGATCAATTTCACCGGTCAG-3') 및 서열번호 14(5'-CGCGGATCCCAGATCTTTGTGAAGAC-3')로 기재되는 유비퀴틴 센스 프라이머를 이용하여 증폭되었고, BamHI 및 XhoI 제한효소를 이용하여 PCR 산물을 처리한 후, 상기 제한효소 인식부위를 포함하는 상기 pET28b-GroES 벡터에 삽입하여 pET28b-GroES-유비퀴틴-Tat-휴마닌 벡터를 수득하였다.

< 실시예 2> 융합 단백질 발현 및 정제

<2-1> 형질전환 및 발현

하나한(Hanahan)이 기술한 방법(Hanahan D, DNA Cloning vol.1 109-135, IRS press 1985)에 의해 실시예 1의 방법으로 수득한 벡터들을 E. coli BL21(DE3) pLysS 세포에 형질전환하였다.

구체적으로 CaCl₂로 처리한 대장균 BL21 (DE3) pLysS(Novagen, USA)에 실시예 1의 벡터들을 열충격 방법으로 형질전환시킨 후, 카나마이신(kanamycin)이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 카나마이신(kanamycin) 저항성을 나타내는 콜로니를 선별하였다. 상기 콜로니를 LB 배지(30 ㎍/㎖ 카나마이신; sigma, USA)에 접종하고, 37℃에서 16시간 배양한 후 적당량을 취하여 LB 배지(30 ㎍/㎖ 카나마이신; sigma, USA)에 접종하였다. 배양액의 OD₆₀₀이 0.6에 이르렀을 때 IPTG를 첨가(0.4 mM)하여 6 시간 동안 더 배양하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다.

<2-2> 융합 단백질의 정제

배양이 끝나고 배양액을 원심분리하여 응집된 균체를 25 ㎖ 세포 파쇄액(20 mM Tri-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM PMSF, 0.1 mM EDTA 및 1 mM b-머캅토에탄올; Sigma, USA)에 현탁하여 파쇄시켰다. 이를 13,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하였다. 봉입체를 형성하고 있는 GroES에 융합되어 발현된 표적 펩티드가 포함 된 응집물을 6 M 우레아(USB chemicals, USA)를 포함하는 재현탁 완충용액(50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 및 1 mM DTT; Sigma, USA)에 재현탁하였다. 재현탁 후, 불용성 단백질은 18,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 제거하였다. 상등액은 한외여과(ultrafiltration)하여 더 정화하였다.

우레아 처리 전의 원심분리된 시료의 상등액과 봉입체를 우레아에 녹여 재현탁된 수용성 단백질 각각 10 ㎕를 2 ㎕와 섞어서 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 10% SDS-PAGE 겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 전기영동 하여 분자량에 따라 분리하였다.

그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이 Aβ_1-42를 포함하는 융합 단백질은 E. coli에서 고발현 하였고, 대부분의 단백질이 봉입체를 형성하는 것으로 확인되었다. 또한, Aβ_1-40 및 Tat-휴마닌의 경우도 마찬가지 였다(도 1c).

< 실시예 3> 융합 단백질 절단 반응 및 펩티드 정제

<3-1> 융합 단백질 절단 반응

<3-1-1> 융합 단백질 절단 반응

Usp2-cc는 Catanzariti AM et al ., Protein Sci 13:1331-1339, 2004의 방법에 따라 정제되었다. 구체적으로, Usp2-cc ORF는 IMAGE clone 1922050의 mouse Usp2-45 cDNA(AY255637; Gousseva & Baker, Gene Expr 11:163-179, 2003)를 주형 DNA로 하여 서열번호 15(CGTGGATCCTCTGCTCACCAAAGCCAAGAATTC) 및 서열번호 16(TCCGGATCCTTACATACGGGAGGGTGGACTG)으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 함으로써 수득하였다. 상기 PCR 산물을 BamHI 제한효소 처리 후, pET15b(Novagen, USA)에 삽입하였다. 상기 벡터를 실시예 2-1의 방법으로 형질전환하여 상기 Usp2-cc를 발현시킨 후, Catanzariti AM et al ., Protein Sci 13:1331-1339, 2004의 방법에 따라 Usp2-cc를 정제하였다.

<3-1-2> 절단 반응

실시예 2-1 및 2-2의 방법으로 수득한 융합 단백질을 재현탁 완충용액에 2배의 비율로 희석한 후, 실시예 3-1-1의 방법으로 수득한 Usp2-cc: 융합 단백질(기질)을 1:25, 1:50 및 1:100의 비율로 섞어서 우레아 2 내지 6 M 존재 시, pH 7 내지 10 및 37℃의 조건에서 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. pH7-9의 조절에는 50 밀리몰라 Tris-Cl, pH10에는 20 mM 중탄산염(bicarbonate) 완충용액(Sigma, USA)이 사용되었다. 따로 표시되지 않는 한, 모든 융합 단백질의 절단 반응은 pH8에서 수행되었다.

<3-2> 펩티드의 정제

실시예 3-1의 방법으로 절단된 시료는 C18 컬럼(25 mm × 250 mm, Grace Vydac, USA)에 로딩되었다. 펩티드들은 용매 시스템 완충용액 1(30 mM 암모늄 아세테이트, pH10, 2% 아세토니트릴; Merck, USA) 및 완충용액 2(70% acetonitrile)에 의해 유량 10 ㎖/분의 속도로 35분이 지난 후 완충용액 2의 20-40% 선형 구배 방법에 의하여 정제되었다. 정제된 펩티드들은 동결건조되어 -20℃에 보관되었고, 사용되기 직전에 0.1% NH₄OH(Sigma, USA)에 1 ㎎/㎖의 농도로 넣어 10분 동안 배스 소니케이션에 의해 용해되었고, 상기 용해액은 동일한 용량의 PBS(10 mM phosphate buffer, pH 7.4, 137 mM NaCl 및 2 mM KCl; Ameresco, USA)와 섞였다. Tat-휴마닌의 경우, 10% 빙초산(glacial acetic acid)에 용해된 후, PBS에 5 배 희석되었다.

그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 Aβ_1-42 펩티드는 크로마토그래피의 한 단계만으로 정제될 수 있었다.

<3-3> 펩티드 분석

<3-3-1> 질량분석

실시예 3-1 및 3-2에서 여러 효소:기질의 비율, 우레아 농도 및 pH 값 조건에서의 절단반응 후 정제된 펩티드들은 질량분석되었다(애니젠, 한국).

그 결과, Aβ_1-42 및 Aβ_1-40은 각각 4514.6 Da(기대치; 4513.8 Da) 및 4330.8 Da(기대치; 4329.86 Da)인 것으로 나타났다. 그러나, Tat-휴마닌은 완충용액에서의 불용성 때문에 질량 분석하지 않았다.

<3-3-2> SDS - PAGE

실시예 3-1 및 3-2에서 여러 효소:기질의 비율, 우레아 농도 및 pH 값 조건에서의 절단반응 후 정제된 펩티드들 각각 10 ㎕를 2 ㎕와 섞어서 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 10% SDS-PAGE 겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 전기영동 하여 분자량에 따라 분리하였다.

그 결과, 6 M 우레아에 용해시킨 봉입체를 시리얼 희석하여 수용성을 유지하 는 지를 확인한 결과, 2 M 우레아 이하에서 응집물이 확인되었다(데이타 없음). 또한 Usp2-cc:기질 = 1:100의 몰라 비에서 3 M 우레아 이하에서는 2 시간 안에 펩티드를 효과적으로 절단하였다. 4 M 우레아 존재시에는 상기 효과와 비슷한 효과를 갖기 위해서는 더 많은 효소(4 배 이하)가 필요하였다(도 2a). 우레아가 고농도로 포함되었을 때는 절단 반응은 효과적으로 수행되지 않았다(데이타 없음). 절단 반응의 효과는 pH7 내지 10에서 거의 변하지 않았다(도 2b). 이전의 보고에서 우레아가 없을 경우, 넓은 범위의 pH에서 안정한 활성을 유지하는 것으로 보고되었다. 시각 관찰 또는 원심분리 방법에 기반해서 3 M 또는 4 M 우레아 존재하에서 절단 반응이 수행되었을 때, 펩티드의 응집은 발견되지 않았다. 반대로 <2 M 우레아에서 수행되었을 때에는 뚜렷한 절단 산물의 응집이 발견되었다(데이타 없음).

본 발명의 방법에 의해 Aβ_1-42 펩티드는 크로마토그래피의 한 단계만으로 정제될 수 있었고(도 3a의 레인 3), 수율은 세포 배양액 1ℓ 당 10 ㎎에 달했다. Aβ_1-40은 동일한 방법에 의해 정제되었을 때 그 수율이 훨씬 높았다(세포 배양액 1ℓ 당 15 ㎎, 도 3a의 레인 4). Tat-휴마닌(Tat-Humanin) 또한 본 발명의 방법에 의해 성공적으로 정제되었다(수율: 세포 배양액 1ℓ 당 12 ㎎; 도 3a의 레인 5).

< 실시예 4> 정제된 펩티드의 생물 물리학적 및 생물학적 성질

<4-1> 세포 배양

인간 신경아세포종(neuroblastoma) SH-SY5Y 세포(ECACC no. 94030304)를 10%(v/v) FBS 및 1% 항체(Jeil Biotechservices, 한국)가 첨가된 DMEM/F-12(Gibco, USA) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 15,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트(Nunc, 덴마크)에 상기 세포를 접종한 후, 추가로 24시간 동안 배양하였다.

<4-2> Aβ _1-42 의 원섬유형성( Fibrillogenesis )

20 마 이크로몰라의 Aβ_1-42를 PBS에 녹인 후, 37℃에서 최종 용량 300 ㎕으로 인큐베이션 하였고, 20 ㎕를 제하여 PBS에 새로 녹여서 준비한 5 μM ThT(Sigma, USA) 80 ㎕와 혼합하였다. 445 ㎚(여기) 및 490 ㎚(방출)에서 마이크로플레이트 스펙트로플루로미터(Microplate Spectrofluorometer; Molecular Devices, USA)를 이용하여 형광을 측정하였다.

<4-3> Aβ _1-42 의 이차구조

실시예 2-2의 방법으로 정제한 Aβ_1-42 20 ㎕를 PBS에 녹인 후, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 한 후 즉시 스펙트럼을 기록하였다.

구체적으로, Jasco J-810 Spectropolarimeter(Jasco Co., Japan)을 이용하여 25℃에서 1 ㎜ 광로 길이 큐벳으로 190 내지 250 ㎚ 사이에서 0.5 ㎚ 간격으로 원자외선 원형 색성[Far UV circular dichroism(CD)]을 기록하였다. 5 개의 누적 표시 도수를 평균 내어 0.1 ㎚ 분해능, 0.5-s 반응시간 및 50 ㎚/분 스캔 속도를 수득하였다.

<4-4> MTT 검사

실시예 4-1의 방법으로 배양된 세포에 실시예 3-2의 방법으로 정제한 Aβ_1-42 및 Aβ_1-40을 0 내지 10 μM의 농도로 처리한 후, MTT 환원 검사법에 의해 세포 생존율을 확인하였다.

구체적으로, 5 ㎎/㎖ MTT 용액(Sigma, USA) 20 ㎕를 96-웰 플레이트의 세포 배양액 100 ㎕에 첨가한 후, CO₂ 인큐베이터에서 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 이어서 50% DMF(pH4.7; Sigma, USA)에 녹인 20% SDS 용액 100 ㎕를 첨가하였다. 추가로 16시간 인큐베이션 후, 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices, USA)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 정제된 Aβ_1-42 펩티드는 생물 물리학적 및 생물학적 성질이 변하지 않았다. ThT 검사(도 4a), CD 분광학에 의해 측정된 β-시트의 형성(도 4b) 및 SH-SY5Y 세포에 대한 세포독성(도 4c)에 의해 시험 된 원섬유형성(Fibrillogenesis) 동역학(kinetics)이 이전의 보고와 일치하였다(Lee EK et al ., Protein Expr Purif 40:183-189, 2005; Naiki H et al ., Lab Invest 74:374-38, 1996; Kirkitadze MD et al ., J Mol Biol 312:1103-1119, 2001). Aβ_1-40도 생물학적 활성을 나타내었으나, Tat-휴마닌의 활성은 세포 배양액에 첨가시 응집되는 현상 때문에 생물학적으로 실험되지 않았다(데이타 없음).

도 1은 GroES-유비퀴틴-Aβ_1-42 융합 단백질 발현용 컨스트럭트 및 과발현 결과를 나타낸 도이다:

a: 유비퀴틴 주변의 구조도;

b: GroES-유비퀴틴-Aβ_1-42의 발현(S: 수용성 세포 융해체, P: 불용성 분획); 및,

c: GroES-유비퀴틴-Aβ1-40와 GroES-유비퀴틴-휴마닌의 발현(S: 수용성 세포 융해체, P: 불용성 분획).

도 2는 우레아 조건에서 Usp2-cc에 의한 GroES-유비퀴틴-Aβ_1-42 융합 단백질의 절단 결과를 나타낸 도이다:

a: 우레아 농도 및 효소:기질 비율에 따른 절단 결과(레인 1 및 5는 Usp2-cc 없음; 레인 2 및 6은 Usp2-cc:융합단백질 = 1:25; 레인 3 및 7은 Usp2-cc:융합단백질 = 1:50; 레인 4 및 8은 Usp2-cc:융합단백질 = 1:100); 및,

b: pH조절에 따른 절단 효과(Usp2-cc:융합단백질 = 1:50).

도 3은 Aβ_1-42 및 여러 펩티드의 정제 결과를 나타낸 도이다:

a: SDS-PAGE(레인 1은 GroES-유비퀴틴-Aβ_1-42 단백질; 레인 2는 Usp2-cc에 의해 절단된 융합 단백질; 레인 3은 정제된 Aβ_1-42; 레인 4는 정제된 Aβ_1-40; 레인 5는 Tat-휴마닌); 및,

b: RP-HPLC.

도 4는 원섬유형성(fibrillogenesis), 이차 구조 및 Aβ_1-42의 생물학적 활성을 나타낸 도이다(3회 반복 실험):

a: 시간-의존적 Aβ_1-42의 ThT-형광의 증가(RFU: 형광 유닛의 상대량);

b: 새로운 Aβ_1-42(실선) 및 응집된 Aβ_1-42(점선)의 CD 스펙트라 기록; 및,

c: SH-SY5Y 세포에서 Aβ_1-42의 세포 독성.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, ChoSun University <120> Method for preparation of peptides by using deubiquitylating enzyme which is stable in presence of high concentration of urea <130> 7P-11-03 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GroES antisense primer <400> 1 aagtccgctc tattcttgat gcggatcccg 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GroES sense primer <400> 2 ggaattccat atgaatattc gtccattgca 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubiquitin antisense primer <400> 3 ccgctcgagt cacgctatga caacaccgcc 30 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubiquitin sense primer <400> 4 cgcggatccc agatctttgt gaaga 25 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A beta 1-42 site-mutation sense primer <400> 5 ctccgcggtg gagatgcagg attc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A beta 1-42 site-mutation antisense primer <400> 6 ggatcctgca tctccaccgc ggag 24 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A beta 1-42 sense primer <400> 7 cgcggatccc agatctttgt gaagac 26 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A beta 1-42 antisense primer <400> 8 ccgctcgagt cacgctatga caacaccgcc 30 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A beta 1-40 sense primer <400> 9 gggggagtat gaatcgccct c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A beta 1-40 antisense primer <400> 10 gaggccgatt catactcccc c 21 <210> 11 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-humanin overlap antisense primer 1 <400> 11 aaaaccacgc ggcgccatac gacgacgctg acgacgtttt ttacgtccac cgcggaggcg 60 caa 63 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-humanin overlap antisense primer 2 <400> 12 atcaatttca ccggtcagca gcagcaggca gctaaaacca cgcggcgcca t 51 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-humanin overlap antisense primer 3 <400> 13 ccgctccagt cacgcacgac gtttcaccgg cagatcaatt tcaccggtca g 51 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-humanin sense primer <400> 14 cgcggatccc agatctttgt gaagac 26 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Usp2-cc forward primer <400> 15 cgtggatcct ctgctcacca aagccaagaa ttc 33 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Usp2-cc reverse primer <400> 16 tccggatcct tacatacggg agggtggact g 31

Claims

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1) 융합파트너, 유비퀴틴 및 외래펩티드의 융합 단백질을 코딩하는 유전자 컨스트럭트가 작동가능하게 포함된 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

2) 단계 1)의 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계;

3) 단계 2)의 재조합 융합 단백질을 2 내지 4 M 우레아를 포함하는 용해액에 현탁하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 현탁액에 디유비퀴틸레이팅 효소(deubiquitylating enzyme; 이하, Usp2-cc)를 처리하여 상기 융합 단백질을 절단하고 상기 외래펩티드를 수득하는 단계를 포함하는 원래 형태의 수용성 외래펩티드 제조방법.
제 8항에 있어서, 단계 3)의 우레아는 2.5 내지 3.5 M의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 8항에 있어서, 단계 3)의 우레아는 3 M의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 8항에 있어서, 단계 3)의 용해액은 pH가 6.5 내지 10.5인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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